Вирусоподобные частицы вируса гриппа, включающие гемагглютинин, продуцированный в растении

ВИРУСОПОДОБНЫЕ ЧАСТИЦЫ ВИРУСА ГРИППА, ВКЛЮЧАЮЩИЕ ГЕМАГГЛЮТИНИН, ПРОДУЦИРОВАННЫЙ В РАСТЕНИИ В соответствии с изобретением предлагается способ получения вирусоподобных частиц (ВЧ) в растении или его части. Способ включает введение ГА вируса гриппа в растения и очищение методом эксклюзивной хроматографии по размеру. В изобретении также предлагаются ВЧ,содержащие белок ГА вируса гриппа и растительные липиды. В изобретении также предлагается нуклеиновая кислота, кодирующая ГА вируса гриппа, а также векторы. ВЧ могут использоваться для создания вакцин от гриппа, либо для улучшения существующих вакцин. 018206 Изобретение относится к получению вирусоподобных частиц. Более конкретно, настоящее изобретение направлено на получение вирусоподобных частиц, представляющих собой антигены вируса гриппа. Предпосылки созданя изобретения Грипп является основной причиной смерти людей, вызванной респираторными вирусами. К его общим симптомам относятся, помимо прочего, лихорадка, боль в горле, одышка и боль в мышцах. В сезон гриппа вирусом гриппа во всем мире подвергаются инфицированию 10-20% населения, что приводит к смерти 250-500 тыс. человек ежегодно. Вирусы гриппа являются оболочечными вирусами, почкующимися из клеточной мембраны инфицированных клеток млекопитающих. Вирусы гриппа подразделяются на три типа: А, В и С, в зависимости от присутствия нуклеопротеидов и антигенов белков матрикса. Вирусы гриппа типа А далее могут быть подразделены на подтипы в зависимости от сочетания расположенных на поверхности гликопротеинов: гемагглютинина (ГА) и нейраминидазы (НА). ГА определяет способность вируса связываться с клеткой-хозяином и проникать в нее. НА удаляет терминальные остатки сиаловой кислоты из гликановых цепей на клетке-хозяине и белки на поверхности вируса, что препятствует агрегации вирусов и способствует их подвижности. В настоящее время известно 16 подтипов ГА (H1-H16) и 9 подтипов НА (N1N9). Каждый вирус гриппа типа А содержит по одному типу гликопротеинов ГА и НА. В общем случае каждый подтип проявляет видовую специфичность; например, известно, что все подтипы ГА и НА способны инфицировать птиц, но только подтипы H1, Н 2, Н 3, Н 5, Н 7, Н 9, Н 10, N1, N2, N3 и N7 опасны для людей (Horimoto 2006; Suzuki 2005). Вирусы гриппа, содержащие Н 5, Н 7 и Н 9, считаются наиболее патогенными формами вируса гриппа типа А, и скорее всего, именно они в будущем станут причиной пандемий. Пандемии гриппа, как правило, вызываются активно распространяющимися высоковирулентными вирусами гриппа, они могут привести к повышенному уровню заболеваемости и смертности в мире. Появление новых подтипов А вируса гриппа привело к 4 главным пандемиям в XX веке. Грипп-испанка,вызванный вирусом H1N1 в 1918-1919 гг., унес жизни более чем 50 млн людей в мире в период с 1917 по 1920 г.г. В настоящее время постоянно существует риск появления нового подтипа или передачи людям подтипа вируса, эндемичного для животных. Особое беспокойство вызывает высоковирулентная форма,называемая "птичий грипп", вспышки которой были зафиксированы в нескольких странах по всему миру. Во многих случаях птичий грипп может вызвать практически 100%-ную смертность в течение 2 суток. Утверждается, что распространение вируса птичьего гриппа (H5N1), который был впервые обнаружен в Гонконге в 1997 г., в другие страны Азии и Европы связано с сезонной миграцией диких птиц. Современным способом борьбы с гриппом у людей является ежегодная вакцинация. Вакцина обычно представляет собой комбинацию нескольких штаммов, которые, как прогнозируется, будут доминирующими в наступающем "сезоне гриппа". Данный прогноз координирует Всемирная организация здравоохранения. В целом количество доз вакцины, которое изготавливается каждый год, недостаточно для вакцинации всего населения в мире. Например, Канада и США получают вакцину в количестве, достаточном для одной трети населения, а для Европейского союза эта величина составляет лишь 17% населения. Очевидно, что существующий объем производства вакцины от гриппа окажется недостаточным перед лицом мировой пандемии. Даже если необходимый годовой объем е производства и будет какимлибо образом достигнут в определенный год, доминирующие штаммы от года к году меняются, и поэтому невозможно предварительное создание запасов вакцины в периоды е низкого потребления. Экономически выгодное крупномасштабное производство эффективной вакцины от гриппа представляет значительный интерес как для государственных промышленных предприятий, так и для частного бизнеса. Запасы вирусов, предназначенные для применения в вакцинах, получают в оплодотворенных яйцах. Вирусные частицы собирают и, при получении убитой вакцины, обрабатывают детергентом для инактивации. Живые ослабленные вакцины получают из вирусов гриппа, адаптированных для роста при низких температурах, что означает, что в организме при нормальной температуре вакцина будет ослаблена. Такая вакцина лицензирована в США для людей в возрасте от 5 до 49 лет. Убитые цельновирионные вакцины становятся безопасными при инактивации химическими реагентами, они образуются в оплодотворенных яйцах или клеточных культурах млекопитающих. Все указанные типы вакцин имеют свои преимущества и недостатки. Одним из преимуществ вакцин, полученных из цельных вирусов, является тип иммунитета, вызванный такой вакциной. В целом, расщепленные (сплит) вакцины вызывают сильный гуморальный ответ (образование антител), в то время как вакцины, изготовленные из цельных вирусов,вызывают как гуморальный, так и клеточный ответ. Несмотря на то что функциональный гуморальный ответ является критерием для лицензирования, коррелирующим с защитным действием вакцины, имеется все больше указаний на то, что Т-клеточный ответ также играет важную роль в иммунитете против гриппа, обеспечивая более надежную защиту для пожилых людей. Для получения клеточного иммунного ответа были разработаны вакцины из цельных вирусов. Вследствие высокой патогенности штамма гриппа (например, H5N1), такие вакцины получают с использованием оборудования с биологической защитой BL3+. Для высокопатогенных штаммов гриппа, таких как H5N1, некоторые производители модифицировали последовательность гена гемагглютинина с целью-1 018206 снижения патогенности штамма гриппа, который становится авирулентным и лучше продуцируется в яйцах или клеточных культурах млекопитающих. В других случаях применялись химерные штаммы, где генетические последовательности белков гемагглютинина и нейраминидазы клонируют в высокопродуктивном донорном штамме гриппа низкой патогенности (A/PR/8/34; Quan F-S с соавт., 2007). Такими способами можно получить полезные вакцины, но при этом не решается задача быстрого производства больших количеств недорогих вакцин в объеме, достаточном для соответствия потребностям обычного года, и разумеется, этого недостаточно в случае пандемии. При использовании технологии обратной генетики может потребоваться также мутация генетической последовательности белка ГА, чтобы сделать его авирулентным. Для высокопатогенных штаммов гриппа производство цельновирионной вакцины либо требует конфайнмента, либо полученные вакцины не будут полностью соответствовать распространяющемуся вирусу по генетической последовательности. Для ослабленных живых вакцин существует риск того, что введенная вакцина будет рекомбинировать с вирусом гриппа организма-хозяина, давая новый вирус гриппа. Несмотря на то что указанный способ поддерживает антигенный эпитоп и посттрансляционную модификацию, у него имеется ряд недостатков, в том числе риск загрязнения вследствие использования цельных вирусов и непостоянный объем производства, в зависимости от штамма вируса. Генетическая неоднородность вируса, вследствие его введения в яйца, может привести к уровню защиты ниже оптимального. К прочим недостаткам относятся: предварительное планирование для получения яиц, риск загрязнения вследствие участия химических веществ в процессе очистки и длительное время производства. Помимо этого, лица, имеющие повышенную чувствительность к яичному белку, возможно, не смогут получать такую вакцину. В случае пандемии производство сплит-вакцин ограничивается необходимостью адаптировать штамм для роста на яйцах и непостоянным количеством продукта. Несмотря на то что данная технология применяется в течение многих лет для получения сезонных вакцин, она вряд ли пригодна для временных рамок развития пандемии, а объем производства в мире ограничен. Для исключения применения яиц вирусы гриппа производили также в клеточной культуре млекопитающих, например в клетках MDCK или PERC.6 или их аналогах. Еще одним подходом является обратная генетика, где вирусы образуются при трансформации клеток генами вируса. Однако указанные способы также требуют применения цельного вируса, а также хорошо разработанных методов и специальных культурных сред. В качестве кандидатур на роль рекомбинантной вакцины от гриппа было разработано несколько продуктов. При этом основное внимание уделяется экспрессии, продуцировании и очистке белков ГА и НА вируса гриппа типа А, в том числе экспрессии указанных белков с помощью клеток насекомых, зараженных бакуловирусом (Crawford с соавт., 1999; Johansson, 1999), вирусных векторов и конструкций ДНК- вакцин (Olsen с соавт., 1997). Специфика заражения вирусом гриппа хорошо известна. Вкратце, инфекционный цикл инициируется присоединением белка ГА, находящегося на поверхности вириона, к клеточному рецептору, содержащему сиаловую кислоту (гликопротеины и гликолипиды). Белок НА влияет на процессинг рецептора сиаловой кислоты, и проникновение вируса в клетку определяется ГА-зависимым эндоцитозом, обусловленным рецептором. В кислотных условиях интернализированных эндосом, содержащих вирион гриппа,конформационные изменения в ГА-белке приводят к слиянию вирусной и клеточной мембраны и потере вирусом оболочки и М 2-опосредованному высвобождению MI-белков из нуклеокапсид-ассоциированных рибонуклеопротеидов (РНП), которые мигрируют в ядро клетки для синтеза вирусной РНК. Антитела к белкам ГА предотвращают инфицирование вирусом, нейтрализуя инфективность вируса, а антитела к белкам НА тормозят их влияние на ранних стадиях репликации вируса. В работе Crawford с соавт. (1999) раскрывается экспрессия ГА вируса гриппа в клетках насекомых,зараженных бакуловирусом. Белки, полученные в результате экспрессии, были способны предотвращать летальное заболевание гриппом, вызванное подтипами Н 5 и Н 7 птичьего вируса. В работе Johansson с соавт. (1999) указано, что белки ГА и НА вируса гриппа, экспрессированные бакуловирусом, вызывают иммунный ответ у животных, превосходящий иммунный ответ, вызванный обычными вакцинами. Иммуногенность и эффективность гемагглютинина вируса лошадиного гриппа, полученного экспрессией бакуловирусом, сравнивали с вакциной-кандидатом с гомологичной ДНК (Olsen с соавт., 1997). Все эти данные показывают, что при использовании различных экспериментальных методов и различных животных моделей рекомбинантные белки ГА или НА могут обеспечить высокую степень защиты против вируса гриппа. Так как предыдущие исследования показали, что гликопротеиды, ГА и НА, расположенные на поверхности вируса гриппа, являются первичными мишенями для выявления защитного иммунитета против вируса гриппа и что M1 представляет собой консервативную мишень для клеточного иммунитета к вирусу гриппа, новая вакцина-кандидат может включать указанные вирусоспецифические антигены в форме белковой макромолекулярной частицы, такой как вирусоподобная частица (ВЧ). Преимущество ВЧ, используемой в качестве вакцин, состоит в более высокой иммуногенности по сравнению с субъединичными или рекомбинантными антигенами, а также в способности стимулировать как гуморальный, так-2 018206 и клеточный иммунный ответ (Grgacic and Anderson, 2006). Далее, частица с такими антигенами вируса гриппа может иметь конформационные эпитопы, приводящие к образованию нейтрализующих антител к множественным штаммам вируса гриппа. Одним из способов предотвращения случайного инфицирования является производство неинфекционного штамма вируса гриппа для вакцины. В качестве альтернативы исследовали применение вирусоподобных частиц (ВЧ), вместо культивируемого вируса. ВЧ имитируют строение капсулы вируса, но у них отсутствует геном, и таким образом они неспособны реплицироваться или вызывать вторичную инфекцию. В нескольких исследованиях было показано, что рекомбинантные белки вируса гриппа агрегируются с образованием ВЧ в клеточной культуре с помощью экспрессионной плазмиды млекопитающих или векторов бакуловируса (Gomez-Puertas с соавт., 1999; Neumann с соавт., 2000; Latham and Galarza, 2001). В работе Gomez-Puertas с соавт. (1999) указано, что эффективное образование ВЧ вируса гриппа зависит от уровня экспрессии нескольких вирусных белков. В работе Neumann с соавт. (2000) создана система на основе экспрессионной плазмиды млекопитающих для генерирования инфекционных вирусоподобных частиц вируса гриппа исключительно из клонированных ДНК. Latham and Galarza (2001) сообщили об образовании ВЧ вируса гриппа в клетках насекомых, инфицированных рекомбинантным бакуловирусом,при коэкспрессии генов ГА, НА, M1 и М 2. Указанные исследования продемонстрировали, что белки вириона гриппа способны к самосборке при коэкспрессии в клетках-эукариотах. Согласно Gomez-Puertas с соавт. (2000), помимо гемагглютинина (ГА), для почкования ВЧ из клеток насекомых необходим матричный белок (M1) вируса гриппа. Однако Chen с соавт. (2007) указывали,что Ml может не требоваться для образования ВЧ, и обнаружили, что для эффективного выделения M1 и ВЧ требуется присутствие ГА и сиалидазная активность, которая обеспечивается НА. НА расщепляет сиаловые кислоты гликопротеидов на поверхности клеток, продуцирующих ВЧ, которые выходят во внешнюю среду. Согласно Quan с соавт. 2007, вакцина на основе ВЧ, полученная в системе экспрессии бакуловируса(клетка насекомого), вызывает защитный иммунитет против некоторых штаммов вируса гриппа(A/PR8/34 (H1N1. В работе Quan при почковании из плазматической мембраны ВЧ имели правильный размер и морфологию, аналогичные тем, что были получены в системе клеток млекопитающих (клеткиMDCK). Оболочечные вирусы могут приобрести липидную оболочку при почковании из инфицированной клетки, а мембрану - из плазматической мембраны либо из мембраны внутренних органелл. Частицы вируса гриппа и ВЧ выходят из плазматической мембраны клетки-хозяина. В системах на основе клеток млекопитающих и бакуловирусов, например, вирус гриппа почкуется из плазматической мембраны(Quan с соавт. 