Варианты ил-12p40 с улучшенной стабильностью

Вебстер Гордон Д., Маккензи Сьюзан П.,Ло Кин-Минь, Стейн Паскаль Андре (US) Представитель: Описаны модифицированные полипептиды, представляющие собой р 40-субъединицу интерлейкина-12 (ИЛ 12). Модифицированные полипептиды содержат изменения в ИЛ-12 р 40 субъединице, удаляющие протеазный сайт между положениями Lys260 и Arg261. Модифицированные ИЛ-12 р 40 полипептиды согласно настоящему изобретению обладают улучшенной стабильностью по сравнению с полипептидами р 40 субъединицы зрелого ИЛ-12 человека дикого типа.(71)(73) Заявитель и патентовладелец: МЕРК ПАТЕНТ ГМБХ (DE) 015338 Область техники Изобретение в целом относится к белкам ИЛ-12 р 40, включая слитые белки, содержащие ИЛ-12 р 40,модифицированные с целью улучшения их стабильности. Более конкретно, белки ИЛ-12 р 40 согласно настоящему изобретению не содержат протеолитического сайта в области Lys260 и Arg261 в р 40 субъединице. Предшествующий уровень техники Интерлейкин-12 (ИЛ-12) - это провоспалительный цитокин, который синтезируется в ответ на инфекцию различными клетками иммунной системы, включая фагоцитарные клетки, В-клетки и активированные дендритные клетки (Colombo and Trinchieri (2002), CytokineGrowth Factor Reviews, 13: 155168). ИЛ-12 играет важную роль в опосредовании взаимодействия врожденной и адаптивной ветвей иммунитета, действуя на Т-клетки и клетки-натуральные киллеры (НК), усиливая пролиферацию и активность цитотоксических лимфоцитов и продукцию других провоспалительных цитокинов, в частности интерферона- (ИФН-). ИЛ-12 представляет собой гетеродимерную молекулу, состоящую из -цепи (р 35-субъединица, ИЛ 12 р 35) и -цепи (р 40-субъединица, ИЛ-12 р 40), ковалентно связанных между собой дисульфидным мостиком с образованием биологически активного гетеродимера с молекулярной массой 74 кДа. Аминокислотные последовательности ИЛ-12 р 35 и ИЛ-12 р 40 зрелого (дикого типа) ИЛ-12 человека изображены на фиг. 1(SEQ ID NO:1) и 2 (SEQ ID NO:2), соответственно. Интерлейкин-23 (ИЛ-23) является связанной дисульфидным мостиком гетеродимерной молекулой,близко родственной ИЛ-12, которая содержит ту же -цепь ИЛ-12 р 40, что и ИЛ-12, но уникальную-цепь (р 19-субъединицу, ИЛ-23 р 19) (Oppmann et al., (2000), Immunity, 13: 715-725). Так же, как и ИЛ 12, ИЛ-23 продуцируется фагоцитарными клетками и активированными дендритными клетками, и считается, что он участвует в рекрутинге и активации ряда воспалительных клеток (Langrish et al., (2004) Immunol. Rev., 202: 96-105). Аминокислотная последовательность ИЛ-23 р 19 зрелого ИЛ-23 человека изображена на фиг. 3 (SEQ ID NO:3). Для того чтобы иммунные клетки секретировали биологически активные гетеродимеры ИЛ-12 или ИЛ-23, необходима одновременная экспрессия - и -субъединиц в одной клетке. Секреции иммунными клетками только ИЛ-12 р 35 или только ИЛ-23 р 19 не наблюдалось, поскольку клетки, продуцирующие биологически активные ИЛ-12 или ИЛ-23 гетеродимеры, секретируют р 40-субъединицу в свободной форме в 10-100-кратном избытке по сравнению с гетеродимером (D'Andrea et al. (1992), J. Exp. Med., 176: 1387-98, Oppmann et al., (2000), Immunity, 13: 715-725). Кроме того, на мышах наблюдали, что, даже в отсутствие -субъединицы, клетки могут продуцировать биологически активный гомодимер ИЛ-12 р 40(Hikawa et al. (2004), Neuroscience, 129: 75-83). Было показано, что наличие эндогенного ИЛ-12 необходимо для иммунологической устойчивости к широкому спектру патогенных микроорганизмов, а также к трансплантированным и химически индуцированным опухолям (Gateley et al. (1998), Аппи. Rev. Immunol., 16: 495-521). Было продемонстрировано,что ИЛ-12 обладает высокой противоопухолевой активностью, основанной на индукции IFN- (интерферона-гамма) и активации эффекторных клеток, таких как CD8+ Т-клетки и НК-клетки (Brunda et al.(1993), J. Exp. Med., 178: 1223-30). Вследствие того, что была продемонстрирована противоопухолевая активность ИЛ-12, он был испытан в клинических исследованиях на людях в качестве иммунотерапевтического средства для лечения разнообразных видов рака (Atkins et al. (1997), Clin. Cancer Res., 3: 409-17;Gollob et al. (2000), Clin. Cancer Res., 6: 1678-92; и Hurteau et al. (2001), Gynecol. Oncol., 82: 7-10), включая рак почки, рак толстого кишечника, рак яичников, меланому и Т-клеточную лимфому, а также в качестве адъюванта для противораковых вакцин (Lee et al. (2001), J. Clin. Oncol. 19. 3836-47). В случае ИЛ-12 и ИЛ-23 продукция рекомбинантного белка в правильно сложенной и биологически активной, гетеродимерной, форме требует одновременной экспрессии -субъединицы и ИЛ-12 р 40 в продуцирующей клеточной линии. Тем не менее, очищенный рекомбинантный белок обнаруживает некоторую гетерогенность, обусловленную протеолитическим расщеплением в С-терминальной области ИЛ 12 р 40. Нестабильность белков ИЛ-12 или ИЛ-23 может вызвать проблемы с их продукцией и клиническим использованием в качестве терапевтического агента. Поэтому в данной области техники существует потребность в усовершенствованных вариантах рекомбинантных ИЛ-12 или ИЛ-23, которые обеспечивали бы гомогенный белок, более устойчивый к протеолитическому расщеплению. Сущность изобретения Изобретение обеспечивает р 40-субъединицы ИЛ-12 человека (р 40-варианты), которые обладают улучшенной стабильностью по сравнению с р 40-белками ИЛ-12 дикого типа. У этих р 40-вариантов Стерминальная область, которая в норме чувствительна к протеолитическому расщеплению, перестроена так, чтобы она стала более устойчивой к расщеплению протеазами. Более конкретно, р 40-варианты согласно настоящему изобретению включают выполненные посредством генной инженерии изменения аминокислот в D3-домене, имеющие своей целью исключение образования потенциальных Т-клеточных эпитопов, которые могли бы сделать варианты белков иммуногенными и запустить реакции образования антител у людей. В результате этого р 40-варианты согласно настоящему изобретению обладают улуч-1 015338 шенными свойствами в качестве терапевтических средств, по сравнению с белками ИЛ 12-р 40 дикого типа, с точки зрения их продукции, составления композиций и фармакокинетики. Соответственно, в одном из аспектов изобретение обеспечивает вариант D3-домена ИЛ-12 р 40 человека (D3-вариант), в котором D3-вариант по меньшей мере на 85% идентичен D3-домену ИЛ-12 р 40 человека дикого типа и содержит изменение аминокислоты в одном или более положениях, соответствующих остаткам 258-266 зрелого ИЛ-12 р 40 человека. Некоторые формы осуществления настоящего изобретения основаны, в частности, на знании того, что изменение (или изменения) аминокислот согласно настоящему изобретению обладают особым преимуществом, состоящим в удалении протеолитического сайта между Lys260 и Arg261. Согласно настоящему изобретению изменения аминокислот в одном или более положениях, соответствующих остаткам 258-266, могут быть делециями, заменами или вставками. Кроме того, для создания вариантов согласно настоящему изобретению могут быть использованы замены аминокислот, при которых основные аминокислоты могут быть заменены неосновными аминокислотами. Более конкретно, D3-варианты согласно настоящему изобретению могут содержать замены одной или более аминокислот в положениях, выбранных из группы, состоящей из Lys258, Ser259, Lys260,Arg261, Lys263, Lys264, Asp265 и Arg266. Такие изменения аминокислот могут быть использованы поодиночке или в комбинации для того, чтобы вызвать структурные и/или функциональные изменения,описанные выше. Например, D3-вариант может содержать одну, две, три, четыре или более из следующих замен: Lys258Gln, Ser259Asp, Lys260Ala, Lys260Asn, Lys260Gln, Lys260Gly, Arg261Ala, Arg261Asp,Arg261Thr, Lys263Gly, Lys263Ser и/или Lys264Gly. В некоторых формах осуществления настоящего изобретения замена производится в позицииLys260. При замене Lys260 может быть заменен неосновной аминокислотой, например - Ala, Asn, Gln или Gly. Другие замены, в дополнение к Lys260, могут быть проведены в положениях Ser259 и Arg261. В частности, некоторые D3-варианты согласно настоящему изобретению содержат замены Ser259Asp,Lys260Asn и Arg261Thr. В другой форме осуществления настоящего изобретения D3-варианты согласно настоящему изобретению содержат замены Ser259Asp, Lys260Asn, Arg261Thr и Lys264Gly, наряду с делециями Lys263, Lys264 и Asp265. В других формах осуществления настоящего изобретения D3-вариант, содержащий замену в положении Lys260, альтернативно содержит другие замены в одном или более положениях, выбранных изLys258, Ser259, Arg261, Lys263 и Lys264. Например, в одной из форм осуществления изобретения D3 вариант содержит замены Lys258Gln, Ser259Asp, Lys260Gln, Arg261Asp, и, факультативно, Lys263Ser иLys264Gly. В следующих формах осуществления настоящего изобретения, кроме замен в положениях Ser259,Lys260 и Arg261, удалены один или более остатков, соответствующих Lys263, Lys264, Asp265 и Arg266,тогда как в еще одной форме осуществления настоящего изобретения один или более остатков в положениях Lys263, Lys264, Asp265 и Arg266 заменены на неосновную аминокислоту. В следующей форме осуществления