Полипептиды, вариабельные домены антител и антагонисты

ПОЛИПЕПТИДЫ, ВАРИАБЕЛЬНЫЕ ДОМЕНЫ АНТИТЕЛ И АНТАГОНИСТЫ Изобретение относится к полипептидам и единичным вариабельным доменам (dAb) антител против TNFR1, устойчивым к деградации протеазой, а также к содержащим их антагонистам. Полипептиды, dAb и антагонисты полезны в качестве терапевтических и/или профилактических средств, которые вероятно сталкиваются с протеазами при введении пациенту, например для внутрилегочного введения, перорального введения, доставки в легкое и доставки в ЖК тракт пациента, а также для лечения воспалительного заболевания, такого как артрит или COPD Изобретение относится к протеазоустойчивым полипептидам, иммуноглобулиновым единичным вариабельным доменам (антитела) и содержащим их антагонистам фактора некроза опухоли 1 (TNFR1,р 55, CD120a, Р 60, член суперсемейства рецепторов TNF 1A, TNFRSF1 А). Изобретение дополнительно относится к применению, препаратам, композициям и устройствам, содержащим такие лиганды противTNFR1. Предшествующий уровень техники Полипептиды и пептиды становятся все более важными агентами в различных приложениях, включая промышленные приложения и применение в качестве медицинских, терапевтических и диагностических агентов. Однако при некоторых физиологических состояниях, таких как воспалительные состояния(например, COPD (хроническое обструктивное заболевание легких и рак, количество протеаз, присутствующих в ткани, органе или животном (например, в легком, в опухоли или рядом с опухолью), может увеличиваться. Это увеличение протеаз может приводить в результате к усиленной деградации и инактивации эндогенных белков и терапевтических пептидов, полипептидов и белков, вводимых для лечения заболевания. Соответственно, некоторые агенты, обладающие потенциалом применения in vivo (например, применение в лечении, диагностике или профилактике заболевания), обладают лишь ограниченной эффективностью, поскольку они быстро деградируют и инактивируются протеазами. Протеазоустойчивые полипептиды обладают некоторыми преимуществами. Например, протеазоустойчивые полипептиды остаются активными in vivo дольше, чем агенты, чувствительные к протеазам,и соответственно остаются функциональными в течение периода времени, достаточного для обеспечения биологических эффектов. Существует потребность в улучшенных способах селекции полипептидов, устойчивых к деградации протеазами, а также обладающих желаемой биологической активностью.TNFR1 представляет собой трансмембранный рецептор, содержащий внеклеточную область, связывающуюся с лигандом, и внутриклеточный домен, лишенный собственной активностью передачи сигнала, но который может ассоциироваться с молекулами, передающими сигнал. Комплекс TNFR1 со связанным TNF содержит три цепи TNFR1 и три цепи TNF (Banner et al., Cell, 73(3) 431-445 (1993. ЛигандTNF представлен в виде тримера, связанного с тремя цепями TNFR1 (Id.). Три цепи TNFR1 сконцентрированы близко друг к другу в комплексе рецептор-лиганд, и это близкое расположение является предпосылкой для опосредованной TNFR1 передачи сигнала. Фактически мультивалентные агенты, которые связываются с TNFR1, такие как антитела против TNFR1, могут вызывать кластеризацию TNFR1 и передачу сигнала в отсутствие TNF и обычно используются в качестве агонистов TNFR1 (см., например,Belka et al., ЕМВО, 14(6): 1156-1165 (1995); Mandik-Nayak et al., J. Immunol, 167:1920-1928 (2001. Соответственно, мультивалентные агенты, которые связываются с TNFR1, как правило, представляют собой неэффективные антагонисты TNFR1, даже если они блокируют связывание TNF c TNFR1. Внеклеточная область TNFR1 содержит амино-концевой сегмент, состоящий из тринадцати аминокислот (аминокислоты 1-13 в SEQ ID NO:603 (человек); аминокислоты 1-13 в SEQ ID NO:604 (мышь,домен 1 (аминокислоты 14-53 в SEQ ID NO:603 (человек); аминокислоты 14-53 в SEQ ID NO:604SEQ ID NO:604 (мышь и домен 4 (аминокислоты 139-167 в SEQ ID NO:603 (человек); аминокислоты 139-167 в SEQ ID NO:604 (мышь, за которым следует лежащая ближе к мембране область (аминокислоты 168-182 в SEQ ID NO:603 (человек); аминокислоты 168-183 SEQ ID NO:604 (мышь (см. Banner et al.,Cell 73(3) 431-445 (1993), и Loetscher et al., Cell 61(2) 351-359 (1990. Домены 2 и 3 формируют контакт со связанным лигандом (TNF, TNF) (Banner et al., Cell, 73(3) 431-445 (1993. Внеклеточная областьTNFR1 также содержит область, названную как домен сборки предшественника лиганда или PLAD домен (аминокислоты 1-53 в SEQ ID NO:603 (человек); аминокислоты 1-53 в SEQ ID NO:604 (мышь (правительство США, WO 01/58953; Deng et al., Nature Medicine, doi: 10.1038/nml304 (2005.TNFR1 выбрасывается с поверхности клеток in vivo при помощи способа, который включает протеолиз TNFR1 в домене 4 или в находящейся ближе к мембране области (аминокислоты 168-182 в SEQ IDNO:603; аминокислоты 168-183 в SEQ ID NO:604), с образованием растворимой формы TNFR1. Растворимый TNFR1 сохраняет способность связываться с TNF и, таким образом, действует в качестве эндогенного ингибитора активности TNF. Краткое изложение сущности изобретения В одном из аспектов в изобретении предложен полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 93% идентична аминокислотной последовательности DOM1h131-206 (представленной на фиг. 3). В одном из воплощений процент идентичности составляет по меньшей мере 94, 95, 96, 97, 98 или 99%. В одном из воплощений полипептид представляет собой DOM1h131-206. В изобретении дополнительно предложен (по существу) чистый мономер DOM1h-131-206. В одном из воплощений DOM1h-131-206 представляет собой по меньшей мере на 98, 99, 99,5% чистый или на 100% чистый мономер. В одном из аспектов в изобретении предложен полипептид, кодируемый аминокислотной последо-1 018723 вательностью, которая по меньшей мере на 80% идентична нуклеотидной последовательности DOM1h131-206 (представленной на фиг. 19). В одном из воплощений процент идентичности составляет по меньшей мере 70, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99%. В одном из аспектов в изобретении предложен полипептид, кодируемый нуклеотидной последовательностью, которая по меньшей мере на 57% идентична нуклеотидной последовательности DOM1h-131206 (представленной на фиг. 19), и где полипептид содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 93% идентична аминокислотной последовательности DOM1h-131-206 (представленной на фиг. 3). В одном из воплощений процент идентичности нуклеотидной последовательности составляет по меньшей мере 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99%. В одном из воплощений процент идентичности аминокислотной последовательности составляет по меньшей мере 94, 95, 96, 97, 98, или 99, или 100%. Например, нуклеотидная последовательность может представлять собой кодон-оптимизированный вариант нуклеотидной последовательности DOM1h-131-206 (представленной на фиг. 19). Оптимизация кодонов последовательности известна в области техники. В одном из воплощений нуклеотидная последовательность оптимизирована для экспрессии в бактериальной клеткехозяине (например, Е.coli или Pseudomonas, например Р. fluorescens), клетке-хозяине млекопитающего(например, СНО) или дрожжевой клетке-хозяине (например, Picchia или Saccharomyces, например P. pastoris или S. cerevisiae). В одном из аспектов в изобретении предложен слитый белок, содержащий полипептид по изобретению. В одном из аспектов в изобретении предложен иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен против рецептора TNF 1 типа (TNFR1; р 55), содержащий аминокислотную последовательность,которая по меньшей мере на 93% идентична аминокислотной последовательности DOM1h-131-206(представленной на фиг. 3). В одном из воплощений процент идентичности составляет по меньшей мере 94, 95, 96, 97, 98 или 99%. В одном из аспектов в изобретении предложен протеазоустойчивый иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен против рецептора TNF 1 типа (TNFR1; р 55), содержащий аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична аминокислотной последовательностиDOM1h-131-206. В одном из воплощений этих аспектов процент идентичности составляет по меньшей мере 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99%. В одном из воплощений иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен содержит аспарагиновую кислоту в положении 53, где нумерация соответствует нумерации по Кабату (Kabat) ("Sequencesof Proteins of Immunological Interest", US Department of Health and Human Services 1991). В одном из воплощений иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен содержит гистидин в положении 91, где нумерация соответствует нумерации по Кабату. В одном из аспектов в изобретении предложен иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен против рецептора TNF 1 типа (TNFR1; р 55), содержащий аминокислотную последовательность,которая идентична аминокислотной последовательности DOM1h-131-206. В одном из аспектов в изобретении предложен иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен против рецептора TNF 1 типа (TNFR1; р 55), кодируемый нуклеотидной последовательностью, которая по меньшей мере на 80% идентична нуклеотидной последовательности DOM1h-131-206 (представленной на фиг. 19). В одном из воплощений процент идентичности составляет по меньшей мере 70, 80,85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99%. В одном из аспектов в изобретении предложен иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен против рецептора TNF 1 типа (TNFR1; р 55), кодируемый нуклеотидной последовательностью, которая по меньшей мере на 57% идентична нуклеотидной последовательности DOM1h-131-206 (представленной на фиг. 19), и где вариабельный домен содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 93% идентична аминокислотной последовательности DOM1h-131-206 (представленной на фиг. 3). В одном из воплощений процент идентичности нуклеотидной последовательности составляет по меньшей мере 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99%. В одном из воплощений процент идентичности аминокислотной последовательности составляет по меньшей мере 94,95, 96, 97, 98, или 99%, или 100%. Например, нуклеотидная последовательность может представлять собой кодон-оптимизированный вариант нуклеотидной последовательности DOM1h-131-206 (представленной на фиг. 19). Оптимизация кодонов последовательности известна в области техники. В одном из воплощений нуклеотидная последовательность оптимизирована для экспрессии в бактериальной клеткехозяине (например, Е.coli или Pseudomonas, например P. fluorescens), клетке-хозяине млекопитающего(например, СНО) или дрожжевой клетке-хозяине (например, Picchia или Saccharomyces, например Р. pastoris или S. cerevisiae). В одном из аспектов в изобретении предложен иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен против рецептора TNF 1 типа (TNFR1; р 55), кодируемый последовательностью, которая идентична нуклеотидной последовательности DOM1h-131-206 (представленной на фиг. 19). В одном из аспектов в изобретении предложен антагонист рецептора TNF 1 типа (TNFR1; р 55),-2 018723 содержащий иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен против TNFR1 по изобретению. В одном из воплощений антагонист содержит первый и второй иммуноглобулиновый единичный вариабельный домены, где каждый вариабельный домен представляет собой вариабельный домен по изобретению. Например, когда антагонист содержит мономер указанного иммуноглобулинового единичного вариабельного домена или гомодимер указанного единичного вариабельного домена. В одном из воплощений аминокислотная последовательность единичного вариабельного домена или каждого единичного вариабельного домена идентична аминокислотной последовательности DOM1h-131-206 (представленной на фиг. 3). В одном из аспектов в изобретении предложен иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен против рецептора TNF 1 типа (TNFR1; р 55), содержащий аминокислотную последовательность,которая идентична аминокислотной последовательности DOM1h-131-206 (представленной на фиг. 3) или отличается от аминокислотной последовательности DOM1h-131-206 не более чем по 25 аминокислотным положениям, и имеет последовательность CDR1, которая по меньшей мере на 50% идентична последовательности CDR1 из DOM1h-131-206. В одном из воплощений различие имеется не более чем по 24, 23,22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 или 1 аминокислотному положению. В одном из воплощений идентичность последовательности CDR составляет по меньшей мере 55, 60, 65, 70,75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 или 99%. В одном из аспектов в изобретении предложен иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен против рецептора TNF 1 типа (TNFR1; р 55), содержащий аминокислотную последовательность,которая идентична аминокислотной последовательности DOM1h-131-206 (представленной на фиг. 3) или отличается от аминокислотной последовательности DOM1h-131-206 не более чем по 25 аминокислотным положениям, и имеет последовательность CDR2, которая по меньшей мере на 50% идентична последовательности CDR2 из DOM1h-131-206. В одном из воплощений различие имеется не более чем по 24, 23,22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 или 1 аминокислотному положению. В одном из воплощений идентичность последовательности CDR составляет по меньшей мере 55, 60, 65, 70,75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 или 99%. В одном из аспектов в изобретении предложен иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен против рецептора TNF 1 типа (TNFR1; р 55), содержащий аминокислотную последовательность,которая идентична аминокислотной последовательности DOM1h-131-206 (представленной на фиг. 3) или отличается от аминокислотной последовательности DOM1h-131-206 не более чем по 25 аминокислотным положениям, и имеет последовательность CDR3, которая по меньшей мере на 50% идентична последовательности CDR3 из DOM1h-131-206. В одном из воплощений различие имеется не более чем по 24, 23,22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 или 1 аминокислотному положению. В одном из воплощений идентичность последовательности CDR составляет по меньшей мере 55, 60, 65, 70,75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 или 99%. В одном из аспектов в изобретении предложен иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен против рецептора TNF 1 типа (TNFR1; р 55), содержащий аминокислотную последовательность,которая идентична аминокислотной последовательности DOM1h-131-206 (представленной на фиг. 3) или отличается от аминокислотной последовательности DOM1h-131-206 не более чем по 25 аминокислотным положениям, и имеет последовательность CDR1, которая по меньшей мере на 50% идентична последовательности CDR1 из DOM1h-131-206, и имеет последовательность CDR2, которая по меньшей мере на 50% идентична последовательности CDR2 из DOM1h-131-206. В одном из воплощений различие имеется не более чем по 24, 23, 22, 21, 20, 19,18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 или 1 аминокислотному положению. В одном из воплощений идентичности одной или обеих последовательностей CDR составляют соответственно по меньшей мере 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 или 99%. В одном из аспектов в изобретении предложен иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен против рецептора TNF 1 типа (TNFR1; р 55), содержащий аминокислотную последовательность,которая идентична аминокислотной последовательности DOM1h-131-206 (представленной на фиг. 3) или отличается от аминокислотной последовательности DOM1h-131-206 не болеечем по 25 аминокислотным положениям, и имеет последовательность CDR1, которая по меньшей мере на 50% идентична последовательности CDR1 из DOM1h-131-206, и имеет последовательность CDR3, которая по меньшей мере на 50% идентична последовательности CDR3 из DOM1h-131-206. В одном из воплощений различие имеется не более чем по 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 или 1 аминокислотному положению. В одном из воплощений идентичности одной или обеих последовательностей CDR составляют соответственно по меньшей мере 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 или 99%. В одном из аспектов в изобретении предложен иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен против рецептора TNF 1 типа (TNFR1; р 55), содержащий аминокислотную последовательность,которая идентична аминокислотной последовательности DOM1h-131-206 (представленной на фиг. 3) или отличается от аминокислотной последовательности DOM1h-131-206 не более чем по 25 аминокислотным положениям, и имеет последовательность CDR2, которая по меньшей мере на 50% идентична последовательности CDR2 из DOM1h-131-206, и имеет последовательность CDR3, которая по меньшей мере на 50% идентична последовательности CDR3 из DOM1h-131-206. В одном из воплощений различие имеется не более чем по 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 или 1 аминокислотному положению. В одном из воплощений идентичности одной или обеих последовательностей CDR составляют соответственно по меньшей мере 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 или 99%. В одном из аспектов в изобретении предложен иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен против рецептора TNF 1 типа (TNFR1; р 55), содержащий аминокислотную последовательность,которая идентична аминокислотной последовательности DOM1h-131-206 (представленной на фиг. 3) или отличается от аминокислотной последовательности DOM1h-131-206 не более чем по 25 аминокислотным положениям, и имеет последовательность CDR1, которая по меньшей мере на 50% идентична последовательности CDR1 из DOM1h-131-206, и имеет последовательность CDR2, которая по меньшей мере на 50% идентична последовательности CDR2 из DOM1h-131-206, и имеет последовательность CDR3, которая по меньшей мере на 50% идентична последовательности CDR3 из DOM1h-131-206. В одном из воплощений различие имеется не более чем по 24, 23, 22, 21, 20, 19,18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11,10, 9, 8, 7, 6,5, 4, 3, 2 или 1 аминокислотному положению. В одном из воплощений идентичности одной или обеих,или каждой последовательности CDR составляют по меньшей мере соответственно 55, 60, 65, 70,75, 80,85, 90, 95, 96, 97, 98 или 99%. В одном из аспектов изобретения предложен антагонист рецептора TNF 1 типа (TNFR1; р 55),имеющий последовательность CDR1, которая по меньшей мере на 50% идентична последовательностиCDR1 из DOM1h-131-206 (представленной на фиг. 3). В одном из воплощений идентичность последовательности CDR составляет по меньшей мере 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 или 99%. Антагонист может быть протеазоустойчивым, например устойчивым к одной или более чем одной из описанных здесь протеаз, например при описанном здесь наборе условий. В одном из аспектов в изобретении предложен антагонист рецептора TNF 1 типа (TNFR1; р 55),имеющий последовательность CDR2, которая по меньшей мере на 50% идентична последовательностиCDR1 из DOM1h-131-206 (представленной на фиг. 3). В одном из воплощений идентичность последовательности CDR составляет по меньшей мере 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 или 99%. Антагонист может быть протеазоустойчивым, например устойчивым к одной или более чем одной из описанных здесь протеаз, например при описанном здесь наборе условий. В одном из аспектов в изобретении предложен антагонист рецептора TNF 1 типа (TNFR1; р 55),имеющий последовательность CDR3, которая по меньшей мере на 50% идентична последовательностиCDR1 из DOM1h-131-206 (представленной на фиг. 3). В одном из воплощений идентичность последовательности CDR составляет по меньшей мере 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 или 99%. Антагонист может быть протеазоустойчивым, например устойчивым к одной или более чем одной из описанных здесь протеаз, например при описанном здесь наборе условий. В одном из аспектов в изобретении