2007). Известно лишь несколько оболочечных вирусов, способных инфицировать растения(например, топовирусы и рабдовирусы). Среди известных оболочечных вирусов они характеризуются почкованием из внутренних мембран клеток-хозяев, а не из плазматической мембраны. Несмотря на то что лишь немного рекомбинантных ВЧ было получено в растениях-хозяевах, ни одна из них не образовалась из плазматической мембраны, в связи с чем возникает вопрос, возможно ли получение в растениях ВЧ из плазматической мембраны, в том числе и ВЧ вируса гриппа. Существующие технологии продуцирования ВЧ вируса гриппа основаны на коэкспрессии многих вирусных белков, что является недостатком данных технологий, так как в случае пандемии или ежегодной эпидемии время реагирования является решающим для вакцинации. Для ускорения разработки вакцины предпочтительна более простая система для получения ВЧ, зависящая от экспрессии только одного вирусного белка. Для защиты населения от гриппа и для предотвращения будущих пандемий производители вакцин должны разработать эффективные и быстрые методы для производства доз вакцины. Существующая технология использования оплодотворенных яиц для производства вакцин неудовлетворительна и требует длительного времени. Краткое описание изобретения Изобретение преследует цель получения улучшенных вирусоподобных частиц (ВЧ) вируса гриппа. В соответствии с настоящим изобретением предлагается нуклеиновая кислота, включающая последовательность нуклеотидов, кодирующую антиген оболочечного вируса, оперативно связанная с регуляторным участком, который активен в растении. Антиген может представлять собой гемагглютинин (ГА) вируса гриппа. В настоящем изобретении также предлагается способ получения вирусоподобных частиц (ВЧ) вируса гриппа в растении, включающий:a) введение в растение или его часть нуклеиновой кислоты, кодирующей антиген оболочечного вируса, например гемагглютинин вируса гриппа (ГА), оперативно связанной с регуляторным участком,который активен в растении иb) инкубирование растения или его части в условиях, позволяющих экспрессию нуклеиновой кислоты с получением таким образом ВЧ. Способ может также включать стадии сбора растения и очистки или отделения ВЧ от ткани расте-3 018206 ния. Настоящее изобретение включает вышеприведенный способ, где на стадии введения (стадия (а нуклеиновая кислота может быть экспрессирована в растении временным или стабильным образом. Далее, ВЧ могут быть очищены методом эксклюзионной хроматографии по размеру. В настоящем изобретении также предлагаются вирусоподобные частицы (ВЧ), содержащие белок ГА вируса гриппа и один или более одного растительный липид. В настоящее изобретение также входит композиция, содержащая эффективную дозу ВЧ, содержащих белок ГА вируса гриппа, один или более одного растительный липид и фармацевтически приемлемый носитель. Настоящее изобретение также предусматривает фрагменты или части белков ГА, образующих ВЧ в растении. ВЧ может содержать белок ГА одного или более чем одного подтипа, в том числе H1, Н 2, Н 3, Н 4,Н 5, Н 6, Н 7, Н 8, Н 9, Н 10, Н 11, Н 12, Н 13, Н 14, Н 15 или Н 16 или их фрагмент или часть. Примеры подтипов, содержащих такие белки ГА - А/Новая Каледония/20/99 (Н 1N1)А/Индонезия/5/2006 (H5N1),А/куры/Нью-Йорк/1995, А/серебристые чайки/Делавер/677/88 (H2N8), А/Техас/32/2003, А/кряквы/(H2N2), А/Аньхой/1/2005 (H5N1), А/Вьетнам/1194/2004 (H5N1), А/дикие утки/Гонконг/W312/97 (H6N1),А/лошади/Прага/56 (H7N7), А/Гонконг/1073/99 (H9N2). Согласно одному из аспектов изобретения белок ГА может относиться к подтипу H1, Н 2, Н 3, Н 5,Н 6, Н 7 или Н 9. Согласно другому варианту, белок H1 может происходить из штаммов А/Новая Каледония/20/99 (H1N1), А/Пуэрто-Рико/8/34 (H1N1), А/Брисбен/59/2007 (H1N1) или А/Соломоновы Острова 3/2006 (H1N1). Белок Н 3 может также происходить из штаммов А/Брисбен 10/2007 (H3N2) или А/Висконсин/67/2005 (H3N2). Еще в одном варианте изобретения белок Н 2 может быть из штамма А/Сингапур/1/57 (H2N2). Белок Н 5 может быть из штамма А/Аньхой/1/2005 (H5N1),А/Вьетнам/1194/2004 (H5N1) или А/Индонезия/5/2005. В одном из вариантов изобретения белок Н 6 может быть из штамма А/дикие утки/Гонконг/W312/97 (H6N1). Белок Н 7 может быть из штамма А/лошади/Прага/56 (H7N7). Согласно варианту изобретения белок Н 9 - из штамма А/Гонконг/1073/99(H9N2). В другом варианте изобретения белок ГА может быть из вируса гриппа, который может быть вирусом типа В, включая В/Малайзия/2506/2004 или В/Флорида/4/2006. Примеры аминокислотных последовательностей белков ГА подтипов H1, Н 2, Н 3, Н 5, Н 6, Н 7 и Н 9 - SEQ ID NOs: 48-59. Белок ГА вируса гриппа может быть белком Н 5 Индонезия. Согласно настоящему изобретению также предлагаются молекулы нуклеиновых кислот с последовательностями, кодирующими белок ГА. Молекулы нуклеиновых кислот могут содержать один или более регуляторный участок, оперативно связанный с последовательностью, кодирующей белок ГА. Молекулы нуклеиновых кислот могут содержать последовательность, кодирующую H1, Н 2, Н 3, Н 4, Н 5, Н 6,Н 7, Н 8, Н 9, Н 10, Н 11, Н 12, Н 13, Н 14, Н 15 или Н 16. В одном варианте изобретения белок ГА, который кодируется молекулой нуклеиновой кислоты, относится к подтипу H1, H2, Н 3, Н 5, Н 6, Н 7 или Н 9. БелокH1, который кодируется молекулой нуклеиновой кислоты, может быть из А/Новая Каледония/20/99(H1N1). В одном варианте изобретения белок Н 3, который кодируется молекулой нуклеиновой кислоты,может быть из А/Брисбен 10/2007 (H3N2), или А/Висконсин/67/2005 (H3N2). Еще в одном варианте изобретения белок Н 2, который кодируется молекулой нуклеиновой кислоты, может быть из штамма А/Сингапур/1/57 (H2N2). Белок Н 5, который кодируется молекулой нуклеиновой кислоты, может также быть из штамма А/Аньхой/1/2005 (H5N1), А/Вьетнам/1194/2004 (H5N1) или А/Индонезия/5/2005. В одном варианте изобретения, белок Н 6, который кодируется молекулой нуклеиновой кислоты, может быть из штамма А/Дикие утки/Гонконг/W312/97 (H6N1). Белок Н 7, который кодируется молекулой нуклеиновой кислоты, может также быть из штамма А/лошади/Прага/56 (H7N7). Помимо этого, белок Н 9, который кодируется молекулой нуклеиновой кислоты, может быть из штамма А/Гонконг/1073/99 (H9N2). Примерами последовательностей нуклеиновых кислот, кодирующих такие белки ГА подтипов H1, Н 2,Н 3, Н 5, Н 6, Н 7 и Н 9, являются SEQ ID NO: 36-47 и 60-73. Последовательность нуклеиновой кислоты может кодировать белок ГА Н 5 вируса гриппа Индонезия. Регуляторные участки, которые могут быть оперативно связаны с последовательностью, кодирующей белок ГА, включают оперативные участки клетки растения, клетки насекомого или клетки дрожжей. К таким регуляторным участкам относятся регуляторный участок пластоцианина, регуляторный участок рибулозо-1,5-бисфосфат-карбоксилазы/оксигеназы (RuBisCO), хлорофилл a/b-связывающего белка(CAB), ST-LS1, регуляторный участок полиэдрина или регуляторный участок gp64. Другие регуляторные-4 018206 участки - 5' НТО, 3' НТО или последовательности прерывания. Регуляторный участок пластоцианина может быть регуляторным участком пластоцианина люцерны; 5' НТО, 3' НТО и последовательность прерывания также могут быть последовательностями люцерны. Предлагается также способ создания иммунитета к вирусу гриппа у объекта, включающий введение вирусоподобных частиц в составе белок ГА вируса гриппа, один или более одного растительный липид и фармацевтически приемлемый носитель. Вирусоподобные частицы можно вводить объекту перорально,внутрикожно, интраназально, внутримышечно, внутрибрюшинно, внутривенно либо подкожно. Настоящее изобретение также относится к вирусоподобной частице (ВЧ), состоящей из одного или более одного белка, полученного из вируса, выбранного из группы, включающей вирусы гриппа, кори,Эбола, Марбург и ВИЧ, и одного или более одного липида, полученного из несиалилирующей клеткихозяина. Белок ВИЧ может представлять собой р 24, gpl20 или gp41; белок вируса Эбола может бытьVP30 или VP35; белок вируса Марбург может быть Gp/SGP; белок вируса кори может быть Н-белком или F-белком. Далее, настоящее изобретение относится к вирусоподобной частице (ВЧ), состоящей из белка ГА вируса гриппа и одного или более одного липида-хозяина. Например, если хозяином является насекомое,вирусоподобная частица (ВЧ) может содержать белок ГА вируса гриппа и один или более одного липид насекомого, либо если хозяин - дрожжи, то вирусоподобная частица (ВЧ) может содержать белок ГА вируса гриппа один или более одного липида дрожжей. Настоящее изобретение также относится к композициям, содержащим ВЧ двух или более штаммов или подтипов гриппа. Два или более подтипа или штамма могут быть выбраны из группы, включающей: А/Новая Каледония/20/99 (H1N1) А/Индонезия/5/2006 (H5N1), А/куры/Нью-Йорк/1995, А/серебристые чайки/Делавер/677/88(H2N8),А/Техас/32/2003,А/кряквы/MN/33/00,А/утки/Шанхай/1/2000,А/шилохвости/Техас/828189/02, А/индейки/Онтарио/6118/68 (H8N4), А/утки-широконоски/Иран/G54/03,А/куры/Германия/N/1949(Н 10N7), А/утки/Англия/56 (H11N6), А/утки/Альберта/60/76 (H12N5),А/чайки/Мэриленд/704/77(Н 13N6), А/кряквы/Гурьев/263/82, А/утки/Австралия/341 /83 (H15N8), А/чайки обыкновенные/Швеция/5/99(Н 16N3), В/Ли/40, С/Йоханнесбург/66, А/Пуэрто-Рико/8/34 (H1N1),А/Брисбен/59/2007 (H1N1), А/Соломоновы Острова 3/2006 (H1N1), А/Брисбен 10/2007 (H3N2),А/Висконсин/67/2005 (H3N2), В/Малайзия/2506/2004, В/Флорида/4/2006, А/Сингапур/1/57 (H2N2),А/Аньхой/1/2005 (H5N1), А/Вьетнам/1194/2004 (H5N1), А/дикие утки/Гонконг/W312/97 (H6N1),А/лошади/Прага/56 (H7N7) или А/Гонконг/1073/99 (H9N2. Два или более подтипа или штамма ВЧ могут присутствовать приблизительно в эквивалентных количествах; либо один или более подтип или штамм может составлять большую часть из присутствующих штаммов или подтипов. Настоящее изобретение относится к способу создания иммунитета к вирусу гриппа у животного или целевого организма, включающему введение эффективной дозы вакцины, состоящей из одного или более одного ВЧ, при этом ВЧ получены с помощью несиалилирующего хозяина, например растенияхозяина, насекомого-хозяина или дрожжей-хозяина. Вакцину можно вводить перорально, внутрикожно,интраназально, внутримышечно, внутрибрюшинно, внутривенно либо подкожно. Целевой организм может быть выбран из группы, включающей человека, приматов, лошадей, свиней, водоплавающих птиц,перелтных птиц, перепелок, уток, гусей, домашних птиц, кур, верблюдов, псовых, собак, кошачьих, кошек, тигров, леопардов, циветт, норок, каменных куниц, хорьков, комнатных животных, домашний скот,мышей, крыс, тюленей, китов и т.д. Настоящее изобретение предлагает способ получения ВЧ, содержащих гемагглютинин (ГА) из разных штаммов вируса гриппа, в приемлемом хозяине, способном продуцировать ВЧ, например в растении, насекомом или дрожжах. ВЧ, полученные в растениях, содержат липиды растительного происхождения, ВЧ, полученные в организме насекомых, содержат липиды из плазматической мембраны клеток насекомых (обычно называемые "липиды насекомых"), а ВЧ, полученные в дрожжах, содержат липиды из плазматической мембраны клеток дрожжей (обычно называемые "липиды дрожжей"). Получение ВЧ в растениях имеет ряд преимуществ по сравнению с их получением в клеточных культурах насекомых. Растительные липиды способны стимулировать специфические иммунные клетки и таким образом усилить иммунный ответ. Растительные мембраны состоят из липидов, фосфатидилхолина (ФХ) и фосфатидилэтаноламина (ФЭ), а также содержат гликосфинголипиды, свойственные только растениям, и некоторые бактерии и простейшие. Особенность сфинголипидов в том, что они не являются эфирами глицерина, как ФХ и ФЭ, а состоят из длинноцепного аминоспирта, связанного амидной связью с жирной кислотой, содержащей в цепи более 18 атомов углерода. ФХ и ФЭ, а также гликосфинголипиды могут связываться молекулами CD1, экспрессирующимися иммунными клетками млекопитающих,такими как антигенпредставляющие клетки (АПК), например, дендритные клетки и макрофаги, и другие клетки, в том числе В- и Т-лимфоциты тимуса и печени (Tsuji M., 2006). Далее, помимо потенциального адъювантного действия растительных липидов, растительные N-гликаны способствуют захвату антигенов гликопротеидов антигенпредставляющими клетками (Saint-Jore-Dupas, 2007), что может повышать эффективность продукции ВЧ в растениях. Не желая ограничиваться конкретной теорией, считают, что ВЧ, полученные в растениях, вызовут более сильную иммунную реакцию, чем ВЧ, полученные в других системах производства, и что иммун-5 018206 ная реакция, вызванная ВЧ из растений, будет сильнее по сравнению с иммунной реакцией, вызванной живой или ослабленной цельновирионной вакциной. В отличие от вакцин, изготовленных из цельных вирусов, преимущество ВЧ в том, что они не инфекционны, поэтому биологическая защита не столь важна, как при работе с цельным инфекционным вирусом и не требуется при производстве. В этом отношении растительные ВЧ имеют дополнительное преимущество, так как систему экспрессии можно выращивать в оранжерее или на открытом воздухе,вследствие чего способ является более экономичным и пригодным для увеличения масштабов производства. Далее, растения не содержат ферментов, участвующих в синтезе и присоединении к белкам остатков сиаловой кислоты. Получение ВЧ можно проводить в отсутствие нейраминидазы (НА), при этом нет необходимости в коэкспрессии НА либо в обработке продуцирующих клеток или экстракта сиалидазой(нейраминидазой) для получения ВЧ в растениях. ВЧ, полученные в соответствии с настоящим изобретением, не содержат белка M1, который, как известно, связывает РНК. РНК является примесью при получении ВЧ, нежелательной при аттестации продукции официальными органами. Данное краткое описание изобретения не обязательно включает все признаки изобретения. Краткое описание рисунков Приведенные выше и прочие признаки изобретения будут более понятными из последующего подробного описания, в котором содержатся ссылки на прилагаемые чертежи (фиг.), на которых: на фиг. 1 А показана последовательность экспрессирующей кассеты на основе пластоцианина люцерны для экспрессии H1 в соответствии с осуществлением настоящего изобретения (SEQ ID NO:8). Сигнальный пептид протеиндисульфидизомеразы (PDI) подчеркнут. Сайты рестрикции BglII (AGATCT) и SacI (GAGCTC), используемые для клонирования, показаны жирным шрифтом. На фиг. 1 В показана схема функциональных доменов гемагглютинина вируса гриппа. После расщепления ГА 0, фрагменты ГА 1 и ГА 2 остаются связаны дисульфидным мостиком. На фиг. 2 А представлено изображение плазмиды 540 в компоновке для экспрессии ГА подтипа H1. На фиг. 2 В показано изображение плазмиды 660 в компоновке для экспрессии ГА подтипа Н 5. На фиг. 3 представлена эксклюзионная хроматография экстрактов белка из листьев после получения гемагглютинина H1 или Н 5. На фиг. 3 А показан профиль элюирования H1; декстран голубой 2000(треугольники) и белки (ромбики). На фиг. 3 В представлен иммунологический анализ (вестерн-блоттинг; анти H1) элюированных фракций H1 после эксклюзионной хроматографии (фаза S500-HR). На фиг. 3 С показан профиль элюирования Н 5; декстран голубой 2000 (треугольники) и белки (ромбики). На фиг. 3D представлен иммунологический анализ (вестерн-блоттинг; анти Н 5) элюированных фракций Н 5 после эксклюзионной хроматографии (фаза S500-HR). На фиг. 4 показана электронная микрофотография крупных структур гемагглютинина H1 и Н 5, полученных из фракции 9, элюированной из хроматографической колонки. На фиг. 4 А показано 50000 кратное увеличение ВЧ из H1, на котором видны множественные сходные структуры (черта соответствует 200 нм). На фиг. 4 В показано 150000-кратное увеличение ВЧ из H1 (черта соответствует 100 нм). На фиг. 4 С показано 50000-кратное увеличение ВЧ из Н 5, на котором видны множественные сходные структуры (черта соответствует 50 нм). На фиг. 5 А представлена последовательность N-терминального фрагмента H1 (SEQ ID NO: 1). На фиг. 5 В представлен С-концевой фрагмент H1 (SEQ ID NO:2). На фиг. 5 С показана полная последовательность, кодирующая ГА 0 H1 (SEQ ID NO:28). На фиг. 6 показана последовательность, кодирующая Н 5, фланкированная сайтом HindIII непосредственно перед исходным ATG и сайтом SacI непосредственно после стоп-кодона (ТАА) (SEQ ID NO:3) На фиг. 7 А показана последовательность праймера Plasto-443c (SEQ ID NO:4). На фиг. 7 В показана последовательность праймера SpHA(Ind)-Plasto.r (SEQ ID NO:5). На фиг. 7 С показана последовательность праймера Plasto-SpHA(Ind).c (SEQ ID NO:6). На фиг. 7D показана последовательность праймераHA(Ind)-Sac.r (SEQ ID NO:7). На фиг. 8 А показана аминокислотная последовательность пептида ГА 1 (SEQ ID NO:9). На фиг. 8 В представлена аминокислотная последовательность пептида ГА 5 (SEQ ID NO: 10). Нативный сигнальный пептид выделен жирным шрифтом. На фиг. 9 показана последовательность ГА вируса гриппа А подтипа Н 7 (SEQ ID 15NO: 11). На фиг. 10 А показана последовательность ГА вируса гриппа А подтипа Н 2 (SEQ ID NO: 12). На фиг. 10 В показана последовательность ГА вируса гриппа А подтипа Н 3 (SEQ ID NO: 13). На фиг. 10 С показана последовательность ГА вируса гриппа А подтипа Н 4 (SEQ ID NO: 14). На фиг. 10D показана последовательность ГА вируса гриппа А подтипа Н 5 (SEQ ID NO: 15). На фиг. 10 Е показана последовательность ГА вируса гриппа А подтипа Н 6 (SEQ ID NO: 16). На фиг. 10F показана последовательность ГА вируса гриппа А подтипа Н 8 (SEQ ID NO: 17). На фиг. 10G показана последовательность ГА вируса гриппа А подтипа Н 9 (SEQ ID NO: 18). На фиг. 10 Н показана последовательность ГА вируса гриппа А подтипа Н 10 (SEQ ID NO: 19). На фиг. 10I показана последовательность ГА вируса гриппа А подтипа Н 11 (SEQ ID NO:20). На фиг. 10J показана последовательность ГА вируса гриппа А подтипа H12 (SEQID NO:21). На фиг. 10 К показана последовательность ГА вируса гриппа А подтипа Н 13 (SEQ ID NO:22). На фиг. 10L показана последовательность ГА вируса гриппа А подтипа H14 (SEQ ID NO:23). На фиг. 10 М показана последовательность ГА вируса гриппа А подтипа H15 (SEQ ID NO:24). На фиг. 10N показана последовательность ГА вируса гриппа А подтипа H16 (SEQ ID 30 NO:25). На фиг. 100 показана последовательность ГА вируса гриппа В (SEQ ID NO:26). На фиг. 10 Р показана последовательность ГА вируса гриппа С (SEQ ID NO:27). На фиг. 10Q показана последовательность праймера