Композиция поликлональных анти-rhd антител, способ её получения и применение композиции

Изобретение относится к способу получения композиции рекомбинантного поликлонального антитела против RhD (анти-RhD rpAb). Способ предусматривает получение совокупности клеток, трансфицированных библиотекой векторов экспрессии антител против RhD, где каждая клетка в совокупности способна экспрессировать с содержащего VH и VL участка нуклеиновой кислоты один из членов библиотеки, который кодирует различный член композиции рекомбинантного поликлонального антитела против RhD и который расположен в одном и том же участке в геноме отдельных клеток в указанной совокупности. Клетки культивируют в приемлемых условиях для экспрессии рекомбинантного поликлонального антитела, которое получают из клеток или супернатанта культуры. Участки нуклеиновых кислот, кодирующие рекомбинантное поликлональное антитело против RhD, вводят в клетки посредством трансфекции библиотекой векторов для сайт-специфического встраивания. Настоящий способ можно использовать для получения рекомбинантного поликлонального антитела против RhD, делая, таким образом, доступной лучшую замену получаемых из плазмы профилактических и терапевтических продуктов иммуноглобулинов. 014182 Область техники, к которой относится изобретение В настоящем изобретении описано получение композиции рекомбинантных поликлональных антител против резус-фактора D (анти-RhD rpAb), а также показан общий подход к созданию рабочего банка поликлональных клеток для дальнейшего получения желаемого поликлонального антитела. Также изобретение относится к библиотекам, кодирующим анти-RhD rpAb, и к линиям клеток, продуцирующим анти-RhD rpAb. Кроме того, в изобретении описаны фармакологические и диагностические композиции,содержащие анти-RhD rpAb, а также их применение в профилактике гемолитической болезни новорожденных (HDN), лечении идиопатической тромбоцитопенической пурпуры (ITP) и профилактике сенсибилизации к резус-антигену D после ошибочных переливаний крови RhD(+) индивидуумам с кровьюRhD(-). Уровень техники Антигены групп крови по резус-системе расположены на трансмембранных белках эритроцитов и включают в себя так называемые антигены С, с, Е, е и D. Приблизительно 16% популяции европеоидов являются отрицательными по резус-фактору D (RhD(-, что обусловлено наследуемым полиморфизмом. Кроме того, существуют многочисленные генетические и серологические варианты RhD (разделяемые на группы II-VII), из которых наиболее клинически важным является RhDVI. Поскольку положительные по группе VI эритроциты (RBC) несут меньшее количество различных эпитопов белка D, чем RBC других групп, то у индивидуумов RhDVI(+) могут формироваться аллоантитела против RBC другихSystem, Montgomery Scientific Publications, Durham, North Carolina, p. 315-423). IssittAnstee, 1998,11809/id. Сама по себе RhD-отрицательность не связана с какими-либо медицинскими заболеваниями, однако имеет важное медицинское значение, если женщина RhD(-) вынашивает плод RhD(+) или RhDVI(+) или если женщина RhDVI(+) вынашивает плод RhD(+). Аллоиммунизация по RhD от плода к матери может происходить в случае, если эритроциты плода поступают в кровоток матери, как правило, перинатально(в ходе родов) и тем самым индукцируют образование у матери антител против RhD. При последующих беременностях RhD-специфичные молекулы IgG матери проходят через плаценту в кровоток плода и опосредуют лизис эритроцитов плода, вызывая тем самым гемолитическую болезнь новорожденных(HDN). Было подсчитано, что в среднем 20% женщин RhD(-) во второй раз рожают ребенка RhD(+), и у тех, кто не защищен соответствующей профилактикой антителами против резус-фактора D, происходит образование антител против RhD. В отсутствие лечения приблизительно у 30% новорожденных наблюдается умеренная анемия, желтуха и гепатомегалия, у 20% развивается тяжелая анемия и водянка плода,а новорожденные с тяжелыми поражениями имеют риск неонатальной смерти или постоянной нетрудоспособности. Во всем мире для профилактики аллоиммунизации беременных женщин RhD(-) и RhDVI(+) используют препараты поликлональных иммуноглобулинов против RhD, таким образом предотвращая гемолитическую болезнь новорожденных. В настоящее время препараты поликлональных иммуноглобулинов против RhD (анти-D) получают, объединяя плазму крови доноров, гипериммунных вследствие естественной аллоиммунизации RhD или вследствие вакцинации RhD-отрицательных добровольцев мужского пола RhD-положительными эритроцитами. Эффективность препаратов иммуноглобулинов против RhD для профилактики HDN хорошо известна, и их применение было обычной практикой в течение многих лет. В результате это тяжелое заболевание стало редкостью. Тем не менее исходная причина заболевания, т.е. аллоиммунизация беременных женщин RhD(-) иRhDVI(+), по-прежнему существует, и, таким образом, требуется постоянный прием препаратов иммуноглобулинов против резус-фактора D. Кроме профилактики HDN, эффективность анти-D иммуноглобулина также была доказана в лечении идиопатической тромбоцитопенической пурпуры (ITP) (George, J.N., 2002. Blood Rev. 16, 37-38). ITP представляет собой гематологическое заболевание, при котором аутоантитела приводят к ускоренному клиренсу тромбоцитов в селезенке и печени. Симптомами являются сниженные уровни тромбоцитов,приводящие к возникновению синяков и кровотечений. В тяжелых случаях селезенку удаляют. Однако вследствие тяжелого побочного эффекта у новорожденных удаление селезенки невозможно, поэтому необходимы альтернативные варианты лечения, например анти-D иммуноглобулином. Кроме того, антиD иммуноглобулин применяют для предупреждения сенсибилизации у реципиентов PhD(-), которым ошибочно перелили кровь PhD(+). Как уже указано, к существующим в настоящее время способам получения анти-D относится многократная иммунизация группы доноров, число которых уменьшается, для получения высокого титра иммунной сыворотки. Кроме того, при использовании для многократной иммунизации резусположительных RBC существует риск и технические проблемы, например риск передачи вирусных заболеваний, таких как гепатит В, СПИД, и других еще неизвестных вирусов. Также существуют трудности,связанные с различиями разных серий. Следовательно, необходим альтернативный способ получения антител против RhD.-1 014182 В качестве альтернативы гипериммунной сыворотке прежде всего были разработаны клеточные подходы получения моноклональных антител против RhD. К этим способам относится трансформация лимфоцитов вирусом Эпштейна-Барр для создания лимфобластных линий В-клеток (Crawford et al. 1983.Lancet 1, 386-8). Однако такие линии клеток нестабильны и требуют активного клонирования. Получение антител гибридными технологиями также ограничено из-за отсутствия подходящего участника для слияния с клеткой миеломы человека (Kozbor, D. and Roder, J.С., 1983. Immunol. Today. 4, 72). В качестве альтернативы этим способам был разработан молекулярный подход, предусматривающий клонирование совокупности VH и VL, а также конструирование библиотек фагового дисплея(Barbas, C.F. et al. 1991. