Рекомбинантные моновалентные антитела и способы их получения

РЕКОМБИНАНТНЫЕ МОНОВАЛЕНТНЫЕ АНТИТЕЛА И СПОСОБЫ ИХ ПОЛУЧЕНИЯ Паррен Пауль, Схюирман Янине,Винк Том, Блекер Виллем Карел,Ван Де Винкел Ян Г.Й., Ван Беркел Патрик, Брскенс Франк (NL) Саломатина И.С. (RU) Настоящее изобретение относится к моновалентным антителам с длительным временем полужизни при введении in vivo, способам получения таких моновалентных антител, фармацевтическим композициям, содержащим такие антитела, и применениям таких моновалентных антител. 016609 Область техники, к которой относится изобретение Настоящее изобретение относится к моновалентным антителам, которые можно использовать в терапевтических применениях. Изобретение также относится к способам получения моновалентных антител, фармацевтическим композициям, содержащим такие моновалентные антитела, и их использованию для различных терапевтических применений. Предшествующий уровень изобретения Нативные антитела и иммуноглобулины обычно представляют собой гетеротетрамерные гликопротеины с молекулярной массой около 150000 Да, состоящие из двух идентичных легких (L) цепей и двух идентичных тяжелых (H) цепей. Каждая легкая цепь соединена с тяжелой цепью одной ковалентной дисульфидной связью, в то время как число дисульфидных связей изменяется для тяжелых цепей различных изотипов иммуноглобулинов. Каждая легкая цепь состоит из вариабельной части (в данном описании сокращенно VL) и константной части (в данном описании сокращенно CL). Каждая тяжелая цепь состоит из вариабельной части (в данном описании сокращенно VH) и константной части (в данном описании сокращенно CH, состоящей из трех доменов CH1, CH2 и CH3). CH1, CH2 тяжелой цепи отделены друг от друга так называемой шарнирной областью. Шарнирная область обычно содержит один или несколько цистеиновых остатков, которые могут образовывать дисульфидные мостики с цистеиновыми остатками шарнирной области другой тяжелой цепи в молекуле антитела. В последнее время антитела стали областью пристального внимания для терапевтических применений, и многие лекарственные продукты на основе антител одобрены или находятся в процессе принятия для применения в качестве терапевтических лекарственных средств. Желательные свойства лечебных антител могут изменяться в соответствии с конкретным состоянием, от которого необходимо лечить. При некоторых показаниях требуется только связывание антигена, например, когда лечебное действие антител должно блокировать взаимодействие между антигеном и одной или несколькими определенными молекулами, способными в других случаях связываться с антигеном. При таких показаниях может быть предпочтительным использование Fab-фрагментов, единственной функцией которых является связывание антигена. При других показаниях также могут потребоваться другие действия, такие как, например, способность индуцировать активацию комплемента и/или способность, например, связывать Fcрецепторы, защищать от катаболизма, рекрутировать иммунокомпетентные клетки и т.д. Для такого применения могут потребоваться другие части молекулы антитела, такие как Fc-область. Некоторые полноразмерные антитела могут проявлять антагонистическое действие (которое может рассматриваться как нежелательное) после связывания с антигеном-мишенью, даже если антитело работает как антагонист, когда используется в виде Fab-фрагмента. В некоторых случаях действие может быть связано с"перекрестным сшиванием" двухвалентных антител, которое, в свою очередь, промотирует димеризацию мишени, которая может привести к активации, в особенности когда мишенью является рецептор. В случае растворимых антигенов димеризация может привести к образованию нежелательных иммунных комплексов. В некоторых случаях моновалентное связывание с антигеном, как в случае FcRI, может активировать сигналы апоптоза (Kanamura et al., Blood published on line, September 25, 2006). Таким образом, при некоторых показаниях могут быть предпочтительны моновалентные антитела. Доступные в настоящее время Fab-фрагменты показывают слабую фармакокинетику из-за их небольшого размера, приводящего к фильтрации в почках, а также их неспособности взаимодействовать с рецептором Brambell FcRn (Junghans R.P. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93(11), 5512-6 (1996, причем поэтому не устойчивы in vivo и имеют очень быстрый клиренс после введения. Также описаны димерные моновалентные антитела (Fab/c), в которых Fc-область содержит два полипептида Fc (WO 200563816, Genentech and Parham P., J. Immunol., 131(6), 2895-902 (1983. Также существует потребность в стабильных моновалентных антителах для применения в качестве лечебных средств. Делеция одного или нескольких доменов из полноразмерных антител, перекрывающая, например,области, содержащие аминокислотные остатки, необходимые для формирования дисульфидных мостиков или обеспечения нековалентных контактов внутри тяжелой цепи в антителе, может представлять путь конструирования моновалентных антител.Igarshi et al. (Igarshi T.M. et al., Biochemistry, 29, 5727 (1990 описывают структуру молекулы мышиного IgG2a, в которой полностью удален домен CH1, но шарнирная область осталась неизменной. Показано, что антитело с делетированным CH1 существует как протяженная структура с относительно небольшим шарнирным углом. Однако молекула сохраняет упорядоченную тетрамерную конфигурацию,состоящую из двух легких цепей и двух тяжелых цепей, ожидаемых для IgG, и, таким образом, все еще является двухвалентной, и делеция CH1 не влияет на аффинность мутированного антитела.Larson et al. (Larson S.B. et al., J. Mol. Biol., 348, 1177 (2005 описывают структуру гуманизированного антитела IgG1, в котором делетирован домен CH2. Такое антитело существует в двух молекулярных формах, названных формой A и формой B. Форма A содержит две внутрицепные дисульфидные связи в шарнире, в то время как форма B не содержит внутрицепных дисульфидных связей. Форма B существует как молекула в 122 кД, которая, как оказывается, удерживается нековалентными взаимодействиями в-1 016609 пределах домена CH3. Антитело быстро выводится из сыворотки из-за неспособности связываться с рецепторами FcRn и возвращаться через них в цикл. Половинные молекулы Ig, которые имеют димерную конфигурацию, включающую только одну легкую цепь и только одну тяжелую цепь, описаны как результат редких делеций при плазмацитомах человека и мыши. У некоторых пациентов, страдающих от экстрамедуллярной плазмацитомы мягких тканей, макроглобуленемии Вальденстрма, плазмоцитарного лейкоза и множественной миеломы, половинные молекулы IgG выделяют в моче. Также обнаружено присутствие половинных молекул в сыворотке. Исследование биохимической природы таких половинных молекул показало, что они состоят из молекул IgG1, в которых области тяжелой цепи CH1, шарнирная и CH2 являются нормальными, в то время как в области CH3 обнаружены делеции. При анализе делеций в домене CH3 константной области в половинной молекуле IgG1 Speiegelberg показал, что она включает 5000-8000 Да и шарнирная пептидная последовательность идентична IgG1 дикого типа. Оказалось, что мутации локализованы в CH3, а шарнирный пептид является нормальным (Hobbs J.R. et al., Clin. Exp. Immunol., 5, 199 (1969); Hobbs J.R., Br.Med. J., 2, 67 (1971); Speiegelberg H.L. et al., Blood, 45, 305 (1975); Speiegelberg H.L. et al., Biochemistry,14, 2157 (1975); Seligmann M.E. et al., Ann. Immunol., (Paris), 129C, 855-870 (1978); Gallango M.X. et al.,Blut, 48, 91 (1983. Также показано, что такая половинная молекула IgG1 человека быстро диссимилирует (время полужизни у человека составляет 4,3 суток) и в мономерной форме неспособна связываться с рецепторами C1q или Fc на лимфоцитах, моноцитах или нейтрофилах человека (Speiegelberg H.L., J. Clin.Invest., 56, 588 (1975. Из этих исследований сделан вывод, что половинной молекуле IgG1 недостает нековалентных взаимодействий, характерных для части Fc тяжелой цепи IgG, что дестабилизирует молекулу и что домен CH3 может быть особенно важным для сохранения взаимодействий между тяжелыми цепями IgG. Также описаны половинные молекулы мышиного IgG, которые получены в результате соматической мутации (Mushinski J.F., J. Immunol., 106, 41 (1971); Mushinski J.F. et al., J. Immunol., 117, 1668Zack D.J. et al., J. Exp. Med., 154, 1554 (1981. Показано, что все такие молекулы содержат делеции домена CH3 или мутации в сочленении CH2-CH3. Половинные молекулы IgG человека также обнаружены у пациентов с множественной миеломой. Обнаружено, что такие молекулы имеют делеции, также локализованные в участках CH3 (Speiegelberg H.L., J. Clin. Invest., 58, 1259 (1976); Kawai Т. et al., Ann. Acad.Med. Singapore, 9, 50 (1980); Sakurabayashi I. et al., Blood, 53, 269 (1979); Biewenga J. et al., Clin. Exp. Immunol., 51, 395 (1983. Описаны и кристаллизованы мутанты человеческого IgG1 с шарнирными делениями (Saphire E.O. etal., J. Mol. Biol., 319, 95 (2002. Dob и Mcg являются белками миеломы человека подкласса человеческого IgG1, которые содержат делецию шарнирной области. Такие молекулы IgG1 с делетированной шарнирной областью образуют стабильные Ig со структурой, состоящей из двух тяжелых и двух легких цепей, которая является типичной гетеротетрамерной структурой антител, которая, однако, образует внутрицепные дисульфидные связи между легкими цепями, что приводит к молекулам, которые конформационно сильно ограничены и которые проявляют слабую эффекторную функцию или не проявляют ееal., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78, 524 (1981. Создана молекула IgG3, в которой делетированы верхняя и средняя части шарнирных областей или полная шарнирная область (Brekke O.H. et al., Nature, 363, 628 (1993); Brekke O.H. et al., Nature, 383, 103(1996. В популяции молекул с полностью делегированным шарниром присутствуют половинные молекулы после анализа с помощью невосстанавливающего SDS-PAGE. Во второй популяции молекул с делетированным шарниром, в которых все верхние и нижние части шарнира IgG3 заменены одним цистеином и нижняя часть шарнира IgG3 содержит одну делецию Ala, также содержатся половинные молекулы согласно анализу SDS-PAGE. Однако результаты показывают, что в физиологических условиях две половинные молекулы из тяжелой-легкой цепей удерживаются вместе нековалентными взаимодействиями между доменами CH3 IgG3 и поэтому образуются интактные молекулы IgG. Также получен соответствующий набор химерных антител IgG1 и IgG4 (Horgan C. et al., J. Immunol., 150, 5400 (1993. Для того чтобы исследовать роль шарнирной области IgG в связывании антитела с антигеном, получили мутантов как IgG1, так и IgG4, лишенных шарнирной области. Мутантов получили с помощью делеций ДНК экзота шарнирной области из генов тяжелых цепей IgG1 и IgG4. Сообщалось,что молекулы как IgG1, так и IgG4 с делетированными шарнирными областями являются двухвалентными, поэтому имеют типичную гетеротетрамерную структуру. В поддержку этого функциональная аффинность IgG4 с делетированной шарнирной областью показала лучшее связывание с антигеном, чемIgG4 дикого типа, что показывает, что на авидность молекулы с делетированной шарнирной областью не влияет полученная таким образом делеция шарнирной области. Молекулы человеческого IgG4 существуют в различных молекулярных формах, которые различаются отсутствием или наличием дисульфидных связей внутри тяжелой цепи, локализованных в шарнир-2 016609 ной области. Таким образом, существуют молекулы IgG4, в которых образовались две или одна дисульфидные связи или они не образовались (Schuurman J. et al., Mol. Immunol., 38, 1 (2001. В физиологических условиях такие молекулярные формы IgG4 могут находиться в равновесии друг с другом. Человеческий IgG4 существует в виде тетрамеров в растворе, состоящем из двух тяжелых цепей Ig и двух легких цепей, что обычно для молекул иммуноглобулина G, безотносительно к отсутствию или наличию таких внутрицепных дисульфидных связей (Schuurman, 2001, цит. выше; Gregory L. et al., Mol. Immunol.,24, 821 (1987. Только после денатурации в невосстанавливающих условиях две нековалентно ассоциированные половинные молекулы диссоциируют, как показывает анализ, определяющий размеры, такой как SDS-PAGE (Schuurman J. et al., Mol. Immunol., 38, 1 (2001); Deng L. et al., Biotechnol. Appl. Biochem.,40, 261 (2004. Показано, что мутация остатков шарнирной области, которые вовлечены в образование внутрицепных дисульфидных связей, или делеция шарнирной области ведут к созданию гомогенного пула молекул IgG4 в растворе, который состоит из тетрамерных молекул, состоящих из двух легких цепей и двух тяжелых цепей (Schuurman J. et al., Mol. Immunol, 38, 1 (2001); Horgan C. et al., J. Immunol.,150, 5400 (1993. IgG4 с делетированной шарнирной областью и мутированные антитела также обладают улучшенной способностью связывать антиген при сравнении с нативными молекулами IgG4 (HorganC. (1993), цит. выше). Теперь в ряде исследований показано, что мутация или делеция доменов константной области IgGCH1 и CH2 не влияет на сборку молекул IgG в их естественной гетеротетрамерной конфигурации с двумя тяжелыми цепями и двумя легкими цепями. Показано, что молекулы рекомбинантных антител, содержащие различные делеции в своих константных областях тяжелой цепи, испытывают влияние на свою эффекторную функцию, например они не способны к активации комплемента, однако они сохраняют свою способность к связыванию антигена. Более того, показано, что половинные молекулы антител, содержащие только одну тяжелую цепь и одну легкую цепь, нестабильны in vivo и/или имеют пониженное время полужизни in vivo. Делеции в/из участка CH3 дают половинные молекулы с быстрым метаболизмом, что делает их непригодными для большинства терапевтических целей. Таким образом, существует потребность в простом способе получения стабильных моновалентных антител, которые могут быть использованы для терапевтических применений, в которых требуется блокировка антигенопосредованной активности связыванием моновалентными антителами (при отсутствии сшивания). Сущность изобретения Настоящее изобретение относится к способу получения моновалентного антитела, включающему:A) i) обеспечение нуклеотидной конструкции, кодирующей легкую цепь указанного моновалентного антитела, причем указанная конструкция содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую область VL выбранного антигенспецифического антитела, и нуклеотидную последовательность, кодирующую константную область CL Ig, где указанная нуклеотидная последовательность, кодирующая область VL выбранного антигенспецифического антитела, и указанная нуклеотидная последовательность,кодирующая область CL Ig, функционально соединены вместе, и где, в случае подтипа IgG1, нуклеотидная последовательность, кодирующая область CL, модифицирована таким образом, что область CL не содержит каких-либо аминокислот, способных образовывать дисульфидные связи или ковалентные связи с другими пептидами, содержащими идентичную аминокислотную последовательность области CL, в присутствии поликлонального человеческого IgG или при введении в организм животного или человека;ii) обеспечение нуклеотидной конструкции, кодирующей тяжелую цепь указанного моновалентного антитела, причем указанная конструкция содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую область VH выбранного антигенспецифического антитела, и нуклеотидную последовательность, кодирующую константную область CH человеческого Ig, где указанная нуклеотидная последовательность,кодирующая область CH, модифицирована таким образом, что область, соответствующая шарнирной области, и, как требует подтип Ig, другие участки области CH, такие как участок CH3, не содержат какихлибо аминокислотных остатков, которые принимают участие в образовании дисульфидных связей или ковалентных или стабильных нековалентных межцепных связей тяжелой цепи с другими пептидами,содержащими идентичную аминокислотную последовательность области CH человеческого Ig, в присутствии поликлонального человеческого IgG или при введении в организм животного или человека, где указанная нуклеотидная последовательность, кодирующая область VH выбранного антигенспецифического антитела, и указанная нуклеотидная последовательность, кодирующая область CH указанного Ig,функционально соединены вместе;iii) обеспечение клеточной экспрессирующей системы для получения указанного моновалентного антитела;iv) получение указанного моновалентного антитела коэкспрессией нуклеотидных конструкций (i) и(ii) в клетках клеточной экспрессирующей системы (iii). В одном воплощении способа человеческий Ig представляет собой антитела IgG1, IgG2, IgG3, IgG4,IgA или IgD, например антитела IgG1, IgG2 или IgG4.