предложен антагонист рецептора TNF 1 типа (TNFR1; р 55),имеющий последовательность CDR1, которая по меньшей мере на 50% идентична последовательностиCDR1 из DOM1h-131-206 (представленной на фиг. 3), и последовательность CDR2, которая по меньшей мере на 50% идентична последовательности CDR2 из DOM1h-131-206. В одном из воплощений идентичность последовательности CDR одной или обеих CDR составляет по меньшей мере соответственно 55,60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 или 99%. Антагонист может быть протеазоустойчивым, например устойчивым к одной или более чем одной из описанных здесь протеаз, например при описанном здесь наборе условий. В одном из аспектов в изобретении предложен антагонист рецептора TNF 1 типа (TNFR1; р 55),имеющий последовательность CDR1, которая по меньшей мере на 50% идентична последовательностиCDR1 из DOM1h-131-206 (представленной на фиг. 3), и последовательность CDR3, которая по меньшей мере на 50% идентична последовательности CDR3 из DOM1h-131-206. В одном из воплощений идентичность последовательности CDR одной или обеих CDR составляет по меньшей мере соответственно 55,60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 или 99%. Антагонист может быть протеазоустойчивым, например устойчивым к одной или более чем одной из описанных здесь протеаз, например при описанном здесь наборе условий. В одном из аспектов в изобретении предложен антагонист рецептора TNF 1 типа (TNFR1; р 55),имеющий последовательность CDR2, которая по меньшей мере на 50% идентична последовательностиCDR2 из DOM1h-131-206 (представленной на фиг. 3), и последовательность CDR3, которая по меньшей мере на 50% идентична последовательности CDR3 из DOM1h-131-206. В одном из воплощений идентичность последовательности CDR одной или обеих CDR составляет по меньшей мере соответственно 55,60, 65, 70,75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 или 99%. Антагонист может быть протеазоустойчивым, например устойчивым к одной или более чем одной из описанных здесь протеаз, например при описанном здесь наборе условий. В одном из аспектов в изобретении предложен антагонист рецептора TNF 1 типа (TNFR1; р 55),имеющий последовательность CDR1, которая по меньшей мере на 50% идентична последовательности мере на 50% идентична последовательности CDR2 из DOM1h-131-206, и последовательность CDR3, которая по меньшей мере на 50% идентична последовательности CDR3 из DOM1h-131-206. В одном из воплощений идентичность последовательности CDR одной или обеих, или каждой CDR составляет по меньшей мере соответственно 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 или 99%. Антагонист может быть протеазоустойчивым, например устойчивым к одной или более чем одной из описанных здесь протеаз, например при описанном здесь наборе условий. В одном из аспектов в изобретении предложен антагонист рецептора TNF 1 типа (TNFR1; р 55),содержащий единичный вариабельный домен иммуноглобулина, содержащий последовательность CDR1,CDR2 и/или CDR3 (например, CDR1, CDR2, CDR3, CDR1 и 2, CDR1 и 3, CDR2 и 3 или CDR1, 2 и 3) изDOM1h-131-206 (представленной на фиг. 3). Антагонист может быть протеазоустойчивым, например устойчивым к одной или более чем одной из описанных здесь протеаз, например при описанном здесь наборе условий. В одном из аспектов в изобретении предложен антагонист рецептора TNF 1 типа (TNFR1; р 55),который конкурирует с DOM1h-131-511-206 за связывание с TNFR1. Таким образом, антагонист может связываться с тем же самым эпитопом, что и DOM1h-131-206, или перекрывающимся эпитопом. В одном из воплощений антагонист содержит иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен, имеющий аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 93% идентична аминокислотной последовательности DOM1h-131-206 (представленной на фиг. 3). В одном из воплощений процент идентичности составляет по меньшей мере 94, 95, 96, 97, 98 или 99%. Антагонист может быть протеазоустойчивым, например устойчивым к одной или более чем одной из описанных здесь протеаз, например при описанном здесь наборе условий. В одном из воплощений антагонист представляет собой антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, такой как моновалентный антигенсвязывающий фрагмент (например, scFv, Fab, Fab', dAb), обладающий специфичностью связывания в отношении TNFR1. Другие примеры антагонистов представляют собой описанные здесь лиганды, которые связываются с TNFR1. Лиганды могут содержать иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен или однодоменное антитело (dAb), обладающее специфичностью связывания в отношении TNFR1, или области, определяющие комплементарность, такого dAb в подходящем формате. В некоторых воплощениях лиганд представляет собой мономер dAb, который состоит по существу из или состоит из иммуноглобулинового единичного вариабельного домена или dAb, обладающего специфичностью связывания в отношении TNFR1. В других воплощениях лиганд представляет собой полипептид, который содержит dAb (или CDR из dAb) в подходящем формате, таком как формат антитела. Один из антагонистов TNFR1 по изобретению не ингибирует связывание TNF с TNFR1, но ингибирует передачу сигнала, опосредованную через TNFR1. Например, антагонист TNFR1 может ингибировать индуцированную TNF кластеризацию TNFR1, предшествующую передаче сигнала через TNFR1. Такие антагонисты обладают несколькими преимуществами. Например, в присутствии такого антагониста TNF может связываться с TNFR1, экспрессирующимся на поверхности клеток, и удаляться из клеточного окружения, но опосредованная TNFR1 передача сигнала не будет активироваться. Таким образом, будет ингибироваться индуцированная TNFR1 сигналом продукция дополнительного TNF и других медиаторов воспаления. Аналогично, антагонисты TNFR1, связывающиеся с TNFR1 и ингибирующие передачу сигнала, опосредованную через TNFR1, но не ингибирующие связывание TNF с TNFR1,не будут ингибировать связывание с TNF и ингибирующую активность эндогенно продуцируемого растворимого TNFR1. Соответственно, введение такого антагониста млекопитающему, нуждающемуся в таком введении, может дополнить эндогенные регуляторные пути, которые ингибируют активностьTNF и активность TNFR1 in vivo. Изобретение также относится к лигандам, которые (1) связываются сTNFR1 (например, в домене 1), (2) оказывают антагонистическое действие в отношении активации опосредованной TNFR1 передачи сигнала и (3) не ингибируют связывание TNF с TNFR1. Такой лиганд связывается с растворимым TNFR1, но не предотвращает связывание растворимого рецептора с TNF, и,таким образом, введение такого антагониста млекопитающему, нуждающемуся в таком введении, может дополнить эндогенные регуляторные пути, которые ингибируют активность TNF in vivo путем увеличения периода полувыведения растворимого рецептора из сыворотки крови. Эти преимущества особенно актуальны для лигандов, которые форматированы таким образом, что обладают большим гидродинамическим размером, например путем присоединения группы PEG (полиэтиленгликоль), альбумина сыворотки крови, трансферрина, рецептора трансферрина или, по меньшей мере, его трансферринсвязывающего фрагмента, области Fc антитела, или путем конъюгации с доменом антитела. Например,агент (например, полипептид, вариабельный домен или антагонист), который 1) связывается с TNFR1(например, в домене 1), (2) оказывает антагонистическое действие в отношении активации опосредованной TNFR1 передачи сигнала, и (3) не ингибирует связывание TNF с TNFR1, такой как мономер dAb,может быть форматирован в виде более крупного антигенсвязывающего фрагмента антитела или в виде антитела (например, форматирован как Fab, Fab', F(ab)2, F(ab')2, IgG, scFv). Гидродинамический размер лиганда и его период полувыведения из сыворотки крови также может быть увеличен путем конъюгации или связывания агента, связывающего TNFR1 (антагонист; вариабельный домен) со связывающим доме-5 018723 ном (например, антителом или фрагментом антитела), связывающим антиген или эпитоп, который увеличивает период полувыведения in vivo, как здесь описано (см. приложение 1 в WO 2006038027, включенной здесь путем ссылки). Например, связывающийся с TNFR1 агент (например, полипептид) может быть сконъюгирован или связан с антителом против альбумина сыворотки крови или его фрагментом или с антителом или фрагментом антитела против неонатального Fc рецептора, например dAb, Fab, Fab' или scFv против SA или против неонатального Fc рецептора, или с аффителом против SA или аффителом против неонатального Fc рецептора. Примеры подходящего альбумина, фрагментов альбумина или вариантов альбумина для применения в TNFR1-связывающем лиганде по изобретению описаны в WO 2005/077042A2 и WO 2006038027,которые включены здесь путем ссылки. В других воплощениях по изобретению, описанных в этом описании, вместо применения "dAb" в антагонисте или лиганде по изобретению предполагается, что специалист в данной области техники может использовать домен, который содержит CDR из dAb, который связывает TNFR1 (например, CDR,привитые на подходящий белковый остов или скелет, например аффитело, SpA остов, домен рецептораLDL (липопротеинов низкой плотности) класса А или домен EGF (фактор роста эпителия, или может представлять собой белковый домен, содержащий сайт связывания с TNFR1, например когда домен выбран из аффитела, домена SpA, домена LDL рецептора класса А или домена EGF. Полное описание следует рассматривать таким образом, что оно раскрывает антагонисты, лиганды и способы использования таких доменов вместо dAb. Полипептиды, единичные вариабельные домены иммуноглобулина и антагонисты по изобретению могут быть устойчивыми к одной или более чем одной из следующих протеаз: сериновая протеаза, цистеиновая протеаза, аспартатпротеазы, тиоловые протеазы, матриксная металлопротеиназа, карбоксипептидаза (например, карбоксипептидаза А, карбоксипептидаза В), трипсин, химотрипсин, пепсин, папаин,эластаза, лейкозим, панкреатин, тромбин, плазмин, катепсины (например, катепсин G), протеиназа (например, протеиназа 1, протеиназа 2, протеиназа 3), термолизин, химозин, энтеропептидаза, каспаза (например, каспаза 1, каспаза 2, каспаза 4, каспаза 5, каспаза 9, каспаза 12, каспаза 13), кальпаин, фикаин,клострипаин, актинидаин, бромелаин и сепараза. В конкретных воплощениях протеаза представляет собой трипсин, эластазу или лейкозим. Протеаза также может обеспечиваться биологическим экстрактом,биологическим гомогенатом или биологическим препаратом. В одном из воплощений протеаза представляет собой протеазу, обнаруженную в мокроте, слизи (например, желудочной слизи, носовой слизи,бронхиальной слизи), бронхоальвеолярном смыве, легочном гомогенате, легочном экстракте, экстракте поджелудочной железы, желудочной жидкости, слюне или слезах. В одном из воплощений протеаза представляет собой протеазу, обнаруженную в глазу и/или слезах. В одном из воплощений протеаза представляет собой небактериальную протеазу. В одном воплощении протеаза представляет собой протеазу животного, например протеазу млекопитающего, например человека. В одном воплощении протеаза представляет собой протеазу ЖК (желудочно-кишечного) тракта или протеазу легочной ткани, например протеазу ЖК тракта или протеазу легочной ткани, обнаруженную у людей. Такая приведенная здесь протеаза также может быть использована в описанных здесь способах, включающих воздействие протеазой на репертуар библиотеки. В одном из аспектов в изобретении предложен протеазоустойчивый иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен, содержащий сайт связывания рецептора TNF 1 типа (TNFR1; р 55), где вариабельный домен устойчив к протеазе, например трипсину, при инкубировании с (1) концентрацией (с) протеазы по меньшей мере 10 мкг/мл при 37 С в течение промежутка времени (t) по меньшей мере 1 ч; или (2) концентрацией (с') протеазы по меньшей мере 40 мкг/мл при 30 С в течение промежутка времени(t) по меньшей мере 1 ч, где вариабельный домен содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична аминокислотной последовательности DOM1h-131-206 (представленной на фиг. 3). В одном из воплощений отношение (на основе моль/моль) протеазы, например трипсина, к вариабельному домену составляет 8000 к 80000 протеаза:вариабельный домен, например когда С составляет 10 мкг/мл, тогда отношение составляет 800 к 80000 протеаза:вариабельный домен; или когда С или С составляет 100 мкг/мл, тогда отношение составляет 8000 к 80000 протеаза:вариабельный домен. В одном из воплощений отношение (на основе масса/масса, например на основе микрограмм/микрограмм) протеазы (например, трипсина) к вариабельному домену составляет 16000 к 160000 протеаза:вариабельный домен, например когда С составляет 10 мкг/мл, тогда отношение составляет 1600 к 160000 протеаза:вариабельный домен; или когда С или С' составляет 100 мкг/мл, тогда отношение составляет 16000 к 160000 протеаза:вариабельный домен. В одном из воплощений концентрация протеазы (с или c') составляет по меньшей мере 100 или 1000 мкг/мл. Здесь сделана ссылка на описание условий, подходящих для протеолитической активности протеазы для применения при работе с репертуарами или библиотеками пептидов или полипептидов (например, параметры мас./мас.). Эти условия могут быть использованы для определения устойчивости к протеазе конкретного иммуноглобулинового единичного вариабельного домена. В одном из воплощений время (t) составляет приблизительно 1, 3 или 24 ч или в течение ночи (например, приблизительно 12-16 ч). В одном из воплощений вариабельный домен устойчив в условиях (1) концентрация протеазы (с) составляет или приблизительно составляет 10 или 100 мкг/мл, время (t) составляет 1 ч. В одном из воплощений вариабельный домен устойчив в условиях (2) концентрация протеазы (с') составляет или приблизительно составляет 40 мкг/мл, время (t) составляет или приблизительно составляет 3 ч. В одном из воплощений протеаза выбрана из трипсина, эластазы, лейкозима и панкреатина. В одном из воплощений протеаза представляет собой трипсин. В одном из воплощений протеаза представляет собой протеазу, обнаруженную в мокроте, слизи (например, желудочной слизи, носовой слизи, бронхиальной слизи), бронхоальвеолярном лаваже, гомогенате легких, экстракте легких, экстракте поджелудочной железы, желудочной жидкости, слюне или слезах. В одном из воплощений протеаза представляет собой протеазу, обнаруженную в глазу и/или слезах. В одном из воплощений протеаза представляет собой небактериальную протеазу. В этом воплощении протеаза представляет собой протеазу животного, например протеазу млекопитающего, например человека. В этом воплощении протеаза представляет собой протеазу ЖК тракта или протеазу легочной ткани, например протеазу ЖК тракта или протеазу легочной ткани, обнаруженные у людей. Такая приведенная здесь протеаза также может быть использована в описанных здесь способах, включающих воздействие протеазой на репертуар библиотеки. В одном из воплощений вариабельный домен устойчив к трипсину и/или по меньшей мере одной другой протеазе, выбранной из эластазы, лейкозима и панкреатина. Например, устойчивость представляет собой устойчивость к трипсину и эластазе; трипсину и лейкозиму; трипсину и панкреатину; трипсину,эластазе и лейкозиму; трипсину, эластазе и панкреатину; трипсину, эластазе, панкреатину и лейкозиму или трипсину, панкреатину и лейкозиму. В одном из воплощений вариабельный домен представлен на бактериофаге при инкубации в условиях (1) или (2), например в фаговой библиотеке, имеющей размер от 106 до 1013, например от 108 до 1012 репликативных единиц (инфекционных вирионов). В одном из воплощений вариабельный домен специфически связывается с TNFR1 после инкубации в условиях (1) или (2), например при оценке с использованием BiaCore или ELISA (твердофазного иммуноферментного анализа), например фагового ELISA или моноклонального фагового ELISA. В одном из воплощений вариабельные домены по изобретению специфически связываются с белком А или белком L. В одном из воплощений специфическое связывание с белком А или L происходит после инкубации в условиях (1) или (2). В одном из воплощений вариабельные домены по изобретению могут иметь величину OD450 вELISA, например фаговом ELISA или моноклональном фаговом ELISA, по меньшей мере 0,404, например после инкубации в условиях (1) или (2). В одном из воплощений вариабельные домены по изобретению демонстрируют (по существу) единственную полосу при электрофорезе в геле, например после инкубации в условиях (1) или (2). В некоторых воплощениях в изобретении предложен антагонист TNFR1, который представляет собой биспецифический лиганд, содержащий первое dAb по изобретению, связывающее TNFR1, и второеdAb, которое обладает той же самой или отличающейся от первого dAb специфичностью связывания. Второе dAb может связываться с мишенью, выбранной из следующего: АроЕ (аполипопротеин Е), ApoSAA (Аро-сывороточный амилоид А-1), BDNF (нейротрофический фактор головного мозга), кардиотрофин-1, СЕА (карциноэмбриональный антиген), CD40 (кластер дифференцировки 40), лиганд CD40,CD56, CD38, CD138, EGF (эпидермальный фактор роста), рецептор EGF, ENA-78 (эпителиальный нейтрофил-активирующий пептид-78), эотаксин, эотаксин-2, экзодус-2 (exodus-2), FAP (белок активации фибробластов ), кислый FGF (фактор роста фибробластов), основный FGF, фактор роста фибробластов 10, лиганд FLT3 (Fms-подобной тирозинкиназы-3), фракталкин (СХЗС), GDNF (глиальный нейротрофический фактор), G-CSF (колониестимулирующий фактор гранулоцитов), GM-CSF (колониестимулирующий фактор гранулоцитов и макрофагов), GF-1 (фактор роста 1), человеческий сывороточный альбумин, инсулин, IFN- (интерферон-), IGF-I (инсулиноподобный фактор роста I), IGF-II, IL-1 (интерлейкин-1), IL-1, рецептор IL-1, рецептор IL-1 типа 1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8 (72 а.к.), IL-8(77 а.к.), IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18 (IGIF (интерферониндуцирующий фактор, ингибин , ингибин , IP-10 (интерферон-индуцибельный белок 10), фактор роста кератиноцитов-2 (KGF-2), KGF, лептин, LIF (лейкоз-ингибирующий фактор), лимфотактин, вещество, ингибирующее мюллеровы протоки, фактор, ингибирующий колониеобразование моноцитов, белок-аттрактант моноцитов, M-CSF (колониестимулирующий фактор макрофагов), MDC (макрофагальный хемокин) (67 а.к.), MDC (69 а.к.), МСР-1 (моноцитарный хемотаксический фактор-1) (MCAF (моноцитарный хемотаксический и активирующий фактор, МСР-2, МСР-3, МСР-4, MDC (67 а.к.), MDC (69 а.