XmaI-pPlas.c (SEQID NO: 29). На фиг. 10R показана последовательность праймера SacI-ATG-pPlas.r (SEQ ID NO: 30). На фиг. 10S показана последовательность праймера SacI-PlasTer.c (SEQ ID NO: 31). На фиг. 10 Т показана последовательность праймера EcoRI-PlasTer.r (SEQ ID NO: 32). На фиг. 11 представлена схема нескольких конструкций, в соответствии с их использованием в данном документе. Конструкция 660 содержит последовательность нуклеотидов, кодирующую ГА подтипа Н 5 при оперативном связывании с промотором (plasto) и терминатором (Pter) пластоцианина; конструкция 540 содержит последовательность нуклеотидов, кодирующую ГА подтипа H1 в комбинации с сигнальным пептидом протеиндисульфидизомеразы (SP PDI) и оперативно связанную с промотором(Plasto) и терминатором (Pter) пластоцианина; конструкция 544, собранная для экспрессии ГА подтипаH1 - последовательность нуклеотидов, кодирующая H1, соединена с сигнальным пептидом протеиндисульфидизомеразы (SP PDI) и пептидом с лейциновой застжкой GCN4pII (вместо трансмембранного домена и цитоплазматического хвоста H1) и оперативно связана с промотором (Plasto) и терминатором(Pter) пластоцианина; и конструкция 750 для экспрессии кодирующей области MI вируса гриппаA/PR/8/34 комбинируется с вирусом гравировки табака (TEV) 5'НТО и оперативно связана с двойным промотором 35S и терминатором Nos. На фиг. 12 представлен иммунологический анализ Н 5 с помощью антител к Н 5 (Вьетнам) в экстракте белка из листьев N. benthamiana, трансформированных конструкцией 660 (дорожка 3). Товарный Н 5 из вируса А/Вьетнам/1203/2004 служил в качестве положительного контрольного образца при обнаружении (дорожка 1), а экстракт белка из листьев, трансформированных пустым вектором - в качестве отрицательного контроля (дорожка 2). На фиг. 13 представлена характеристика структур гемагглютинина методом эксклюзионной хроматографии. Белковый экстракт из отдельных образцов биомассы, продуцирующей Н 5, H1, растворимыйH1 или H1 и M1 разделяли гель-хроматографией на S-500 HR. Также фракционировали товарный образец H1 в виде розеткообразной структуры (розеточный H1). На фиг. 13 А приведены результаты анализа элюированных фракций на относительное содержание белка (относительное содержание белка - показан стандартный профиль элюирования белков при фракционировании биомассы). Обозначен пик голубого декстрана 2000 (2 МДа, стандартный образец). На фиг. 13 В показаны результаты иммуноблоттинга для определения наличия гемагглютинина в элюированных фракциях с антителами к Н 5 (Вьетнам). На фиг. 13 С показаны результаты анализа элюированных фракций на наличие H1 с помощью антител к вирусу гриппа А. На фиг. 13D показаны результаты анализа элюированных фракций на наличие растворимогоH1 с помощью антител к вирусу гриппа А. На фиг. 13 Е показаны результаты анализа элюированных фракций на наличие розеточного H1 с помощью антител к вирусу гриппа А. На фиг. 13F показаны результаты анализа элюированных фракций на наличие H1 + M1 с помощью антител к вирусу гриппа А. На фиг. 14 показано центрифугирование структур Н 5 в градиенте плотности сахарозы и исследование концентрированных фракций гемагглютинина с помощью электронного микроскопа. На фиг. 14 А показана характеристика фракций, полученных центрифугированием в градиенте плотности сахарозы. Каждую фракцию анализировали на наличие Н 5 методом иммуноблоттинга с антителами к Н 5 (Вьетнам)(верх.) и на относительное содержание белка и способность к гемагглютинации (график). На фиг. 14 В показаны результаты исследования методом просвечивающей электронной микроскопии с негативным окрашиванием смешанных фракций 17, 18 и 19, полученных центрифугированием в градиенте плотности сахарозы. Черта соответствует 100 нм. На фиг. 15 показана очистка ВЧ Н 5 вируса гриппа. На фиг. 15 А показаны результаты определения содержания белков на ДДС-Na-ПААГ с окрашиванием кумасси на стадиях очистки: дорожка 1 - сырой экстракт; дорожка 2 - экстракт, приведенный к рН 6; дорожка 3 - термообработанный экстракт; дорожка 4 -экстракт, отфильтрованный через диатомовую землю; стадии аффинной очистки на фетуине: дорожка 5 - загрузка; дорожка 6 - промывка; дорожка 7 - элюирование (концентрирование 10). На фиг. 15 В показаны результаты исследования методом просвечивающей электронной микроскопии с негативным окрашиванием очищенного образца ВЧ Н 5. Черта соответствует 100 нм. На фиг. 15 С показана выделенная ВЧ Н 5 с увеличением, позволяющим видеть детали строения. На фиг. 15D показана ВЧ Н 5 на восстанавливающем ДДС-Na-ПААГ с окрашиванием кумасси (дорожка А) и Вестерн-блот анализ (дорожка В) с помощью поликлонального антитела кролика против ГА штамма А/Вьетнам/1203/2004 (H5N1). На фиг. 16 показана последовательность нуклеотидов гена гемагглютинина (ГА) вируса гриппа типа А (А/Новая Каледония/20/99(Н 1N1, полная кодирующая последовательность. GenBank входящий .AY289929 (SEQ ID NO: 33). На фиг. 17 показана последовательность нуклеотидов мРНК протеиндисульфидизомеразы Medicago-7 018206 На фиг. 18 показана последовательность нуклеотидов сегмента 7 вируса гриппа типа А (А/ПуэртоРико/8/34(Н 1N1, полная последовательность. GenBank входящий . NC002016.1 (SEQ ID NO: 35). На фиг. 19 показана локализация накопления ВЧ при исследовании методом просвечивающей электронной микроскопии с позитивным окрашиванием Н 5-продуцирующей ткани. CW - клеточная оболочка, ch - хлоропласт, рm - плазматическая мембрана, VLP - вирусоподобная частица. Черта соответствует 100 нм. На фиг. 20 показано индуцирование гуморального ответа сывороточных антител через 14 сут после повторной иммунизации мышей линии Balb/c, вакцинированных ВЧ Н 5, полученными в растении, либо рекомбинантным растворимым ГА. На фиг. 20(A) Гуморальный иммунный ответ после иммунизации мышей путем внутримышечной инъекции. На фиг. 20(B) представлен гуморальный иммунный ответ после интраназальной иммунизации мышей. Гуморальный ответ измеряли по отношению к инактивированным цельным вирусам H5N1 (А/Индонезия/5/05). СГТ - средний геометрический титр. Приведены СГТ (log2) обратных величин конечного титра для пяти мышей на группу. Черточка показывает среднее отклонение.р 0.05 по сравнению с рекомбинантным растворимым ГА. На фиг. 21 представлен гуморальный ответ по ингибированию гемагглютинации (HAI) через 14 сут после повторной иммунизации мышей линии Balb/c, вакцинированных ВЧ Н 5, полученными в растении,либо рекомбинантным растворимым ГА. На фиг. 21(A) представлен гуморальный иммунный ответ после иммунизации мышей путем внутримышечной инъекции. На фиг. 21(B) показан гуморальный иммунный ответ после иммунизации мышей путем интраназального введения. Гуморальный ответ HAI измеряли по отношению к инактивированным цельным вирусам H5N1 (А/Индонезия/5/05). СГТ - средний геометрический титр. Приведены СГТ (log2) обратных величин конечного титра для пяти мышей на группу. Черточка показывает среднее отклонение.р 0.05 ир 0.01 по сравнению с рекомбинантным растворимым ГА. На фиг. 22 показано влияние адъюванта на иммуногенность ВЧ в организме мышей. На фиг. 22(A) показано влияние квасцов при иммунизации мышей путем внутримышечной инъекции. На фиг. 22(B) показано влияние хитозана при интраназальной иммунизации мышей. Гуморальный ответ HAI измеряли по отношению к инактивированным цельным вирусам H5N1 (А/Индонезия/5/05). СГТ - средний геометрический титр. Приведены СГТ (log2) обратных величин конечного титра для пяти мышей на группу. Черточка показывает среднее отклонение.р 0.05 по сравнению с рекомбинантным растворимым ГА. На фиг. 23 представлен гуморальный иммунный ответ на введение ВЧ. На фиг. 23(A) показан изотип иммуноглобулина анти-Индонезия/5/05 для мышей, вакцинированных путем внутримышечной инъекции, через 30 сут после повторной иммунизации. Приведены СГТ (log2) обратных величин конечного титра для пяти мышей на группу. Твердофазный ИФА выполнен с цельными инактивированными вирусами. Черточки показывают среднее отклонение.р 0.05,р 0.001 по сравнению с рекомбинантным растворимым ГА. На фиг. 23(B) представлены титры антител к цельным инактивированным вирусам. Все группы статистически различались при отрицательном контроле. На фиг. 24 представлен титр антител к гомологичным цельным инактивированным вирусам(А/Индонезия/5/05) через 2 недели после первой дозы (неделя 2), через 14 сут после повторной иммунизации (неделя 5) или через 30 сут после повторной иммунизации (неделя 7). СГТ - средний геометрический титр. Приведены СГТ (log2) обратных величин конечного титра для пяти мышей на группу.р 0.05 по сравнению с рекомбинантным растворимым ГА. На фиг. 25 представлен перекрестный ответ in vitro сывороточных антител. (А) Титры антител к цельным инактивированным вирусам. (В) Титры ингибирования гемагглютинации к различным цельным инактивированным вирусам. Приведены СГТ (log2) обратных величин конечного титра для пяти мышей на группу. Черточки показывают среднее отклонение. Все группы статистически различались при отрицательном контроле.р 0.05,р 0.001 по сравнению с рекомбинантным растворимым ГА. На фиг. 26 показана эффективность ВЧ Н 5, полученного в растении. (А) Коэффициент выживаемости мышей после заражения 10 LD50 (4.09105 CCID50 - 50% дозы инфицированной клеточной культуры) штаммом А/Турция/582/06 (H5N1) (В) Масса тела иммунизированных мышей после заражения. Приведены средние массы тела живых мышей. На фиг. 27 показано образование ВЧ вируса гриппа в растениях. (А) Состав полярных липидов очищенных ВЧ вируса гриппа. Липиды, содержащиеся в пробе, эквивалентной 40 мкг белка, экстрагировали из ВЧ, как описано, отделяли ВЭ-ТСХ и сравнивали по профилю миграции с липидами, выделенными из высокочистой плазматической мембраны (ПМ) табака. Аббревиатуры соответствуют следующим липидам: DGDG - дигалактозилдиацилглицерин; gluCER - глюкозилцерамид; РА - фосфатная кислота; PC - фосфатидилхолин; РЕ - фосфатидилэтаноламин; PG - фосфатидилглицерин; PI - фосфатидилинозит; PS - фосфатидилсерин; SG - стерил-гликозид. (В) Состав нейтральных липидов очищенных ВЧ вируса гриппа. Липиды, содержащиеся в пробе, эквивалентной 20 мкг белка, экстрагировали из ВЧ, как описано, отделяли ВЭ-ТСХ и сравнивали по профилю миграции с ситостерином. (С) Иммунологический анализ протонного насоса АТФазы (РМА) маркера плазматической мембраны в очищенных ВЧ и высокоочищенных ПМ из листьев табака (PML) и клеток табака BY2 (PMBY2)- на каждую дорожку наносили 18 мкг белка.-8 018206 На фиг. 28 показана последовательность от сайта DraIII до SacI клона 774 - последовательность нуклеототидов вируса А/Брисбен/59/2007 (H1N1) (SEQ ID NO: 36). Кодирующая последовательность фланкирована регуляторным участком пластоцианина, начиная с сайта рестрикции DraIII на 5'-конце и стоп кодоном и сайтом SacI на 3'-конце. Сайты рестрикции подчеркнуты; кодон ATG выделен жирным шрифтом и подчеркнут. На фиг. 29 показана последовательность от сайта DraIII до SacI клона 775 - последовательность нуклеотидов вируса А/Соломоновы Острова 3/2006 (H1N1) (SEQ ID NO: 37). Кодирующая последовательность фланкирована регуляторным участком пластоцианина, начиная с сайта рестрикции DraIII на 5'-конце и стоп кодоном и сайтом SacI на 3'-конце. Сайты рестрикции подчеркнуты; кодон ATG выделен жирным шрифтом и подчеркнут. На фиг. 30 показана последовательность от сайта DraIII до SacI клона 776 - последовательность нуклеотидов вируса А/Брисбен 10/2007 (H1N1) (SEQ ID NO: 38). Кодирующая последовательность фланкирована регуляторным участком пластоцианина, начиная с сайта рестрикции DraIII на 5'-конце и стоп кодоном и сайтом SacI на 3'-конце. Сайты рестрикции подчеркнуты; кодон ATG выделен жирным шрифтом и подчеркнут. На фиг. 31 показана последовательность от сайта DraIII до SacI клона 777 - последовательность нуклеотидов вируса А/Висконсин/67/2005 (H3N2) (SEQ ID NO: 39). Кодирующая последовательность фланкирована регуляторным участком пластоцианина, начиная с сайта рестрикции DraIII на 5'-конце и стоп кодоном и сайтом SacI на 3'-конце. Сайты рестрикции подчеркнуты; кодон АТС выделен жирным шрифтом и подчеркнут. На фиг. 32 показана последовательность от сайта DraIII до SacI клона 778 - последовательность нуклеотидов вируса В/Малайзия/2506/2004 (SEQ ID NO: 40). Кодирующая последовательность фланкирована регуляторным участком пластоцианина, начиная с сайта рестрикции DraIII на 5'-конце и стоп кодоном и сайтом SacI на 3'-конце. Сайты рестрикции подчеркнуты; кодон ATG выделен жирным шрифтом и подчеркнут. На фиг. 33 показана последовательность от сайта DraIII до SacI клона 779 - последовательность нуклеотидов вируса В/Флорида/4/2006 (SEQ ID NO: 41). Кодирующая последовательность фланкирована регуляторным участком пластоцианина, начиная с сайта рестрикции DraIII на 5'-конце и стоп кодоном и сайтом SacI на 3'-конце. Сайты рестрикции подчеркнуты; кодон ATG выделен жирным шрифтом и подчеркнут. На фиг. 34 показана последовательность от сайта DraIII до SacI клона 780 - последовательность нуклеотидов вируса А/Сингапур/1/57 (H2N2) (SEQ ID NO: 42). Кодирующая последовательность фланкирована регуляторным участком пластоцианина, начиная с сайта рестрикции DraIII на 5'-конце и стоп кодоном и сайтом SacI на 3'-конце. Сайты рестрикции подчеркнуты; кодон ATG выделен жирным шрифтом и подчеркнут. На фиг. 35 показана последовательность от сайта DraIII до SacI клона 781 - последовательность нуклеотидов вируса А/Аньхой/1/2005 (H5N1) (SEQ ID NO: 43). Кодирующая последовательность фланкирована регуляторным участком пластоцианина, начиная с сайта рестрикции DraIII на 5'-конце и стоп кодоном и сайтом SacI на 3'-конце. Сайты рестрикции подчеркнуты; кодон ATG выделен жирным шрифтом и подчеркнут. На фиг. 36 показана последовательность от сайта DraIII до SacI клона 782 - последовательность нуклеотидов вируса А/Вьетнам/1194/2004 (H5N1) (SEQ ID NO: 44). Кодирующая последовательность фланкирована регуляторным участком пластоцианина, начиная с сайта рестрикции DraIII на 5'-конце и стоп кодоном и сайтом SacI на 3'-конце. Сайты рестрикции подчеркнуты; кодон ATG выделен жирным шрифтом и подчеркнут. На фиг. 37 показана последовательность от сайта DraIII до SacI клона 783 - последовательность нуклеотидов вируса А/дикие утки/Гонконг/W312/97 (H6N1) (SEQ ID NO: 45). Кодирующая последовательность фланкирована регуляторным участком пластоцианина, начиная с сайта рестрикции DraIII на 5'-конце и стоп кодоном и сайтом SacI на 3'-конце. Сайты рестрикции подчеркнуты; кодон ATG выделен жирным шрифтом и подчеркнут. На фиг. 38 показана последовательность от сайта DraIII до SacI клона 784 - последовательность нуклеотидов вируса А/лошади/Прага/56 (H7N7) (SEQ ID NO: 46). Кодирующая последовательность фланкирована регуляторным участком пластоцианина, начиная с сайта рестрикции DraIII на 5'-конце и стоп кодоном и сайтом SacI на 3'-конце. Сайты рестрикции подчеркнуты; кодон ATG выделен жирным шрифтом и подчеркнут. На фиг. 39 после последовательность от сайта DraIII до SacI клона 785 - последовательность нуклеотидов вируса А/Гонконг/1073/99 (H9N2) (SEQ ID NO: 47). Кодирующая последовательность фланкирована регуляторным участком пластоцианина, начиная с сайта рестрикции DraIII на 5'-конце и стоп кодоном и сайтом SacI на 3'-конце. Сайты рестрикции подчеркнуты; кодон ATG выделен жирным шрифтом и подчеркнут. На фиг. 40 А показана аминокислотная последовательность (SEQ ID NO: 48) полипептида, транслированная с клона 774 (А/Брисбен/59/2007 (H1N1. Открытая рамка считывания клона 774 начинается с-9 018206 кодона ATG, показанного на фиг. 28. На фиг. 40 В приведена аминокислотная последовательность (SEQID NO: 49) полипептида, транслированная с клона 775 (А/Соломоновы Острова 3/2006 (H1N1. Открытая рамка считывания клона 775 начинается с кодона ATG, показанного на фиг. 29. На фиг. 41 А показана аминокислотная последовательность (SEQ ID NO: 50) полипептида, транслированная с клона 776 (А/Брисбен/10/2007 (H3N2. Открытая рамка считывания клона 776 начинается с кодона ATG, показанного на фиг. 30. На фиг. 41 В приведена аминокислотная последовательность (SEQID NO: 51) полипептида, транслированная с клона 777 (А/Висконсин/67/2005 (H3N2. Открытая рамка считывания клона 777 начинается с кодона ATG, показанного на фиг. 31. На фиг. 42 А показана аминокислотная последовательность (SEQ ID NO: 52) полипептида, транслированная с клона 778 (В/Малайзия/2506/2004). Открытая рамка считывания клона 778 начинается с кодона ATG, показанного на фиг. 32. На фиг. 42 В приведена аминокислотная последовательность (SEQ IDNO: 