Новые маркеры для пренатальной диагностики и мониторинга
Номер патента: 14274
Опубликовано: 29.10.2010
Авторы: Ли Треси Йуэн Хан, Чим Стивен Сиу Чунг, Ло Йук Минг Деннис, Чиу Росса Вай Квун, Цзин Шэнгнан, Лун Фиона Миу Фун, Динг Чунминг
Формула / Реферат
1. Способ детектирования или мониторинга ассоциированного с беременностью нарушения у беременной женщины, предусматривающий стадии:
(a) получения биологической пробы от женщины, где этой пробой является цельная кровь, сыворотка, плазма, моча или слюна;
(b) определения статуса метилирования CpG-содержащей геномной последовательности в этой пробе, где эта геномная последовательность у плода и эта геномная последовательность у женщины являются дифференциально (различно) метилированными, с различением посредством этого этой геномной последовательности у женщины и этой геномной последовательности у плода в этой пробе, где эта геномная последовательность имеет длину по меньшей мере 15 нуклеотидов, содержит по меньшей мере один цитозин и находится в районе хромосомы 21 и где этот район состоит из (1) геномного локуса, выбранного из группы, состоящей из CGI137, фосфодиэстеразы 9А (PDE9A), протеинфосфатазы 1 homo sapiens, псевдогена 2 регуляторной (ингибиторной) субьединицы 2 (PPP1R2P2), сходства с Fem1A (Caenorhabditis elegans), CGI009, карбонилредуктазы 1 (CBR1), молекулы адгезии клеток синдрома Дауна (DSCAM), открытой рамки считывания 29 хромосомы 21 (C21orf29), голокарбоксилазы-синтетазы (HLCS) и CGI132; и (2) последовательности ДНК не более 10 т.п.н. слева и/или справа от этого локуса;
(c) определения уровня этой геномной последовательности у плода;
d) сравнения уровня этой геномной последовательности у плода со стандартным контролем, где увеличение или уменьшение от этого стандартного контроля указывает на присутствие или прогрессирование ассоциированного с беременностью нарушения.
2. Способ по п.1, в котором эта геномная последовательность у женщины является метилированной, а эта геномная последовательность у плода является неметилированной.
3. Способ по п.1, в котором эта геномная последовательность у женщины является неметилированной, а эта геномная последовательность у плода является метилированной.
4. Способ по п.1, в котором стадию (b) выполняют обработкой пробы реагентом, который дифференциально модифицирует метилированную и неметилированную ДНК.
5. Способ по п.4, в котором этот реагент содержит бисульфит.
6. Способ по п.4, в котором этот реагент содержит один или несколько ферментов, которые предпочтительно расщепляют метилированную ДНК.
7. Способ по п.4, в котором этот реагент содержит один или несколько ферментов, которые предпочтительно расщепляют неметилированную ДНК.
8. Способ по п.1, в котором стадию (b) выполняют с использованием специфической в отношении метилирования ПЦР.
9. Способ детектирования или мониторинга ассоциированного с беременностью нарушения у беременной женщины, предусматривающий стадии:
(a) получения ДНК в биологической пробе у женщины, где этой пробой является цельная кровь, сыворотка, плазма, моча или слюна;
(b) обработки ДНК из стадии (а) бисульфитом и
(c) выполнения реакции амплификации с использованием ДНК из стадии (b) и двух праймеров для амплификации CpG-содержащей геномной последовательности, где эта геномная последовательность имеет длину по меньшей мере 15 нуклеотидов, содержит по меньшей мере один цитозин и находится в районе хромосомы 21 и где этот район состоит из (1) геномного локуса, выбранного из группы, состоящей из CGI137, фосфодиэстеразы 9А (PDE9A), протеинфосфатазы 1 homo sapiens, псевдогена 2 регуляторной (ингибиторной) субъединицы 2 (PPP1R2P2), сходства с Fem1A (Caenorhabditis elegans), CGI009, карбонилредуктазы 1 (CBR1), молекулы адгезии клеток синдрома Дауна (DSCAM), открытой рамки считывания 29 хромосомы 21 (C21orf29), голокарбоксилазы-синтетазы (HLCS) и CGI132; и (2) последовательности ДНК не более 10 т.п.н. слева и/или справа от этого локуса; и где по меньшей мере один из этих двух праймеров связывается дифференциально с геномной последовательностью у плода; и
(d) сравнения уровня амплифицированной части геномной последовательности из стадии (с) со стандартным контролем, где увеличение или уменьшение от стандартного контроля указывает на присутствие или прогрессирование ассоциированного с беременностью нарушения.
10. Способ по п.9, в котором этой реакцией амплификации является полимеразная цепная реакция (ПЦР).
11. Способ по п.9, в котором этой реакцией амплификации является специфическая в отношении метилирования ПЦР.
12. Способ по п.9, в котором этой реакцией амплификации является амплификация на основе последовательности нуклеиновой кислоты.
13. Способ по п.9, в котором этой реакцией амплификации является реакция вытеснения цепи.
14. Способ по п.9, в котором этой реакцией амплификации является реакция амплификации разветвленной ДНК.
15. Способ по п.1 или 9, в котором ассоциированным с беременностью нарушением является преэклампсия.
16. Способ по п.1 или 9, в котором ассоциированным с беременностью нарушением являются преждевременные роды.
17. Способ по п.1 или 9, в котором ассоциированным с беременностью нарушением является неукротимая рвота беременных (hyperemesis gravidarum).
18. Способ по п.1 или 9, в котором ассоциированным с беременностью нарушением является внематочная (эктопическая) беременность.
19. Способ по п.1 или 9, в котором ассоциированным с беременностью нарушением является хромосомная анеуплоидия.
20. Способ по п.1 или 9, в котором ассоциированным с беременностью нарушением является трисомия 21.
21. Способ по п.1 или 9, в котором ассоциированным с беременностью нарушением является задержка внутриутробного развития (плода).
22. Способ детектирования и мониторинга ассоциированного с беременностью нарушения, предусматривающий стадии:
(a) получения ДНК в биологической пробе от женщины, где этой пробой является цельная кровь, сыворотка, плазма, моча или слюна;
(b) обработки ДНК из стадии (а) реагентом, который дифференциально модифицирует метилированную и неметилированную ДНК;
(c) определения нуклеотидной последовательности CpG-содержащей геномной последовательности из стадии (b), где эта геномная последовательность имеет длину по меньшей мере 15 нуклеотидов, содержит по меньшей мере один цитозин и находится в районе хромосомы 21 и где этот район состоит из (1) геномного локуса, выбранного из группы, состоящей из CGI137, фосфодиэстеразы 9A (PDE9A), протеинфосфатазы 1 homo sapiens, псевдогена 2 регуляторной (ингибиторной) субъединицы 2 (PPP1R2P2), сходства с Fem1A (Caenorhabditis elegans), CGI009, карбонилредуктазы 1 (CBR1), молекулы адгезии клеток синдрома Дауна (DSCAM), открытой рамки считывания 29 хромосомы 21 (C21orf29), голокарбоксилазы-синтетазы (HLCS) и CGI132; и (2) последовательности ДНК не более 10 т.п.н. слева и/или справа от этого локуса; и
(d) сравнения профиля нуклеотидной последовательности из стадии (с) со стандартным контролем, где изменение в этом профиле от стандартного контроля указывает на присутствие или прогрессирование ассоциированного с беременностью нарушения.
23. Способ по п.22, в котором этот реагент содержит бисульфит.
24. Способ по п.22, в котором этот реагент содержит один или несколько ферментов, которые предпочтительно расщепляют метилированную ДНК.
25. Способ по п.22, в котором этот реагент содержит один или несколько ферментов, которые предпочтительно расщепляют неметилированную ДНК.
26. Способ по п.22, дополнительно предусматривающий стадию амплификации с использованием ДНК из стадии (b) и двух праймеров для амплификации этой геномной последовательности.
27. Способ по п.26, в котором стадию амплификации выполняют с использованием ПЦР.
28. Способ по п.26, в котором стадию амплификации выполняют с использованием специфической в отношении метилирования ПЦР.
29. Способ по п.22, в котором стадию (с) выполняют при помощи масс-спектрометрии.
30. Способ по п.22, в котором стадию (с) выполняют удлинением праймера.
31. Способ по п.22, в котором стадию (с) выполняют гибридизацией полинуклеотидов.
32. Способ по п.22, в котором стадию (с) выполняют с использованием ПЦР реального времени.
33. Способ по п.22, в котором стадию (с) выполняют при помощи электрофореза.
34. Способ детектирования трисомии 21 в плоде беременной женщины, предусматривающий стадии:
(a) получения биологической пробы у женщины, где этой пробой является цельная кровь, сыворотка, плазма, моча или слюна;
(b) обработки пробы из стадии (а) реагентом, который дифференциально модифицирует метилированную и неметилированную ДНК;
(c) анализа аллелей CpG-содержащей геномной последовательности, где эта геномная последовательность имеет длину по меньшей мере 15 нуклеотидов, содержит по меньшей мере один цитозин и находится в районе хромосомы 21 и где этот район состоит из (1) геномного локуса, выбранного из группы, состоящей из CGI137, фосфодиэстеразы 9А (PDE9A), протеинфосфатазы 1 homo sapiens, псевдогена 2 регуляторной (ингибиторной) субъединицы 2 (PPP1R2P2), сходства с Fem1A (Caenorhabditis elegans), CGI009, карбонилредуктазы 1 (CBR1), молекулы адгезии клеток синдрома Дауна (DSCAM), открытой рамки считывания 29 хромосомы 21 (C21orf29), голокарбоксилазы-синтетазы (HLCS) и CGI132; и (2) последовательности ДНК не более 10 т.п.н. слева и/или справа от этого локуса; и
(d) определения отношения аллелей, где отклонение от отношения аллелей женщины, несущей плод, не имеющий трисомии 21, указывает на трисомию 21 у этого плода.
35. Способ по п.34, в котором этот реагент содержит бисульфит.
36. Способ по п.34, в котором этот реагент содержит один или несколько ферментов, которые предпочтительно расщепляют метилированную ДНК.
37. Способ по п.34, в котором этот реагент содержит один или несколько ферментов, которые предпочтительно расщепляют неметилированную ДНК.
38. Способ по п.34, дополнительно предусматривающий стадию амплификации после стадии (b) для амплификации метилированной или неметилированной геномной последовательности.
39. Способ по п.38, в котором эту стадию амплификации выполняют с использованием ПЦР.
40. Способ по п.38, в котором эту стадию амплификации выполняют с использованием специфической в отношении метилирования ПЦР.
41. Способ по п.34, в котором стадию (с) выполняют при помощи масс-спектрометрии.
42. Способ по п.34, в котором стадию (с) выполняют анализом удлинения праймера.
43. Способ по п.34, в котором стадию (с) выполняют с использованием ПЦР реального времени.
44. Способ по п.34, в котором стадию (с) выполняют гибридизацией полинуклеотидов.
45. Способ по п.34, в котором стадию (с) выполняют при помощи электрофореза.
46. Способ по п.34, в котором два разных аллеля этой геномной последовательности у плода содержат полиморфизм единственного нуклеотида, полиморфизм инсерции-делеции или полиморфизм простой тандемной дупликации.
47. Способ детектирования или мониторинга ассоциированного с беременностью нарушения у беременной женщины, предусматривающий стадии:
(a) получения биологической пробы у женщины, где этой пробой является цельная кровь, сыворотка, плазма, моча или слюна;
(b) определения уровня CpG-содержащей геномной последовательности в этой пробе, где эта геномная последовательность имеет длину по меньшей мере 15 нуклеотидов, содержит по меньшей мере один неметилированный цитозин и находится в районе на хромосоме 21 и где этот район состоит из (1) геномного локуса, выбранного из группы, состоящей из CGI137, фосфодиэстеразы 9A (PDE9A), протеинфосфатазы 1 homo sapiens, псевдогена 2 регуляторной (ингибиторной) субъединицы 2 (PPP1R2P2) и сходства с Fem1A (Caenorhabditis elegans); и (2) последовательности ДНК не более 10 т.п.н. слева и/или справа от этого локуса; и
(с) сравнения этого уровня геномной последовательности со стандартным контролем, где увеличение или уменьшение от стандартного контроля указывает на присутствие или прогрессирование ассоциированного с беременностью нарушения.
48. Способ детектирования или мониторинга ассоциированного с беременностью нарушения у беременной женщины, предусматривающий стадии:
(a) получения биологической пробы у женщины, где этой пробой является цельная кровь, сыворотка, плазма, моча или слюна;
(b) определения уровня CpG-содержащей геномной последовательности в этой пробе, где эта геномная последовательность имеет длину по меньшей мере 15 нуклеотидов, содержит по меньшей мере один метилированный цитозин и находится в районе на хромосоме 21 и где этот район состоит из (1) геномного локуса, выбранного из группы, состоящей из CGI009, карбонилредуктазы 1 (CBR1), молекулы адгезии клеток синдрома Дауна (DSCAM), открытой рамки считывания 29 хромосомы 21 (C21orf29), голокарбоксилазы-синтетазы (HLCS) и CGI132; и (2) последовательности ДНК не более 10 т.п.н. слева и/или справа от этого локуса; и
(c) сравнения этого уровня геномной последовательности со стандартным контролем, где увеличение или уменьшение от стандартного контроля указывает на присутствие или прогрессирование ассоциированного с беременностью нарушения.
49. Способ по п.47 или 48, в котором стадия (b) предусматривает обработку ДНК, присутствующей в пробе крови, реагентом, который дифференциально модифицирует метилированный и неметилированный цитозин.
50. Способ по п.49, в котором этот реагент содержит бисульфит.
51. Способ по п.49, в котором этот реагент содержит один или несколько ферментов, которые предпочтительно расщепляют ДНК, содержащую метилированный цитозин.
52. Способ по п.49, в котором этот реагент содержит один или несколько ферментов, которые предпочтительно расщепляют ДНК, содержащую неметилированный цитозин.
53. Способ по п.47 или 48, в котором стадия (b) включает в себя реакцию амплификации.
54. Способ по п.53, в котором стадией амплификации является полимеразная цепная реакция (ПЦР).
55. Способ по п.54, в котором этой ПЦР является специфическая в отношении метилирования ПЦР.
56. Способ по п.53, в котором этой реакцией амплификации является амплификация на основе последовательности нуклеиновой кислоты.
57. Способ по п.53, в котором этой реакцией амплификации является реакция вытеснения цепи.
58. Способ по п.53, в котором этой реакцией амплификации является реакция амплификации разветвленной ДНК.
59. Способ по п.47 или 48, в котором уровень геномной последовательности ДНК определяют электрофорезом.
60. Способ по п.47 или 48, в котором уровень геномной последовательности ДНК определяют гибридизацией полинуклеотидов.
61. Способ по п.47 или 48, где ассоциированным с беременностью нарушением является преэклампсия.
62. Способ по п.47 или 48, в котором ассоциированным с беременностью нарушением являются преждевременные роды.
63. Способ по п.47 или 48, в котором ассоциированным с беременностью нарушением является неукротимая рвота беременных (hyperemesis gravidarum).
64. Способ по п.47 или 48, в котором ассоциированным с беременностью нарушением является внематочная (эктопическая) беременность.
65. Способ по п.47 или 48, в котором ассоциированным с беременностью нарушением является трисомия 21.
66. Способ по п.47 или 48, в котором ассоциированным с беременностью нарушением является задержка внутриутробного развития (плода).
67. Способ по пп.1, 9, 22, 34, 47 или 48, в котором этой геномной последовательностью является CpG-островок (ЦГ-островок).