-3 016609 образом, что осуществлены одна или несколько следующих замен аминокислот: Arg (R) в позиции 238 заменен Gln (Q); Asp (D) в позиции 239 заменен Glu (E); Lys (K) в позиции 292 заменен Arg (R); Gln (Q) в позиции 302 заменен Glu (E) и Pro (P) в позиции 328 заменен Leu (L). Изобретение относится к способу по B), где Arg (R) в позиции 238 заменен Gln (Q). Изобретение относится к способу по B), где Arg (R) в позиции 238 заменен Gln (Q) и Pro (P) в позиции 328 заменен Leu (L). Изобретение относится к способу по B), где осуществлены все пять замен аминокислот.C) Изобретение относится к способу по A) или B), где человеческий Ig представляет собой IgG1 и область CL представляет собой CL легкой цепи каппа с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 18, где область CL модифицирована таким образом, что концевой цистеиновый остаток в позиции 106 заменен другим аминокислотным остатком или делетирован.D) Изобретение относится к способу по A) или B), где человеческий Ig представляет собой IgG1 и область CL представляет собой CL легкой цепи лямбда с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 17, где область CL модифицирована таким образом, что концевой цистеиновый остаток в позиции 104 заменен другим аминокислотным остатком или делетирован.G) Изобретение относится к способу по A), где человеческий Ig представляет собой IgG2 с аминокислотной последовательностью области CH, представленной в SEQ ID NO: 20, где участок CH3 модифицирован таким образом, что осуществлены одна или несколько следующих замен аминокислот: Arg (R) в позиции 234 заменен Gln (Q); Met (M) в позиции 276 заменен Val (V); Lys (K) в позиции 288 заменен Arg(R); Gln (Q) в позиции 298 заменен Glu (E) и Pro (P) в позиции 324 заменен Leu (L). Изобретение относится к способу по G), где Arg (R) в позиции 234 заменен Gln (Q). Изобретение относится к способу по G), где Arg (R) в позиции 234 заменен Gln (Q) и Pro (P) в позиции 324 заменен Leu (L). Изобретение относится к способу по G), где осуществлены все пять замен аминокислот.H) Изобретение относится к способу по A), где человеческий Ig представляет собой IgG3 с аминокислотной последовательностью области CH, представленной в SEQ ID NO: 21, где участок CH3 модифицирован таким образом, что осуществлены одна или несколько следующих замен аминокислот: Arg (R) в позиции 285 заменен Gln (Q); Ser (S) в позиции 314 заменен Asn (N); Asn (N) в позиции 322 заменен Lys(K); Met (M) в позиции 327 заменен Val (V); Lys (K) в позиции 339 заменен Arg (R); Gln (Q) в позиции 349 заменен Glu (Е); Ile (I) в позиции 352 заменен Val (V); Arg (R) в позиции 365 заменен His (H); Phe (F) в позиции 366 заменен Tyr (Y) и Pro (P) в позиции 375 заменен Leu (L). Изобретение относится к способу по H), где Arg (R) в позиции 285 заменен Gln (Q). Изобретение относится к способу по H), где Arg (R) в позиции 285 заменен Gln (Q) и Pro (P) в позиции 375 заменен Leu (L). Изобретение относится к способу по H), где осуществлены все 10 замен. Настоящее изобретение также относится к способу получения моновалентного антитела, включающему:i) обеспечение нуклеотидной конструкции, кодирующей легкую цепь указанного моновалентного антитела, причем указанная конструкция содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую область VL выбранного антигенспецифического антитела, и нуклеотидную последовательность, кодирующую константную область (CL) Ig, где указанная нуклеотидная последовательность, кодирующая область VL выбранного антигенспецифического антитела, и указанная нуклеотидная последовательность,кодирующая область CL Ig, функционально соединены вместе;ii) обеспечение нуклеотидной конструкции, кодирующей тяжелую цепь указанного моновалентного антитела, причем указанная конструкция содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую область VH выбранного антигенспецифического антитела, и нуклеотидную последовательность, кодирующую область CH человеческого IgG4, где указанная нуклеотидная последовательность, кодирующая тяжелую цепь, модифицирована так, что область, соответствующая шарнирной области тяжелой цепи, не содержат каких-либо аминокислотных остатков, способных принимать участие в образовании дисульфидных связей с другими пептидами, содержащими идентичную аминокислотную последовательность константной области (CH) человеческого IgG4, где указанная нуклеиновая кислота, кодирующая областьiii) обеспечение клеточной экспрессирующей системы для получения указанного антитела;iv) получение указанного моновалентного антитела коэкспрессией нуклеотидных конструкций (i) и(ii) в клетках клеточной экспрессирующей системы (iii). Настоящее изобретение также относится к моновалентному антителу, полученному с применением способа по изобретению. Настоящее изобретение также относится к моновалентному антителу, которое можно получить с-4 016609 применением способа по изобретению. Настоящее изобретение также относится к моновалентному антителу, содержащему легкую цепь и тяжелую цепь, в котором:a) указанная легкая цепь содержит аминокислотную последовательность вариабельной (VL) области выбранного антигенспецифического антитела и аминокислотную последовательность константной (CL) области Ig иb) указанная тяжелая цепь содержит аминокислотную последовательность вариабельной (VH) области выбранного антигенспецифического антитела и аминокислотную последовательность константной(CH) области человеческого IgG4, где аминокислотная последовательность тяжелой цепи модифицирована так, что ни один из аминокислотных остатков, присутствующих в области, соответствующей шарнирной области, не способен принимать участие в образовании дисульфидных связей с другими пептидами,содержащими идентичную аминокислотную последовательность константной области (CH) человеческого IgG4. Настоящее изобретение также относится к способу получения моновалентных антител по изобретению, включающему стадии:a) культивирования клеток-хозяев, содержащих нуклеотидную последовательность, кодирующую указанные моновалентные антитела; иb) извлечения моновалентных антител из культуры клеток-хозяев. Настоящее изобретение также относится к нуклеотидной конструкции, содержащей нуклеотидную последовательность, кодирующую область CH IgG4, где нуклеотидная последовательность, кодирующая область CH, модифицирована так, что область, соответствующая шарнирной области в указанной областиCH, не содержит каких-либо аминокислотных остатков, способных принимать участие в образовании дисульфидных связей с пептидами, содержащими аминокислотную последовательность, идентичную аминокислотной последовательности указанной области CH, или последовательность, комплементарную ей. Настоящее изобретение также относится к способу получения моновалентных антител по изобретению, включающему культивирование клеток-хозяев, содержащих нуклеотидную конструкцию по изобретению, и, если указанная нуклеотидная конструкция не кодирует легкую цепь указанных антител,также содержащих нуклеотидную конструкцию, кодирующую легкую цепь указанных антител, так что экспрессируются полипептиды, и извлечение моновалентных антител из клеточной культуры. Настоящее изобретение также относится к применению нуклеотидной конструкции по изобретению для получения моновалентного тела по изобретению. Настоящее изобретение также относится к клетке-хозяину, содержащей нуклеиновую кислоту по изобретению. Настоящее изобретение также относится к способу получения моновалентных антител по изобретению, включающему культивирование клеток-хозяев по изобретению, содержащих нуклеотидную последовательность, кодирующую легкую цепь указанных антител, так что экспрессируются полипептиды, и извлечение моновалентных антител из клеточной культуры. Настоящее изобретение также относится к применению клетки-хозяина по изобретению для получения моновалентных антител по изобретению. Настоящее изобретение также относится к иммуноконъюгату, содержащему моновалентное антитело по изобретению, конъюгированное с лечебной молекулой. Настоящее изобретение также относится к моновалентным антителам по изобретению для применения в качестве лечебного средства. Настоящее изобретение также относится к применению моновалентных антител по изобретению в качестве лечебного средства. Настоящее изобретение также относится к применению антител по изобретению для получения фармацевтической композиции для лечения рака, расстройства клеточной пролиферации, (ауто)иммунного расстройства и/или ангиогенного расстройства, где антитела специфически связываются с заданной мишенью или эпитопом мишени, где связывание антител с указанными мишенью или эпитопом мишени эффективно при лечении указанного заболевания. Настоящее изобретение также относится к применению антител по изобретению для получения фармацевтической композиции для лечения заболевания или расстройства, которые поддаются лечению путем введения антител против определенной мишени, где вовлечение опосредованных иммунной системой активностей не является необходимым или нежелательно для достижения эффекта от введения антител, и где указанные антитела специфически связываются с указанным антигеном. Настоящее изобретение также относится к применению антител по изобретению для получения фармацевтической композиции для лечения заболевания или расстройства, которые поддаются лечению путем блокировки или ингибирования растворимого антигена, где при мультимеризации указанного антигена могут образовываться нежелательные комплексы и где указанные антитела специфически связываются с указанным антигеном. Настоящее изобретение также относится к применению антител по изобретению для получения-5 016609 фармацевтической композиции для лечения заболевания или расстройства, которые поддаются лечению путем блокировки или ингибирования клеточного мембраносвязанного рецептора, где указанный рецептор может быть активирован путем димеризации указанного рецептора и где указанные антитела специфически связываются с указанным рецептором. Настоящее изобретение также относится к способу ингибирования антигена у субъекта, страдающего от заболевания или расстройства, при котором нежелательна активность антигена, включающему введение субъекту моновалентных антител по изобретению, которые специфически связываются с указанным антигеном, фармацевтической композиции, содержащей указанные антитела, иммуноконъюгата,содержащего указанные антитела, или нуклеотидной конструкции по изобретению, так что активность антигена у субъекта ингибируется. Настоящее изобретение также относится к способу лечения заболевания или расстройства, включающему введение субъекту, нуждающемуся в таком лечении, терапевтически эффективного количества моновалентных антител по изобретению, фармацевтической композиции, содержащей указанные антитела, иммуноконъюгата, содержащего указанные антитела, или нуклеотидной конструкции по изобретению, посредством чего заболевание или расстройство лечится. Настоящее изобретение также относится к фармацевтической композиции, содержащей моновалентные антитела по изобретению вместе с одним или несколькими фармацевтически приемлемыми эксципиентами, разбавителями или носителями. Настоящее изобретение также относится к трансгенному животному, содержащему указанную нуклеотидную конструкцию по изобретению. Описание чертежей Фиг. 1 - специфические к CD20 антитела 7D8-IgG1, 7D8-IgG4 и 7D8-HG оценивают в невосстанавливающем SDS-PAGE. Полоса 1: маркер, предварительно окрашенный SeuBlue plus2 (Invitrogen BV, Нидерланды), полоса 2: внутренний контроль, полоса 3: 7D8-IgG1, полоса 4: 7D8-IgG4 и полоса 5: 7D8-HG. Фиг. 2 - хроматограмма экстрагированных ионов для ионов [M+3H]3+ и [M+2H]2+ (m/z 676,4 и 1014,1 соответственно) с элюированием при времени TIC 39,3 мин в восстановленной смеси(220VAPEFLGGPSVFLFPPKPK238), из восстановленной смеси CNBr/триптический гидролизат 7D8-HG. Фиг. 4A и 4B - интерпретация исходных данных, полученных в анализе MC с распылением до наночастиц/MC сигналов m/z, соответствующих пептиду, перекрывающему аминокислотные остатки 220238 (220VAPEFLGGPSVFLFPPKPK238), из восстановленной смеси CNBr/триптический гидролизат 7D8HG. Фиг. 5 - специфические к CD20 антитела 7D8-IgG1, 7D8-IgG4 и 7D8-HG оценивают по их связыванию с клетками, трансфицированными CD20. Фиг. 6 - специфические к CD20 антитела 7D8-IgG1, 7D8-IgG4 и 7D8-HG наносят на планшет дляELISA (интервал концентраций указан на оси х). Оценивают связывание C1q (2 мкг/мл). Фиг. 7, 7A) - клетки Дауди предварительно инкубируют со специфическими к CD20 антителами в интервале концентраций в течение 10 мин перед добавлением NHS. Через сорок пять минут после индукции CDC клетки ресуспендируют в растворе PI. Лизис клеток (число PI-положительных клеток) измеряют проточной цитометрией. Данные показывают среднюю интенсивность флуоресценции PIположительных (погибших) клеток. Фиг. 7B) - для того чтобы оценить роль комплемента в измеренном лизисе, добавляют инактивированную нагреванием сыворотку (сыворотка T) к клеткам, инкубированным с 10 мкг антител против stof. Данные показывают среднюю интенсивность флуоресценции PIположительных (погибших) клеток. Фиг. 8 - бесшарнирные (лишенные шарнирной области) антитела IgG4, направленные против Betv1(Betv1-HG) испытывают в невосстанавливающем SDS-PAGE. Полоса 1: маркер, предварительно окрашенный SeuBlue plus2 (Invitrogen BV, Нидерланды), полоса 2: внутренний контроль, полоса 3: Betv1-HG, полоса 4: контроль IgG1. Фиг. 9 - гель-фильтрация Betv1-HG (бесшарнирные антитела IgG4 против Betv1). Кондиционированную среду из клеток HEK, содержащую бесшарнирные rIgG4 Betv1-HG, фракционируют на колонке с супердексом 200. В колонку вносят всего 1 мкг Betv1-HG. Во фракциях определяют специфический кBetv1 IgG , инкубируя 10 мкл каждой фракции при испытании на связывание Betv1. Результаты выражают в виде процента меченного радиоизотопом Betv1 относительно добавленного количества. Пунктирная кривая представляет элюирование очищенного Betv1-IgG4 (10 мкг) при ВЭЖХ по измерению поглощения при 214 нм (A214 нм). Фиг. 10 - проверяют связывание Betv1-IgG1, Betv1-IgG4 и Betv1-HG в радиоиммунном анализе. Проверяют связывание меченного 125I Betv1 с серийными разведениями антител, связанных с протеиномG на сефарозе.-6 016609 Фиг. 11 - в радиоиммунном анализе проверяют способность Betv1-IgG1, Betv1-IgG4 и Betv1-HG сшивать связанный с сефарозой Betv1 с меченным изотопом Betv1. Проверяют связывание меченного 125IBetv1 с серийными разведениями антител, связанных с Betv1 на сефарозе. Фиг. 12 - полулогарифмический график концентраций в мышиной плазме 7D8-HG в сравнении с нормальным 7D8-IgG4, интактным 7D8-IgG1, 7D8-IgG1, фрагментами F(ab')2 и Fab 7D8-IgG1 после внутривенного введения 100 мкг на мышь. Фиг. 13 - логарифмический график скоростей клиренса из плазмы в виде зависимости доза/площадь под кривой, вычисленной из кривых зависимости концентрации от времени (D/AUC). Данные приводятся для отдельных мышей и выражены в млсутки-1 кг-1. Фиг. 14 - кривые зависимости реакции от дозы, показывающие ингибирование индуцированногоEGF фосфорилирования EGFr в клетках A431 mAb 2F8-HG против EGFr, в сравнении с фрагментами 2F8-IgG4 и 2F8-Fab. Верхний график показывает кривые ингибирования в бессывороточной среде, средний и нижний графики показывают ингибирование, когда в среду добавляют IVIG в концентрации 100 и 1000 мкг/мл соответственно. Ось y представляет фосфорилированный EGFr, обнаруженный с помощью антифосфотирозиновых mAb и выраженный в единицах флуоресценции с разрешением во времени (единицы TRF). По оси х концентрация mAb в мкг/мл. Точки данных представляют среднее и SEM из 4 повторов. Фиг. 15 - полулогарифмический график зависимости концентраций от времени. Начальные концентрации в плазме все порядка 100 мкг/мл, что согласуется с начальным распределением в компраменте плазмы мышей. Клиренс варианта бесшарнирного IgG4 происходит только несколько быстрее, чем нормального IgG4. Важно, что клиренс варианта бесшарнирного IgG4 происходит значительно медленнее,чем клиренс фрагментов F(ab')2, которые имеют сравнимый молекулярный размер. Данный эксперимент показывает, что Fc-часть оказывает благоприятное действие на время пребывания в плазме у мышей с нормальной иммунной системой и указывает на функциональное взаимодействие с неонатальным рецептором Fc (FcRn) также в присутствии эндогенного IgG. Фиг. 16 - связывание 2F8-HG с покрытием из белка EGFr сравнивают в ELISA со связыванием 2F8IgG4, 2F8-IgG1 и фрагментов Fab 2F8-IgG1 в присутствии поликлонального человеческого IgG (IVIG) в концентрации 100 мкг/мл. Фиг. 17 - индукции ADCC 2F8-HG в сравнении с индукцией 2F8-IgG1 и 2F8-IgG4. Используют клетки A431 в качестве клеток-мишеней и мононуклеарные клетки периферической крови человека в качестве эффекторных клеток. Фиг. 18 - последовательность праймеров, используемых в примерах. Фиг. 19 - последовательности праймеров, используемых в примерах. Фиг. 20 - клиренс вариантов 7D8 с добавлением IVIG у мышей SCID. В верхней части чертежа приводятся полулогарифмические графики зависимости концентрации вариантов mAb 7D8 от времени и в нижней части концентрации полного человеческого IgG. Фиг. 21 - клиренс вариантов 7D8 у мышей FcRn -/- в сравнении с мышами дикого типа. Чертеж представляет полулогарифмический график зависимости концентрации от времени. Начальные концентрации в плазме все порядка 100 мкг/мл, что согласуется с начальным распределением в компраменте плазмы мышей. На модели сравнивают бесшарнирный вариант IgG4 (7D8-HG), нормальный человеческий IgG4 (7D8-IgG4) и фрагменты из 7D8-IgG1(7D8-G1-F(ab')2). Фиг. 22 - клетки DU-145 культивируют и инкубируют с серийным разведением (A) cMet-Fab, cMetFab и IVIG, cMet-Fab и HGF, cMet-Fab и IVIG и HGF, (B) cMet-HG, cMet-HG и IVIG, cMet-HG и HGF,cMet-HG и IVIG, и HGF. Рассеяние наблюдают двойным слепым методом (оценено 14 человек) под микроскопом через 48 ч, и строят график средней оценкиSEM. Фиг. 23 - клетки DU-145 культивируют и инкубируют с 10 мкг/мл (A) cMet-Fab, cMet-Fab и IVIG,cMet-Fab и HGF, cMet-Fab и IVIG, и HGF, (B) cMet-HG, cMet-HG и IVIG, cMet-HG и HGF, cMet-HG иIVIG, и HGF. Рассеяние наблюдают двойным слепым методом (оценено 14 человек) под микроскопом через 48 ч.cMet-Fab с или без IVIG и cMet-HG, предварительно инкубированные с IVIG, существенно ингибируют индуцируемое HGF рассеяние. Для статистического анализа выполняют проверенный ранговый двусторонний критерий Уилкоксона с гипотетической медианой 3 (максимальное рассеяние). Фиг. 24 - экстракты, полученные из клеток A549, инкубированные с cMet-HG (полоса 1), cMet-HG иIVIG (полоса 2), cMet-HG (полоса 3), cMet-HG, IVIG и HGF (полоса 4), cMet-IgG1 (полоса 5), cMet-IgG1 и IVIG (полоса 6), расщепляют SDS-PAGE в 4-20% геле Criterion Precast с трис-HCl и осуществляют вестерн-блоттинг на нитроцеллюлозной мембране. Мембрану инкубируют в течение ночи при 4C с кроличьим IgG против фосфо-Met(pYpYpY 1230 1234 1235) (Abcam, ab5662). После промывки TBST вторичные антитела, козьи антикроличьи HPR, Cell Signaling, 7074 в реагенте для блокировки инкубируют в течение 60 мин при комнатной температуре на качалке. Мембрану промывают 6 раз TBST. Наконец, полосы проявляют усиливающим стоп-раствором люминала и анализируют на устройстве для визуализации Lumiivager. Вестерн-блоттинг показывает полосу 169 кД, указывающую на фосфо-Met(pYpYpY 1230-7 016609 1234 1235). Фиг. 25 - начальная концентрация при добавлении HuMax-CD4 или фрагментов Fab HuMax-CD4 в анализ in vitro нейтрализации ВИЧ-1. Величины IC50 ингибирования HuMax-CD4 и фрагментами FabHuMax-CD4 вычисляют, подбирая 4-параметрическую логистическую кривую, и указывают для каждой вирусной конструкции. Фиг. 26 - % человеческих T-клеток, % мышиных клеток и % клеток CD4 и % клеток CD8, и отношение CD4/CD8 отдельных восстановленных РВМС мышей, обработанных интраперитонеально HuMaxCD4, контролем IgG, и необработанных и инфицированных ВИЧ-1. Фиг. 27 - кривые ингибирования HuMax-CD4 или фрагментов Fab HuMax-CD4 заражения несколькими штаммами ВИЧ-1 CD4-CCR5- или CD4CXCR4-положительных клеток, измеренного по люциферазной активности (среднее из трех измерений). Фиг. 28 - зависимость от времени концентрации HuMax-CD4 в плазме отдельных восстановленных РВМС мышей, обработанных интраперитонеально HuMax-CD4 ИЛИ необработанных и инфицированных ВИЧ-1. Фиг. 29 - зависимость от времени количества копий РНК ВИЧ-1 у отдельных восстановленных РВМС мышей, обработанных интраперитонеально HuMax-CD4 или контролем IgG или необработанных и инфицированных ВИЧ-1. Подробное описание перечней последовательностейSEQ ID NO: 2: аминокислотная последовательность легкой цепи каппа человеческого Ig.SEQ ID NO: 4: аминокислотная последовательность легкой цепи лямбда человеческого Ig.SEQ ID NO: 5: нуклеотидная последовательность области VH HuMab-7CD8.SEQ ID NO: 6: аминокислотная последовательность области VH HuMab-7CD8.SEQ ID NO: 7: нуклеотидная последовательность области VH мышиного антитела против Betv-1.SEQ ID NO: 8: аминокислотная последовательность области VH мышиного антитела против Betv-1.SEQ ID NO: 9: нуклеотидная последовательность области VL HuMab-7CD8.SEQ ID NO: 10: аминокислотная последовательность области VL HuMab-7CD8.SEQ ID NO: 11: нуклеотидная последовательность области VL мышиного