53) полипептида, транслированная с клона 779 (В/Флорида/4/2006). Открытая рамка считывания клона 779 начинается с кодона ATG, показанного на фиг. 33. На фиг. 43 А показана аминокислотная последовательность (SEQ ID NO: 54) полипептида, транслированная с клона 780 (А/Сингапур/1/57 (H2N2. Открытая рамка считывания клона 780 начинается с кодона ATG, показанного на фиг. 34. На фиг. 43 В приведена аминокислотная последовательность (SEQID NO: 55) полипептида, транслированная с клона 781 (А/Аньхой/1/2005 (H5N1. Открытая рамка считывания клона 781 начинается с кодона ATG, показанного на фиг. 35. На фиг. 44 А показана аминокислотная последовательность (SEQ ID NO: 56) полипептида, транслированная с клона 782 (А/Вьетнам/1194/2004 (H5N1. Открытая рамка считывания клона 782 начинается с кодона ATG, показанного на фиг. 36. На фиг. 44 В приведена аминокислотная последовательность (SEQID NO: 57) полипептида, транслированная с клона 783 (А/дикие утки/Гонконг/W312/97 (H6N1. Открытая рамка считывания клона 783 начинается с кодона ATG, показанного на фиг. 37. На фиг. 45 А показана аминокислотная последовательность (SEQ ID NO: 58) полипептида, транслированная с клона 784 (А/лошади/Прага/56 (H7N7. Открытая рамка считывания клона 784 начинается с кодона ATG, показанного на фиг. 38. На фиг. 45 В приведена аминокислотная последовательность (SEQID NO: 59) полипептида, транслированная с клона 785 (А/Гонконг/1073/99 (H9N2. Открытая рамка считывания клона 785 начинается с кодона ATG, показанного на фиг. 39. На фиг. 46 показан иммунологический анализ (вестерн-блот) элюированных фракций ВЧ, полученных в растении, после эксклюзионной хроматографии. Показаны подтипы гемагглютинина H1, Н 2, Н 5,Н 6 и Н 9. Гемагглютинин обнаруживается во фракциях 7-14, соответствующих элюированию ВЧ. На фиг. 47 показаны результаты иммуноблот-анализа экспрессии ряда гемагглютининов H1 из ежегодного эпидемического штамма. На дорожки 1 и 2 наносили соответственно 10 и 20 мкг белковых экстрактов. На фиг. 48 показаны результаты иммуноблот-анализа экспрессии ряда гемагглютининов Н 5 из потенциально пандемических штаммов. На дорожки 1 и 2 наносили соответственно 10 и 20 мкг белковых экстрактов. На фиг. 49 показаны результаты иммуноблот-анализа Н 5 из А/Индонезия/5/2005 в экстрактах белков из листьев Nicotiana tabacum, агроинфильтрованных AGL1/660. Проводили инфильтрацию двух растений, на дорожки 1 и 2 наносили соответственно 10 и 20 мкг растворимых белков из каждого растения. На фиг. 50 представлен перекрестный ответ in vitro сывороточных антител. Титры ингибирования гемагглютинации (H1) в сыворотке крови хорька через 14 суток (А) после первой иммунизации и (В) после повторной иммунизации ВЧ Н 5 вируса гриппа, полученных в растении. Гуморальный иммунный ответ HAI измеряли с помощью перечисленных ниже инактивированных цельных вирусов H5N1: А/индейки/Турция/1/05, А/Вьетнам/1194/04, А/Аньхой/5/05 и гомологичного штамма А/Индонезия/5/05. Приведены СГТ (log2) обратных величин конечного титра для пяти хорьков на группу. Диагональные полосы: А/Индонезия/6/06 (клада 2.1.3); клетки - А/индейки/Турция/1/05 (клада 2.2); белые колонки А/Вьетнам/1194/04 (клада 5 1); черные колонки - А/Аньхой/5/05. Указаны респондеры. Черточки показывают среднее отклонение. На фиг. 51 показана последовательность нуклеиновой кислоты для экспрессирующей кассеты ГА,содержащая промотор пластоцианина люцерны и 5'-НТО, гемагглютинин-кодирующую последовательность для Н 5 из А/Индонезия/5/2005 (конструкция 660), а также последовательности 3' НТО и терминатора пластоцианина люцерны. На фиг. 52 показана последовательность нуклеиновой кислоты для экспрессирующей кассеты ГА,содержащая промотор пластоцианина люцерны и 5'-НТО, гемагглютинин-кодирующую последовательность для H1 из А/Новая Каледония/20/1999 (конструкция 540), а также последовательности 3' НТО и терминатора пластоцианина люцерны. На фиг. 53 показана последовательность нуклеиновой кислоты для экспрессирующей кассеты ГА,содержащая промотор пластоцианина люцерны и 5'-НТО, гемагглютинин-кодирующую последовательность для H1 из А/Брисбен/59/2007 (конструкция 774), а также последовательности 3' НТО и терминатора пластоцианина люцерны. На фиг. 54 показана последовательность нуклеиновой кислоты для экспрессирующей кассеты ГА,- 10018206 содержащая промотор пластоцианина люцерны и 5'-НТО, гемагглютинин-кодирующую последовательность для H1 из А/Соломоновы Острова/3/2006 (H1N1) (конструкция 775), а также последовательности 3' НТО и терминатора пластоцианина люцерны. На фиг. 55 показана последовательность нуклеиновой кислоты для экспрессирующей кассеты ГА,содержащая промотор пластоцианина люцерны и 5'-НТО, гемагглютинин-кодирующую последовательность для Н 2 из А/Сингапур/1/57 (H2N2) (конструкция 780), а также последовательности 3' НТО и терминатора пластоцианина люцерны. На фиг. 56 показана последовательность нуклеиновой кислоты для экспрессирующей кассеты ГА,содержащая промотор пластоцианина люцерны и 5'-НТО, гемагглютинин-кодирующую последовательность для Н 5 из А/Аньхой/1/2005 (H5N1) (конструкция 781), а также последовательности 3' НТО и терминатора пластоцианина люцерны. На фиг. 57 показана последовательность нуклеиновой кислоты для экспрессирующей кассеты ГА,содержащая промотор пластоцианина люцерны и 5'-НТО, гемагглютинин-кодирующую последовательность для Н 5 из А/Вьетнам/1194/2004 (H5N1) (конструкция 782), а также последовательности 3' НТО и терминатора пластоцианина люцерны. На фиг. 58 показана последовательность нуклеиновой кислоты для экспрессирующей кассеты ГА,содержащая промотор пластоцианина люцерны и 5'-НТО, гемагглютинин-кодирующую последовательность для Н 6 из А/дикие утки/Гонконг/W312/97 (H6N1) (конструкция 783), а также последовательности 3' НТО и терминатора пластоцианина люцерны. На фиг. 59 показана последовательность нуклеиновой кислоты для экспрессирующей кассеты ГА,содержащая промотор пластоцианина люцерны и 5'-НТО, гемагглютинин-кодирующую последовательность для Н 9 из А/Гонконг/1073/99 (H9N2) (конструкция 785), а также последовательности 3' НТО и терминатора пластоцианина люцерны. На фиг. 60 показана последовательность нуклеиновой кислоты для экспрессирующей кассеты ГА,содержащая промотор пластоцианина люцерны и 5'-НТО, гемагглютинин-кодирующую последовательность для Н 3 из А/Брисбен/10/2007 (H3N2), а также последовательности 3' НТО и терминатора пластоцианина люцерны. На фиг. 61 показана последовательность нуклеиновой кислоты для экспрессирующей кассеты ГА,содержащая промотор пластоцианина люцерны и 5'-НТО, гемагглютинин-кодирующую последовательность для Н 3 из А/Висконсин/67/2005 (H3N2), а также последовательности 3' НТО и терминатора пластоцианина люцерны. На фиг. 62 показана последовательность нуклеиновой кислоты для экспрессирующей кассеты ГА,содержащая промотор пластоцианина люцерны и 5'-НТО, гемагглютинин-кодирующую последовательность для Н 7 из А/лошади/Прага/56 (H7N7), а также последовательности 3' НТО и терминатора пластоцианина люцерны. На фиг. 63 показана последовательность нуклеиновой кислоты для экспрессирующей кассеты ГА,содержащая промотор пластоцианина люцерны и 5'-НТО, гемагглютинин-кодирующую последовательность для ГА из В/Малайзия/2506/2004, а также последовательности 3' НТО и терминатора пластоцианина люцерны. На фиг. 64 показана последовательность нуклеиновой кислоты для экспрессирующей кассеты ГА,содержащая промотор пластоцианина люцерны и 5'-НТО, гемагглютинин-кодирующую последовательность для ГА из В/Флорида/4/2006, а также последовательности 3' НТО и терминатора пластоцианина люцерны. На фиг. 65 показана консенсусная аминокислотная последовательность (SEQ ID NO: 74) для ГА штаммов А/Новая Каледония/20/99 (H1N1) (который кодируется SEQ ID NO: 33), А/Брисбен/59/2007- К или Т; Х 5 (положение 111) - Y или Н; Х 6 (положение 145) - V или Т; Х 7 (положение 154) - Е или К; Х 8 (положение 161) - R или К; Х 9 (положение 181) - V или А; X10 (положение 203) - D или N; XI1 (положение 205) - R или К; Х 12 (положение 210) - Т или К; Х 13 (положение 225) - R или К; Х 14 (положение 268) - W или R; X15 (положение 283) - Т или N; X16 (положение 290) - Е или К; Х 17 (положение 432) - I или L; XI8 (положение 489) - N или D. На фиг. 66 показана аминокислотная последовательность H1 штамма Новая Каледония(ААР 34324.1), который кодируется SEQ ID NO: 33. На фиг. 67 показана аминокислотная последовательность H1 штамма Пуэрто-Рико (NC0409878.1),который кодируется SEQ ID NO: 35 Подробное описание изобретения Изобретение относится к получению вирусоподобных частиц. Более конкретно, настоящее изобретение направлено на получение вирусоподобных частиц, представляющих собой антигены вируса гриппа. Приведенное описание относится к предпочтительному осуществлению. Согласно настоящему изобретению предлагается нуклеиновая кислота, включающая последова- 11018206 тельность нуклеотидов, кодирующую антиген оболочечного вируса, например гемагглютинин вируса гриппа (ГА), оперативно связанная с регуляторным участком, который активен в растении. Далее, в настоящем изобретении предлагается способ получения вирусоподобных частиц (ВЧ) вируса гриппа. Метод включает введение в растение или его часть нуклеиновой кислоты, кодирующей антиген, оперативно связанной с регуляторным участком, который активен в растении, и инкубирование растения или части растения в условиях, позволяющих экспрессию нуклеиновой кислоты, что приводит к получению ВЧ. ВЧ можно получать из вируса гриппа, но ВЧ можно получать также из других вирусов, происходящих из плазматической мембраны, в том числе (без ограничения) вирусы кори, Эбола, Марбург и ВИЧ. Изобретение включает ВЧ всех типов вирусов гриппа, которые способны инфицировать человека, в том числе (без ограничения) очень распространенный тип А (H1N1) (например, А/Новая Каледония/20/ 99 (H1N1, А/Индонезия/5/05 (H5N1) (SEQ ID NO: 60) и менее распространенный тип В (например, SEQID NO:26, На фиг. 100) и С (SEQ ID NO:27, На фиг. 10 Р), а также ГА, полученные из других подтипов вируса гриппа. Настоящее изобретение включает также ВЧ других подтипов вируса гриппа, например,А/Брисбен/59/2007 (H1N1; SEQ ID NO:48), А/Соломоновы Острова/3/2006 (H1N1; SEQ ID NO:49),А/Сингапур/1/57 (H2N2; SEQ ID NO:54), А/Аньхой/1/2005 (H5N1; SEQ ID NO:55), А/Вьетнам/1194/2004NO:51), А/лошади/Прага/56 (H7N7; SEQ ID NO:58), В/Малайзия/2506/2004 (SEQ ID NO:52) или В/Флорида/4/2006 (SEQ 20 ID NO:53). Настоящее изобретение также относится к вирусам гриппа, инфицирующим других млекопитающих или животных-хозяев, например человека, приматов, лошадей, свиней, птиц, водоплавающих птиц,мигрирующих птиц, перепелок, уток, гусей, домашних птиц, кур, верблюдов, псовых, собак, кошачьих,кошек, тигров, леопардов, циветт, норок, каменных куниц, хорьков, комнатных животных, домашний скот, мышей, крыс, тюленей, китов и так далее. Примерами (без ограничения) других антигенов, которые могут быть экспрессированы в вирусах из плазматической мембраны являются капсидный белок ВИЧ - р 24; gp120, gp41 - оболочечные белки,структурные белки VP30 и VP35; Gp/SGP (гликозилированный интегральный белок мембраны) филовирусов, например вирусов Эбола или Марбург, либо белок Н, а также белок F парамиксовирусов, например вируса кори. Настоящее изобретение включает также (без ограничения) ВЧ вируса гриппа, формирующие липидную оболочку из плазматической мембраны клетки, в которой происходит экспрессия белков ВЧ. Например, если экспрессия ВЧ происходит в системе на основе растения, то ВЧ получают липидную оболочку из плазматической мембраны клетки. В общем случае термин "липид" относится к растворимым в жирах (липофильным) природным молекулам. Термин используется также более конкретно по отношению к жирным кислотам и их производным (в том числе три-, ди- и моноглицеридам и фосфолипидам), а также другим жирорастворимым стеринсодержащим метаболитам или к стеринам. Фосфолипиды являются основным компонентом всех биологических мембран, наряду с гликолипидами, стеринами и белками. К фосфолипидам относятся фосфатидилэтаноламин, фосфатидилхолин, фосфатидилинозит, фосфатидилсерин и аналогичные. Примерами стеринов являются зоостерины (например, холестерин) и фитостерины. Более 200 фитостеринов были идентифицированы в различных видах растений, наиболее распространенными из них являются кампестерин, стигмастерин, эргостерин, брассикастерин, дельта-7-стигмастерин, дельта-7-авенастерин,даукостерин, ситостерин, 24-метилхолестерин, холестерин или бета-ситостерин. Специалисту в данной области ясно, что липидный состав плазматической мембраны клетки может изменяться в зависимости от культуры, условий выращивания клеток или организма, из которого клетку получают. Клеточные мембраны обычно содержат липидные бислои и белки, выполняющие различные функции. Определенные липиды могут быть локализованы в липидном бислое, образуя так называемый липидный рафт. Не желая ограничиваться конкретной теорией, можно полагать, что липидный рафт играет значительную роль в эндо- и экзоцитоце, входе и выходе вирусов и других возбудителей инфекции,межклеточной трансдукции сигналов, взаимодействии с другими структурными компонентами клетки или организма, такими как внутриклеточные и внеклеточные матрицы. В отношении вируса гриппа термин "гемагглютинин" или "ГА" в данном документе означает гликопротеид, расположенный на наружной стороне вирусной частицы гриппа. ГА - гомотримерный гликопротеид мембранного типа I, как правило включающий сигнальный пептид, домен ГА 1, а также домен ГА 2, содержащий участок трансмембранного "якоря" на С-конце и малый цитоплазматический хвост (на фиг. 1 В). Нуклеотидные последовательности, кодирующие ГА, хорошо известны и доступны, см., например, базу данных BioDefence Public Health (вирус гриппа; см. URL: biohealthbase.org) или Национальный центр информации по биотехнологии (см. URL: ncbi.nlm.nih.gov), оба источника включены в данный документ посредством ссылки. Термин "гомотример" или "гомотримерный" относится к олигомеру, образованному тремя молекулами белка ГА. Если не ограничиваться конкретной теорией, белок ГА образуется при синтезе в виде- 12018206 мономерного предшественника (ГАО) молекулярной массой около 75 кДа, который организуется на поверхности в вытянутый тримерный белок. Перед тримеризаций белок-предшественник расщепляется по консервативному участку активации (называемому также слитым пептидом) на две полипептидные цепи,ГА 1 и ГА 2 (включающие трансмембранный участок), связанные дисульфидным мостиком. Сегмент ГА 1 может состоять из 328 аминокислот, а ГА 2 - из 221 аминокислоты. Несмотря на то что указанное расщепление может быть важно для инфективности вируса, оно может не иметь существенного значения для тримеризаций белка. Внедрение ГА в мембрану эндоплазматической сети (ЭПС) клетки-хозяина, расщепление сигнального пептида и гликозилирование белка - котрансляционные процессы. Для правильного рефолдинга ГА требуется гликозилирование белка и образование шести внутрицепных дисульфидных связей. Тример ГА образуется в цис- и транс-Гольджи комплексе, при этом трансмембранный домен участвует в процессе тримеризации. Кристаллические структуры обработанных бромелайном белков ГА, в которых отсутствует трансмембранный домен - высококонсервативны среди штаммов вируса гриппа. Было также установлено, что в процессе инфицирования в ГА происходит 20 основных конформационных изменений, для чего требуется расщепление предшественника - ГА 0 на две полипептидных цепи ГА 1 и ГА 2. Белок ГА может быть процессирован (т.е., содержать домены ГА 1 и ГА 2), либо непроцессирован (т.