Текст
НОВЫЕ МАРКЕРЫ ДЛЯ ПРЕНАТАЛЬНОЙ ДИАГНОСТИКИ И МОНИТОРИНГА Это изобретение обеспечивает применение новых фетальных маркеров для пренатальной диагностики и мониторинга некоторых связанных с беременностью состояний. Более конкретно, это изобретение относится к обнаружению, что некоторые CpG-островки, расположенные на фетальной хромосоме 21, демонстрируют профиль метилирования, который отличается от профиля метилирования соответствующих CpG-островков, расположенных на материнской хромосоме 21. Эта заявка обеспечивает также наборы для диагностики или мониторинга релевантных состояний. Ло Йук Минг Деннис, Чиу Росса Вай Квун,Чим Стивен Сиу Чунг, Динг Чунминг,Цзин Шэнгнан, Ли Треси Йуэн Хан, Лун Фиона Миу Фун (CN)(71)(73) Заявитель и патентовладелец: ТЕ ЧАЙНИЗ ЮНИВЕРСИТИ ОВ ГОНГКОНГ (CN) 014274 Родственные заявки Эта заявка претендует на приоритет относительно предварительной заявки на патент США 60/797456, поданной 3 мая 2006 года, содержание которой включено сюда в качестве ссылки в полном виде. Предшествующий уровень техники Раннее обнаружение связанных с беременностью состояний, в том числе потенциальных осложнений во время беременности или родов и генетические дефекты плода, имеет решающее значение, так как оно делает возможным раннее медицинское вмешательство, необходимое для безопасности как матери,так и плода. Пренатальную диагностику проводили с использованием клеток, выделенных у плода посредством таких процедур, как взятие проб ворсинок хориона (CVS) или чрезбрюшинный амниоцентез. Однако эти общепринятые способы являются инвазивными и представляют понятный риск как для матери, так и для плода, несмотря на самое осторожное выполнение (Tabor et al., Lancet, 1:1287-1293, 1986). Были разработаны альтернативы этим инвазивным подходам для пренатального скрининга, например для определения отклонений от нормы плода, после обнаружений, что несколько типов фетальных клеток могут быть обнаружены в кровотоке матери (Johansen et al., Prenat. Diagn., 15:921-931, 1995) и,что более важно, циркулирующая бесклеточная фетальная ДНК может быть детектирована в материнской плазме и сыворотке (Lo et al., Lancet, 350:485-487, 1997). Было показано, что количество фетальной ДНК является достаточным для генетического анализа без сложной обработки плазмы или сыворотки в противоположность альтернативным способам, требующим стадий выделения и обогащения фетальных клеток. Резус D (RhD)-генотипирование плода (Lo et al., N. Engl. J. Med., 339:1734-1738, 1998), определение пола плода (Costa et al., N. Engl. J. Med., 346:1502, 2002) и диагностика нескольких нарушений плода(Amicucci et al., Clin. Chern., 46:301-302, 2000; Saito et al., Lancet, 356:1170, 2000 и Chiu et al., Lancet,360:998-1000, 2002) были с тех пор достигнуты посредством детектирования фетальной ДНК в материнской плазме или сыворотке с использованием способа, основанного на полимеразной цепной реакции(ПЦР). Кроме того, сообщались количественные отклонения от нормы фетальной ДНК в материнской плазме/сыворотке в преэклампсии (Lo et al., Clin. Chem., 45:184-188, 1999 и Zhong et al., Am. J. Obstet.al., Prenat. Diagn., 20:795-798, 2000) и в неукротимой рвоте беременных (Sekizawa et al., Clin. Chem.,47:2164-2165, 2001). Детектирование фетальной нуклеиновой кислоты в материнской крови для пренатального генетического анализа описано также в патенте США 6258540. Фетальная РНК, присутствующая в материнской крови, также была установлена в качестве диагностического инструмента для связанных с беременностью состояний. Например, заявка на патент США 09/876005 описывает неинвазивные способы, основанные на детектировании фетальной РНК в материнской крови; заявка на патент США 10/759783 дополнительно описывает, что количество определенных разновидностей мРНК (например, hCG-, hCRH, hPL, KISS1, TPFI2 и PLAC1), присутствующее в материнской крови, может быть использовано в качестве маркеров для диагностики, мониторинга или предсказания связанных с беременностью нарушений, таких как преэклампсия, фетальная хромосомная анеуплоидия и преждевременные роды. Хотя стабильность ДНК обеспечивает преимущество для диагностики на основе фетальной ДНК,для этого подхода существует один основной недостаток: как фетальная, так и материнская ДНК присутствуют в бесклеточной части крови беременной женщины, например сыворотке или плазме. Таким образом, существует необходимость отличия фетальной ДНК от материнской ДНК для гарантии точного диагноза. В заявке на патент США 09/944951, опубликованной как 20030044388, впервые было описано,что фетальная и материнская DNA могут различаться по их разному профилю метилирования. Landes etal. в публикации патента США 20030211522 также предположили, что маркеры дифференциального(различного) метилирования могут быть использованы для пренатальной диагностики. В данном описании ряд последовательностей геномной ДНК человека, локализованных на хромосоме 21, идентифицированы впервые как локусы, содержащие районы, дифференциально (различно) метилированные в геномной ДНК, происходящей у плода или у взрослого (например, беременной женщины). Таким образом,эти дифференциально (различно) метилированные геномные локусы позволяют правильно идентифицировать и определить количественно фетальную и материнскую ДНК и, следовательно, надежно диагностировать пренатальные состояния. Сущность изобретения В первом аспекте этого изобретения обеспечен способ детектирования или мониторинга ассоциированного с беременностью нарушения у беременной женщины. Этот способ предусматривает следующие стадии: (а) получения биологической пробы от женщины, где этой пробой является цельная кровь,сыворотка, плазма, моча или слюна; (b) определения статуса метилирования CpG-содержащей геномной последовательности в этой пробе, где эта геномная последовательность у плода и эта геномная последовательность у женщины являются дифференциально (различно) метилированными, с различением посредством этого этой геномной последовательности у женщины и этой геномной последовательности у плода в этой пробе, где эта геномная последовательность имеет длину по меньшей мере 15 нуклеотидов,-1 014274 содержит по меньшей мере один цитозин и находится в районе хромосомы 21 и где этот район состоит из (1) геномного локуса, выбранного из группы, состоящей из CGI137, фосфодиэстеразы 9 А (PDE9A),протеинфосфатазы 1 homo sapiens, псевдогена 2 регуляторной (ингибиторной) субъединицы 2(PPP1R2P2), сходства с Fem1A (Caenorhabditis elegans), CGI009, карбонилредуктазы 1 (CBR1), молекулы адгезии клеток синдрома Дауна (DSCAM), открытой рамки считывания 29 хромосомы 21 (C21orf29),голокарбоксилазы-синтетазы (HLCS) и CGI132; (2) последовательности ДНК не более 10 т.п.н. слева и/или справа от этого локуса; (с) определения уровня этой геномной последовательности у плода и (d) сравнения уровня этой геномной последовательности у плода со стандартным контролем, где увеличение или уменьшение от стандартного контроля указывает на присутствие или прогрессирование ассоциированного с беременностью нарушения. В некоторых вариантах осуществления эта геномная последовательность у женщины является метилированной, а эта геномная последовательность у плода является неметилированной. В других варианте осуществления эта геномная последовательность у женщины является неметилированной, а эта геномная последовательность у плода является метилированной. В некоторых вариантах осуществления стадию (b) выполняют обработкой пробы реагентом, который дифференциально модифицирует метилированную и неметилированную ДНК. Например, этот регант может содержать один или несколько ферментов, которые преимущественно расщепляют метилированную ДНК; или этот реагент может содержать один или несколько ферментов, которые преимущественно расщепляют неметилированную ДНК. В некоторых вариантах осуществления стадию (b) выполняют при помощи специфической в отношении метилирования ПЦР. Во втором аспекте этого изобретения обеспечен способ детектирования или мониторинга ассоциированного с беременностью нарушения у беременной женщины. Этот способ предусматривает стадии:(а) получения ДНК в биологической пробе у женщины, где этой пробой является цельная кровь,сыворотка, плазма, моча или слюна;(b) обработки ДНК из стадии (а) бисульфитом и(с) выполнения реакции амплификации с использованием ДНК из стадии (b) и двух праймеров для амплификации CpG-содержащей геномной последовательности, где эта геномная последовательность имеет длину по меньшей мере 15 нуклеотидов, содержит по меньшей мере один цитозин и находится в районе хромосомы 21 и где этот район состоит из (1) геномного локуса, выбранного из группы, состоящей из CGI137, фосфодиэстеразы 9A (PDE9A), протеинфосфатазы 1 homo sapiens, псевдогена 2 регуляторной (ингибиторной) субъединицы 2 (PPP1R2P2), сходства с Fem1A (Caenorhabditis elegans), CGI009,карбонилредуктазы 1 (CBR1), молекулы адгезии клеток синдрома Дауна (DSCAM), открытой рамки считывания 29 хромосомы 21 (C21orf29), голокарбоксилазы-синтетазы (HLCS) и CGI132; и (2) последовательности ДНК не более 10 т.п.н. слева и/или справа от этого локуса, и где по меньшей мере один из этих двух праймеров связывается дифференциально с геномной последовательностью у плода; и(d) сравнения уровня амплифицированной части этой геномной последовательности из стадии (с) со стандартным контролем, где увеличение или уменьшение от стандартного контроля указывает на присутствие или прогрессирование ассоциированного с беременностью нарушения. В некоторых вариантах осуществления этой реакцией амплификации является полимеразная цепная реакция (ПЦР), например специфическая в отношении метилирования ПЦР. В других вариантах осуществления этой реакцией амплификации является амплификация на основе последовательности нуклеиновой кислоты, реакция вытеснения цепи или реакция амплификации разветвленной ДНК. Этот способ, так же как и способ, описанный в первом аспекте этого изобретения, пригоден для детектирования или мониторинга таких состояний, как преэклампсия, преждевременные роды, неукротимая рвота беременных, эктопическая (внематочная) беременность, хромосомная анеуплоидия (например,трисомия 21) и задержка внутриутробного развития плода. В третьем аспекте этого изобретения обеспечен способ детектирования и мониторинга ассоциированного с беременностью нарушения. Этот способ содержит стадии (а) получения ДНК в биологической пробе у женщины, где этой пробой является цельная кровь, сыворотка, плазма, моча или слюна; (b) обработки ДНК из стадии (а) реагентом, который дифференциально модифицирует метилированную и неметилированную ДНК; (с) определения нуклеотидной последовательности CpG-содержащей геномной последовательности из стадии (b), где эта геномная последовательность имеет длину по меньшей мере 15 нуклеотидов, содержит по меньшей мере один цитозин и находится в районе хромосомы 21 и где этот район состоит из (1) геномного локуса, выбранного из группы, состоящей из CGI137, фосфодиэстеразы 9 А (PDE9A), протеинфосфатазы 1 homo sapiens, псевдогена 2 регуляторной (ингибиторной) субъединицы 2 (PPP1R2P2), сходства с Fem1A (Caenorhabditis elegans), CGI009, карбонилредуктазы 1 (CBR1), молекулы адгезии клеток синдрома Дауна (DSCAM), открытой рамки считывания 29 хромосомы 21(C21orf29), голокарбоксилазы-синтетазы (HLCS) и CGI132; и (2) последовательности ДНК не более 10 т.п.н. слева и/или справа от этого локуса; и (d) сравнения профиля нуклеотидной последовательности из стадии (с) со стандартным контролем, где изменение в этом профиле от стандартного контроля указывает на присутствие или прогрессирование ассоциированного с беременностью нарушения. В некоторых вариантах осуществления этот реагент содержит бисульфит; или этот реагент может-2 014274 содержать один или несколько ферментов, которые преимущественно расщепляют метилированную ДНК; или этот реагент может содержать один или несколько ферментов, которые преимущественно расщепляют неметилированную ДНК. В некоторых вариантах осуществления этот способ может дополнительно содержать стадию амплификации с использованием ДНК из стадии (b) и двух праймеров для амплификации этой геномной последовательности. Например, эта стадия амплификации может выполняться при помощи ПЦР, такой как специфическая в отношении метилирования ПЦР. В некоторых вариантах осуществления стадию (с) выполняют масс-спектрометрией. В других вариантах осуществления стадию (с) выполняют удлинением праймеров. Другой возможный способ проведения стадии (с) включает в себя гибридизацию полинуклеотидов, применение ПЦР реального времени и применение электрофореза. В четвертом аспекте этого изобретения обеспечен способ детектирования трисомии 21 у плода беременной женщины. Этот способ предусматривает стадии (а) получения биологической пробы у женщины, где этой пробой является цельная кровь, сыворотка, плазма, моча или слюна; (b) обработки ДНК из стадии (а) реагентом, который дифференциально модифицирует метилированную и неметилированную ДНК; (с) анализа аллелей CpG-содержащей геномной последовательности, где эта геномная последовательность имеет длину по меньшей мере 15 нуклеотидов, содержит по меньшей мере один цитозин и находится в районе хромосомы 21 и где этот район состоит из (1) геномного локуса, выбранного из группы, состоящей из CGI137, фосфодиэстеразы 9 А (PDE9A), протеинфосфатазы 1 homo sapiens, псевдогена 2 регуляторной (ингибиторной) субъединицы 2 (PPP1R2P2), сходства с Fem1A (Caenorhabditis elegans), CGI009, карбонилредуктазы 1 (CBR1), молекулы адгезии клеток синдрома Дауна (DSCAM), открытой рамки считывания 29 хромосомы 21 (C21orf29), голокарбоксилазы-синтетазы (HLCS) и CGI132; и (2) последовательности ДНК не более 10 т.п.н. слева и/или справа от этого локуса; и (d) определения отношения аллелей, где отклонение от отношения аллелей женщины, несущей плод, не имеющий трисомии 21, указывает на трисомию 21 у этого плода. В некоторых вариантах осуществления этот реагент содержит бисульфит. В других вариантах осуществления этот реагент содержит один или несколько ферментов, которые преимущественно расщепляют метилированную ДНК. Альтернативно этот реагент может содержать один или несколько ферментов, которые преимущественно расщепляют неметилированную ДНК. В некоторых вариантах осуществления этот способ дополнительно содержит стадию амплификации после стадии (b) для амплификации метилированной или неметилированной геномной последовательности. Эту стадию амплификации можно выполнять при помощи ПЦР, например, специфической в отношении метилирования ПЦР. Имеются разные возможности выполнения стадии (с) заявленного способа. Например, эта стадия может выполняться при помощи масс-спектрометрии, анализом удлинения праймеров, ПЦР реального времени, гибридизацией полинуклеотидов или электрофорезом. В некоторых вариантах осуществления этого способа два разных аллеля этой геномной последовательности на хромосоме 21 у плода содержат полиморфизм одного нуклеотида, полиморфизм инсерцииделеции или полиморфизм простой тандемной дупликации. В пятом аспекте этого изобретения обеспечен способ детектирования или мониторинга ассоциированного с беременностью нарушения у беременной женщины. Этот способ предусматривает стадии (а) получения биологической пробы у женщины, где этой пробой является цельная кровь, сыворотка, плазма, моча или слюна; (b) определения уровня CpG-содержащей геномной последовательности в этой пробе, где эта геномная последовательность имеет длину по меньшей мере 15 нуклеотидов, содержит по меньшей мере один неметилированный цитозин и находится в районе на хромосоме 21 и где этот район состоит из (1) геномного локуса, выбранного из группы, состоящей из CGI137, фосфодиэстеразы 9A(PPP1R2P2) и сходства с Fem1A (Caenorhabditis elegans); и (2) последовательности ДНК не более 10 т.п.н. слева и/или справа от этого локуса; и (с) сравнения этого уровня геномной последовательности со стандартным контролем, где увеличение или уменьшение от стандартного контроля указывает на присутствие или прогрессирование ассоциированного с беременностью нарушения. В некоторых вариантах осуществления стадия (b) предусматривает обработку ДНК, присутствующей в пробе крови, реагентом, который дифференциально модифицирует метилированный и неметилированный цитозин. Этот реагент может содержать бисульфит или он может содержать один или несколько ферментов, которые преимущественно расщепляют ДНК, содержащую метилированный цитозин, или он может содержать один или несколько ферментов, которые преимущественно расщепляют ДНК, содержащую неметилированный цитозин. В некоторых вариантах осуществления стадия (b) предусматривает реакцию амплификации, такую как полимеразная цепная реакция (ПЦР), в частности, специфическая в отношении метилирования ПЦР. Этой реакцией амплификации может быть также амплификация на основе последовательности нуклеиновой кислоты, реакция вытеснения цепи или реакция амплификации разветвленной ДНК. В некоторых вариантах осуществления уровень геномной последовательности ДНК определяют при помощи электрофореза или гибридизации полинуклеотидов.-3 014274 Этот способ пригоден для детектирования или мониторинга ряда ассоциированных с беременностью нарушений, включающих в себя преэклампсию, преждевременные роды, неукротимую рвоту беременных, эктопическую (внематочную) беременность, хромосомную анеуплоидию (например, трисомию 21) и задержку внутриутробного развития плода. В шестом аспекте этого изобретения обеспечен способ детектирования или мониторинга ассоциированного с беременностью нарушения у беременной женщины. Этот способ предусматривает стадии:(а) получения биологической пробы у женщины, где этой пробой является цельная кровь, сыворотка,плазма, моча или слюна; (b) определения уровня CpG-содержащей геномной последовательности в этой пробе, где эта геномная последовательность имеет длину по меньшей мере 15 нуклеотидов, содержит по меньшей мере один метилированный цитозин и находится в районе на хромосоме 21 и где этот район состоит из (1) геномного локуса, выбранного из группы, состоящей из CGI009, карбонилредуктазы 1(CBR1), молекулы адгезии клеток синдрома Дауна (DSCAM), открытой рамки считывания 29 хромосомы 21 (C21orf29), голокарбоксилазы-синтетазы (HLCS) и CGI132; (2) последовательности ДНК не более 10 т.