антитела против Betv-1.SEQ ID NO: 12: аминокислотная последовательность области VL мышиного антитела против Betv-1.SEQ ID NO: 13: нуклеотидная последовательность области CH человеческого IgG4 дикого типа.SEQ ID NO: 14: аминокислотная последовательность области CH человеческого IgG4 дикого типа.SEQ ID NO: 15: нуклеотидная последовательность области CH человеческого IgG4 (SEQ ID NO: 13),мутированного в позициях 714 и 722.SEQ ID NO: 16: аминокислотная последовательность области CH человеческого IgG4, полученного экспрессией нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 15.SEQ ID NO: 17: аминокислотная последовательность константной области лямбда-цепи человекаSEQ ID NO: 18: аминокислотная последовательность константной области каппа-цепи человекаSEQ ID NO: 19: аминокислотная последовательность константной области IgG1 (инвентарный номер P01857).SEQ ID NO: 20: аминокислотная последовательность константной области IgG2 (инвентарный номер P01859).SEQ ID NO: 21: аминокислотная последовательность константной области IgG3 (инвентарный номер A23511). Подробное описание изобретения Для того чтобы настоящее изобретение можно было легче понять, сначала даются определения некоторых терминов. Другие определения приводятся по ходу подробного описания. Термин "антитело", используемый в данном описании, включает полные молекулы антител, антигенсвязывающие фрагменты, моновалентные антитела и их отдельные цепи. Молекулы антител принадлежат к семейству белков плазмы, называемых иммуноглобулинами, чей основной строительный блокиммуноглобулиновая складка или домен используются в различных формах во многих молекулах иммунной системы и других биологических систем узнавания. Нативные антитела и иммуноглобулины обычно представляют собой гетеротетрамерные гликопротеины в примерно 150000 Да, состоящие из двух идентичных легких (L) цепей и двух идентичных тяжелых (H) цепей. Каждая легкая цепь соединена с тяжелой цепью одной ковалентной дисульфидной связью, в то время как число дисульфидных связей изменяется для тяжелых цепей различных изотипов иммуноглобулинов. Каждая тяжелая и легкая цепи также может иметь упорядоченно размещенные внутрицепные дисульфидные мостики. Каждая легкая цепь состоит из вариабельной области легкой цепи (в данном описании сокращенно VL) и константной области легкой цепи (в данном описании сокращенно CL). Каждая тяжелая цепь состоит из вариабельной области тяжелой цепи (VH) и константной области тяжелой цепи (CH), состоящей из трех доменов CH1,-8 016609CH2 и CH3 и шарнирной области. Константная область легкой цепи располагается под углом к первому домену константной области (CH1) тяжелой цепи, и вариабельная область легкой цепи располагается под углом к вариабельной области тяжелой цепи, образуя то, что известно как "Fab-фрагмент". CH1 и CH2 тяжелой цепи отделены друг от друга так называемой шарнирной областью, которая позволяет "плечам"Fab молекулы антитела до некоторой степени колебаться. Шарнирная область обычно содержит один или несколько цистеиновых остатков, которые способны образовывать дисульфидные мостики с цистеиновыми остатками шарнирной области другой тяжелой цепи в молекуле антитела. Вариабельные области тяжелой и легкой цепей содержат связывающий домен, который взаимодействует с антигеном. Константные области антител могут опосредовать связывание иммуноглобулина с тканями или факторами хозяина, включая различные клетки иммунной системы (например, эффекторные клетки) и первый компонент (C1q) классической системы комплемента. В зависимости от аминокислотных последовательностей константной области их тяжелых цепей иммуноглобулины можно приписать к различным классам. Существует по меньшей мере пять основных классов иммуноглобулинов: IgA, IgD, IgE, IgG и IgM, и некоторые их них можно дополнительно разделить на подклассы (изотипы), например IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4; IgA1 и IgA2. Гены для константных областей тяжелых цепей, которые соответствуют различным классам иммуноглобулинов, называются альфа , дельта , ипсилон , гаммаи мюсоответственно. Подклассы иммуноглобулинов кодируются различными генами, такими как 1, 2, 3 и 4. Гены для легких цепей антител приписываются к одному из двух четко различающихся классов, называемых каппаи лямбда , основанных на аминокислотных последовательностях их константной области. Структуры субъединиц и трехмерные конфигурации различных классов иммуноглобулинов хорошо известны. Существуют различные аллотипы иммуноглобулинов в человеческой популяции, такие как G1m(a), G1m(x), G1m(f) и G1m(z) для тяжелой цепи IgG1 и Km1, Km1,2 и Km3 для легкой цепи каппа. Такие аллотипы отличаются по различным аминокислотам в их участке, кодирующем константные области. Термин "антитело" также охватывает "производные" антител, в которых один или несколько аминокислотных остатков дериватизированы, например, ацилированием или гликозилированием, без существенного воздействия или изменения связывающих свойств антитела, содержащего аминокислотные последовательности. В контексте настоящего изобретения производное моновалентного антитела может представлять собой, например, моновалентное антитело, в котором один или несколько аминокислотных остатков моновалентного антитела модифицированы химически (например, алкилированием, ацилированием, образованием эфира или образованием амида) или ассоциированы с одним или несколькими неаминокислотными органическими и/или неорганическими атомными или молекулярными заместителями (например,группой полиэтиленгликоля (ПЭГ, PEG), липофильным заместителем (который, необязательно, может быть соединен с аминокислотной последовательностью пептида спейсерным остатком или группой, такой как -аланин, -аминомасляная кислота (GABA), L/D-глутаминовая кислота, янтарная кислота и т.д.),флуорофор, биотин, радионуклеид и т.д.) и также, или альтернативно, может содержать несущественные,невстречающиеся в природе и/или не-L аминокислотные остатки, если контекст не опровергает этого или не указывает на иное (однако вновь следует признать, что такие производные могут сами по себе рассматриваться как независимые особенности настоящего изобретения и такие молекулы в описании настоящего изобретения включают в обозначения пептида для удобства, а не для того, чтобы выразить какую-либо равнозначность между простыми пептидами и такими производными). Не являющиеся ограничительными примеры таких аминокислотных остатков включают, например, остатки 2 аминоадипиновой кислоты, 3-аминоадипиновой кислоты, -аланина, -аминопропионовой кислоты, 2 аминомасляной кислоты, 4-аминомасляной кислоты, 6-аминокапроновой кислоты, 2-аминогептановой кислоты, 2-аминоизомасляной кислоты, 3-аминоизомасляной кислоты, 2-аминопимелиновой кислоты,2,4-диаминомасляной кислоты, десмозина, 2,2'-диаминопимелиновой кислоты, 2,3-диаминопропионовой кислоты, N-этилглицина, N-этиласпарагина, гидроксилизина, аллогидроксилизина, 3-гидроксипролина,4-гидроксипролина, изодесмозина, аллоизолейцина, N-метилглицина, N-метилизолейцина, 6-Nметиллизина, N-метилвалина, норвалина, норлейцина, орнитина и статингалогенированных аминокислот. Время полужизни in vivo антител можно, например, улучшить модификацией спасенного эпитопа рецептора константной области Ig или Ig-подобной константной области так, что молекула не содержит интактного домена CH2 или интактного Fc-участка Ig, ср. US 6121022 и US 6194551. Время полужизни invivo антител можно повысить, осуществляя мутации Fc-участка, например заменяя треонином лейцин в позиции, соответствующей позиции 252 интактной молекулы антитела, треонином серин в позиции, соответствующей позиции 254 интактной молекулы антитела, или треонином фенилаланин в позиции, соответствующей позиции 256 интактной молекулы антитела, ср. US 6277375. Кроме того, антитела, в частности Fab или другие фрагменты, для повышения времени полужизни можно пегилировать. Это можно осуществить реакциями пегилирования, известными в технике, как описано, например, в Focus on Growth Factors, 3, 4-10 (1992); EP 154316 и EP 401384.-9 016609 Также можно ввести произвольно мутации по всей или части кодирующей последовательности антитела, например, насыщающим мутагенезом, и полученные модифицированные антитела можно скринировать на связывающую активность и/или другие свойства. Термин "производные антитела" относится к любой модифицированной форме антитела, например конъюгату антитела и другого вещества или антитела. Термин "антигенсвязывающая часть" или "антигенсвязывающий домен" антитела, такого как моновалентное антитело, используемый в данном описании, относится к одному или нескольким фрагментам антитела, которые сохраняют способность специфически связываться с антигеном. Показано, что антигенсвязывающая функция антитела может осуществляться фрагментами полноразмерного антитела. Примеры связывающих фрагментов, охваченных термином "антигенсвязывающая часть" антитела,включают:(i) фрагмент Fab или Fab'-моновалентный фрагмент, состоящий из областей VL, VH, CL и CH;(ii) фрагмент F(ab')2 - двухвалентный фрагмент, содержащий два фрагмента Fab', соединенных дисульфидным мостиком в шарнирной области;(vi) изолированный гипервариабельный участок (CDR) и(vi) сочетание двух или большего числа изолированных CDR, которые могут быть, необязательно,соединены синтетическим линкером. Кроме того, хотя две области фрагмента Fv VL и VH кодируются отдельными генами, их можно соединить с использованием методов рекомбинантных ДНК синтетическим линкером, который позволит получить их в виде единой белковой цепи, в которой области VL и VH образуют пару с образованием одновалентных молекул (известных как одноцепочечные антитела или одноцепочечный Fv (scFv), см., например, Bird et al., Science, 242, 423-426 (1988) и Huston et al., PNAS USA, 85, 5879-5883 (1988. Такие одноцепочечные антитела охватываются термином "антитело", если иное не отмечено или четко не указано в контексте. Другим примером являются слитые белки иммуноглобулинов с антигенсвязывающим доменом, содержащие полипептид с антигенсвязывающим доменом, который слит с:(i) полипептидом шарнирной области иммуноглобулина,(ii) константной областью CH2 тяжелой цепи иммуноглобулина, слитой с шарнирной областью, иCH2. Полипептид с антигенсвязывающим доменом может представлять собой вариабельную область тяжелой цепи или вариабельную область легкой цепи, scFv или любой другой полипептид, способный специфически связываться с антигеном. Такие слитые белки иммуноглобулинов с антигенсвязывающим доменом также раскрываются в US 2003/0118592 и US 2003/0133939. Такие фрагменты антител получают с использованием обычных методов, известных специалистам в данной области техники, и фрагменты скринируют для использования таким же образом, как интактные антитела. Термин "половинная молекула антитела" используется в данном описании для обозначения молекулы антитела, описанной выше, но содержащей не более одной легкой цепи и не более одной тяжелой цепи, которая существует в водных растворах в виде гетеродимера указанной одной легкой и одной тяжелой цепи. Такое антитело является по характеру моновалентным, так как присутствует только одна антигенсвязывающая часть. Термин "консервативные модификации последовательности" в контексте нуклеотидных и аминокислотных последовательностей обозначает модификации нуклеотида(ов) и аминокислоты(аминокислот) соответственно, которые существенно не влияют на или не изменяют связывающие свойства антитела,кодированного нуклеотидной последовательностью или содержащего аминокислотную последовательность. Такие консервативные модификации последовательности включают замены, добавления и делеции нуклеотидов и аминокислот. Модификации можно ввести в последовательности стандартными методами, известными в технике, такими как сайт-направленный мутагенез и GWH-модифицированный мутагенез. Консервативные аминокислотные замены включают замены, при которых аминокислотный остаток заменяют аминокислотным остатком со схожей боковой цепью. Семейства аминокислотных остатков со схожими боковыми цепями определены в технике. Такие семейства включают аминокислоты с боковыми цепями основного характера (например, лизин, аргинин, гистидин), боковыми цепями кислотного характера (например, аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота), незаряженными полярными боковыми цепями (например, глицин, аспарагин, глутамин, серин, треонин, тирозин, цистеин, триптофан), неполярными боковыми цепями (например, аланин, валин, лейцин, изолейцин, пролин, фенилаланин, метионин), бета-разветвленными боковыми цепями (например, треонин, валин, изолейцин) и ароматическими боковыми цепями (например, тирозин, фенилаланин, триптофан, гистидин). Таким образом,заранее установленный несущественный аминокислотный остаток в человеческом антителе, специфиче- 10016609 ском для определенного антигена, можно заменить другим аминокислотным остатком из семейства с такими же боковыми цепями. Как используется в данном описании, человеческое антитело "получают из" определенной последовательности зародышевой линии, если антитело получают из системы с использованием последовательностей человеческого иммуноглобулина, например иммунизацией трансгенной мыши, несущей гены человеческого иммуноглобулина, или скринингом библиотеки генов человеческого иммуноглобулина, и в котором кодируемая геном вариабельная область (не исключая CDR3 тяжелой или легкой цепи) выбранного человеческого антитела по меньшей мере на 90%, предпочтительнее по меньшей мере на 95%,даже предпочтительнее по меньшей мере на 96, 97, 98 или 99% идентична в нуклеотидной последовательности гену иммуноглобулина зародышевой линии. Типично, человеческое антитело, полученное из определенной последовательности человеческой зародышевой линии, будет показывать не более 10 различий в аминокислотах, предпочтительнее не более 5 или даже предпочтительнее не более 4, 3, 2 или 1 различий в аминокислотах в сравнении с аминокислотной последовательностью, кодированной геном иммуноглобулина зародышевой линии. Термин "эпитоп" обозначает белковую детерминанту, способную специфически связываться с антителом. Обычно эпитопы состоят из химически активных поверхностных группировок молекул, таких как аминокислоты или боковые цепи сахаров, и, как правило, имеют специфические свойства трехмерной структуры, а также специфические зарядовые характеристики. Конформационные и неконформационные эпитопы различаются в том, что связывание с первым, но не с последним, отсутствует в присутствии денатурирующих растворителей. Термин "эпитоп прерывистого типа", используемый в данном описании, обозначает конформационный эпитоп на антигене белка, который образуется по меньшей мере из двух отдельных областей в первичной последовательности белка. Для нуклеотидных и аминокислотных последовательностей термин "гомология" указывает на степень идентичности между двумя нуклеотидными или аминокислотными последовательностями, при оптимальном выравнивании и сравнении с соответствующими вставками или делениями. С другой стороны, существует значительная гомология, когда сегменты ДНК будут гибридизировать в выбранных условиях гибридизации с комплементом цепи. Процент идентичности между двумя последовательностями является функцией числа идентичных позиций, общих для последовательностей (т.е. % гомологии =идентичных позиций/общеепозиций 100), принимая в расчет число брешей и длину каждой бреши, которые следует ввести для оптимального выравнивания двух последовательностей. Сравнение последовательностей и определение процента идентичности между двумя последовательностями можно осуществить с использованием математического алгоритма, например, описанного далее. Процент идентичности между двумя нуклеотидными последовательностями можно определить с использованием программы GAP в пакете программного обеспечения GCG (доступного наhttp://www.gcg.com) с использованием NWSgapdna. Матрикс CMP, штраф за брешь 40, 50, 60, 70 или 80,и штраф за удлиненную брешь 1, 2, 3, 4, 5 или 6. Процент идентичности между двумя нуклеотидными или аминокислотными последовательностями также можно определить с использованием алгоритма Е.Meyers and W. Miller (Comput. Appl. Biosci., 4, 11-17 (1988, включенного в программу ALGN (версия 2.0) с использованием таблицы массы остатков PAM120, штрафа за удлиненную брешь 12 и штрафа за брешь 4. Кроме того, процент идентичности между двумя аминокислотными последовательностями можно определить с использованием алгоритма Needleman and Wunsch (J. Mol. Biol., 48, 444-453 (1970,который включен в программу GAP в пакете программного обеспечения GCG (доступного наhttp://www.gcg.com), с использованием или матрицы Biossum 62, или матрицы PAM250, и штрафа за брешь 16, 14, 12, 10, 8, 6 или 4, и штрафа за удлиненную брешь 1, 2, 3, 4, 5 или 6. Термин "клетка-хозяин" (или "рекомбинантная клетка-хозяин"), используемый в данном описании,предназначен для обозначения клетки, в которую введен рекомбинантный экспрессирующий вектор. Следует иметь в виду, что такие термины предназначены не только для обозначения определенной клетки субъекта, но также для потомства такой клетки. Поскольку некоторые модификации могут иметь место в последующих образованиях из-за или мутации, или влияния окружающей среды, такое потомство,в действительности, не может быть идентичным родительской клетке, но все еще входит в объем термина "клетка-хозяин", используемого в данном описании. Рекомбинантные клетки-хозяева включают, например, трансфектомы, такие как трансфицированные клетки CHO, клетки NS/0 и лимфоцитарные клетки. Термин "клетка-хозяин" в форме единственного числа также может обозначать культуру определенного вида клетки-хозяина. Термин "человеческое антитело", используемый в данном описании, предназначен для включения антител, имеющих вариабельные и константные области, образованные от последовательностей человеческого иммуноглобулина зародышевой линии. Человеческие антитела по изобретению могут включать аминокислотные остатки, некодированные последовательностями человеческого иммуноглобулина зародышевой линии (например, мутации, введенные произвольным или сайт-специфическим мутагенезом invitro или соматической мутацией in vivo). Однако термин "человеческое антитело", используемый в дан- 11016609 ном описании, не предназначен для включения антител, в которых последовательности CDR1 или CDR2,образованные от последовательности зародышевой линии другого вида млекопитающего, такого как мышь, или участок CDR3, образованный от антитела другого вида, такого как мышь, привиты на человеческие каркасные последовательности. Термин "KD" (М), используемый в данном описании, относится к константе равновесия диссоциации определенного взаимодействия антитело-антиген. Термины "моноклональное антитело" или "композиция моноклональных антител", используемые в данном описании, относятся к препарату молекул антител одного молекулярного состава. Композиция моноклональных антител проявляет одну