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88, 7978-7982). Технологию фагового дисплея также можно использовать для выделения веществ, связывающих резус-антиген D. Благодаря этой технологии было выделено большое число моноклональных антител (mAb) со специфичностью связывания резусантигена D (WO 97/49809 и Siegel, D.L. et al. 2002. Transfus. Clin. Biol. 9, 83-97). В последних клинических испытаниях с использованием рекомбинантных анти-RhDVI mAb была показана возможность предотвращения иммунизации RhD после значительного введения RBC RhD(+)(Miescher, S., et al. 2004, Blood, 103, 4028-4035). Однако в испытании также было показано, что mAb менее эффективны в отношении клиренса RBC, чем анти-D иммуноглобулин. Причина этой пониженной скорости клиренса неизвестна. Возможно, что одно антитело не так эффективно, как разнообразие антител, присутствующих в продукте анти-D иммуноглобулина, или что наличие более одного изотипа иммуноглобулинов, т.е. IgG1 и IgG3 (Siegel, Czerwinski, et al. 2002, 10320/id), повышает клиренс RBC. Другой проблемой профилактики HDN, кроме проблемы эффективности, является случай, когда женщина RhDVI(+) вынашивает плод RhD(H-). В этом случае анти-RhDVI mAb не способны предотвращать аллоиммунизацию женщины. Таким образом, для защиты женщин RhD(-) и RhDVI(+) необходим продукт с антителами против резус-антигена D группы VI, а также с антителами, которые связываются не с антигеном группы VI, а с другими обычными резус-антигенами D. Еще одна возможная проблема, связанная с применением моноклональных антител, состоит в том,что они могут быть иммуногенны. Хотя mAb являются человеческими, у женщин, получающих моноклональные антитела, первое введение может приводить к гуморальному иммунному ответу. Теоретически это может происходить из-за того, что участки CDR mAb, если они присутствуют в достаточно большой дозе, могут распознаваться иммунной системой индивидуума, получающего лечение, как чужеродные, так как они не были представлены в организме. Такая реакция делает анти-RhD mAb непригодными для повторного профилактического лечения. Возможно, некоторых из этих вероятных трудностей, связанных с использованием mAb, можно избежать путем смешивания моноклональных антител. Однако такое смешивание подразумевает раздельное получение и очистку неопределенного числа антител, что достаточно дорого. Кроме того, различные свойства партий отдельных моноклональных антител такой смеси могут влиять на конечный продукт. Сущность изобретения Настоящее изобретение относится к способу получения линии продуцирующих клеток, которые могут экспрессировать рекомбинантное поликлональное антитело против RhD (анти-RhD rpAb) в виде единообразной партии. Описание изобретения Настоящее изобретение относится к способам унифицированного получения рекомбинантного поликлонального антитела против RhD (анти-RhD rpAb). Авторы полагают, что благодаря настоящему изобретению появится возможность широкомасштабного производства и получения нового класса профилактических и терапевтических антител против RhD. Теоретически анти-RhD rpAb по настоящему изобретению обладают некоторыми преимуществами по сравнению с моноклональными антителами против резус-фактора D. Прежде всего, на каждый возможный эпитоп резус-фактора D действует более одного антитела, поэтому композицию анти-RhD rpAb можно использовать для профилактического лечения женщин RhD(-) и RhDVI, вынашивающих ребенкаRhD(+). Таким образом, для достижения полного профилактического эффекта нет необходимости смешивать mAb разных партий и проводить очистку. Кроме того, анти-RhD rpAb может быть хорошей альтернативой в тех случаях, когда mAb будут обладать иммуногенностью вследствие высокой концентрации одной или нескольких молекул. Поскольку анти-RhD rpAb по настоящему изобретению состоит из вариантов молекул антител от 5 до 56, то концентрация каждого из них будет низкой, и если концентрацию одного из антител необходимо уменьшить вследствие его иммуногенности, то останется большое разнообразие других антител против резусантигена D, и, таким образом, профилактика сохранит эффективность. Получение анти-RhD rpAb по настоящему изобретению можно проводить в виде единообразной партии из единственной линии клеток. Получение линии поликлональных продуцирующих клеток для получения анти-RhD rpAb представлено в подробном описании и в демонстрационном примере."Ген устойчивости к антибиотику" представляет собой ген, кодирующий белок, который способен защищать клетку от ингибиторного или токсического эффекта антибиотика, обеспечивая выживание и непрерывную пролиферацию клеток в присутствии антибиотика. Термин "антитело" описывает функциональный компонент сыворотки и обычно относится либо к совокупности молекул (антител или иммуноглобулинов), либо к одной молекуле (молекула антитела или молекула иммуноглобулина). Молекула антитела способна связываться или взаимодействовать со специфической антигенной детерминантой (эпитопом антигена или антигенным эпитопом), что, в свою очередь, может приводить к индукции эффекторных механизмов. Как правило, отдельную молекулу антитела рассматривают как моноспецифичную, а композиция молекул антител может быть моноклональной(т.е. состоять из одинаковых молекул антител) или поликлональной (т.е. состоять из различных молекул антител, взаимодействующих с одним и тем же или различными эпитопами на одном и том же антигене или даже на отдельных различных антигенах). Каждая молекула антитела имеет уникальную структуру,которая позволяет ей специфично связываться с соответствующим ей антигеном, а все природные молекулы антител имеют одну и ту же общую основополагающую структуру из двух одинаковых легких цепей и двух одинаковых тяжелых цепей. В собирательном значении антитела также называют иммуноглобулинами. В рамках настоящего изобретения под терминами "антитело" или "антитела" также понимают химерные и одноцепочечные антитела, кроме того, связывающие фрагменты антител, такие как молекулы Fab, Fab' или F(ab)2, фрагменты Fv или одноцепочечные фрагменты Fv, или любой другой стабильный фрагмент, а также полноразмерные молекулы антител и полимерные формы, такие как димерные молекулы IgA или пентавалентные IgM. Термин "участок нуклеиновой кислоты, кодирующий анти-RhD" обозначает участок нуклеиновой кислоты, содержащий пару генетических элементов VH и VL. Участок может дополнительно содержать генетические элементы константной области легкой цепи и/или тяжелой цепи, например константной области легкой цепи каппа или лямбда, и/или один или несколько доменов константной области CH1,CH2, CH3 или CH4, выбранных из одного из изотипов IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2, IgM, IgD иIgE. Предпочтительными изотипами являются IgG1 и/или IgG3. Кроме того, участок нуклеиновой кислоты может содержать кассеты промоторов, которые способствуют двунаправленной или однонаправленной транскрипции последовательностей, кодирующих VH и VL. Также в участке могут присутствовать дополнительные элементы транскрипции или трансляции, такие как функциональные лидерные последовательности, которые нацеливают генный продукт на секреторный