п.н. слева и/или справа от этого локуса; и (с) сравнения этого уровня геномной последовательности со стандартным контролем, где увеличение или уменьшение от стандартного контроля указывает на присутствие или прогрессирование ассоциированного с беременностью нарушения. В некоторых вариантах осуществления стадия (b) предусматривает обработку ДНК, присутствующей в пробе крови, реагентом, который дифференциально модифицирует метилированный и неметилированный цитозин. Этот реагент может содержать бисульфит или он может содержать один или несколько ферментов, которые преимущественно расщепляют ДНК, содержащую метилированный цитозин, или он может содержать один или несколько ферментов, которые преимущественно расщепляют ДНК, содержащую неметилированный цитозин. В некоторых вариантах осуществления стадия (b) предусматривает реакцию амплификации, такую как полимеразная цепная реакция (ПНР), в частности, специфическая в отношении метилирования ПЦР. Этой реакцией амплификации может быть также амплификация на основе последовательности нуклеиновой кислоты, реакция вытеснения цепи или реакция амплификации разветвленной ДНК. В некоторых вариантах осуществления уровень геномной последовательности ДНК определяют при помощи электрофореза или гибридизации полинуклеотидов. Этот способ пригоден для детектирования или мониторинга ряда ассоциированных с беременностью нарушений, включающих в себя преэклампсию, преждевременные роды, неукротимую рвоту беременных, эктопическую (внематочную) беременность, трисомию 21 и задержку внутриутробного развития плода. В практике данного изобретения во всех вышеуказанных аспектах CpG-островок (ЦГ-богатый островок) может быть использован в качестве CpG-содержащей геномной последовательности в некоторых случаях, в то время как в других случаях CpG-содержащая геномная последовательность может не бытьCpG-островком. Способы этого изобретения во всех аспектах могут проводиться без какой-либо стадии, выполняемой на женщине. В этих вариантах осуществления способы этого изобретения лишены стадии получения биологической пробы у женщины и начинаются с первой указанной стадии, которую проводят на пробе. Все остальное описание в этой заявке относится равным образом к этим вариантам осуществления, за исключением случаев, в которых контекст ясно требует другого. Таким образом, способ первого аспекта в этом варианте осуществления становится следующим: способ детектирования или мониторинга ассоциированного с беременностью нарушения у беременной женщины, предусматривающий стадии: (а) [опущена]; (b) определения статуса метилирования CpGсодержащей геномной последовательности в биологической пробе у женщины, где этой пробой является цельная кровь, сыворотка, плазма, моча или слюна; где эта геномная последовательность у плода и эта геномная последовательность у женщины являются дифференциально (различно) метилированными, с различением посредством этого геномной последовательности у женщины и этой геномной последовательности у плода в этой пробе, где эта геномная последовательность имеет длину по меньшей мере 15 нуклеотидов, содержит по меньшей мере один цитозин и находится в районе хромосомы 21 и где этот район состоит из (1) геномного локуса, выбранного из группы, состоящей из CGI137, фосфодиэстеразы 9 А (PDE9A), протеинфосфатазы 1 homo sapiens, псевдогена 2 регуляторной (ингибиторной) субъединицы 2 (PPP1R2P2), сходства с Fem1A (Caenorhabditis elegans), CGI009, карбонилредуктазы 1 (CBR1), молекулы адгезии клеток синдрома Дауна (DSCAM), открытой рамки считывания 29 хромосомы 21(C21orf29), голокарбоксилазы-синтетазы (HLCS) и CGI132; и (2) последовательности ДНК не более 10 т.п.н. слева и/или справа от этого локуса; (с) определения уровня этой геномной последовательности у плода и (d) сравнения уровня этой геномной последовательности у плода со стандартным контролем, где увеличение или уменьшение от стандартного контроля указывает на присутствие или прогрессирование ассоциированного с беременностью нарушения. Подобным образом способ второго аспекта в этом варианте осуществления становится следующим: способ детектирования или мониторинга ассоциированного с беременностью нарушения у беременной женщины, предусматривающий стадии: (а) [опущена]; (b) обработки ДНК биологической пробы у жен-4 014274 щины, где этой пробой является цельная кровь, сыворотка, плазма, моча или слюна, бисульфитом; (с) выполнения реакции амплификации с использованием ДНК из стадии (b) и двух праймеров для амплификации CpG-содержащей геномной последовательности, где эта геномная последовательность имеет длину по меньшей мере 15 нуклеотидов, содержит по меньшей мере один цитозин и находится в районе хромосомы 21 и где этот район состоит из (1) геномного локуса, выбранного из группы, состоящей из(ингибиторной) субьединицы 2 (PPP1R2P2), сходства с Fem1A (Caenorhabditis elegans), CGI009, карбонилредуктазы 1 (CBR1), молекулы адгезии клеток синдрома Дауна (DSCAM), открытой рамки считывания 29 хромосомы 21 (C21orf29), голокарбоксилазы-синтетазы (HLCS) и CGI132; и (2) последовательности ДНК не более 10 т.п.н. слева и/или справа от этого локуса; и где по меньшей мере один из этих двух праймеров связывается дифференциально с этой геномной последовательностью у плода; и (d) сравнения уровня амплифицированной части этой геномной последовательности из стадии (с) со стандартным контролем, где увеличение или уменьшение от стандартного контроля указывает на присутствие или прогрессирование ассоциированного с беременностью нарушения. Подобным образом способ третьего аспекта в этом варианте осуществления становится следующим: способ детектирования и мониторинга ассоциированного с беременностью нарушения у беременной женщины, предусматривающий стадии: (а) [опущена]; (b) обработки ДНК биологической пробы у женщины, где этой пробой является цельная кровь, сыворотка, плазма, моча или слюна, реагентом, который дифференциально модифицирует метилированную и неметилированную ДНК; (с) определения нуклеотидной последовательности CpG-содержащей геномной последовательности из стадии (b), где эта геномная последовательность имеет длину по меньшей мере 15 нуклеотидов, содержит по меньшей мере один цитозин и находится в районе хромосомы 21 и где этот район состоит из (1) геномного локуса, выбранного из группы, состоящей из CGI137, фосфодиэстеразы 9A (PDE9A), протеинфосфатазы 1 homo(Caenorhabditis elegans), CGI009, карбонилредуктазы 1 (CBR1), молекулы адгезии клеток синдрома Дауна(DSCAM), открытой рамки считывания 29 хромосомы 21 (C21orf29), голокарбоксилазы-синтетазы(HLCS) и CGI132; и (2) последовательности ДНК не более 10 т.п.н. слева и/или справа от этого локуса; и(d) сравнения профиля нуклеотидной последовательности из стадии (с) со стандартным контролем, где изменение в этом профиле от стандартного контроля указывает на присутствие или прогрессирование ассоциированного с беременностью нарушения. Подобным образом способ четвертого аспекта в этом варианте осуществления становится следующим: способ детектирования трисомии 21 у плода беременной женщины, предусматривающий стадии:(а) [опущена]; (b) обработки биологической пробы у женщины, где этой пробой является цельная кровь,сыворотка, плазма, моча или слюна, реагентом, который дифференциально модифицирует метилированную и неметилированную ДНК; (с) анализа аллелей CpG-содержащей геномной последовательности, где эта геномная последовательность имеет длину по меньшей мере 15 нуклеотидов, содержит по меньшей мере один цитозин и находится в районе хромосомы 21 и где этот район состоит из (1) геномного локуса,выбранного из группы, состоящей из CGI137, фосфодиэстеразы 9 А (PDE9A), протеинфосфатазы 1 homo(Caenorhabditis elegans), CGI009, карбонилредуктазы 1 (CBR1), молекулы адгезии клеток синдрома Дауна(DSCAM), открытой рамки считывания 29 хромосомы 21 (C21orf29), голокарбоксилазы-синтетазы(HLCS) и CGI132; и (2) последовательности ДНК не более 10 т.п.н. слева и/или справа от этого локуса; и(d) определения отношения аллелей, где отклонение от отношения аллелей женщины, несущей плод, не имеющий трисомии 21, указывает на трисомию 21 у этого плода. Подобным образом способ пятого аспекта в этом варианте осуществления становится следующим: способ детектирования и мониторинга ассоциированного с беременностью нарушения у беременной женщины, предусматривающий стадии: (а) [опущена]; (b) определения уровня CpG-содержащей геномной последовательности в биологической пробе у женщины, где этой пробой является цельная кровь,сыворотка, плазма, моча или слюна, где эта геномная последовательность имеет длину по меньшей мере 15 нуклеотидов, содержит по меньшей мере один неметилированный цитозин и находится в районе хромосомы 21 и где этот район состоит из (1) геномного локуса, выбранного из группы, состоящей из(ингибиторной) субъединицы 2 (PPP1R2P2) и сходства с Fem1A (Caenorhabditis elegans); и (2) последовательности ДНК не более 10 т.п.н. слева и/или справа от этого локуса; и (с) сравнения этого уровня геномной последовательности со стандартным контролем, где увеличение или уменьшение от стандартного контроля указывает на присутствие или прогрессирование ассоциированного с беременностью нарушения. Подобным образом способ шестого аспекта в этом варианте осуществления становится следующим: способ детектирования или мониторинга ассоциированного с беременностью нарушения у беременной женщины, предусматривающий стадии: (а) [опущена]; (b) определения уровня CpG-содержащей геномной последовательности в биологической пробе у женщины, где этой пробой является цельная кровь,сыворотка, плазма, моча или слюна, где эта геномная последовательность имеет длину по меньшей мере-5 014274 15 нуклеотидов, содержит по меньшей мере один метилированный цитозин и находится в районе хромосомы 21 и где этот район состоит из (1) геномного локуса, выбранного из группы, состоящей из CGI009,карбонилредуктазы 1 (CBR1), молекулы адгезии клеток синдрома Дауна (DSCAM), открытой рамки считывания 29 хромосомы 21 (C21orf29), голокарбоксилазы-синтетазы (HLCS) и CGI132; и (2) последовательности ДНК не более 10 т.п.н. слева и/или справа от этого локуса; и (с) сравнения этого уровня геномной последовательности со стандартным контролем, где увеличение или уменьшение от стандартного контроля указывает на присутствие или прогрессирование ассоциированного с беременностью нарушения. Краткое описание чертежей Фиг. 1. Клонирование и бисульфитное секвенирование (А) района А и (В) района В CGI137 среди парных тканей плаценты и клеток материнской крови. Отдельные сайты CpG пронумерованы по первому ряду с положениями нуклеотидов, определенными относительно chr21: 46,249,636 (+1) Human May 2004(hg17) блока браузера UCSC Genome. Каждый следующий ряд изображает статус метилирования на протяжении сайтов CpG в отдельной молекуле ДНК, выделенной клонированием. Черные и белые кружки представляют метилированные и неметилированные сайты CpG соответственно. Клоны из проб ткани плаценты отмечены префиксом "PLN", тогда как клоны из клеток материнской крови отмечены префиксом "MBN". Плацента и клетки материнской крови из одного и того же индивидуума идентифицируются одинаковым номером проб после "PLN" или "MBN". Фиг. 2. Диаграмма в виде столбцов индексов метилирования среди всех секвенированных клонов для проб плаценты и материнской крови для каждого из исследованных сайтов CpG в районе А (А) и районе В (В) CGI137. По х-оси обозначены отдельные сайты с их положениями нуклеотидов относительно chr21: 46,249,636 (+1) Human May 2004 (hg17) блока браузера UCSC Genome. Фиг. 3. Диаграмма в виде столбцов индексов метилирования среди всех секвенированных клонов для проб плаценты и материнской крови для каждого из исследованных сайтов CpG в PDE9A среди беременностей третьего триместра и первого триместра для района A (A и B), района В (С и D) и района С(E). Для фиг. 3 А и 3 В по х-оси указаны отдельные сайты CpG с их положениями нуклеотидов относительно обратной цепи chr21: 42,978,424 (+1) Human May 2004 (hg17) блока браузера UCSC Genome; а для фиг. 3 С и 3D относительно прямой цепи chr21: 42,978,718 (+1); для фиг. 3 Е относительно прямой цепиchr21: 42,978,005 (+1). Фиг. 4. Диаграмма в виде столбцов индексов метилирования среди всех секвенированных клонов для проб плаценты и материнской крови для каждого из исследованных сайтов CpG в районе APPP1R2P2 среди беременностей третьего триместра (А) и первого триместра (В) и в районе В PPP1R2P2 среди беременностей третьего триместра (С). По х-оси указаны отдельные сайты CpG с их положениями нуклеотидов относительно chr21: 36,180,493 (+1) Human May 2004 (hg17) блока браузера UCSC Genome. Фиг. 5. Диаграмма в виде столбцов индексов метилирования среди всех секвенированных клонов для проб плаценты и материнской крови для каждого из исследованных сайтов CpG в районе А (А) и районе В (В) сходства с Fem1A (C. elegans). По х-оси указаны отдельные сайты CpG с их положениями нуклеотидов относительно chr21: 14,056,070 (+1) Human May 2004 (hg17) блока браузера UCSC Genome. Фиг. 6. Диаграмма в виде столбцов индексов метилирования среди всех секвенированных клонов для проб плаценты и материнской крови для каждого из исследованных сайтов CpG в CGI009. По х-оси указаны отдельные сайты CpG с их положениями нуклеотидов относительно chr21: 25,855,701 (+1) Human May 2004 (hg17) блока браузера UCSC Genome. Фиг. 7. Диаграмма в виде столбцов индексов метилирования среди всех секвенированных клонов для проб плаценты и материнской крови для каждого из исследованных сайтов CpG в локусе карбонилредуктазы 1. По х-оси указаны отдельные сайты CpG с их положениями нуклеотидов относительноchr21: 36,363,538 (+1) Human May 2004 (hg17) блока браузера UCSC Genome. Фиг. 8. Диаграмма в виде столбцов индексов метилирования среди всех секвенированных клонов для проб плаценты и материнской крови для каждого из исследованных сайтов CpG в локусе молекулы адгезии клеток синдрома Дауна. По х-оси указаны отдельные сайты CpG с их положениями нуклеотидов относительно chr21: 41,139,872 (+1) Human May 2004 (hg17) блока браузера UCSC Genome. Фиг. 9. Диаграмма в виде столбцов индексов метилирования среди всех секвенированных клонов для проб плаценты и материнской крови для каждого из исследованных сайтов CpG в C21orf29. По х-оси указаны отдельные сайты CpG с их положениями нуклеотидов относительно chr21: 44,953,288 (+1) Human May 2004 (hg17) блока браузера UCSC Genome. Фиг. 10. Клонирование и бисульфитное секвенирование CGI111 среди парных тканей плаценты и клеток материнской крови. Отдельные сайты CpG пронумерованы по первому ряду с положениями нуклеотидов, определенными относительно chr21:44,699,072 (+1) Human May 2004 (hg17) блока браузераUCSC Genome. Каждый следующий ряд изображает статус метилирования на протяжении сайтов CpG в отдельной молекуле ДНК, выделенной клонированием. Черные и белые кружки представляют метилированные и неметилированные сайты CpG соответственно. Клоны из проб ткани плаценты отмечены префиксом "PLN", тогда как клоны из клеток материнской крови отмечены префиксом "MBN". Плацента и клетки материнской крови из одного и того же индивидуума идентифицируются одинаковым номером-6 014274 проб после "PLN" или "MBN". Фиг. 11. Диаграмма в виде столбцов индексов метилирования среди всех секвенированных клонов для проб плаценты и материнской крови для каждого из исследованных сайтов CpG в CGI121. По х-оси указаны отдельные сайты CpG с их положениями нуклеотидов относительно chr21: 45,262,112 (+1) Human May 2004 (hg17) блока браузера UCSC Genome. Фиг. 12. Иллюстрация гомогенного анализа MassEXTEND, нацеленного на неметилированную форму CGI137. Показана нуклеотидная последовательность, охватывающая амплифицированный район. Исходная последовательность ДНК (SEQ ID NO:1) сопоставлена над преобразованной бисульфитом последовательностью (SEQ ID NO:2). Сайты CpG идентифицируются по знаку . Эти сайты CpG дополнительно пронумерованы, и эта нумерация соответствует нумерации на фиг. 1A и 2 А и в табл. 2 А. Остатки цитозина, которые не являются частью динуклеотида CpG, идентифицируются знаком ":". Изображенная преобразованная последовательность основана на предположении, что все сайты CpG являются метилированными. Сопоставления для прямого, удлиненного и обратного праймеров показаны ниже преобразованной бисульфитом последовательности. Фиг. 13. Масс-спектрометрические записи (самописцем) гомогенного анализа MassEXTEND, нацеленного на неметилированную форму CGI137. Показаны результаты чистоты плацентарной ДНК, ДНК материнской лейкоцитной пленки, смесь 95:5 (ДНК материнской лейкоцитной пленки:плацентарная ДНК), контроли предродовой и послеродовой материнской плазмы и контроли без матрицы (NTC). Для всех масс-спектров х-ось изображает молекулярную массу детектированных продуктов удлинения (показанных в виде острых пиков), в то время как у-ось изображает интенсивность в произвольных единицах. Отмечено ожидаемое положение неметилированной молекулы. Фиг. 14. Объединенный бисульфитный рестрикционный анализ, (COBRA) (А) района А голокарбоксилазы-синтетазы, (В) района B1 и (С) района В 2. Анализировали две плаценты с трисомией 21 (Т 21PLN), две нормальные плаценты 1-го триместра (нормальная PLN 1st), две нормальные плаценты 3-го триместра (нормальная PLN 3rd) и две пробы клеток материнской крови 1-го триместра (лейкоцитная пленка). Продукты ПЦР расщепляли ферментом BstUI (+) и без фермента BstU (+). Метилирование ДНК детектировали по появлению продуктов расщепления меньшего размера. В гель-электрофорезе использовали 1 т.п.н.-лэддер (лестницу) (Invitrogen Carlsbad, CA) (M). Фиг. 15. COBRA-анализ CGI009. Анализировали две плаценты с трисомией 21 (Т 21 PLN), две нормальные плаценты 1-го триместра (нормальная PLN 1st), две нормальные плаценты 3-го триместра (нормальная PLN 3rd) и две пробы клеток материнской крови 1-го триместра (лейкоцитная пленка). Продукты ПЦР расщепляли ферментом BstUI (+) и без фермента BstU (+). Метилирование ДНК детектировали по появлению продуктов расщепления меньшего размера. В гель-электрофорезе использовали 1 т.