настоящего изобретения в положении Lys264 произведена замена Lys264Gly и, возможно, удалены Lys263 и Asp265. Другие D3-варианты согласно настоящему изобретению содержат заменыLys263, Asp265 и Arg 266. Специалистам в данной области техники будет очевидно, что р 40-варианты и их активные участки,содержащие D3-вариант, описанный в данной заявке, входят в объем изобретения. Сходным образом,белки ИЛ-12 и их активные участки, содержащие р 40-вариант (варианты ИЛ-12), также входят в объем изобретения. Изобретение также охватывает слитые белки, содержащие варианты ИЛ-12 согласно настоящему изобретению и часть молекулы, выбранную из группы, состоящей из части антитела, цитокина, не являющегося ИЛ-12, или их активного участка. Сходным образом, белки ИЛ-23 и их активные участки, содержащие р 40-вариант (варианты ИЛ-23),также входят в объем изобретения. Изобретение также охватывает слитые белки, содержащие варианты ИЛ-23 согласно настоящему изобретению и часть молекулы, выбранную из группы, состоящей из части антитела, цитокина, не являющегося ИЛ-23, или их активного участка. В другом аспекте изобретение относится к нуклеиновой кислоте, кодирующей любые D3-варианты,р 40-варианты, варианты ИЛ-12 и варианты ИЛ-23 согласно настоящему изобретению. Изобретение также охватывает клетку, например прокариотическую клетку, содержащую такую нуклеиновую кислоту. Изобретение также относится к способам получения таких D3-вариантов, р 40-вариантов, вариантов ИЛ-12, вариантов ИЛ-23 и слитых белков, содержащих эти части молекул. В следующем аспекте изобретение предусматривает способы использования вариантов согласно настоящему изобретению и нуклеиновых кислот, кодирующих эти варианты. Например, изобретение охватывает способ лечения пациента, который включает в себя введение пациенту терапевтически эффективного количества р 40-варианта согласно настоящему изобретению или его активного участка. Вышеуказанные и другие признаки и преимущества изобретения, а также само изобретении, будут лучше понятны из приведенных ниже рисунков, описания изобретения и формулы изобретения. В целом, изобретение относится к-2 015338 варианту D3-домена ИЛ-12 р 40, причем вариант по меньшей мере на 85% идентичен D3-домену ИЛ 12 р 40 дикого типа и содержит изменение аминокислоты в одном или более положениях, соответствующих остаткам в положениях 258-266 исходного зрелого ИЛ-12 р 40 человека; соответствующему варианту, в котором изменение удаляет протеазный сайт между Lys260 иArg261; соответствующему варианту, в котором изменение является заменой или делецией; соответствующему варианту, в котором изменение является заменой, выбранной из группы, состоящей из Lys258, Lys260, Lys263 и Lys264; соответствующему варианту, в котором выбрана одна или более из следующих замен аминокислотLys258Gln, Lys260Ala, Lys260Asn, Lys260Gln, Lys260Gly, Lys263Gly, Lys263Ser и Lys264Gly; соответствующему варианту, в котором замена произведена по меньшей мере в положении Lys260; соответствующему варианту, в котором замена заменяет основную кислоту на неосновную кислоту,выбранную из группы, состоящей из Ala, Asn, Gln или Gly; соответствующему варианту, содержащему дополнительно одну или более замен в положенияхSer259, Arg261 или Arg 266; соответствующему варианту, в котором замены произведены в положениях Ser259 и Arg261; соответствующему варианту, в котором произведены замены Ser259Asp, Lys260Asn и Arg261Thr; соответствующему варианту, дополнительно содержащему замену Lys264Gly. соответствующему варианту, в котором дополнительно делетированы один или оба остатка Lys263 и Asp265; соответствующему варианту, в котором делетированы один или более остатков, соответствующихLys263, Lys264, Asp 265 и Arg266; соответствующему варианту, дополнительно содержащему одну или более замен, выбранных из группы, состоящей из: Lys263, Lys264, Asp 265 и Arg266, причем соответствующий исходный остаток аминокислоты заменен на неосновную аминокислоту; соответствующему варианту, дополнительно содержащему одну или более замен, выбранных из группы, состоящей из: Lys258, Ser259, Arg261, Lys263 и Lys264; соответствующему варианту, в котором замены произведены в положениях Lys258Gln, Ser259Asp,Lys260Gln и Arg261Asp; соответствующему варианту, дополнительно содержащему замены Lys263Ser и Lys264Gly; соответствующему варианту, специфически содержащему (i) следующие замены: Ser259Asp,Lys260Asn и Arg261Thr, и (ii) следующие делеции: Lys263, Lys264 и Asp265, где вышеуказанные положения относятся к немодифицированной молекуле дикого типа, за счет чего формируется последовательность Lys - Asp - Asn - Thr - Glu - Arg в положениях 258-263 варианта; соответствующему варианту, специфически содержащему (i) следующие замены: Ser259Asp,Lys260Asn, Arg261Thr и Lys264Gly и (ii) следующие делеции:Lys263 и Asp265, где вышеуказанные положения относятся к немодифицированной молекуле дикого типа, за счет чего формируется последовательность: Lys - Asp - Asn - Thr - Glu - Gly - Arg в положениях 258-264 варианта; соответствующему варианту, содержащему следующие замены: Lys258Gln, Ser259Asp, Lys260Gln,Arg261Asp, за счет чего формируется последовательность: Gln - Asp - Gln - Asp - Glu - Lys - Lys - Arg в положениях 258-265 варианта; соответствующему варианту, содержащему следующие замены: Lys258Gln, Ser259Asp, Lys260Gln,Arg261Asp, Lys263Ser, Lys264Gly, за счет чего формируется последовательность: Gln - Asp - Gln - Asp Glu - Ser- Gly - Arg в положениях 258-265 варианта; белку ИЛ-12 или его фрагменту, содержащему вариант, описанный выше или ниже; белку ИЛ-23 или его фрагменту, содержащему вариант, описанный выше или ниже; слитому белку, содержащему вариант или белок ИЛ-12 или ИЛ-23, описанный выше, и антитело или его активный участок; соответствующему слитому белку, в котором вышеуказанный вариант или вышеуказанный белок соединены с С-концом вышеуказанного антитела или участка антитела, предпочтительно - с Fc-областью вышеуказанного антитела, причем вышеуказанное антитело нацелено на опухолевые антигены, такие какKS (EpCam) или 14.18, или на рецепторы, которые гиперэкспрессированы на опухолевой ткани, такие как HER2, EGFR или VEGFR. нуклеиновой кислоте или молекуле ДНК, кодирующей вариант или белок ИЛ-12 или ИЛ-23, или слитый белок, описанный выше или ниже; вектору экспрессии, содержащему вышеуказанную нуклеиновую кислоту; клетке-хозяину, продуцирующей вариант, или белок ИЛ-12 или ИЛ-23, или слитый белок, описанный в данной работе; фармацевтической композиции, подходящей для лечения болезней, запускаемых ИЛ-12 или ИЛ-23,и содержащей фармакологически эффективное количество варианта, белка ИЛ-12 или ИЛ-23, или слитого белка, содержащего такой вариант или белок ИЛ-12 или ИЛ-23, возможно совместно с фармацевтиче-3 015338 ски приемлемым носителем, разбавителем или вспомогательным веществом, или с другими фармакологически эффективными лекарственными средствами в режиме комбинированной терапии; использованию вышеуказанной фармацевтической композиции или ее эффективных компонентов для производства медикамента для лечения рака или аутоиммунного заболевания. Краткое описание графических материалов Фиг. 1 изображает зрелую последовательность аминокислот -цепи, то есть р 35-субъединицы, зрелого (дикого типа) ИЛ-12 человека (SEQ ID NO:1). Фиг. 2 изображает зрелую последовательность аминокислот -цепи, то есть р 40-субъединицы, зрелого (дикого типа) ИЛ-12 человека (SEQ ID NO:2). Домен D3, соответствующий положениям 211-306(SEQ ID NO:26), выделен курсивом, а фрагмент пептида, соответствующий положениям 258-266, подчеркнут (SEQ ID NO:5), a Lys260 и Arg261 выделены полужирным шрифтом. Фиг. 3 изображает зрелую последовательность аминокислот -цепи, то есть р 19-субъединицы, зрелого (дикого типа) ИЛ-23 человека (SEQ ID NO:3). Фиг. 4 А изображает результаты SDS-PAGE гель-электрофореза нескольких очищенных партий ИЛ 12 человека, полученных в виде слитых белков с антителами (дорожки 1-8), тогда как фиг. 4 В изображает результаты SDS-PAGE гель-электрофореза нескольких очищенных партий ИЛ-23 человека, полученных в виде слитых белков с антителами (дорожки 1-3). Субъединицы ИЛ-12 р 35 and ИЛ-23 р 19 ковалентно соединены с тяжелыми цепями антител. Полоса для молекулярной массы 6 кДа указана стрелкой. Молекулярные массы (в кДа) указаны для маркеров (дорожка М). Фиг. 5 изображает последовательность аминокислот С-терминального фрагмента пептида зрелой(дикого типа) ИЛ-12 р 40 субъединицы человека. Фрагмент начинается с Arg261 (SEQ ID NO:4). Фиг. 6 изображает последовательность аминокислот пептидного фрагмента, соответствующего положениям 258-266 зрелой (дикого типа) ИЛ-12 р 40 субъединицы человека (SEQ ID NO:5). Фиг. 7.1 и 7.2 изображает сравнение последовательности аминокислот ИЛ-12 р 40 субъединиц различных млекопитающих, включая человека, павиана (Papio anubis), макаки-резус (Масаса mulatta), мангабея (Cercocebus torquatos), собаки (Canis familiaris), кошки (Felis catus), лошади (Equus caballus), свиньи(Sus scrofa), коровы (Bos Taurus), козы (Capra hircus), овцы (Ovis aries), оленя (Cervus elaphus), водяного буйвола (Bubalus