путь, сигнальные поли(А)последовательности, UCOE и/или IRES. Термин "рекомбинантное поликлональное антитело против RhD", или "анти-RhD rpAb", обозначает композицию рекомбинантно получаемых различных молекул антител, где отдельные члены способны связываться по крайней мере с одним эпитопом резус-антигена D. Предпочтительно композицию получают из одной линии продуцирующих клеток. Разнообразие поликлонального антитела определяется вариабельными областями (областями VH и VL), в частности областями CDR1, CDR2 и CDR3. Термин "отклонение" используют для обозначения явления в ходе получения рекомбинантного поликлонального антитела, при котором композиция библиотеки экспрессии, линии поликлональных клеток или поликлонального белка изменяется с течением времени вследствие случайных генетических мутаций, различий в кинетике пролиферации отдельных клеток, различий в уровнях экспрессии различных последовательностей экспрессионных конструкций или различий в эффективности клонирования ДНК. Термин "отдельный член анти-RhD rpAb" используют для обозначения отдельной молекулы антитела в композиции рекомбинантного поликлонального антитела, содержащей в вариабельных областях один или несколько фрагментов, для которых характерно различие аминокислотной последовательности по сравнению с другими членами поликлонального белка. В частности, эти фрагменты расположены в областях CDR1, CDR2 и CDR3. В рамках настоящего изобретения под термином "геном" следует понимать не только обычный набор присутствующих в клетке хромосом, но также и внехромосомные элементы, которые могут быть введены и сохранены в клетке. Такие внехромосомные элементы могут включать в себя, но ими не ограничиваются, мини-хромосомы, YAC (искусственные хромосомы дрожжей), MAC (искусственные хромосомы мыши) или НАС (искусственные хромосомы человека). Термин "промоторы "голова-к-голове" относится к паре промоторов, расположенных в непосредственной близости таким образом, что контролируемая транскрипция двух генетических элементов происходит в противоположных направлениях (двунаправленная транскрипция). Конструирование такой системы подробно описано в примере 3 патента США 5789208, который приведен здесь в качестве ссылки в полном объеме. Также промотор "голова-к-голове" можно конструировать с использованием вставки, состоящей из не имеющих значения нуклеиновых кислот между двумя промоторами. Такой вставочный фрагмент может легко содержать более 500 нуклеотидов.-3 014182 Термин "горячая точка", как, например, в "линии клеток с горячей точкой" относится к заранее определенному участку генома клетки, который выбран или сконструирован и охарактеризован для высокоэффективной транскрипции представляющего интерес интегрированного сегмента нуклеиновой кислоты после встраивания вектора экспрессии в этот сайт. Как правило, термин "иммуноглобулин" используют как совокупное обозначение смеси антител,находящихся в крови или сыворотке антител, а также его можно использовать для обозначения смеси антител, полученных из других источников или термин "иммуноглобулин" используют в термине "молекула иммуноглобулина". Термин "сайт внутренней посадки рибосом", или "IRES", описывает структуру, отличную от обычной 5'-кэп структуры мРНК. Обе структуры могут распознаваться рибосомой для начала поиска кодонаAUG и инициации транскрипции. Используя последовательность одного промотора и двух инициирующих AUG, можно транслировать первую и вторую полипептидную последовательность с помощью одной мРНК. Таким образом, для обеспечения совместной трансляции первой и второй полинуклеотидных последовательностей из одной двухцистронной мРНК первую и вторую полинуклеотидные последовательности можно транскрипционно сливать через линкерную последовательность, в том числе последовательность IRES, которая обеспечивает трансляцию полинуклеотидной последовательности, ниже последовательности IRES. В этом случае транскрибируемая двухцистронная молекула РНК транслируется и с 5'-кэп конца, и с внутренней последовательности IRES двухцистронной молекулы РНК, продуцируя,таким образом, первый и второй полипептиды. В рамках настоящего изобретения термин "библиотека" относится к совокупности различных последовательностей нуклеиновых кислот. Например, совокупность различных последовательностей нуклеиновых кислот, кодирующих разнообразную совокупность вариабельных тяжелых цепей и/или вариабельных легких цепей антитела. Если представитель различных последовательностей нуклеиновых кислот состоит из двух различных генетических элементов, например VH и VL, то его обычно называют участком нуклеиновой кислоты. Совокупность различных последовательностей/участков нуклеиновых кислот может находиться в виде набора таких последовательностей нуклеиновых кислот или она может представлять собой совокупность отдельных последовательностей нуклеиновых кислот (например, одна уникальная последовательность в каждой лунке 96-луночного планшета). Обычно библиотека по настоящему изобретению состоит по крайней мере из 3, 5, 10, 20, 50, 1000, 104, 105 или 106 различных членов. В "библиотеке векторов" различные последовательности/участки нуклеиновых кислот были встроены в вектор. Однако термины "библиотека" и "библиотека векторов" также можно использовать взаимозаменяемо. Термин "библиотека векторов экспрессии антител против RhD" относится к совокупности различных последовательностей нуклеиновых кислот кодирующих антител против RhD, которые встроены в вектор, несущий регуляторные элементы для транскрипции антител против RhD. Регуляторные элементы могут быть расположены во встроенных участках нуклеиновой кислоты или в исходной структуре вектора. Предпочтительно векторы экспрессии антитела против RhD также несут по крайней мере одну последовательность распознавания рекомбиназы, например сайт FRT, также они могут нести две различные последовательности распознавания рекомбиназы, такие как сайты FRT и FRT'. Термин "большинство отдельных клеток" относится к проценту клеток, например более 80%, предпочтительно более 85%, более предпочтительно 90, 95 или даже 99% или выше. Термин "перенос вещества" или "перенос в вещество" используют для описания переноса представляющих интерес участков нуклеиновых кислот из одной совокупности векторов в другую совокупность векторов, и перенос осуществляют одновременно для каждого из участков нуклеиновых кислот, без выделения отдельных представляющих интерес участков. Такие совокупности векторов могут быть библиотеками, содержащими, например, представляющие интерес различные участки, промоторы, лидерные последовательности или энхансерные элементы. Эти последовательности можно затем помещать в вектор экспрессии млекопитающего без предварительного выделения, например, из фагового вектора. Этот способ, особенно для последовательностей антител, обеспечивает отсутствие потери связи между разнообразием VH и VL при перемещении библиотек, например, из вектора селекции (например, вектор на основе фагового дисплея) в вектор экспрессии млекопитающего. Таким образом, сохраняются исходные пары VH и VL. В рамках настоящего изобретения термин "функционально связан" относится к участку, связанному с другим участком при помещении в функциональную взаимосвязь с другим участком. Например, ДНК,кодирующая сигнальную последовательность, функционально связана с ДНК, кодирующей полипептид,если она экспрессируется в виде лидерной последовательности, участвующей в переносе полипептида в эндоплазматический ретикулюм. Также промотор или энхансер функционально связан с кодирующей последовательностью, если он стимулирует транскрипцию последовательности.