е., содержать домен ГА 0). Настоящее изобретение относится к применению белка ГА, включающего трансмембранный домен и домены ГА 1 и ГА 2. Например, белок ГА может быть ГА 0, либо процессированным ГА, состоящим из ГА 1 и ГА 2. Белок ГА может быть использован для получения или образования ВЧ с помощью системы экспрессии на основе растения или клетки растения. ГА в соответствии с настоящим изобретением может быть получен из любого подтипа. Например,ГА может относиться к подтипам H1, Н 2, Н 3, Н 4, Н 5, Н 6, Н 7, Н 8, Н 9, Н 10, Н 11, Н 12, Н 13, Н 14, Н 15 или Н 16. Рекомбинантные ГА в соответствии с настоящим изобретением могут содержать также аминокислотную последовательность, основанную на последовательности любого гемагглютинина, известного в данной области, см., например, базу данных BioDefence Public Health (вирус гриппа; см. URL:biohealthbase.org) или Национальный центр информации по биотехнологии (см. URL: ncbi.nlm.nih.gov). Далее ГА может быть основан на последовательности гемагглютинина, выделенного из одного или нескольких появившихся или вновь идентифицированных вирусов гриппа. К настоящему изобретению также относятся ВЧ, включающие ГА, полученные из одного или более одного подтипа вируса гриппа. Например, ВЧ могут содержать один или более одного ГА подтипа H1NO:24), H16 (который кодируется SEQ ID 15 NO:25), либо их сочетание. Один или более одного ГА из одного или более одного подтипа вируса гриппа может образоваться при коэкспрессии в клетке растения или насекомого, в результате чего синтез одного или более одного ГА приводит к образованию ВЧ, содержащих комбинацию ГА, полученных из одного или более одного подтипа вируса гриппа. Выбор указанной комбинации ГА может определяться предполагаемым применением вакцины, приготовленной из ВЧ. Например, вакцина, предназначенная для вакцинации птиц может содержать любую комбинацию подтипов ГА, а ВЧ для вакцинации человека могут содержать один или более одного из подтипов H1,Н 2, Н 3, Н 5, Н 7, Н 9, Н 10, N1, N2, N3 и N7. В зависимости от назначения вакцины могут быть приготовлены и другие комбинации подтипов ГА. Таким образом, настоящее изобретение относится к ВЧ, содержащим один или более одного подтипа ГА. Согласно настоящему изобретению предлагаются также нуклеиновые кислоты, кодирующие гемагглютинины, образующие ВЧ при экспрессии в растениях. Белки ГА вируса гриппа имеют как общие характеристики, так и различия по молекулярной массе,изоэлектрической точке, составу гликанов и т.п. Различия в физико-химических свойствах гемагглютининов позволяют различить ГА, полученные при экспрессии в клетках растений, насекомых или дрожжей, что особенно полезно при коэкспрессии более чем одного ГА в одной системе. Примеры таких физико-химических свойств приведены в табл. 1.- 13018206 Таблица 1. Физико-химические свойства гемагглютининов вируса гриппа Настоящее изобретение также относится к нуклеотидной последовательности SEQ ID NO:28; SEQID NO:3; SEQ ID NO: 11, кодирующей ГА из соответственно H1, Н 5 или Н 7, нуклеотидной последовательности, которая гибридизуется в жестких условиях в SEQ ID NO:28; SEQ ID NO:3; SEQ ID NO:11 или нуклеотидной последовательности, которая гибридизуется в жестких условиях в комплемент SEQ IDNO:28; SEQ ID NO:3; SEQ ID NO:1, причем нуклеотидная последовательность кодирует белок гемагглютинин, который при экспрессии образует ВЧ, и указанные ВЧ индуцируют образование антител при введении в организм объекта. Например, экспрессия нуклеотидной последовательности в клетке растения приводит к образованию ВЧ, а ВЧ позволяет получать антитела, способные связывать ГА, включая зрелые ГА, ГА 0, ГА 1 или ГА 2 одного или более типов или подтипов вируса гриппа. При введении в организм объекта ВЧ индуцирует иммунный ответ. Гибридизация в жестких условиях известна в данной отрасли (см., например, Current Protocols inLaboratory Manual, третье изд., 2001; каждый из указанных источников включен в данный документ посредством ссылки). Примером таких жестких условий гибридизации является например: гибридизация в течение около 16-20 ч в буфере 4SSC при 65 С с последующей промывкой в 0.1SSC при 65 С в течение часа, либо две промывки в 0.1SSC при 65 С каждая в течение 20 или 30 мин. Другим примером жестких условий гибридизации может служить выдержка до следующего дня (16-20 ч) в 50%-ном формамиде, 4SSC при 42 С с последующей промывкой в 0.1SSC при 65 С в течение 1 ч либо две промывки в 0.1SSC при 65 С каждая в течение 20 или 30 мин, либо до следующего дня (16-20 ч), либо гибридизация в водном фосфатном буфере Черча (7% ДДС Na; буфер 0.5 М NaPO4 pH 7.2; 10 мМ ЭДТА) при 65 С, две промывки либо при 50 С в 0.1SSC, 0.1% ДДС Na по 20 или 30 мин либо две промывки при 65 С в 2SSC, 0.1% ДДС Na по 20 или 30 мин. Помимо этого согласно настоящему изобретению предлагаются последовательности нуклеотидов,имеющие около 70, 75, 80, 85, 87, 90, 91, 92, 93 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100%) или любой промежуточный процент идентичности или сходства данной последовательности, с последовательностью нуклеотидов,кодирующей ГА из H1 (SEQ ID NO:28), Н 5 (SEQ ID NO:3) или Н 7 (SEQ ID NO: 11), где последовательность нуклеотидов кодирует белок гемагглютинин, который при экспрессии образует ВЧ, и указанные ВЧ индуцируют образование антитела. Например, при экспрессии последовательности нуклеотидов в клетке растения образуется ВЧ, а ВЧ можно использовать для образования антитела, способного связывать ГА, включая зрелые ГА, ГА 0, ГА 1 или ГА 2. При введении в организм объекта ВЧ индуцирует иммунный ответ. Аналогично, настоящее изобретение относится к ГА, ассоциированным с подтипами H1 (который кодируется SEQ ID NO:28), Н 2 (который кодируется SEQ ID NO: 12), Н 3 (который кодируется SEQ ID(который кодируется SEQ ID NO:25); см. фиг. 10 А - 10 Р) и к последовательностям нуклеотидов, имеющим от прибл. 70 до 100% или любой промежуточный процент, 80 - 100% или любой промежуточный процент, 90-100% или любой промежуточный процент либо 95-100% или любой промежуточный процент идентичности последовательности с H1 (SEQ ID NO:28), Н 2 (SEQ ID NO: 12), Н 3 (SEQ ID NO: 13),H4 (SEQ ID NO: 14), H5 (SEQ ID NO: 15), H6 (SEQ ID NO: 16), H7 (SEQ ID NO: 11), H8 (SEQ ID NO: 17),H9 (SEQ ID NO: 18), H10 (SEQ ID NO: 19), H11 (SEQ ID NO:20), H12 (SEQ ID NO:21), H13 (SEQ IDNO:27), H14 (SEQ ID NO:23), H15 (SEQ ID NO:24), H16 (SEQ ID NO:25), последовательность нуклеотидов кодирует гемагглютинин, который при экспрессии образует ВЧ, и указанные ВЧ индуцируют образование антитела. Например, при экспрессии последовательности нуклеотидов в клетке растения обра- 14018206 зуются ВЧ, а ВЧ позволяет получать антитела, способные связывать ГА, включая зрелые ГА, ГА 0, ГА 1 или ГА 2. При введении в организм объекта ВЧ индуцирует иммунный ответ."Иммунный ответ" обычно относится к реакции адаптивной иммунной системы. Адаптивная иммунная система как правило предполагает гуморальный ответ и клеточный иммунный ответ. Гуморальный ответ - часть иммунитета, опосредованная секретированными антителами, образованными в клетках линии В-лимфоцитов (В клетки). Секретированные антитела связываются с антигенами на поверхности инвазивных микробов (вирусов или бактерий), что является сигналом к их уничтожению. Термин гуморальный иммунитет, как правило, относится к продукции антител и процессам, которые его сопровождают, а также эффекторной функции антител, в том числе активации Th2-клеток и продукции цитокинов,образованию Т-лимфоцитов, влиянию опсонинов на фагоцитоз, удаление патогенных микроорганизмов и прочее. Термины "модулировать" и "модулирование" и аналогичные относятся к повышению или понижению конкретного ответа или параметра, по данным любого из нескольких испытаний, известных и применяемых в общем случае, некоторые из которых описаны в данном документе. Клеточный иммунный ответ - это иммунный ответ, в котором не участвуют антитела, но участвует активация макрофагов, природных клеток-киллеров (NK), антиген-специфические цитотоксичные Тлимфоциты и выделение различных цитокинов в ответ на антиген. Клеточный иммунитет обычно относится к активации некоторых Th-клеток, Тс-клеток и Т-клеточному ответу. Клеточный иммунитет особенно важен при вирусной инфекции. Например, индукцию антиген-специфических CD8-положительных Т-лимфоцитов можно измерить методом ELISPOT; стимуляцию CD4-положительных Т-лимфоцитов можно определить измерением пролиферации. Количественное определение титров антител к вирусу гриппа осуществляют методом твердофазного ИФА; изотипы антиген-специфических или перекрестно-отвечающих антител можно определить также с помощью антител к изотипам (например, анти-IgG, IgA, IgE или IgM). Способы и методики указанных количественных испытаний хорошо известны в данной отрасли. Определение ингибирования гемагглютинации (H1 или HAI) может также служить для демонстрации эффективности антител, образование которых индуцировано вакциной, либо вакцина может ингибировать агглютинацию красных кровяных клеток (эритроцитов) рекомбинантными ГА. Титры антител,ингибирующих гемагглютинацию, в образцах сыворотки могут быть оценены микротитрованием HAI(Aymard с соавт. 1973). При этом могут быть использованы эритроциты любого вида животных: лошадь,индейка, курица и т.д. Такой метод анализа дает косвенную информацию тримеризации ГА на поверхности ВЧ, подтверждая правильную презентирование сайтов антигенов на ГА. Титры перекрестного ответа HAI могут служить также для демонстрации эффекта иммунного ответа на другие штаммы вирусов, родственных подтипу вакцины. Например, сыворотку, полученную от объекта, вакцинированного композицией вакцины на основе первого штамма (например, ВЧ штамма А/Индонезия 5/05), можно использовать в анализе HAI со вторым штаммом цельного вируса или вирусных частиц (например, А/Вьетнам/1194/2004), и определения титра HAI. Также возможно определение наличия или уровня цитокинов. Например, ответ Т-клеток-хелперов(Th1/Th2) характеризуется путем определения IFN и IL-4-секретирующих клеток методом твердофазного ИФА (например, BD OptEIA производства Biosciences). Культивируют мононуклеары периферической крови (МПК) или спленоциты объекта, после чего супернатант можно анализировать. Количественное определение Т-лимфоцитов проводят также методом флуоресцентной сортировки активированных клеток (FACS) с помощью маркер-специфических флуоресцентных меток и методов, известных в отрасли. Для оценки иммунного ответа также проводят анализ методом микронейтрализации, см. например,методы Rowe с соавт., 1973. Титры нейтрализации вирусов могут быть получены несколькими способами, в том числе: 1) подсчет бляшек лизиса (анализ бляшкообразования) после фиксации/окрашивания клеток кристаллическим фиолетовым; 2) наблюдение лизиса клеток в культуре через микроскоп; 3) твердофазный ИФА и спектрофотометрическое определение нуклеокапсидного белка вируса (корреляция с вирусным инфицированием клеток-хозяев). Идентичность или сходство последовательностей определяют с помощью программы сравнения последовательностей нуклеотидов, например, программы, поставляемой в пакете DNASIS [например, без ограничения, на основе следующих параметров: GAP penalty (коррекция пропуска) 5, of top diagonals 5(размер идентичного участка), floating gap (плавающий пропуск) 10 и window size (длина сегмента) 5]. Другие методы выравнивания последовательностей для сопоставления хорошо известны в отрасли, например алгоритмы SmithWaterman (1981, Adv. Appl. Math. 2:482), NeedlemanWunsch (J. Mol. Biol. 48:443, 1970), PearsonLipman (1988, 25 Proc. Nat'l. Acad. Sci. США 85:2444), а также программная реализация указанных алгоритмов (например, GAP, BESTFIT, FASTA и BLAST), либо выравнивание вручную и визуальный осмотр. Термин "домен гемагглютинина" относится к пептиду, содержащему либо домен ГА 0, либо домены ГА 1 и ГА 2. Домен гемагглютинина не включает сигнальный пептид, трансмембранный домен и цитоплазматический хвост, присутствующие в природном белке.- 15018206 Термины "вирусоподобная частица" и "вирусоподобные частицы" (ВЧ) относятся к самоорганизующимся структурам, содержащим структурные белки, таким как белок ГА вируса гриппа. Обычно ВЧ морфологически и антигенно сходны с вирионами, образующимися при инфекции, но не несут генетической информации, достаточной для репликации и поэтому неинфекционны. В некоторых примерах ВЧ могут содержать один вид белка, либо белки более чем одного вида. Если ВЧ содержит более одного вида белка, то белок может соответствовать тому же виду вируса, но может быть и белком из другого вида, рода, подсемейства или семейства вирусов (в соответствии с обозначением в номенклатуре международного комитета по таксономии вирусов). В других примерах один или более одного из видов белка,содержащихся в ВЧ, может быть модифицирован по отношению к природной последовательности. Получение ВЧ осуществляют в пригодных клетках-хозяевах, в том числе клетках растений и насекомых. После экстракции из клетки-хозяина, ВЧ могут быть выделены и очищены в соответствующих условиях и получены в неизменном виде. ВЧ, полученные из белков вирусов гриппа в соответствии с настоящим изобретением, не содержат белок M1. Известно, что белок M1 связывается с РНК (Wakefield and Brownlee, 1989), которая присутствует в качестве примеси при получении ВЧ. Присутствие РНК нежелательно для сертифицирования продукта ВЧ органами государственного регулирования, поэтому препарат ВЧ, не содержащий РНК, имеет преимущество. ВЧ согласно настоящему изобретению получают в клетках-хозяевах, которые характеризуются неспособностью к сиалилированию белков, т.е., не содержат сиалидазу, например, это клетки растений,клетки насекомых, грибы и другие организмы, в том числе губки, кишечнополостные, кольчатые черви,членистоногие, моллюски, нематоды, трохельминты, плоские черви, щетинкочелюстные, щупальцевые,хламидии, спирохеты, грамположительные бактерии, цианобактерии, архебактерии, в соответствии с определениями на сайте glycoforum (см., например, URL: glvcoforum.gr.ip/science/word/evolution/ESA03E.html). ВЧ, полученные как описано в данном документе, обычно не содержат нейраминидазу (НА). Тем не менее возможна коэкспрессия НА вместе с ГА, если требуются ВЧ, содержащие ГА и НА. ВЧ, полученные в растении в соответствии с некоторыми вариантами изобретения, могут сочетаться с липидами растительного происхождения. ВЧ может содержать пептид ГА 0, ГА 1 или ГА 2. Липиды растительного происхождения могут присутствовать в форме липидного бислоя и могут дополнительно содержать оболочку, окружающую ВЧ. Липиды растительного происхождения могут содержать компоненты плазматической мембраны растения, в котором были получены ВЧ, в том числе (без ограничения) фосфатидилхолин (ФХ), фосфатидилэтаноламин (ФЭ), гликосфинголипиды, фитостерины или их комбинации. Липид растительного происхождения может также быть назван "растительным липидом". Примеры фитостеринов известны в данной отрасли, к ним относятся, например, стигмастерин, ситостерин, 24 метилхолестерин и холестерин - см., например, Mongrand с соавт., 2004. Строение и размер ВЧ можно определить, например, методами анализа гемагглютинации, электронной микроскопии или эксклюзионной хроматографии. Для проведения эксклюзионной хроматографии, суммарный растворимый белок экстрагируют из ткани растения путем гомогенизации (Polytron) образца растительного материала, измельченного в замороженном виде, в экстракционном буфере, и нерастворимый остаток удаляют центрифугированием. Хорошие результаты могут быть получены и при осаждении ПЭГ. Проводят количественное определение растворимого белка и экстракт пропускают через колонку с Sephacryl. Стандартом для градуировки служит декстран голубой 2000. Фракции, полученные после хроматографии, можно анализировать методом иммуноблоттинга для определения белкового состава фракции. Не желая ограничиваться конкретной теорией, считают, что способность ГА связываться с эритроцитами различных животных регулируется сродством ГА к сиаловым кислотам 2,3 или 2,3 и присутствием указанных сиаловых кислот на поверхности эритроцитов. ГА лошадей и птиц из вирусов гриппа агглютинируют эритроциты нескольких видов, к которым относятся индейки, куры, утки, морские свинки, человек, овцы, лошади и коровы; при этом ГА человека способны связываться с эритроцитами индейки, курицы, утки, морской свинки, человека и овцы (см. также Ito Т. с соавт., 1997, Virology, том 227,стр. 493-499; и Medeiros R. с соавт., 2001, Virology, том 289 стр.74-85). Примеры ответа на ГА различных штаммов гриппа приведены в табл. 2 А и 2 В. Таблица 2А. Виды эритроцитов, с которыми связываются ГА некоторых сезонных штаммов гриппа- 16018206 Таблица 2 В. Виды эритроцитов, с которыми связываются ГА некоторых пандемических штаммов гриппа В данном документе "белок" означает цепь аминокислот, связанных пептидной связью, которая может складываться с формированием вторичной, третичной или четвертичной структуры с соответствующей морфологией. Альтернативно, в аналогичном контексте могут использоваться термины полипептид, пептид или пептидный фрагмент. Фрагмент или часть белка, слитый белок или полипептид означает пептид или полипептид, содержащий часть аминокислотного состава определенного белка или полипептида при условии, что фрагмент может образовать ВЧ при экспрессии. Например, фрагмент может содержать