bubalis), хомяка (Mesocricetus auratus), морской свинки (Cavia porcellus), хлопкового хомяка (Sigmodon hispidus), крысы (Rattus norvegicus) и мыши (Mus musculus). Две аминокислоты, отмеченные полужирным шрифтом, обозначают сайт протеолитического расщепления. Фиг. 8 изображает последовательность аминокислот варианта, обозначенного в данной работе какp40V1 зрелой ИЛ-12 р 40 субъединицы человека (SEQ ID NO:6). Последовательность, перестроенная посредством генной инженерии, подчеркнута. Фиг. 9 изображает последовательность аминокислот варианта, обозначенного в данной работе какp40V2 зрелой ИЛ-12 р 40 субъединицы человека (SEQ ID NO:7). Последовательность, перестроенная посредством генной инженерии, подчеркнута. Фиг. 10 изображает последовательность аминокислот варианта, обозначенного в данной работе какp40V3 зрелой ИЛ-12 р 40 субъединицы человека (SEQ ID NO:8). Последовательность, перестроенная посредством генной инженерии, подчеркнута. Фиг. 11 изображает последовательность аминокислот варианта, обозначенного в данной работе какp40V4 зрелой ИЛ-12 р 40 субъединицы человека (SEQ ID NO:9). Последовательность, перестроенная посредством генной инженерии, подчеркнута. Фиг. 12 изображает последовательность аминокислот варианта, обозначенного в данной работе какp40V5 зрелой ИЛ-12 р 40 субъединицы человека (SEQ ID NO:10). Изменение подчеркнуто. Фиг. 13 изображает последовательность аминокислот варианта, обозначенного в данной работе какp40V6 зрелой ИЛ-12 р 40 субъединицы человека (SEQ ID NO:11). Изменения подчеркнуты. Фиг. 14 изображает последовательность аминокислот варианта, обозначенного в данной работе какp40V7 зрелой ИЛ-12 р 40 субъединицы человека (SEQ ID NO:12). Изменение подчеркнуто. Фиг. 15 изображает последовательность аминокислот варианта, обозначенного в данной работе какp40V8 зрелой ИЛ-12 р 40 субъединицы человека (SEQ ID NO:13). Изменение подчеркнуто. Фиг. 16 изображает последовательность аминокислот варианта, обозначенного в данной работе какp40V9 зрелой ИЛ-12 р 40 субъединицы человека (SEQ ID NO:14). Изменение подчеркнуто. Фиг. 17 изображает последовательность аминокислот варианта, обозначенного в данной работе какp40V10 зрелой ИЛ-12 р 40 субъединицы человека (SEQ ID NO:15). Изменение подчеркнуто. Фиг. 18 изображает последовательность аминокислот варианта, обозначенного в данной работе какp40V11 зрелой ИЛ-12 р 40 субъединицы человека (SEQ ID NO:16). Изменения подчеркнуты. Фиг. 19 изображает последовательность оснований нуклеиновой кислоты, кодирующей полномерную (дикого типа) ИЛ-12 р 40 субъединицу человека (SEQ ID NO:21). Фиг. 20 изображает последовательность оснований синтетического нуклеотидного фрагмента, обозначенного в данной работе как V1V2 и кодирующего участки р 40-вариантов p40V1 и p40V2. V1V2 фрагмент включает в себя V1-фрагмент, содержащий область (подчеркнута), кодирующую SEQ IDNO:17. За ней следует линкерная последовательность (нижний блок), а затем - V2-фрагмент, содержащий область (подчеркнута), кодирующую SEQ ID NO:18. Фиг. 21 изображает последовательность оснований синтетического нуклеотидного фрагмента, обозначенного в данной работе как V3V4 и кодирующего участки р 40-вариантов p40V3 и p40V4. V3V4 фрагмент включает в себя V3-фрагмент, содержащий область (подчеркнута), кодирующую SEQ IDNO:19. За ней следует линкерная последовательность (нижний блок), а затем - V4-фрагмент, содержащий область (подчеркнута), кодирующую SEQ ID NO:20. Фиг. 22 изображает последовательность оснований синтетического нуклеотидного фрагмента, обозначенного в данной работе как V5V6 и кодирующего участки р 40-вариантов p40V5 и p40V6. V5V6 фрагмент включает в себя V5-фрагмент, содержащий замену кодона (подчеркнута), кодирующуюArg261Ala. За ней следует линкерная последовательность (нижний блок), а затем - V6-фрагмент, содержащий замены кодонов (подчеркнуты), кодирующие Lys260Ala и Arg261Ala. Фиг. 23 изображает последовательность оснований синтетического нуклеотидного фрагмента, обозначенного в данной работе как V7V8 и кодирующего участки р 40-вариантов p40V7 и p40V8. V7V8 фрагмент включает в себя V7-фрагмент, содержащий замену кодона (подчеркнута), кодирующуюLys260Ala. За ней следует линкерная последовательность (нижний блок), а затем - V8-фрагмент, содержащий замену кодонов (подчеркнута), кодирующую Lys260Gly. Фиг. 24 представляет результат вестерн-блоттинга с поликлональным антителом к р 40 человека(V1-V4), были собраны и обработаны посредством SDS-PAGE гель-электрофореза. Было испытано по два независимых клона (a, b) каждого варианта ИЛ-12 р 40 - p40V1, p40V2, p40V3 и p40V4. Стрелки указывают на полосу расщепленного ИЛ-12 р 40, не имеющего С-терминального фрагмента (дорожка р 40 wt). Фиг. 25 демонстрирует результаты SDS-PAGE гель-электрофореза слитых белков, состоящих из антитела и ИЛ-12, которые содержат варианты р 40: p40V1, p40V2, p40V3, p40V4, p40V5, p40V6, p40V7,p40V8 и р 40 дикого типа (дорожки 1-9). Верхняя главная полоса относится к слитому белку, состоящему из тяжелой цепи антитела и р 35-субъединицы, а нижняя главная полоса относится к легкой цепи антитела. Полоса для 6 кД не была обнаружена ни в одной дорожке, связанной с вариантами белков, кроме дорожки 5. Молекулярные массы (кД) указаны для маркеров (дорожка М). Фиг. 26 изображает данные относительно фармакокинетики слитых белков, состоящих из антитела и ИЛ-12 и содержащих варианты р 40, а именно - p40V1-p40V8, в сравнении со слитыми белками, содержащими антитело и ИЛ-12 (дикого типа), при внутривенном введении. Фиг. 27 А изображает данные относительно фармакокинетики слитых белков, состоящих из антитела и ИЛ-12 и содержащих варианты р 40, а именно - p40V1-p40V4, в сравнении со слитыми белками, содержащими антитело и ИЛ-12 (дикого типа) (панель А), а Фиг. 27 В изображает данные относительно фармакокинетики слитых белков, состоящих из антитела и ИЛ-12 и содержащих варианты р 40, а именно- p40V5-p40V8, в сравнении со слитыми белками, содержащими антитело и ИЛ-12 (дикого типа) (панель В), при подкожном введении. Фиг. 28 изображает вариант ИЛ-12 р 40, содержащий мутации за пределами D3-области белка. Подробное описание изобретения Изобретение описывает варианты р 40-субъединицы цитокина-интерлейкина-12 (ИЛ-12), которые обладают улучшенной стабильностью по сравнению с белком дикого типа. В этих вариантах область р 40-субъединицы, которая в норме не структурирована и чувствительна к протеолитическому расщеплению, мутирована для придания ей большей устойчивости к протеолитическому расщеплению. Эта область, находящаяся в домене D3, расположена вблизи С-конца р 40-субъединцы и содержит полипептидный участок, соответствующий аминокислотам 258-260 в зрелой р 40-субъединице человека (р 40(258260. ИЛ-12 р 40 субъединица также является субъединицей, входящей в состав цитокина интерлейкина 23 (ИЛ-23). ИЛ-23 состоит из двух субъединиц - -субъединицы "р 19" и-субъединицы "р 40". р 40 субъединица ИЛ-23 - такая же, как ИЛ-12 р 40. Поэтому варианты ИЛ-12 р 40 субъединицы также являются вариантами ИЛ-23 р 40 субъединицы. В одном из общих классов форм осуществления изобретения в области р 40, соответствующей аминокислотным остаткам 258-266, производят одну или более мутаций с целью устранения сайта расщепления, который в субъединице р 40 человека соответствует сайту между Lys260 и Arg261. В других формах осуществления настоящего изобретения в этой области осуществляют специфические мутации, которые при моделировании обеспечивают более плотную складчатую структуру. В другом аспекте изобретения осуществляют такие мутации, которые, по предварительным прогнозам, исключают появление иммуногенности у измененной посредством генной инженерии области р 40-субъединицы. Например,замены аминокислот в измененной посредством генной инженерии области р 40-субъединицы выбирают так, чтобы избежать образования пептидов, которые могут быть распознаны как потенциальные эпитопы для Т-клеток человека. Мутации могут быть выполнены в области р 40-субъединицы, соответствующей аминокислотным остаткам 258-266, с использованием различных механизмов. Например, в одной из форм осуществления-5 015338 настоящего изобретения мутацию или мутации осуществляют посредством замены одного аминокислотного остатка на другой. В другой форме осуществления настоящего изобретения мутацию или мутации осуществляют посредством делеции одного или более остатков в р 40-субъединице. В следующей форме осуществления настоящего изобретения мутацию или мутации осуществляют посредством вставки одного или более аминокислотных остатков в р 40-субъединицу. В одной из форм осуществления настоящего изобретения варианты р 40-субъединицы согласно настоящему изобретению содержатся в белковых композициях, таких как белки ИЛ-12, слитые белки, содержащие ИЛ-12, белки ИЛ-23, слитые белки, содержащие ИЛ-23 или гомодимеры р 40-субъединицы. Например, в одной из форм осуществления настоящего изобретения белок ИЛ-12 содержит р 35 субъединицу и вариант р 40-субъединицы согласно настоящему изобретению. В другой форме осуществления настоящего изобретения белок ИЛ-23 содержит р 19-субъединицу и вариант р 