-4 014182 Термин "поликлональное антитело" относится к композиции различных (разнообразных) молекул антител, которые способны связываться или взаимодействовать с несколькими различными специфичными антигенными детерминантами на одних и тех же или на различных антигенах. Как правило, разнообразие поликлональных антител определяется называемыми вариабельными областями поликлонального антитела, в частности участками CDR. Если говорят, что один из членов поликлонального антитела связывается с антигеном, то в рамках настоящего изобретения под этим подразумевают связывание при константе связывания ниже 1 мМ, предпочтительно ниже 100 нМ, еще более предпочтительно ниже 10 нМ. Термин "линия рекомбинантных поликлональных продуцирующих клеток" относится к смеси/совокупности клеток, экспрессирующих белок, которые так трансфицированы библиотекой представляющих интерес различных участков нуклеиновых кислот, что каждая из отдельных клеток, которые вместе составляют линию рекомбинантных поликлональных продуцирующих клеток, несет только одну транскрипционно активную копию отдельного, представляющего интерес участка нуклеиновой кислоты,который кодирует один член представляющего интерес рекомбинантного поликлонального антитела, и каждая копия встроена в один и тот же участок генома каждой клетки. Клетки, составляющие линию рекомбинантных поликлональных продуцирующих клеток, отбирают по их способности сохранять встроенную копию отдельного, представляющего интерес участка нуклеиновой кислоты, например, посредством селекции с использованием антибиотиков. Клетки, составляющие такую линию продуцирующих клеток, могут представлять собой, например, бактерии, грибы, эукариотические клетки, такие как дрожжи, клетки насекомых или клетки млекопитающих, особенно линии бессмертных клеток млекопитающих, таких как клетки CHO, клетки COS, клетки BHK, клетки миеломы (например, клетки Sp2/0,NS0), NIH 3 Т 3, YB2/0, и бессмертные клетки человека, такие как клетки HeLa, клетки HEK 293 илиPER.С 6. Термин "рекомбинантное антитело" используют для описания молекулы антитела или нескольких молекул, экспрессирующейся/ихся клеткой или линией клеток, трансфицированых вектором экспрессии,содержащим кодирующую последовательность белка, который в природе не связан с клеткой. Если молекулы антител разнообразны или различны, то термин "рекомбинантное поликлональное антитело" используют в соответствии с определением поликлонального антитела. Термин "рекомбиназа" относится к ферменту, катализирующему рекомбинацию между двумя или более сайтами рекомбинации или последовательностями распознавания при рекомбинации. Рекомбиназы, которые можно использовать в настоящем изобретении, катализируют рекомбинацию в специфических сайтах рекомбинации, которые представляют собой специфические последовательности нуклеиновых кислот, распознаваемые конкретной рекомбиназой. Термины "сайт распознавания рекомбиназы" или "сайт рекомбинации" обозначают последовательность нуклеиновой кислоты и являются сайтом распознавания и рекомбинации сайт-специфичного фермента рекомбиназы. Как правило, сайт распознавания рекомбиназы состоит из коротких обращенных повторяющихся элементов (длиной 11-13 п.о.), фланкирующих внутреннюю последовательность (длиной 6-8 п.о.). Также сайты распознавания рекомбиназы называют мишеневыми сайтами рекомбиназы, сайтами рекомбинации или сайтами интеграции, и к ним относятся, например, участок FLP, участок loxP, участки attP/attB, участок six, участок gix, участок R и участок Res. Сайты распознавания рекомбиназы, между которыми рекомбиназа способна катализировать интегрирование, удаление или инверсию, называют совместимыми сайтами распознавания рекомбиназы, например два сайта FRT дикого типа считают соответствующими, так же как и сайт attB и сайт attP составляют совместимую пару участков распознавания рекомбиназы, тогда как участок FRT дикого типа и мутантный участок FRT не обязательно составляют совместимую пару участков распознавания рекомбиназы; это зависит от мутации. Эти термины также используют взаимозаменяемо с термином участок встраивания. Термин "анализ RFLP" относится к "анализу полиморфизма длин фрагментов рестрикции", способу, которым анализируют характер движения в геле фрагментов молекул нуклеиновых кислот после расщепления ферментами рестрикции. Термин "перестановка" описывает случаи, когда отдельная клетка экспрессирует два или более различных члена поликлонального белка, где каждый член состоит из двух различных полипептидных цепей, например цепей VH и VL. Эта ситуация может возникать, если в геном отдельной клетки встроено более одной пары генетических элементов, где каждая пара генетических элементов кодирует отдельный член поликлонального белка. В таких случаях можно получать непредусмотренные сочетания полипептидных цепей, экспрессируемых генетическими элементами. Примером указанной перестановки является "перестановка цепей VH-VL". Перестановка происходит, когда непредусмотренные сочетания полипептидов VH и VL продуцируются клеткой, в которой два различных кодирующих VH и VL участка нуклеиновой кислоты встроены в транскрипционно активные сайты одной и той же клетки. Вероятно, такая молекула антитела с перестановкой не сохраняет исходную специфичность и поэтому, вероятно, не обладает каким-либо терапевтическим эффектом.-5 014182 Термин "селекция" используют для описания способа, при котором клетки приобретают определенное свойство, благодаря которому их можно отделить от клеток, которые не приобрели такое свойство. Такими свойствами могут быть устойчивость к цитотоксическому агенту или продукция необходимого питательного вещества, фермента или окрашивание. Термины "селектируемый ген-маркер", "ген-маркер селекции", "ген селекции" и "ген-маркер" используют для описания гена, кодирующего селектируемый маркер (например, ген, который придает устойчивость к какому-либо цитотоксическому лекарственному средству, например определенным антибиотикам, ген, способный продуцировать необходимое питательное вещество, которое можно удалить из среды для роста, ген, кодирующий фермент, который продуцирует анализируемые метаболиты, или ген,кодирующий окрашенный белок, который, например, можно отделять посредством FACS), где ген вводят в клетки вместе с представляющим интерес геном(ами). В рамках настоящего изобретения термин "трансфекция" используют в качестве общего термина для введения чужеродной ДНК в клетку. Под термином также понимают другие функционально эквивалентные способы встраивания чужеродной ДНК в клетку, такие как, например, трансформация, инфекция, трансдукция или сливание клетки-донора и клетки-акцептора. В