к.), MIG (монокин, индуцируемый IFN-), MIP-1 (макрофагальный белок воспаления 1), MIP-1, MIP-3, MIP-3,MIP-4, фактор-1, ингибирующий миелоидные предшественники (MPIF-1), NAP-2 (нейтрофилактивирующий белок-2), нейртурин, фактор роста нервов (NGF), -NGF, NT-3 (нейротрофин-3), NT-4,онкостатин М, PDGF-AA (тромбоцитарный фактор роста-АА), PDGF-AB, PDGF-BB, PF-4 (тромбоцитарный фактор 4), RANTES (цитокин, экспрессируемый и секретируемый нормальными Т-клетками при активации), SDF1 (фактор-1 стромальных клеток), SDF1, SCF, SCGF (фактор роста стволовых клеток), фактор стволовых клеток (SCF), TARC (хемокин, регулируемый тимусом и при активации), TGF-7 018723(трансформирующий фактор роста ), TGF-, TGF-2, TGF-3, фактор некроза опухолей (TNF), TNF-,TNF-, рецептор I TNF, рецептор II TNF, TNIL-1, ТРО (тромбопоэтин), VEGF (фактор роста сосудистого эндотелия), VEGF A, VEGF В, VEGF С, VEGF D, рецептор 1 VEGF, рецептор 2 VEGF, рецептор 3 VEGF,GCP-2 (гранулоцитарный хемотаксический фактор-2), GRO/MGSA (регулирующий рост онкоген/фактор,стимулирующий рост меланомы), GRO-, GRO-, HCC1 (гемофильтратный СС-хемокин 1), 1-309, HER 1, HER 2, HER 3, HER 4, сывороточный альбумин, vWF (фактор (фон) Виллебранда), амилоидные белки(например, альфа-амилоид), ММР 12 (матриксная металлопротеаза 12), PDK1 (P13K (фосфатидилинозит 3-киназа)-зависимая киназа 1), IgE (иммуноглобулин Е), IL-13Ra1, IL-13Ra2, IL-15, IL-15R, IL-16, IL17R, IL-17, IL-18, IL-18R, IL-23, IL-23R, IL-25, CD2, CD4, CD11a, CD23, CD25, CD27, CD28, CD30,CD40, CD40L, CD56, CD138, ALK5 (активиновый рецептор-подобная киназа 5), EGFR (рецептор эпидермального фактора роста), FcER1 (высокоаффинный рецептор для IgE), TGFb, CCL2 (хемокиновый лиганд-2 с СС-мотивом), CCL18, СЕА, CR8 (цитокин-отвечающие (CR) гены), CTGF (фактор роста соединительной ткани), CXCL12 (хемокиновый лиганд-12 с СХС-мотивом) (SDF-1), химазу, FGF, фурин,эндотелин-1, эотаксины (например, эотаксин, эотаксин-2, эотаксин-3), GM-CSF, ICAM-1 (фактор межклеточной адгезии 1), ICOS (индуцибельный Т-клеточный костимулятор), IgE, IFN, 1-309, интегрины,L-селектин, MIF (фактор, ингибирующий миграцию макрофагов), MIP4, MDC, МСР-1, ММР, эластазу нейтрофилов, остеопонтин, ОХ-40, PARC (легочный хемокин, регулируемый активацией), PD-1 (рецептор апоптоза 1), RANTES, SCF, SDF-1, siglec8 (связывающий сиаловую кислоту иммуноглобулиноподобный лектин 8), TARC, TGFb, тромбин, Tim-1 (семейство Ig и муциновых доменов, член 1), TNF,TRANCE (индуцирующий TNF-ассоциированную активацию цитокин), триптаза, VEGF, VLA-4 (очень поздний антиген-4), VCAM (молекула адгезии сосудистых клеток), 47, CCR2 (хемокиновый рецептор 2 с СС-мотивом), CCR3, CCR4, CCR5, CCR7, CCR8, alphavbeta6, alphavbeta8, сМЕТ, CD8, vWF, амилоидные белки (например, альфа-амилоид), ММР 12, PDK1 и IgE. В одном из примеров обладающий двойной специфичностью лиганд содержит первое dAb, связывающееся с первым эпитопом на TNFR1, и второе dAb, связывающееся с эпитопом на другой мишени. В еще одном примере второе dAb связывается с эпитопом на альбумине сыворотки крови. В других воплощениях лиганд представляет собой мультиспецифический лиганд, который содержит первый эпитопсвязывающий домен, обладающий специфичностью связывания в отношении TNFR1,и по меньшей мере один другой эпитопсвязывающий домен, обладающий специфичностью связывания,отличающейся от первого эпитопсвязывающего домена. Например, первый эпитопсвязывающий домен может представлять собой dAb, связывающее TNFR1, или может представлять собой домен, который содержит CDR из dAb, которое связывает TNFR1 (например, CDR, привитые на подходящем белковом остове или скелете, например аффитело, остов SpA, домен LDL рецептора класса А или домен EGF), или может представлять собой домен, связывающий TNFR1, где домен выбран из аффитела, домена SpA,домена LDL рецептора класса А или домена EGF. В некоторых воплощениях полипептид, антагонист, лиганд или мономер dAb против TNFR1 характеризуется одним или более чем одним из следующего: 1) диссоциирует из человеческого TNFR1 с константой диссоциации (Kd) от 50 нМ до 20 пМ и константой скорости Koff от 510-1 с-1 до 110-7 с-1, как определено при помощи поверхностного плазмонного резонанса; 2) ингибирует связывание фактора некроза опухоли альфа (TNF) с TNFR1 с IC50 (средней ингибирующей концентрацией) от 500 нМ до 50 пМ; 3) нейтрализует человеческий TNFR1 в стандартном анализе на клетках L929 с ND50 (средней нейтрализующей дозой) от 500 нМ до 50 пМ; 4) оказывает антагонистическое действие в отношении активностиTNFR1 в стандартном клеточном анализе с ND50 не более 100 нМ, и в концентрации не более 10 мкМdAb оказывает агонистическое действие в отношении активности TNFR1 не более 5% в анализе; 5) ингибирует летальность в модели септического шока у мышей, вызванного LPS (липополисахарид)/Dгалактозамином; 6) устойчив к агрегации; 7) секретируется в количестве, составляющем по меньшей мере приблизительно 0,5 мг/л при экспрессии в E.coli или в видах Pichia (например, P. pastoris); 8) подвергается обратимому рефолдингу; 9) обладает эффективностью в модели хронического воспалительного заболевания, выбранного из группы, состоящей из модели индуцированного коллагеном артрита у мышей, модели ARE артрита у мышей, модели ARE воспалительного заболевания кишечника у мышей,модели воспалительного заболевания кишечника, индуцированного натрия декстрансульфатом, модели вызванного табачным дымом хронического обструктивного заболевания легких у мышей и подходящих моделей у приматов (например, модели индуцированного коллагеном артрита у приматов); и/или 10) обладает эффективностью в лечении, подавлении или профилактике хронического воспалительного заболевания. Ссылка на WO 2006038027 в отношении подробной информации относительно анализов и тестов, и параметров, применяемых для условий (1)-(10), и она включена здесь путем ссылки. В конкретных воплощениях полипептид, антагонист, лиганд или мономер dAb диссоциирует из человеческого TNFR1 с константой диссоциации (Kd) от 50 нМ до 20 пМ и константой скорости Koff от 510-1 до 110-7 с-1, как определено при помощи поверхностного плазмонного резонанса; ингибирует связывание фактора некроза опухоли альфа (TNF) с TNFR1 с IC50 от 500 нМ до 50 пМ и нейтрализует человеческий TNFR1 в стандартном анализе на клетках L929 с ND50 от 500 нМ до 50 пМ. В других кон-8 018723 кретных воплощениях полипептид, антагонист, лиганд или мономер dAb диссоциирует из человеческогоTNFR1 с константой диссоциации (Kd) от 50 нМ до 20 пМ и константой скорости Koff от 510-1 до 110-7 с-1; ингибирует связывание фактора некроза опухоли альфа (TNF) c TNFR1 с IC50 от 500 нМ до 50 пМ и обладает эффективностью в модели хронического воспалительного заболевания, выбранного из группы, состоящей из модели индуцированного коллагеном артрита у мышей, ARE модели артрита у мышей, ARE модели воспалительного заболевания кишечника у мышей, модели воспалительного заболевания кишечника, индуцированного натрия декстрансульфатом, модели вызванного табачным дымом хронического обструктивного заболевания легких у мышей и подходящих моделей у приматов (например, модели индуцированного коллагеном артрита у приматов). В других конкретных воплощениях полипептид, антагонист, лиганд или мономер dAb диссоциирует из человеческого TNFR1 с константой диссоциации (Kd) от 50 нМ до 20 пМ и константой скорости Koff от 510-1 до 110-7 с-1, как определено при помощи поверхностного плазмонного резонанса; нейтрализует человеческий TNFR1 в стандартном анализе на клетках L929 с ND50 от 500 нМ до 50 пМ и оказывает антагонистическое действие в отношении активности TNFR1 в стандартном клеточном анализе с ND50 не более 100 нМ, и в концентрации не более 10 мкМ dAb оказывает агонистическое действие в отношении активности TNFR1 не более 5% в анализе. Протеазоустойчивые полипептиды, иммуноглобулиновые единичные вариабельные домены и антагонисты по изобретению обладают полезностью в терапии, профилактике и диагностике заболевания или состояний у млекопитающих, например людей. В частности, они обладают полезностью в качестве основы лекарств, которые вероятно сталкиваются с протеазами при введении пациенту, такому как человек. Например, при введении в ЖК тракт (например, при пероральном, сублингвальном, ректальном введении), в этом случае полипептиды, единичные вариабельные домены иммуноглобулина и антагонисты могут быть подвергнуты воздействию протеазы в одном или более чем одном из следующего: верхний отдел ЖК тракта, нижний отдел ЖК тракта, рот, желудок, тонкий кишечник и толстая кишка. Таким образом, в одном из воплощений предложен протеазоустойчивый полипептид, единичный вариабельный домен иммуноглобулина или антагонист, вводимый перорально, сублингвально или ректально в ЖК тракт пациента для лечения и/или профилактики заболевания или состояния у пациента. Например, пероральное введение пациенту (например, пациенту человеку) для лечения и/или профилактики опосредованного TNF состояния или заболевания, такого как артрит (например, ревматоидный артрит), IBD,псориаз или болезнь Крона. В еще одном примере полипептид, вариабельный домен или антагонист вероятно сталкивается с протеазой при введении (например, путем ингаляции или интраназально) в легочную ткань (например, легкое или дыхательные пути). Таким образом, в одном из воплощений предложено введение пациенту (например, человеку) протеазоустойчивого полипептида, единичного вариабельного домена иммуноглобулина или антагониста путем ингаляции или интраназально в легочную ткань пациента для лечения и/или профилактики заболевания или состояния у пациента. Такое состояние может представлять собой астму (например, аллергическую астму), COPD (хроническое обструктивное заболевание легких), грипп или любое другое легочное заболевание или состояние, раскрытое вWO 2006038027, включенной здесь путем ссылки. В еще одном примере полипептид, вариабельный домен или антагонист вероятно сталкивается с протеазой при введении (например, при помощи внутриглазной инъекции или в виде глазных капель) в глаз пациента. Таким образом, в одном из воплощений предложено глазное введение пациенту (например, человеку) протеазоустойчивого полипептида, единичного вариабельного домена иммуноглобулина или антагониста для лечения у пациента и/или профилактики заболевания или состояния (например, заболевания или состояния глаз). Введение может представлять собой местное введение в глаз, в форме глазных капель или путем инъекции в глаз, например в стекловидное тело глаза. Антагонисты, полипептиды и иммуноглобулиновые единичные вариабельные домены по изобретению могут демонстрировать улучшенные или относительно высокие температуры плавления (Tm), обеспечивая улучшенную стабильность. Высокоаффинное связывание с мишенью может также или альтернативно представлять собой свойство антагонистов, полипептидов и вариабельных доменов. Одно или более чем одно из этих свойств, комбинированное с устойчивостью к протеазе, делает антагонисты, вариабельные домены и полипептиды пригодными для применения в качестве лекарственных средств у млекопитающих, таких как люди, где, вероятно, сталкиваются с протеазами, например для введения в ЖК тракт или легочную ткань. Таким образом, в одном из аспектов в изобретении предложен антагонист TNFR1 для пероральной доставки. В одном из аспектов в изобретении предложен антагонист TNFR1 для доставки в ЖК тракт пациента. В одном из аспектов в изобретении предложено применение антагониста TNFR1 в изготовлении лекарственного средства для пероральной доставки. В одном из аспектов в изобретении предложено применение антагониста TNFR1 в изготовлении лекарственного средства для доставки в ЖК тракт пациента. В одном из воплощений вариабельный домен устойчив к трипсину и/или по меньшей мере одной другой протеазе, выбранной из эластазы, лейкозима и панкреатина. Например, устойчивость представляет собой устойчивость к трипсину и эластазе; трипсину и лейкозиму; трипсину и панкреатину; трипсину,-9 018723 эластазе и лейкозиму; трипсину, эластазе и панкреатину; трипсину, эластазе, панкреатину и лейкозиму; или трипсину, панкреатину и лейкозиму. В одном из аспектов в изобретении предложен антагонист TNFR1 для легочной доставки. В одном из аспектов в изобретении предложен антагонист TNFR1 для доставки в легкое пациента. В одном из аспектов в изобретении предложено применение антагониста TNFR1 в изготовлении лекарственного средства для легочной доставки. В одном из аспектов в изобретении предложено применение антагониста TNFR1 в изготовлении лекарственного средства для доставки в легкое пациента. В одном из воплощений вариабельный домен устойчив к лейкозиму. В одном из аспектов в изобретении предложен способ пероральной доставки или доставки лекарственного средства в ЖК тракт пациента или в легкое или легочную ткань пациента, который включает введение пациенту фармацевтически эффективного количества антагониста TNFR1 по изобретению. В одном из аспектов в изобретении предложен антагонист TNFR1 по изобретению для лечения и/или профилактики воспалительного состояния. В одном из аспектов в изобретении предложено применение антагониста TNFR1 в изготовлении лекарственного средства для лечения и/или профилактики воспалительного состояния. В одном из воплощений состояние выбрано из группы, состоящей из артрита, рассеянного склероза, воспалительного заболевания кишечника и хронического обструктивного заболевания легких. Например, указанный артрит представляет собой ревматоидный артрит или юношеский ревматоидный артрит. Например, указанное воспалительное заболевание кишечника выбрано из группы,состоящей из болезни Крона и неспецифического язвенного колита. Например, указанное хроническое обструктивное заболевание легких выбрано из группы, состоящей из хронического бронхита, хронического обструктивного бронхита и эмфиземы. Например, указанная пневмония представляет собой бактериальную пневмонию. Например, указанная бактериальная пневмония представляет собой стафилококковую пневмонию. В одном из аспектов в изобретении предложен антагонист TNFR1 для лечения и/или профилактики респираторного заболевания. В одном из аспектов в изобретении предложено применение антагонистаTNFR1 в изготовлении лекарственного средства для лечения и/или профилактики респираторного заболевания. Например, указанное респираторное заболевание выбрано из группы, состоящей из воспаления легких, хронического обструктивного заболевания легких, астмы, пневмонии, гиперчувствительного пневмонита, легочного инфильтрата с эозинофилией, легочного заболевания вследствие факторов окружающей среды, пневмонии, бронхоэктаза, муковисцидоза, интерстициального легочного заболевания,первичной легочной гипертензии, легочной тромбоэмболии, расстройств плевры, расстройств средостения, расстройств диафрагмы, гиповентиляции, гипервентиляции, приступов апноэ во сне, острого респираторного дистресс-синдрома, мезотелиомы, саркомы, отторжения трансплантата, заболевания трансплантат против хозяина, рака легкого, аллергического ринита, аллергии, асбестоза, аспергилломы, аспергиллоза, бронхоэктаза, хронического бронхита, эмфиземы, эозинофильной пневмонии, идиопатического легочного фиброза, инвазивного пневмококкового заболевания, гриппа, нетуберкулезных микобактерий,плеврального выпота, пневмокониоза, пневмоцитоза, пневмонии, легочного актиномикоза, легочного альвеолярного протеиноза, легочной формы сибирской язвы, отека легких, легочной эмболии, воспаления легких, легочного гистиоцитоза X, легочной гипертензии, легочного нокардиоза, легочного туберкулеза, легочного венозно-окклюзионного заболевания, ревматоидного легочного заболевания, саркоидоза и гранулематоза Вегенера. Например, заболевание представляет собой хроническое обструктивное заболевание легких (COPD). Например, заболевание представляет собой астму. Антагонист по изобретению, содержащий агент, который ингибирует TNFR1 (например, когда агент выбран из группы, состоящей из фрагментов антитела (например, Fab фрагмент, Fab' фрагмент, Fv фрагмент (например, scFv, связанный дисульфидными связями Fv), F(ab')2 фрагмент, dAb), лигандов и мономеров и мультимеров (например, гомо- или гетеродимеров) dAb, может быть введен локально в легочную ткань (например, легкое) субъекта с использованием любого подходящего способа. Например,агент может быть введен локально в легочную ткань путем ингаляции или интраназального введения. Для ингаляции или интраназального введения антагонист TNFR1 может быть введен с использованием распылителя, ингалятора, пульверизатора, аэрозоля, атомайзера, сухого порошкового ингалятора, ингалятора отмеренной дозы, распылителя отмеренной дозы, атомайзера отмеренной дозы, пульверизатора отмеренной дозы или другого подходящего ингалятора или устройства для интраназальной доставки. Таким образом, в одном из воплощений изобретения предложено устройство для легочной доставки, содержащее антагонист TNFR1. В одном из воплощений устройство представляет собой ингалятор или устройство для интраназальной доставки. В одном из аспектов в изобретении предложена композиция для перорального введения, содержащая антагонист TNFR1. Композиция может представлять собой таблетку, пилюлю, капсулу, жидкость или сироп. В одном из воплощений в изобретении предложена легочная композиция для доставки в легкое, которая содержат антагонист, полипептид или вариабельный домен по изобретению с частицами, размер которых составляет меньше 5 мкм, например меньше 4,5, 4, 3,5 или 3 мкм (например, в буфере БриттонаРобинсона, например при рН 6,5-8,0, например при рН 7-7,5, например при рН 7 или 7,5). В одном из воплощений предложены препараты и композиции по изобретению при рН от 6,5 до 8,0,например от 7 до 7,5, например 7, например 7,5. Вариабельные домены в соответствии с любым из аспектов изобретения могут иметь Tm по меньшей мере 50 С, или по меньшей мере 55 С, или по меньшей мере 60 С, или по меньшей мере 65 С, или по меньшей мере 70 С. Антагонист, применение, способ, устройство или композиция по изобретению может содержать такой вариабельный домен. В одном из аспектов изобретения полипептиды, вариабельные домены, антагонисты, композиции или препараты по изобретению, по существу, стабильны после инкубации (в концентрации полипептида или вариабельного домена 1 мг/мл) при 37-50 С в течение 14 суток в буфере Бриттона-Робинсона. В одном из воплощений по меньшей мере 65, 70, 75, 80, 85, 86, 87, 88, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% полипептида, антагониста или вариабельного домена остаются неагрегированными после такой инкубации при 37 С. В одном из воплощений по меньшей мере 65, 70, 75, 80, 85, 86, 87, 88, 90, 91, 92, 93, 94, 95,96, 97, 98, 99% полипептида или вариабельного домена остаются мономерными после такой инкубации при 37 С. В одном из воплощений по меньшей мере 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75,80, 85, 86, 87, 88, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% полипептида, антагониста или вариабельного домена остаются неагрегированными после такой инкубации при 50 С. В одном из воплощений по меньшей мере 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 86, 87, 88, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96,97, 98, 99% полипептида или вариабельного домена остаются мономерными после такой инкубации при 50 С. В одном из воплощений после любой из таких инкубаций не обнаружена агрегация полипептидов,вариабельных доменов, антагонистов. В одном из воплощений pI полипептида или вариабельного домена остается не измененной или по существу неизменной после инкубации при 37 С при концентрации полипептида или вариабельного домена 1 мг/мл в буфере Бриттона-Робинсона. В одном из аспектов изобретения полипептиды, вариабельные домены, антагонисты, композиции или препараты по изобретению, по существу, стабильны после инкубации (при концентрации полипептида или вариабельного домена 100 мг/мл) при 4 С в течение 7 суток в буфере Бриттона-Робинсона при рН 7-7,5 (например, при рН 7 или 7,5). В одном из воплощений по меньшей мере 95, 95,5, 96, 96,5, 97,97,5, 98, 98,5, 99 или 99,5% полипептида, антагониста или вариабельного домена остаются неагрегированными после такой инкубации. В одном из воплощений по меньшей мере 95, 95,5, 96, 96,5, 97, 97,5, 98, 98,5, 99 или 99,5% полипептида или вариабельного домена остаются мономерными после такой инкубации. В одном из воплощений после любой из таких инкубаций не обнаружена агрегация полипептидов, вариабельных доменов,антагонистов. В одном из аспектов изобретения полипептиды, вариабельные домены, антагонисты, композиции или препараты по изобретению, по существу, стабильны после распыления (при концентрации полипептида или вариабельного домена 40 мг/мл), например, при комнатной температуре, 20 или 37 С, в течение 1 ч, например в струйном распылителе, например Pari LC+ cup. В одном из воплощений по меньшей мере 65, 70, 75, 80, 85, 86, 87, 88, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 95,5, 96, 96,5, 97, 97,5, 98, 98,5, 99 или 99,5% полипептида, антагониста или вариабельного домена остаются неагрегированными после такого распыления. В одном из воплощений по меньшей мере 65, 70, 75, 80, 85, 86, 87, 88, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 95,5, 96, 96,5,97, 97,5, 98, 98,5, 99 или 99,5% полипептида или вариабельного домена остаются мономерными после такого распыления. В одном из воплощений после любого из таких распылений не