40-субъединицы согласно настоящему изобретению. В следующей форме осуществления настоящего изобретения слитый белок содержит участок антитела, соединенный с ИЛ-12, содержащим вариант ИЛ-12 р 40. В следующей форме осуществления настоящего изобретения слитый белок содержит участок антитела, соединенный с ИЛ-23, содержащим вариант ИЛ-12 р 40. В следующей форме осуществления настоящего изобретения часть слитого белка, представляющая собой антитело, является интактным антителом, Fc-фрагментом,sc-Fv, антигенсвязывающим участком антитела или активным фрагментом антитела. В следующей форме осуществления настоящего изобретения слитый белок согласно настоящему изобретении содержит вариант ИЛ-12 р 40, соединенный с цитокином, не являющимся ИЛ-12 или ИЛ-23, или с его активным участком. В следующем аспекте настоящего изобретения белковые композиции, которые содержат один из вариантов р 40-субъединицы согласно настоящему изобретению, обладают более длительным периодом полувыведения из кровотока, чем соответствующий белок дикого типа. Так, по сравнению с белками ИЛ-12 или ИЛ-23, содержащими р 40-субъединицу дикого типа, варианты ИЛ-12 или варианты ИЛ-23,которые содержат измененную посредством генной инженерии р 40-субъединицу согласно настоящему изобретению, обладают улучшенными свойствами в качестве терапевтических агентов, относящимися к их продукции, составлению рецептур и фармакокинетике. В следующей форме осуществления настоящего изобретения мутации аминокислотной последовательности ИЛ-12 р 40 осуществляют за пределами ИЛ-12 р 40(258-260) области и, возможно, за пределамиD3-домена ИЛ-12 р 40. Такие мутации могут быть осуществлены в других местах D3-домена ИЛ-12 р 40 или могут быть осуществлены в других доменах. Например, фиг. 28 изображает последовательность р 40 субъединицы ИЛ-12, которая содержит изменения в последовательности аминокислот за пределами остатков 258-266. В работе Leong et al., (2003), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 100:1163-1168, содержание которой включено в данную заявку посредством ссылки, указаны различные остатки, которые могут быть мутированы в последовательности аминокислот ИЛ-12 р 40 за пределами области 258-266. Кроме того,поскольку известна трехмерная кристаллическая структура ИЛ-12 р 40 (работа Yoon et al., (2000), EMBOJ., 19:3530-3541, содержание которой включено в данную заявку посредством ссылки), специалист в данной области техники может выбрать другие мутации, которые не будут нарушать функциональность р 40 субъединицы. Определение продукта расщепления Изобретение отчасти основано на наблюдении, состоящем в том, что ИЛ-12 р 40 субъединица чувствительна к специфическому протеолитическому расщеплению, и на новых результатах экспериментов, в ходе которых был определен сайт расщепления. Было обнаружено, что очищенный рекомбинантный белок ИЛ-12, продуцируемый NS/0 клетками, как описано в примере 2, устойчиво обнаруживает определенный уровень гетерогенности при разделении рекомбинантного белка посредством электрофореза наSDS-PAGE геле в восстановительных условиях, отчетливо видимый в виде дополнительной полосы белка с молекулярной массой около 6 кД. Сходное наблюдение было сделано в случае рекомбинантного белка ИЛ-23. Это проиллюстрировано на фиг. 4, которая демонстрирует результаты SDS-PAGE гельэлектрофореза нескольких очищенных партий белковых композиций, содержащих ИЛ-12 человека (панель А) и ИЛ-23 человека (панель В) и полученных в виде слитых белков, содержащих антитело. Загрязнитель был очищен; была определена последовательность его аминокислот, как описано в примере 3, и было обнаружено, что она соответствует последовательности С-терминального фрагмента ИЛ-12 р 40 субъединицы, состоящего из 46 аминокислот и полученного посредством протеолитического расщепления между Lys260 и Arg261 (фиг. 5-SEQ ID NO:4). Расщепление между Lys260 и Arg261, повидимому, является приоритетным, несмотря на преобладание основных аминокислот в области, окружающей сайт расщепления (KSKREKKDR (фиг. 6 - SEQ ID NO:5), где Lys260 и Arg261 обозначены полужирным шрифтом). Тем не менее, С-терминальный фрагмент пептида, несмотря на то, что он отщеплен от р 40-субъединицы, остается нековалентно связанным с остатком р 40-субъединицы, что затрудняет устранение остаточной гетерогенности посредством дополнительной очистки рекомбинантного белка. Белок IL-12P40 Зрелая р 40-субъединица человека представляет собой белок, состоящий из 306 аминокислот, напоминающий растворимый цитокиновый -рецептор класса I, который состоит из доменов D1, D2 и D3.III, состоящем из 96 аминокислот, занимающих область от I211 до S306. Последовательность р 40 субъединицы зрелого ИЛ-12 человека изображена на фиг. 2. Последовательность аминокислот в доменеD3 изображена на фиг. 2 курсивом. В опубликованной структуре гетеродимера ИЛ-12 человека, установленной посредством рентгенокристаллографического анализа (Yoon et al. (2000), EMBO J., 19: 3530-41),часть петли в области р 40(258-26 б) D3-домена человека не разрешена. Не желая быть связанными теорией, отметим все же, что неразрешенные области в кристаллических структурах часто являются признаком гибких, неструктурированных петель и могут быть целевыми сайтами для протеолиза. Сопоставление первичной структуры зрелой р 40-субъединицы различных видов млекопитающих приведено на фиг. 7.1 и 7.2, в том числе - человека, приматов - павиана, макаки-резус и мангабея, собаки,кошки, лошади, свиньи, жвачных животных - коровы, козы, овцы, оленя, водяного буйвола, грызунов хомяка, морской свинки, хлопкового хомяка, крысы и мыши. При сопоставлении область вокруг р 40(258-266) обнаруживает вариабельность последовательности, особенно в отношении ее длины. Более конкретно, у некоторых видов, а именно жвачных животных, последовательность короче, а у других видов, например - у грызунов, последовательность в некоторых случаях может содержать дополнительную вставку. У многих видов дипептидный мотив, соответствующий K260R261 р 40 человека консервирован,либо являясь идентичным, либо обнаруживая две основные аминокислоты. Эти виды включают в себя важные сельскохозяйственные и коммерческие виды, в том числе (но не ограничиваясь этим) - лошадь,корову, козу, свинью и овцу. Соответственно, внедрение одной или более мутаций в область ИЛ-12 р 40 животных, соответствующую остаткам 258-266 ИЛ-12 р 40 человека, причем аналогичных мутациям,предложенным в данной работе для ИЛ-12 р 40 человека, может оказаться полезным для снижения или устранения протеолитического расщепления ИЛ-12 р 40 животных по сайту расщепления K260R261. В принципе, согласно настоящему изобретению можно использовать вариант ИЛ-12 р 40 от тех видов, у которых отсутствует положительно заряженный дипептидный мотив, соответствующий мотивуK260R261 р 40-субъединицы ИЛ-12 человека, для человека или другого гетерологичного организма. Однако важно указать, что при практическом осуществлении настоящего изобретения формы ИЛ-12 р 40,происходящие не от человека, при введении их человеку обычно приводят к образованию антител к р 40 субъединице. Если рассмотреть вопрос шире, то не оптимально вводить р 40-субъединицу одного вида другому виду. Кроме того, вероятность протеолитического расщепления различных р 40-субъединиц,происходящих не от человека, мало изучена. Кроме того, р 40-субъединицы одних видов могут не функционировать в других видах, либо на стадии сборки с такими субъединицами, как р 35 или р 19, либо на стадии взаимодействия с субъединицами рецепторов. Варианты белков ИЛ-12 р 40 Изобретение предусматривает варианты ИЛ-12 р 40 белков с мутациями в D3-домене, улучшающими стабильность. При использовании в контексте настоящего изобретения термин "D3-вариант" относится к D3-домену р 40-субъединицы, например - субъединицы ИЛ-12 или ИЛ-23 человека, содержащему одно или более изменений аминокислот, по сравнению с D3-доменом дикого типа. Термин "вариант р 40 субъединицы" используется в данной работе для обозначения р 40-субъединицы, например - ИЛ-12 или ИЛ-23 человека, с мутациями в D3-домене, то есть к р 40-субъединице, содержащей вариант D3. Термин"вариант ИЛ-12" используется в данной работе для обозначения белка ИЛ-12 человека, содержащего вариант р 40-субъединицы. Термин "вариант ИЛ-23" используется в данной работе для обозначения белка ИЛ-23 человека, содержащего вариант р 40-субъединицы. Согласно одной из форм осуществления настоящего изобретения D3-домен варианта р 40 субъединицы обладает по меньшей мере 70%-ной идентичностью последовательности D3-домену ИЛ 12 р 40 дикого типа. В другой форме осуществления настоящего изобретения D3-домен варианта р 40 субъединицы обладает по меньшей мере 75%-ной или большей идентичностью последовательности D3 домену ИЛ-12 р 40 дикого типа. В следующей форме осуществления изобретения D3-домен р 40-варианта обладает по меньшей мере 80%-ной или большей идентичностью последовательности D3-домену ИЛ 12 р 40 дикого типа, тогда как в других формах осуществления настоящего изобретения D3-домен р 40 варианта обладает по меньшей мере 81%-ной или большей, или по меньшей мере 82%-ной или