п.н.лэддер (лестницу) (Invitrogen Carlsbad, CA) (M). Фиг. 16. COBRA-анализ CGI132. Анализировали две плаценты с трисомией 21 (Т 21 PLN), две нормальные плаценты 1-го триместра (нормальная PLN 1st), две нормальные плаценты 3-го триместра (нормальная PLN 3rd) и две пробы клеток материнской крови 1-го триместра (лейкоцитная пленка). Продукты ПЦР расщепляли ферментом BstUI (+) и без фермента BstU (+). Метилирование ДНК детектировали по появлению продуктов расщепления меньшего размера. В гель-электрофорезе использовали 1 т.п.н.лэддер (лестницу) (Invitrogen Carlsbad, CA) (M). Фиг. 17. Клонирование и бисульфитное секвенирование района В 2 HLCS CGI111 среди плацентарных тканей и клеток материнской крови. Отдельные сайты CpG пронумерованы по первому ряду с положениями нуклеотидов, определенными относительно chr21: 37,274,682-37,275,036 Human May 2004(hg17) блока браузера UCSC Genome. Каждый следующий ряд изображает статус метилирования на протяжении сайтов CpG в отдельной молекуле ДНК, выделенной клонированием. Черные и белые кружки представляют метилированные и неметилированные сайты CpG соответственно. Клоны из проб плацентарных тканей трисомии 21, нормального 1-го триместра и нормального 3-го триместра отмечены префиксом "T21-PLN", "нормальная PLN 1st" и "нормальная PLN 3rd" соответственно, тогда как клоны из клеток материнской крови отмечены префиксом "Buffy coat" ("лейкоцитная пленка"). Плацента и клетки материнской крови из разных беременных индивидуумов идентифицируются номерами проб после этого префикса. Фиг. 18. Определение количества ДНК HLCS из плацентарной ткани и материнской лейкоцитной пленки. Индекс метилирования определяли как концентрации ДНК HLCS после расщепления рестрикционным ферментом в сравнении с общими концентрациями, определенными в контроле ложного расщепления той же самой пробы. ДНК из плацентарной ткани обозначают как "нормальная PLN", а ДНК из материнской лейкоцитной пленки обозначают как "MBC." Фиг. 19. Детектирование фетус-специфической HLCS в материнской плазме 3-го триместра. Сигналы HLCS детектировали в пробах материнской плазмы обработкой (фиг. 19A) чувствительным к метилированию рестрикционным ферментом и без (фиг. 19 В) чувствительного к метилированию рестрикционного фермента. Пробы предродовой плазмы обозначены как "до родов", тогда как пробы послеродовой плазмы обозначены как "после родов". В реакциях расщепления использовали рестрикционные ферменты Нра II и BstU I, и они обозначены как "(+)" в этом графике. Ложные расщепления без обработки фер-7 014274 ментом обозначены как "(-)". Определения Термин "ассоциированное с беременностью нарушение" в контексте этой заявки относится к любому состоянию или заболеванию, которое может поражать беременную женщину, плод, который несет эта женщина, или как женщину, так и плод. Такое состояние или заболевание может проявлять его симптомы во время ограниченного периода времени, например во время беременности или родов, или может длиться в течение всей продолжительности жизни плода после его рождения. Некоторые примеры ассоциированного с беременностью нарушения включают в себя внематочную (эктопическую) беременность,преэклампсию, преждевременные роды и фетальные хромосомные отклонения от нормы, такие как трисомия 21."CpG-содержащей геномной последовательностью" называют в данном контексте сегмент последовательности ДНК в определенном местоположении в геноме индивидуума, такого как плод человека или беременная женщина. Обычно "CpG-содержащая геномная последовательность" имеет длину по меньшей мере 15 нуклеотидов и содержит по меньшей мере один цитозин. Предпочтительно она может иметь длину по меньшей мере 30, 50, 80, 100, 150, 200, 250 или 300 нуклеотидов и содержит по меньшей мере 2, 5, 10, 15, 20, 25 или 30 цитозинов. Для любой "CpG-содержащей геномной последовательности" в конкретном местоположении, например в районе, сосредоточенном около конкретного генетического локуса на хромосоме 21 (таком как, например, CpG-островок (ЦГ-островок) CGI137, PDE9A, CGI009 и т.д.),могут существовать вариации нуклеотидной последовательности от индивидуума к индивидууму и от аллеля к аллелю даже для одного и того же индивидуума. Обычно такой район, сосредоточенный около определенного генетического локуса (например, CpG-островка), содержит локус, а также последовательности слева и/или справа от него. Каждая из этих расположенных слева или справа последовательностей(считая от 5'- или 3'-границы этого генетического локуса соответственно) может быть такой длинной, как 10 т.п.н., в других случаях может быть такой длинной, как 5 т.п.н., 2 т.п.н., 1 т.п.н., 500 п.н., 200 п.н. или 100 п.н. Кроме того, "CpG-содержащая геномная последовательность" может включать в себя нуклеотидную последовательность, транскрибируемую или не транскрибируемую для получения белка, и эта нуклеотидная последовательность может быть кодирующей белок последовательностью, не кодирующей белок последовательностью (например, промотором транскрипции) или их комбинацией."CpG-островок" в этой заявке описывает сегмент последовательности ДНК, обнаруживаемый в геноме, который имеет минимальную длину, минимальное содержание GC и минимальное отношение наблюдаемая частота встречаемости CpG/ожидаемая частота встречаемости CpG (OCF/ECF). Yamada et al.(Genome Research, 14:247-266, 2004) описали набор стандартов для определения CpG-островка: он должен иметь по меньшей мере 400 нуклеотидов в длину, имеет содержание GC более 50% и отношениеOCF/ECF, большее чем 0,6. Другие авторы (Takai et al., Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A., 99:3740-3745, 2002) определили CpG-островок менее строго: как последовательность по меньшей мере 200 нуклеотидов в длину, имеющую содержание GC, большее чем 50%, и отношение OCF/ECF, большее чем 0,6. Принцип"CpG-островка" на хромосоме 21, используемый в этой заявке, является принципом, который соответствует профилям CpG-островков, обеспечиваемым любой из компьютерных программ, разработанных для сканирования хромосом на основе вышеупомянутых критериев, включающих в себя результаты, полученные с использованием размеров окна 100, 200 или 300 нуклеотидов и размеров смещения или ступеней 1, 2 или 3 нуклеотида в процессе скрининга. Отдельные CpG-островки, упомянутые в этом описании,дополнительно определяются по номеру доступа соответствующего геномного контига, версии и району в GenBank, хромосомному местоположению относительно последовательности хромосомы 21 HumanMay 2004 (hg17) блока браузера UCSC Genome (genome.ucsc.edu) и их способности амплифицироваться праймерами ПЦР при конкретных условиях, как показано в табл. 1 этого описания. Термин "эпигенетическое состояние" или "эпигенетический статус" относится в данном контексте к любому структурному признаку на молекулярном уровне нуклеиновой кислоты (например, ДНК или РНК), другому, чем первичная нуклеотидная последовательность. Например, эпигенетическое состояние геномной ДНК может включать в себя ее вторичную или третичную структуру, определяемую или обусловленную, например, ее паттерном метилирования или ее ассоциацией с клеточными белками. Термин "профиль метилирования" или "статус метилирования" при использовании в этой заявке для описания состояния метилирования геномной последовательности относится к характеристикам ДНК-сегмента в конкретном геномном локусе, относящемся к метилированию. Такие характеристики включают в себя, но не ограничиваются ими, установление, являются ли остатки цитозина (С) в этой последовательности ДНК метилированными, местоположение метилированного остатка (метилированных остатков) С, процент метилированного С в любом конкретном отрезке остатков и аллельные различия в метилировании вследствие, например, различия в происхождении этих аллелей. Термин "профиль метилирования" или "статус метилирования" относится также к относительной или абсолютной концентрации метилированного С или неметилированного С в любом конкретном отрезке остатков в биологической пробе. Термин "полиморфизм единственного нуклеотида" или "SNP" в данном контексте относится к вариации полинуклеотидной последовательности, присутствующей в единственном нуклеотидном остатке,-8 014274 в различных аллелях одной и той же геномной последовательности. Эта вариация может встречаться в кодирующем районе или некодирующем районе (например, в районе промотора) геномной последовательности, если эта геномная последовательность транскрибируется во время образования белка. Детектирование одного или нескольких SNP позволяет различать отличающиеся аллели единственной геномной последовательности. Термин "кровь" относится в данном контексте к пробе или препарату крови от беременной женщины или женщины, тестируемой на возможную беременность. Этот термин включает в себя цельную кровь или любые фракции крови, такие как сыворотка или плазма, определяемые общепринятым образом. Термин "бисульфит" в данном контексте включает в себя все типы бисульфитов, такие как бисульфит натрия, которые способны химически превращать цитозин (С) в урацил (U), без химической модификации метилированного цитозина, и, следовательно, могут быть использованы для дифференциальной модификации последовательности ДНК на основе статуса метилирования этой ДНК. В данном контексте реагент, который "дифференциально модифицирует" метилированную и/или неметилированную ДНК, включает в себя любой реагент, который модифицирует метилированную и/или неметилированную ДНК в процессе, посредством которого образуются различимые продукты из метилированной и неметилированной ДНК, позволяющие посредством этого идентифицировать статус метилирования ДНК. Такие процессы могут включать в себя, но не ограничиваются ими, химические реакции (такие как превращение СU бисульфитом) и обработку ферментом (такую как расщепление зависимой от метилирования эндонуклеазой). Таким образом, фермент, который преимущественно расщепляет или гидролизует метилированную ДНК, является ферментом, способным к расщеплению или гидролизу молекулы ДНК с гораздо более высокой эффективностью, когда эта ДНК является метилированной, в то время как фермент, который преимущественно расщепляет или гидролизует неметилированную ДНК, проявляет значительно более высокую эффективность, когда эта ДНК не является метилированной. Термин "нуклеиновая кислота" или "полинуклеотид" относится к дезоксирибонуклеиновым кислотам (ДНК) или рибонуклеиновым кислотам (РНК) и их полимерам в одноцепочечной или двухцепочечной форме. Если нет других указаний, этот термин включает в себя нуклеиновые кислоты, содержащие известные аналоги природных нуклеотидов, которые имеют свойства связывания, аналогичные свойствам связывания ссылочной нуклеиновой кислоты, и метаболизируются аналогично метаболизации природно-встречающихся нуклеотидов. Если нет других указаний, конкретная последовательность нуклеиновой кислоты безоговорочно включает в себя также ее модифицированные варианты (например, замены вырожденных кодонов), аллели, ортологи, полиморфизмы единственных нуклеотидов (SNP) и комплементарные последовательности, а также последовательность, точно указанную. Конкретно, замены вырожденных кодонов могут быть получены генерированием последовательностей, в которых третье положение одного или нескольких выбранных (или всех) кодонов заменено смешанным основанием и/или остатками дезоксиинозина (Batzer et al., Nucleic. Acid. Res., 19:5081 (1991); Ohtsuka et al., J. Biol. Chem.,260:2605-2608 (1985) и Rossolini et al., Mol. Cell. Probes, 8:91-98 (1994. Термин нуклеиновая кислота используется взаимозаменяемо с геном, кДНК и мРНК, кодируемой геном. Термин "ген" обозначает сегмент ДНК, участвующий в продуцировании полипептидной цепи; он включает в себя районы, предшествующие кодирующему району, и районы, следующие за кодирующим районом (лидер и трейлер), участвующие в транскрипции/трансляции генного продукта и регуляции транскрипции/трансляции, а также промежуточные последовательности (интроны) между отдельными кодирующими сегментами (экзонами). В этой заявке термины "полипептид", "пептид" и "белок" используются взаимозаменяемо здесь для обозначения полимера аминокислотных остатков. Эти термины относятся к полимерам аминокислот, в которых один или несколько аминокислотных остатков являются искусственными химическими миметиками соответствующей природно-встречающейся аминокислоты, а также природно-встречающимся полимерам аминокислот и не встречающимся в природе полимерам аминокислот. В данном контексте эти термины включают в себя цепи аминокислот любой длины, в том числе полноразмерные белки (например, антигены), в которых аминокислотные остатки связаны ковалентными пептидными связями. Термин "аминокислота" относится к природно-встречающимся и синтетическим аминокислотам, а также аминокислотным аналогам и аминокислотным миметикам, которые функционируют аналогично природно-встречающимся аминокислотам. Природно-встречающимися аминокислотами являются аминокислоты, кодируемые генетическим кодом, а также аминокислоты, которые модифицированы позднее,например гидроксипролин, -карбоксиглутамат и О-фосфосерин. Аминокислоты могут называться здесь либо обычно известными трехбуквенными символами, либо однобуквенными символами, рекомендованными Комиссией по биохимической номенклатуре (IUPACIUB Biochemical Nomenclature Commission). Нуклеотиды подобным образом могут называться их общепринятыми однобуквенными кодами. В контексте этой заявки термины "увеличение" или "уменьшение" относятся к детектируемому по-9 014274 ложительному или отрицательному изменению количества относительно установленного стандартного контроля. Увеличением является положительное изменение предпочтительно по меньшей мере 10%, более предпочтительно 50%, еще более предпочтительно 2-кратное, даже более предпочтительно по меньшей мере 5-кратное и наиболее предпочтительно по меньшей мере 10-кратное в сравнении с контрольной величиной. Другими терминами, указывающими на количественные изменения или отличия от сравнительной основы, такие как "более" или "менее", используются в этой заявке таким же образом, как описано выше."Способ гибридизации полинуклеотидов" относится в данном контексте к способу детектирования присутствия и/или количества полинуклеотида, основанный на его способности образовывать спаривание оснований Уотсона-Крика при подходящих условиях гибридизации, с полинуклеотидным зондом известной последовательности. Примеры таких способов гибридизации включают в себя блоттинг по Саузерну и нозерн-блоттинг."Праймерами" в данном контексте называют олигонуклеотиды, которые могут быть использованы в способе амплификации, таком как полимеразная цепная реакция (ПЦР), для амплификации нуклеотидной последовательности на основе полинуклеотидной последовательности, соответствующей конкретной геномной последовательности, например последовательности, расположенной в CpG-островке CGI137,PDE9A или CGI009 на хромосоме 21, в разном статусе метилирования, по меньшей мере один из праймеров ПЦР для амплификации полинуклеотидной последовательности является последовательностьспецифическим в отношении этой последовательности."Стандартным контролем" называют в данном контексте пробу, содержащую геномную последовательность с заданным количеством или профилем метилирования (который может включать в себя множественные различные и разделяемые характеристики, связанные с метилированием), подходящую для использования способа данного изобретения, для сравнения количества или статуса метилирования конкретной геномной последовательности, например последовательности, расположенной в CpG-островкеCGI137, PDE9A или CGI009 на хромосоме 21, которая присутствует в тест-пробе. Проба, служащая в качестве стандартного контроля, обеспечивает среднее количество или средний профиль метилирования представляющего интерес гена, которые являются типичными для определенного времени (например,первого триместра) во время беременности в крови средней, здоровой беременной женщины, несущей нормальный плод, причем оба, как женщина, так и плод, не имеют риска развития каких-либо ассоциированных с беременностью нарушений или осложнений. Термин "среднее" относится в контексте описания беременной женщины к тому факту, что эта женщина не имеет или имеет по меньшей мере одно соответствующее состояние, такое как наличие хромосомно отклоняющегося от нормы плода или страдание от ассоциированного с беременностью состояния(например, эктопической беременности, преэклампсии или преждевременных родов). Термин "среднее" в другом контексте относится к некоторым характеристикам, таким как профиль метилирования конкретной геномной последовательности (например, расположенной в CpG-островке CGI137, PDE9A илиCGI009 на хромосоме 21) как материнского, так и фетального происхождения, обнаруженный в крови женщины, которые представляют произвольно выбранную группу здоровых женщин, которые являются беременными с хромосомно нормальными плодами и не склонны к каким-либо связанным с беременностью заболеваниям или состояниям. Эта выбранная группа должна содержать достаточное количество женщин, так что среднее количество или профиль метилирования представляющей интерес геномной последовательности среди этих женщин отражает с разумной точностью соответствующий профиль в обычной популяции здоровых беременных женщин со здоровыми плодами. Кроме того, выбранная группа женщин обычно имеет внутриутробный возраст плода (гестационный возраст), сходный с гестационным возрастом у женщины, кровь которой тестируется на показатель потенциального ассоциированного с беременностью нарушения. Предпочтительный гестационный возраст для применения на практике данного изобретения может варьироваться в зависимости от нарушения, которое подвергается скринингу. Например, беременную женщину подвергают скринингу на риск преэклампсии предпочтительно во время второго триместра беременности, в то время как скрининг на фетальную хромосомную анеуплоидию и диагностику выполняют как можно раньше. Кроме того, предпочтительный гестационный возраст для тестирования может также зависеть от представляющего интерес гена в тестировании. Термин "преэклампсия" относится в данном контексте к состоянию, которое встречается во время беременности, основным симптомом которого являются разные формы высокого кровяного давления,часто сопровождающиеся присутствием белков в моче и отеком (опуханием). Преэклампсия, иногда называемая токсикозом беременности (гестозом), связана с более серьезным нарушением, называемым "эклампсией", которая является преэклампсией вместе с судорогами. Эти состояния обычно развиваются во время второй половины беременности (после 20 недель), хотя они могут развиваться вскоре после родов или до 20 недель беременности."