обнаружена агрегация полипептидов, вариабельных доменов, антагонистов. Вариабельные домены по любому из аспектов изобретения могут нейтрализовать стимулируемоеTNF высвобождение IL-8 в анализе на клетках MRC-5 с ND50 от 2 нМ до 50 пМ. Антагонист, применение, способ, устройство или препарат по изобретению может содержать такой вариабельный домен. В одном из аспектов в изобретении предложена выделенная или рекомбинантная нуклеиновая кислота, кодирующая полипептид, содержащий иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен по любому из аспектов изобретения, или кодирующая полипептид, антагонист или вариабельный домен по любому из аспектов изобретения. В одном из аспектов в изобретении предложен вектор, содержащий эту нуклеиновую кислоту. В одном из аспектов в изобретении предложена клетка-хозяин, содержащая нуклеиновую кислоту или вектор. В одном из аспектов в изобретении предложен способ продуцирования полипептида, содержащего иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен, который включает поддержание клетки-хозяина в условиях, подходящих для экспрессии указанной нуклеиновой кислоты или вектора, посредством чего продуцируется полипептид, содержащий иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен. Способ может дополнительно включать выделение полипептида, вариабельного домена или антагониста и возможно продуцирование варианта, например мутантного варианта, обладающего улучшенной аффинностью и/или ND50 по сравнению с выделенным полипептидом, вариабельным доменом или антагонистом. В области техники известны способы улучшения аффинности связывания иммуноглобулинового единичного вариабельного домена, например способы созревания аффинности. В одном из аспектов в изобретении предложена фармацевтическая композиция, содержащая иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен, полипептид или антагонист по любому из аспектов изобретения, и фармацевтически приемлемый носитель, эксципиент или разбавитель. В одном из воплощений иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен или антагонист по любому из аспектов изобретения содержит константный домен антитела, например Fc антитела, возможно, где N-конец Fc связан (возможно непосредственно связан) с С-концом вариабельного домена. Полипептид или вариабельный домен по изобретению может быть выделенным и/или рекомбинантным. Здесь описан способ селекции протеазоустойчивого пептида или полипептида. Способ включает получение репертуара пептидов или полипептидов, объединение репертуара и протеазы в условиях, подходящих для протеазной активности, и выделение пептида или полипептида, обладающего желаемой биологической активностью (например, специфическим связыванием с TNFR1), посредством чего выбирают протеазоустойчивый пептид или полипептид. Репертуар и протеазу, как правило, инкубируют в течение периода времени, составляющего по меньшей мере приблизительно 30 мин. В способе может быть использована любая желаемая протеаза,такая как одна или более чем одна из следующих: сериновая протеаза, цистеиновая протеаза, аспартатпротеазы, тиоловые протеазы, матриксная металлопротеиназа, карбоксипептидаза (например, карбоксипептидаза А, карбоксипептидаза В), трипсин, химотрипсин, пепсин, папаин, эластаза, лейкозим, панкреатин, тромбин, плазмин, катепсины (например, катепсин G), протеиназа (например, протеиназа 1, протеиназа 2, протеиназа 3), термолизин, химозин, энтеропептидаза, каспаза (например, каспаза 1, каспаза 2,каспаза 4, каспаза 5, каспаза 9, каспаза 12, каспаза 13), калпаин, фикаин, клострипаин, актинидаин, бромелаин и сепараза. В конкретных воплощениях протеаза представляет собой трипсин, эластазу или лейкозим. Протеаза также может также содержаться в биологическом экстракте, биологическом гомогенате или биологическом препарате. Если желательно, способ дополнительно включает добавление ингибитора протеазы к комбинации репертуара и протеазы после завершения инкубирования. В некоторых воплощениях пептид или полипептид, обладающий желаемой биологической активностью, выделяют на основе связывающей активностью. Например, пептид или полипептид может быть выделен на основе связывания общего лиганда, такого как белок А, белок G или белок L. Связывающая активность может также представлять собой специфическое связывание с целевым лигандом. Примеры целевых лигандов включают АроЕ, Apo-SAA, BDNF, кардиотрофин-1, СЕА, CD40, лиганд CD40, CD56,CD38, CD138, EGF, EGF рецептор, ENA-78, эотаксин, эотаксин-2, Exodus-2, FAP, кислый FGF, основной FGF, фактор роста фибробластов-10, лиганд FLT3, фракталкин (СХЗС), GDNF, G-CSF, GM-CSF, GF1, человеческий альбумин сыворотки крови, инсулин, IFN-, IGF-I, IGF-II, IL-1, IL-1, рецептор IL-1,рецептор IL-1 тип 1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8 (72 а.к.), IL-8 (77 а.к.), IL-9, IL-10, IL-11, IL-12,IL-13, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18 (IGKF), ингибин , ингибин , IP-10, фактор роста кератиноцитов-2(KGF-2), KGF, лептин, LIF, лимфотацин, ингибирующее вещество Mullerian, моноцитарный колониеингибирующий фактор, белок-аттрактант моноцитов, M-CSF, MDC (67 а.к.), MDC (69 а.к.), МСР-1 (MCAF),МСР-2, МСР-3, МСР-4, MDC (67 а.к.), MDC (69 а.к.), MIG, MIP-1, MIP-1, MIP-3, MIP-3, MIP-4,миелоидный предшественник ингибирующего фактора-1 (MPIF-1), NAP-2, неуртурин, фактор роста нервов, -NGF, NT-3, NT-4, онкостатин М, PDGF-AA, PDGF-AB, PDGF-BB, PF-4, RANTES, SDF1, SDF1,SCF, SCGF, фактор стволовых клеток (SCF), TARC, TGF-, TGF-, TGF-2, TGF-3, фактор некроза опухоли (TNF), TNF-, TNF-, TNF рецептор I, TNF рецептор II, TNIL-1, TPO, VEGF, VEGF A, VEGF B,VEGF C, VEGF D, VEGF рецептор 1, VEGF рецептор 2, VEGF рецептор 3, GCP-2, GRO/MGSA, GRO-,GRO-, HCC1, 1-309, HER 1, HER 2, HER 3, HER 4, альбумин сыворотки крови, vWF, амилоидные белки(например, амилоид альфа), ММР 12, PDK1, IgE, IL-13R1, IL-13Ra2, IL-15, IL-15R, IL-16, IL-17R, IL-17,IL-18, IL-18R, IL-23 IL-23R, IL-25, CD2, CD4, CD11a, CD23, CD25, CD27, CD28, CD30, CD40, CD40L,CD56, CD138, ALK5, EGFR, FcER1, TGFb, CCL2, CCL18, CEA, CR8, CTGF, CXCL12 (SDF-1), химаза,FGF, фурин, эндотелин-1, эотаксины (например, эотаксин, эотаксин-2, эотаксин-3), GM-CSF, ICAM-1,ICOS, IgE, IFNa, I-309, интегрины, L-селектин, MIF, MIP4, MDC, МСР-1, ММР, эластазу нейтрофилов,остеопонтин, ОХ-40, PARC, PD-1, RANTES, SCF, SDF-1, siglec8, TARC, TGFb, тромбин, Tim-1, TNF,TRANCE, триптазу, VEGF, VLA-4, VCAM, 47, CCR2, CCR3, CCR4, CCR5, CCR7, CCR8, alphavbeta6,alphavbeta8, cMET, CD8, vWF, амилоидные белки (например, амилоид альфа), ММР 12, PDK1 и IgE. В конкретных воплощениях пептид или полипептид выделяют путем пэннинга. В некоторых воплощениях репертуар включает дисплейную систему. Например, дисплейная система может представлять собой бактериофаговый дисплей, рибосомальный дисплей, эмульсионную компартментализацию и дисплей, дрожжевой дисплей, пуромициновый дисплей, бактериальный дисплей,плазмидный дисплей или ковалентный дисплей. Дисплейные системы связывают кодирующую функцию нуклеиновой кислоты и функциональные характеристики пептида или полипептида, кодируемого нуклеиновой кислотой. В конкретных воплощениях система дисплея включает реплицируемые генетические комплексы. В некоторых воплощениях система дисплея включает бактериофаговый дисплей. Например, бактериофаг может представлять собой fd, M13, лямбда, MS2 или Т 7. В конкретных воплощениях система бактериофагового дисплея является мультивалентной. В некоторых воплощениях пептид или полипеп- 12018723 тид экспонируется в виде слитого белка pIII. В других воплощениях способ дополнительно включает амплификацию нуклеиновой кислоты, кодирующей пептид или полипептид, обладающий желаемой биологической активностью. В конкретных воплощениях нуклеиновая кислота амплифицируется путем амплификации фага, роста клеток или полимеразной цепной реакции. В некоторых воплощениях репертуар представляет собой репертуар иммуноглобулиновых единичных вариабельных доменов. В конкретных воплощениях иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен представляет собой вариабельный домен тяжелой цепи. В конкретных воплощениях вариабельный домен тяжелой цепи представляет собой вариабельный домен тяжелой цепи человеческого иммуноглобулина. В других воплощениях иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен представляет собой вариабельный домен легкой цепи. В конкретных воплощениях вариабельный домен легкой цепи представляет собой вариабельный домен легкой цепи человеческого иммуноглобулина. В еще одном аспекте предложен способ селекции пептида или полипептида, связывающего целевой лиганд (например, TNFR1) с высокой аффинностью, из репертуара пептидов или полипептидов. Способ включает получение репертуара пептидов или полипептидов, объединение этого репертуара и протеазы в условиях, подходящих для протеазной активности, и выделение пептида или полипептида, связывающих целевой лиганд. Репертуар и протеазу, как правило, инкубируют в течение периода, составляющего по меньшей мере приблизительно 30 мин. В способе может быть использована любая желаемая протеаза, такая как одна или более чем одна из следующих: сериновая протеаза, цистеиновая протеаза, аспартатпротеазы, тиоловые протеазы, матриксная металлопротеиназа, карбоксипептидаза (например, карбоксипептидаза А, карбоксипептидаза В), трипсин, химотрипсин, пепсин, папаин, эластаза, лейкозим, панкреатин, тромбин,плазмин, катепсины (например, катепсин G), протеиназа (например, протеиназа 1, протеиназа 2, протеиназа 3), термолизин, химозин, энтеропептидаза, каспаза (например, каспаза 1, каспаза 2, каспаза 4, каспаза 5, каспаза 9, каспаза 12, каспаза 13), калпаин, фикаин, клострипаин, актинидаин, бромелаин и сепараза. В конкретных воплощениях протеаза представляет собой трипсин, эластаза или лейкозим. Протеаза может также содержаться в биологическом экстракте, биологическом гомогенате или биологическом препарате. Если желательно, способ дополнительно включает добавление ингибитора протеазы к комбинации репертуара и протеазы после завершения инкубации. Пептид или полипептид может быть выделен на основе связывания любого желаемого целевого лиганда, такого как раскрытые здесь целевые лиганды (например, TNFR1). В конкретных воплощениях пептид или полипептид выделяют путем пэннинга. В некоторых воплощениях репертуар содержит дисплейную систему. Например, система дисплея может представлять собой бактериофаговый дисплей, рибосомальный дисплей, эмульсионную компартментализацию и дисплей, дрожжевой дисплей, пуромициновый дисплей, бактериальный дисплей, плазмидный дисплей или ковалентный дисплей. Дисплейные системы связывают кодирующую функцию нуклеиновой кислоты и функциональные характеристики пептида или полипептида, кодируемого нуклеиновой кислотой. В конкретных воплощениях дисплейная система содержит реплицируемые генетические комплексы. В некоторых воплощениях дисплейная система содержит бактериофаговый дисплей. Например,бактериофаг может представлять собой fd, M13, лямбда, MS2 или Т 7. В конкретных воплощениях система бактериофагового дисплея является мультивалентной. В некоторых воплощениях пептид или полипептид экспонируется в виде слитого белка pIII. В других воплощениях способ дополнительно включает амплификацию нуклеиновой кислоты, кодирующей пептид или полипептид, которые обладают желаемой биологической активностью. В конкретных воплощениях нуклеиновая кислота амплифицируется посредством фаговой амплификации, роста клеток или полимеразной цепной реакции. В некоторых воплощениях репертуар представляет собой репертуар иммуноглобулиновых единичных вариабельных доменов. В конкретных воплощениях иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен представляет собой вариабельный домен тяжелой цепи. В конкретных воплощениях вариабельный домен тяжелой цепи представляет собой вариабельный домен тяжелой цепи человеческого иммуноглобулина. В других воплощениях иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен представляет собой вариабельный домен легкой цепи. В конкретных воплощениях вариабельный домен легкой цепи представляет собой вариабельный домен легкой цепи человеческого иммуноглобулина. В еще одном аспекте здесь описан способ продуцирования репертуара протеазоустойчивых пептидов или полипептидов. Способ включает получение репертуара пептидов или полипептидов, объединение репертуара пептидов или полипептидов и протеазы в условиях, подходящих для активности протеазы, и выделение множества пептидов или полипептидов, обладающих желаемой биологической активностью, посредством чего продуцируется репертуар протеазоустойчивых пептидов или полипептидов. В некоторых воплощениях репертуар и протеазу инкубируют в течение периода времени по меньшей мере приблизительно 30 мин. Например, протеаза, используемая в способе, может представлять собой одну или более чем одну из следующих: сериновая протеаза, цистеиновая протеаза, аспартатпротеа- 13018723 зы, тиоловые протеазы, матриксная металлопротеиназа, карбоксипептидаза (например, карбоксипептидаза А, карбоксипептидаза В), трипсин, химотрипсин, пепсин, папаин, эластаза, лейкозим, панкреатин,тромбин, плазмин, катепсины (например, катепсин G), протеиназа (например, протеиназа 1, протеиназа 2, протеиназа 3), термолизин, химозин, энтеропептидаза, каспаза (например, каспаза 1, каспаза 2, каспаза 4, каспаза 5, каспаза 9, каспаза 12, каспаза 13), калпаин, фикаин, клострипаин, актинидаин, бромелаин и сепараза. В конкретных воплощениях протеаза представляет собой трипсин, эластазу или лейкозим. Протеаза может также быть представлена в биологическом экстракте, биологическом гомогенате или биологическом препарате. Если желательно, то способ дополнительно включает добавление ингибитора протеазы к комбинации репертуара и протеазы после завершения инкубации. В некоторых воплощениях множество пептидов или полипептидов, обладающих желаемой биологической активностью, выделяют на основе связывающей активности. Например, множество пептидов или полипептидов может быть выделено на основе связывания типичного лиганда, такого как белок А,белок G или белок L. Связывающая активность может также представлять собой специфическое связывание с лигандом-мишенью, таким как описанный здесь лиганд. В конкретных воплощениях множество пептидов или полипептидов, обладающих желаемой биологической активностью, выделяют путем пэннинга. В некоторых воплощениях репертуар содержит дисплейную систему. Например, дисплейная система может представлять собой бактериофаговый дисплей, рибосомальный дисплей, эмульсионную компартментализацию и дисплей, дрожжевой дисплей, пуромициновый дисплей, бактериальный дисплей, плазмидный дисплей или ковалентный дисплей. В конкретных воплощениях система дисплея связывает кодирующую функцию нуклеиновой кислоты и функциональные характеристики пептида или полипептида, кодируемого нуклеиновой кислотой. В конкретных воплощениях дисплейная система содержит реплицируемые генетические комплексы. В некоторых воплощениях дисплейная система содержит бактериофаговый дисплей. Например,бактериофаг может представлять собой fd, M13, лямбда, MS2 или T7. В конкретных воплощениях система бактериофагового дисплея является многовалентной. В некоторых воплощениях пептид или полипептид экспонируется в виде слитого белка pIII. В других воплощениях способ дополнительно включает амплификацию нуклеиновых кислот, кодирующих множество пептидов или полипептидов, обладающих желаемой биологической активностью. В конкретных воплощениях нуклеиновые кислоты амплифицируются путем фаговой амплификации, роста клеток или полимеразной цепной реакции. В некоторых воплощениях репертуар представляет собой репертуар иммуноглобулиновых единичных вариабельных доменов. В конкретных воплощениях иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен представляет собой вариабельный домен тяжелой цепи. В конкретных воплощениях вариабельный домен тяжелой цепи представляет собой вариабельный домен тяжелой цепи человеческого иммуноглобулина. В других воплощениях иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен представляет собой вариабельный домен легкой цепи. В конкретных воплощениях вариабельный домен легкой цепи представляет собой вариабельный домен легкой цепи человеческого иммуноглобулина. В еще одном аспекте здесь описан способ селекции из репертуара протеазоустойчивого полипептида, содержащего иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен (dAb), который связывает целевой лиганд (например, TNFR1). В одном из воплощений способ включает получение системы фагового дисплея, содержащей репертуар полипептидов, содержащих иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен, объединение системы фагового дисплея и протеазы, выбранной из группы, состоящей из эластазы, лейкозима и трипсина, в условиях, подходящих для протеазной активности, и выделение фага,экспонирующего полипептид, содержащий иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен, который связывает целевой лиганд. В некоторых воплощениях протеазу используют в концентрации 100 мкг/мл, и объединенные систему фагового дисплея и протеазу инкубируют приблизительно при 37 С в течение ночи. В некоторых воплощениях фаг, экспонирующий полипептид, содержащий иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен, который связывает целевой лиганд, выделяют путем связывания с указанной мишенью. В других воплощениях фаг, который экспонирует полипептид, содержащий иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен, который связывает целевой лиганд, выделяют путем пэннинга. Также описан выделенный протеазоустойчивый пептид или полипептид, селектируемый или селектированный при помощи описанных здесь способов. В конкретном воплощении предложен выделенный протеазоустойчивый (например, к трипсину, эластазе, лейкозиму) иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен (например, вариабельный домен тяжелой цепи человеческого антитела, вариабельный домен легкой цепи человеческого антитела), селектируемый или селектированный при помощи описанных здесь способов. Далее здесь описаны выделенная или рекомбинантная нуклеиновая кислота, которая кодирует протеазоустойчивый пептид или полипептид (например, устойчивый к трипсину, эластазе, или лейкозиму иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен), селектируемый или селектированный при по- 14018723 мощи описанных здесь способов, и вектора (например, экспрессирующие вектора) и клетки-хозяева, содержащие эти нуклеиновые кислоты. Здесь далее описан способ получения протеазоустойчивого пептида или полипептида (например,устойчивого к трипсину, эластазе или лейкозиму иммуноглобулинового единичного вариабельного домена), селектируемого или селектированного при помощи описанных здесь способов, включающий поддержание клетки-хозяина, которая содержит рекомбинантную нуклеиновую кислоту, кодирующую протеазоустойчивый пептид или полипептид, в условиях, подходящих для экспрессии, посредством чего продуцируется протеазоустойчивый пептид или полипептид. Здесь дополнительно описан протеазоустойчивый пептид или полипептид (например, устойчивый к трипсину, эластазе или лейкозиму иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен), селектируемый или селектированный при помощи описанных здесь способов, для применения в медицине (например, для терапии или диагностики). Здесь дополнительно описано применение протеазоустойчивого пептида или полипептида (например, устойчивого к трипсину, эластазе или лейкозиму иммуноглобулинового единичного вариабельного домена), селектируемого или селектированного при помощи описанных здесь способов, для изготовления лекарственного средства для лечения заболевания. Здесь дополнительно описан способ лечения заболевания, включающий введение нуждающемуся в этом субъекту эффективного количества протеазоустойчивого пептида или полипептида (например, устойчивого к трипсину,эластазе или лейкозиму иммуноглобулинового единичного вариабельного домена), селектируемого или селектированного при помощи описанных здесь способов. Здесь дополнительно описан диагностический набор для определения того, присутствует ли в образце TNFR1 или насколько много TNFR1 присутствует в образце, содержащий полипептид, иммуноглобулиновый вариабельный домен (dAb) или антагонист по изобретению и инструкции по применению(например, для определения присутствия и/или количества TNFR1 в образце). В некоторых воплощениях набор дополнительно содержит один или более чем один вспомогательный реагент, такой как подходящий буфер или подходящий детектирующий реагент (например, детектируемое меченое антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, который связывает полипептид или dAb по изобретению или группировку, ассоциированную или конъюгированную с ним). Изобретение также относится к устройству, содержащему твердую поверхность, на которой иммобилизован полипептид, антагонист или dAb по изобретению, таким образом, что иммобилизованный полипептид или dAb связывается с TNFR1. Могут быть использованы любые подходящие твердые поверхности, на которых может быть иммобилизовано антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, например стекло, пластики, углеводороды (например, агарозные шарики). Если желательно, подложка может содержать или может быть модифицирована таким образом, чтобы содержать желаемые функциональные группы для облегчения иммобилизации. Устройство и/или подложка могут обладать любой подходящей формой, например формой листа, прута, ленты, пластины, слайда, шарика, гранулы, диска,геля, трубки, сферы, чипа, пластины или чашки и т.