большей,или по меньшей мере 83%-ной или большей, или по меньшей мере 84%-ной или большей, или по меньшей мере 85%-ной или большей, или по меньшей мере 86%-ной или большей, или по меньшей мере 87%-ной или большей, или по меньшей мере 88%-ной или большей, или по меньшей мере 89%-ной или большей, или по меньшей мере 90%-ной или большей, или по меньшей мере 91%-ной или большей, или по меньшей мере 92%-ной или большей, или по меньшей мере 93%-ной или большей, или по меньшей мере 94%-ной или большей, или по меньшей мере 95%-ной или большей, или по меньшей мере 96%-ной или большей, или по меньшей мере 97%-ной или большей, или по меньшей мере 98%-ной или большей,или по меньшей мере 99%-ной или большей идентичностью последовательности D3-домену ИЛ-12 р 40 дикого типа. Согласно следующей форме осуществления настоящего изобретения последовательность аминокислот р 40-варианта обладает по меньшей мере 70%-ной или большей идентичностью последовательности аминокислот р 40-субъединицы зрелого ИЛ-12 дикого типа. В следующей форме осуществления изо-7 015338 бретения последовательность аминокислот р 40-варианта обладает по меньшей мере 75%-ной или большей идентичностью последовательности аминокислот р 40-субъединицы зрелого ИЛ-12 дикого типа. В следующей форме осуществления изобретения последовательность аминокислот р 40-варианта обладает по меньшей мере 80%-ной или большей идентичностью последовательности аминокислот р 40 субъединицы зрелого ИЛ-12 дикого типа, тогда как в других формах осуществления изобретения последовательность аминокислот р 40-варианта обладает по меньшей мере 81%-ной или большей, или по меньшей мере 82%-ной или большей, или по меньшей мере 83%-ной или большей, или по меньшей мере 84%-ной или большей, или по меньшей мере 85%-ной или большей, или по меньшей мере 86%-ной или большей, или по меньшей мере 87%-ной или большей, или по меньшей мере 88%-ной или большей, или по меньшей мере 89%-ной или большей, или по меньшей мере 90%-ной или большей, или по меньшей мере 91%-ной или большей, или по меньшей мере 92%-ной или большей, или по меньшей мере 93%-ной или большей, или по меньшей мере 94%-ной или большей, или по меньшей мере 95%-ной или большей,или по меньшей мере 96%-ной или большей, или по меньшей мере 97%-ной или большей, или по меньшей мере 98%-ной или большей, или по меньшей мере 99%-ной или большей идентичностью последовательности аминокислот р 40-субъединицы зрелого ИЛ-12 дикого типа Для определения процента идентичности двух последовательностей аминокислот эти последовательности выравнивают для обеспечения оптимального сравнения (например, в первую последовательность аминокислот можно ввести разрывы для оптимального выравнивания со второй последовательностью аминокислот). Процент идентичности двух последовательностей является функцией числа идентичных положения, общих для обеих последовательностей (то есть, % идентичности = (N идентичных положений/N положений) умножить на 100). Если сравниваемые последовательности имеют неодинаковую длину, то для определения общего числа положений используется более короткая последовательность. Определение процента идентичности двух последовательностей также может быть выполнено с использованием математического алгоритма. Не ограничивающим примером математического алгоритма, используемого для сравнения двух последовательностей, является алгоритм Карлина и Альтшуля (1990), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:226468, модифицированный в работе Karlin and Altschul, (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:5873-77. Этот алгоритм использован в программах NBLAST и XBLAST, опубликованных в работе Altschul et al., (1990)J. Mol. Biol., 215:403-10. Поиск гомологичных нуклеотидов (BLAST-нуклеотидов) может быть выполнен с помощью программы NBLAST, оценка = 100, длина "слова" = 12. Поиск гомологичных белков (BLAST-белков) может быть выполнен с помощью программы XBLAST, оценка = 50, длина "слова" = 3. Для того чтобы получить выравнивания с разрывами для целей сравнения, можно использовать программу Gapped BLAST,как описано в работе Altschul et al., (1997) Nucleic Acids Research, 25(17):3389-3402. При использовании программ BLAST и Gapped BLAST можно использовать значения параметров по умолчанию соответствующих программ (например, XBLAST и NBLAST). В одной из форм осуществления настоящего изобретения изобретение предусматривает D3 варианты, содержащие изменение, которое удаляет сайт протеолитического расщепления между Lys260 и Arg261. В одной из форм осуществления настоящего изобретения осуществляется мутация аминокислоты в положении Lys260. В более специфической форме осуществления настоящего изобретенияLys260 заменяют неосновной аминокислотой. Неосновными аминокислотами являются, например, Ala,Asn, Asp, Cys, Glu, Gln, Gly, He, Leu, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr или Val. Например, Lys 260 заменяют на Ala, Asn, Asp, Cys, Glu, Gln, Gly, Ile, Leu, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr или Val. В альтернативной форме осуществления настоящего изобретения Lys260 заменяют на селеноцистеин. Примеры D3 вариантов, в которых Lys260 был заменен на другую аминокислоту, приведены на фиг. 12, 13, 14, 15, 16 и 18. В другой форме осуществления настоящего изобретения осуществляют мутацию Arg261. Например, в одной из форм осуществления настоящего изобретения Arg261 заменяют неосновной аминокислотой. Например, в одной из форм осуществления настоящего изобретения Arg261 заменяют на Ala, Asn,Asp, Cys, Glu, Gln, Gly, Ile, Leu, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr или Val. В альтернативной форме осуществления настоящего изобретения Arg261 заменяют на селеноцистеин. Примеры D3-вариантов, в которых Arg261 был заменен на другую аминокислоту, приведены на фиг. 12, 13, 17 и 18. В другой форме осуществления настоящего изобретения осуществляют мутацию Lys260 и Arg261. Например, в одной из форм осуществления настоящего изобретения Lys260 заменяют на Gln, Ala, Asn или Gly, a Arg261 заменяют на Ala, Asp или Thr. Примеры D3-вариантов, в которых и Lys260, и Arg261 заменены на другие аминокислоты, изображены на фиг. 13 и 18. Кроме того, в одной из форм осуществления настоящего изобретения Lys260 и Arg261 удаляют, тогда как в другой форме осуществления настоящего изобретения между Lys260 и Arg261 вставляют аминокислоту. В следующей форме осуществления настоящего изобретения получен D3-вариант, в котором одна или более аминокислот из Lys258, Ser259, Lys260, Arg261, Lys263, Lys264 или Arg266 заменены на другие аминокислоты. В одной из форм осуществления настоящего изобретения одна или более аминокис-8 015338 лот из Lys258, Ser259, Lys260, Arg261, Lys263, Lys264 или Arg266 заменены на неосновные аминокислоты. Например, в одной из форм осуществления настоящего изобретения Lys258 заменяют на Gln. В другой форме осуществления настоящего изобретения Ser259 заменяют на Asp. В следующей форме осуществления настоящего изобретения Lys260 заменяют на Ala, Gly, Asn или Gln. В еще одной форме осуществления настоящего изобретения Arg261 заменяют на Ala, Thr или Asp. В следующей форме осуществления настоящего изобретения Lys263 заменяют на Ser. В следующей форме осуществления настоящего изобретения Lys264 заменяют на Gly. В одной из форм осуществления настоящего изобретения Arg266 заменяют на Gln, Asp, Asn или Thr. В следующей форме осуществления настоящего изобретения каждую из аминокислот Lys263 и Lys264 заменяют на другую аминокислоту. Например, в одной из форм осуществления настоящего изобретения Lys263 и Lys264 заменены на Ser и Gly, соответственно. В следующей форме осуществления настоящего изобретения Lys258, Ser259, Lys260, Arg261, Lys263 и Lys264 заменены на Gln, Asp, Gln, Asp, Ser и Gly, соответственно. В следующей форме осуществления настоящего изобретения получен D3-вариант, в котором одна или более из аминокислот Ser259, Lys260 и Arg261 заменены другими аминокислотами. В следующей форме осуществления настоящего изобретения одна или более из аминокислот Ser259, Lys260 и Arg261 заменены неосновными аминокислотами. Например, в одной из форм осуществления настоящего изобретения Ser259, Lys260 и Arg261 заменены на Asp, Asn и Thr, соответственно. В другой форме осуществления настоящего изобретения каждая из аминокислот Lys258, Ser259,Lys260 и Arg261 заменена на другую аминокислоту. Например, в одной из форм осуществления настоящего изобретения каждая из аминокислот Lys258, Ser259, Lys260 и Arg261 заменена на неосновную аминокислоту. В одной из форм осуществления настоящего изобретения Lys258, Ser259, Lys260 и Arg261 заменены на Gln, Asp, Gln и Asp, соответственно. В следующей форме осуществления настоящего изобретения Ser259, Lys260, Arg261 и Lys264 заменены на Asp, Asn, Thr и Gly, соответственно. В еще одной форме осуществления настоящего изобретения Ser259, Lys260, Arg261 и Lys264 заменены на Asp, Asn,Thr и Gly, соответственно, тогда как Lys263 и Asp265 удалены. В следующей форме осуществления настоящего изобретения Ser259, Lys260 и Arg261 заменены на Asp, Asn и Thr, соответственно, тогда какLys263, Lys264 