Родами до срока" или "преждевременными родами" называют в данном контексте состояние, при котором роды, которые начинаются более чем за 3 недели перед полным гестационным периодом около 40 недель, часто приводят к преждевременному рождению, если не подвергаются лечению. Термин "неукротимая рвота беременных" относится к выраженной, постоянной тошноте и рвоте во- 10014274 время беременности, в частности во время первого триместра. Эти рвота и тошнота могут приводить к дегидратации и препятствовать увеличению массы во время беременности."Внематочной (эктопической) беременностью" называют отклоняющуюся от нормы беременность,в которой оплодотворенная яйцеклетка имплантируется вне матки. Хотя в большинстве случаев внематочная (эктопическая) беременность образуется в фаллопиевых трубах (яйцеводах), этот термин включает в себя также отклоняющиеся от нормы беременности, при которых оплодотворенная яйцеклетка имплантируется в яичнике, животе или шейке матки женщины. Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретенияI. Введение. Присутствие фетальной ДНК в материнской плазме впервые сообщалось в 1997 году и предоставляет возможность неинвазивной пренатальной диагностики просто анализом пробы материнской крови(Lo et al., Lancet, 350:485-487, 1997). В настоящее время были разработаны многочисленные потенциальные клинические применения. В частности, было обнаружено, что количественные отклонения от нормы концентраций фетальной ДНК в материнской плазме ассоциированы с рядом ассоциированных с беременностью нарушений, включающих в себя преэклампсию, преждевременные роды, дородовое кровотечение, инвазивную плацентацию, фетальный синдром Дауна и другие фетальные хромосомные анеуплоидии. Таким образом, анализ фетальной ДНК в материнской плазме был предложен в качестве потенциального маркера для мониторинга хорошего самочувствия плода и матери. Однако фетальная ДНК сосуществует с фоновой материнской ДНК в материнской плазме. Таким образом, большинство сообщенных применений основывались на детектировании последовательностейY-хромосом, так как они являются наиболее удобно отличимыми от материнской ДНК. Такой подход ограничивает применимость существующих анализов до только 50% всех беременностей, а именно беременностей плодами мужского пола. Таким образом, существует большая потребность в развитии независимых от пола маркеров фетальной ДНК для детектирования в материнской плазме. Ранее было продемонстрировано, что фетальная и материнская ДНК могут быть различены по их различиям в статусе метилирования (публикация заявки на патент США 20030044388). Метилирование является эпигенетическим явлением, которое обозначает процессы, изменяющие фенотип без участия изменений в последовательности ДНК. Без использования различия в статусе метилирования ДНК между наследованными по отцовской линии и материнской линии аллелей в H19, локусе, проявляющем геномный импринтинг (дифференциальное метилирование и, следовательно, дифференциальную экспрессию двух аллелей единственного гена, связанную с родительским происхождением конкретного аллеля), один из авторов данного изобретения (Y.M.D. Lo) и его группа впервые продемонстрировали возможность применения эпигенетических маркеров для детектирования происходящей у плода наследуемой по материнской линии последовательности ДНК из материнской плазмы (Poon et al., Clin. Chem.,48:35-41, 2002). Landes et al. также предложили использовать эпигенетические маркеры для неинвазивной пренатальной диагностики (публикация заявки на патент США 20030211522). Авторы данного изобретения недавно продемонстрировали, что полученная из плаценты РНК может быть детектирована в материнской плазме (Ng et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 100:4748-4753,2003). С другой стороны, было показано, что ДНК плазмы у нормальных индивидуумов происходит преимущественно из гемопоэтических клеток (Lui et al., Clin. Chem., 48:421-427, 2002). Таким образом, была высказана гипотеза, что доминирующий источник материнской ДНК происходит из клеток периферической крови, в то время как плацента является возможным источником высвобождения фетальной ДНК в материнскую плазму. Таким образом, одной стратегией для развития общего маркера, специфического в отношении фетальной ДНК, для детектирования в материнской плазме, является идентификация гена,который дифференциально метилирован между плацентой и клетками материнской периферической крови. Авторы данного изобретения впервые продемонстрировали, что количество геномных последовательностей, расположенных в специфических геномных локусах на хромосоме 21, дифференциально метилированы между фетальной ДНК у плода (например, из плаценты) и материнской ДНК из клеток материнской периферической крови. Таким образом, это открытие обеспечивает новый подход для различения фетальной и материнской геномной ДНК и новые способы для неинвазивной пренатальной диагностики.II. Общая методология. Практика этого изобретения использует рутинные способы в области молекулярной биологии. Основные руководства, описывающие общие способы для использования в этом изобретении, включают в себя Sambrook and Russell, Molecular Cloning, A Laboratory Manual (3rd ed. 2001); Kriegler, Gene Transferand Expression: A Laboratory Manual (1990) и Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al, eds.,1994. Для нуклеиновых кислот размеры даются либо в тысячах пар оснований (т.п.н.), либо в парах оснований (п.н.). Они являются приближенными оценками, полученными из электрофореза в агарозном или акриламидном геле, из секвенированных нуклеиновых кислот или из опубликованных последовательностей ДНК. Для белков размеры даются в килодальтонах (кДа) или количествах аминокислотных остат- 11014274 ков. Размеры белков являются приближенными оценками из гель-электрофореза, из секвенированных белков, из полученных аминокислотных последовательностей или из опубликованных белковых последовательностей. Олигонуклеотиды, которые не являются коммерчески доступными, могут быть химически синтезированы, например, в соответствии с твердофазным фосфорамидит-триэфирным способом, впервые описанным BeaucageCaruthers, Tetrahedron Lett., 22:1859-1862 (1981), с использованием автоматизированного синтезатора, как описано в Van Devanter et.al., Nucleic Acids. Res., 12:6159-6168 (1984). Очистку олигонуклеотидов выполняют с использованием любой признанной в данной области стратегии, например нативного гель-электрофореза в акриламидном геле или анионообменной высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЖХ), как описано в PearsonReanier, J. Chrom., 255:137-149 (1983). Геномные последовательности данного изобретения, например последовательности, расположенные в CpG-островках на хромосоме 21, таких как CGI137, PDE9A и CGI009, и полинуклеотидная последовательность синтетических олигонуклеотидов может быть подтверждена с использованием, например,способа терминации цепи для двухцепочечных матриц Wallace et al., Gene, 16:21-26 (1981).III. Получение проб крови и экстракция ДНК. Данное изобретение относится к анализу эпигенетического статуса фетальной ДНК, обнаруженной в материнской крови, в качестве неинвазивного средства для детектирования присутствия и/или мониторинга прогрессирования ассоциированного с беременностью состояния или нарушения. Таким образом,первыми стадиями применения на практике этого изобретения являются получение пробы крови у беременной женщины и экстракция ДНК из этой пробы.A. Получение проб крови. Пробу крови получают у беременной женщины при гестационном возрасте, подходящем для тестирования с использованием способа данного изобретения. Подходящий гестационный возраст может варьироваться в зависимости от тестируемого нарушения, как обсуждается ниже. Сбор крови у женщины выполняют в соответствии со стандартным протоколом, который обычно используют больницы и клиники. Подходящее количество периферической крови, например обычно 5-50 мл, собирают, и кровь может храниться в соответствии со стандартной процедурой до последующего приготовления.B. Приготовление проб крови. Анализ фетальной ДНК, обнаруженной в материнской крови, согласно данному изобретению может выполняться с использованием, например, цельной крови, сыворотки или плазмы. Способы приготовления сыворотки или плазмы из материнской крови хорошо известны среди специалистов с квалификацией в данной области. Например, кровь беременной женщины может быть помещена в пробирку, содержащую ЭДТА, или специализированный коммерческий продукт, такой как Vacutainer SST (BectonDickinson, Franklin Lakes, NJ), для предотвращения свертывания крови, и затем может быть получена плазма из цельной крови посредством центрифугирования. С другой стороны, сыворотка может быть получена с центрифугированием или без центрифугирования после свертывания крови. Если используют центрифугирование, его обычно, хотя и не исключительно, проводят при подходящей скорости, например 1500-3000g. Плазма или сыворотка могут быть подвергнуты дополнительным стадиям центрифугирования перед перенесением в свежую пробирку для экстракции ДНК. Кроме бесклеточной части цельной крови, ДНК может быть также извлечена из клеточной фракции, обогащенной частью, содержащей лейкоцитную пленку, которая может быть получена после центрифугирования пробы цельной крови у женщины и удаления плазмы.C. Экстракция ДНК. Имеются многочисленные известные способы для экстракции ДНК из биологической пробы, в том числе крови. Могут быть использованы общие способы получения ДНК (например, описанные Sambrookand Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3d ed., 2001); могут быть также использованы различные коммерчески доступные реагенты или наборы, такие как мининабор QiaAmp DNA или мининабор QiaAmp DNA Blood (Qiagen, Hilden, Germany), набор для выделения ДНК крови GenomicPrep(Promega, Madison, WI) и набор для очистки ДНК крови GFX Genomic (Amersham, Piscataway, NJ) для получения ДНК из пробы крови у беременной женщины. Могут быть также использованы комбинации более чем одного из этих способов.IV. Специфическая в отношении метилирования модификация ДНК. После экстракции из пробы крови беременной женщины ДНК обрабатывают реагентом, способным химически модифицировать ДНК дифференциальным относительно метилирования образом, т.е. разные и различимые химические структуры будут происходить из метилированного остатка цитозина (С) и неметилированного остатка С после этой обработки. Обычно такой реагент взаимодействует с неметилированным остатком С (остатками С) в молекуле ДНК и превращает каждый неметилированный остаток С в остаток урацила (U), в то время как метилированные остатки С остаются неизмененными. Это превращение СU позволяет детектировать и сравнивать статус метилирования на основе изменений в первичной последовательности этой нуклеиновой кислоты. Примерным реагентом, подходящим для этой цели,является бисульфит, например бисульфит натрия. Способы использования бисульфита для химической- 12014274 модификации ДНК хорошо известны в данной области (см., например, Herman et al., Proc. Natl. Acad.Sci., USA, 93:9821-9826, 1996) и не будут подробно обсуждаться здесь. Как будет понятно квалифицированному в данной области специалисту, любые другие реагенты,которые не названы здесь, но имеют то же самое свойство дифференциальной химической модификации(или любого другого механизма) метилированной и неметилированной ДНК, могут быть использованы для применения на практике данного изобретения. Например, специфическая в отношении метилирования модификация ДНК может также выполняться чувствительными к метилированию рестрикционными ферментами, некоторые из которых обычно расщепляют неметилированный фрагмент ДНК, но не метилированный фрагмент ДНК, тогда как другие (например, зависимая от метилирования эндонуклеазаMcrBC) расщепляет ДНК, содержащую метилированные цитозины, но не неметилированную ДНК. Кроме того, комбинация химической модификации и обработки рестрикционным ферментом, например объединенный бисульфитный-рестрикциоиный анализ (COBRA), может быть использован для применения на практике данного изобретения.V. Амплификация и определение полинуклеотидной последовательности. После химической модификации ДНК дифференциальным в отношении метилирования образом эту обработанную ДНК подвергают затем анализу на основе последовательности, так что одна или несколько геномных последовательностей данного изобретения (например, расположенные в CpG-островках на хромосоме 21, таких как CGI137, PDE9A и CGI009) из фетальной ДНК могут быть отличены от их копий из материнской ДНК, и так, что профиль метилирования фетальной геномной последовательности может быть определен и сравнен со стандартным контролем. Кроме того, после определения, что одна конкретная геномная последовательность фетального происхождения является гиперметилированной или гипометилированной в сравнении с материнской копией, количество этой фетальной геномной последовательности может быть определено на основе ее специфического статуса метилирования. Затем это количество можно быть сравнено с величиной стандартного контроля и может служить в качестве указания на потенциал некоторого ассоциированного с беременностью нарушения. А. Амплификация нуклеотидных последовательностей. Реакция амплификации является необязательной перед анализом последовательности на геномную последовательность после специфической в отношении метилирования модификации. В некоторых вариантах осуществления этого изобретения амплификацию выполняют для преимущественной амплификации CpG-содержащей геномной последовательности на хромосоме 21, которая имеет конкретный паттерн метилирования, так что детектируется только геномная последовательность из одного конкретного источника, например из плаценты или других тканей этого плода. Различные способы амплификации полинуклеотидов хорошо установлены и часто применимы в исследовании. Например, общие способы полимеразной цепной реакции (ПЦР) для амплификации полинуклеотидной последовательности хорошо известны в данной области и, следовательно, не описываются здесь подробно. В отношении обзора способов, протоколов и принципов ПЦР см., например, Innis et al.,PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Academic Press, Inc. N.Y., 1990. Реагенты и протоколы ПЦР также доступны от коммерческих поставщиков, таких как Roche Molecular Systems. ПЦР наиболее часто проводят в виде автоматизированного процесса с термостабильным ферментом. В этом процессе температуру реакционной смеси повторяют циклически через область денатурации,область отжига праймера и область реакции удлинения автоматически. Приборы, специально приспособленные для этой цели, являются коммерчески доступными. Хотя в применении на практике данного изобретения используют ПЦР-амплификацию полинуклеотидной последовательности-мишени (например, CpG-содержащей геномной последовательности на хромосоме 21, где фетальная и материнская последовательность по-разному (дифференциально) метилирована), квалифицированному в данной области специалисту будет понятно, что амплификация геномной последовательности, обнаруженной в пробе материнской крови, может выполняться известным способом, таким как лигазная цепная реакция (LCR), опосредованная транскрипцией амплификация и самоподдерживаемая репликация или амплификация на основе последовательности нуклеиновой кислоты(NASBA), каждый из которых обеспечивает достаточную амплификацию. Недавно разработанная технология разветвленных ДНК может быть также использована для количественной демонстрации присутствия конкретной геномной последовательности этого изобретения, которая представляет конкретный паттерн метилирования, или для количественного определения этой конкретной геномной последовательности в материнской крови. В отношении обзора амплификации сигнала разветвленных ДНК для прямого количественного определения последовательностей нуклеиновых кислот в клинических пробах см. Nolte,Adv. Clin. Chem., 33:201-235, 1998. В. Определение полинуклеотидных последовательностей. Способы для определения полинуклеотидных последовательностей также хорошо установлены и широко практикуются в соответствующей области исследований. Например, основные принципы и общие способы секвенирования полинуклеотидов описаны в разных исследовательских сообщениях и научных трудах по молекулярной биологии и рекомбинантной генетике, таких как Wallace et al., supra;- 13014274 практикуемые в исследовательских лабораториях, ручные или автоматизированные, могут быть использованы для применения на практике данного изобретения. Дополнительные средства, подходящие для детектирования изменений (например, СU) в последовательности полинуклеотида для применения на практике способов данного изобретения, включают в себя, но не ограничиваются ими, масс-спектрометрию, удлинение праймеров, гибридизацию полинуклеотидов, ПЦР реального времени и электрофорез.VI. Установление стандартного контроля. Для установления стандартного контроля для применения на практике способа этого изобретения сначала отбирают группу здоровых беременных женщин, несущих здоровые фетусы. Эти женщины имеют сходный гестационный возраст, который находится в подходящем временном периоде беременности для скрининга таких состояний, как преэклампсия, фетальная хромосомная анеуплоидия и преждевременные роды, с использованием способов данного изобретения. Подобным образом устанавливают стандартный контроль с использованием проб из группы здоровых небеременных женщин. Состояние здоровья отобранных беременных женщин и плодов, которые они несут, подтверждают хорошо установленными, рутинно применяемыми способами, которые включают в себя, но не ограничиваются ими, мониторинг кровяного давления женщин, регистрацию начала родов и проведение фетального генетического анализа с использованием CVS и амниоцентеза (пункции плодного пузыря). Кроме того, отобранная группа здоровых беременных женщин, несущих здоровые фетусы, должна быть разумного размера, так что среднее количество геномной последовательности этого изобретения,которое происходило из фетуса, в материнской крови или профиль метилирования фетальной геномной последовательности в материнской крови, полученной из этой группы, могли бы обоснованно рассматриваться в качестве репрезентативного результата нормального или среднего количества или профиля метилирования среди общей популяции здоровых женщин, несущих здоровые фетусы. Предпочтительно эта отобранная группа содержит по меньшей мере 10 женщин. Стандартный контроль для профиля метилирования фетальной геномной последовательности может отражать множественные разные и разделяемые аспекты статуса метилирования этой конкретной геномной последовательности. Например, одним аспектом профиля метилирования является установление метилирован любой конкретный остаток С или не метилирован; другим аспектом является количество метилированных оснований С в конкретной геномной последовательности; следующим аспектом этого профиля является процент (проценты) метилированного С в любых конкретных местоположениях. Дополнительные аспекты профиля метилирования могут включать в себя, но не ограничиваются ими,аллельное различие в метилировании, отношение дифференциально метилированных аллелей и т.