п. В некоторых воплощениях устройство представляет собой тест-полоску. Краткое описание графических материалов Фиг. 1 представляет собой иллюстрацию сайта множественного клонирования pDOM13 (также известного как pDOM33), который использовали для получения фаг-дисплейного репертуара. На фиг. 2 показаны несколько гелей Novex 10-20% Tricine с образцами dAb, отобранными в разные моменты времени, которые инкубировали с трипсином в концентрации 40 мкг/мл при 30 С. Образцы отбирали непосредственно перед добавлением трипсина и затем через 1, 3 и 24 ч после добавления трипсина. Белки окрашивали с помощью 1 SureBlue. Гели иллюстрируют, что и DOM15-10, и DOM15-26501, оба, подвергались значительному перевариванию в течение первых 3 ч инкубации с трипсином. Переваривание DOM15-26, DOM4-130-54 и DOM1h-131-511 становилось заметным только через 24 ч инкубации с трипсином. Фиг. 3 представляет собой иллюстрацию аминокислотных последовательностей DOM1h-131-511 и 24 селектированных вариантов. Аминокислоты в селектированных клонах, которые отличаются от родительской последовательности, указаны (идентичные аминокислоты обозначены точками). Петли, соответствующие CDR1 (гипервариабельный участок 1), CDR2 и CDR3, обведены рамками. Фиг. 4 представляет собой иллюстрацию аминокислотных последовательностей DOM4-130-54 и 27 селектированных вариантов. Аминокислоты в селектированных клонах, которые отличаются от родительской последовательности, указаны (идентичные аминокислоты обозначены точками). Петли, соответствующие CDR1, CDR2 и CDR3, обведены рамками. Фиг. 5 представляет собой иллюстрацию аминокислотной последовательности DOM15-26-555 и 21 селектированного варианта. Аминокислоты в селектированных клонах, которые отличаются от родительской последовательности, указаны (идентичные аминокислоты обозначены точками). Петли, соответствующие CDR1, CDR2 и CDR3, обведены рамками. Фиг. 6 представляет собой иллюстрацию аминокислотной последовательности DOM15-10 и 16 селектированных вариантов. Аминокислоты в селектированных клонах, которые отличаются от родительской последовательности, указаны (идентичные аминокислоты обозначены точками). Петли, соответст- 15018723 вующие CDR1, CDR2 и CDR3, обведены рамками. Фиг. 7A-7D представляют собой кривые BIAcore, показывающие связывание родительского dAb,DOM1h-131-511 (фиг. 7 А), и трех вариантов dAb, DOM1h-131-203 (фиг. 7 В), DOM1h-131-204 (фиг. 7 С) иDOM1h-131-206 (фиг. 7D), с иммобилизованным TNFR1 после инкубации с различными концентрациями трипсина (варьирующими от 0 до 100 мкг/мл) в течение ночи при 37 С. Результаты демонстрируют,что все три варианта более устойчивы, чем родительское антитело, к протеолизу при высоких концентрациях трипсина (100 мкг/мл). Фиг. 8 А-8 С представляют собой кривые BIAcore, показывающие связывание dAb DOM1h-131-511(фиг. 8 А), DOM1h-131-202 (фиг. 8 В) и DOM1h-131-206 (фиг. 8 С) с иммобилизованным TNFR1 после инкубации с эластазой и лейкозимом в течение ночи. Эти dAb продемонстрировали повышенную устойчивость к протеолизу по сравнению с родительским антителом против эластазы и лейкозима. На фиг. 9 показаны два геля 4-12% Novex Bis-Tris с образцами dAb DOM1h-131-511, DOM1h-131203, DOM1h-131-204, DOM1h-131-206, DOM1h-131-54, DOM1h-131-201 и DOM1h-131-202 перед инкубацией с трипсином, и образцами после инкубации с 100 мкг/мл трипсина в течение 1, 3 и 24 ч. Фиг. 10 А-10 С представляют собой кривые BIAcore, показывающие связывание DOM4-130-54 (фиг. 10 А), DOM4-130-201 (фиг. 10 В) и DOM4-130-202 (фиг. 10 С) с иммобилизованным слитым белком IL1R1 после инкубации с различными концентрациями трипсина (варьирующими от 0 до 100 мкг/мл) в течение ночи при 37 С. Результаты демонстрируют, что оба варианта более устойчивы, чем родительское антитело, к протеолизу при высоких концентрациях трипсина. Фиг. 11 А-11 С представляют собой кривые BIAcore, показывающие связывание DOM4-130-54 (фиг. 11A), DOM4-130-201 (фиг. 11 В) и DOM4-130-202 (фиг. 11 С) с иммобилизованным слитым белком IL1R1 после инкубации с эластазой и лейкозимом в течение ночи. Эти dAb продемонстрировали повышенную устойчивость к протеолизу по сравнению с родительским антителом против обеих тестируемых протеаз. Фиг. 12 представляет собой иллюстрацию аминокислотной последовательности DOM15-26-555 и 6 вариантов. Аминокислоты, которые отличаются от родительской последовательности, в селектированных клонах указаны (идентичные аминокислоты обозначены точками). Фиг. 13 А и 13 В представляют собой кривые BIAcore, показывающие связывание родительскогоdAb, DOM15-26-555 (фиг. 13 А), и наиболее протеазоустойчивого варианта, DOM15-26-593 (фиг. 13 В), с иммобилизованным VEGF. Родительское антитело и вариант сравнивали на BIAcore в отношении связывания с hVEGF (VEGF человека) при концентрации dAb 100 нМ после инкубации с трипсином в концентрации 200 мкг/мл. Реакцию осуществляли в течение 3 ч или 24 ч при 37 С. Результаты демонстрируют,что вариант более устойчив, чем родительское антитело, к протеолизу после 24-часовой обработки трипсином. Фиг. 14 представляет собой график, показывающий влияние обработки трипсином на связывание вариантов DOM15-26-555 с hVEGF. Результаты ясно демонстрируют, что все варианты более устойчивы,чем родительское антитело (DOM15-26-555), к протеолизу после 24-часовой обработки трипсином. На фиг. 15 показаны два геля Novex 10-20% Tricine, на которые наносили по 15 мкг обработанных и необработанных образцов DOM15-26-555 или DOM15-26-593. Образцы отбирали непосредственно перед добавлением трипсина и затем через 1, 3 и 24 ч после добавления трипсина. Белки окрашивали с помощью 1 SureBlue. Гели иллюстрируют, что профиль устойчивости к трипсину для DOM15-26-593 отличается от профиля, продемонстрированного BIAcore экспериментом. Фиг. 16 представляет собой иллюстрацию аминокислотной последовательности DOM15-10 и варианта, DOM15-10-11. Аминокислоты, которые в этом варианте отличаются от родительской последовательности, указаны (идентичные аминокислоты обозначены точками). Фиг. 17 А и 17 В представляют собой кривые BIAcore, показывающие связывание родительского антитела DOM15-10 (фиг. 17 А), и варианта, DOM15-10-11 (фиг. 17 В), с иммобилизованным VEGF. Родительское антитело и вариант сравнивали на BIAcore в отношении связывания с hVEGF при концентрацииdAb 100 нМ после инкубации с трипсином в концентрации 200 мкг/мл. Реакцию осуществляли в течение 1, 3 и 24 ч при 37 С. Результаты демонстрируют, что вариант более устойчив, чем родительское антитело, к протеолизу после 24-часовой обработки трипсином. На фиг. 18 показаны два геля Novex 10-20% Tricine, на которые наносили по 15 мкг образцовDOM15-10 и DOM15-10-11. Образцы отбирали непосредственно перед добавлением трипсина и затем через 1, 3 и 24 ч после добавления трипсина. Белки окрашивали с помощью SureBlue (1 х). Результаты демонстрируют, что связывающая активность, обнаруженная в BIAcore исследовании, непосредственно отражает целостность белка. Фиг. 19A-19L иллюстрируют нуклеотидные последовательности нескольких нуклеиновых кислот,кодирующих dAb, которые представляют собой варианты DOM1h-131-511 или DOM4-130-54. Нуклеотидные последовательности кодируют аминокислотные последовательности, представленные соответственно на фиг. 3 и 4. Фиг. 20 А-20 Е иллюстрируют нуклеотидные последовательности нескольких нуклеиновых кислот,кодирующих dAb, которые представляют собой варианты DOM15-26-555 или DOM15-10. Нуклеотидные последовательности кодируют аминокислотные последовательности, представленные соответственно на фиг. 5 и 6. На фиг. 21 показана карта вектора pDOM38. На фиг. 22 показан гель (Labchip) с белками DOM10-53-474 и DOM15-26-593, обработанными трипсином при соотношении dAb:трипсин 25:1 при 30 С в различные моменты времени. Стрелки указывают на полноразмерный белок. На фиг. 23 представлены кривые гель-фильтрации (SEC), демонстрирующие высокий уровень чистоты, полученный для каждого образца после очистки посредством ММС-хроматографии, затем анионного обмена. УФ контролировали при 225 нм и через колонку пропускали 1 PBS (забуференный фосфатом физиологический раствор) с 10% этанола (об./об.). Процентное содержание мономера рассчитывали посредством интегрирования площади пика с учетом фона. На фиг. 24 представлены данные по стабильности к протеазам для DOM1h-131-511, DOM1h-131202 и DOM1h-131-206. На фиг. 25 представлены результаты SEC, которые иллюстрируют данные по стабильностиDOM1h-131-202, DOM1h-131-206 и DOM1h-131-511 в течение 14 суток в буфере Бриттона-Робинсона при 37 и 50 С. Концентрация белка для всех dAb составляла 1 мг/мл. SEC использовали для определения того, произошли ли какие-либо изменения в белке во время теплового стресса и в количестве мономера,остающегося в растворе, по сравнению с образцом на момент времени 0 (Т 0). На фиг. 26 A-I показаны SEC кривые, демонстрирующие влияние теплового стресса (37 и 50 С) наDOM1h-131-511 (A-C), -202 (D-F) и -206 (G-I). Также показан процент мономера, остающегося в растворе, относительно Т=0 в заданный момент времени. На фиг. 27 показан IEF (изоэлектрофокусирование) анализ DOM1h-131-202, DOM1h-131-206 иDOM1h-131-511 на 24, 48 ч и 7-е и 14-е сутки теплового стресса. Образцы инкубировали либо при 37,либо при 50 С в буфере Бриттона-Робинсона. Фиг. 28: RBA (receptor binding assay, анализ связывания с рецептором) с TNFR-1, демонстрирующий влияние 14-суточной инкубации DOM1h-131-202, DOM1h-131-206 и DOM1h-131-511 при 50 С. Концентрацию белка считали равной 1 мг/мл. Также показано отрицательное контрольное dAb (имитация (dummy) VH), которое не связывалось с антигеном. На фиг. 29 проиллюстрированы эффекты хранения A: DOM1h-131-202, В: DOM1h-131-206 и С:DOM1h-131-511 в концентрации примерно 100 мг/мл в течение 7 суток в буфере Бриттона-Робинсона при 4 С. УФ контролировали при 280 нм. На фиг. 30 показаны данные тестирования DOM1h-131-202, DOM1h-131-206 и DOM1h-131-511 с использованием небулайзеров Pari E-flow и LC+. Концентрация белка в каждом случае составляла 5 мг/мл в буфере Бриттона-Робинсона. На фиг. 31 проиллюстрированы относительные процентные изменения концентраций мономера в процессе распыления DOM1h-131-202, DOM1h-131-206 и DOM1h-131-511 в буфере Бриттона-Робинсона при 5 мг/мл. На фиг. 32 показаны SEC кривые для DOM1h-131-206 и DOM1h-131-511 в буфере БриттонаРобинсона после распыления из Pari LC+. На фиг. 33 показаны SEC кривые для DOM1h-131-206 в процессе распыления в течение 1 ч при 40 мг/мл в PBS. Белки, находящиеся как в колпачке небулайзера, так и в аэрозоле, обладают высокой устойчивостью к эффектам сдвига и теплового стресса, которым может подвергаться dAb при распылении. На фиг. 34 показаны кривые скорости седиментации для каждого из трех основных белков(DOM1h-131-206, DOM1h-131-511 и DOM1h-131-202). Бимодальный пик, наблюдаемый для образца с более низкой концентрацией, DOM1h-131-206, в этом случае представляет собой артефакт вследствие утечки образца из ячейки. На фиг. 35 показано влияние буфера и устройства на размер капли при распылении GSK1995056A(DOM1h-131-511). Фиг. 36: стабильность GSK1995056A (DOM1h-131-511) после распыления в различных устройствах, оцениваемая по образованию димеров, как измерено с использованием SEC. На фиг. 37 показаны данные тестирования GSK1922567A (202), GSK1995057A (206) иGSK1995056A (511) с использованием небулайзеров Pari E-flow и LC+. А) тестирование в буфере Бриттона-Робинсона, В) тестирование в ПЭГ 1000/сахарозном буфере. На фиг. 38 изображена кривая зависимости от дозы TNF-, полученная в анализе связывания с рецептором TNFR1 человека. Каждый образец тестировали в четырех повторах. На фиг. 39 показано ингибирование посредством GSK1922567A (DOM1h-131-202), GSK1995057A(DOM1h-131-206) и GSK1995056A (DOM1h-131-511) в анализе связывания с рецептором TNFR1 человека. Каждый образец тестировали в четырех повторах. На фиг. 40 проиллюстрирована эффективность dAb DOM15-26 и DOM15-26-593 в RBA с VEGF. На фиг. 41 показаны фармакокинетические данные для DMS1529 (DOM15-26-593) и DMS1545(DOM15-26-501) после однократного в/в (внутривенного) введения болюсной дозы крысам в концентра- 17018723 ции 5 мг/мг. На фиг. 42 а показан SEC-MALLS (гель-хроматография/многоугловое лазерное светорассеяние) анализ слитой конструкции DMS1529F-C (слитой конструкции DOM15-26-593 Fc), подтверждающий мономерные свойства. Показаны две разные партии, которые демонстрируют похожие свойства в отношении показателя преломления (т.е. концентрации; пунктирные линии) и светорассеяния (сплошные линии). Линия, отмеченная стрелкой, показывает расчет молекулярной массы. На фиг. 42b показан AUC (аналитическое ультрацентрифугирование) анализ слитой конструкцииDMS1529 Fc (слитой конструкции DOM15-26-593 Fc), подтверждающий мономерные свойства. Одну партию вещества тестировали в трех разных концентрациях, приблизительно равных 0,2, 0,5 и 1,0 мг/мл в PBS-буфере. Анализ скорости седиментации подтвердил, что молекулярная масса составляет приблизительно 80 кДа. На фиг. 43 показаны DSC (дифференциальная сканирующая калориметрия) кривые для DMS1529VEGF для DMS1529 (DOM15-26-593) до и после 10 циклов замораживания-оттаивания для двух разных партий вещества. На фиг. 45 показан SEC-профиль устойчивости DOM15-26-593 до и после 10 циклов замораживания-оттаивания. На фиг. 46 проиллюстрированы результаты ускоренного исследования стабильности для слитой конструкции DMS1529 (слитой конструкции DOM15-26-593 Fc); где связывание в ELISA демонстрирует активность через 7 суток инкубации при показанной температуре. На фиг. 47 А показана стабильность DMS1529 (DOM15-26-593) у яванского макака через 14 и 15 суток инкубации при 37 С. На фиг. 47 В показана стабильность DMS1529 (DOM15-26-593) в сыворотке человека через 14 и 15 суток инкубации при 37 С. На фиг. 48 показана эффективность dAb DOM15-26 и DOM15-26-593 в виде Fc слияний (DMS1564 и 1529 соответственно) в RBA с VEGF. На фиг. 49 проиллюстрировано ингибирование пролиферации клеток HUVEC (эндотелиальные клетки пупочной вены человека) слитой конструкцией DMS1529 (слитой конструкцией DOM15-26-593Fc). Фиг. 50: карта вектора pDom33. На фиг. 51 изображены последовательности (аминокислотная и нуклеотидная) dAb, связывающихся с сывороточным альбумином. Подробное описание изобретения Изобретение раскрыто в данном описании со ссылкой на воплощения, что делает возможным составление ясного и четкого описания. Предполагается и должно быть очевидным, что данные воплощения можно различным образом комбинировать или разделять без отклонения от сущности изобретения. Если не указано иное, все технические и научные термины, используемые здесь, имеют такое же значение, что и обычно понимаемое специалистом в данной области техники (например, в клеточной культуре, молекулярной генетике, химии нуклеиновых кислот, способах гибридизации и биохимии). Для молекулярных, генетических и биохимических способов используются стандартные способы (в общем см. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2d ed. (1989), Cold Spring Harbor LaboratoryWileySons, Inc., включенные здесь путем ссылки) и химические способы. Используемый здесь "антагонист рецептора фактора некроза опухоли 1 (TNFR1)" или "антагонистTNFR1" и т.п. относится к агенту (например, молекуле, соединению), который связывается с TNFR1 и может ингибировать функцию (одну или более чем одну) TNFR1. Например, антагонист TNFR1 может ингибировать связывание TNF с TNFR1 и/или ингибировать передачу сигнала, опосредованную черезTNFR1. Соответственно, опосредованные TNFR1 процессы и клеточные ответы (например, индуцированная TNF клеточная гибель в стандартном анализе цитотоксичности на клетках L929) могут ингибироваться антагонистом TNFR1. Как использовано в данном изобретении, "пептид" относится к аминокислотам в количестве от примерно двух до примерно 50, которые соединены вместе посредством пептидных связей. Как использовано в данном изобретении, "полипептид" относится к по меньшей мере примерно 50 аминокислотам, которые соединены вместе пептидными связями. В большинстве случаев полипептиды имеют третичную структуру и сворачиваются в функциональные домены. Как использовано в данном изобретении, пептид или полипептид (например, однодоменное антитело (dAb, который является "устойчивым к расщеплению протеазой", по существу, не расщепляется протеазой при инкубации с данной протеазой в условиях, подходящих для протеазной активности. Полипептид (например, dAb), по существу, не расщепляется, когда не более чем примерно 25%, не более чем примерно 20%, не более чем примерно 15%, не более чем примерно 14%, не более чем примерно 13%, не более чем примерно 12%, не более чем примерно 11%, не более чем примерно 10%, не более чем примерно 9%, не более чем примерно 8%, не более чем примерно 7%, не более чем примерно 6%, не более чем примерно 5%, не более чем примерно 4%, не более чем примерно 3%, не более чем примерно 2%, не более чем примерно 1% белка расщепляется протеазой, или по существу никакое количество белка не расщепляется протеазой при инкубации с протеазой в течение примерно 1 ч при температуре, подходящей для протеазной активности. Например, при 37 или 50 С. Расщепление белка можно оценивать с использованием любого подходящего способа, например с использованием SDS-PAGE (электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия) или функционального анализа (например, связывания с лигандом), как описано в данном патенте. Как использовано в данном изобретении, "дисплейная система" относится к системе, в которой"коллекция" полипептидов или пептидов доступна для селекции на основании желаемой характеристики,такой как физическая, химическая или функциональная характеристика. Дисплейная система может представлять собой подходящий репертуар полипептидов или пептидов (например, в растворе, иммобилизованном на подходящей подложке). Дисплейная система также может представлять собой систему,которая использует клеточную экспрессирующую систему (например, экспрессию библиотеки нуклеиновых кислот, например, в трансформированных, инфицированных, трансфицированнных или трансдуцированных клетках и экспонирование кодируемых полипептидов на поверхности этих клеток) или бесклеточную экспрессирующую систему (например, эмульсионную компартментализацию и дисплей). Предпочтительные дисплейные системы связывают кодирующую функцию нуклеиновой кислоты и физические, химические и/или функциональные характеристики полипептида или пептида, кодируемого данной нуклеиновой кислотой. Если применяют такую дисплейную систему, то можно осуществлять селекцию полипептидов или пептидов, имеющих желаемую физическую, химическую и/или функциональную характеристику, и можно легко выделить или извлечь нуклеиновую кислоту, кодирующую селектированный полипептид или пептид. В данной области техники известен ряд дисплейных систем,которые связывают кодирующую функцию нуклеиновой кислоты и физические, химические и/или функциональные характеристики полипептида или пептида, например бактериофаговый дисплей (фаговый дисплей, например фагмидный дисплей), рибосомный дисплей, эмульсионная компартментализация и дисплей, дрожжевой дисплей, пуромициновый дисплей, бактериальный дисплей или плазмидный дисплей, ковалентный дисплей и т.