рамках настоящего изобретения термин "вектор" относится к молекуле нуклеиновой кислоты, в которую можно встраивать последовательность нуклеиновой кислоты для переноса между различными генетическими средами и/или для экспрессии в клетке-хозяине. В рамках настоящего изобретения вектор, способный к встраиванию в геном клетки-хозяина в заранее определенный специфический участок генома, называют "вектором сайт-специфического встраивания". Если вектор несет регуляторные элементы транскрипции, встроенной в вектор последовательности нуклеиновой кислоты (по крайней мере, подходящий промотор), то вектор в этом случае называют"вектором экспрессии". Термин "вектор, кодирующий изотип" относится к вектору, который несет последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие изотип антитела. В настоящем описании "фагмидный вектор" и "фаговый вектор" используют взаимозаменяемо. Термины "плазмида" и "вектор" используют взаимозаменяемо. Следует иметь в виду, что изобретение включает в себя другие формы векторов, выполняющие эквивалентные функции, например плазмиды, фагмиды и вирусные геномы или любые молекулы нуклеиновых кислот, способные контролировать продукцию желаемого белка в соответствующем организме-хозяине. Следующий вариант написания "VH:LC" и "VH:VL" указывает на конкретную пару последовательности вариабельной тяжелой цепи и последовательности легкой цепи или вариабельной легкой цепи. Такие конкретные пары последовательностей VH и VL могут представлять собой последовательности нуклеиновых кислот или полипептидов. В настоящем изобретении конкретные пары VH и VL придают специфичность связывания в отношении резус-антигена D. СокращенияAb = антитело. Анти-RhD rpAb = рекомбинантное поликлональное антитело против резус-фактора D.mAb = моноклональное антитело. рМСВ = главный банк поликлональных клеток.pWCB = рабочий банк поликлональных клеток.RhDVI = резус-антиген D группы VI. Анти-D = препарат поликлонального иммуноглобулина против RhD гипериммунных доноров. Поли(А)-SV40 = сигнальная поли(А)-последовательность вируса обезьяны 40.UCOE = распространенные открывающие хроматин элементы. 5' UTR = 5'-нетранслируемая область мРНК.-6 014182 Краткое описание чертежей Фиг. 1 А. Схема процесса получения линии рекомбинантных поликлональных продуцирующих клеток и продукция рекомбинантного поликлонального антитела: 1) иллюстрирует способ полной трансфекции; 2) иллюстрирует способ частичной трансфекции и 3) иллюстрирует способ индивидуальной трансфекции; А) иллюстрирует библиотеку векторов экспрессии антител против RhD (горизонтальные линии),стрелки-указатели иллюстрируют распределение векторов по группам. В способе 1 векторы объединяют в большую группу, в способе 2 их объединяют в меньшие фракции (частичный), а в способе 3 их разделяют друг от друга (индивидуальный); В) иллюстрирует трансфекцию, где количество пробирок зависит от распределения составляющих библиотеку векторов по группам; С) иллюстрирует селекцию клеток, у которых в геном клетки-хозяина был сайт-специфически интегрирован участок нуклеиновой кислоты, кодирующий антитело против RhD;D) иллюстрирует получение исходной библиотеки поликлональных антител против RhD, где выбранные клетки, которые содержат встроенные участки нуклеиновых кислот, кодирующие антитело против RhD, хранят в морозильном устройстве. Необязательно, сохраняют отдельные клоны или объединяют клоны в общую группу; Е) иллюстрирует начало производственной фазы, когда клоны размораживают из исходного источника (по отдельности, из небольших фракций или из общей группы);F) иллюстрирует стадию получения, где количество клеток в линии поликлональных клеток увеличивают для посева в более крупный биореактор (возможны, хотя не представлены, промежуточные стадии посевов). В способах 2 и 3 эта стадия представляет собой стадию, когда исходный источник клонов поликлональных клеток больше не сохраняют как индивидуальные клоны или частичные фракции, а объединяют в совокупность клеток, образуя линию рекомбинантных поликлональных продуцирующих клеток (эту линию поликлональных продуцирующих клеток также можно хранить в виде замороженного исходного источника);G) иллюстрирует конечное получение, осуществляемое при производстве в биореакторе. После фазы получения композицию поликлональных белков собирают для очистки и характеристики продукта. Фиг. 1 В. Схема процесса, в которой описано получение pWCB/pMCB и подгруппы pWCB из индивидуально трансфицированных клеток-хозяев, а также посев линии поликлональных продуцирующих клеток: А) иллюстрирует библиотеку, состоящую из кодирующих вариабельную область участков нуклеиновых кислот, стрелки-указатели иллюстрируют отдельные члены библиотеки; В) иллюстрирует трансфекцию, где для трансфекции клетки-хозяина используют каждый отдельный член библиотеки. Для трансфекции необходимо столько же отдельных пробирок, сколько существует отдельных членов библиотеки; С) иллюстрирует селекцию клеток, у которых в геном был стабильно встроен кодирующий вариабельную область участок нуклеиновой кислоты;D) иллюстрирует селекцию отдельных линий клеток, обладающих сходными скоростями пролиферации и/или продуктивностью, например посредством клонирования и анализа отдельных клеток, разделяемых FACS. Эта стадия не обязательна для получения pWCB/pMCB, и ее можно также проводить после стадии Е; Е) иллюстрирует получение замороженной исходной библиотеки, состоящей из n-количества отдельных линий клеток, где каждая экспрессирует один из членов библиотеки, которая состоит из используемых для трансфекции участков нуклеиновых кислот, кодирующих вариабельную область. Необязательно, перед получением pWCB/pMCB отдельные клоны сохраняют в замороженной исходной библиотеке;F) иллюстрирует смешивание отдельных линий клеток, где флаконы отдельной исходной библиотеки размораживают и увеличивают количество клеток в отдельных культурах клеток с последующим смешиванием заранее определенного количества клеток из каждой культуры в отдельную клеточную культуру;G) иллюстрирует получение pWCB/pMCB замораживанием партий из смешанной культуры клеток стадии F, получая, таким образом, совокупность флаконов; Н) иллюстрирует получение подгруппы pWCB посредством увеличения количества содержимого отдельного флакона рМСВ и замораживания аликвот приблизительно с таким же количеством клеток,как и во флаконе рМСВ;I) иллюстрирует получение линии поликлональных продуцирующих клеток из ряда посевов (промежуточные стадии посевов не представлены), которые начинают из pWCB или подгруппы pWCB. Фиг. 2. Вектор на основе фагового дисплея: Em351, вектор E.coli используют для получения библиотеки фагового дисплея Fab против RhD посредством встраивания вариабельной области тяжелой цепи и участков легкой цепи, амплифицированных от приемлемого донора, в вектор в определенные сайты-7 014182 рестрикции AscI/XhoI и NheI/NotI соответственно. Вектор содержит следующие элементы:CH1 человека = последовательность, кодирующая домен 1 тяжелой цепи гамма 1 иммуноглобулина человека; вставка = вставки не имеющей значение последовательности, которые удаляют в ходе встраивания участков тяжелой и легкой цепей; р tac и р lac Z = бактериальные промоторы;PelB = измененные бактериальные лидерные последовательности PelB для направленной экспрессии Fab в периплазматическое пространство E.coli;gIII = усеченный ген III фага М 13 (с 198 п.