п. Профиль метилирования фетальной геномной последовательности может также варьироваться в зависимости от типа ткани, например ткани плаценты или другой фетальной ткани. Таким образом, могут быть установлены отдельные стандартные контроля для разных фетальных тканей, используемых в тестировании. После установления среднего уровня метилирования для конкретной фетальной геномной последовательности в материнской крови на основе отдельных величин, обнаруженных у каждой женщины отобранной здоровой контрольной группы, эта средняя или медианная либо репрезентативная величина или средний, медианный или репрезентативный профиль рассматриваются как стандартный контроль. Таким образом, любая проба крови, которая содержит сходную величину фетальной геномной последовательности или сходный профиль метилирования фетальной геномной последовательности, может быть использована в качестве стандартного контроля. Кроме того, раствор, содержащий геномную последовательность ДНК в среднем, медианном или репрезентативном количестве, или средний либо медианный или репрезентативный профиль метилирования, может быть искусственно приготовлен и может служить в качестве стандартного контроля. Кроме того, отдельные стандартные контроли могут быть установлены для разных аспектов профиля метилирования геномной последовательности фетального происхождения. Примеры Следующие примеры обеспечены только в качестве иллюстрации, а не в качестве ограничения. Квалифицированные в данной области специалисты будут легко узнавать различные не являющиеся критическими параметры, которые могут быть изменены или модифицированы с получением, по существу, тех же самых или сходных результатов. Пример 1. Авторы изобретения пытались идентифицировать эпигенетические маркеры, которые являются специфическими для плода, в материнской крови. Предыдущие данные предполагают, что фетальные молекулы ДНК в материнской плазме происходят преимущественно из плаценты (Chim et al., Proc Natl.Acad. Sci., USA., 102:14753-14758; Masuzaki et al., J. Med. Genet., 41, 289-292, 2004; Flori et al., Hum Reprod, 19, 723-724, 2004), в то время как фоновая ДНК в материнской плазме может происходить из клеток материнской крови (Lui et al., Clin. Chem., 48, 421-427, 2002). Таким образом, для идентификации фетальных эпигенетических маркеров профили метилирования генетических локусов оценивали как в плацентарных тканях, так и клетках материнской крови с целью идентификации локусов, которые демонст- 14014274 рируют дифференциальное (различное) метилирование между этими типами клеток. Такие маркеры могут быть использованы для пренатальной диагностики и мониторинга связанных с беременностью состояний. Материалы и способы Идентификация CpG-содержащих геномных последовательностей Метилированием ДНК называют присоединение метильной группы к положению пятого углерода остатков цитозина в CpG-динуклеотидах. Кластеры таких CpG-динуклеотидов на хромосоме 21q идентифицировали компьютерным способом с использованием Genome Browser сайта UCSC Genome Bioinformatics (genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgGatewav) (Yamada et al., Genome Res., 14, 247-266, 2004). CpG-сайты дополнительно отбирали на основе следующих критериев: отрезок последовательности ДНК с длиной по меньшей мере 400 п.н. с минимальным содержанием гуанина и цитозина 50% и минимальное отношение наблюдаемая частота CpG/ожидаемая частота CpG по меньшей мере 0,6. После идентификации CpGсодержащих геномных последовательностей авторы также исследовали CpG-сайты слева и справа от ранее идентифицированного геномного района, например районов А и С PDE9A. Комплектование субъектов и сбор проб Плацентарные ткани и соответствующие пробы крови собирали у женщин в первом и третьем триместре беременности. Плацентарные ткани собирали из субъектов третьего триместра после кесарева сечения и из субъектов первого триместра после прерывания беременности. Материнскую кровь (10 мл) собирали в пробирки, содержащие ЭДТА, для крови перед началом родов или выполнением любых родовспомогательных (акушерских) процедур. Пробы крови центрифугировали при 1600g в течение 10 мин при 4 С. Часть, содержащую лейкоцитную пленку, получали после осторожного удаления плазмы и хранили при -20C. Плацентарные ткани промывали в забуференном фосфатом солевом растворе и хранили в простых полипропиленовых пробирках при -80C. Бисульфитное секвенирование ДНК экстрагировали из плацентарных тканей и материнской лейкоцитной пленки с использованием мининабора QIAamp DNA и мининабора QIAamp DNA Blood (Qiagen, Hilden, Germany) соответственно,в соответствии с инструкциями изготовителя. Для каждой пробы 1 мкг ДНК подвергали бисульфитному превращению, которое превращает неметилированные остатки цитозина в урацил, но оставляет метилированные остатки цитозина неизмененными, с использованием набора CpGenome DNA Modification Kit(Intergen, Burlington, MA) в соответствии с инструкциями изготовителя. Затем превращенную бисульфитом ДНК подвергали ПЦР-амплификации с парами праймеров, фланкирующими CpG-сайты (табл. 1). Некоторые CpG-содержащие геномные последовательности исследовали двумя или тремя ПЦР, а именно районы А, В и С. Праймеры конструировали таким образом, что они не связывались с какими-либо потенциально метилированными остатками цитозина. Эти праймеры показаны в качестве иллюстрации и не должны рассматриваться как ограничивающие диапазон праймеров, которые могут быть использованы для этой цели. Использовали реагенты, поставляемые в наборе реагентов TaqMan PCR Core ReagentKit (Applied Biosystems, Foster City, CA). Композиции реагентов для каждой ПЦР подробно представлены в табл. 1. Обычно ПЦР выполняли в конечном объеме реакции 25 мкл с MgCl2, праймерами, TaqGold,1X буфером II, 200 мкМ каждого из dNTP, с диметилсульфоксидом (ДМСО) или бетаином или без диметилсульфоксида или бетаина. Температурный профиль состоял из начальной стадии денатурации 95C в течение 10 мин с последующими 40 циклами 95C в течение 1 мин, диапазона температур отжига 55-65C в течение 1 мин (табл. 1), 72C в течение 1 мин и конечного удлинения 72C в течение 10 мин. Для анализа статуса метилирования при разрешении единственной молекулы продукт ПЦР ТА-клонировали в плазмидный вектор с использованием векторной системы pGEM-T Easy (Promega, Madison, WI). Инсерты из положительных рекомбинантных клонов анализировали циклическим секвенированием с использованием набора BigDye Terminator Cycle Sequencing v1.1 (Applied Biosystems) в соответствии с инструкциями изготовителя. После очистки с использованием колонок genCLEAN (Genetix) 8 мкл проб добавляли к 12 мкл формамида Hi-Di и помещали для анализа в ДНК-анализатор 3100 (Applied Biosystems).- 15014274 Таблица 1 Идентичность, местоположение, последовательности праймеров и условия реакции ПЦР исследованных геномных последовательностей на хромосоме 21. Соответствующие районы на геномных контигах (номер доступа, версия, номера стартового и конечного нуклеотидов), депонированных в GenBank Национального центра Информации Биотехнологии, и положения в хромосомах (хромосома, номера стартового и конечного нуклеотидов) на Human May 2004 (hg17) блока браузера UCSCGenome (доступного в веб-сайте genome.ucsc.edu web) показаны во втором и третьем столбцах соответственноCpG-сайт оценивали как метилированный, если эта последовательность содержала цитозин; и оценивали как неметилированный, если в нем находился остаток тимина (дезокси-копия урацила). Долю метилированного остатка цитозина для каждого CpG-сайта определяли среди плацентарных тканей, а также проб материнской крови. Распределение метилированного и неметилированного цитозинов сравнивали между плацентарными тканями и материнской лейкоцитной пленкой для каждого CpG-сайта при помощи хи-квадрат-анализа. Р-величину 0,05 считали статистически значимо отличающейся. Статистический анализ выполняли с использованием программного обеспечения Sigma Stat 3.0 (SPSS). Результаты и обсуждение Среди CpG-содержащих геномных последовательностей, идентифицированных из компьютеризованного поиска, 13 локусов находились в центре данного исследования. Названия, хромосомное местоположение и номера доступа GenBank этих локусов приведены в табл. 1. Для каждого из исследованных локусов выполняли бисульфитное секвенирование на плацентарных тканях и клетках материнской крови.CGI137 Профиль метилирования CGI137 исследовали среди плацентарных тканей и соответствующих клеток материнской крови, собранных из пяти беременных женщин третьего триместра. Результаты бисульфитного секвенирования для районов А и В всех пяти случаев показаны на фиг. 1A и 1B соответственно. Каждый ряд в соответствующих панелях представляет результат бисульфитного секвенирования для одного клона, в то время как каждый столбец представляет отдельный динуклеотид CpG в этой геномной последовательности. Долю метилированных клонов среди всех этих секвенированных клонов,индекс метилирования, в каждом CpG-сайте определяли для всех пяти проб плацентарных тканей и клеток материнской крови. Эти результаты суммированы на фиг. 2 А и 2 В. Можно видеть, что плацента является гипометилированной в сравнении с клетками материнской крови. Хи-квадрат-анализ выполняли- 16014274 для сравнения распределения метилированных и неметилированных клонов между плацентарными тканями и клетками материнской крови в каждом CpG-сайте. Различия в индексах метилирования между плацентой и клетками материнской крови являются статистически значимыми для всех из 21 CpG-сайта(хи-квадрат, Р 0,0001, табл. 2 А и 2 В). Таблица 2 А Суммирование данных бисульфитного секвенирования и сравнение с использованием хи-квадрат-анализа профиля метилирования плацентарных тканей и клеток материнской крови в отдельных CpG-сайтах в районе A CGI137. Отдельные CpG-сайты обозначены по их положениям нуклеотидов относительно Таблица 2 В Суммирование данных бисульфитного секвенирования и сравнение с использованием хи-квадрат-анализа профиля метилирования плацентарных тканей и клеток материнской крови в отдельных CpG-сайтах в районе В CGI137. Отдельные CpG-сайты обозначены по их положениям нуклеотидов относительно chr21: 46,249,636 (+1) Human May 2004 (hg17) блока браузера UCSC Genome Фосфодиэстераза 9 А (PDE9A) Профиль метилирования PDE9A исследовали среди плацентарных тканей и соответствующих клеток материнской крови, собранных из пяти беременных женщин третьего триместра. Выполняли клонирование и бисульфитное секвенирование, и индексы метилирования исследованных CpG-сайтов в плацентарных тканях и клетках материнской крови для ампликона района А суммированы на фиг. 3 А и 3 В. Соответствующие результаты для района В суммированы на фиг. 3 С и 3D. Сравнения между плацентарными тканями и клетками материнской крови третьего семестра для района С показаны на фиг. 3 Е. Обычно плацента является гипометилированной в сравнении с клетками материнской крови. Анализ с использованием хи-квадрата выполняли, как описано выше, для оценки статистически значимых различий между этими двумя тканями. Все, кроме CpG2250 в сравнении третьего триместра, являются статистически значимо различными в случае беременностей как первого, так и третьего семестра (хи-квадратанализ, табл. 3 А-E).- 17014274 Таблица 3 А Суммирование данных бисульфитного секвенирования, индексов метилирования и сравнения с использованием хи-квадрат-анализа профиля метилирования плацентарных тканей и клеток материнской крови третьего триместра в отдельных CpG-сайтах в районе A PDE9A. Отдельные CpG-сайты обозначены по их положениям нуклеотидов относительно chr21: 42,978,424 (+1) Human May 2004 (hg17) блока браузера Таблица 3 В Суммирование данных бисульфитного секвенирования, индексов метилирования и сравнения с использованием хи-квадрат-анализа профиля метилирования плацентарных тканей и клеток материнской крови первого триместра в отдельных CpG-сайтах в районе A PDE9A. Отдельные CpG-сайты обозначены по их положениям нуклеотидов относительно chr21: 42,978,424 (+1) Human May 2004 (hg17) блока браузера UCSC Genome Таблица 3 С Суммирование данных бисульфитного секвенирования, индексов метилирования и сравнения с использованием хи-квадрат-анализа профиля метилирования плацентарных тканей и клеток материнской крови третьего триместра в отдельных CpG-сайтах в районе В PDE9A. Отдельные CpG-сайты обозначены по их положениям нуклеотидов относительно chr21: 42,978,718 (+1) Human May 2004 (hg17) блока браузера UCSC Genome- 18014274 Таблица 3D Суммирование данных бисульфитного секвенирования, индексов метилирования и сравнения с использованием хи-квадрат-анализа профиля метилирования плацентарных тканей и клеток материнской крови первого триместра в отдельных CpG-сайтах в районе В PDE9A. Отдельные CpG-сайты обозначены по их положениям нуклеотидов относительно chr21: 42,978,718 (+1) Human May 2004 (hg17) блока браузера UCSC Genome Таблица 3 Е Суммирование данных бисульфитного секвенирования, индексов метилирования и сравнения с использованием хи-квадрат-анализа профиля метилирования плацентарных тканей и клеток материнской крови третьего триместра в отдельных CpG-сайтах в районе С PDE9A. Отдельные CpG-сайты обозначены по их положениям нуклеотидов относительно chr21: 42,978,005 (+1) Протеинфосфатаза 1 Homo sapiens, псевдоген 2-й регуляторной (ингибиторной) субъединицы 2 (PPP1R2P2) Профиль метилирования района A PPP1R2P2 исследовали среди плацентарных тканей и соответствующих клеток материнской крови, собранных от пяти беременных женщин третьего триместра и пяти беременных женщин первого триместра. Выполняли клонирование и бисульфитное секвенирование, и индексы метилирования исследованных CpG-сайтов для района А в плацентарных тканях и клетках материнской крови для ампликона района А суммированы на фиг. 4 А и 4 В. Обычно плацента является гипометилированной в сравнении с клетками материнской крови. Анализы с использованием хи-квадрата выполняли, как описано выше, для оценки статистически значимых различий между этими двумя тканями. Среди исследованных CpG-сайтов 23 являются статистически значимо различными в беременностях третьего триместра и 23 являются статистически значимо различными в беременностях первого триместра (анализ с использованием хи-квадрата, табл. 4 А и 4 В). Кроме того, профиль метилирования CpG-сайтов в районе В PPP1R2P2 также анализировали клонированием и бисульфитным секвенированием в плацентарных тканях и соответствующих клетках материнской крови, собранных из пяти беременностей- 19014274 третьего триместра. Для большинства CpG-сайтов в районе В плацентарная ткань является гипометилированной в сравнении с клетками материнской крови. Индексы метилирования в районе В суммированы на фиг. 4 С. Хи-квадрат-анализ выполняли, как описано выше для оценки на статистически значимые различия между этими двумя тканями. Среди двенадцати исследованных CpG-сайтов пять являются статистически значимо различными (хи-квадрат-анализ, табл. 4C). Таблица 4 А Суммирование данных бисульфитного секвенирования, индексов метилирования и сравнения с использованием хи-квадрат-анализа профиля метилирования плацентарных тканей и клеток материнской крови третьего триместра в отдельныхCpG-сайтах в районе A PPP1R2P2. Отдельные CpG-сайты обозначены по их положениям нуклеотидов относительно chr21: 36,180,493 (+1) Human May 2004 (hg17) блока браузера UCSC Genome Таблица 4 В Суммирование данных бисульфитного секвенирования, индексов метилирования и сравнения с использованием хи-квадрат-анализа профиля метилирования плацентарных тканей и клеток материнской крови первого триместра в отдельных CpG-сайтах в районе A PPP1R2P2. ОтдельныеCpG-сайты обозначены по их положениям нуклеотидов относительно- 20014274 Таблица 4 С Суммирование данных бисульфитного секвенирования, индексов метилирования и сравнения с использованием хи-квадрат-анализа профиля метилирования плацентарных тканей и клеток материнской крови первого триместра в отдельных CpG-сайтах в районе В PPP1R2P2. ОтдельныеCpG-сайты обозначены по их положениям нуклеотидов относительно Сходство