п. (см., например, ЕР 0436597 (Dyax), патент США 6172197 (McCafferty et al.), патент США 6489103 (Griffiths et al Как использовано в данном изобретении, "репертуар" относится к коллекции полипептидов или пептидов, которые характеризуются вариабельностью аминокислотной последовательности. Индивидуальные члены репертуара могут иметь общие признаки, такие как общие структурные признаки (например, общую коровую структуру) и/или общие функциональные признаки (например, способность связываться с общим лигандом (например, типичным лигандом или целевым лигандом, TNFR1. Как использовано в данном изобретении, термин "функциональный" описывает полипептид или пептид, имеющий такую биологическую активность, как специфическая связывающая активность. Например, термин "функциональный полипептид" включает в себя антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, который связывается с целевым антигеном посредством своего антигенсвязывающего сайта. Как использовано в данном изобретении, "типичный лиганд" относится к лиганду, который связывается со значительной частью функциональных членов (например, по существу всеми функциональнами членами) заданного репертуара. Типичный лиганд (например, общий типичный лиганд) может связываться со многими членами заданного репертуара, даже несмотря на то, что эти члены могут не обладать специфичностью связывания в отношении общего целевого лиганда. В общем случае присутствие функционального сайта связывания с типичным лигандом на полипептиде (на что указывает способность связываться с типичным лигандом) указывает на то, что полипептид надлежащим образом свернут и функционален. Подходящие примеры типичных лигандов включают суперантигены, антитела, которые связываются с эпитопом, экспрессируемым на значительной части функциональных членов репертуара, и т.п."Суперантиген" представляет собой термин данной области техники, который относится к типичным лигандам, взаимодействующим с членами иммуноглобулинового суперсемейства в сайте, отличающемся от сайтов связывания с целевым лигандом, расположенных на этих белках. Примерами суперантигенов являются стафилококковые энтеротоксины, которые взаимодействуют с Т-клеточными рецепторами. Суперантигены, связывающиеся с антителами, включают белок G, который связывается с константной областью IgG (Bjorck and Kronvall, J. Immunol., 133: 969 (1984; белок А, который связывается с константной областью IgG и VH-доменами (Forsgren and Sjoquist, J. Immunol., 97: 822 (1966; и белок L,который связывается с VL-доменами (Bjorck, J. Immunol., 140: 1194 (1988. Как использовано в данном изобретении, "целевой лиганд" относится к лиганду, который специфически или селективно связывается полипептидом или пептидом. Например, если полипептид представляет собой антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, то целевой лиганд может представлять собой любой желаемый антиген или эпитоп. Связывание с целевым антигеном зависит от функциональности данного полипептида или пептида. Как оно использовано здесь, антитело относится к IgG, IgM, IgA, IgD или IgE или фрагменту (такому как Fab, F(ab')2, Fv, связанный дисульфидными связями Fv, scFv, мультиспецифическое антитело в закрытой конформации, связанный дисульфидными связями scFv, диатело), происходящему из любого вида, в природе продуцирующего антитело, или созданному при помощи технологии рекомбинантной ДНК; выделенное из сыворотки крови, В-клеток, гибридом, трансфектом, дрожжей или бактерий. Как использовано в данном изобретении, "формат антитела" относится к любой подходящей полипептидной структуре, в которую может быть инкорпорирован один или более вариабельных доменов антитела с тем, чтобы придать данной структуре специфичность связывания с антигеном. В данной области техники известен ряд подходящих форматов антител, таких как химерные антитела, гуманизированные антитела, человеческие антитела, одноцепочечные антитела, биспецифические антитела, тяжелые цепи антител, легкие цепи антител, гомодимеры и гетеродимеры тяжелых цепей и/или легких цепей антител, антигенсвязывающие фрагменты любого из перечисленного выше (например, Fv-фрагмент (например, одноцепочечный Fv (scFv), связанный дисульфидной связью Fv), Fab-фрагмент, Fab'-фрагмент,P(ab')2-фрагмент), единичный вариабельный домен антитела (например, dAb, VH, VHH, VL) и модифицированные версии любого из перечисленного выше (например, модифицированные посредством ковалентного присоединения полиэтиленгликоля или другого подходящего полимера или гуманизированногоVHH). Фраза "иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен" относится к вариабельному домену антитела (VH, VHH, VL), специфически связывающемуся с антигеном или эпитопом независимо от другихV-областей или доменов. Иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен может быть представлен в формате (например, гомо- или гетеромультимера) с другими вариабельными областями или вариабельными доменами, где другие области или домены не требуются для связывания антигена с единичным иммуноглобулиновым вариабельным доменом (т.е. когда иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен связывается с антигеном независимо от дополнительных вариабельных доменов). "Однодоменное антитело" или "dAb" представляет собой то же, что и "иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен", как этот термин используется в данном изобретении. Иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен представляет собой то же самое, что и единичный иммуноглобулиновый вариабельный домен, как этот термин используется здесь. Иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен в одном воплощении представляет собой вариабельный домен антитела человека, но также включает единичные вариабельные домены антител от других видов, как, например, VHH dAb грызунов(например, как описано в WO 00/29004, содержание которой включено в данное описание во всей своей полноте посредством ссылки), усатых акул и верблюжьи VHH dAb. Верблюжьи VHH представляют собой полипептиды иммуноглобулинового единичного вариабельного домена, которые происходят из видов,включающих верблюда, ламу, альпаку, дромадера и гуанако, которые продуцируют антитела, состоящие из тяжелых цепей, по своей природе лишенные легких цепей."Домен" представляет собой свернутую белковую структуру, сохраняющую свою третичную структуру независимо от остальной части белка. В большинстве случаев домены ответственны за отдельные функциональные свойства белков и во многих случаях могут быть добавлены, удалены или перенесены в другие белки без потери функции оставшейся части белка и/или домена. Единичный вариабельный домен антитела представляет собой свернутый полипептидный домен, содержащий последовательности,характерные для вариабельных доменов антител. Следовательно, он включает полные вариабельные домены антител и модифицированные вариабельные домены, например в которых одна или более петель заменены на последовательности, не характерные для вариабельных доменов антител, или вариабельные домены антител, которые укорочены или содержат N- или С-концевые удлиняющие сегменты, а также свернутые фрагменты вариабельных доменов, которые сохраняют, по меньшей мере, связывающую активность и специфичность полноразмерного домена. Термин "библиотека" относится к смеси гетерогенных полипептидов или нуклеиновых кислот. Библиотека состоит из членов, каждый из которых имеет единичную полипептидную или нуклеиновокислотную последовательность. До некоторой степени "библиотека" является синонимом "репертуару". Различия в последовательностях среди членов библиотеки ответственны за разнообразие, представленное в этой библиотеке. Библиотека может принимать форму простой смеси полипептидов или нуклеиновых кислот или может быть в форме микроорганизмов или клеток, например бактерий, вирусов, клеток животных и растений и т.п., трансформированных с использованием библиотеки нуклеиновых кислот. В одном воплощении каждый индивидуальный микроорганизм или клетка содержит только один член библиотеки или ограниченное их количество. В одном воплощении нуклеиновые кислоты инкорпорированы в экспрессирующие векторы для того, чтобы способствовать экспрессии полипептидов, кодируемых данными нуклеиновыми кислотами. Следовательно, в одном аспекте библиотека может принимать форму популяции организмов-хозяев, при этом каждый организм содержит одну или более копий экспрессирующего вектора, содержащего единичный член библиотеки в форме нуклеиновой кислоты, которая может быть экспрессирована с целью получения соответствующего ей полипептидного члена. Таким образом, популяция организмов-хозяев имеет возможность кодировать большой репертуар различающихся полипептидов."Универсальный каркас" представляет собой последовательность каркаса одиночного антитела, соответствующую областям антитела, консервативным в последовательности, как определено Kabat ("Sequences of Proteins of Immunological Interest", US Department of Health and Human Services, 1991), или соответствующую репертуару или структуре иммуноглобулинов зародышевой линии человека, как определено в Chothia and Lesk (1987), J. Mol. Biol. 196: 910-917. В библиотеках и репертуарах могут использоваться одиночный каркас или набор таких каркасов, в отношении которых обнаружено, что они допускают получение производных по сути с любой специфичностью связывания посредством внесения изменений только в гипервариабельные участки. Используемый здесь термин "доза" относится к количеству лиганда, вводимому субъекту одновременно (разовая доза), или в течение двух или более чем двух введений в течение определенного промежутка времени. Например, доза может относиться к количеству лиганда (например, лиганда, содержащего иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен, связывающий целевой антиген), вводимому субъекту в течение суток (24 ч) (суточная доза), двух суток, одной недели, двух недель, трех недель или одного или более чем одного месяца (например, путем разового введения, или путем двух или более чем двух введений). Интервал между дозами может представлять собой любое желаемое количество времени. Фраза "период полувыведения" представляет собой период времени, в течение которого концентрация лиганда (например, dAb, полипептида или антагониста) в сыворотке крови уменьшается на 50% invivo, например вследствие деградации лиганда и/или клиренса или разрушения лиганда при помощи природных механизмов. Лиганды по изобретению могут быть стабилизированы in vivo, и период их полувыведения увеличивается путем связывания с молекулами, которые устойчивы к деградации и/или клиренсу, или разрушению. Типично, такие молекулы представляют собой природные белки, которые сами обладают длительным периодом полувыведения in vivo. Период полувыведения лиганда увеличивается в том случае, если его функциональная активность сохраняется in vivo в течение более длительного периода, чем у похожего лиганда, который не специфичен в отношении молекулы, увеличивающей период полувыведения. Например, лиганд, специфический в отношении HAS (человеческого сывороточного альбумина), и молекулу-мишень сравнивают с тем же лигандом, у которого специфичность в отношении HSA отсутствует, то есть он не связывается с HAS, но связывается с другой молекулой. Например, он может связываться с третьей мишенью на клетке. Типично, период полувыведения увеличивается на 10, 20, 30, 40, 50 или более чем 50%. Возможны увеличения периода полувыведения в диапазоне 2, 3, 4, 5, 10, 20, 30, 40, 50 или более чем 50. Альтернативно или дополнительно возможно увеличение периода полувыведения в диапазоне 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150. Используемый здесь термин "гидродинамический размер" относится к кажущемуся размеру молекулы (например, белковой молекулы, лиганда) на основе диффузии молекулы через водный раствор. Диффузия или движение белка через раствор может быть обработано для выведения кажущегося размера белка, где размер приводится в виде "радиуса Стокса" или "гидродинамического радиуса" белковой частицы. "Гидродинамический размер" белка зависит от массы и формы (конформации) так, что два белка,обладающие одинаковой молекулярной массой, могут обладать отличающимися гидродинамическими размерами на основе общей конформации белка. Использованный здесь термин "конкурирует" означает, что связывание первой мишени с ее штатным целевым связывающим доменом ингибируется в присутствии второго связывающего домена, специфического в отношении указанной когнатной мишени. Например, связывание может быть ингибировано стерически, например путем физического блокирования связывающего домена, или путем изменения структуры или окружения связывающего домена таким образом, что его аффинность или авидность в отношении мишени уменьшается (см. WO 2006038027 в отношении подробной информации относительно того, как осуществлять конкурентные ELISA и конкурентные эксперименты BiaCore для определения конкуренции между первым и вторым связывающими доменами). Расчеты "гомологии" или "идентичности", или "близости" между двумя последовательностями(термины здесь используются взаимозаменяемо) осуществляют следующим образом. Последовательности выравнивают в целях оптимального сравнения (например, могут быть введены разрывы в одну или обе первую и вторую аминокислотную или нуклеиново-кислотную последовательности для оптимального выравнивания, а для сравнительных целей негомологичными последовательностями можно пренебречь). В одном воплощении длина референсной последовательности, выравненной для сравнительных целей, составляет по меньшей мере 30%, или по меньшей мере 40%, или по меньшей мере 50%, или по меньшей мере 60%, или по меньшей мере 70, 80, 90, 100% длины референсной последовательности. Затем сравнивают аминокислотные остатки или нуклеотиды в соответствующих аминокислотных положениях или нуклеотидных положениях. Если положение в первой последовательности занято тем же аминокислотным остатком или нуклеотидом, что и соответствующее положение во второй последовательности, тогда молекулы идентичны по этому положению (как использовано в данном описании, аминокислотная "гомология" или "гомология" нуклеиновой кислоты эквивалентна аминокислотной "идентичности" или "идентичности" нуклеиновой кислоты). Процент идентичности между двумя последовательно- 21018723 стями есть функция количества идентичных положений, общих для этих последовательностей, с учетом количества разрывов и длины каждого разрыва, которые необходимы для введения с целью оптимального выравнивания двух последовательностей. Выравнивания аминокислотной и нуклеотидной последовательности и их гомология, сходство или идентичность, как определено в данном описании, могут быть проведены и определены с использованием алгоритма для последовательностей BLAST 2 Sequences, используя параметры по умолчанию (Tatusova, Т.A. et al., FEMS Microbiol. Lett, 174: 187-188 (1999. Способы селекции Изобретение в одном из воплощений относится к полипептидам и dAb, селектируемым при помощи способа селекции протеазоустойчивых пептидов и полипептидов, обладающих желаемой биологической активностью. Два селективных критерия отбора используют в способе для обеспечения эффективного процесса селекции полипептидов, которые являются высокостабильными и устойчивыми к деградации протеазой и которые обладают желаемой биологической активностью. Как здесь описано, протеазоустойчивые пептиды и полипептиды, как правило, сохраняют биологическую активность. Наоборот, пептиды и полипептиды, чувствительные к протеазе, расщепляются или разрушаются протеазой в описанных здесь способах, и таким образом, утрачивают свою биологическую активность. Соответственно,протеазоустойчивые пептиды или полипептиды, как правило, отбирают на основании их биологической активности, такой как связывающая активность. Описанные здесь способы обеспечивают несколько преимуществ. Например, как здесь раскрыто и примеры чего здесь приведены, вариабельные домены, антагонисты, пептиды или полипептиды, отобранные по их устойчивости к протеолитической деградации одной из протеаз (например, трипсином),также устойчивы к деградации другими протеазами (например, эластазой, лейкозимом). В одном из воплощений устойчивость к протеазе коррелирует с более высокой температурой плавления (Tm) пептида или полипептида. Более высокие температуры плавления представляют собой показатели более стабильных вариабельных доменов антагонистов, пептидов и полипептидов. Устойчивость к деградации протеазой также коррелирует в одном из воплощений с высокоаффинным связыванием с лигандами-мишенями. Таким образом, описанные здесь способы обеспечивают эффективный путь селекции, выделения и/или извлечения вариабельных доменов, антагонистов, пептидов, полипептидов, обладающих желаемой биологической активностью, и которые хорошо подходят для терапевтического и/или диагностического применения in vivo, поскольку они устойчивы к протеазе и стабильны. В одном из воплощений устойчивость к протеазе коррелирует с улучшенной PK (фармакокинетикой), например улучшением по сравнению с вариабельным доменом, антагонистом, пептидом или полипептидом, который не протеазоустойчивым. Улучшенная PK может представлять собой улучшенную AUC (площадь под кривой) и/или улучшенный период полувыведения. В одном из воплощений устойчивость к протеазе коррелирует с улучшенной стабильностью вариабельного домена, антагониста, пептида или полипептида к сдвигу и/или тепловому стрессу, и/или уменьшенной склонности к агрегации при распылении, например улучшение по сравнению с вариабельным доменом, антагонистом, пептидом или полипептидом, который не является протеазоустойчивым. В одном из воплощений устойчивость к протеазе коррелирует с улучшенной стабильностью при хранении, например улучшением по сравнению с вариабельным доменом, антагонистом, пептидом или полипептидом, который не является протеазоустойчивым. В одном из аспектов предложено одно, два, три, четыре или все преимущества, где преимущества представляют собой устойчивость к деградации протеазой, более высокую Tm и высокоаффинное связывание с целевым лигандом. В одном из аспектов предложен способ селекции, выделения и/или извлечения из библиотеки или репертуара пептидов и полипептидов (например, дисплейной системы) пептида или полипептида, устойчивого к деградации протеазой (например, одной или более чем одной из протеаз). В одном из воплощений способ представляет собой способ селекции, выделения и/или извлечения из библиотеки или репертуара пептидов и полипептидов (например, дисплейной системы) полипептида, устойчивого к деградации протеазой (например, одной или более чем одной из протеаз). Как правило, способ включает получение библиотеки или репертуара пептидов или полипептидов, объединение этих библиотеки или репертуара с протеазой (например, трипсином, эластазой, лейкозимом, панкреатином, слюной) в условиях,подходящих для активности протеазы, и селекцию, выделение и/или извлечение пептида или полипептида, устойчивого к деградации протеазой и обладающего желаемой биологической активностью. Пептиды или полипептиды, деградирующие под действием