область антигена, область,обусловливающую реакцию на стресс, или область, включающую функциональный домен белка или полипептида. Фрагмент может также содержать область или домен, общий для белков определенного семейства, либо фрагмент может содержать аминокислотную последовательность, достаточную для специфичной идентификации полноразмерного белка, из которого он произошел. Например, фрагмент или часть может включать от около 60 до около 100% полноразмерного белка,либо любое промежуточное количество, при условии, что фрагмент может образовать ВЧ при экспрессии. Например, от примерно 60 до примерно 100%, от примерно 70 до примерно 100%, от примерно 80 до примерно 100%, от примерно 90 до примерно 100%, от примерно 95 до примерно 100% длины полноразмерного белка либо любое промежуточное количество. В качестве альтернативы, фрагмент или часть может содержать от примерно 150 до примерно 500 аминокислот или любое промежуточное количество,в зависимости от ГА и при условии, что фрагмент может образовать ВЧ при экспрессии. Например,фрагмент может иметь от 150 до примерно 500 аминокислот или любое промежуточное количество, от примерно 200 до примерно 500 аминокислот, или любое промежуточное количество, от примерно 250 до примерно 500 аминокислот, или любое промежуточное количество, от примерно 300 до примерно 500 или любое промежуточное количество, от примерно 350 до примерно 500 аминокислот или любое промежуточное количество, от примерно 400 до примерно 500 или любое промежуточное количество, от примерно 450 до примерно 500 или любое промежуточное количество, в зависимости от ГА и при условии, что фрагмент может образовать ВЧ при экспрессии. Например, около 5, 10, 20, 30, 40 или 50 аминокислот или любое промежуточное количество может быть удалено с С-конца, N-конца или как с N-, так и с С-конца белка ГА при условии, что фрагмент может образовать ВЧ при экспрессии. Нумерация аминокислот в любой данной последовательности осуществляется относительно конкретной последовательности, тем не менее, специалист может без труда определить "равноценность" отдельной аминокислоты в последовательности на основе структуры и/или последовательности. Например, если при конструировании клона для кристаллографии удалено 6 N-терминальных аминокислот, то при этом изменится нумерация конкретных аминокислот в цепи (напр., относительно полноразмерного белка), но не изменится их относительное расположение в структуре. Сопоставление последовательности или последовательностей может осуществляться с помощью алгоритма BLAST (Altschul с соавт., 1990. J. Mol Biol 215:403-410). Поиск BLAST позволяет сопоставить изучаемую последовательность с заданной последовательностью или группой последовательностей или с большой библиотекой или базой данных (например, GenBank или GenPept) и идентифицировать не только последовательности, имеющие 100%) идентичность, но также и имеющие меньшую степень идентичности. Последовательности нуклеиновых кислот или аминокислот можно сопоставлять с помощью алгоритма BLAST. Далее, идентичность двух или более последовательностей можно определить, выравнивая последовательности и рассчитывая процент их идентичности. Выравнивание можно осуществить с помощью алгоритма BLAST (например, в базе данных GenBank; URL: ncbi.nlm.nih.gov/cgi-bin/BLAST/ с параметрами по умолчанию: Program: blastn; Database: nr; Expect 10; filter: default; Alignment: pairwise;index.html с параметрами по умолчанию: Matrix 5 BLOSUM62; Filter: default, echofilter: on, Expect: 10,cutoff: default; Strand: both; Descriptions: 50, Alignments: 50; или алгоритм FASTA с параметрами по умолчанию) либо сопоставляя последовательности вручную и рассчитывая процент идентичности. Настоящее изобретение описывает, не ограничиваясь этим, клонирование нуклеиновой кислоты,кодирующей ГА, в экспрессирующий вектор растения и получение из растения ВЧ вируса гриппа, при- 17018206 годных для производства вакцины. Примерами таких нуклеиновых кислот являются (без ограничения) грипп А/Новая Каледония/20/99 (H1N1) ГА вируса (напр., SEQ ID NO: 61), ГА из подтипа А/Индонезия/5/05 (H5N1) (напр., SEQ ID NO: 60), А/Брисбен/59/2007 (H1N1) (напр., SEQ ID NO: 36,48,62), А/Соломоновы Острова/3/2006 (H1N1) (напр., SEQ15 ID NO: 37, 49, 63), А/Сингапур/1/57 (H2N2)(напр., SEQ ID NO: 40, 52, 72), В/Флорида/4/2006 (напр., SEQ ID NO: 41, 53, 73). Соответствующие номера клонов или конструкций для этих штаммов приведены в табл. 1. Последовательности нуклеиновых кислот, соответствующие SEQ ID NO: 36-47, содержат пластоцианин, оперативно связанный с кодирующей последовательностью ГА для каждого из типов или подтипов, как показано на фиг. 28-39. Последовательности нуклеиновых кислот, соответствующие SEQ ID NO: 60-73 представляют собой кассету, экспрессирующую ГА, содержащую промотор пластоцианина люцерны и 5'-НТО, гемагглютининкодирующую последовательность для ГА, а также последовательности 3' НТО и терминатора пластоцианина люцерны, как показано на фиг. 51-64. ВЧ позволяют получать реагенты, состоящие из рекомбинантных структурных белков вируса гриппа, самоорганизующихся в функциональные и иммуногенные гомотипные макромолекулярные белковые структуры, включая субвирусные частицы вируса гриппа и ВЧ вируса гриппа, в трансформированных клетках-хозяевах, например клетках растений или клетках насекомых. Таким образом, согласно изобретению, предлагаются ВЧ и способ получения вирусных ВЧ в растительной системе экспрессии при экспрессии отдельного оболочечного белка. Указанные ВЧ могут представлять собой ВЧ вируса гриппа или ВЧ, полученные из других вирусов плазматической мембраны, в том числе (без ограничения) вирусы кори, Эбола, Марбург и ВИЧ. Также можно использовать белки из других оболочечных вирусов, например (без ограничения) филовирусов (напр., вирус Эбола, вирус Марбург и т.п.), парамиксовирусов (напр., вирус кори, вирус паротита, респираторно-синцитиальный вирус, пневмовирусы и т.п.), ретровирусов (напр., вирус иммунодефицита человека-1, вирус иммунодефицита человека-2, вирус Т-клеточной лейкемии человека-1, и т.п.),флавивирусов (напр., вирус лихорадки Западного Нила, вирус тропической лихорадки, вирус гепатита С,вирус жлтой лихорадки и т.п.), буньявирусов (напр., хантавирус и т.п.), коронавирусов (напр., коронавирус, вирус атипичной пневмонии и т.п.), как это известно специалистам. Неограничивающими примерами антигенов, которые могут экспрессироваться в вирусах из плазматической мембраны являются капсидный белок ВИЧ - р 24; гликопротеиды gp120 и gp41, белки филовирусов, в том числе VP30 или VP35 вируса Эбола, Gp/SGP вируса Марбург, Н белок или F белок парамиксовируса кори. Например, Р 24 ВИЧ(напр., см. GenBank, reference gi: 19172948) - белок, получаемый трансляцией и расщеплением последовательности gag генома вируса ВИЧ (напр., GenBank reference gi:9629357); gp 120 и gp41 ВИЧ - гликопротеиды, полученные трансляцией и расщеплением белка gp160 (напр., GenBank reference gi:9629363),который кодируется env генома вируса ВИЧ. VP30 вирус Эбола (GenPept reference gi: 55770813) - белок,получаемый трансляцией последовательности vp30 генома вируса Эбола (напр., GenBank referencegi:55770807); VP35 вируса Эбола (GenPept Reference gi:55770809) - белок, получаемый трансляцией последовательности vp35 генома вируса Эбола. Gp/SGP вируса Марбург (GenPept reference gi: 296965) белок, полученный трансляцией (последовательности) генома вируса Марбург (GenBank reference gi: 158539108). Белок Н (GenPept Reference gi: 9626951) - белок Н последовательности генома вируса кори(GenBank Reference gi: 9626945); F белок (GenPept reference gi: 9626950) - белок F последовательности генома вируса кори. Однако способы настоящего изобретения предполагают применение и других белков оболочки, что известно специалисту. Таким образом, согласно изобретению, предлагается молекула нуклеиновой кислоты, последовательность которой кодирует ВИЧ-р 24, ВИЧ-gp120, ВИЧ-gp41, вирус Эбола-VP30, вирус Эбола-VP35,вирус Марбург Gp/SGP, H белок или F белок вируса кори. Молекула нуклеиновой кислоты может быть оперативно связана с регуляторным участком, активным в клетке насекомого, дрожжей или растения,либо в определенной ткани растения. Далее, в настоящем изобретении предлагается клонирование нуклеиновой кислоты, кодирующей ГА, например, но без ограничения, ГА вируса гриппа человека А/Индонезия/5/05 (H5N1), в вектор экспрессии насекомого (например, вектор экспрессии бакуловируса) и получение вакцин-кандидатов от гриппа либо реагентов, состоящих из рекомбинантньгх структурных белков вируса гриппа, которые в результате самосборки превращаются в функциональные и иммуногенные гомотопные макромолекулярные белковые структуры, в том числе субвирусные частицы гриппа и ВЧ вируса гриппа в трансформированных клетках растений или в трансформированных клетках насекомых. Экспрессия нуклеиновой кислоты, кодирующей ГА подтипов вируса гриппа, например, но без ограничения, подтипа А/Новая Каледония/20/99 (H1N1), А/Индонезия/5/05 (H5N1), А/Брисбен/59/2007(H1N1), А/Соломоновы Острова/3/2006 (H1N1), А/Сингапур/1/57 (H2N2), А/Аньхой/1/2005 (H5N1),А/Вьетнам/1194/2004 (H5N1), А/дикие утки/Гонконг/W312/97 (H6N1), А/Гонконг/1073/99 (H9N2),А/Брисбен/10/2007 (H3N2), А/Висконсин/67/2005 (H3N2), А/лошади/Прага/56 (H7N7), В/Малайзия/2506/ 2004, В/Флорида/4/2006, может осуществляться, например, с помощью системы экспрессии бакуловируса в подходящей линии клеток, например, в клетках Spodopterafrugiperda (например, линия клеток Sf-9;ATCC РТА-4047). Можно использовать и другие клеточные линии насекомых. В качестве альтернативы, экспрессия нуклеиновой кислоты, кодирующей ГА, может осуществляться в клетке растения или в растении. Нуклеиновую кислоту, кодирующую ГА, можно синтезировать обратной транскрипцией и полимеразной цепной реакцией (ПЦР) с помощью РНК ГА. Например, РНК может быть выделена из вируса гриппа человека А/Новая Каледония/20/99 (H1N1), или вируса гриппа человека А/Индонезия/5/05 (H5N1), или из другого вируса гриппа, например А/Брисбен/59/2007 (H1N1),А/Соломоновы острова/3/2006 (H1N1), А/Сингапур/1/57 (H2N2), А/Аньхой/1/2005 (H5N1), А/Вьетнам/ 1194/2004 (H5N1), А/дикие утки/Гонконг/W312/97 (H6N1), А/Гонконг/1073/99 (H9N2), А/Брисбен/ 10/2007 (H3N2), А/Висконсин/67/2005 (H3N2), А/лошади/Прага/56 (H7N7), В/Малайзия/2506/2004, В/ Флорида/4/2006, либо из клеток, инфицированных вирусом гриппа. Для обратной транскрипции и ПЦР пригодны олигонуклеотидные праймеры, специфичные для РНК ГА, например, но без ограничения, последовательности ГА вируса гриппа человека А/Новая Каледония/20/99 (H1N1), последовательности ГА 0 вируса гриппа человека А/Индонезия/5/05 (H5N1) или последовательности ГА подтипов А/Брисбен/59/2007 (H1N1), А/Соломоновы Острова/3/2006 (H1N1), А/Сингапур/1/57 (H2N2), А/Аньхой/ 1/2005 (H5N1), А/Вьетнам/1194/2004 (H5N1), А/дикие утки/Гонконг/W312/97 (H6N1), А/Гонконг/1073/99(H9N2), А/Брисбен/10/2007 (H3N2), А/Висконсин/67/2005 (H3N2), А/лошади/Прага/56 (H7N7), В/ Малайзия/2506/2004, В/Флорида/4/2006. Помимо этого, нуклеиновая кислота, кодирующая ГА, может быть химически синтезирована способами, известными специалистам в данной области. Полученные копии ДНК указанных генов могут быть клонированы в подходящем векторе экспрессии, как требуется для системы экспрессии хозяина. Примеры соответствующих векторов экспрессии для растений приведены ниже, помимо этого, возможно применение вектора экспрессии бакуловируса, например, pFastBacl (InVitrogen), приводящее к плазмидам на основе pFastBacl, с помощью известных методов и информации, приведенной в инструкции производителя. Настоящее изобретение далее относится к генетической конструкции, включающей нуклеиновую кислоту, кодирующую ГА, как описано выше, оперативно связанную с регуляторным элементом, который активен в растении. Примерами регуляторных элементов, активных в клетке растения и пригодных для использования в соответствии с настоящим изобретением, являются, без ограничения, регуляторный участок пластоцианина (US 307125978; включен в данный документ посредством ссылки), регуляторный участок рибулозо-1,5-бисфосфат-карбоксилазы/оксигеназы (RuBisCO; US 4962028; включен в данный документ посредством ссылки), хлорофилл a/b-связывающий белок (CAB; Leutwiler с соавт.; 1986; включен в данный документ посредством ссылки), ST-LS1 (связанный с выделяющим кислород комплексом фотосистемы II и описанный Stockhaus с соавт. 1987, 1989; включено в данный документ посредством ссылки). Пример регуляторного участка пластоцианина - последовательность, содержащая нуклеотиды 10-85 SEQ ID NO: 36 или аналогичный участок любой из SEQ ID NOS: 37-47. Если конструкция экспрессируется в клетке насекомого, примерами регуляторных элементов, оперирующих в клетке насекомого являются, без ограничения промотор полиэдрина (Possee and Howard 1987. Nucleic Acids Research 15:10233-10248), промотор gp64 (Kogan с соавт., 1995. J Virology 69:14521461) и т.п. Соответственно, согласно варианту изобретения предлагается нуклеиновая кислота, содержащая регуляторный участок и последовательность, кодирующую ГА вируса гриппа. Регуляторный участок может быть регуляторным элементом пластоцианина, а ГА вируса гриппа может быть выбран из группы штаммов или подтипов гриппа, в том числе А/Новая Каледония/20/99 (H1N1), А/Индонезия/5/05 (H5N1),А/Брисбен/59/2007 (H1N1), А/Соломоновы острова/3/2006 (H1N1), А/Сингапур/1/57 (H2N2),А/Аньхой/1/2005 (H5N1), А/Вьетнам/1194/2004 (H5N1), А/дикие утки/Гонконг//W312/97 (H6N1),А/Гонконг/1073/99 (H9N2), А/Брисбен/10/2007 (H3N2), А/Висконсин/67/2005 (H3N2), А/лошади/Прага/56(H7N7), В/Малайзия/2506/2004, В/Флорида/4/2006. В данном документе примером последовательности нуклеиновой кислоты, содержащей регуляторный элемент пластоцианина и ГА вируса гриппа являютсяSEQ ID NO: 36-47. Известно, что в аминокислотной последовательности гемагглютинина вируса гриппа или кодирующих его нуклеиновых кислот возможны различия при получении вируса гриппа культивированием в яйцах или в клетках млекопитающих (например, в клетках MDCK) или выделением из зараженного организма. Неограничивающие примеры таких различий проиллюстрированы в данном документе, в том числе в примере 18. Далее, специалисту в данной области понятно, что в случае гемагглютининов, полученных из новых штаммов, могут наблюдаться дополнительные вариации, так как мутации продолжают происходить. Вследствие известной вариативности последовательностей в различных гемагглютининах вируса гриппа, настоящее изобретение относится к ВЧ, которые могут быть получены на основе любого гемагглютинина вируса гриппа при условии, что при экспрессии в клетке-хозяине, как описано в на- 19018206 стоящем документе, гемагглютинин вируса гриппа образует ВЧ. Выравнивание последовательностей и консенсусные последовательности могут быть определены с помощью нескольких пакетов программного обеспечения, известных в данной области, например MULTALIN (F. CORPET, 1988, Nucl. Acids Res., 16 (22), 10881-10890), либо последовательности могут выравниваться вручную с определением сходства и различий между последовательностями. Строение гемагглютининов хорошо изучено, а также известно, что оно является консервативным. При наложении гемагглютининовых структур наблюдается высокая степень консервативности (среднекв. отклонение 2 А). Консервативность структуры сохраняется, несмотря на то, что аминокислотная последовательность в некоторых положениях может различаться (см., например, Skehel and Wiley, 2000Ann Rev Biochem 69:531-69; 10 Vaccaro с соавт. 2005). Участки гемагглютининов также высоко консервативны, например,структурные домены: полипротеин ГА 0 расщепляется с образованием зрелого ГА. ГА - гомотример, где каждый мономер включает рецептор-связывающий домен (ГА 1) и заякоренный в мембране домен (ГА 2), которые связаны одинарной дисульфидной связью; 20 N-терминальных остатков субъединицы ГА 2 также являются связывающим доменом или связывающей последовательностью ГА. Также имеется участок хвоста (внутренний по отношению к мембранной оболочке). Такие участки или домены присутствуют в каждом гемагглютинине. Отдельные участки или домены обычно консервативны по длине; все гемагглютинины содержат одинаковое число внутри- и межмолекулярных дисульфидных мостиков в тех же положениях. Количество цистеинов, участвующих в сети дисульфидных связей, и их положение в аминокислотной последовательности остается постоянным для всех ГА. Примеры структур,иллюстрирующие характерные внутри- и межмолекулярные дисульфидные мостики и другие консервативные аминокислоты, а также их относительные положения приведены например, в работе Gamblin с соавт. 