и Asp265 удалены. Не желая быть связанными теорией, все же отметим, что считается, что делеции оказывают эффект,состоящий в снижении конформационной гибкости области р 40(258-266), за счет чего снижается способность мотива Lys260-Arg261 принимать конформацию, обеспечивающую расщепление соответствующей протеазой. Поэтому в одной из форм осуществления настоящего изобретения делетируют одну или более из аминокислот Lys258, Ser259, Lys260, Arg261, Lys263, Lys264, Asp265 или Arg266. В следующей форме осуществления настоящего изобретения получен D3-вариант, в котором делетированы одна или более из аминокислот Lys263, Lys264, Asp265 или Arg266. Например, в одной из форм осуществления настоящего изобретения делетированы Lys263 и Asp265, тогда как в другой форме осуществления настоящего изобретения делетированы Lys263, Lys264 и Asp265. В следующей форме осуществления делетированы Lys263, Lys264 и Asp265 или заменены на одну или более неосновных аминокислот. В следующей форме осуществления изобретения делетированы Lys263, Lys264, Asp265 иArg266. В следующей форме осуществления настоящего изобретения делетированы одна или более из аминокислот Lys263, Lys264, Asp265 или Arg266, тогда как одна или более из аминокислот Ser259,Lys260 или Arg261 заменены другими аминокислотами. Например, в одной из форм осуществления настоящего изобретения Ser259, Lys260 и Arg261 заменены на Asp, Asn и Thr, соответственно, тогда какLys263, Lys264 и Asp265 делетированы. В следующей форме осуществления настоящего изобретенияArg266 делетированы. В других формах осуществления настоящего изобретения замены аминокислот выбраны так, что они исключают образование новых Т-клеточных эпитопов. Способы анализа пептидных последовательностей на их способность создавать Т-клеточные эпитопы хорошо известны в данной области техники(см., например, публикацию заявки на патент США No. 2003/0153043; Международную публикацию No.WO 00/034317; и Sturniolo et al. (1999), Nature Biotech., 17: 555-61). В одной из форм осуществления настоящего изобретения последовательность ИЛ-12 р 40(258-266) человека была заменена последовательностью KDNTER (SEQ ID NO:17). Другими словами, Ser259, Lys260 и Arg261 были заменены на Asp, Asn иThr, соответственно, тогда как Lys263, Lys264 и Asp265 были делетированы, так что результирующая последовательность остатков 258-263 в варианте имеет вид KDNTER. Результирующий ИЛ-12 р 40 вариант изображен на фиг. 8. В другой форме осуществления настоящего изобретения последовательность ИЛ-12 р 40(258-266) человека была заменена на последовательность KDNTEGR (SEQ ID NO:18). Другими словами, Ser259,Lys260 и Arg261 были заменены на Asp, Asn и Thr, соответственно, тогда как Lys263, Lys264 и Asp265 были делетированы и заменены только остатком Gly, так что результирующая последовательность остатков 258-264 в данном варианте имеет вид KDNTEGR. KDNTER. Результирующий ИЛ-12 р 40 вариант изображен на фиг. 9. В еще одной форме осуществления изобретения последовательность ИЛ-12 р 40(258-266) человека-9 015338 была заменена на последовательность QDQDEKKDR (SEQ ID NO:19). Другими словами, Lys258, Ser259,Lys260 и Arg261 были заменены на Gln, Asp, Gln и Asp, соответственно, так что результирующая последовательность остатков 258-266 в данном варианте имеет вид QDQDEKKDR. Результирующий ИЛ 12 р 40 вариант изображен на фиг. 10. В следующей форме осуществления изобретения последовательность ИЛ-12 р 40(258-266) человека была заменена на последовательность QDQDESGDR (SEQ ID NO:20). Другими словами, Lys258, Ser259,Lys260, Arg261, Lys263 и Lys264 были заменены на Gln, Asp, Gln, Asp, Ser и Gly, соответственно, так что результирующая последовательность остатков 258-266 в данном варианте имеет вид QDQDESGDR. Результирующий ИЛ-12 р 40 вариант изображен на фиг. 11. В следующей форме осуществления изобретения D3-вариант находится в пределах ИЛ-12 р 40 субъединицы или ее активного участка. Под активным участком подразумевается то, что ИЛ-12 р 40 субъединица, содержащая D3-вариант, обладает по меньшей мере 10%-ной активностью в одной из форм осуществления изобретения, по меньшей мере 20%-ной активностью в другой форме осуществления изобретения, по меньшей мере 30%-ной активностью в другой форме осуществления изобретения, по меньшей мере 50%-ной активностью в другой форме осуществления изобретения, по меньшей мере 70%-ной активностью в другой форме осуществления изобретения, по меньшей мере 75%-ной активностью в другой форме осуществления изобретения, по меньшей мере 80%-ной активностью в другой форме осуществления изобретения, по меньшей мере 90%-ной активностью в другой форме осуществления изобретения,по меньшей мере 95%-ной активностью в другой форме осуществления изобретения, по меньшей мере 99%-ной активностью в другой форме осуществления изобретения, по меньшей мере 100%-ной активностью в другой форме осуществления изобретения, по меньшей мере 150%-ной активностью в другой форме осуществления изобретения, по меньшей мере 200%-ной активностью в другой форме осуществления изобретения, по меньшей мере 300%-ной активностью в другой форме осуществления изобретения, по меньшей мере 400%-ной активностью в другой форме осуществления изобретения, по меньшей мере 500%-ной активностью в другой форме осуществления изобретения, или, по меньшей мере 1000%ной активностью в другой форме осуществления изобретения, по сравнению с биологической активностью ИЛ-12 р 40 субъединицы дикого типа. Белки, содержащие варианты ИЛ-12 р 40 Варианты ИЛ-12 р 40 могут быть включены в белковые композиции вместо ИЛ-12 р 40 дикого типа. Примерами биологически активных белковых композиций, включающих ИЛ-12 р 40, являются гомодимеры р 40, ИЛ-12 и слитые белки, содержащие ИЛ-12, и ИЛ-23 и слитые белки, содержащие ИЛ-23. В одном из аспектов настоящего изобретения гетеродимер, состоящий из ИЛ-12 р 35/варианта р 40, состоит из раздельных полипептидных цепей. Альтернативно, гетеродимер, состоящий из ИЛ-12 р 35/варианта р 40,может состоять из одной полипептидной цепи. В другом аспекте настоящего изобретения гетеродимер,состоящий из ИЛ-23 р 19/варианта р 40, состоит из раздельных полипептидных цепей. Альтернативно,гетеродимер, состоящий из ИЛ-23 р 19/варианта р 40, может состоять из одной полипептидной цепи. В другом аспекте настоящего изобретения, будучи частью слитого белка на основе ИЛ-12, партнер ИЛ-12 по слиянию может быть молекулой антитела или частью молекулы антитела. Применимыми молекулами антител являются такие молекулы, которые доставляют слитый белок на основе ИЛ-12 в опухолевую среду, например - к самим опухолевым клеткам, или к некротическому ядру опухоли или к опорной строме. В другой форме осуществления настоящего изобретения партнером по слиянию является другой цитокин. Применимыми цитокинами являются, но не ограничиваются ими, ИЛ-2, ИЛ-7 и ИЛ 15. В следующем аспекте настоящего изобретения, будучи частью слитого белка на основе ИЛ-23,партнер ИЛ-23 по слиянию может быть молекулой антитела или частью молекулы антитела. Применимыми молекулами антител являются такие молекулы, которые доставляют слитый белок на основе ИЛ 23 в опухолевую среду, например - к самим опухолевым клеткам, или к некротическому ядру опухоли или к опорной строме. В другой форме осуществления настоящего изобретения партнером по слиянию является другой цитокин. Применимыми цитокинами являются, но не ограничиваются ими, ИЛ-2, ИЛ-7 и ИЛ-15. Нуклеиновые кислоты, кодирующие варианты р 40-субъединицы В следующем аспекте настоящего изобретения предусмотрены нуклеиновые кислоты, кодирующие полипептиды, содержащие варианты р 40-субъединицы. Нуклеиновые кислоты, кодирующие варианты р 40-субъединицы согласно настоящему изобретению, можно сконструировать, например, с использованием способов инженерии ДНК, известных специалистам в данной области техники. Примеры процедур можно найти в примере 1. Фиг. 19 изображает последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую р 40-субъединицу зрелого ИЛ-12 человека. Фиг. 20-22 изображают синтетические нуклеотидные фрагменты, кодирующие типичные мутации, обнаруживаемые в вариантах р 40-субъединицы согласно настоящему изобретению. Способы лечения с использованием вариантов р 40-субъединицы Варианты р 40-субъединицы, включая слитые белки и белки ИЛ-12 или ИЛ-23, содержащие вариант р 40-субъединицы согласно настоящему изобретению, можно использовать в качестве иммунотерапеви- 10015338 ческих средств, например, для лечения широкого спектра раковых заболеваний, на основании продемонстрированной противоопухолевой активности белков ИЛ-12. Например, варианты р 40-субъединицы согласно настоящему изобретению можно использовать, предпочтительно - в виде гетеродимера с р 35 субъединицей, для лечения раковых заболеваний, в том числе (но не ограничиваясь этим) рака почек,рака толстого кишечника, рака яичников, меланомы и Т-клеточной лимфомы, а также в качестве адъюванта для противораковых вакцин. Варианты р 40-субъединицы можно также использовать в качестве части р 40/р 40-гомодимера для снижения ТН 1 реакции (например, ТН 1 реакции, связанной с аутоиммунным заболеванием). Введение Варианты ИЛ-12, варианты ИЛ-23 и варианты р 40-субъъединицы согласно настоящему изобретению можно включить в состав фармацевтической композиции, пригодной для введения. Такие композиции обычно содержат вариант ИЛ-12 или слитый белок, содержащий вариант ИЛ-12, и фармацевтически приемлемый носитель. При использовании в контексте настоящего изобретения термин "фармацевтически приемлемый носитель" охватывает любые растворители, дисперсионные среды, покрытия, антибактериальные и противогрибковые агенты, изотонические и замедляющие абсорбцию агенты и т.