протеазы, как правило, обладают уменьшенной биологической активностью или утрачивают свою биологическую активность вследствие активности протеазы. Соответственно, пептиды или полипептиды, устойчивые к деградации протеазой, могут быть селектированы, выделены и/или извлечены с использованием способа на основании их биологической активности, такой как связывающая активность (например, связывание с типичным лигандом, связывание со специфическим лигандом, связывание с субстратом), каталитическая активность или другая биологическая активность. Библиотеку или репертуар пептидов или полипептидов объединяют с протеазой (например, одной или более чем одной протеазой) в условиях, подходящих для протеолитической активности протеазы. Условия, подходящие для протеолитической активности протеазы, и биологические препараты или смеси, обладающие протеолитической активностью, хорошо известны в области техники или могут быть легко определены специалистом в данной области техники. Если желательно, то подходящие условия могут быть идентифицированы или оптимизированы, например путем оценки протеазной активности в диапазоне условий рН, концентраций протеазы, температур и/или путем варьирования времени, в течение которого дают возможность для взаимодействия библиотеки или репертуара и протеазы. Например,в некоторых воплощениях отношение (из расчета моль/моль) протеазы, например трипсина, к пептиду или полипептиду (например, вариабельному домену) составляет от 800 до 8000 (например, от 8000 до 80000) протеаза:пептид или полипептид, например когда используют 10 мкг/мл протеазы, тогда отношение составляет от 800 до 80000 протеаза:пептид или полипептид; или когда используют 100 мкг/мл протеазы, тогда отношение составляет от 8000 до 80000 протеаза:пептид или полипептид. В одном из воплощений отношение (из расчета масса/масса, например из расчета микрограмм/микрограмм) протеазы(например, трипсина) к пептиду или полипептиду (например, вариабельному домену) составляет от 1600 до 160000 (например, от 16000 до 160000) протеаза:пептид или полипептид, например когда используют 10 мкг/мл протеазы, тогда отношение составляет от 1600 до 160000 протеаза:пептид или полипептид; или когда используют 100 мкг/мл протеазы, тогда отношение составляет от 16000 до 160000 протеаза:пептид или полипептид. В одном из воплощений протеазу используют в концентрации, составляющей по меньшей мере 100 или 1000 мкг/мл, и отношение протеаза:пептид (из расчета моль/моль) протеазы, например трипсина, к пептиду или полипептиду (например, вариабельному домену) составляет от 8000 до 80000 протеаза:пептид или полипептид. В одном из воплощений протеазу используют в концентрации, составляющей по меньшей мере 10 мкг/мл, и отношение протеаза:пептид (из расчета моль/моль) протеазы, например трипсина, к пептиду или полипептиду (например, вариабельному домену) составляет от 800 до 80000 протеаза:пептид или полипептид. В одном из воплощений отношение (из расчета масса/масса, например из расчета микрограмм/микрограмм) протеазы (например, трипсина) к пептиду или полипептиду(например, вариабельному домену) составляет от 1600 до 160000 протеаза:пептид или полипептид, например когда С составляет 10 мкг/мл; или когда С или С' составляет 100 мкг/мл, тогда отношение составляет от 16000 до 160000 протеаза:пептид или полипептид. В одном из воплощений концентрация (с или с') составляет по меньшей мере 100 или 1000 мкг/мл протеазы. Для тестирования индивидуального или выделенного пептида или полипептида (например, иммуноглобулинового вариабельного домена),например уже выделенного из репертуара или библиотеки, протеаза может быть добавлена к раствору пептида или полипептида в подходящем буфере (например, PBS) с получением раствора пептид или полипептид/протеаза, такого как раствор, составляющий по меньшей мере приблизительно 0,01%(мас./мас.) протеаза/пептид или полипептид, от приблизительно 0,01% до приблизительно 5% (мас./мас.) протеаза/пептид или полипептид, от приблизительно 0,05% до приблизительно 5% (мас./мас.) протеаза/пептид или полипептид, от приблизительно 0,1% до приблизительно 5% (мас./мас.) протеаза/пептид или полипептид, от приблизительно 0,5% до приблизительно 5% (мас./мас.) протеаза/пептид или полипептид, от приблизительно 1% до приблизительно 5% (мас./мас.) протеаза/пептид или полипептид, по меньшей мере приблизительно 0,01% (мас./мас.) протеаза/пептид или полипептид, по меньшей мере приблизительно 0,02% (мас./мас.) протеаза/пептид или полипептид, по меньшей мере приблизительно 0,03% (мас./мас.) протеаза/пептид или полипептид, по меньшей мере приблизительно 0,04% (мас./мас.) протеаза/пептид или полипептид, по меньшей мере приблизительно 0,05% (мас./мас.) протеаза/пептид или полипептид, по меньшей мере приблизительно 0,06% (мас./мас.) протеаза/пептид или полипептид,по меньшей мере приблизительно 0,07% (мас./мас.) протеаза/пептид или полипептид, по меньшей мере приблизительно 0,08% (мас./мас.) протеаза/пептид или полипептид, по меньшей мере приблизительно 0,09% (мас./мас.) протеаза/пептид или полипептид, по меньшей мере приблизительно 0,1% (мас./мас.) протеаза/пептид или полипептид, по меньшей мере приблизительно 0,2% (мас./мас.) протеаза/пептид или полипептид, по меньшей мере приблизительно 0,3% (мас./мас.) протеаза/пептид или полипептид, по меньшей мере приблизительно 0,4% (мас./мас.) протеаза/пептид или полипептид, по меньшей мере приблизительно 0,5% (мас./мас.) протеаза/пептид или полипептид, по меньшей мере приблизительно 0,6%(мас./мас.) протеаза/пептид или полипептид, по меньшей мере приблизительно 0,7% (мас./мас.) протеаза/пептид или полипептид, по меньшей мере приблизительно 0,8% (мас./мас.) протеаза/пептид или полипептид, по меньшей мере приблизительно 0,9% (мас./мас.) протеаза/пептид или полипептид, по меньшей мере приблизительно 1% (мас./мас.) протеаза/пептид или полипептид, по меньшей мере приблизительно 2% (мас./мас.) протеаза/пептид или полипептид, по меньшей мере приблизительно 3% (мас./мас.) протеаза/пептид или полипептид, по меньшей мере приблизительно 4% (мас./мас.) протеаза/пептид или полипептид, или приблизительно 5% (мас./мас.) протеаза/пептид или полипептид. Смесь может быть инкубирована при подходящей для протеазной активности температуре (например, комнатной температуре,приблизительно 37 С), и образцы могут быть отобраны с временными интервалами (например, через 1,2, 3 ч и т.д.). Образцы могут быть проанализированы в отношении деградации белка с использованием любого подходящего способа, такого как анализ путем SDS-PAGE или связывание лиганда, и результаты могут быть использованы для оценки динамики деградации по времени. В описанных здесь способах может быть использована любая желаемая протеаза или протеазы. Например, может быть использована одна протеаза, любая желаемая комбинация различных протеаз, или любой биологический препарат, биологический экстракт, или биологический гомогенат, который обла- 23018723 дает протеолитической активностью. Не обязательно, чтобы была известна идентичность используемой протеазы или протеаз. Подходящие примеры протеаз, которые могут быть использованы самостоятельно или в любой желаемой комбинации, включают сериновую протеазу, цистеиновую протеазу, аспартатпротеазы, тиоловые протеазы, матриксную металлопротеиназу, карбоксипептидазу (например, карбоксипептидазу А, карбоксипептидазу В), трипсин, химотрипсин, пепсин, папаин, эластазу, лейкозим, панкреатин, тромбин, плазмин, катепсины (например, катепсин G), протеиназу (например, протеиназу 1,протеиназу 2, протеиназу 3), термолизин, химозин, энтеропептидазу, каспазу (например, каспазу 1, каспазу 2, каспазу 4, каспазу 5, каспазу 9, каспазу 12, каспазу 13), калпаин, фикаин, клострипаин, актинидаин, бромелаин, сепаразу и т.п. Подходящие биологические экстракты, гомогенаты и препараты, обладающие протеолитической активностью, включают слюну, слизь (например, желудочную слизь, носовую слизь, бронхиальную слизь), бронхоальвеолярный лаваж, легочный гомогенат, легочный экстракт, экстракт поджелудочной железы, желудочную жидкость, слюну, слезы и т.п. Протеазу используют в количестве, подходящем для осуществления протеолитической деградации. Например, как здесь описано,протеаза может быть использована в концентрации от приблизительно 0,01 до приблизительно 5%(мас./мас., протеаза/пептид или полипептид). Когда протеазу объединяют с дисплейной системой, которая включает репертуар пептидов или полипептидов (например, система фагового дисплея), протеаза может быть использована в концентрации от приблизительно 10 мкг/мл до приблизительно 3 мг/мл, приблизительно 10 мкг/мл, приблизительно 20 мкг/мл, приблизительно 30 мкг/мл, приблизительно 40 мкг/мл, приблизительно 50 мкг/мл, приблизительно 60 мкг/мл, приблизительно 70 мкг/мл, приблизительно 80 мкг/мл, приблизительно 90 мкг/мл, приблизительно 100 мкг/мл, приблизительно 200 мкг/мл,приблизительно 300 мкг/мл, приблизительно 400 мкг/мл, приблизительно 500 мкг/мл, приблизительно 600 мкг/мл, приблизительно 700 мкг/мл, приблизительно 800 мкг/мл, приблизительно 900 мкг/мл, приблизительно 1000 мкг/мл, приблизительно 1,5 мг/мл, приблизительно 2 мг/мл, приблизительно 2,5 мг/мл или приблизительно 3 мг/мл. Протеазу инкубируют с коллекцией пептидов или полипептидов (библиотека или репертуар) при температуре, подходящей для активности протеазы. Например, протеазу и коллекцию пептидов или полипептидов можно инкубировать при температуре от приблизительно 20 до приблизительно 40 С (например, при комнатной температуре, приблизительно 20, приблизительно 21, приблизительно 22, приблизительно 23, приблизительно 24, приблизительно 25, приблизительно 26, приблизительно 27, приблизительно 28, приблизительно 29, приблизительно 30, приблизительно 31, приблизительно 32, приблизительно 33, приблизительно 34, приблизительно 35, приблизительно 36, приблизительно 37, приблизительно 38, приблизительно 39, приблизительно 40 С). Протеазу и коллекцию пептидов или полипептидов инкубируют вместе в течение периода времени, достаточного для осуществления протеолитической деградации. Например, коллекцию пептидов или полипептидов можно инкубировать вместе с протеазой в течение от приблизительно 30 мин до приблизительно 24 ч или приблизительно 48 ч. В некоторых примерах коллекцию пептидов или полипептидов инкубируют вместе с протеазой в течение ночи или в течение по меньшей мере приблизительно 30 мин, приблизительно 1 ч, приблизительно 1,5, приблизительно 2, приблизительно 3, приблизительно 4, приблизительно 5, приблизительно 6, приблизительно 7, приблизительно 8, приблизительно 9, приблизительно 10, приблизительно 11, приблизительно 12, приблизительно 13, приблизительно 14, приблизительно 15, приблизительно 16, приблизительно 17, приблизительно 18, приблизительно 19, приблизительно 20, приблизительно 21, приблизительно 22, приблизительно 23, приблизительно 24, приблизительно 48 ч или больше. В большинстве случаев желательно, по меньшей мере, на ранних раундах селекции (например, когда используют дисплейную систему), чтобы результатом действия протеазы было уменьшение количества клонов, имеющих желаемую биологическую активность, которая составляет, по меньшей мере, величину одного порядка в сравнении с активностью, полученной в раундах селекции, не включающих инкубацию с протеазой. В конкретных примерах количество протеазы и условия, использованные в таких способах, достаточны для уменьшения количества выделенных клонов по меньшей мере примерно на один логарифм (коэффициент 10), по меньшей мере примерно на 2 логарифма (коэффициент 100), по меньшей мере примерно 3 логарифма (коэффициент 1000) или по меньшей мере примерно 4 логарифма(коэффициент 10000). Подходящие количества протеазы и условия инкубации, которые будут приводить к желаемому уменьшению количества извлеченных клонов, могут быть легко определены с использованием традиционных методов и/или руководства, приведенного в данном изобретении. Протеаза и коллекция пептидов или полипептидов могут быть объединены и инкубированы с использованием любого подходящего способа (например, in vitro, in vivo или ex vivo). Например, протеаза и коллекция пептидов или полипептидов могут быть объединены в подходящем контейнере и выдержаны в условиях неподвижности, качания, встряхивания, вихревого вращения или т.п., при температуре,подходящей для протеазной активности. Если желательно, протеаза и коллекция пептидов или полипептидов могут быть объединены в системе in vivo или ex vivo, например, путем введения коллекции полипептидов (например, библиотеки фагового дисплея или репертуара) в подходящего животного (например, мышь) и после прохождения промежутка времени, достаточного для протеазной активности, извлечения коллекции пептидов или полипептидов. В другом примере орган или ткань подвергают перфузии коллекцией полипептидов (например, библиотекой фагового дисплея или репертуаром) и после прохождения промежутка времени, достаточного для протеазной активности, извлекают коллекцию полипептидов. После инкубации протеазоустойчивый пептид или полипептид может быть селектирован на основании желаемой биологической активности, такой как связывающая активность. Если желательно, протеазный ингибитор может быть добавлен перед селекцией. Может быть использован любой подходящий протеазный ингибитор (или комбинация двух или более протеазных ингибиторов), который, по существу, не будет препятствовать такому способу селекции. Примеры подходящих протеазных ингибиторов включают 1-анти-трипсин, 2-макроглобулин, амастатин, антипаин, антитромбин III, апротинин, гидрохлорид 4-(2-аминоэтил)бензолсульфонил-фторида(TPCK) и т.п. В дополнение к этому в продаже имеется много препаратов, которые содержат ингибиторы нескольких классов протеаз (например, Roche Complete Protease Inhibitor Cocktail Tablets (полный коктейль протеазных ингибиторов в таблетках от Roche) (Roche Diagnostics Corporation; Indianapolis, IN,USA), который ингибирует химотрипсин, термолизин, папаин, проназу, экстракт поджелудочной железы и трипсин). Селекция протеазоустойчивого пептида или полипептида может быть проведена с использованием желаемого способа селекции по биологической активности, который позволяет отличить пептиды и полипептиды, имеющие желаемую биологическую активность, от пептидов и полипептидов, не имеющих желаемой биологической активности, и провести их селекцию. В большинстве случаев пептиды или полипептиды, подвергнутые перевариванию или расщеплению протеазой, теряют свою биологическую активность, тогда как протеазоустойчивые пептиды или полипептиды сохраняют свою функциональность. Таким образом, для селекции протеазоустойчивых пептидов или полипептидов можно использовать подходящие анализы биологической активности. Например, обычная функция связывания (например, связывание с типичным лигандом, связывание со специфическим лигандом или связывание с субстратом) может быть оценена с использованием подходящего анализа связывания (например, ELISA,пэннинга). Например, полипептиды, которые связываются с целевым лигандом или типичным лигандом,таким как белок А, белок L или антитело, могут быть селектированы, выделены и/или извлечены посредством пэннинга или с использованием подходящей аффинной матрицы. Пэннинг может быть осуществлен путем добавления раствора лиганда (например, типичного лиганда, целевого лиганда) в подходящий сосуд (например, пробирку, чашку Петри) и оставления лиганда для осаждения на стенках или прикрепления к стенкам сосуда. Избыток лиганда можно отмыть, в сосуд можно добавить полипептиды (например, библиотеку фагового дисплея) и сосуд поддерживать в условиях, подходящих для связывания полипептидов с иммобилизованным лигандом. Несвязанный полипептид можно отмыть, а связанные полипептиды можно извлечь с использованием любого подходящего способа, такого как, например, соскабливание или уменьшение рН. Если используют систему фагового дисплея, то связывание может быть протестировано в фаговомELISA. Фаговый ELISA может быть проведен в соответствии с любой подходящей методикой. В одном из примеров популяции фага, продуцируемые в каждом раунде селекции, могут быть подвергнуты скринингу в отношении связывания в ELISA с выбранным целевым лигандом или типичным лигандом с целью идентификации фага, экспонирующего протеазоустойчивые пептиды или полипептиды. Если желательно, растворимые пептиды и полипептиды могут быть протестированы в отношении связывания с целевым лигандом или типичным лигандом, например, посредством ELISA с использованием реагентов,например, против С- или N-концевой метки (см., например, Winter et al. (1994), Ann. Rev. Immunology 12,433-55 и приведенные там ссылки). Вариабельность селектированного фага также может быть оценена посредством гель-электрофореза продуктов ПЦР (полимеразной цепной реакции) (Marks et al. 1991, выше; Nissim et al. 1994, выше), путем введения зонда (Tomlinson et al., 1992, J. Mol. Biol. 227, 776) или посредством секвенирования векторной ДНК. Дополнительно к специфичности в отношении TNFR1 антагонист или полипептид (например, обладающий двойной специфичностью лиганд), содержащий протеазоустойчивый полипептид противTNFR1 (например, единичный вариабельный домен антитела), может обладать специфичностью связывания в отношении типичного лиганда или любого желаемого целевого лиганда, такого как человеческие или животные белки, включая цитокины, факторы роста, цитокиновые рецепторы, рецепторы факторов роста, ферменты (например, протеазы), кофакторы ферментов, ДНК-связывающие белки, липиды и углеводороды. В некоторых воплощениях протеазоустойчивый пептид или полипептид (например, dAb) или антагонист связывается с TNFR1 в легочной ткани. В одном из воплощений антагонист или полипептид также связывается с дополнительной мишенью в легочной ткани. Если в способах, описанных в данном изобретении, используют дисплейную систему (например,дисплейную систему, в которой связаны кодирующая функция нуклеиновой кислоты и функциональные характеристики пептида или полипептида, кодируемого данной нуклеиновой кислотой), то часто бывает предпочтительно амплифицировать или увеличить количество копий нуклеиновых кислот, которые кодируют выбранные пептиды или полипептиды. Благодаря этому имеют эффективный способ получения достаточных количеств нуклеиновых кислот и/или пептидов или полипептидов для дополнительных раундов селекции с использованием способов, описанных в данном изобретении, или других подходящих способов либо для получения дополнительных репертуаров (например, репертуаров с "созреванием" аффинности). Таким образом, в некоторых воплощениях способ по изобретению включает применение дисплейной системы (например, в которой связаны кодирующая функция нуклеиновой кислоты и функциональные характеристики пептида или полипептида, кодируемого данной нуклеиновой кислотой, такой системы, как фаговый дисплей) и также включает амплификацию или увеличение количества копий нуклеиновой кислоты, которая кодирует селектированный пептид или полипептид. Нуклеиновые кислоты могут быть амплифицированы с использованием любых подходящих способов, например, посредством амплификации фагов, роста клеток или полимеразной цепной реакции. Способы, описанные в данном изобретении, могут быть использованы в качестве части программы по выделению протеазоустойчивых пептидов или полипептидов, например dAb, которая может включать в себя, если желательно, другие подходящие способы селекции. В этих ситуациях способы, описанные в данном изобретении, могут быть применены в любом желаемом месте данной программы, например, до или после использования других способов селекции. Кроме того, способы, описанные в данном изобретении, могут быть использованы для проведения двух или более раундов селекции, как описано и приведено в качестве примера в данном патенте. В одном из примеров изобретение относится к способу селекции пептида или полипептида, который устойчив к расщеплению эластазой, включающему получение