с Fem1A (Caenorhabditis elegans (С. elegans Профиль метилирования сходства с Fem1A (C. elegans) исследовали среди плацентарных тканей и соответствующих клеток материнской крови, собранных у пяти беременных женщин третьего триместра,Выполняли клонирование и бисульфитное секвенирование, и индексы метилирования исследованныхCpG-сайтов в плацентарных тканях и клетках материнской крови суммированы на фиг. 5 А и 5 В. Обычно плацента является гипометилированной в сравнении с клетками материнской крови. Анализы с использованием хи-квадрата выполняли, как описано выше, для оценки статистически значимых различий между этими двумя тканями. Среди исследованных CpG-сайтов восемь являются статистически значимо различными в районе А и семь являются статистически значимо различными в районе В (анализ с использованием хи-квадрата, табл. 5 А и 5 В). Таблица 5 А Суммирование данных бисульфитного секвенирования, индексов метилирования и сравнения с использованием хи-квадрат-анализа профиля метилирования плацентарных тканей и клеток материнской крови третьего триместра в отдельных CpG-сайтах в районе А сходства с Fem1A. Отдельные CpG-сайты обозначены по их положениям нуклеотидов относительно chr21: 14,056,070 (+1) Human May 2004 (hg17) блока браузера- 21014274 Таблица 5 В Суммирование данных бисульфитного секвенирования, индексов метилирования и сравнения с использованием хи-квадрат-анализа профиля метилирования плацентарных тканей и клеток материнской крови третьего триместра в отдельных CpG-сайтах в районе В сходства с Fem1A. ОтдельныеCpG-сайты обозначены по их положениям нуклеотидов относительно chr21: 14,056,070 (+1) Human May 2004 (hg17) блока браузера UCSC GenomeCGI009 Профили метилирования CGI009 из двух проб клеток материнской крови сравнивали с профилями метилирования CGI009 двух проб плацентарных тканей первого триместра и двух проб третьего триместра, собранных у нормальных беременностей, а также двух проб плацентарных тканей первого триместра из беременностей, в которых плод имел трисомию 21. Выполняли клонирование и бисульфитное секвенирование, и индексы метилирования исследованных CpG-сайтов в плацентарных тканях и клетках материнской крови суммированы на фиг. 6. Обычно плацента является гиперметилированной в сравнении с клетками материнской крови. Карбонилредуктаза 1 (CBR1 Профили метилирования CBR1 из двух проб клеток материнской крови сравнивали с профилями метилирования CBR1 двух проб плацентарной ткани первого триместра, собранных у нормальных беременностей, а также двух проб плацентарной ткани первого триместра из беременностей, в которых плод имел трисомию 21. Выполняли клонирование и бисульфитное секвенирование, и индексы метилирования исследованных CpG-сайтов в плацентарных тканях и клетках материнской крови суммированы на фиг. 6. Обычно плацента является гиперметилированной в сравнении с клетками материнской крови. Среди 20 исследованных CpG-сайтов все являются статистически значимо различающимися между клетками материнской крови и плацентарными тканями первого триместра как нормальной беременности,так и беременности с трисомией (хи-квадрат-анализ, табл. 6). Таблица 6 Суммирование данных бисульфитного секвенирования, индексов метилирования и сравнения с использованием хи-квадрат-анализа профиля метилирования нормальных и имеющих трисомию 21 в отдельных CpG-сайтах плацентарных тканей и клеток материнской крови первого триместра в отдельных CpG-сайтах в CBR1. ОтдельныеCpG-сайты обозначены по их положениям нуклеотидов относительно chr21: 36,363,538 (+1) Human May 2004 (hg17) блока браузера UCSC Genome Молекула адгезии клеток синдрома Дауна (DSCAM) Профили метилирования DSCAM из двух проб материнской крови сравнивали с профилями метилирования двух проб плацентарной ткани первого триместра и двух проб плацентарной ткани третьего триместра, собранных у нормальных беременностей, а также двух проб плацентарной ткани первого триместра из беременностей, в которых плод имел трисомию 21. Выполняли клонирование и бисульфитное секвенирование, и индексы метилирования исследованных CpG-сайтов в плацентарных тканях и клетках- 22014274 материнской крови суммированы на фиг. 8. Обычно плацента является гиперметилированной в сравнении с клетками материнской крови. Среди 27 исследованных CpG-сайтов все являются статистически значимо различающимися между клетками материнской крови и плацентарными тканями первого триместра как нормальной беременности, так и беременности с трисомией (хи-квадрат-анализ, табл. 7). Таблица 7 Суммирование данных бисульфитного секвенирования, индексов метилирования и сравнения с использованием хи-квадрат-анализа профиля метилирования нормальных и имеющих трисомию 21 плацентарных тканей и клеток материнской крови первого триместра в отдельных CpG-сайтах в DSCAM. Отдельные CpG-сайты обозначены по их положениям нуклеотидов относительно chr21: 41,139,872 (+1) Human May 2004 (hg17) блока браузера UCSC Genome Открытая рамка считывания 29 хромосомы 21 (C21orf29) Профили метилирования C21orf29 из двух проб материнских клеток сравнивали с профилями метилирования C21orf29 проб плацентарной ткани 1-го и 2-го триместров, собранных у нормальных беременностей, а также двух проб плацентарной ткани первого триместра из беременностей, в которых плод имел трисомию 21. Выполняли клонирование и бисульфитное секвенирование, и индексы метилирования исследованных CpG-сайтов в плацентарных тканях и клетках материнской крови суммированы на фиг. 9. Обычно плацента является гиперметилированной в сравнении с клетками материнской крови. Среди 16 исследованных CpG-сайтов, все 9 и 10 сайтов были статистически значимо различающимися между клетками материнской крови и плацентарной ткани первого триместра беременностей с трисомией 21, плацентарными тканями первого триместра и третьего триместра нормальных беременностей соответственно (хи-квадрат-анализ, табл. 8).- 23014274 Таблица 8 Суммирование данных бисульфитного секвенирования, индексов метилирования и сравнения с использованием хи-квадрат-анализа профиля метилирования нормальных и имеющих трисомию 21 плацентарных тканей и клеток материнской крови первого триместра в отдельных CpG-сайтах в C21orf29. Отдельные CpG-сайты обозначены по их положениям нуклеотидов относительно Генетические локусы, которые не обнаруживали дифференциального(различного) паттерна метилирования между плацентарными клетками и клетками материнской крови Дифференциальное (различное) метилирование между плацентарными тканями и клетками материнской крови не наблюдали для всех исследованных локусов. Профиль метилирования CGI111 исследовали среди плацентарных тканей и соответствующих клеток материнской крови, собранных из четырех беременностей 3-го триместра. Выполняли клонирование и бисульфитное секвенирование, и эти результаты показаны на фиг. 10. Клоны как из клеток материнской крови, так и из плацентарных тканей были преимущественно неметилированными. Подобным образом профиль метилирования между клетками материнской крови и плацентарными тканями пяти беременностей 3-го триместра не отличались значимо от CGI121, за исключением CpGсайта 1603 (фиг. 11 и табл. 9). Таблица 9 Суммирование данных бисульфитного секвенирования, индексов метилирования и сравнения с использованием хи-квадрат-анализа профиля метилирования плацентарных тканей и клеток материнской крови первого триместра в отдельныхCpG-сайтах в CGI121. Отдельные CpG-сайты обозначены по их положениям нуклеотидов относительно chr21: 45,262,112 (+1) Ншпап May 2004 (hg17) блока браузера UCSC Genome С другой стороны, для KIAA0656, связывающего белка фактора 2 транскрипции теплового шока(HSF2BP) и COL6A1 исследованные плацентарные ткани и клетки материнской крови были в обоих случаях преимущественно метилированными без значимых различий между их индексами метилирования. Пример 2. ЦГ-содержащие геномные последовательности с дифференциальными профилями метилирования между плацентарными тканями и клетками материнской крови применимы в качестве фетальных эпигенетических маркеров для детектирования материнской крови. Для отличия происходящих из фетуса молекул ДНК от молекул ДНК, которые получены из матери в материнской крови, анализы должны быть направлены на детектирование специфической для плаценты эпигенетической формы каждого дифференциально метилированного локуса. Был разработан анализ, направленный на специфическую для плаценты- 24014274 форму CGI137 (фиг. 1), а именно на неметилированные молекулы, и была оценена его специфичность. Материалы и способы Обработка проб и экстракция ДНК Пробу плацентарной ткани третьего семестра и соответствующую пробу клеток материнской крови собирали из субъекта, подвергнутого родам посредством планового кесарева сечения. Материнскую кровь (10 мл) собирали в содержащие ЭДТА пробирки до и после родов. Эти пробы центрифугировали при 1600g в течение 10 мин при 4C. Часть, содержащую лейкоцитную пленку, получали после осторожного удаления плазмы и хранили отдельно при -20C. Плазму дополнительно центрифугировали при 16000g в течение 10 мин и 1,6 мл плазмы переносили в чистые полипропиленовые пробирки осторожно,не нарушая лежащий ниже осадок клеток. Биопсии плацентарных тканей промывали в забуференном фосфатом солевом растворе и хранили в простых полипропиленовых пробирках при -80C. ДНК экстрагировали из плацентарных тканей с использованием мининабора QIAamp DNA (Qiagen, Hilden,Germany). ДНК из материнской плазмы и лейкоцитной пленки экстрагировали с использованием мининабора QIAamp DNA Blood (Qiagen, Hilden, Germany) в соответствии с инструкциями изготовителя. Для каждой пробы плацентарной ДНК и ДНК лейкоцитной пленки 1 мкг ДНК подвергали бисульфитному превращению, которое превращает неметилированные остатки цитозина в урацил, но оставляет метилированные остатки цитозина неизмененными, с использованием набора Methylamp DNA ModificationKit (Epigentek Inc., New York, NY) в соответствии с инструкциями изготовителя. ДНК, экстрагированную из 1,6 мл плазмы, также подвергали бисульфитному превращению. Готовили также дополнительные аликвоты смешанной превращенной бисульфитом ДНК, состоящие из смесей препаратов ДНК лейкоцитной пленки и плаценты в соотношениях 95:5. Гомогенный анализ MassEXTEND Поскольку плацентарные ткани являются гипометилированными относительно клеток материнской крови в CGI137 (фиг. 1 и 2), был создан анализ, направленный на детектирование неметилированной формы CGI137. Этот анализ основан на платформе MassARRAY (Sequenom, San Diego, CA) platform. Для специфической амплификации неметилированной формы GPI137 конструируют специфические в отношении метилирования праймеры. Иллюстрация местоположения этих праймеров показана на фиг. 12, а последовательности этих праймеров приведены в списке в табл. 10. Прямой праймер включает в себяCpG-сайты 472, 477, 481 и 486. Обратный праймер включает в себя CpG-сайты 553 и 561. Этот ампликон простирается между координатами: 2742998-2743130 для номера доступа GenBank: NT011515. Анализ удлинения праймеров (фиг. 12), основанный на протоколе гомогенного MassEXTEND (hME), построен на запросе статуса метилирования CpG-сайта 541. По существу, праймер праймерного удлинения простирается до нуклеотида 3' (справа) относительно CpG-сайта 541 (табл. 10). Неметилированная молекула может удлиняться одним нуклеотидом с включением dd(2',3'-дидезоксинуклеозид)ATF, в то время как метилированная молекула может удлиняться двумя нуклеотидами с включением dGTP с последующим включением ddATP. Затем эти неметилированные и метилированные молекулы детектируют и разрешают по различиям их массы с использованием масс-спектрометрии на MassARRAY Analyzer Compact(Sequenom). Таблица 10 Последовательности праймеров hME-анализа, направленного на неметилированную форму CGI137 3 мкл превращенной бисульфитом ДНК из проб плаценты (эквивалент 150 нг ДНК перед бисульфитным превращением), материнской лейкоцитной пленки и смесей, а также 10 мкл превращенной бисульфитом ДНК плазмы (эквивалент ДНК, экстрагированной из 1,6 мл материнской плазмы) амплифицировали для каждых 25 мкл ПЦР-реакции. Каждая реакция содержала 1X ПЦР-буфер (Applied Biosystems, Foster City, CA) с 2,0 мМ MgCl2 (Applied Biosystems), 200 мкМ каждого из dATP, dGTP и dCTP,400 мкМ dUTP (Applied Biosystems), 200 нМ каждого из прямого и обратного праймеров (Integrated DNATechnologies, Coralville, IA) и 1 E ДНК-полимеразы AmpliTaq Gold (Applied Biosystems). Реакцию ПЦР инициировали при 95 С в течение 10 мин с последующими денатурацией при 94 С в течение 30 с, отжигом при 60C в течение 40 с, удлинением при 72 С в течение 40 с на протяжении 40 циклов и конечной инкубацией при 72C в течение 5 мин. Продукты ПЦР подвергали действию щелочной фосфатазы мелкого ракообразного для дефосфорилирования любых оставшихся dNTP и предотвращения их включения в последующий анализ удлинения праймеров. Для каждых 25 мкл реакции ПЦР добавляли 0,4 мкл буфера hME (Sequenom), 0,6 мкл щелочной фосфатазы мелкого ракообразного (Sequenom) и 3,06 мкл воды. Эту реакционную смесь инкубировали при 37C в течение 40 мин с последующей инактивацией нагреванием при 85 С в течение 5 мин. Для реакции удлинения праймеров 4 мкл реакционного коктейля удлинения с использованием ос- 25014274 нований, содержащего 1500 нМ праймера удлинения (Integrated DNA Technologies), 1,15 E термосеквеназы (Sequenom) и 64 мкМ каждого из ddATP, ddCTP, dTTP и dGTP (Sequenom), добавляли к 10 мкл продуктов ПЦР. Условиями реакции были 94 С в течение 2 мин с последующими 94C в течение 5 с, 52C в течение 5 с и 72C в течение 5 с на протяжении 75 циклов. Конечный продукт удлинения оснований очищали при помощи смолы SpectroCLEAN (Sequenom) для удаления солей, которые могут мешать масс-спектрометрическому анализу. 24 мкл воды и 12 мг смолы добавляли в каждый продукт удлинения оснований. Эти конечные смеси смешивали в ротаторе в течение 20 мин. После центрифугирования при 361 g в течение 5 мин приблизительно 10 нл реакционного раствора распределяли на 384-формат SpectroCHIP (Sequenom), на котором предварительно были нанесены пятна 3-гидроксипиколиновой кислоты с использованием автоматического раздаточного устройства SpectroPoint nanodispenser (Sequenom). Для получения данных из SpectroCHIP использовали массспектрометр MassARRAY Analyzer Compact (Sequenom). Macc-спектрометрические данные автоматически передавали в базу данных SpectroTYPER (Sequenom) для анализа. Результаты и заключение Масс-спектры для MassARRAY-анализов показаны на фиг. 13. Продукт удлинения праймера для неметилированной формы CGI137 может быть детектирован в пробах ДНК плаценты и плазмы перед родами, а также смесях 95:5 ДНК материнской лейкоцитной крови и плаценты. Эти результаты предполагают, что этот анализ является чувствительным для детектирования происходящей из плаценты неметилированной формы CGI137 в материнской плазме и смесях ДНК вплоть до фракционной концентрации 5%. Сигнал не детектировали в пробе материнской плазмы после родов, что подтверждает специфичность в отношении беременности этой неметилированной формы CGI137. Отсутствие сигнала в пробе материнской лейкоцитной пленки также подтверждает специфичность этого анализа в отношении детектирования неметилированной формы CGI137. Таким образом, вследствие различий в профиле метилирования CGI137 между плацентарными тканями и клетками материнской крови, могут быть разработаны чувствительные и специфические анализы, нацеленные на детектирование происходящей из плаценты формы CGI137 среди фона метилированных молекул CGI137, происходящих из клеток материнской крови. Поскольку плацента является тканевым источником высвобождения фетальной ДНК в материнский кровоток (Chim et al., supra), в котором содержится высокий фон ДНК, происходящих из клеток материнской крови (Liu et al., supra), анализы, нацеленные на плацента-специфические эпигенетические маркеры,применимы для детектирования фетус-специфических молекул нуклеиновых кислот в материнской крови. Пример 3. Альтернативный способ, объединенный бисульфитный-рестрикционный анализ (COBRA) (Xiongand Laird Nucleic. Acids. Res., 25:2532-2534, 1997), использовали для оценки на присутствие дифференциального метилирования трех геномных последовательностей на хромосоме 21 (табл. 11) между ДНК из плацент и клеток материнской крови. Таблица 11 Идентичность, местоположение, последовательности праймеров и условия реакции ПЦР исследованных геномных последовательностей на хромосоме 21. Соответствующие районы на геномных контигах (номер доступа, версия, номера стартового и конечного нуклеотидов), депонированных в GenBank Национального центра информации биотехнологии, и положения в хромосомах (хромосома, номера стартового и конечного нуклеотидов) на Human May 2004 (hg17) блока браузераUCSC Genome (genome.ucsc.edu) показаны во втором и третьем столбцах соответственно Материалы и способы Объединенный бисульфитный-рестрикционный анализ (COBRA) Один мкг ДНК подвергали бисульфитному превращению с использованием набора для метилирования ДНК EZ (Zymo Research, Orange, CA) в соответствии с инструкциями изготовителя. Затем 40 нг превращенной бисульфитом ДНК (в расчете на исходное введение непревращенной ДНК) подвергали ПЦР-амплификации, как описано в примере 1, с некоторыми модификациями. Использовали реагенты,поставляемые в наборе HotStar Taq DNA Polymerase (Qiagen, Hilden, Germany). Композиции реагентов для каждой ПЦР подробно описаны в табл. 11. Обычно ПЦР выполняли в конечном объеме реакции 20 мкл, с MgCl2, праймерами, HotStar Taq, 1X ПЦР-буфером, 50 мкМ каждого из dNTP и 2 Х PCRxусилителем (Invitrogen, Carlsbad, CA). Профиль температур состоял из начальной стадии денатурации(табл. 11), 72C в течение 1,5 мин и конечного удлинения 72C в течение 3 мин. Затем продукты ПЦР подвергали расщеплению рестрикционными ферментами. Рестрикционный фермент, подлежащий использованию для каждого соответствующего локуса, отбирали на его способность различать между метилированной и неметилированной последовательностью после бисульфитного превращения. По существу, сайты рестрикции присутствуют