специфичность связывания и аффинность в отношении определенного эпитопа. Соответственно термин "человеческое моноклональное антитело" относится к антителам, проявляющим одну специфичность связывания, которые имеют вариабельные и константные области, образованные от последовательностей человеческого иммуноглобулина зародышевой линии. Термин "моноклональное антитело" в контексте настоящего изобретения означает, что молекула антитела способна связывать одну молекулу антигена и, таким образом, не способна сшивать антиген. Термины "нуклеиновая кислота", "нуклеотидная конструкция" или "молекула нуклеиновой кислоты", используемые в данном описании, предназначены для включения молекул ДНК и молекул РНК. Молекула нуклеиновой кислоты может быть одноцепочечной или двухцепочечной. Термины "изолированная нуклеиновая кислота", "изолированная нуклеотидная конструкция" или"изолированная молекула нуклеиновой кислоты", используемые в данном описании в отношении нуклеиновых кислот, кодирующих антитела или их фрагменты, предназначены для обозначения молекулы нуклеиновой кислоты, в которой нуклеотидные последовательности, кодирующие интактное антитело или их фрагменты, свободны от других нуклеотидных последовательностей. Нуклеиновая кислота может являться изолированной или представленной как по существу чистой, когда очищена от других клеточных компонентов или других загрязнений, например других клеточных нуклеиновых кислот или белков,стандартными методами, включая обработку щелочью/SDS, бэндинг с CsCl, колоночную хроматографию, электрофорез в агарозном геле и другие методы, хорошо известные в технике, см. F. Ausubel et al.,ed., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, New York (1987). Нуклеиновая кислота является "функционально связанной", когда размещена в функциональном соотношении с последовательностью другой нуклеиновой кислоты. Например, промотор или энхансер функционально связаны с кодирующей последовательностью, если он влияет на транскрипцию последовательности. В случае последовательностей-переключателей "функционально связанные" означает, что последовательности способны влиять на рекомбинацию переключения. Когда делается ссылка на "физиологическое условие", это обозначает условие, которое существуетin vivo в организме, или условие in vivo, которое создается полностью или частично имитированием условия, указанного in vivo, например водный раствор с осмотическим показателем, эквивалентным крови. Термин "рекомбинантное человеческое антитело", используемый в данном описании, включает все человеческие антитела, которые получены, экспрессированы, созданы или выделены рекомбинантными способами, такие как, например, (a) антитела, выделенные из организма животного (например, мыши),которое является трансгенным или трансхромосомным для генов человеческого иммуноглобулина или полученных из них гибридом, (b) антитела, выделенные из клетки-хозяина, трансформированной для экспрессии антител, например из трансфектом, (c) антитела, выделенные из рекомбинантных комбинаторных библиотек человеческих антител, и (d) антитела, полученные, экспрессированные, созданные или выделенные любыми другими способами, которые включают сплайсинг последовательностей генов человеческого иммуноглобулина с другими ДНК-последовательностями. Такие рекомбинантные человеческие антитела имеют вариабельные и константные области, образованные от последовательностей человеческого иммуноглобулина зародышевой линии. Такие рекомбинантные человеческие антитела могут быть подвержены мутагенезу in vitro (или, когда используют животное, трасгенное для последовательностей человеческого Ig, соматическому мутагенезу in vivo), и, таким образом, аминокислотные последовательности областей VH и VL рекомбинантных антител являются последовательностями, которые, хотя и образованы от и родственны с человеческими VH- и VL-последовательностями зародышевой линии, не могут обычно существовать в репертуаре человеческих антител зародышевой линии in vivo. Используемый в данном описании термин "специфическое связывание" относится к связыванию антитела или его антигенсвязывающего фрагмента с предварительно установленным антигеном. Типично антитело связывается с аффинностью, соответствующей KD примерно 10-7 М или меньшей, например 10-8 М или меньшей, например 10-9 М или меньшей, примерно 10-10 М или меньшей или примерно 10-11 М или даже меньшей, при измерении, например, с использованием сульфонплазмонного резонанса наBIAcore, или как кажущейся аффинности на основе величин IC50 в FACS или ELISA, и связывается с предварительно установленным антигеном с аффинностью, соответствующей KD, которая по меньшей мере в десять раз ниже, например по меньшей мере в 100 раз ниже, например по меньшей мере в 1000 раз ниже, например по меньшей мере в 10000 раз ниже, например по меньшей мере в 100000 раз ниже,чем его аффинность для связывания с неспецифическим антигеном (например, BSA, казеином), иным,чем предварительно установленный антиген или близкородственный антиген. Величина, на которую аф- 12016609 финность ниже, зависит от KD антигенсвязывающего пептида, так что когда KD антигенсвязывающего пептида очень низкая (т.е. антигенсвязывающий пептид высокоспецифичный), тогда величина, на которую аффинность к антигену ниже, чем аффинность к неспецифичному антигену, может составлять по меньшей мере 10000 раз. Используемый в данном описании термин "субъект" включает любого человека или животное, не являющееся человеком. Термин "животное, не являющееся человеком" включает всех позвоночных, например млекопитающих и не относящихся к млекопитающим, таких как приматы, овцы, козы, собаки,кошки, мыши, крысы, кролики, куры, земноводные, пресмыкающиеся и т.д. Когда делается ссылка на "терапевтически" эффективную дозировку или "терапевтически эффективное количество", это следует использовать для обозначения дозировки или количества, эффективных для достижения желательного лечебного результата за некоторый период времени. Терапевтически эффективная дозировка моновалентных антител по изобретению, конечно, будет изменяться в связи с мишенью антител и также может изменяться в соответствии с факторами, такими как болезненное состояние, возраст, пол и масса тела индивидуума, и способности моновалентных антител добиваться нужной реакции у индивидуума. Терапевтически эффективная дозировка или количество также могут являться дозировкой или количеством, при которых терапевтически благоприятное действие перевешивает любое токсичное или вредное действие моновалентных антител. Термин "трансгенное животное, не являющееся человеком" относится к животному, не являющемуся человеком, с геномом, содержащим один или несколько трансгенов или трансхромосом тяжелой и/или легкой цепи человека (или интегрированных, или неинтегрированных в природную геномную ДНК животного), и которое способно экспрессировать человеческие антитела. Например, трансгенная мышь может иметь трансген легкой цепи человека и/или трансген тяжелой цепи человека или трансхромосому тяжелой цепи человека, так что мышь продуцирует человеческие антитела, когда иммунизирована антигеном и/или клетками, экспрессирующими антиген. Трансген тяжелой цепи человека может быть интегрирован в хромосомную ДНК мыши, как в случае трансгенных мышей, например HuMAb, таких как мыши HCo7 или HCo12, или трансген тяжелой цепи человека может поддерживаться экстрахромосомно,как в случае трансхромосомных мышей KM, как описано в WO 02/43478. Такие трансгенные и трансхромосомные мыши способны продуцировать многие классы и изотипы моновалентных антител к данному антигену (например, IgM, IgG, IgA и/или IgE) за счет претерпевания рекомбинации V-D-J и переключения изотипов. Термин "трансфектома", используемый в данном описании, включает рекомбинантные эукариотические клетки-хозяева, экспрессирующие антитела, такие как клетки яичника китайского хомячка (CHO),клетки NS/0, клетки HEK293, клетки растений или грибов, в том числе дрожжевые клетки. Термины "лечение", "лечащий" или "лечить" обозначают облегчение, ослабление или устранение(вылечивание) симптомов болезненных состояний. Термин "валентность антитела" обозначает максимальное число антигенных детерминант, с которыми антитело может взаимодействовать. Например, антитела IgG содержат два участка Fab и могут связывать две молекулы антигена или два идентичных сайта на одной и той же частице и, таким образом,имеют валентность два. Термин "вектор", используемый в данном описании, предназначен для обозначения молекулы нуклеиновой кислоты, способной переносить и вызывать репликацию другой нуклеиновой кислоты, с которой она связана. Одним типом вектора является "плазмида", которая относится к кольцевой петле двухцепочечной ДНК, в которую могут быть лигированы сегменты другой ДНК. Другим типом вектора является вирусный вектор, в котором дополнительные сегменты ДНК или РНК могут быть лигированы в вирусный геном. Некоторые векторы способны к автономной репликации в клетке-хозяине, в которую они внедрены (например, бактериальные векторы с бактериальным происхождением репликации и эписомные векторы млекопитающих). Другие векторы (например, неэписомные векторы млекопитающих) могут быть интегрированы в геном клетки-хозяина после введения в клетку-хозяина и посредством этого реплицируются вместе с геномом хозяина. Более того, некоторые векторы способны управлять экспрессией генов, с которыми они оперативно связаны. Такие векторы в данном описании относят к "рекомбинантным экспрессирующим векторам" (или проще "экспрессирующим векторам"). Вообще, экспрессирующие векторы для применения в методах рекомбинантных ДНК часто находятся в форме плазмид. В настоящем описании термины "плазмида" и "вектор" могут использоваться как взаимозаменяемые, так как плазмида является наиболее часто используемой формой вектора. Однако предполагается, что изобретение включает также другие формы экспрессирующих векторов, например вирусные векторы (например, репликативно дефектные ретровирусы, аденовирусы и аденоассоциированные вирусы), которые выполняют эквивалентные функции. Ряд ссылок в данном описании сделан на водный раствор или физиологическое условие. Когда упоминается "водный раствор", это обозначает водный раствор любого химического вещества в воде,например раствор соли, такой как забуференный фосфатом физиологический раствор (PBS). Водный раствор может быть получен для определенной цели и содержать ряд различных химических веществ или он может представлять собой природную жидкость организма, например кровь.- 13016609 Существует пять различных классов иммуноглобулинов, т.е. IgM, IgD, IgG, IgA и IgE, и указанные классы можно различить по их C-областям. В пределах класса антител IgG существует несколько подклассов, т.е. в человеческом IgG подклассы IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4 (Jefferis R., 1990, Molecular structure of human IgG subclasses. In The humanIgG subclasses. F. Shakib, ed., Pergamon Press, Oxford, p. 15). Каждая тяжелая цепь IgG состоит из структурно родственных пептидных последовательностей (т.е. доменов вариабельной и константной областей), которые кодированы различными сегментами гена или экзонами. Шарнирная область, соединяющая домены CH1 и CH2, кодируется отдельным экзоном. Тяжелые цепи каждого из четырех подклассовIgG можно экспрессировать в сочетании с или каппа, или лямбда легкими цепями и получить, по существу, симметричные молекулы, состоящие из двух идентичных тяжелых цепей и двух идентичных легких цепей каппа или лямбда. Сравнение в пределах тяжелой цепи определяет участки гомологии CH1, CH2 иCH3. Сравнение между схожими по гомологии участками каждого из четырех подклассов показывает идентичность последовательностей 95% (Jefferis R., 1990, F. Shakib, ed., Pergamon Press, Oxford, p. 15). Последовательность между доменами CH1 и CH2 называют шарнирной областью, поскольку она допускает гибкость молекулы. Домены CH3 являются парными, и для молекул IgG достаточно нековалентных взаимодействий для поддержания структурной идентичности после восстановления дисульфидных мостиков вне тяжелой цепи в умеренных условиях. Объединение доменов CH3 является компактным и схожим с объединением в Fab с почти точной диадой между двумя доменами (Saphire et al., 2002, J. Mol.Biol., 319: 9). Это противоположно доменам СН 2, которые тесно не ассоциируют, и их контакт опосредуется, главным образом, двумя углеводными цепями, присоединенными к остаткам Asn297 (Saphire et al.,2002, J. Mol. Biol., 319:9). Таким образом, характеристическая структура IgG, в которой соединены два гетеродимера из тяжелой и легкой цепей, сохраняется за счет дисульфидных мостиков между тяжелыми цепями в шарнирной области и нековалентных взаимодействий доменов CH3. Показано, что взаимодействие участка CH3 в IgG1 является важным. Половинные молекулы Ig, которые имеют димерную конфигурацию, состоящую только из одной легкой цепи и только одной тяжелой цепи, описаны как результат редких делеций при человеческой и мышиной плазмацитоме. Некоторые пациенты, страдающие от экстрамедуллярной плазмацитомы мягкой ткани, макроглобулинемии Вальденстрма, плазмацитарного лейкоза и множественной миеломы, выделяют половинные молекулы IgG в свою урину. Также обнаружено, что половинные молекулы присутствуют в их сыворотке. Исследования биохимической природы таких половинных молекул показало, что они состоят из молекул IgG1, в которых участки CH1 тяжелой цепи, шарнира и CH2 оказываются нормальными, в то время как в участке CH3 обнаружены делеции (уже описано в заявке на патент, с. 3). Авторы в данной заявке показывают, что удаление шарнирной области в IgG4 приводит к образованию моновалентных антител, в которых связь между двумя гетеродимерами тяжелой и легкой цепей утрачена или ослаблена. Следовательно, изменения в дисульфидных мостиках шарнирной области других подклассов IgG, одни или в сочетании с мутациями во взаимодействиях домена CH3, также могут привести к образованию моновалентных антител в случае таких других подклассов. Специалисты в данной области техники могут применить свои знания структуры подклассов Ig, как это сделано в данной заявке,для отбора и модификации выбранных аминокислот для предотвращения взаимодействий легкой цепи. Соответственно в одном воплощении настоящее изобретение относится к моновалентному антителу, содержащему легкую цепь и тяжелую цепь, в котором:a) указанная легкая цепь содержит аминокислотную последовательность вариабельной (VL) области выбранного антигенспецифического антитела и аминокислотную последовательность константной (CL) области Ig;b) указанная тяжелая цепь содержит аминокислотную последовательность вариабельной (VH) области выбранного антигенспецифического антитела и аминокислотную последовательность константной(CH) области человеческого Ig, где аминокислотная последовательность тяжелой цепи модифицирована таким образом, что ни один из аминокислотных остатков, присутствующих в области, соответствующей шарнирной области, не способен принимать участие в образовании дисульфидных связей с другими пептидами, содержащими идентичную аминокислотную последовательность константной области (CH) человеческого Ig;c) указанная тяжелая или легкая цепь в зависимости от изотипа Ig модифицирована точечной мутацией или делецией для того, чтобы удалить или заменить любые аминокислоты, т.е. цистеины, способные вызывать соединение антитела, или модифицирована в форме точечной мутации или делеции для того, чтобы сделать константную область тяжелой цепи схожей с такой же областью IgG4 в отношении способности образовывать дисульфидные связи или ковалентно соединять молекулу с ее эквивалентом с образованием димера. Аминокислотная последовательность легкой цепи моновалентного антитела по изобретению содержит вариабельную (VL) область выбранного антигенспецифического антитела и аминокислотную последовательность константной (CL) области иммуноглобулина. Согласно изобретению аминокислотная последовательность области VL моновалентного антитела- 14016609 не вносит вклад в молекулярные свойства указанной молекулы антитела, представляющей интерес по изобретению, в частности неспособность моновалентного антитела образовывать гетеротетрамеры("нормальные" антитела), и поэтому изобретение не ограничивается какими-либо определенными аминокислотными последовательностями области VL. Аминокислотная последовательность области VL может быть образована от аминокислотной последовательности любого антигенспецифического антитела,полученного любым из многочисленных способов, известных специалистам в данной области техники. Согласно изобретению аминокислотная последовательность области VH моновалентного антитела не вносит вклад в молекулярные свойства указанной молекулы антитела, представляющей интерес по изобретению, в частности неспособность моновалентного антитела образовывать гетеротетрамеры("нормальные" антитела), и поэтому изобретение не ограничивается какими-либо определенными аминокислотными последовательностями области VH. Аминокислотная последовательность области VH может быть образована от аминокислотной последовательности любого антигенспецифического антитела,полученного любым из многочисленных способов, известных специалистам в данной области техники. В одном воплощении моновалентное антитело по изобретению не связывается с синтетическим антигеном (Tyr, Glu), Ala, Lys (Pincus et al., 1985, Molecular Immunol., vol. 22, 4; p. 455-461). В другом воплощении антитело по изобретению является человеческим антителом. В другом воплощении антитело по изобретению является антителом на основе человеческого антитела. В одном воплощении настоящее изобретение относится к моновалентному антителу, содержащему легкую цепь и тяжелую цепь, в котором:a) указанная легкая цепь содержит аминокислотную последовательность вариабельной (VL) области выбранного антигенспецифического антитела и аминокислотную последовательность константной (CL) области Ig;b) указанная тяжелая цепь содержит аминокислотную последовательность вариабельной (VH) области указанного выбранного антигенспецифического антитела и аминокислотную последовательность константной (CH) области человеческого IgG4, где аминокислотная последовательность тяжелой цепи модифицирована таким образом, что ни один из аминокислотных остатков, присутствующих в области,соответствующей шарнирной области, не способен принимать участие в образовании дисульфидных связей с другими пептидами, содержащими идентичную аминокислотную последовательность константной области (CH) человеческого IgG4. Аминокислотная последовательность легкой цепи моновалентного антитела по изобретению содержит вариабельную (VL) область выбранного антигенспецифического антитела и аминокислотную последовательность константной (CL) области иммуноглобулина. Согласно изобретению аминокислотная последовательность области VL моновалентного антитела не вносит вклад в молекулярные свойства указанной молекулы антитела, представляющей