библиотеки или репертуара пептидов или полипептидов, объединение библиотеки или репертуара с эластазой (или биологическим препаратом, экстрактом или гомогенатом, содержащим эластазу) в условиях, подходящих для протеолитического расщепления эластазой, и селекцию, выделение и/или извлечение пептида или полипептида, который устойчив к расщеплению эластазой и обладает TNFR1 связывающей активностью. В конкретных воплощениях предложен способ селекции иммуноглобулинового единичного вариабельного домена (dAb), который устойчив к расщеплению эластазой и связывается c TNFR1. В этих воплощениях библиотеку или репертуар, содержащие dAb, получают и объединяют с эластазой (или биологическим препаратом, экстрактом или гомогенатом, содержащим эластазу) в условиях, подходящих для протеолитического расщепления эластазой. Отбирают эластаза-устойчивые dAb, которые связываются с TNFR1. Например, эластаза-устойчивое dAb, по существу, не расщепляется, когда его инкубируют при 37 С в 0,04%-ном (мас./мас.) растворе эластазы в течение по меньшей мере примерно 2 ч. В одном воплощении эластаза-устойчивое dAb, по существу, не расщепляется, когда его инкубируют при 37 С в 0,04%-ном (мас./мас.) растворе эластазы в течение по меньшей мере примерно 12 ч. В одном воплощении эластаза-устойчивое dAb, по существу, не расщепляется, когда его инкубируют при 37 С в 0,04%-ном (мас./мас.) растворе эластазы в течение по меньшей мере примерно 24 ч, по меньшей мере примерно 36 ч или по меньшей мере примерно 48 ч. В воплощении предложен способ отбора единичного вариабельного домена иммуноглобулина(dAb), резистентного к деградации эластазой и связывающегося с TNFR1. Этот способ включает обеспечение системы фагового дисплея, содержащей репертуар полипептидов, которые содержат единичный вариабельный домен иммуноглобулина, комбинирование системы фагового дисплея с эластазой (приблизительно 100 мкг/мл) и инкубацию смеси при приблизительно 37 С, например, в течение ночи (например, приблизительно 12-16 ч), и затем отбор фага, которые представляет dAb, специфически связывающееся с TNFR1. В одном из примеров изобретение относится к способу селекции пептида или полипептида (например, dAb), который устойчив к расщеплению лейкозимом, включающему получение библиотеки или репертуара пептидов или полипептидов, объединение библиотеки или репертуара с лейкозимом (или биологическим препаратом, экстрактом или гомогенатом, содержащим лейкозим) в условиях, подходящих для протеолитического расщепления лейкозимом, и селекцию, выделение и/или извлечение пептида или полипептида, который устойчив к расщеплению лейкозимом и обладает специфической TNFR1 связывающей активностью. В конкретных воплощениях предложен способ селекции иммуноглобулинового единичного вариабельного домена (dAb), который устойчив к расщеплению лейкозимом и связывается с TNFR1. В этих воплощениях библиотеку или репертуар, содержащие dAb, получают и объединяют с лейкозимом (или биологическим препаратом, экстрактом или гомогенатом, содержащим лейкозим) в условиях, подходящих для протеолитического расщепления лейкозимом. Отбирают устойчивые к лейкозиму dAb, которые специфически связываются с TNFR1. Например, устойчивое к лейкозиму dAb, по существу, не расщепляется, когда его инкубируют при 37 С в 0,04%-ном (мас./мас.) растворе лейкозима в течение по меньшей мере примерно 2 ч. В одном воплощении устойчивое к лейкозиму dAb, по существу, не расщепляет- 26018723 ся, когда его инкубируют при 37 С в 0,04%-ном (мас./мас.) растворе лейкозима в течение по меньшей мере примерно 12 ч. В одном воплощении устойчивое к лейкозиму dAb, по существу, не расщепляется,когда его инкубируют при 37 С в 0,04%-ном (мас./мас.) растворе лейкозима в течение по меньшей мере примерно 24 ч, по меньшей мере примерно 36 ч или по меньшей мере примерно 48 ч. В одном воплощении изобретение относится к способу селекции иммуноглобулинового единичного вариабельного домена (dAb), который устойчив к расщеплению лейкозимом и специфически связывается с TNFR1. Способ включает получение системы фагового дисплея, содержащей репертуар полипептидов,которые содержат иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен, объединение данной системы фагового дисплея с лейкозимом (примерно 100 мкг/мл) и инкубирование этой смеси при примерно 37 С,например, в течение ночи (например, примерно 12-16 ч) и затем селекцию фага, экспонирующего dAb,которое специфически связывается с TNFR1. В другом примере предложен способ селекции пептида или полипептида (например, dAb), который устойчив к расщеплению трипсином, включающему получение библиотеки или репертуара пептидов или полипептидов, объединение библиотеки или репертуара с трипсином в условиях, подходящих для протеолитического расщепления трипсином, и селекцию, выделение и/или извлечение пептида или полипептида, который устойчив к расщеплению трипсином и специфически связывается с TNFR1. В конкретных воплощениях изобретение относится к способу селекции иммуноглобулинового единичного вариабельного домена (dAb), который устойчив к расщеплению трипсином и специфически связывается с TNFR1. В этих воплощениях библиотеку или репертуар, содержащие dAb, получают и объединяют с трипсином (или биологическим препаратом, экстрактом или гомогенатом, содержащим трипсин) в условиях, подходящих для протеолитического расщепления трипсином. Отбирают трипсинустойчивые dAb, которые связываются с TNFR1. Например, устойчивое к трипсину dAb, по существу, не расщепляется, когда его инкубируют при 37 С в 0,04%-ном (мас./мас.) растворе трипсина в течение по меньшей мере примерно 2 ч. В одном воплощении устойчивое к трипсину dAb, по существу, не расщепляется, когда его инкубируют при 37 С в 0,04%-ном (мас./мас.) растворе трипсина в течение по меньшей мере примерно 3 ч. В одном воплощении устойчивое к трипсину dAb, по существу, не расщепляется,когда его инкубируют при 37 С в 0,04%-ном (мас./мас.) растворе трипсина в течение по меньшей мере примерно 4 ч, по меньшей мере примерно 5 ч, по меньшей мере примерно 6 ч, по меньшей мере примерно 7 ч, по меньшей мере примерно 8 ч, по меньшей мере примерно 9 ч, по меньшей мере примерно 10 ч,по меньшей мере примерно 11 ч или по меньшей мере примерно 12 ч. В типичном воплощении предложен способ селекции иммуноглобулинового единичного вариабельного домена (dAb), который устойчив к расщеплению трипсином и специфически связывается сTNFR1. Способ включает получение системы фагового дисплея, содержащей репертуар полипептидов,которые содержат иммуноглобулиновый единичный вариабельный домен, объединение данной системы фагового дисплея с трипсином (100 мкг/мл) и инкубирование этой смеси при примерно 37 С, например,в течение ночи (например, примерно 12-16 ч), и затем селекцию фага, экспонирующего dAb, которое специфически связывается с TNFR1. В другом аспекте предложен способ получения репертуара протеазоустойчивых пептидов или полипептидов (dAb). Способ включает получение репертуара пептидов или полипептидов; объединение репертуара пептидов или полипептидов и протеазы в условиях, подходящих для протеазной активности; и извлечение множества пептидов или полипептидов, которые специфически связываются с TNFR1, посредством чего получают репертуар протеазоустойчивых пептидов или полипептидов. Протеазы, дисплейные системы, условия для протеазной активности и способы селекции пептидов или полипептидов,которые подходят для применения в данном способе, описаны в данном изобретении с учетом других способов по изобретению. В некоторых воплощениях используют дисплейную систему (например, дисплейную систему, в которой связаны кодирующая функция нуклеиновой кислоты и функциональные характеристики пептида или полипептида, кодируемого данной нуклеиновой кислотой), которая содержит репертуар пептидов или полипептидов, и способ также включает амплификацию или увеличение количества копий нуклеиновых кислот, кодирующих это множество селектированных пептидов или полипептидов. Нуклеиновые кислоты могут быть амплифицированы с использованием любого подходящего способа, например, посредством амплификации фагов, роста клеток или полимеразной цепной реакции. В конкретном воплощении предложен способ получения репертуара протеазоустойчивых полипептидов, содержащих анти-TNFR1 dAb. Способ включает получение репертуара полипептидов, содержащих dAb; объединение репертуара пептидов или полипептидов и протеазы (например, трипсина, эластазы, лейкозима) в условиях, подходящих для протеазной активности; и извлечение множества полипептидов, содержащих dAb, обладающих специфичностью связывания с TNFR1. Способ может быть использован для получения "наивного" репертуара или репертуара, который "смещен" в сторону желаемой специфичности связывания, такого как репертуар с созреванием аффинности, основанный на родительскомdAb, обладающем специфичностью связывания с TNFR1. Системы полипептидного дисплея В одном воплощении репертуар или библиотека пептидов или полипептидов, предложенные для применения в способах по изобретению, содержат подходящую дисплейную систему. Дисплейная система предпочтительно препятствует расщеплению протеазой (например, единичной протеазой или комбинацией протеаз и любым биологическим экстрактом, гомогенатом или препаратом, содержащим протеолитическую активность (например, мокроты, слизи (например, желудочной слизи, носовой слизи,бронхиальной слизи), бронхоальвеолярного лаважа, гомогената легких, экстракта легких, экстракта поджелудочной железы, желудочной жидкости, слюны, слез и т.п Дисплейная система и связь между этой дисплейной системой и экспонируемым полипептидом в одном воплощении, по меньшей мере, настолько же устойчивы к протеазе, насколько устойчивы наиболее стабильные пептиды или полипептиды репертуара. Это дает возможность легко выделить и/или амплифицировать нуклеиновую кислоту, кодирущую селектированный экспонируемый полипептид. В одном из примеров протеазоустойчивый пептид или полипептид (например, dAb) может быть селектирован, выделен и/или извлечен из репертуара пептидов или полипептидов, находящегося в растворе или ковалентно или нековалентно присоединенного к подходящей поверхности, такой как пластик или стекло (например, титрационному микропланшету, полипептидному массиву, такому как микромассив). Например, можно использовать расположение пептидов на поверхности способом, посредством которого каждый индивидуальный член библиотеки (например, уникальная пептидная последовательность) располагается в отдельном, предварительно определенном местоположении в этом массиве. Идентичность каждого члена библиотеки в таком массиве можно определить по его пространственному расположению в данном массиве. Те положения в массиве, где происходят взаимодействия связывания между, например, целевым лигандом и реакционноспособными членами библиотеки, могут быть определены, благодаря этому идентифицируют последовательности реакционноспособных членов на основе пространственного расположения (см., например, патент США 5143854, WO 90/15070 и WO 92/10092). В одном воплощении в данных способах используют дисплейную систему, в которой связаны кодирующая функция нуклеиновой кислоты и физические, химические и/или функциональные характеристики полипептида, кодируемого данной нуклеиновой кислотой. Такая дисплейная система может содержать множество способных реплицироваться генетических комплексов, таких как бактериофаг или клетки (бактерии). В одном воплощении дисплейная система содержит такую библиотеку, как бактериофаговая дисплейная библиотека. Описан ряд подходящих бактериофаговых дисплейных систем (например, моновалентные дисплейные и поливалентные дисплейные системы) (см., например, Griffiths и др., патент США 6555313 В 1(включенный в данное описание посредством ссылки); Johnson и др., патент США 5733743 (включенный в данное описание посредством ссылки); McCafferty и др., патент США 5969108 (включенный в данное описание посредством ссылки); Mulligan-Kehoe, патент США 5702892 (включенный в данное описание посредством ссылки); Winter, G. et al., Annu. Rev. Immunol. 12: 433-455 (1994); Soumillion, P. etScreen., 4(2): 121-133 (2001. Пептиды или полипептиды, экспонируемые в бактериофаговой дисплейной системе, могут экспонироваться, например, на любом подходящем бактериофаге, таком как нитчатый фаг (например, fd, М 13, F1), литический фаг (например, Т 4, Т 7, лямбда) или РНК-содержащий фаг (например, MS2). В большинстве случаев получена или предложена библиотека фага, экспонирующего репертуар пептидов или полипептидов в виде белков, слитых с подходящим белком оболочки фага (например, сpIII-белком fd). Слитый белок может эксонировать пептиды или полипептиды на конце белка оболочки фага, или, если будет желательно, во внутреннем положении. Например, экспонируемый пептид или полипептид может быть аминоконцевым относительно домена 1 в pIII (домен 1 в pIII также обозначают какN1). Экспонируемый полипептид может быть непосредственно слит с pIII (например, с N-концом домена 1 в pIII) или слит с pIII с использованием линкера. Если желательно, такая слитая конструкция может дополнительно содержать метку (например, эпитоп myc, His-метку). Библиотеки, содержащие репертуар пептидов или полипептидов, которые экспонируются в виде белков, слитых с белком оболочки фага,могут быть получены с использованием любых подходящих способов, таких как введение библиотеки фаговых векторов или фагмидных векторов, кодирующих экспонируемые пептиды или полипептиды, в подходящих бактерий-хозяев и культивирование полученных бактерий с целью продуцирования фага(например, с использованием подходящего хелперного фага или комплементирующей плазмиды, если желательно). Библиотека фага может быть извлечена из культуры с использованием любого подходящего метода, такого как осаждение и центрифугирование. Дисплейная система может содержать репертуар пептидов или полипептидов, который содержит любое желаемое количество разнообразных вариантов. Например, репертуар может содержать пептиды или полипептиды, которые имеют аминокислотные последовательности, соответствующие полипептидам природного происхождения, экспрессируемым организмом, группой организмов (например, репертуар последовательностей VHH dAb, выделенных из верблюжьих), желаемой тканью или желаемым типом клеток, или может содержать пептиды или полипептиды, которые имеют случайные или рандомизи- 28018723 рованные аминокислотные последовательности. Если желательно, полипептиды могут иметь общее ядро или общий остов. Полипептиды в таком репертуаре или такой библиотеке могут содержать определенные области случайной или рандомизированной аминокислотной последовательности и области общей аминокислотной последовательности. В некоторых воплощениях все или по существу все полипептиды в репертуаре являются полипептидами желаемого типа, такими как желаемый фермент (например, полимераза) или желаемый антигенсвязывающий фрагмент антитела (например, VH человека или VL человека). В некоторых воплощениях полипептидная дисплейная система содержит репертуар полипептидов,где каждый полипептид представляет собой вариабельный домен антитела. Например, каждый полипептид в репертуаре может содержать VH, VL или Fv (например, одноцепочечный Fv). Вариабельность аминокислотной последовательности может быть внесена в любую желаемую область пептида или полипептида либо остова с использованием любого подходящего способа. Например,вариабельность аминокислотной последовательности может быть внесена в целевую область, такую как определяющий комплементарность участок вариабельного домена антитела или гидрофобный домен,посредством получения библиотеки нуклеиновых кислот, кодирующих разнообразные полипептиды, с использованием любых подходящих методов мутагенеза (например, ПЦР пониженной точности, олигонуклеотид-опосредованного или сайт-специфического мутагенеза, диверсификации с использованием кодонов NNK) или любого другого подходящего метода. Если желательно, область полипептида, в которую должно быть внесено разнообразие, может быть выбрана случайным образом. Размер полипептидов, которые входят в состав репертуара, во многом является предметом выбора,и единообразный размер полипептида не обязателен. В одном воплощении полипептиды в репертуаре имеют, по меньшей мере, третичную структуру (образовывали по меньшей мере один домен). Селекция/выделение/извлечение Протеазоустойчивый пептид или полипептид (например, популяция протеазоустойчивых полипептидов) может быть селектирован, выделен и/или извлечен из репертуара или библиотеки (например, в дисплейной системе) с использованием любого подходящего способа. Предпочтительно протеазоустойчивый полипептид селектируют или выделяют на основании селектируемой характеристики (например,физической характеристики, химической характеристики, функциональной характеристики). Подходящие селектируемые функциональные характеристики включают биологические активности пептидов или полипептидов в репертуаре, например, связывание с типичным лигандом (например, суперантигеном),связывание с целевым лигандом (например, антигеном, эпитопом, субстратом), связывание с антителом(например, через эпитоп, экспрессируемый на пептиде или полипептиде) и каталитическую активность(см., например, Tomlinson et al., WO 99/20749; WO 01/57065; WO 99/58655). В одном из воплощений селекция основана на специфическом связывании с TNFR1. В еще одном воплощении селекция основана на выбранной функциональной характеристике с получением второго репертуара, в котором члены устойчивы к протеазе, а затем путем селекции члена из второго репертуара, специфически связывающегося с TNFR1. В некоторых воплощениях протеазоустойчивый пептид или полипептид отбирают и/или селектируют из библиотеки или репертуара пептидов или полипептидов, в которой по существу все протеазоустойчивые пептиды или полипептиды обладают общим селектируемым свойством. Например, протеазоустойчивый пептид или полипептид может быть выбран из библиотеки или репертуара, в которых по существу все протеазоустойчивые пептиды или полипептиды связываются с общим родовым лигандом,связываются с общим целевым лигандом, связываются (или связаны) с общим антителом, или обладают общей каталитической активностью. Этот тип селекции в особенности полезен для получения репертуара протеазоустойчивых пептидов или полипептидов, основанного на родительском пептиде или полипептиде, обладающем желаемой биологической активностью, например, когда осуществляют созревание аффинности иммуноглобулинового единичного вариабельного домена. Селекция на основании связывания с общим родовым лигандом может дать начало коллекции или популяции пептидов или полипептидов, содержащей все или по существу все из протеазоустойчивых пептидов или полипептидов, представляющих собой компоненты исходной библиотеки или репертуара. Например, пептиды или полипептиды, связывающие целевую лиганд или общий лиганд, такой как белок А, белок L или антитело, могут быть селектированы, выделены и/или извлечены посредством пэннинга или с использованием подходящей матрицы аффинности. Пэннинг может быть осуществлен путем добавления раствора лиганда (например, общего лиганда, целевого лиганда) в подходящий сосуд (например, пробирку, чашку Петри) и предоставления лиганду возможности осаждаться или образовывать слой на стенках сосуда. Избыток лиганда может быть отмыт, и пептиды или полипептиды (например, репертуар, который инкубируют с протеазой) могут быть добавлены в сосуд, и сосуд поддерживают в условиях, подходящих для связывания пептидов или полипептидов с иммобилизованным лигандом. Несвязавшиеся пептиды или полипептиды могут быть отмыты, а связанные пептиды или полипептиды могут быть выделены с использованием любого подходящего способа, такого как, например, соскребание или уменьшение рН. Подходящие аффинные матрицы для лиганда, как правило, содержат твердый носитель или шарики(например, агарозу), к которым лиганд прикреплен ковалентно или нековалентно. Аффинная матрица