о. до С-конца). Фиг. 3 А-3 С. Выравнивание последовательностей нуклеиновых кислот, кодирующих вариабельную тяжелую цепь (VH), 56 выбранных клонов RhD. Названия отдельных клонов указаны справа от выравнивания, а положение областей CDR указано над выравниванием. Фиг. 4 А-4 Е. Выравнивание последовательностей нуклеиновых кислот, кодирующих полноразмерную легкую цепь, 56 выбранных клонов RhD. Названия отдельных клонов вместе с указанием, являются ли они каппа- или лямбдой-цепью, представлены справа от выравнивания, а положение областей CDR указаны над выравниваниями. Фиг. 5. Выравнивание аминокислотных последовательностей, соответствующих VH, 56 выбранных клонов RhD. Названия отдельных клонов указаны справа от выравнивания, а положение областей CDR указано над выравниванием. Фиг. 6 А, 6 В. Выравнивание аминокислотных последовательностей, соответствующих VL, 56 выбранных клонов RhD, где (А) соответствует каппа-цепям, а (В) - лямбда-цепям. Названия отдельных клонов указаны справа от выравнивания, а положение областей CDR указано над выравниваниями. Фиг. 7. Вектор экспрессии Neo: схематическое изображение вектора экспрессии млекопитающих,используемого для ускорения сайт-специфического встраивания в геном клетки-хозяина участков нуклеиновых кислот, которые кодируют антитело против RhD. Вектор содержит следующие элементы:pro amp и AMP = промотор и ген устойчивости к ампициллину; точка инициации pUC = участок инициации репликации pUC; сайты ферментов рестрикции: XhoI, AscI, NheI и NotI; Р 1/Р 2 = набор промоторов, контролирующих экспрессию легкой цепи и тяжелой цепи IgG соответственно;LH = лидерная последовательность тяжелой цепи;VH = последовательность, кодирующая вариабельную тяжелую цепь антитела против RhD; константная тяжелая цепь IgG1 человека = последовательности, кодирующие константную тяжелую цепь IgG1 человека; поли(A)-RBG = сигнальная поли(А)-последовательность -глобина кролика; поли(А)-BGH = сигнальная поли(А)-последовательность бычьего гормона роста;LK = лидерная последовательность каппа-цепи; легкая цепь = последовательность, кодирующая легкую цепь антитела против RhD; участок FRT = последовательность распознавания рекомбиназы Flp; неомицин = ген устойчивости к неомицину; поли(А)-SV40= сигнальная поли(А)-последовательность вируса обезьяны 40. Фиг. 8. Катионообменные хроматограммы композиции анти-RhD rpAb из аликвот 3948 и 3949 через 9 недель культивирования. Нижняя диаграмма соответствует аликвоте 3949, а верхняя диаграмма - партии 3948. Верхнюю диаграмму сместили по оси Y для отделения ее от нижней диаграммы. Пики А-J содержат антитела, отличающиеся по суммарному заряду, и отдельные антитела, проявляющие гетерогенность по заряду. Фиг. 9. Изображение геля, на котором представлен анализ RFLP HinfI продукта RT-PCR, полученного из аликвот 3948+ и 3949+ (FCW065) линий поликлональных клеток, продуцирующих анти-RhDrpAb, через 11 недель культивирования. Выявлены полосы, которые могут соответствовать конкретным клонам. Фиг. 10. Схемы T-RFLP легких цепей антител против резус-фактора D из культуры поликлональных клеток, экспрессирующих анти-RhD rpAb с 8 различными антителами против резус-фактора D; 8 различных клонов антител против резус-фактора D были соотнесены с пиками, указанными стрелками. Фиг. 11. Схемы T-RFLP вариабельных областей тяжелых цепей антител против резус-фактора D из культуры поликлональных клеток, экспрессирующих анти-RhD rpAb с 25 различными антителами к резус-фактору D, в заданный момент времени; 25 различных клонов антител против резус-фактора D были соотнесены с пиками, указанными стрелками.-8 014182 Фиг. 12. Распределение кДНК, оцениваемое посредством T-RFLP, 8 различных последовательностей, кодирующих тяжелую цепь антитела против резус-фактора D последовательностей из культуры поликлональных клеток, которую культивировали в течение 5 недель. Фиг. 13. Относительное содержание (%) анти-RhD rpAb с 8 различными антителами, анализируемое с помощью катионообменной хроматографии. Объединенные хроматографические пики были соотнесены с отдельными антителами на основании времени удерживания и наборов пиков, полученных от отдельных антител, которые анализировали по отдельности с помощью катионообменной хроматографии при тех же условиях. Фиг. 14. Катионообменная хроматограмма анти-RhD rpAb с 25 отдельными членами образца, полученного через 4 недели культивирования. Пики АС 1 до AC25 содержат антитела, отличающиеся по суммарному заряду, и отдельные антитела, проявляющие гетерогенность по заряду. Фиг. 15: А - представлено сравнение эффективности трех партий, Sym04:21, Sym04:23 и Sym04:24,анти-RhD rpAb с 25 отдельными членами, получаемыми культивированием с подпиткой в масштабе 5 л. Связывание поликлонального антитела с RhD-положительными эритроцитами оценивали посредствомFACS, а средняя интенсивность флуоресценции (MFI) представлена в виде функции концентрации поликлонального антитела в нг/мл. Кроме того, функциональную активность анти-RhD rpAb с 25 отдельными членами оценивали для Sym04:21 и Sym04:24 в сочетанном анализе ADCC/фагоцитоза; В - представлены результаты ADCC в виде процентов специфического лизиса RhD-положительных и RhD-отрицательных эритроцитов как функции концентрации поликлонального антитела в нг/мл;C - представлен процент фагоцитоза RhD-положительных и RhD-отрицательных эритроцитов как функции концентрации поликлонального антитела в нг/мл. Фиг. 16. Графики катионообменной хроматографии образцов, которые отбирают на различных стадиях в ходе последовательной обработки образца анти-RhD rpAb, содержащего 25 отдельных членов,представленных веществом, которое получают после селекции элюцией (А), на сефадексе G-25 (В),DEAE-сефарозе (С) и МЕР Hypercel (D). Подробное описание изобретения Система экспрессии рекомбинантного поликлонального белка. Настоящее изобретение относится к системе экспрессии рекомбинантного поликлонального антитела для последовательного получения рекомбинантного поликлонального антитела против RhD (антиRhD rpAb) из одной или нескольких линий клеток. Одно из главных преимуществ способа получения по настоящему изобретению состоит в том, что все члены, составляющие анти-RhD rpAb, можно получать в одном или нескольких биореакторах или их эквивалентах. Кроме того, композицию анти-RhD rpAb из реактора можно очищать в виде единого препарата без необходимости разделения членов, составляющих анти-RhD rpAb, в ходе процесса. Напротив,если желательно воспроизвести композицию анти-RhD rpAb путем смешивания очищенных моноклональных антител против RhD (анти-RhD rpAb) (как это, например, предложено в WO 97/49809), то будет необходимо раздельное получение в биореакторе каждого моноклонального антитела, подлежащего включению в композицию, и, вероятней всего, также будет необходимо раздельное очищение антитела. Такое получение смеси анти-RhD mAb дорогостояще, занимает