интерес по изобретению, в частности неспособность моновалентного антитела образовывать гетеротетрамеры("нормальные" антитела), и поэтому изобретение не ограничивается какими-либо определенными аминокислотными последовательностями области VL. Аминокислотная последовательность области VL может быть образована от аминокислотной последовательности любого антигенспецифического антитела,полученного любым из многочисленных способов, известных специалистам в данной области техники. Согласно изобретению аминокислотная последовательность области VH моновалентного антитела не вносит вклад в молекулярные свойства указанной молекулы антитела, представляющей интерес по изобретению, в частности неспособность моновалентного антитела образовывать гетеротетрамеры("нормальные" антитела), и поэтому изобретение не ограничивается какими-либо определенными аминокислотными последовательностями области VH. Аминокислотная последовательность области VH может быть образована от аминокислотной последовательности любого антигенспецифического антитела,полученного любым из многочисленных способов, известных специалистам в данной области техники. Изобретение относится к примеру 1) моновалентного антитела, содержащего область VH, содержащую аминокислотную последовательность области VH HuMab-7D8, идентифицированную как SEQ IDNO: 6, и аминокислотную последовательность, кодирующую бесшарнирную CH IgG4, идентифицированную как SEQ ID NO: 16, где указанные последовательности функционально связаны вместе, и 2) моновалентного антитела, содержащего область VH, содержащую аминокислотную последовательность областиVH мышиного антитела против Betv-1, идентифицированную как SEQ ID NO: 8, и аминокислотную последовательность, кодирующую бесшарнирную CH IgG4, идентифицированную как SEQ ID NO: 16, где указанные последовательности функционально связаны вместе. В одном воплощении области VH и VL молекулы антитела по изобретению образованы от одного и того же антигенспецифического антитела. Согласно изобретению последовательность области CL легкой цепи молекулы антитела может быть образована от последовательности области CL иммуноглобулина. В одном воплощении область CL является константной областью легкой цепи каппа человеческого IgG. В одном воплощении область CL содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2. В одном воплощении область CL является константной областью легкой цепи лямбда человеческого IgG. В одном воплощении область CL содержит- 15016609 аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4. В одном воплощении легкая цепь и тяжелая цепь моновалентного антитела соединены друг с другом через одну или несколько дисульфидных связей. Очевидно, что в случае таких дисульфидных связей ни один из партнеров по связыванию в дисульфидной связи не присутствует в области, соответствующей шарнирной области. В одном воплощении легкая цепь и тяжелая цепь моновалентного антитела соединены друг с другом через амидную связь, например, как видно в случае одноцепочечных Fv. Шарнирная область представляет собой участок антитела, расположенный между участками CH1 иCH2 константной области тяжелой цепи. Протяженность шарнирной области определяется отдельным экзоном, который кодирует шарнирную область. Шарнирная область обычно вовлекается в участие в обеспечении правильной сборки цепей четырех пептидов антитела в традиционную тетрамерную форму через образование дисульфидных связей или мостиков между одним или несколькими цистеиновыми остатками в шарнирной области одной тяжелой цепи и одним или несколькими цистеиновыми остатками в шарнирной области другой тяжелой цепи. Модификация шарнирной области таким образом, что ни один из аминокислотных остатков в шарнирной области не способен принимать участие в образовании дисульфидных связей, может включать, например, делецию и/или замену цистеиновых остатков, присутствующих в шарнирной области. Участок, соответствующий шарнирной области, для целей данного описания должен быть сконструирован как обозначающий область между участками CH1 и CH2 тяжелой цепи антитела. В контексте настоящего изобретения такая область также может вовсе не содержать аминокислотные остатки, что соответствует делеции шарнирной области, и приводит к тому, что участкиCH1 и CH2 соединяются друг с другом без каких-либо аминокислотных остатков-посредников. Такая область также может содержать только один или несколько аминокислотных остатков, которые не нуждаются в том, чтобы представлять собой аминокислотные остатки, присутствующие в N- или C-конце исходной шарнирной области. Дисульфидные связи являются хорошо известной особенностью некоторых белков, например антител, когда один цистеиновый остаток образует дисульфидную связь с другим цистеиновым остатком в той же цепи (внутрицепные дисульфидные связи) или других цепях (межцепные дисульфидные связи) белка. В данном белке может иметься несколько таких дисульфидных связей. В случае антител образование дисульфидных связей как внутрицепных, так и межцепных является неотъемлемой частью правильной сборки полного зрелого антитела дикого типа, и дисульфидные связи обычно, по меньшей мере,частично ответственны за высокоупорядоченный и регулярный вид антител, а также за стабильность антитела. В моновалентных антителах по изобретению ни один из аминокислотных остатков в шарнирной области не способен принимать участие в образовании таких дисульфидных связей. Модификацию аминокислотной последовательности шарнирной области можно осуществить на уровне ДНК с использованием рекомбинантных методов, дающих возможность делеции и/или замены нуклеиновых кислот, что хорошо известно в технике, и как описано также в данном описании и приведены примеры в примерах. Модификацию также можно осуществить с антителом, экспрессированным из немодифицированной нуклеиновой кислоты, например, дериватизацией в шарнирной области аминокислотных остатков,которые способны к образованию дисульфидных связей. Такую дериватизацию цистеиновых остатков путем блокировки их от образования дисульфидных связей с другими цистеиновыми остатками можно осуществить так, как известно в технике. Модификацию также можно осуществить, получая цепи антител синтетически с использованием аминокислотных остатков иных, чем цистеин, например встречающихся в природе аминокислот или аминокислот, невстречающихся в природе, таких как, например, дериватизированные цистеины вместо цистеиновых остатков. Моновалентное антитело IgG4 по настоящему изобретению также может представлять собой вариант IgG4. Такое вариантное антитело представляет собой антитело, которое отличается от антитела IgG4 одним или несколькими изменениями подходящих аминокислотных остатков, т.е. заменами, делециями,вставками или добавлениями концевых последовательностей, например, в константной области и/или вариабельных областях (или в любом одном или нескольких ее CDR), в одном вариантном антителе. Типично желательно, чтобы изменения аминокислотных последовательностей, такие как вариации консервативных замен, существенно не изменяли структурные характеристики исходной последовательности(например, замена аминокислоты не должна приводить к нарушению вторичной структуры, которая характеризует функцию исходной последовательности), но которые могут ассоциироваться с выгодными свойствами, такими как изменение функциональных или фармакокинетических свойств антител, например увеличение времени полужизни, изменение иммуногенности, обеспечение сайта для ковалентного или нековалентного связывания с другой молекулой, уменьшение подверженности протеолизу, уменьшение подверженности окислению или изменение картины гликозилирования. Такие варианты аминокислотной последовательности антитела можно получить так, как описано выше для модификаций в участке, соответствующем шарнирной области. В одном воплощении аминокислотную последовательность тяжелой цепи модифицируют таким об- 16016609 разом, что участок, соответствующий шарнирной области, не включает никаких цистеиновых остатков. В одном воплощении аминокислотную последовательность тяжелой цепи модифицируют таким образом, что по меньшей мере один из аминокислотных остатков участка, соответствующего шарнирной области, включая любые цистеиновые остатки, делетирован и/или заменен на другой аминокислотный остаток. Таким образом, шарнирная область антител по изобретению может быть модифицирована в иных позициях, чем позиции, в которых обычно присутствуют любые цистеиновые остатки, что также описано выше для антител вариантов IgG4 по изобретению. Такие модификации можно осуществить так,как описано выше, или любыми другими способами, известными в технике. В контексте настоящего изобретения цистеиновые остатки участка, соответствующего шарнирной области, модифицируют таким образом, что тяжелая цепь содержит область CH, в которой аминокислотные остатки, соответствующие аминокислотам 106 и 109 последовательности SEQ ID NO: 14, делетированы. SEQ ID NO: 14 показывает аминокислотную последовательность области CH дикого типа человеческого IgG4, а позиции 106 и 109 являются позициями двух цистеиновых остатков. В одном воплощении аминокислотную последовательность тяжелой цепи модифицируют таким образом, что тяжелая цепь содержит область CH, в которой делетированы, по меньшей мере, аминокислотные остатки, соответствующие аминокислотам 106-109 последовательности SEQ ID NO: 14. В одном воплощении аминокислотную последовательность тяжелой цепи модифицируют таким образом, что тяжелая цепь содержит область CH, в которой делетированы, по меньшей мере, аминокислотные остатки, соответствующие аминокислотам 99-110 последовательности SEQ ID NO: 14. В одном воплощении тяжелая цепь содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 16.SEQ ID NO: 16 представляет собой аминокислотную последовательность области CH человеческогоIgG4, полученного экспрессией нуклеиновой кислоты, содержащей последовательность SEQ ID NO: 15,которая представляет собой нуклеотидную последовательность, кодирующую область CH человеческогоIgG4 (SEQ ID NO: 13), с мутациями замены в позициях 714 и 722. Такие замены в донорном сайте сплайсинга нуклеотидной последовательности имеют такое действие, что сплайсинг с участием экзона, кодирующего шарнирную область, не будет осуществляться правильно, причем результатом станет тяжелая цепь без аминокислотных остатков, кодируемых экзоном. В одном воплощении делетируют всю шарнирную область области CH. Это случай, когда в тяжелой цепи не присутствуют аминокислоты, кодированные экзоном, кодирующим область CH. Для IgG4, представленного в SEQ ID NO: 14, это будет соответствовать области CH с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 16. В одном воплощении аминокислотную последовательность тяжелой цепи модифицируют таким образом, что тяжелая цепь содержит область CH, в которой аминокислотные остатки, соответствующие аминокислотам 106 и 109 последовательности SEQ ID NO: 14, заменены на аминокислотные остатки,отличные от цистеина. В одном воплощении аминокислотную последовательность тяжелой цепи модифицируют таким образом, что тяжелая цепь содержит область CH, в которой один из аминокислотных остатков, соответствующих аминокислотам 106 и 109 последовательности SEQ ID NO: 14, заменен на аминокислотный остаток, отличный от цистеина, а другой из аминокислотных остатков, соответствующих аминокислотам 106 и 109 последовательности SEQ ID NO: 14, делетирован. В другом воплощении аминокислотный остаток, который заменен аминокислотным остатком, отличным от цистеина, соответствует аминокислотным остаткам 106, а аминокислотный остаток, который делетирован, соответствует аминокислотным остаткам 109. В еще одном воплощении аминокислотный остаток, который делетирован, соответствует аминокислотным остаткам 106, а аминокислотный остаток, который заменен аминокислотным остатком,отличным от цистеина, соответствует аминокислотным остаткам 109. В одном воплощении моновалентное антитело по изобретению можно получить способом, включающим рекомбинантную экспрессию антитела в клеточной экспрессирующей системе in vitro, как описано в данном описании. В одном воплощении такой способ включает:i) обеспечение нуклеотидной конструкции, кодирующей легкую цепь указанного антитела, причем указанная конструкция содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую область VL выбранного антигенспецифического антитела, и нуклеотидную последовательность, кодирующую константную область CL IgG;ii) обеспечение нуклеотидной конструкции, кодирующей тяжелую цепь указанного антитела, причем указанная конструкция содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую область VH выбранного антигенспецифического антитела, и нуклеотидную последовательность, кодирующую областьCH человеческого IgG4, где нуклеотидная последовательность, кодирующая область CH, модифицирована таким образом, что участок, соответствующий шарнирной области, не содержат каких-либо аминокислотных остатков, способных принимать участие в образовании дисульфидных связей;iii) обеспечение клеточной экспрессирующей системы для получения указанного моновалентного антитела;iv) получение указанного моновалентного антитела, содержащего легкую цепь, кодируемую нук- 17016609 леотидной конструкцией (i), и тяжелую цепь, кодируемую нуклеотидной конструкцией (ii), коэкспрессией нуклеотидных конструкций (i) и (ii) в клетках клеточной экспрессирующей системы (iii). В одном воплощении моновалентные антитела по изобретению имеют концентрацию в плазме свыше 10 мкг/мл в течение более 7 дней, когда введены in vivo в дозе 4 мг на 1 кг, при измерении в фармакокинетическом исследовании на мышах SCID (например, как показано в примере 32). Скорость клиренса моновалентных антител по изобретению можно измерить с применением фармакокинетических методов, как известно в технике. Антитела можно инъецировать человеку или животному, например,внутривенно (также можно использовать другие способы, такие как i.p. или i.m.), после чего берут образцы крови венопункцией в определенные моменты времени, например через 1, 4, 24 ч, 3, 7, 14, 21 и 28 дней после инъекции. Концентрацию антител в сыворотке определяют соответствующим анализом, таким как ELISA. Фармакокинетический анализ осуществляют так, как известно в технике и описано в примере 32. Моновалентные антитела по изобретению могут иметь время пребывания в плазме, которое в 100 раз протяженнее, чем время пребывания в плазме, например фрагментов Fab, которые часто используют в качестве моновалентных антител. В одном воплощении моновалентные антитела по изобретению имеют клиренс из плазмы, который в более чем в 10 раз медленнее, чем клиренс из плазмы фрагментов F(ab')2, которые имеют сравнимый молекулярный размер. Это может указывать на способность антител по изобретению связываться с FcRn.FcRn является рецептором класса I главного комплекса гистосовместимости и играет некую роль в пассивной доставке иммуноглобулинов (Ig)G от матери к зародышу и в регуляции сывороточных уровнейIgG, защищая IgG от внутриклеточного разрушения (Ghetie V. et al., Annu. Rev. Immunol., 18, 739-66(2000. В одном воплощении фрагмент F(ab')2 направляют на тот же антиген, что и моновалентное антитело по изобретению. В одном воплощении фрагмент F(ab')2 направляют на тот же эпитоп, что и моновалентное антитело по изобретению. В одном воплощении область VH и область VL фрагмента F(ab')2 идентичны области VH и области VL моновалентного антитела по изобретению. В одном воплощении моновалентное антитело по изобретению имеет время полужизни по меньшей мере 5 дней, когда введено in vivo. Время полужизни моновалентного антитела по изобретению можно измерить любым способом, известным в технике, например, так как описано выше. В одном воплощении моновалентное антитело по изобретению имеет время полужизни по меньшей мере 5 дней и до 14 дней, когда введено in vivo. В одном воплощении моновалентное антитело по изобретению имеет время полужизни по меньшей мере 5 дней и до 21 дня, когда введено in vivo. В одном воплощении моновалентное антитело по изобретению способно связываться с FcRn. Такое связывание можно определить с применением способов определения связывания, известных в технике,например с использованием анализов ELISA. Связывание моновалентного антитела по изобретению сFcRn можно сравнить, например, со связыванием с FcRn фрагмента F(ab')2, который имеет область VH и область VL, идентичные области VH и области VL моновалентного антитела по изобретению, в том же анализе. В одном воплощении связывание моновалентного антитела по изобретению с FcRn более чем в 10 раз прочнее, чем связывание фрагмента F(ab')2 с FcRn. В одном воплощении моновалентное антитело по изобретению специфически связывает опухолевый антиген. Не ограничиваясь определенными опухолевыми антигенами, примерами таких опухолевых антигенов могут быть cMet и VEGF-R. В одном воплощении моновалентное антитело по изобретению специфически связывается с рецептором клеточной поверхности, который активирован после димеризации рецепторов. Моновалентные антитела, такие как моновалентные антитела по изобретению, часто можно применять для лечения заболеваний или расстройств, при которых активация рецептора нежелательна, так как молекулы антител по изобретению из-за их моновалентного характера неспособны индуцировать такую димеризацию и посредством этого активацию. Не ограничиваясь определенными рецепторами, примерами таких рецепторов могут быть erb-B1, erb-B2, erb-B3, erb-B4 и представители эфринов и эфриновых рецепторов, такие как эфрин-A1-эфрин-A6, ephA1-A8, эфрин-B1-B3 и ephB1-B6. В одном воплощении моновалентное антитело по изобретению, когда связывается с молекулоймишенью, ингибирует мультимеризацию молекулы-мишени (такую как димеризация). Вновь моновалентные антитела, такие как моновалентные антитела по изобретению, часто можно применять для лечения заболеваний или расстройств, при которых нежелательна мультимеризация мишени-антигена, так как молекулы антител по изобретению из-за их моновалентного характера неспособны индуцировать такую мультимеризацию. В случае растворимых антигенов мультимеризация может давать нежелательные иммунные комплексы. Не ограничиваясь определенными мишенями, примерами таких мишеней могут быть Toll-подобные рецепторы, такие как TLR3 и TLR9, или ангиопоэтин-1 или ангиопоэтин-2 или члены семейства рецепторов TNF, такие как CD30, CD40 и CD95. В одном воплощении моновалентное антитело по изобретению является ингибитором TNF-альфа. В одном воплощении моновалентные антитела по изобретению являются моновалентной формой адалимумаба, этанерцепта или инфликсимаба. В одном воплощении моновалентное антитело по изобретению неспособно связываться с эффекто- 18016609 ром. Выражение "не способно связываться с эффектором" или "неспособность к связыванию с эффектором" в данном контексте означает, что моновалентное антитело IgG4 по изобретению не способно связываться с компонентом C1q первого компонента комплемента (C1) и поэтому не способно активировать классический путь комплементопосредованной цитотоксичности. Кроме того, моновалентные антитела по изобретению не способны взаимодействовать с Fc-рецепторами и поэтому не способны запускать эффекторные функции, опосредуемые Fc-рецепторами, такие как фагоцитоз, активация клеток, индукция высвобождения цитокинов. В одном воплощении моновалентные антитела по изобретению получают с использованием технологии рекомбинантных ДНК. Антитела можно получить с использованием рекомбинантных эукариотических клеток-хозяев, таких как клетки яичника китайского хомячка (CHO), клетки NS/0, клеткиHEK293, клетки насекомых, клетки растений или грибов, включая дрожжевые клетки. Как устойчивые,так и транзиентные системы можно использовать для такой цели. Трансфекцию можно осуществить с использованием плазмидных экспрессирующих векторов рядом установленных способов, таких как электропорация, липофекция или нуклеофекция. С другой стороны, можно использовать заражение для экспрессии белков, кодированных рекомбинантными вирусами, такими как аденовирусы, вакцины или бакуловирусы. Другим способом может являться использование трансгенных животных для продуцирования антител. Последовательность ДНК, кодирующую антитело, можно получить синтетически известными стандартными способами, например фосфоамидиновым способом, описанным в Beacauge et al., TetrahedronLett., 22, 1859-1869 (1981), или способом, описанным в Matthes et al., EMBO J., 3, 801-805 (1984). Согласно фосфоамидиновому способу олигонуклеотиды синтезируют, например, в автоматическом синтезаторе ДНК, очищают, отжигают, лигируют и клонируют в подходящих векторах. Кодирующая ДНК-последовательность также может быть по происхождению геномной или от кДНК, например, полученной через получение геномной библиотеки или библиотеки кДНК и скрининг последовательностей кДНК, кодирующих все антитело или его часть, путем гибридизации с использованием синтетических олигонуклеотидных зондов согласно стандартным методам (ср. Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor, 1089). Последовательность ДНК также можно получить полимеразной цепной реакцией с использованием специфических праймеров, например,так, как описано в US 4683202 или в Saiki et al., Science, 239, 487-491 (1988). Затем ДНК-последовательность можно встроить в рекомбинантный экспрессирующий вектор, который можно традиционно подвергнуть процедурам метода рекомбинантных ДНК. Выбор вектора часто будет зависеть от клетки-хозяина, в которую его вводят. Так, вектор может представлять собой автономно реплицирующий вектор, т.е. вектор, который существует как внехромосомный элемент, репликация которого не зависит от репликации хромосомы, например плазмиду. С другой стороны, вектор может представлять собой вектор, который, когда внедрен в клетку-хозяина, интегрирует в геном клеткихозяина и реплицирует вместе с хромосомой(ами), в которую(ые) он интегрирован. В векторе последовательность ДНК, кодирующая антитело, должна быть функционально соединена с подходящей промоторной последовательностью. Промотор может представлять собой последовательность любой ДНК, которая показывает транскрипционную активность в выбранной клетке-хозяине, и может происходить от генов, кодирующих белки или гомологичные или гетерологичные клетке-хозяину. Примерами подходящих промоторов для управления транскрипцией кодирующей последовательности ДНК в клетках млекопитающих являются промотор CMV, промотор SV40, промотор MT-1 (ген металлотионеина) или главный поздний промотор аденовирус 2. В технике известны другие подходящие промоторы. Подходящим промотором для применения в клетках насекомых является, например, полиэдриновый промотор. Подходящие промоторы для применения в дрожжевых клетках включают промоторы из гликолитических генов дрожжей или генов алкогольдегидрогеназы или промоторы TPI1 или ADH2-4c. Подходящими промоторами для применения в клетках-хозяевах мицелиальных грибов являются, например, промотор ADH3 или промотор tpiA. Кодирующая ДНК-последовательность также может быть соединена с подходящим терминатором,таким как терминатор гормона роста человека или (в случае хозяев грибов) терминаторы TPI1 илиADH3. В технике известны другие подходящие терминаторы. Вектор также может содержать элементы,такие как сигналы полиаденелирования (например, из SV40 или области 5Elb аденовируса), транскрипционные энхансерные последовательности (например, энхансер SV40) и трансляционные энхансерные последовательности (например, последовательности, кодирующие РНК аденовируса VA). В технике известны другие такие сигналы и энхансеры. Рекомбинантный экспрессирующий вектор также может содержать последовательность ДНК, позволяющую вектору реплицировать в данной клетке-хозяине. Примером такой последовательности (когда клеткой-хозяином является клетка млекопитающего) является ориджин SV40 репликации. В технике известны другие ориджины репликации. Вектор также может содержать селектируемый маркер, например ген, продукт которого дополняет дефект в клетке-хозяине, такой как ген, кодирующий дигидрофолат-редуктазу (DHFR), глутамин-синтетазу (GS), или ген, который придает устойчивость к лекарственному средству, например неомицину, гидромицину или метотрексату. В технике известны другие селек- 19016609 тируемые маркеры. Процедуры, используемые для лигирования последовательностей ДНК, кодирующих пептиды или полноразмерные белки, промотор и терминатор соответственно, и встраивания их в подходящие векторы, содержащие информацию, необходимую для репликации, хорошо известны специалистам в данной области техники (ср., например, Sambrook et al., цит. выше). Для того чтобы получить рекомбинантные моновалентные антитела по изобретению, последовательности ДНК, кодирующие различные части полипептидной(ых) цепи(ей) антитела, можно экспрессировать по отдельности в клетке-хозяине или можно слить, получая конструкцию ДНК, кодирующую слитый полипептид, такой как полипептид, содержащий как легкие, так и тяжелые цепи, встроенные в рекомбинантный экспрессирующий вектор, и экспрессировать в клетках-хозяевах. Клетка-хозяин, в которую можно ввести экспрессирующий вектор, может представлять собой любую клетку, способную к экспрессии полноразмерных белков, и может представлять собой, например,эукариотическую клетку, такую как клетки беспозвоночных (насекомых) или клетки позвоночных, например ооциты Xenopus laevis или клетки млекопитающих, такие как клетки насекомых или клетки млекопитающих. Примерами подходящих клеточных линий млекопитающих являются клеточные линии(ECACC 85110503) или CHO (ATCC CCL-61). В технике известны другие подходящие клеточные линии. В одном воплощении экспрессирующая система представляет собой экспрессирующую систему млекопитающего, такую как экспрессирующая система клеток млекопитающего, содержащая различные клональные вариации клеток HEK293. Способы трансфекции клеток млекопитающего и экспрессии последовательностей ДНК, введенных в клетки, описаны, например, в Kaufman et al., J. Mol. Biol., 159, 601-621 (1982); Southern et al., J. Mol.Appl. Genet., 1, 327-341 (1982); Loyter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 422-426 (1982); Wiger et al.,Cell., 14, 725 (1978); Corsaro et al., Somatic Cell Genetics, 7, 603 (1981); Graham et al., Virol., 52, 456 (1973); и Neumann et al., EMBO J., 1, 841-845 (1982). Для того чтобы получить моновалентные антитела по изобретению, клетки-хозяева экспрессирующей системы можно в одном воплощении котрансфицировать двумя экспрессирующими векторами одновременно, где первый вектор из двух указанных экспрессирующих векторов содержит последовательность ДНК, кодирующую тяжелую цепь антитела, и второй вектор из двух указанных экспрессирующих векторов содержит последовательность ДНК, кодирующую легкую цепь антитела. Также две последовательности могут присутствовать в одном и том же экспрессирующем векторе или они могут быть слиты с образованием конструкции ДНК, кодирующей слитый полипептид, такой как полипептид, содержащий как легкую, так и тяжелую цепи. В одном воплощении в качестве клеток-хозяев можно использовать клетки грибов (включая клетки дрожжей). Примеры подходящих клеток дрожжей включают клетки вида Saccharomyces или видаSchizosaccharomyces, в частности штаммов Saccharomyces cerevisiae. Примерами других клеток грибов являются клетки мицеллиальных грибов, например, вида Aspergillus или вида Neurospora, в частности штаммов Aspergillus oryzae или Aspergillus niger. Применение вида Aspergillus для экспрессии белков описано, например, в EP 238023. Среда, используемая для культивирования клеток, может представлять собой любую обычную среду, подходящую для выращивания клеток млекопитающих, такую как содержащая сыворотку или бессывороточная среда, содержащая подходящие добавки, или подходящая среда для выращивания клеток насекомых, дрожжей или грибов. Подходящие среды доступны от коммерческих поставщиков или их можно получить согласно опубликованным рецептам (например, в каталоге Американской коллекции типовых культур). Затем полученные рекомбинантно моновалентные антитела можно извлечь из среды для выращивания обычными процедурами, включающими отделение клеток-хозяев от среды центрифугированием или фильтрацией, осаждение белковых компонентов супернатанта или фильтрата с помощью соли, например сульфата аммония, и очистку различными хроматографическими процедурами, например ВЭЖХ,ионообменной хроматографии, хроматографии на протеине A, хроматографии на протеине G или подобными способами. Настоящее изобретение также относится к способу получения моновалентных антител по изобретению, включающему стадии:(a) культивирования клеток-хозяев, содержащих нуклеиновую кислоту, кодирующую указанные моновалентные антитела; и(b) извлечения моновалентных антител из культуры клеток-хозяев. В одном воплощении указанные клетки-хозяева являются прокариотическими клетками-хозяевами. В одном воплощении клетка-хозяин представляет собой клетку E. coli. В одном воплощении клетки E.coli являются клетками штамма с недостаточной эндогенной протеазной активностью. В одном воплощении указанные клетки-хозяева являются эукариотическими клетками-хозяевами. В одном воплощении клетка-хозяин представляет собой клетку HEK293. В другом воплощении клеткахозяин представляет собой клетку CHO. В одном воплощении моновалентные антитела выделяют из среды для культивирования. В другом- 20016609 воплощении моновалентные антитела выделяют из клеточного лизата. Антитела по настоящему изобретению имеют преимущество длительного времени полужизни, что ведет к более протяженному терапевтическому окну по сравнению с, например, фрагментами FAB тех же антител, которые имеют сравнительно более короткое время полужизни in vivo. Кроме того, в силу длительного времени полужизни и небольшого размера моновалентные антитела по изобретению будут иметь возможность лучшего распределения in vivo, например, за счет способности проникать в солидные опухоли. Это ведет к большей возможности применения моновалентных антител по изобретению, например, при лечении рака, так как антитела по изобретению можно применять или для ингибирования молекул-мишеней, или в качестве механизма мишенеспецифической доставки для других лекарственных средств, которые могут лечить болезнь. Из-за отсутствия активации иммунной системы моновалентными антителами по изобретению такие антитела являются ингибиторами клетки-мишени, но не киллерами клетки-мишени. Это может являться преимуществом при рассмотрении лечения различных заболеваний, когда механизм ингибирования нужен без желания уничтожения клетки. В одном воплощении моновалентные антитела против VEGF используют для лечения AMD (острой дегенерации желтого пятна) и других заболеваний. В одном воплощении используемые моновалентные антитела против VEGF являются моновалентной формой бевацизумаба (авастина). Антитела по настоящему изобретению являются моновалентными, стабильными в физиологических условиях, неспособны к активации комплемента и, таким образом, подходят для применения при лечении расстройств и заболеваний, при которых не является необходимым или выгодным применение поливалентных антител, или когда не является необходимой или выгодной активация комплемента. Моновалентное антитело по изобретению можно представить в водных растворах гетеродимером, состоящим из одной легкой цепи и одной тяжелой цепи. Выражение "устойчивы в физиологических условиях" или "устойчивость в физиологических условиях" в данном контексте означает, что моновалентные антитела сохраняют свои основные структурные и функциональные характеристики неизменными и присутствуют в терапевтически существенной концентрации в течение более одной недели после того, как указанные молекулы введены субъекту in vivo в дозе 1-10 мг на 1 кг. Концентрация в плазме 5 мкг/мл считается существенной для большинства лечебных антител, поскольку антитела могут показывать насыщение связывания с мишенью на таком уровне. Промежуток времени в 7 дней в данном контексте рассматривается как относительно длительный. Как у иммунодефицитных, так и у иммунокомпетентных мышей клиренс бесшарнирного варианта происходит значительно медленнее, чем фрагментов F(ab')2, которые имеют сравнимый молекулярный размер. Это показывает, что Fc-часть оказывает благоприятное действие на время пребывания в плазме и указывает на функциональное взаимодействие с неонатальным Fc-рецептором (FcRn), который защищает захваченный клеткой IgG от внутриклеточного разложения. Скорость клиренса бесшарнирного варианта примерно в 300 раз меньше, чем скорость клиренса фрагментов F(ab')2, что указывает на то, что можно давать дозу в 300 раз меньшую для получения равнозначных во времени концентраций в плазме. Изобретение также относится к иммуноконъюгату моновалентного антитела по изобретению. Настоящее изобретение относится, в частности, к моновалентному антителу по изобретению, конъюгированному с лечебной молекулой, такой как цитотксин, химиотерапевтическое лечебное средство, иммунодепрессант или радиоизотоп. Такие конъюгаты называют "иммуноконъюгатами". Цитотоксин или цитотоксическое средство включают любое средство, которое вредно для клеток (например, убивает клетки). Примеры включают таксол, цитохалазин B, грамицидин D, бромид этидия, эметин, митомицин, этопозид, тенопозид, винкристин, винбластин, колхицин, даунорубицин, дигидроксиантрациндион, митоксантрон, митрамицин, актиномицин D, 1-дегидротестостерон, глюкокортикоиды, прокаин, тетракаин,лидокаин, пропанолол и пирумицин, их аналоги и гомологи. Подходящие химиотерапевтические средства для образования иммуноконъюгатов по изобретению включают, но не ограничиваются перечисленным, антиметаболиты (например, метотрексат, 6 меркаптопутин, 6-тиогуанин, цитарабин, флударабин, 5-флуороурацил, декарбазин, гидроксимочевину,азатиприн, гемцитабин и кладрибин), алкилирующие агенты (например, мехлоретамин, тиоэпу, хрорамбуцил, мелфалан, кармустин (BSNU) и ломустин (CCNU), циклофосфамид, бусульфан, дибромманнит,стрептозотоцин, митомицин C и цисплатин цис-дихлордиаминплатину(II) (DDP, антрациклины (например, даунорубицин (прежде дауномицин) и доксорубицин), антибиотики (например, дактиномицин(например, винкристин, винбластин, доцетксел, паклитаксел и винорелбин). Подходящими радиоизотопами являются, например, иод-131, иттрий-90 или индий-111. Другими примерами лечебных элементов могут являться белок или полипептид, обладающие нужной биологической активностью. Такие белки могут включать, например, ферментативно активный токсин или его активный фрагмент, такой как абрин, рицин A, эндотоксин Pseudomonas или дифтерийный токсин; белок, такой как фактор некроза опухоли или интерферон-, или модификаторы биологических реакций, такие как, например, лимфокины, интерлейкин-1 (IL-1), интерлейкин-2 (IL-2), интерлейкин-6(IL-6), колониестимулирующий фактор макрофагов (GM-CSF), колониестимулирующий фактор гранулоцитов (G-CSF) или другие факторы роста. В одном воплощении лечебной молекулой является доксорубицин, цисплатин, блеомицин, кармустин, хлорамбуцил, циклофосфамид или рицин A. Методы конъюгации такой лечебной молекулы с антителами хорошо известны, см., например,"Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drags In Cancer Therapy", Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld et al. (eds.), p. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985); Hellstrom et al., "Antibodies For DrugPreparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates", Immunol. Rev., 62:119-58 (1982). В одном воплощении моновалентные антитела по изобретению присоединены к линкерукомплексообразователю, например тиуксетану, что дает возможность конъюгировать антитела с радиоизотопом. В одном воплощении настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей моновалентные антитела по настоящему изобретению. Фармацевтическую композицию можно получить с фармацевтически приемлемыми носителями или разбавителями, а также любыми другими известными адъювантами и эксципиентами согласно обычным методам, таким как раскрыты в Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19th Edition, Gennaro, Ed., Mack Publishing Co., Easton, PA,1995. Фармацевтическую композицию можно вводить любым подходящим путем и способом. Как будет понятно специалистам, путь и/или способ введения будет изменяться в зависимости от желаемых результатов. Фармацевтическая композиция по настоящему изобретению включает композиции, подходящие для перорального, назального, местного (включая трансбуккальный и сублингвальный), ректального,вагинального и/или парентерального введения. Композиции по настоящему изобретению, подходящие для вагинального введения, включают пессарии, тампоны, кремы, гели, пасты, пенки или спреи, содержащие такие носители, которые известны в технике для соответствующего случая. Лекарственные формы для местного или трансдермального введения композиций по изобретению включают порошки, спреи, мази, пасты, кремы, лосьоны, гели, растворы, пэтчи и лекарственные формы для ингаляции. В одном воплощении фармацевтическая композиция подходит для парентерального введения. Выражения "парентеральное введение" и "введенный парентерально", используемые в данном описании, обозначают способ введения иной, чем энтеральное и местное введение, как правило, инъекцию, и включает, без ограничения, внутривенную, внутримышечную, интраартериальную, интратекальную, интракапсулярную, интраорбитальную, интракардиальную, интрадермальную, интраперитонеальную,транстрахеальную, подкожную, субкутикулярную, интраартикулярную, субкапсулярную, субарахноидальную, интраспинальную, эпидуральную и интрастернальную инъекцию и инфузию. В одном воплощении фармацевтическую композицию вводят внутривенной или подкожной инъекцией или инфузией. В одном воплощении моноклональные антитела по изобретению вводят в кристаллической форме подкожной инъекцией, ср. Yang et al., PNAS, 100 (12), 6943-6939 (2003). Независимо от выбранного способа введения, моноклональные антитела по настоящему изобретению, которые можно использовать в форме фармацевтически приемлемой соли или в подходящей гидратированной форме, и/или фармацевтические композиции по настоящему изобретению, составляют в фармацевтически приемлемых лекарственных формах обычными способами, известными специалистам в данной области техники. Используемое в данном описании определение "фармацевтически приемлемый носитель" включает любые и все растворители, дисперсионные среды, покрытия, антибактериальные и противогрибковые средства, средства для регулирования изотоничности, антиоксиданты и средства для отсрочки поглощения и подобные средства, которые являются физиологически совместимыми. Фармацевтически приемлемые носители включают стерильные водные растворы или дисперсии и стерильные порошки для приготовления стерильных растворов или дисперсий для инъекции. Применение таких сред и средств для фармацевтически активных веществ известно в технике. За исключением тех случаев, когда обычные среды или средства несовместимы с моновалентными антителами, предполагается их применение в фармацевтических композициях по изобретению. В одном воплощении носитель является подходящим для парентерального введения, например,внутривенной или подкожной инъекции или инфузии. Типично фармацевтические композиции должны быть стерильными и устойчивыми в условиях изготовления и хранения. Композиция может быть получена в виде раствора, микроэмульсии, липосом или- 22016609 другой упорядоченной структуры, подходящей для высокой концентрации лекарственного средства. Примеры подходящих водных и неводных носителей, которые можно использовать в фармацевтических композициях по изобретению, включают воду, этанол, полиолы (такие как глицерин, пропиленгликоль,полиэтиленгликоль и т.