2004 (Science 303:1838-1842). Примеры структур и последовательностей включают 1RVZ, 1RVX,1RVT, 1RV0, 1RUY, 1RU7, которые можно найти в базе данных структур белков (URL: www.rcsb.org); цитоплазматический хвост - большая часть гемагглютининов содержит 3 цистеина в постоянном положении. При посттрансляционной модификации один и более из данных цистеинов может быть пальмитоилирован. Для гемагглютининов вируса гриппа возможно варьирование аминокислот. Указанное варьирование приводит к появлению новых штаммов, которые постоянно идентифицируют. Инфекционные свойства новых штаммов могут различаться. Однако образование тримеров гемагглютинина, которые затем образуют ВЧ, сохраняется. В настоящем изобретении, таким образом, предложена аминокислотная последовательность гемагглютинин либо нуклеиновая кислота, кодирующая аминокислотную последовательность гемагглютинина, образующая ВЧ в растении, при этом оно включает как известные последовательности, так и альтернативные последовательности, которые могут возникнуть. На фиг. 65 приведен пример такой известной вариации. На фиг. изображает консенсусную последовательность аминокислот (SEQ ID NO: 74) для ГА следующих штаммов H1N1: А/Новая Каледония/20/99(положение 210) - Т или К; Х 13 (положение 225) - R или К; Х 14 (положение 268) - W или R; X15 (положение 283) - Т или N; X16 (положение 290) - Е или К; X17 (положение 432) - I или L; XI8 (положение 489) - N или D. В качестве другого примера вариации ниже в табл. 3 приведено выравнивание последовательностей и консенсусная последовательность для ГА штаммов А/Новая Каледония/20/99 (H1N1) (который кодируется SEQ ID NO: 33), А/Брисбен/59/2007 (H1N1) (SEQ ID NO: 48), А/Соломоновы острова/3/2006 (H1N1)(SEQ ID NO: 49), A/ Пуэрто-Рико /8/34 (H1N1) и SEQ ID NO: 9. Таблица 3. Выравнивание последовательностей и консенсусная последовательность для ГА некоторых штаммов H1N1 В консенсусную последовательность входят аминокислоты, общие для всех последовательностей в обозначенных положениях, записанные прописными буквами; строчными буквами записаны аминокислоты, общие как минимум для половины или большей части последовательностей; символ означает I или V; символ - любое из L или М; символ "%" - любое из F или Y; символ - любое из N, D, Q, Е,В или Z; а символ "." означает отсутствие аминокислоты (например, делению); X в положении 3 - любое из А или V; X в положении 52 - любое из Е или N; X в положении 90 - K или R; X в положении 99 - Т или K; X в положении 111 - любое из Y или Н; X в положении 145 - любое из V или Т; X в положении 157 - K или Е; Х в положении 162 - R или K; X в положении 182 - V или А; X в положении 203 - N или D;X в положении 205 - R или K; X в положении 210 - Т или K; X в положении 225 - K или Y; X в положении 333 - Н или деления; X в положении 433 - I или L; X в положении 490 - N или D. В качестве еще одного примера вариации, ниже в табл. 4 приведено выравнивание последовательностей и консенсусная последовательность для ГА штаммов А/Аньхой/1/2005 (H5N1) (SEQ ID NO: 55),А/Вьетнам/1194/2004 (H5N1) и А/Индонезия/5/2006 (H5N1) (SEQ ID NO: 10).- 22018206 Таблица 4. Выравнивание последовательностей и консенсусная последовательность для ГА некоторых штаммов Н 1N1 В консенсусную последовательность входят аминокислоты, общие для всех последовательностей в обозначенных положениях, записанные прописными буквами; строчными буквами записаны аминокислоты, общие как минимум для половины или большей части последовательностей; символ означает I или V; символ - любое из L или М; символ "%" - любое из F или Y; символ - любое из N, D, Q, Е,В или Z; X в положении 102 - любое из Т, V или А; X в положении 110 - любое из S, D или N; X в положении 156 - любое из S, K или Т. Приведенные выше вариации выравнивания последовательностей и консенсусные последовательности представляют собой неограничивающие примеры вариантов аминокислотных последовательностей гемагглютинина для применения в различных осуществлениях изобретения для получения ВЧ в растении. Нуклеиновую кислоту, кодирующую аминокислотную последовательность, несложно определить,так как кодоны для каждой аминокислоты известны в данной области. Следовательно, предлагаемая аминокислотная последовательность представляет вырожденную последовательность нуклеиновой кислоты, которая ее кодирует. В настоящем изобретении, таким образом, предлагается последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующей гемагглютинин штаммов и подтипов гриппа, раскрытых в данном документе (например, А/Новая Каледония/20/99 (Н 1N1) А/Индонезия/5/2006 (H5N1), А/куры/НьюЙорк/1995, А/серебристые чайки/Делавэр/677/88 (H2N8), А/Техас/32/2003, А/кряквы/Миннесота/33/00,А/утки/Шанхай/1/2000, А/шилохвости/Техас/828189/02, А/индейка/Онтарио/6118/68 (H8N4), А/уткишироконоски/Иран/G54/03, А/куры/Германия/N/l 949(Н 10N7), /утки/Англия/56 (Н 11N6), А/утки/Альберта/60/76 (Н 12N5), А/чайки/Мэриленд/704/77 (Н 13N6), А/кряквы/Гурьев/263/82, А/утки/Австралия/ 341/83 (H15N8), А/чайки обыкновенные/Швеция/5/99 (Н 16N3), В/Ли/40, С/Йоханнесбург/66, А/ПуэртоРико/8/34 (H1N1), А/Брисбен/59/2007 (H1N1), А/Соломоновы острова 3/2006 (H1N1), А/Брисбен 10/2007(H2N2), А/Аньхой/1/2005 (H5N1), А/Вьетнам/1194/2004 (H5N1), А/дикие утки/Гонконг/W312/97 (H6N1),- 24018206 А/лошади/Прага/56 (H7N7), А/Гонконг/1073/99 (H9N2), а также вырожденные последовательности, которые кодируют указанные выше гемагглютинины. Далее, аминокислотную последовательность, которую кодирует нуклеиновая кислота, можно легко определить, так как кодон или кодоны для каждой аминокислоты известны. Таким образом, предлагаемая нуклеиновая кислота представляет аминокислотную последовательность, которая ею кодируется. В настоящем изобретении, таким образом, предлагаются аминокислотные последовательности гемагглютинина штаммов и подтипов гриппа, раскрытых в данном документе (например, А/Новая Каледония/20/99 (Н 1N1) А/Индонезия/5/2006 (H5N1), А/куры/Нью-Йорк/1995, А/серебристые чайки/Делавэр(H3N2), В/Малайзия/2506/2004, В/Флорида/4/2006, А/Сингапур/1/57 (H2N2), А/Аньхой/1/2005 (H5N1),А/Вьетнам/1194/2004 (H5N1), А/дикие утки/Гонконге/W312/97 (H6N1), А/лошади/Прага/56 (H7N7),А/Гонконг/1073/99 (H9N2. В растении ВЧ вируса гриппа отпочковываются из плазматической мембраны (см. пример 5, и на фиг. 19), поэтому липидный состав ВЧ отражает их происхождение. ВЧ, полученные в соответствии с настоящим изобретением, включают ГА одного или более чем одного типа или подтипа вируса гриппа в комплексе с липидами растений. Растительные липиды могут стимулировать специфические иммунные клетки и усилить иммунный ответ. Растительные мембраны состоят из липидов, фосфатидилхолина (ФХ) и фосфатидилэтаноламина (ФЭ), а также содержат гликосфинголипиды, сапонины и фитостерины. Кроме того, в плазматических мембранах растений обнаруживаются липидные рафты - микродомены, обогащенные сфинголипидами и стеринами. В растениях содержатся различные фитостеролы, в том числе стигмастерин, ситостерин, 24-метилхолестерин и холестерин (Mongrand с соавт., 2004). ФХ и ФЭ, а также гликосфинголипиды могут связываться с молекулами CD1, экспрессированными иммунными клетками млекопитающих, таким как антигенпредставляющие клетки (АПК), например,дендритные клетки и макрофаги, а также другие клетки, в том числе В- и Т-лимфоциты в тимусе и печени (Tsuji M., 2006). Молекулы CD1 сходны по строению с молекулами главного комплекса гистосовместимости (ГКГС) класса I, их роль заключается в представлении антигенов гликолипидов клеткам природных киллеров NKT. При активации клетки NKT активируют клетки естественного иммунитета, такие как NK-клетки и дендритные клетки, а также активируют адаптивные иммунные клетки, такие как антителопродуцирующие В-клетки и Т-клетки. В плазматической мембране обнаруживается ряд различных фитостеринов - специфический комплемент может варьировать, в зависимости от вида, условий выращивания, запасов питательных веществ или патогенного состояния, помимо прочих факторов. Как правило, наиболее распространенным фитостерином является бета-ситостерин. Фитостерины, присутствующие в ВЧ вируса гриппа в комплексе с липидным бислоем, таким как оболочка из плазматической мембраны, могут быть предпочтительны для состава вакцины. Не желая ограничиваться конкретной теорией, считают, что полученные в растениях ВЧ в комплексе с липидным бислоем, таким как оболочка из плазматической мембраны, может вызвать более сильную иммунную реакцию по сравнению с ВЧ, полученных в других системах экспрессии, аналогичную иммунной реакции, вызванной живой или ослабленной цельновирионной вакциной. Таким образом, в некоторых осуществлениях изобретения предложены ВЧ в комплексе с липидным бислоем растительного происхождения. В некоторых осуществлениях липидный бислой растительного происхождения может представлять собой оболочку ВЧ. ВЧ, полученные в растении, могут индуцировать ГА, содержащий специфические растительные Nгликаны. Следовательно, в настоящем изобретении предложены также ВЧ, содержащие ГА со специфическими растительными N-гликанами. Далее, модификация N-гликана в растениях известна (см., например, U.S. 60/944344; включен в данный документ посредством ссылки), и возможно получение ГА с модифицированными N-гликанами. Возможно получение ГА с модифицированным типом гликозилирования, например, с пониженным уровнем фукозилирования, ксилозилирования или как фукозилирования, так и ксилозилирования Nгликанов, либо получение ГА с модифицированным типом гликозилирования, где в белке уменьшен уровень фукозилированиия, ксилозилирования или и того, и другого, но присутствует повышенный уровень галактозилирования. Далее, модулирование пост-трансляционной модификации, например, присоединение терминальной галактозы может привести к снижению степени фукозилирования и ксилозилирования экспрессированного ГА по сравнению с растением дикого типа, экспрессипующим ГА. Например, не считая данный пример ограничивающим, синтез ГА с модифицированным гликозилирования можно осуществить при коэкспрессии целевого белка с последовательностью нуклеотидов,кодирующей бета-1.4-галактозилтрансферазу (GalT), например, без ограничения, GalT млекопитающих- 25018206 или GalT человека; также можно брать GalT и из других источников. Каталитический домен GalT может быть слит с доменом CTS (т.е. цитоплазматическим хвостом, трансмембранным доменом, стволовым участком) N-ацетилглюкозаминилтрансферазы (GNT1) с образованием гибридного фермента GNTl-GalT,и указанный гибридный фермент может выделяться при коэкспрессии с ГА. Другой вариант - коэкспрессия ГА с последовательностью нуклеотидов, кодирующей N-ацетилглюкозаминилтрансферазу III (GnTIII), например, но без ограничения, GnT-III млекопитающих или GnT-III человека; также можно братьGnT-III из других источников. Еще один вариант - гибридный фермент GNTl-GnT-III, состоящий из CTSGNT1, слитого с GnT-III. Следовательно, настоящее изобретение также относится к ВЧ, содержащим ГА с модифицированными N-гликанами. Не желая ограничиваться конкретной теорией, считают, что наличие растительных N-гликанов на ГА может стимулировать иммунный ответ, способствуя связыванию ГА антигенпредставляющими клетками. Стимулирование иммунного ответа с помощью растительных N-гликанов было предложено в работе Saint-jore-Dupas с соавт. (2007). Далее, конформация ВЧ может быть выгодной для представления антигена и повышать адъювантное действие ВЧ в комплексе с липидным слоем растительного происхождения. Под терминами "регуляторный участок", "регуляторный элемент" или "промотор" подразумевается часть нуклеиновой кислоты, как правило, но не всегда, расположенная ранее участка гена, кодирующего белок, и состоящая из ДНК, РНК или одновременно и ДНК, и РНК. Если регуляторный участок активен,и оперативно ассоциирован или оперативно связан с целевым геном, это может привести к экспрессии целевого гена. Регуляторный элемент может влиять на органоспецифичность или регулировать временную активацию гена или активацию в ходе развития. "Регуляторный участок" включает элементы промоторов, коровые регуляторные элементы, проявляющие базовую промоторную активность, элементы,способные индуцироваться в ответ на внешнее воздействие, элементы, опосредующие промоторную активность, такие как негативные регуляторные элементы или усилители транскрипции. "Регуляторный участок" в данном документе также включает элементы, которые активны после транскрипции, например регуляторные элементы, модулирующие экспрессию генов, такие как усилители трансляции и транскрипции, репрессоры трансляции и транскрипции, расположенные ранее активирующие последовательности и детерминанты нестабильности мРНК. Некоторые из последних упомянутых элементов могут быть расположены вблизи кодирующей области. В рамках данного описания термин "регуляторный элемент" или "регуляторный участок" как правило относится к последовательности ДНК, обычно, но не всегда, расположенной ранее (5') кодирующей последовательности структурного гена, которая регулирует экспрессию кодирующей области за счет распознавания РНК-полимеразы и/или других факторов, необходимых для начала транскрипции на определенном участке. Однако следует учитывать, что другие последовательности нуклеотидов, расположенные в интронах, или 3' последовательности могут также участвовать в регулировании экспрессии целевой кодирующей области. Примером регуляторного элемента, осуществляющего распознавание РНК-полимеразы или других факторов транскрипции, что обеспечивает ее начало в определенной позиции, является элемент промотора. Большая часть, но не все, регуляторные элементы эукариотов содержат ТАТА-бокс - консервативную последовательность нуклеиновой кислоты, состоящую из пар азотистых оснований аденозин и тимидин, обычно расположенных приблизительно за 25 пар оснований ранее сайта начала транскрипции. Элемент промотора содержит базальный элемент промотора, ответственный за инициирование транскрипции, а также другие регуляторные элементы (как указано выше), модифицирующие экспрессию генов. Регуляторные участки относятся к нескольким типам, в том числе активные в ходе развития, индуцируемые или конститутивные. Регуляторный участок, активный в ходе развития или управляющий дифференциальной экспрессией гена, активируется в определенных органах или тканях органа в определенные моменты времени в процессе развития данного органа или ткани. Тем не менее, некоторые регуляторные участки, которые активны в ходе развития, могут быть предпочтительно активны в определенных органах или тканях на определенных стадиях развития, но могут также быть активны либо в ходе развития либо на базовом уровне в других органах или тканях растения. Примерами тканеспецифических регуляторных участков, например, see-специфических регуляторных участков являются промотор напина и промотор круциферина (Rask с соавт., 1998, J. Plant Physiol. 152: 595-599; Bilodeau с соавт., 1994,Plant Cell 14: 125-130). Примером промотора, специфического для листьев, является промотор пластоцианина (На фиг. 1b или SEQ ID NO:23); US 7125978, включен в данный документ посредством ссылки). Индуцируемым является регуляторный участок, который способен прямо или косвенно активировать транскрипцию одной или более последовательности ДНК или гена под действием индуктора. В отсутствие индуктора транскрипции последовательности ДНК или гена не происходит. Как правило, белковый фактор, который специфически связывается с индуцируемым регуляторным участком для активации транскрипции, может присутствовать в неактивной форме, которая затем прямо или косвенно превращается в активную под действием индуктора. Однако белковый фактор может и отсутствовать. В качестве индуктора может служить химический агент, такой как белок, метаболит, регулятор роста, герби- 26018206 цид или производное фенола, а также физиологический стресс, оказываемый прямо действием тепла,холода, соли или токсичных элементов или косвенно при действии патогенного микроорганизма или болезнетворного агента, например вируса. Действие индуктора на клетку растения, содержащую индуцируемый регуляторный участок, происходит за счет внешнего воздействия - обрызгивания, полива, нагревания и прочих способов. Индуцируемые регуляторные элементы могут иметь происхождение из растительных или нерастительных генов (напр., Gatz, С. and Lenk, I.R.P., 1998, Trends Plant Sci. 3, 352-358; включен посредством ссылки). Примеры возможных индуцируемых промоторов (без ограничения) - индуцируемый тетрациклином промотор (Gatz, С.,1997, Ann. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 48, 89-108; включен посредством ссылки), индуцируемый стероидами промотор (Aoyama, Т. and Chua, N.H.,1997,Plant J. 2, 5 397-404; включен посредством ссылки) и индуцируемый этанолом промотор (Salter, M.G., с соавт., 1998, Plant Journal 16, 127-132; Caddick, M.X., с соавт.,1998, Nature Biotech. 16, 177-180, включены посредством ссылки) гены IB6 и CKI1, индуцируемые цитокином (Brandstatter, I. and Kieber, JJ.,1998,Plant Cell 10, 1009-1019; Kakimoto, Т., 1996, Science 274, 982-985; включены посредством ссылки) и индуцируемый ауксином элемент DR5 (Ulmasov, Т., с соавт., 1997, Plant Cell 9,1963-1971; включен посредством ссылки). Конститутивный регуляторный участок управляет экспрессией гена в разных частях растения и постоянно в ходе его развития. Примерами известных конститутивных регуляторных элементов являются промоторы, связанные с транскриптом CaMV 35S (Odell с соавт., 1985, Nature, 313: 810-812), гены актина риса 1 (Zhang с соавт., 1991, Plant Cell, 3: 1155-1165), актина 2 (An с соавт., 1996, Plant J., 10: 107-121),тропомиозина 2 (U.S. 5428147, включен в данный документ посредством ссылки), и триозофосфатизомеразы 1 (Xu с соавт., 1994, Plant Physiol. 106: 459-467), ген убиквитина кукурузы 1 (Cornejo с соавт., 1993,Plant Mol. Biol. 29: 637-20 646), гены убиквитина Arabidopsi 1 и 6 (Holtorf с соавт., 1995, Plant Mol. Biol. 29: 637-646), и фактор гена инициации трансляции табака 4 А (Mandel с соавт., 1995 Plant Mol. Biol. 29: 995-1004). В данном документе термин "конститутивный" не означает обязательно, что экспрессия гена под управлением конститутивного регуляторного участка осуществляется на одном и том же уровне во всех типах клеток - экспрессия осуществляется в широком интервале типов клеток, хотя часто в различном количестве. Термин "оперативно связанный" подразумевает, что определенные последовательности, например регуляторный элемент и целевая кодирующая область, взаимодействуют прямо или косвенно для осуществления заданной функции, такой как опосредование или модуляция экспрессии генов. Взаимодействие оперативно связанных последовательностей может, например, осуществляться за счет белков которые взаимодействуют с оперативно связанными последовательностями. Экспрессия одной или более одной последовательности нуклеотидов согласно настоящему изобретению может происходить в любом приемлемом растении-хозяине, трансформированном последовательностью нуклеотидов, конструкцией или векторами в соответствии с настоящим изобретением. К таким хозяевам относятся (без ограничения) сельскохозяйственные культуры, в том числе люцерна, рапс канола, Brassica spp., кукуруза, Nicotiana spp., люцерна, картофель, женьшень, горох, овес, рис, соя, пшеница, ячмень, подсолнечник, хлопчатник и т.п. Одна или более химерная генетическая конструкция согласно настоящему изобретению может также содержать 3'-нетранслируемую область. 3'-Нетранслируемая область относится к той части гена,включающей сегмент ДНК, которая содержит сигнал полиаденилирования и другие регуляторные сигналы, способные влиять на процессинг мРНК или экспрессию генов. Сигнал полиаденилирования обычно способствует присоединению треков полиадениловой кислоты к 3'-концу прекурсора мРНК. Сигналы полиаденилирования обычно распознаются по наличию гомологии с канонической формой 5'-ААТААА 3', несмотря на то, что вариации нередки. Одна или несколько химерных генетических конструкций в соответствии с настоящим изобретением могут также содержать дополнительные энхансеры - энхансеры трансляции или транскрипции, по необходимости. Такие области энхансеров хорошо известны специалистам в данной области и могут содержать АТГ-кодон инициации и ближайшие последовательности. Кодон инициации должен находится в фазе с рамкой считывания кодирующей последовательности для осуществления трансляции всей последовательности. Неограничивающими примерами подходящих 3'-областей являются нетранслируемые 3'-области транскрипции, содержащие сигнал полиаденилирования опухолеиндуцирующей Ti-плазмиды гена агробактерии, например, нопалинсинтазы (Nos-ген), и гены растений, такие как гены белков хранения сои и гены малой субъединицы рибулозо-1,5-бисфосфат-карбоксилазы (ssRUBISCO; US 4962028; включен в данный документ посредством ссылки), промотор, используемый при регулировании экспрессии пластоцианина (Pwee и Gray 1993; включен в данный документ посредством ссылки). Пример промотора пластоцианина описан в документе US 7125978 (включен в данный документ посредством ссылки). В соответствии с настоящим документом промоторы, включающие энхансеры с известной эффективностью при экспрессии в листьях, оказываются эффективными и при временной экспрессии. Не желая ограничиваться конкретной теорией, полагают, что присоединение предшествующих регуляторных элементов гена фотосинтеза к ядерной матрице может влиять на экспрессию. Например, до -784 от сайта начала трансляции пластоцианина гороха можно использовать для получения значительной экспрессии- 27018206 гена-репортера. Для более простой идентификации трансформированных клеток растения конструкции согласно настоящему изобретению можно далее изменять с включением селектируемых маркеров растений. К полезным селектируемым маркерам относятся ферменты, обеспечивающие устойчивость к химическим агентам, таким как антибиотики, например гентамицин, гигромицин, канамицин, или гербициды, например, фосфинотрицин, глифосат, хлорсульфурон и т.п. Аналогичную роль могут играть ферменты, осуществляющие получение соединения, которое обнаруживается по изменению цвета, например GUS (бетаглюкуронидаза) или по люминесценции, например люцифераза или GFP (зеленый фосфоресцирующий белок). Еще одним компонентом настоящего изобретения являются трансгенные растения, клетки или семена растений, содержащие конструкцию химерного гена в соответствии с настоящим изобретением. Способы регенерации целого растения из его клеток также известны в данной области. В общем виде трансформированные клетки растения культивируют в соответствующей среде, которая может содержать селективные агенты, такие как антибиотики, при этом селектируемые маркеры служат для идентификации трансформированных растительных клеток. После образования каллюса, формирование ростков можно стимулировать действием соответствующих растительных гормонов известными способами,затем ростки переносят в субстрат для регенерации растения. Далее растения могут служить для производства следующих генераций, либо из семян либо методами вегетативного размножения. Трансгенные растения также могут быть получены без использования культур тканей. Еще одним компонентом настоящего изобретения являются трансгенные растения, деревья, дрожжи, бактерии, грибы, клетки насекомых и животных, содержащие конструкцию химерного гена, представляющую собой нуклеиновую кислоту, кодирующую рекомбинантные ГА 0 для получения ВЧ, в соответствии с настоящим изобретением. Регуляторные элементы настоящего изобретения могут комбинироваться с целевой кодирующей областью для экспрессии в ряде организмов-хозяев, пригодных для трансформации или временной экспрессии. К таким организмам относятся, без ограничения, растения (как однодольные, так и двудольные), например, без ограничения кукуруза, зерновые растения, пшеница, ячмень, овес, Nicotiana spp,Brassica spp, соя, бобы, горох, люцерна, картофель, томат, женьшень и Arabidopsis. Способы стабильной трансформации и регенерации указанных организмов хорошо разработаны в данной области и известны специалистам. Способ получения трансформированного и регенерированного растения не является принципиальным в отношении настоящего изобретения. Под "трансформацией" понимается межвидовой перенос генетической информации (последовательности нуклеотидов), который проявляется в генотипе и/или в фенотипе. Межвидовой перенос генетической информации от химерной конструкции к хозяину может быть наследуемым, тогда перенос генетической информации считается стабильным, либо перенос может быть транзиентным (временным),тогда перенос генетической информации не наследуется. Понятие "растительное вещество" означает любой материал, полученный из растения. Растительным веществом может быть растение целиком, ткань, клетки или любая их часть. Далее, растительное вещество может включать внутриклеточные компоненты, внеклеточные компоненты, жидкие или твердые экстракты растения либо их сочетание. Далее, растительное вещество может представлять собой растение, клетки растения, ткани, жидкий экстракт или их сочетание из листьев, стеблей, плодов, корней или их сочетания. Растительное вещество может быть растением или его частью, которые не подвергались ни одной из стадий обработки. Однако предусмотрено и что растительное вещество прошло стадии минимальной переработки, которые раскрыты ниже, либо более жесткой переработки, включая частичную или значительную очистку белка обычными методами, известными в данной области, к которым относятся (без ограничения) хроматография, электрофорез и т.п. Понятие "минимальная переработка" относится к растительному веществу, например растению или части растения, содержащему целевой белок, которое было частично очищено с получением экстракта растения, гомогената, фракции гомогената и т.п. (т.е. минимально переработано). Частичная очистка может представлять собой (без ограничения) нарушение клеточной структуры растения, приводящее к образованию композиции, содержащей растворимые компоненты растения и нерастворимые компоненты растения, которые можно разделить, например, (без ограничения) центрифугированием, фильтрованием или их сочетанием. При этом белки, секретированные в межклеточном пространстве листа или другой ткани, можно легко выделить вакуумной или центробежной экстракцией либо провести экстракцию тканей под давлением, пропуская их через валки, измельчая и т.п., чтобы отжать или выделить белок из межклеточного пространства. Минимальная переработка может также подразумевать приготовление первичного экстракта растворимых белков, так как указанные препараты будут содержать пренебрежимо малое количество примесей из вторичных растительных продуктов. Далее, минимальная переработка может подразумевать экстракцию растворимого белка из листьев в водную фазу с последующим осаждением любой приемлемой солью. К другим методам относятся мацерация и жидкостная экстракция в крупных масштабах, что позволяет непосредственное использование экстракта. Растительное вещество в виде растительного материала или ткани пригодно для перорального при- 28018206 менения. Растительное вещество можно принимать в составе добавки к рациону - вместе с пищей или в капсулах. Можно провести концентрирование вещества или ткани растения для улучшения или повышения его съедобности, либо объединить с другими материалами, ингредиентами, или фармацевтическим наполнителем, по необходимости. Примерами объектов или целевых организмов для введения ВЧ настоящего изобретения являются,без ограничения, человек, приматы, птицы, водоплавающие птицы, перелтные птицы, перепелки, утки,гуси, домашние птицы, куры, свиньи, овцы, лошади, верблюды, псовые, собаки, кошачьи, кошки, тигры,леопарды, циветты, норки, каменные куницы, хорьки, комнатные животные, домашний скот, кролики,мыши, крысы, морские свинки или другие грызуны, тюлени, киты и т.д. Указанные целевые организмы приведены как примеры и не должны считаться ограничивающими область применения настоящего изобретения. Предусматривается, что растение, содержащее целевой белок либо экспрессирующее ВЧ, содержащие целевой белок, можно вводить в организм объекта или целевой организм разными способами, в зависимости от необходимости и ситуации. Например, целевой белок, полученный из растения, можно экстрагировать перед использованием в неочищенном, частично очищенном или очищенном виде. Если предполагается очистка белка, то его получение может осуществляться в съедобном либо несъедобном растении. Далее, при пероральном введении белка, растения можно собрать и непосредственно употреблять в пищу, либо собранные растения можно предварительно высушить, и только затем употреблять в пищу, либо животные могут поедать растущие растения без предварительного сбора урожая. В рамках данного изобретения собранные ткани растений могут также применяться в составе пищевой добавки к корму животных. Если животные поедают растительную ткань после лишь незначительной переработки или без нее, то предпочтительно, чтобы данная растительная ткань была съедобной. В ограничении экспрессии трансгенов в растениях может принимать участие посттранскрипционный сайленсинг генов (PTGS), а коэкспрессия супрессора сайленсинга из вируса картофеля Y (HcPro) может быть использована для противодействия специфической деградации трансгенных мРНК (Brigneti с соавт., 1998). Другие супрессоры сайленсинга хорошо известны в данной области и могут применяться как здесь описано (Chiba с соавт., 2006, Virology 346:7-14; включен в данный документ посредством ссылки), например (без ограничения): TEV -pl/HC-Pro (вирус гравировки табака-pl/HC-Pro), BYV -р 21,р 19 вируса кустистой карликовости томата (TBSV р 19), капсидный белок вируса скрученности томата(TCV -СР), 22b вируса огуречной мозаики; CMV-2b), p25 вируса картофеля X (PVX-p25), p11 вируса картофеля М (PVM-p11), p11 вируса картофеля S (PVS-p11), р 16 вируса ожога черники (BScV -pl6), р 23 вируса тристеца цитрусовых (CTV-p23), p24 вируса скручивания листьев винограда-2 (GLRaV-2 р 24), р 10 вируса винограда A (GVA-p10), p14 вируса винограда В (GVB-p14), p10 латентного вируса борщевика(HLV-p10) или р 16 обыкновенного латентного вируса чеснока (GCLV-p16). Таким образом, для дополнительного повышения уровня экспрессии белка в растении возможна коэкспрессия супрессора сайленсинга, например (без ограничения), HcPro, TEV -p1/HC-Pro, BYV-p21, TBSV p19, TCV-CP, CMV-2b,PVX-p25, PVM-p11, PVS-p11, BScV-p16, CTV-p23, GLRaV-2 p24, GBV-p14, HLV-p10, GCLV-p16 илиGVA-p10, одновременно с последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей целевой белок. Далее, можно осуществить получение ВЧ, представляющих собой комбинацию подтипов ГА. Например, ВЧ могут содержать один или более одного ГА подтипов H1, Н 2, Н 3, Н 4, Н 5, Н 6, Н 7, Н 8, Н 9,Н 10, Н 11, Н 12, Н 13, Н 14, Н 15, Н 16 или их комбинацию. Выбор комбинации ГА определяется предполагаемой областью применения полученной их ВЧ вакцины. Например, вакцина, предназначенная для вакцинации птиц, может содержать любую комбинацию подтипов ГА, в то время как ВЧ, предназначенные для вакцинации людей, могут содержать один или более одного из подтипов H1, Н 2, Н 3, Н 5. Тем не менее, возможно приготовление и других комбинаций подтипов ГА, в зависимости от применения ВЧ. Для получения ВЧ, содержащих комбинации подтипов ГА, возможна коэкспрессия требуемого подтипа ГА в той же клетке, например, в клетке растения. Далее, ВЧ, полученные как описано в настоящем документе, не содержат нейраминидазу (НА). Тем не менее, если требуются ВЧ, содержащие ГА и НА, возможна совместная экспрессия НА с ГА. В настоящем изобретении также предлагается соответствующий вектор, включающий химерную конструкцию, пригодную для использования в системах стабильной либо временной экспрессии. Генетическая информация может быть заключена в одной или нескольких конструкциях. Например, последовательность нуклеотидов, кодирующая целевой белок, может быть введена в виде одной конструкции, а вторая нуклеотидная последовательность, кодирующая белок, модифицирующий тип гликозилирования целевого белка, может быть введена как отдельная конструкция. Указанные последовательности нуклеотидные могут быть коэкспрессированы в растении. Можно использовать также конструкцию, содержащую нуклеотидную последовательность, кодирующую как целевой белок, так и белок, который модифицирует тип гликозилирования целевого белка. В этом случае последовательность нуклеотидов будет содержать первую последовательность, соответствующую нуклеиновой кислоте, кодирующей целевой белок и оперативно связанную с промотором или регуляторным участком, и вторую последовательность,соответствующую второй нуклеиновой кислоте, кодирующей белок, который модифицирует тип гликозилирования целевого белка, при этом вторая последовательность оперативно связана с промотором или