п., совместимые с фармацевтическим введением. Использование таких сред и агентов для фармацевтически активных веществ хорошо известно в данной области техники. Фармацевтическую композицию согласно настоящему изобретению составляют так, чтобы она была совместимой с предполагаемым путем введения. Примерами путей введения являются парентеральное, например - внутривенное, интрадермальное, подкожное, оральное (например - посредством ингаляции), трансдермальное (местное), трансмукозальное и ректальное введение Растворы или суспензии, используемые для парентерального, интрадермального или подкожного введения, могут включать в себя следующие компоненты стерильный разбавитель, такой как вода для инъекций, физиологический раствор, нелетучие масла, полиэтиленгликоли, глицерин, пропиленгликоль или другие синтетические растворители, антибактериальные агенты, такие как бензиловый спирт или метилпарабены, антиоксиданты,такие как аскорбиновая кислота или натрия бисульфит, хелатирующие агенты, такие как этилендиаминтетрауксусная кислота, буферы, такие как ацетатный, цитратный или фосфатный буферы, и средства для регулирования тоничности, такие как хлорид натрия или декстроза. рН можно отрегулировать с использованием кислот или оснований, таких как хлористо-водородная кислота или гидроксид натрия. Препарат для парентерального введения может быть заключен в ампулы, одноразовые шприцы или флаконы,содержащие несколько доз, изготовленные из стекла или пластика. Медикаменты, содержащие варианты ИЛ-12, варианты ИЛ-23 или варианты р 40-субъединицы согласно настоящему изобретению, могут иметь концентрацию от 0,01 до менее чем 100% (вес./вес.), причем концентрация варьирует в зависимости от лекарственной формы медикаментов. Вводимая доза зависит от массы тела пациентов, степени тяжести заболевания, конкретного типа используемого варианта ИЛ-12 р 40 и мнения врача. Например, для варианта ИЛ-12 согласно настоящему изобретению обычно рекомендуется вводить от примерно 0,01 до примерно 10 мг/кг массы тела в день,от примерно 0,02 до примерно 2 мг/кг/день в случае инъекции, или примерно 0,5 мг/кг/день. Дозу можно вводить один или более раз в день в зависимости от тяжести заболевания и мнения врача. Для слитого белка, состоящего из антитела и ИЛ-12, или слитого белка, состоящего из антитела и ИЛ-23, которые содержат вариант ИЛ-12 р 40 согласно настоящему изобретению, обычно рекомендуется вводить от примерно 0,001 до примерно 1 мг/кг массы тела в день, от примерно 0,002 до примерно 0,5 мг/кг/день в случае инъекции, или примерно 0,1 мг/кг/день. Дозу можно вводить один или два раза за 2-, 3- или 4 недельный период, в зависимости от природы и тяжести заболевания и мнения врача. Различные аспекты настоящего изобретения далее будут проиллюстрированы приведенными ниже примерами. Описание примеров осуществления изобретения Пример 1. Клонирование вариантов р 40-субъединиц ИЛ-12 человека. Нуклеиновые кислоты, кодирующие варианты р 40-субъединицы согласно настоящему изобретению, более конкретно - варианты от p40V1 до p40V8 (SEQ ID NOS:6-13), были сконструированы с использованием стандартных способов получения рекомбинантных ДНК, известных специалистам в данной области техники. По существу, ДНК-кассета, кодирующая фрагмент, включающий в себя область,содержащую мутированные остатки аминокислот, и ограниченный стандартными сайтами рестрикции,была синтезирована de novo (Blue Heron Biotechnology, Bothell, WA), и ею был заменен соответствующий фрагмент последовательности дикого типа, содержащийся в экспрессирующей плазмиде, несущей р 40 последовательность (см., например, pNC-p40 в патенте США 6838260). Последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующей р 40-субъединицу зрелого (дикого типа) ИЛ-12 человека, приведена на фиг. 19. Таким способом были получены экспрессирующие плазмиды, кодирующие варианты р 40 субъединицы. Более конкретно, нуклеиновые кислоты, кодирующие p40V1 и p40V2, были получены следующим образом. Клонирующий вектор, содержащий ДНК-кассеты p40V1 и p40V2 (pBHV1V2) и синтезированный в виде непрерывного фрагмента, как показано на фиг. 20, был подвергнут расщеплению рестрикта- 11015338 зой Bpu10 I и либо рестриктазами Eco RI / Sca I, либо рестриктазой Bbs I, с получением EcoR I / Bpu10 I для V1) и Bbs I / Bpu10 I (для V2) кассет с концами, совместимыми с EcoR I / Bpu10 I, соответственно. Расщепление рестриктазой Sca I было включено для исключения V2-фрагмента сходного размера. Эти очищенные фрагменты клонировали в экспрессирующий вектор pNC-p40 посредством тройного лигирования с соответствующими Bpu10 I / Pvu I и Pvu I / Eco RI фрагментами, полученными из NC-p40. Идентичный подход был использован для получения нуклеиновых кислот, кодирующих p40V5 иp40V6, начиная с синтезированной последовательности, изображенной на фиг. 21, и для получения нуклеиновых кислот, кодирующих p40V7 и p40V8, начиная с синтезированной последовательности, изображенной на фиг. 23. Сходным образом, для получения нуклеиновых кислот, кодирующих p40V3 и p40V4 варианты,плазмиду (pBHV3V4), содержащую синтезированную последовательность, изображенную на фиг. 22,расщепляли рестриктазами EcoR I / Bbs I / Sca I (расщепление рестриктазой Sea I было включено для исключения V4-фрагмента сходного размера) или только рестриктазой Bbs I с получением EcoR I / Bbs I(для V3) и Bbs I (для V4) кассет, соответственно, причем каждая из кассет имела концы, совместимые с расщепленной рестриктазами EcoR I / Bbs I экспрессирующей плазмидой pNC-p40. Отметим, что для рестрицирующего фермента Bbs I распознаваемые и расщепляемые последовательности различны, и поэтому последовательности, содержащие несколько сайтов, распознаваемых рестриктазой Bbs I, могут генерировать различные, специфичные для каждой последовательности "тупые" концы. Затем V3 и V4 кассеты очищали посредством гель-фильтрации и лигировали, соответственно, в экспрессирующую плазмиду pNC-p40 посредством тройного лигирования с использованием соответствующих Bbs I / Pvu I и Pvu I / Eco RI фрагментов, полученных из pNC-p40. Такой же общий подход может быть использован для получения других молекул нуклеиновой кислоты, кодирующих другие варианты р 40-субъединицы, предусмотренные настоящим изобретением. Пример 2. Экспрессия вариантов р 40-субъединцы и слитых белков типа "антитело-ИЛ-12", содержащих варианты р 40-субъединицы. Для получения клеточных линий, экспрессирующих варианты р 40-субъединицы согласно настоящему изобретению были использованы стандартные способы (см. патент США 6838260). Экспрессирующие плазмиды pNC-p40, кодирующие варианты р 40-субъединицы, вводили в клетки, например клетки NS/0, посредством электропорации. Клетки засевали на чашки Петри и трансфицированные клетки отбирали на среде, содержащей G418. Супернатанты культур устойчивых к лекарственному препарату клонов анализировали на продукцию р 40 посредством твердофазного иммуноферментного анализаELISA, и наиболее активных продуцентов субклонировали и тестировали на предмет стабильности экспрессии. Для получения клеточных линий, экспрессирующих слитые белки типа "антитело-ИЛ-12", содержащие варианты р 40-субъединицы, использовали способ последовательной трансфекции, описанный в Патенте США 6838360. Например, слитый белок DI-NHS-IL12p40V1 был получен посредством дополнительной трансфекции клеточной линии, экспрессирующей p40V1, второй плазмидой(pdHL10lambdaDI-NHS-p35), кодирующей антитело NHS76, в котором С-конец константной области тяжелой цепи соединен с N-концом р 35-субъединицы ИЛ-12. Экспрессирующая плазмида pdHL10lambda является производной от pdHL7, в которой закодированный константный домен легкой цепи представляет собой лямбда-цепь. Клетки отбирали на среде, содержащей метотрексат, и стабильные трансфектанты,экспрессирующие слитые белки, содержащие антитело, клонировали стандартными способами. Пример 3. Очистка и определение характеристик вариантов р 40-субъединииы. Для того чтобы охарактеризовать целостность вариантов р 40-субъединицы p40V1, p40V2, p40V3 иp40V4 (SEQ ID NO:6-9), истощенные среды для культивирования клеток после культивирования дважды кратковременно трансфицированных NS-0 клеток, экспрессирующих эти варианты, собирали и обрабатывали для вестерн-блоттинга поликлональным anti-hu-p40 антителом, изображенным на фиг. 24. Контрольная р 40-субъединица дикого типа была использована в качестве контроля (дорожка 1). Было обнаружено, что расщепленные виды, утратившие С-терминальный фрагмент массой 6 кДа, который обычно хорошо разрешается у