п.) и их подходящие смеси, растительные масла, такие как оливковое масло, и подходящие для инъекции органические сложные эфиры, такие как этилолеат. Подходящую текучесть можно поддерживать, например, применяя обволакивающие материалы, такие как лецитин, путем сохранения требуемого размера частиц в случае дисперсии и применения поверхностно-активных веществ. Фармацевтические композиции также могут содержать адъюванты, такие как консерванты, смачивающие вещества, эмульгаторы и диспергирующие вещества. Предотвращение присутствия микроорганизмов можно обеспечить как процедурами стерилизации, так и включением различных антибактериальных и противогрибковых средств, например парабена, хлорбутанола, фенола, сорбиновой кислоты и подобных средств. Также может быть желательно включение в композиции средств для регулирования изотоничности, таких как сахара, многоатомные спирты, такие как маннит, сорбит, глицерин, или хлорид натрия. Также можно включать фармацевтически приемлемые антиоксиданты, например (1) водорастворимые антиоксиданты, такие как аскорбиновая кислота, гидрохлорид цистеина, бисульфат натрия, метабисульфит натрия, сульфит натрия и т.п.; (2) маслорастворимые антиоксиданты, такие как аскорбилпальмитат, бутилированный гидроксианизол (ВНА), бутилированный гидрокситолуол (ВНТ), лецитин,пропилгаллат, альфа-токоферол и т.п.; и (3) вещества, образующие хелатные соединения с металлами,такие как лимонная кислота, этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТК), сорбит, винная кислота, фосфорная кислота и т.п. Пролонгированное всасывание композиций для инъекции можно получить, включая средства, задерживающие всасывание, например соли моностеараты и желатин. Стерильные растворы для инъекций можно получить, включая моновалентные антитела в требуемом количестве в соответствующий растворитель с одним ингредиентом или сочетанием ингредиентов,например, из числа перечисленных выше, как требуется, с последующей стерилизацией микрофильтрацией. Как правило, дисперсии получают, включая моновалентные антитела в стерильную среду, которая содержит основную дисперсионную среду и другие требуемые ингредиенты, например, из числа перечисленных выше. В случае стерильных порошков для получения стерильных растворов для инъекций примерами способов получения являются вакуумная сушка и сушка вымораживанием (лиофилизация),которые дают порошок активного ингредиента с добавлением любого желательного дополнительного ингредиента из их раствора, предварительно стерилизованного фильтрацией. В соответствующем случае моновалентные антитела можно использовать в подходящей гидратированной форме или в форме фармацевтически приемлемых солей. Термин "фармацевтически приемлемая соль" относится к соли, которая сохраняет желательную биологическую активность исходного соединения и не оказывает какого-либо нежелательного токсикологического действия (см., например, Berge S.M.et al. (1977), J. Pharm. Sci., 66: 1-19). Примеры таких солей включают соли присоединения кислот и оснований. Соли присоединения кислот включают соли, образованные с нетоксичными неорганическими кислотами, такими как хлороводородная, азотная, фосфорная, серная, бромоводородная, фосфористая и т.п., а также нетоксичными органическими кислотами, такими как алифатические моно- и дикарбоновые кислоты, фенилзамещенные алкановые кислоты, гидроксиалкановые кислоты, ароматические кислоты,алифатические и ароматические сульфоновые кислоты и т.п. Соли присоединения оснований включают соли, образованные со щелочными и щелочно-земельными металлами, такими как натрий, калий, магний, кальций и т.п., а также с нетоксичными органическими аминами, такими как N,N'дибензилэтилендиамин, N-метилглюкамин, хлорпрокаин, холин, диэтаноламин, этилендиамин, прокаин и т.п. В зависимости от способа введения моновалентные антитела можно заключить в материал для защиты соединения от действия кислот и других естественных факторов, которые могут инактивировать соединение. Например, соединение можно вводить субъекту в соответствующем носителе, например липосомах. Липосомы включают эмульсии CGF вода-в-масле, масло-в-воде, а также обычные липосомы(Strejan et al., J. Neuroimmunol., 7, 27 (1984. Моновалентные антитела можно ввести в препарат с носителями, которые будут защищать моновалентные антитела от быстрого высвобождения, такой как композиция с регулируемым высвобождением,включая такие системы доставки, как имплантаты, трансдермальные пэтчи и микроинкапсулированные препараты. Можно использовать биоразлагаемые биосовместимые полимеры, такие как сополимер этилена с винилацетатом, полиангидриды, полигликолевая кислота, коллаген, полиортоэфиры и полиакриловая кислота. Способы получения таких композиций вообще известны специалистам в данной области техники, см., например, Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed., MarcelDekker, Inc., New York, 1978. Фармацевтические композиции можно вводить с помощью медицинских устройств, известных в технике. В одном воплощении лечебную композицию по изобретению можно вводить безыгольным устройством для подкожных инъекций, таким как устройства, описанные в US 5399163; US 5383851; US 5312335; US 5064413; US 4941880; US 4790824 или US 4596556. Примеры хорошо известных импланта- 23016609 тов и модулей, применимых в настоящем изобретении, включают устройства, описанные в US 4487603,где раскрывается имплантируемый насос для микроинфузий для подачи лекарственного средства с регулируемой скоростью; в US 4486194, где раскрывается лечебное устройство для введения лекарственных средств через кожу; в US 4447233, где раскрывается насос для инфузии лекарственных средств для доставки лекарственного средства с точной скоростью инфузии; в US 4447224, где раскрывается имплантируемый прибор для инфузии с переменным потоком для непрерывной доставки лекарственного средства; в US 4439196, где раскрывается осмотическая система доставки лекарственного средства с многокамерными компартментами; и в US 4475196, где раскрывается осмотическая система доставки лекарственного средства. Специалистам известно много других таких имплантатов, систем доставки и модулей. В одном воплощении моновалентные антитела по изобретению можно ввести в композицию, обеспечивающую надлежащее распределение in vivo, например, с использованием липосом. В отношении способов получения липосом см., например, US 4522811; US 5374548 и US 5399331. Липосомы могут содержать одну или несколько частиц, которые селективно переносятся в определенные клетки или органы, таким образом усиливая направленную доставку лекарственного средства (см., например, V.V.Ranade, J. Clin. Pharmacol., 29, 685 (1989. Примеры нацеливающих частиц включают фолат или биотинChemother., 39, 180 (1995; поверхностно-активный рецептор протеина A (Briscoe et al., Am. J. Physiol.,1233, 134 (1995; различные добавки, которые могут содержать композиции по изобретению, а также компоненты молекул по изобретению; p.120 (Schreier et al., J. Biol. Chem., 269, 9090 (1994; см. такжеKeinanen et al., FEBS Lett., 346, 123 (1994); Killion et al., Immunomethods, 4, 273 (1994). Композиция должна быть жидкой до такой степени, чтобы существовала возможность легкого введения через шприц. Она должна быть устойчива в условиях изготовления и хранения, и ее необходимо защитить от загрязняющего действия микроорганизмов, таких как бактерии и грибы. В одном воплощении моновалентные антитела по изобретению можно ввести в композицию с предотвращением или уменьшением их переноса через плаценту. Это можно осуществить способами, известными в технике, например ПЭГилированием моновалентных антител. Также можно сослаться наImmunol., 74, 279-283 (1995). Подбирают схемы введения лекарственных средств, обеспечивающие оптимальную желательную реакцию (например, лечебную реакцию). Например, можно ввести однократную болюсную дозу, можно ввести несколько разделенных во времени доз или дозу можно пропорционально уменьшать или увеличивать, как показывают потребности лечебной ситуации. Особенно выгодно получать парентеральные композиции в стандартной лекарственной форме для простоты введения и равномерности дозировки. Стандартной лекарственной формой в данном описании называются физически дискретные единицы,подходящие как единичные дозировки для субъектов, которых лечат; каждая единица содержит предварительно установленное количество моновалентных антител, рассчитанное на получение нужного лечебного действия, в сочетании с требуемым фармацевтическим носителем. Технические требования для стандартных лекарственных форм по изобретению диктуются и непосредственно зависят от (a) уникальных характеристик моновалентных антител и определенного лечебного действия, которого нужно достичь, и (b) собственных ограничений в технике получения композиций таких моновалентных антител для лечения из-за чувствительности у индивидуумов. Фактические уровни дозировки моновалентных антител в фармацевтических композициях по настоящему изобретению могут изменяться с тем, чтобы получить количество активного ингредиента, которое эффективно для достижения желательной лечебной реакции у определенного пациента, в зависимости от композиции и способа введения. Выбранный уровень дозировки будет зависеть от многих фармакокинетических факторов, включая активность используемых определенных моновалентных антител по настоящему изобретению, способ введения, время введения, скорость экскреции определенных используемых моновалентных антител, длительность лечения, другие лекарственные средства, соединения и/или материалы, используемые в сочетании с определенной используемой композицией, возраст, пол,массу тела, состояние, общее состояние здоровья и предшествующую историю болезни пациента, которого лечат, и подобных факторов, хорошо известных в медицине. Рядовой врач или ветеринар может легко определить и прописать эффективное количество требуемой фармацевтической композиции. Например, врач или ветеринар может назначить начальные дозы соединений по изобретению, используемых в фармацевтической композиции, на уровнях меньших, чем требуется для того, чтобы достичь желательного лечебного действия, и постепенно увеличивать дозировку до тех пор, пока желаемое действие не будет достигнуто. Вообще, подходящая доза фармацевтической композиции по изобретению будет представлять собой количество моновалентных антител, которое является наименьшей дозой, эффективной для получения лечебного действия. Такая эффективная доза, как правило, будет зависеть от факторов, описанных выше. Как другой пример, врач или ветеринар могут начать с высокой ударной дозы с последующим повторным введением меньших доз для быстрого накопления терапевтически эффективной дозы и поддержания ее в течение длительных периодов време- 24016609 ни. Фармацевтическая композиция по изобретению может содержать одни моноклональные антитела или комбинацию различных моноклональных антител по изобретению. Таким образом, в другом воплощении фармацевтическая композиция включает сочетание нескольких (например, двух или большего числа) моновалентных антител по изобретению, которые действуют по различным механизмам. Моновалентные антитела также можно комбинировать с двухвалентными антителами. Настоящее изобретение также относится к нуклеотидной конструкции, кодирующей аминокислотную последовательность области CH тяжелой цепи моновалентного антитела по изобретению. В одном воплощении изобретение относится к нуклеотидной конструкции, содержащей нуклеотидную последовательность области CH IgG4, где нуклеотидная последовательность, кодирующая областьCH, модифицирована таким образом, что участок, соответствующий шарнирной области в указанной области CH, не содержит каких-либо аминокислотных остатков, способных принимать участие в образовании дисульфидных связей с пептидами, содержащими аминокислотную последовательность, идентичную аминокислотной последовательности указанной области CH, или комплементарной ей последовательности. Нуклеотидную конструкцию, кодирующую область CH моновалентного антитела по изобретению,можно получить из нуклеиновых кислот, кодирующих область CH IgG4. Нуклеотидную конструкцию,кодирующую полноразмерную аминокислотную последовательность области CH IgG4, можно получить любым из способов, обсуждаемых в данном описании, например в примерах, или другими способами,известными в технике. Способы манипуляции с последовательностями рекомбинантных ДНК хорошо известны в технике, и могут, например, осуществляться с использованием сайт-направленного мутагенеза, как описано в настоящем описании. Однако сайт-направленный мутагенез является только одним из неограничительных примеров технологий, которые можно применять. Модификацию нуклеотидной последовательности, кодирующей область CH, можно осуществить так, как описано выше для конструкции моновалентных антител по изобретению. В одном воплощении нуклеотидную последовательность, кодирующую область CH, модифицируют таким образом, что участок, соответствующий шарнирной области, не содержит цистеиновых остатков. В одном воплощении нуклеотидную последовательность, кодирующую область CH, модифицируют таким образом, что по меньшей мере один из аминокислотных остатков участка, соответствующего шарнирной области, включая цистеиновые остатки, делетирован и/или заменен другими аминокислотными остатками. В одном воплощении нуклеотидную последовательность, кодирующую область CH, модифицируют таким образом, что аминокислотные остатки, соответствующие аминокислотам 106 и 109 последовательности SEQ ID NO: 14, делетированы. В одном воплощении нуклеотидную последовательность, кодирующую область CH, модифицируют таким образом, что по меньшей мере один из аминокислотных остатков, соответствующих аминокислотам 106 и 109 последовательности SEQ ID NO: 14, делетирован. В одном воплощении нуклеотидную последовательность, кодирующую область CH, модифицируют таким образом, что делетированы, по меньшей мере, аминокислотные остатки, соответствующие аминокислотам 99-110 последовательности SEQ ID NO: 14. В одном воплощении нуклеотидную последовательность, кодирующую область CH, модифицируют таким образом, что делетирована вся шарнирная область. В одном воплощении мутация (замена) нуклеотидов, соответствующих донорному сайту сплайсинга шарнирной области в последовательности, кодирующей область CH IgG4, идентифицированную в данном описании как SEQ ID NO: 13, приводит к экспрессии полипептида, содержащего бесшарнирную область CH IgG4. Соответственно в одном воплощении нуклеотидную конструкцию по изобретению модифицируют таким образом, что по меньшей мере один нуклеотид донорного сайта сплайсинга нуклеотидной последовательности, кодирующей шарнирную область, заменен нуклеотидом иным, чем нуклеотид, первоначально присутствующий в указанной позиции. В одном воплощении нуклеотиды, соответствующие нуклеотидам в позиции 714 и 722 последовательности SEQ ID NO: 13, заменяют нуклеотидом иным, чем нуклеотид, присутствующий в указанной позиции в SEQ ID NO: 13. В одном воплощении нуклеотидная последовательность, кодирующая область CH нуклеотидной конструкции по изобретению, содержит последовательность SEQ ID NO: 13, в которой нуклеотиды 714 и 722 последовательности SEQ ID NO: 13 заменены нуклеотидом иным, чем нуклеотид, присутствующий в указанной позиции в SEQ ID NO: 13. В одном воплощении нуклеотидная последовательность, кодирующая область CH, нуклеотидной конструкции по изобретению, содержит нуклеотидную последовательность SEQ ID NO:15. В одном воплощении нуклеотидная последовательность, кодирующая область CH нуклеотидной конструкции по изобретению, модифицируют таким образом, что аминокислотные остатки, соответствующие аминокислотам 106 и 109 последовательности SEQ ID NO: 14, заменены аминокислотными ос- 25016609 татками, отличными от цистеина. В одном воплощении заменяемые нуклеотиды нуклеотидной последовательности, кодирующей область CH нуклеотидной конструкции по изобретению, заменяют с использованием сайт-направленного мутагенеза. В одном воплощении нуклеотидную конструкцию, содержащую нуклеотидную последовательность, кодирующую область CH IgG4, где нуклеотидная последовательность, кодирующая область CH,модифицирована таким образом, что участок, соответствующий шарнирной области в указанной областиCH, не содержит каких-либо аминокислотных остатков, способных принимать участие в образовании дисульфидных связей, сливают с нуклеиновой кислотой, содержащей нуклеотидную последовательность, кодирующую область VL моновалентного антитела по изобретению. Таким образом, в одном воплощении нуклеотидная конструкция содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую область VL антигенспецифического антитела, или последовательность, комплементарную ей. В одном воплощении нуклеотидная последовательность, кодирующая область VL нуклеотидной конструкции, функционально связана с нуклеотидной последовательностью, кодирующей область CH,или последовательностью, комплементарную ей. В одном воплощении нуклеотидная конструкция содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую тяжелую цепь моновалентного антитела по изобретению. Этого можно достичь