только либо в метилированной последовательности, либо в неметилированной последовательности, но не в обеих, так что одна из этих последовательностей будет расщепляться, тогда как другая будет оставаться интактной (табл. 12). Расщепления рестрикционными ферментами выполняли в конечном реакционном объеме 20 мкл, с 5 мкл продуктов ПЦР, 1X подходящим буфером и 10 E рестрикционного фермента (или без рестрикционного фермента для ложного расщепления), при рекомендуемых изготовителем температурах в течение 2 ч. Все ферменты покупали из NewEngland Biolabs (Beverly, MA). Затем расщепленные продукты анализировали гель-электрофорезом. Таблица 12 Прогнозирование результатов для анализа COBRA Клонирование и бисульфитное секвенирование ДНК из той же самой реакции ПЦР-амплификации, описанной в разделе "Объединенный бисульфитный-рестрикционный анализ (COBRA)", представленном выше, использовали для клонирования и бисульфитного секвенирования. Для анализа статуса метилирования при разрешении единственной молекулы продукт ПЦР ТА-клонировали в плазмидный вектор с использованием векторной системыpGEM-T Easy (Promega, Madison, WI). Инсерты из положительных рекомбинантных клонов анализировали циклическим секвенированием с использованием набора BigDye Terminator Cycle Sequencing v1.1(Applied Biosystems) в соответствии с инструкциями изготовителя. После очистки осаждением этанолом пробы ресуспендировали 10 мкл формамида Hi-Di и анализировали на ДНК-анализаторе 3100 (AppliedBiosystems). Результаты и заключение Голокарбоксилаза-синтетаза (HLCS) Профили метилирования предположительного района промотора HLCS из двух проб материнской крови сравнивали с этими профилями метилирования из двух проб плацентарной ткани первого триместра и двух проб третьего триместра, собранных у нормальных беременностей, а также двух проб плацентарной ткани первого триместра из имеющих трисомию 21 беременностей. Выполняли анализ COBRA, и результаты гель-электрофореза для района А, района B1 и района В 2 показаны на фиг. 14 А, 14 В и 14 С соответственно. Обычно плацента является гиперметилированной в сравнении с клетками материнской крови. Эксперимент по клонированию и бисульфитному секвенированию выполняли на районе В 2 для дополнительного анализа статуса метилирования при разрешении отдельной молекулы, и этот результат, показанный на фиг. 17, подтвердил, что метилирование в HLCS является плацента-специфическим.CGI009 Профили метилирования CGI009 из двух проб клеток материнской крови сравнивали с этими профилями метилирования двух проб плацентарной ткани первого триместра и двух проб третьего триместра, собранных у нормальных беременностей, а также двух проб плацентарной ткани из имеющих трисомию 21 беременностей. Выполняли анализ COBRA, и результаты гель-электрофореза показаны на фиг. 15. Обычно плацента является гиперметилированной в сравнении с клетками материнской крови.CGI132 Профили метилирования CGI132 из двух проб клеток материнской крови сравнивали с этими профилями метилирования двух проб плацентарной ткани первого триместра и двух проб третьего триместра, собранных у нормальных беременностей, а также двух проб плацентарной ткани из имеющих трисомию 21 беременностей. Выполняли анализ COBRA, и результаты гель-электрофореза показаны на фиг. 16. Обычно плацента является гиперметилированной в сравнении с клетками материнской крови. Пример 4. На основе признака дифференциального метилирования идентифицированных маркеров в плацентарных тканях и клетках материнской крови был разработан альтернативный способ применения чувствительного к метилированию расщепления рестрикционными ферментами с последующей количественной ПЦР реального времени для количественного анализа дифференциального метилирования геномной- 27014274 последовательности района В 2 HLCS (табл. 11) между ДНК из плацент и клеток материнской крови. Материалы и методы Чувствительное к метилированию расщепление рестрикционными ферментами ДНК экстрагировали из плацентарных тканей с использованием мининабора QIAamp DNA (Qiagen,Hilden, Germany). ДНК из материнской лейкоцитной пленки и плазмы экстрагировали с использованием мининабора QIAamp DNA Blood (Qiagen, Hilden, Germany) в соответствии с инструкциями изготовителя. Для каждой пробы ДНК плаценты и лейкоцитной пленки 100 нг ДНК подвергали чувствительному к метилированию расщеплению рестрикционными ферментами. Расщепления рестрикционными ферментами выполняли в конечном реакционном объеме 50 мкл с ДНК, подходящим 1X буфером и 25 E Нра II и 50 EBstU I (или без ферментов для ложного расщепления) при рекомендуемых изготовителем температурах в течение по меньшей мере 16 ч. Для каждой пробы материнской плазмы использовали 1,6 мл плазмы для экстракции ДНК и элюировали в 50 мкл деионизованной воды, 21 мкл которой подвергали расщеплению рестрикционными ферментами. Расщепления рестрикционными ферментами выполняли в конечном реакционном объеме 30 мкл с ДНК, подходящим 1X буфером и 20 E Нра II и 30 E BstU I (или без ферментов для ложного расщепления) при рекомендуемых изготовителем температурах в течение по меньшей мере 16 ч. Все ферменты приобретали из New England Biolabs (Beverly, MA). Затем расщепленные продукты анализировали количественной ПЦР реального времени. Отобранные рестрикционные ферменты расщепляют только неметилированную ДНК, но не метилированную ДНК. Поскольку данные из примера 3 показали, что HLCS является гиперметилированной в плацентарных тканях и гипометилированной в клетках материнской крови, авторы ожидают, что доля ДНК из плацентарных тканей будет оставаться детектируемой, в то время как большая часть ДНК из клеток материнской крови будет расщепляться и,следовательно, будет недетектируемой после обработки рестрикционными ферментами. Количественная ПЦР реального времени Был разработан ПЦР-анализ для количественного анализа геномной ДНК HLCS с расщеплением и без расщепления рестрикционными ферментами. 4 мкл обработанной рестрикционным ферментом ДНК или ложно расщепленную пробу использовали в анализе ПЦР реального времени. Каждая реакция содержит 1X основную универсальную смесь для ПЦР (TaqMan Universal PCR Master Mix) (Applied Biosystems, Foster City, CA), 300 нМ прямого праймера (5'-CCGTGTGGCCAGAGGTG-3': SEQ ID NO:60) 300 нМ обратного праймера (5'-TGGGAGCCGGAACCTACC-3': SEQ ID NO:61) и 100 нМ зонда TaqMan(5'-6FAM-TCCCGACCTGGCCCTTTGCC-TAMRA-3': SEQ ID NO:62). Профиль температур был следующим: 50C в течение 2 мин, 95C в течение 10 мин, 50 циклов 95C в течение 15 с и 60C в течение 1 мин. Все реакции выполняли в двух повторностях и определяли среднее значение. Серийно разведенную геномную ДНК человека первоначально определяли количественно измерением оптической плотности в качестве количественного стандарта для этого анализа. Поскольку детектируемая ДНК HLCS после расщепления рестрикционными ферментами представляла метилированную фракцию, авторы выражали количественную ПЦР реального времени как индекс метилирования. Индекс метилирования пробы рассчитывали делением концентрации ДНК HLCS после расщепления ферментами на концентрацию ДНК,полученную с ложным расщеплением. Результаты и заключение Профили метилирования предположительного района промотора HLCS из восьми проб материнской крови сравнивали с этими профилями метилирования из двух проб плацентарной ткани первого триместра и двух проб третьего триместра, собранных у нормальных беременностей. За расщеплением рестрикционными ферментами следовал анализ ПЦР реального времени, и эти результаты показаны на фиг. 18. ДНК из всех проб клеток материнской крови наиболее сильно расщеплялись рестрикционными ферментами, приводя к индексам метилирования, приближающимся к 0; в то время как ДНК из плацентарных тканей были частично расщепленными, что приводило к уровням метилирования 0,567-0,966. Предшествующие результаты предполагают, что плацента является преобладающим тканевым источником фетальной ДНК, в то время как клетки материнской крови являются основным поставщиком фоновых материнских ДНК, которые детектируются в материнской плазме. Авторы изобретения считают, что плацента-специфическая (со ссылкой на клетки материнской крови) фракция ДНК HLCS, а именно метилированная или нерасщепляемая фракция, может быть детектирована в материнской плазме и является специфической в отношении беременности. Парные пробы плазмы 3-го триместра до и после родов брали у 25 нормальных беременных индивидуумов. Выполняли расщепление рестрикционными ферментами с последующим анализом ПЦР реального времени, и эти результаты представлены на фиг. 19. Показано, что сигнал HLCS положительно детектировался в расщепленных ферментами пробах плазмы 3-го триместра перед родами и уменьшался после родов. Медиана концентрации HLCS в пробах плазмы после родов после расщепления ферментами была равна 8,1% этой медианы концентрации в пробах плазмы перед родами после расщепления ферментами (фиг. 19A). Картина клиренса из обработанной ферментами до и после родов плазмы показывает, что детектируемый сигнал HLCS является специфическим для плаценты. Напротив, медианная концентрация ДНК HLCS в материнской плазме после родов с ложным расщеплением рестрикционными ферментами была равна 83,8% концентрации ДНК в пробах с ложным расщеплением перед родами (фиг. 19 В).- 28014274 Все патенты, заявки на патент и другие публикации, цитируемые в этой заявке, в том числе опубликованные аминокислотные или полинуклеотидные последовательности, включены в качестве ссылки в полном виде для всех целей. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Способ детектирования или мониторинга ассоциированного с беременностью нарушения у беременной женщины, предусматривающий стадии:(a) получения биологической пробы от женщины, где этой пробой является цельная кровь, сыворотка, плазма, моча или слюна;(b) определения статуса метилирования CpG-содержащей геномной последовательности в этой пробе, где эта геномная последовательность у плода и эта геномная последовательность у женщины являются дифференциально (различно) метилированными, с различением посредством этого этой геномной последовательности у женщины и этой геномной последовательности у плода в этой пробе, где эта геномная последовательность имеет длину по меньшей мере 15 нуклеотидов, содержит по меньшей мере один цитозин и находится в районе хромосомы 21 и где этот район состоит из (1) геномного локуса, выбранного из группы, состоящей из CGI137, фосфодиэстеразы 9 А (PDE9A), протеинфосфатазы 1 homo(Caenorhabditis elegans), CGI009, карбонилредуктазы 1 (CBR1), молекулы адгезии клеток синдрома Дауна(DSCAM), открытой рамки считывания 29 хромосомы 21 (C21orf29), голокарбоксилазы-синтетазы(HLCS) и CGI132; и (2) последовательности ДНК не более 10 т.п.н. слева и/или справа от этого локуса;(c) определения уровня этой геномной последовательности у плода;d) сравнения уровня этой геномной последовательности у плода со стандартным контролем, где увеличение или уменьшение от этого стандартного контроля указывает на присутствие или прогрессирование ассоциированного с беременностью нарушения. 2. Способ по п.1, в котором эта геномная последовательность у женщины является метилированной,а эта геномная последовательность у плода является неметилированной. 3. Способ по п.1, в котором эта геномная последовательность у женщины является неметилированной, а эта геномная последовательность у плода является метилированной. 4. Способ по п.1, в котором стадию (b) выполняют обработкой пробы реагентом, который дифференциально модифицирует метилированную и неметилированную ДНК. 5. Способ по п.4, в котором этот реагент содержит бисульфит. 6. Способ по п.4, в котором этот реагент содержит один или несколько ферментов, которые предпочтительно расщепляют метилированную ДНК. 7. Способ по п.4, в котором этот реагент содержит один или несколько ферментов, которые предпочтительно расщепляют неметилированную ДНК. 8. Способ по п.1, в котором стадию (b) выполняют с использованием специфической в отношении метилирования ПЦР. 9. Способ детектирования или мониторинга ассоциированного с беременностью нарушения у беременной женщины, предусматривающий стадии:(a) получения ДНК в биологической пробе у женщины, где этой пробой является цельная кровь,сыворотка, плазма, моча или слюна;(b) обработки ДНК из стадии (а) бисульфитом и(c) выполнения реакции амплификации с использованием ДНК из стадии (b) и двух праймеров для амплификации CpG-содержащей геномной последовательности, где эта геномная последовательность имеет длину по меньшей мере 15 нуклеотидов, содержит по меньшей мере один цитозин и находится в районе хромосомы 21 и где этот район состоит из (1) геномного локуса, выбранного из группы, состоящей из CGI137, фосфодиэстеразы 9 А (PDE9A), протеинфосфатазы 1 homo sapiens, псевдогена 2 регуляторной (ингибиторной) субъединицы 2 (PPP1R2P2), сходства с Fem1A (Caenorhabditis elegans), CGI009,карбонилредуктазы 1 (CBR1), молекулы адгезии клеток синдрома Дауна (DSCAM), открытой рамки считывания 29 хромосомы 21 (C21orf29), голокарбоксилазы-синтетазы (HLCS) и CGI132; и (2) последовательности ДНК не более 10 т.п.н. слева и/или справа от этого локуса; и где по меньшей мере один из этих двух праймеров связывается дифференциально с геномной последовательностью у плода; и(d) сравнения уровня амплифицированной части геномной последовательности из стадии (с) со стандартным контролем, где увеличение или уменьшение от стандартного контроля указывает на присутствие или прогрессирование ассоциированного с беременностью нарушения. 10. Способ по п.9, в котором этой реакцией амплификации является полимеразная цепная реакция(ПЦР). 11. Способ по п.9, в котором этой реакцией амплификации является специфическая в отношении метилирования ПЦР. 12. Способ по п.9, в котором этой реакцией амплификации является амплификация на основе последовательности нуклеиновой кислоты.
МПК / Метки
МПК: C12Q 1/68
Метки: мониторинга, маркеры, новые, диагностики, пренатальной
Код ссылки
<a href="https://eas.patents.su/30-14274-novye-markery-dlya-prenatalnojj-diagnostiki-i-monitoringa.html" rel="bookmark" title="База патентов Евразийского Союза">Новые маркеры для пренатальной диагностики и мониторинга</a>
Многофункциональные маркеры продуктов и способы их получения и применения
Номер патента: 9689
Опубликовано: 28.02.2008
Авторы: Тэнджен Н.Майкл, Найтингейл Стефен Д.
МПК: A23L 1/052, A23L 1/00, A23L 1/0534...
Метки: получения, маркеры, многофункциональные, способы, продуктов, применения
Формула / Реферат:
1. Многофункциональный маркер продуктов, который содержит, по существу, сплошной поперечный сегмент основного полимерного волокна, имеющего продольную ось, в котором: (i) указанный поперечный сегмент имеет, по существу, параллельные первую и вторую лицевые стороны и по меньшей мере одну дополнительную лицевую сторону, по существу, перпендикулярную указанной первой лицевой стороне и/или второй лицевой стороне и, по существу, параллельную...
Способ идентификации сероокисляющих бактерий и мониторинга элементарной серы в окружающей среде
Номер патента: 14242
Опубликовано: 29.10.2010
Авторы: Де Ферра Франческа, Кризари Антонелла
МПК: C12Q 1/68
Метки: идентификации, бактерий, сероокисляющих, мониторинга, элементарной, окружающей, среде, способ, серы
Формула / Реферат:
1. Способ идентификации сероокисляющих бактерий в почве, включающий выделение ДНК из почвенных образцов окружающей среды и последующую идентификацию по меньшей мере одного фрагмента рибосомального гена Thio 16S и/или гена SoxB, присутствующего у этих бактерий, посредством амплификации гена в присутствии пар олигонуклеотидов, комплементарных гену Thio 16S, выбранных из следующих пар последовательностей:и/или в присутствии пар олигонуклеотидов,...
Способы обнаружения, характеристики и мониторинга углеводородных месторождений
Номер патента: 9055
Опубликовано: 26.10.2007
Авторы: Рамстад Марит Валеур, Котлар Ханс Кристиан, Бракстад Одд Гуннар, Руэслаттен Хакон Гуннар
МПК: C12Q 1/68
Метки: углеводородных, обнаружения, способы, характеристики, мониторинга, месторождений
Формула / Реферат:
1. Способ обнаружения, характеристики или мониторинга углеводородной зоны, включающий генотипический анализ образца на присутствие одного или более чем одного термофильного или экстремофильного микроорганизма, где указанная характеристика включает в себя корреляцию присутствия одного или более чем одного указанного микроорганизма со свойствами рассматриваемых углеводородов. 2. Способ по п.1, где образец получен из подповерхностной формации. 3....
Тест-система для диагностики рака предстательной железы и способ диагностики рака предстательной железы
Номер патента: 11694
Опубликовано: 28.04.2009
Авторы: Кузнецова Екатерина Михайловна, Северин Сергей Евгеньевич, Савватеева Мария Владимировна, Северин Евгений Сергеевич, Будорагин Евгений Сергеевич
МПК: G01N 21/59, G01N 33/68
Метки: диагностики, рака, железы, тест-система, способ, предстательной
Формула / Реферат:
1. Тест-система для диагностики рака предстательной железы, характеризующаяся веществом для проверки качества реакции, буфером, планшетным фотометром с планшетами с постоянной длиной оптического пути L, холодильной установкой и центрифугой, отличающаяся тем, что в качестве вещества для проверки качества реакции используют рекомбинантный белок хепсин, в качестве субстрата используют вещество, выбираемое из группы веществ, обладающих способностью...
Беспроводное устройство мониторинга
Номер патента: 10438
Опубликовано: 29.08.2008
Авторы: Нефф Рэймонд Линн, Барретт Фред
МПК: G01S 13/75
Метки: устройство, мониторинга, беспроводное
Формула / Реферат:
1. Устройство мониторинга транспортного контейнера, содержащее источник питания, датчик, размещенный на внутренней поверхности контейнера и предназначенный для излучения сигнала, приема отраженного сигнала и формирования сигнала выхода, блок электроники, электрически связанный с датчиком, содержащий микропроцессор и память и предназначенный для детектирования и записи изменения излученного сигнала как инициирующего события, радиопередатчик,...