интактных видов р 40-субъединицы в этих условиях электрофореза (см. стрелку,указывающую на полосу в дорожке 1), отсутствовали во всех исследованных вариантах (дорожки 2-9), и удавалось обнаружить только интактную р 40-субъединицу. Таким образом, исследованные варианты р 40-субъединицы были устойчивыми к протеолитической активности, существующей во время экспрессии белка. Слитые белки на основе антитела, содержавшие варианты р 40-субъединицы ИЛ-12, выделяли из супернатанта культуры клеток с использованием стандартных способов, основанных на захвате антитела белком А (см. патент США 6838260). Результаты SDS-PAGE гель-электрофореза очищенных слитых белков, полученных из стабильных клонов NS-0 клеток и содержавших варианты р 40-субъединицы, представляющие собой последовательности SEQ ID6-13 (дорожки 1 - 8), или немутированный контроль (дорожка 9), приведены на фиг. 25. Средняя из трех основных полос представляет собой нерасщепленную р 40-субъединицу, при этом расположенная немного выше нечеткая полоса отображает более гликозилированные виды. Самая верхняя- 12015338 из основных полос представляет собой слитый белок, состоящий из тяжелой цепи антитела и р 35 субъединицы, а нижняя из основных полос представляет собой легкую цепь антитела. Было обнаружено,что, за исключением образца слитого белка, состоявшего из антитела и варианта p40V5 ИЛ-12, полоса с молекулярной массой 6 кДа везде отсутствовала. В случае варианта p40V5 ИЛ-12 наблюдалась остаточная полоса с молекулярной массой 6 кДа (дорожка 5). Пример 4. Определение характеристик сайта протеолитического расщепления в р 40-субъединице ИЛ-12 дикого типа. Идентичность загрязняющего белкового фрагмента с молекулярной массой, примерно равной 6 кДа, была определена стандартными способами. Коротко говоря, очищенный белок DI-NHS-IL12 денатурировали и восстанавливали в забуференном растворе 6 М гуанидина/1 мМ DTT при 55 С, после чего подвергали разделению посредством обратнофазной жидкостной хроматографии высокого давления на колонке Vydac C4 с градиентом ацетонитрила от 10 до 90%. Фракцию, соответствовавшую неидентифицированному виду белка, собирали, высушивали и ресуспендировали для прогона в SDS-PAGE геле, который подтвердил, что этот белок соответствовал фрагменту массой 6 кДа, и для определения последовательности аминокислот в пептиде посредством N-терминального секвенирования. Анализ последовательности выявил пептид с последовательностью REKKDRVFTD, который соответствует последовательности р 40-субъединицы зрелого (дикого типа) ИЛ-12 человека, начиная с Arg261. Пример 5. Биологическая активность белков ИЛ-12, содержащих варианты р 40-субъединицы. Биологическая активность белков ИЛ-12, содержащих варианты р 40-субъединицы, была измерена посредством индукции экспрессии интерферона-гамма (IFN ) мононуклеарными клетками периферической крови (РМВС) человека. Слитые белки Ab-IL-12, содержавшие антитело и варианты р 40 субъединицы p40V1-p40V8 сравнивали со слитыми белками Ab-IL-12, содержавшими р 40 субъединицу дикого типа и рекомбинантный белок ИЛ-12 человека. Анализ индукции IFN был выполнен, по существу, так как описано в работе Gately et al (1995),Current Protocols in Immunology, Section 6 16 4, и Kobayashi et al (1989), J Exp Med, 170 827-845 Мононуклеарные клетки периферической крови (РМВС) культивировали с фитогемагглютинином (РНА-Р) в течение 3 дней, после чего еще на 24 ч к ним добавляли 25 МЕд/мл ИЛ-2 человека (производства компанииRD Systems, Миннеаполис, Миннесота). Клетки промывали, ко всем клеткам добавляли 20 МЕд/мл ИЛ 2, а затем - слитые белки, содержавшие ИЛ-12, в виде серии двукратных разведений, начиная с концентрации 20 нг/мл (в пересчете на относительную массовую долю ИЛ-12 в молекуле). Через 24 ч измеряли концентрацию IFN посредством твердофазного иммуноферментного анализа ELISA с использованием парных антител, закупленных в компании RD Systems. Результаты двух раздельных экспериментов, в которых были использованы РМВС от различных доноров, суммированы в табл. 1. Таблица 1. Биологическая активность Ab-IL12 вариантов, определенная в анализе индукции IFN- 13015338 По сравнению с рекомбинантным ИЛ-12 человека, активность Ab-IL12 с р 40-субъединицей дикого типа была снижена примерно в 10 раз. Было обнаружено, что исследованные белки, состоявшие из антитела и варианта ИЛ-12, не оказывали достоверного дополнительного влияния на активность белка. Слитые белки от Ab-IL12p40V1 до Ab-IL12p40V8 обладали несколько сниженной активностью (примерно в 1,5-3 раза), по сравнению со слитым белком, состоявшим из соответствующего антитела и ИЛ-12 дикого типа. Пример 6. Фармакокинетика белков ИЛ-12, содержащих варианты р 40-субъединицы. Была определена фармакокинетика слитых белков, содержавших антитело и варианты р 40 субъединицы. Эксперименты были выполнены с использованием стандартных способов, известных специалистам в данной области техники. Коротко говоря, мышам линии BALB/c (n=3 в каждой группе, получавшей определенный препарат) инъецировали по 25 мкг слитых белков Ab-IL12 или вариантов AbIL12, содержавших варианты p40V1, p40V2, p40V3, p40V4, p40V5, p40V6, p40V7 и p40V8, в объеме, равном 0,2 мл, либо внутривенно в хвостовую вену, либо подкожно. В различные моменты времени в течение 24 и 96 ч, соответственно, небольшие объемы крови получали посредством ретроорбитального кровопускания и собирали в пробирки с гепариновым покрытием для предотвращения свертывания. После центрифугирования с целью удаления клеток плазму анализировали посредством связывания с HL антисывороткой к IgG человека и обнаружения с использованием антитела к ИЛ-12 человека. Результаты нормализовали к начальной концентрации в плазме каждой мыши, полученной через 30 с после инъекции (t = 0). Фиг. 26 представляет собой компиляцию репрезентативных экспериментов по анализу фармакокинетики внутривенно введенного белка. Было обнаружено, что по сравнению с контрольным белком дикого типа слитые белки, состоявшие из антитела и ИЛ-12 и содержавшие варианты p40V1, p40V2,p40V3, p40V4 и p40V6, обладали значительно лучшими фармакокинетическими характеристиками. Более конкретно, было обнаружено, что время полувыведения в фазе распределения (альфа-фазе) примерно удваивалось, и соответственно также удваивалась площадь под кривой "концентрация-время" (AUC). Однако фазы выведения (бета-фазы) у всех слитых белков Ab-IL-12 оставались примерно одинаковыми. Эти результаты совпадают с данными по фармакокинетике тех же белков при подкожном введении мышам. Фиг. 27, панель А, демонстрирует сравнение Ab-IL-12 дикого типа с вариантами Ab-IL-12, содержащими р 40 V1, р 40 V2, р 40 V3 и р 40 V4, а панель В демонстрирует сравнение Ab-IL-12 дикого типа с вариантами Ab-IL-12, содержащими р 40 V5, р 40 V6, р 40 V7 и р 40 V8. Пример 7. Лечение людей вариантами ИЛ-12 р 40. Варианты ИЛ-12 р 40 согласно настоящему изобретению были использованы для профилактики и лечения болезней и расстройств у людей следующим образом. В целом, предпочтительным способом введения являются внутривенная инфузия или внутривенная инъекция, а также подкожная инъекция,ингаляция, хотя возможны и оральное введение и другие способы. Пациентов с продвинутым метастатическим раком предстательной железы и со стандартной химиотерапией в анамнезе лечат слитым белком, состоящим из антитела и ИЛ-12, содержащего вариант ИЛ 12 р 40. Доза слитого белка, состоящего из антитела и ИЛ-12, на цикл лечения составляет примерно 150 микрограммов на кг массы тела, и ее можно ввести за один день или за два-три последовательных дня посредством капельной инфузии. Лечение можно сочетать со стандартным лечением рака предстательной железы, которое определено лечащим врачом как подходящее для пациента. Также назначают нестероидные противовоспалительные средства, например - Naproxen. Циклы лечения повторяют примерно через каждые три недели. Пациентов с устойчивым к гормонам раком молочной железы лечат посредством капельной инфузии слитого белка, состоящего из антитела и ИЛ-12, содержащего вариант ИЛ-12 р 40. Также назначают нестероидные противовоспалительные средства, например - Naproxen. При альтернативной стратегии лечения пациентов с продвинутым гормон-резистентным раком предстательной железы или продвинутым гормон-резистентным раком молочной железы лечат слитым белком, состоящим из антитела и ИЛ-12, содержащего вариант ИЛ-12 р 40, примерно один раз в три недели в комбинации с содержащим ИЛ-2 иммуноцитокином, например - KS-IL2. Эти два агента можно вводить совместно путем капельной инфузии. Перед лечением пациенты получают иммуностимулирующее количество циклофосфамида. Также назначают нестероидные противовоспалительные средства, например Naproxen . Пациентов с ревматоидным артритом лечат слитым белком Fc-p40, в котором р 40-субъединица является вариантом ИЛ-12 р 40, примерно один раз в две недели в дозе, примерно равной 8 мг/кг, используя введение посредством капельной инфузии. Было обнаружено, что прогрессирование деструкции сустава значительно замедляется при монотерапии, даже при сравнении с модифицирующими заболевание антиревматическими препаратами.