с использованием хорошо известных технологий получения нуклеотидной конструкции, в которой две различные кодирующие последовательности функционально связаны вместе. Нуклеотидную последовательность, кодирующую область VH моновалентного антитела по изобретению,можно получить из нуклеиновых кислот, кодирующих область VH любого антигенспецифического антитела. В одном воплощении область VH получают из того же антитела, из которого получают область VL моновалентного антитела. В изобретении приводятся примеры того, как получить конструкции нуклеиновых кислот, содержащие: 1) нуклеотидную последовательность, кодирующую область VH HuMab-7D8, идентифицированную как SEQ ID NO: 5, и нуклеотидную последовательность, кодирующую бесшарнирную область CH IgG4,идентифицированную как SEQ ID NO: 15, где указанные последовательности функционально связаны вместе; 2) нуклеотидную последовательность, кодирующую область VH мышиного антитела против Betv-1,идентифицированную как SEQ ID NO: 7, и нуклеотидную последовательность, кодирующую бесшарнирную область CH IgG4, идентифицированную как SEQ ID NO: 15, где указанные последовательности функционально связаны вместе. Ряд различных нуклеотидных конструкций, кодирующих моновалентные антитела, способные связываться с различными специфическими антигенами, можно получить с использованием способа по изобретению, описанного выше, и поэтому примеры специфических моновалентных антител не ограничиваются примерами антител, описанных в данном описании. В одном воплощении нуклеотидная конструкция по изобретению также содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую легкую цепь моновалентного антитела по изобретению. В одном воплощении нуклеотидная конструкция по изобретению также содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую область VL моновалентного антитела по изобретению. В одном воплощении нуклеотидная конструкция по изобретению также содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую область CL моновалентного антитела по изобретению. В одном воплощении область CL представляет собой область CL легкой цепи каппа. В одном воплощении область CL имеет последовательность SEQ ID NO: 1. В другом воплощении область CL представляет собой областьCL легкой цепи лямбда. В одном воплощении область CL имеет последовательность SEQ ID NO: 3. Такую нуклеотидную конструкцию можно получить любой рекомбинантной технологией, обсуждаемой в данном описании, или получить согласно процедурам, описанным в настоящей заявке в приведенных примерах. Нуклеотидную последовательность, кодирующую область VL моновалентного антитела по изобретению, можно получить из нуклеиновых кислот, кодирующих область VH любого антигенспецифического антитела. В одном воплощении область VL получают из того же антитела, из которого получают область VH моновалентного антитела. В изобретении приводятся примеры того, как получить: 1) нуклеотидную конструкцию, содержащую нуклеотидную последовательность, кодирующую область VL HuMab-7D8, идентифицированную как SEQ ID NO: 9, и нуклеотидную последовательность,кодирующую CL каппа Ig, идентифицированную как SEQ ID NO: 1, где указанные последовательности функционально связаны вместе; 2) нуклеотидную конструкцию, содержащую нуклеотидную последовательность, кодирующую область VL мышиного антитела против Betv-1, идентифицированную как SEQ ID NO: 11, и нуклеотидную последовательность, кодирующую CL каппа Ig, идентифицированную как SEQ ID NO: 1, где указанные последовательности функционально связаны вместе. Нуклеиновые кислоты могут присутствовать в целых клетках, в клеточных лизатах или в частично- 26016609 очищенной или в, по существу, очищенной форме. Нуклеотидные конструкции по настоящему изобретению часто не только в нативной последовательности (за исключением модифицированных сайтов рестрикции и т.п.), но и из кДНК, геномной последовательности или их смесей можно мутировать согласно стандартным методам получения последовательностей генов. В случае кодирующих последовательностей такие мутации могут влиять на аминокислотную последовательность, как желательно. В частности, рассматриваются последовательности ДНК, по существу, гомологичные или происходящие от нативной, V, D, J, константной, вариантовпереключателей и других таких последовательностей, описанных в данном описании (где "происходящие от" указывает, что последовательность идентична другой последовательности или модифицирована). В одном воплощении нуклеотидная конструкция представляет собой конструкцию ДНК. В одном воплощении нуклеотидная конструкция представляет собой конструкцию двухцепочечной ДНК. В одном воплощении нуклеотидная конструкция представляет собой конструкцию РНК. В одном воплощении моновалентные антитела по изобретению получают, создавая возможность экспрессии в клетке нуклеотидной конструкции, описанной выше. Таким образом, изобретение относится к нуклеотидной конструкции, описанной выше, которая является экспрессирующим вектором. В одном воплощении экспрессирующий вектор является прокариотическим экспрессирующим вектором. В одном воплощении экспрессирующий вектор является эукариотическим экспрессирующим вектором. В одном воплощении экспрессирующий вектор представляет собой экспрессирующий вектор на основе ДНК млекопитающего. Примеры различных экспрессирующих векторов, которые можно использовать для целей изобретения, обсуждаются в тексте описания, и конкретные примеры описаны в разделе "Примеры". Изобретение относится к способу получения моновалентных антител по изобретению, включающему культивирование клеток-хозяев, содержащих нуклеотидную конструкцию по изобретению и, если указанная нуклеотидная конструкция не кодирует легкую цепь указанных антител, также нуклеотидную конструкцию, кодирующую легкую цепь указанных антител, так что экспрессируются полипептиды, и извлечение моновалентных антител из культуры клеток. В одном воплощении моновалентные антитела выделяют из клеточного лизата. В другом воплощении моновалентные антитела выделяют из культуральной среды. Изобретение также относится к применению нуклеотидной конструкции по изобретению для получения моновалентных антител по изобретению. В одном воплощении указанное получение включает применение способа, подробно описанного ниже. Таким образом, моновалентные антитела по изобретению можно получить, например, экспрессией в клетках-хозяевах экспрессирующего вектора, содержащего нуклеотидную последовательность, кодирующую легкую цепь антитела по изобретению, и экспрессией экспрессирующего вектора, содержащего нуклеотидную последовательность, кодирующую тяжелую цепь антитела по изобретению, или экспрессирующего вектора, содержащего обе последовательности. Клетки-хозяева можно выбрать из числа любых клеток, подходящих для экспрессии чужеродных белков, например клетки млекопитающего, как описано в данном описании. Изобретение относится к экспрессии как in vivo, так и in vitro. Для транзиентной экспрессии in vitro можно использовать клетки млекопитающего HEK293. В таком случае клетки в культуре трансфицируют описанными выше экспрессирующими векторами любым из способов, подходящих для трансфекции клеток, которые хорошо известны в технике, например можно закупить подходящий набор для трансфекции клеток у коммерческого производителя, например у Stratogene или Invitrogene. Для экспрессии in vivo экспрессирующий вектор вводят in vivo любым подходящим способом введения, разработанным для такой цели. Способы введения экспрессирующих векторов invivo хорошо известны в технике. Соответственно изобретение относится к клетке-хозяину, содержащей нуклеотидную конструкцию,описанную выше. В одном воплощении клетка-хозяин представляет собой прокариотическую клетку. В одном воплощении клетка-хозяин представляет собой клетку E. coli. В другом воплощении клеткахозяин представляет собой эукариотическую клетку. В одном воплощении клетка-хозяин представляет собой клетку млекопитающего. В одном воплощении клетка-хозяин представляет собой клетку CHO. В другом воплощении клетка-хозяин представляет собой клетку HEK-293F. Изобретение относится к способу получения моновалентных антител по изобретению, включающему культивирование клеток-хозяев по изобретению, содержащих нуклеотидную последовательность,кодирующую тяжелую цепь указанных антител, и нуклеотидную последовательность, кодирующую легкую цепь указанных антител, так что экспрессируются полипептиды, и извлечение моновалентных антител из культуры клеток. Изобретение также относится к применению клеток-хозяев по изобретению для получения моновалентных антител по изобретению. В одном воплощении указанное получение включает применение способа, подробно описанного ниже. Нуклеотидная последовательность может присутствовать в одной и той же нуклеотидной конструкции как нуклеотидной последовательности, кодирующей тяжелую цепь, или присутствовать в отдельной нуклеотидной конструкции. В одном воплощении моновалентные антитела выделяют из клеточного лизата. В другом воплощении моновалентные антитела вы- 27016609 деляют из культуральной среды. Изобретение также относится к трансгенному животному, содержащему нуклеотидную конструкцию, описанную выше. Изобретение относится к способу рекомбинантного получения моновалентного антитела, включающему:i) обеспечение нуклеотидной конструкции, кодирующей легкую цепь указанного моновалентного антитела, причем указанная конструкция содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую область VL выбранного антигенспецифического антитела, и нуклеотидную последовательность, кодирующую константную область (CL) Ig, где указанная нуклеотидная последовательность, кодирующая область VL выбранного антигенспецифического антитела, и указанная нуклеотидная последовательность,кодирующая область CL Ig, функционально соединены вместе;ii) обеспечение нуклеотидной конструкции, кодирующей тяжелую цепь указанного моновалентного антитела, причем указанная конструкция содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую область VH выбранного антигенспецифического антитела, и нуклеотидную последовательность, кодирующую область CH человеческого IgG4, где указанная нуклеотидная последовательность, кодирующая тяжелую цепь, модифицирована таким образом, что участок, соответствующий шарнирной области тяжелой цепи, не содержит каких-либо аминокислотных остатков, способных принимать участие в образовании дисульфидных связей с другими пептидами, содержащими идентичную аминокислотную последовательность константной области (CH) человеческого IgG4, где указанная нуклеотидная последовательность, кодирующая область VH выбранного антигенспецифического антитела, и указанная нуклеиновая кислота, кодирующая область CH IgG4, функционально соединены вместе;iii) обеспечение клеточной экспрессирующей системы для получения указанного антитела;iv) получение указанного моновалентного антитела коэкспрессией нуклеотидных конструкций (i) и(ii) в клетках клеточной экспрессирующей системы (iii). После стадии (iv) моновалентные антитела можно очистить и ввести в нужные композиции. В одном воплощении нуклеотидную последовательность, кодирующую тяжелую цепь, модифицируют таким образом, что участок, соответствующий шарнирной области тяжелой цепи, не содержит каких-либо цистеиновых остатков, как описано выше. В одном воплощении нуклеотидную последовательность, кодирующую тяжелую цепь, модифицируют таким образом, что по меньшей мере один из аминокислотных остатков участка, соответствующего шарнирной области, включая цистеиновые остатки, делетирован и/или заменен на другие аминокислотные остатки, как описано выше. В одном воплощении нуклеотидную последовательность, кодирующую тяжелую цепь, модифицируют таким образом, что тяжелая цепь содержит область CH, в которой аминокислотные остатки, соответствующие аминокислотам 106 и 109 последовательности SEQ ID NO: 14, делетированы, как описано выше. В одном воплощении нуклеотидную последовательность, кодирующую тяжелую цепь, модифицируют таким образом, что тяжелая цепь содержит область CH, в которой делетированы, по меньшей мере,аминокислотные остатки, соответствующие аминокислотным остаткам 99-110 последовательности SEQID NO: 14, как описано выше. В одном воплощении нуклеотидную последовательность, кодирующую тяжелую цепь, модифицируют таким образом, что делетирована вся шарнирная область, как описано выше. В одном воплощении нуклеотидная конструкция, кодирующая тяжелую цепь указанного моновалентного антитела, содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую область CH человеческогоIgG4, где по меньшей мере один нуклеотид донорного сайта сплайсинга нуклеотидной последовательности, кодирующей шарнирную область, заменен другим нуклеотидом, как описано выше. В одном воплощении нуклеотидная конструкция, кодирующая тяжелую цепь указанного моновалентного антитела, содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую область CH человеческогоNO: 13, как описано выше. В одном воплощении нуклеотидная конструкция, кодирующая тяжелую цепь указанного моновалентного антитела, содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую область CH человеческогоIgG4, содержащую последовательность SEQ ID NO: 13, в которой нуклеотиды 714 и 722 последовательности SEQ ID NO: 13 заменены нуклеотидом иным, чем нуклеотид, присутствующий в указанной позиции в SEQ ID NO: 13, как описано выше. В одном воплощении нуклеотидная конструкция, кодирующая тяжелую цепь указанного моновалентного антитела, содержит нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 15, как описано выше. В одном воплощении нуклеотидную конструкцию, кодирующую тяжелую цепь, модифицируют таким образом, что тяжелая цепь содержит область CH, в которой аминокислотные остатки, соответствующие аминокислотным остаткам 106 и 109 последовательности SEQ ID NO: 14, заменены аминокислотными остатками, отличными от цистеина, как описано выше.- 28016609 В одном воплощении заменяемые нуклеотиды нуклеотидной последовательности, кодирующей шарнирную область области CH, заменяют с использованием сайт-направленного мутагенеза, как описано выше. В одном воплощении нуклеотидная конструкция, кодирующая легкую цепь указанного моновалентного антитела, содержит последовательность, кодирующую область CL цепи каппа человеческогоIgG4, как описано выше. В одном воплощении нуклеотидная конструкция содержит последовательность SEQ ID NO: 1, как описано выше. В одном воплощении нуклеотидная конструкция, кодирующая легкую цепь указанного моновалентного антитела, содержит последовательность, кодирующую область CL цепи лямбда человеческогоIgG4, как описано выше. В одном воплощении нуклеотидная конструкция содержит последовательность SEQ ID NO: 3, как описано выше. В одном воплощении нуклеотидные конструкции представляют собой конструкции ДНК, как описано выше. В одном воплощении нуклеотидная конструкция (i)-(iii) и/или (iv) представляет собой прокариотический экспрессирующий вектор, описанный выше. В другом воплощении клеточная экспрессирующая система представляет собой прокариотическую клеточную экспрессирующую систему, как описано выше. В другом воплощении прокариотическая клеточная экспрессирующая система содержит клетки E.coli, как описано выше. В другом воплощении клетки E. coli представляют собой штамм с недостаточной эндогенной протеазной активностью, как описано выше. В одном воплощении нуклеотидная конструкция (i)-(iii) и/или (iv) представляет собой эукариотический экспрессирующий вектор, описанный выше. В другом воплощении клеточная экспрессирующая система представляет собой эукариотическую клеточную экспрессирующую систему, как описано выше. В другом воплощении эукариотическая клеточная экспрессирующая система представляет собой экспрессирующую систему на основе клеток млекопитающего, как описано выше. В другом воплощении клеточная экспрессирующая система на основе клеток млекопитающего содержит клетки CHO, как описано выше. В еще одном другом воплощении клеточная экспрессирующая система на основе клеток млекопитающего содержит клетки HEK-293F, как описано выше. Настоящее изобретение также относится к моновалентному антителу, которое можно получить с применением способа по изобретению. Настоящее изобретение также относится к моновалентному антителу, которое получают с применением способа по изобретению. Согласно изобретению любое антигенспецифическое моновалентное антитело по изобретению можно получить с использованием способа, описанного выше. Моновалентные антитела по настоящему изобретению имеют многочисленные диагностические и терапевтические применения in vitro и in vivo, включая диагностику и лечение расстройств с участием клеток, экспрессирующих антиген, который антитела могут узнавать и связываться с ним. Изобретение не относится к моновалентным антителам, направленным на любой специфический антиген, так как согласно изобретению моновалентные антитела, описанные в настоящем описании, можно получить против любого специфического антигена. Изобретение раскрывает два различных моновалентных антитела 7D8-HG (HuMab 7D8 или просто 7D8 представляет собой антитело против CD20, описанное в WO 04/035607, и HuMab 7D8-HG или просто 7D8-HG представляет собой то же самое антитело, содержащее тяжелую цепь IgG4, содержащую область CH, состоящую из аминокислотной последовательности SEQID NO: 16) и антитело против Betv-1 (антитело против Betv-1 представляет собой мышиное антитело,экспрессируемое клоном 2 Н 8, см. ссылку (Akkerdaas J.H. et al., Allergy, 50(3), 215-20 (1995, и антитело против Betv-1-HG представляет собой то же самое антитело, содержащее тяжелую цепь IgG4, содержащую область CH, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 16), полученные способом, описанным в настоящей заявке, однако изобретение не ограничивается указанными двумя моновалентными антителами. В одном воплощении моновалентные антитела к CD20 по изобретению представляют собой моновалентные антитела из антител, описанных в WO 2005/103081. При некоторых патологических состояниях необходимо и/или желательно использовать моновалентные антитела. Также в некоторых случаях предпочтительно, чтобы лечебные антитела проявляли свое лечебное действие без вовлечения активностей, опосредуемых иммунной системой, таких как эффекторные функции, ADCC, фагоцитоз и CDC. В таких ситуациях желательно получать формы антител,в которых такая активность существенно ослаблена или устранена. Также выгодно, если антитела имеют форму, которую можно получить эффективно и с хорошим выходом. Настоящее изобретение относится к таким антителам, которые можно использовать для различных целей, например в качестве лечебных средств, профилактических средств и диагностических средств. Конкретное применение моновалентных антител по изобретению, естественно, зависит от специфической мишени антител. Выбор мишеней, для которых моновалентные антитела по изобретению являются антителами, применимыми для лечения, профилактики и диагностики, может основываться на