много времени и пространства, что сравнимо со способом получения рекомбинантного поликлонального антитела против RhD по настоящему изобретению. Таким образом, способ, описанный в WO 97/49809, естественным образом может приводить к практическому ограничению анти-RhD rpAb, которые можно включать в такую смесь, тогда как способом, описанным здесь, в целом можно получать поликлональное антитело с таким количеством отдельных членов, которое желательно. Кроме того, отдельные члены анти-RhD rpAb по настоящему изобретению получают в абсолютно одинаковых условиях (в том же самом реакторе для производства),тем самым обеспечивая одинаковые посттрансляционные модификации в сравнении со смесью анти-RhDrpAb, где незначительные различия получения от партии к партии могут изменять свойства продукта. Для получения линии рекомбинантных поликлональных продуцирующих клеток, способных экспрессировать анти-RhD rpAb, по существу, без потери разнообразия, характерного для поликлональности в период получения, необходимо, чтобы отдельные клетки в смеси клеток, составляющих линию поликлональных продуцирующих клеток, были настолько единообразны, насколько это возможно. Для получения рекомбинантного поликлонального антитела нежелательны общепринятые способы экспрессии моноклональных антител с использованием случайного встраивания, поскольку случайный характер процесса вызывает различия количества и положений встраиваемых последовательностей нуклеиновых кислот между клетками. Таким образом, если рекомбинантное поликлональное антитело получают такими общепринятыми способами, то он, вероятно, приведет к гетерогенной культуре клеток с различными уровнями экспрессии отдельных членов поликлонального белка и к генетической нестабильности вследствие эффектов положения встроенного участка нуклеиновой кислоты. Наиболее вероятно, такое получение приведет к неодинаковой экспрессии составляющих поликлональный белок членов.-9 014182 Поэтому желательно встраивание участка нуклеиновой кислоты, кодирующего антитело противRhD, в заранее определенный участок генома, что, по существу, можно достигать гомологичной рекомбинацией. Однако из-за преобладания событий незаконной рекомбинации гомологичная рекомбинация является слабой и, кроме того, может приводить к введению в геном отдельной клетки нескольких копий различных участков нуклеиновых кислот, кодирующих антитело против RhD. Для решения этих трудностей в системе экспрессии по настоящему изобретению используют сайтспецифическое встраивание в геном отдельных клеток-хозяев. Система по настоящему изобретению содержит библиотеку векторов экспрессии антител против RhD для сайт-специфического встраивания,включающую в себя различные участки нуклеиновых кислот, кодирующие анти-RhD rpAb. Отдельные участки нуклеиновых кислот из библиотеки встраивают в отдельные клетки в одинаковое, заранее определенное положение на хромосоме посредством сайт-специфического встраивания в заранее определенный участок распознавания рекомбинации или посредством опосредуемой рекомбиназой процедуры обмена кассет, получая, таким образом, линию клеток, в которой отдельные клетки экспрессируют различные члены рекомбинантного поликлонального антитела против RhD. Как описано ниже, в некоторых клетках, составляющих линию рекомбинантных поликлональных продуцирующих клеток, может происходить множество встраиваний. Однако считают, что это не является помехой, поскольку большинство отдельных клеток экспрессируют один отдельный член анти-RhD rpAb. Предпочтительно это достигают,обеспечивая встраивание одного компонента в геном большинства отдельных клеток или, в случае большего количества встроенных компонентов, обеспечивая транскрипции только одного из них. Можно использовать рекомбиназы, такие как Cre, Flp, бета-рекомбиназа, Gin, Pin, PinB, PinD, R/RS,резолваза Tn3, интеграза/рекомбиназа XerC/D, интеграза лямбда или интеграза фага ФС 31. Подходящие рекомбиназы для встраивания в участок хромосомы можно получить (i) экспрессией из собственного генома клетки, в который встраивают указанный участок нуклеиновой кислоты; (ii) посредством функционального кодирования встроенным в клетку вектором; (iii) экспрессией со второй молекулы нуклеиновой кислоты или (iv) в виде белка. В предпочтительном варианте осуществления участок нуклеиновой кислоты, кодирующий антитело против RhD, который содержится в отдельном векторе библиотеки,встраивают в так называемый "горячий участок", т.е. участок, опосредующий высокоэффективную транскрипцию и экспрессию участка нуклеиновой кислоты для антитела против RhD. Предпочтительно используемой линией клеток-хозяев является линия клеток млекопитающих, которая содержит обычно используемые для экспрессии биофармацевтических белков клетки, например клетки CHO, клетки COS, клетки BHK, клетки миеломы (например, клетки Sp2/0, NSO), YB2/0, NIH 3 Т 3,а также бессмертные клетки человека, такие как клетки HeLa, клетки HEK 293 или PER.С 6. В практике настоящего изобретения были использованы клетки CHO. Однако для специалиста в данной области не составит труда заменить клетки CHO другими клетками млекопитающих, такими как описано, или даже использовать другие типы клеток, включая клетки растений, клетки дрожжей, клетки насекомых, грибы и бактерии. Таким образом, выбор типа клеток не следует рассматривать как ограничивающий изобретение. В предпочтительном варианте осуществления для получения производства используют линию клеток млекопитающих, которая содержит предварительно охарактеризованный горячий участок, опосредующий высокие уровни экспрессии анти-RhD rpAb. В еще более предпочтительном варианте осуществления линия клеток млекопитающих содержит один участок распознавания рекомбиназы, расположенный в заранее определенном горячем участке. В другом варианте осуществления настоящего изобретения различные участки нуклеиновых кислот, кодирующие антитело против RhD, встраивают в клетки-хозяева сайт-специфическим способом с использованием одного и того же хромосомного участка встраивания. Такое встраивание в один специфический участок минимизирует эффекты положения, наблюдаемые в случае случайного встраивания во множество участков в геноме. Кроме того, при использовании одного специфического участка для встраивания, вероятно, не происходит смешивания цепей VH и VL. В линии клеток-хозяев, содержащих систему сайт-специфического встраивания, отдельно трансфицируемые клетки-хозяева экспрессируют в целом одинаковое антитело, за исключением различий, наблюдаемых в вариабельной области антитела. Поэтому большинство клеток в такой совокупности клеток проявляют сходные свойства продуктивности и генетической устойчивости и поэтому этот способ делает возможным контроль получения анти-RhD rpAb. Кроме вариабельности областей VH и VL, особенно областей CDR, также могут различаться изотипы константных областей. Это означает, что одну конкретную пару VH и VL можно получать с различными изотипами константной области тяжелой цепи, например IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2, IgM,IgD и IgE человека. Таким образом, анти-RhD rpAb может содержать молекулы антител, характеризующиеся различиями последовательностей отдельных молекул антител в вариабельной области (областьV), а также в константной области. Композиция анти-RhD rpAb может состоять из антител с любым указанным выше изотипом тяжелой цепи или его сочетаниями. Предпочтительные композиции анти-RhDrpAb содержат константные области IgG1, константные области IgG3 или константные области IgG1 иIgG3. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения каждая или некоторые из пар VH и VL экспрессируются с константной областью тяжелой цепи IgG1, IgG3, IgA1 и/или IgA2 чело- 10014182 века. Для получения библиотеки участков нуклеиновых кислот, кодирующих антитело против RhD,можно использовать множество известных в данной области способов. Первую библиотеку, содержащую участки, которые кодируют VH и VL, можно получать комбинаторными способами (например,ЕР 0368684) или способами, обеспечивающими образование сходных пар (пар, кодирующих вариабельную область последовательностей, получаемых из одной и той же клетки, как описано в WO 05/042774,по которой испрашивают приоритет неопубликованной патентной заявки DK 200400782). Кроме того,библиотеки кодирующих VH и VL участков можно получать включением отдельных участков гена CDR в соответствующую каркасную область (например, Soderlind, E. et al. 2000. Nat. Biotechnol. 18, 852-856) или мутацией одной или нескольких последовательностей, кодирующих VH и VL против RhD. Эту первую библиотеку скринировали на наличие кодирующих VH и VL участков нуклеиновых кислот, которые продуцируют антитела или фрагменты со специфичностью связывания в отношении RhD, получая, таким образом, библиотеку участков нуклеиновых кислот, кодирующих антитело против RhD. Особенно в случае комбинаторных библиотек скринингу предшествует стадия обогащения, например, так называемая стадия биопэннинга. Известными способами биопэннинга являются фаговый дисплей (Kang, A.S. etImmunol. Methods, 231, 119-135), дисплей ДНК (Cull, M.G. et al. 1992. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, 18651869), дисплей РНК-пептид (Roberts, R.W., Szostak, J.W., 1997. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94, 1229712302), ковалентный дисплей (WO 98/37186), дисплей бактериальных поверхностей (Fuchs, P. et al. 1991.Biotechnology, 9, 1369-1372), дисплей дрожжевых поверхностей (Boder, E.T., Wittrup, K.D., 1997. Nat.Biotechnol, 15, 553-557) и дисплей эукариотических вирусов (Grabherr, R., Ernst, W., 2001. Comb. Chem.High Throughput. Screen. 4, 185-192). Также в целях обогащения (пэннинга) можно использовать FACS и разделение магнитными частицами с использованием меченого антигена. Как правило, селекцию связывающих резус-фактор D веществ проводят иммунологическими анализами, такими как анализы агглютинации, FACS, ELISA, FLISA и/или иммунодот. Как правило, после селекции полученную подбиблиотеку участков нуклеиновых кислот, кодирующих VH и VL, необходимо перенести из вектора селекции в векторы экспрессии, подходящие для сайтспецифического встраивания и экспрессии в желаемой клетке-хозяине. Во время такого переноса важно сохранить последовательности, кодирующие отдельные пары VH:VL. Этого можно достигнуть при сохранении отдельных членов подбиблиотеки по отдельности и по одному, перемещая кодирующие VH иVL последовательности одну за одной. Альтернативно, составляющие подбиблиотеку векторы объединяют в совокупность, а последовательности, кодирующие пары VH:VL, перемещают как сегменты, сохраняя вместе последовательности, кодирующие VH и VL, в ходе переноса. Также этот процесс называют переносом вещества, и он обеспечивает легкий перенос всех выбранных пар VH:VL из одного вектора в другой. В другом варианте осуществления настоящего изобретения композиция рекомбинантного поликлонального антитела против RhD содержит определенную подгруппу отдельных антител, обладающих общим свойством связывания по крайней мере с одним эпитопом на резус-антигене D, например epD1,epD2, epD3, epD4, epD5, epD6/7, epD8 и/или epD9, и слабым или отсутствием связывания с резусантигенами С, с, Е, е. Предпочтительно композиция анти-RhD rpAb состоит по крайней мере из одного антитела, связывающегося с epD3, epD4 и epD9 (антитело, связывающее антиген RhD группы VI), и дополнительных антител, которые, по крайней мере, в сочетании связываются с остальными эпитопамиepDl, epD2, epD5, epD6/7 и epD8, например антитела против антигена RhD группы II или III или антитела, связывающего антиген RhD группы IV или V, в сочетании с антителом против антигена группы VII. Как правило, композиция анти-RhD rpAb содержит по крайней мере 5, 10, 20, 50, 100 или 500 отдельных различных членов. Предпочтительное количество различных членов находится в диапазоне от 5 до 100,еще более предпочтительно от 5 до 50 и наиболее предпочтительно от 10 до 25. Другой вариант осуществления настоящего изобретения относится к линии рекомбинантных поликлональных продуцирующих клеток, содержащей совокупность клеток, которые трансфицированы библиотекой участков нуклеиновых кислот, кодирующих поликлональное антитело против RhD, где каждая клетка совокупности способна экспрессировать один из членов библиотеки, который кодирует отдельный член анти-RhD rpAb или фрагмент и который расположен в одном и том же сайте генома отдельных клеток в указанной совокупности, где указанный участок нуклеиновой кислоты в природе не связан с указанной клеткой совокупности. В дополнительном варианте осуществления все различные участки нуклеиновых кислот, кодирующие анти-RhD rpAb, получают из природных последовательностей, например, выделяемых у донора либо в виде комбинаторных пар VH:VL, либо в виде сходных пар, а не получают посредством мутации. Композиции клеток, содержащих различные нуклеиновые кислоты, которые расположены в отдельном специфическом участке генома каждой клетки, были описаны в WO 02/44361. В этом документе описано использование клеток для идентификации молекул, обладающих желаемыми свойствами, однако ссылка не относится к системе продукции или поликлональному антителу, характеризующемуся специфичным связыванием антигена.- 11014182 Клетка-хозяин. Подходящая клетка-хозяин содержит в участке своего генома один или несколько участков рекомбинации, т.е. последовательностей нуклеиновой кислоты, распознаваемых одним или несколькими ферментами рекомбиназами, также называемых поэтому последовательностями распознавания рекомбиназ. Для возможности селекции компонентов со вставками (т.е. клеток, имеющих в участке для встраивания встроенную копию участка нуклеиновой кислоты, кодирующего антитело против RhD) участок рекомбинации функционально связывают с первым геном селекции (например, геном устойчивости к антибиотику), расположенным со стороны 3' (ниже) от участка рекомбинации. Кроме того, со стороны 5' (выше) от участка рекомбинации можно располагать слабый промотор (например, усеченный ранний промоторSV40) и кодон начала транскрипции, составляющие одно целое с областью, кодирующей маркер устойчивости областью. Таким образом, кодон начала транскрипции инициирует начало транскрипции гена селекции в клетке-хозяине перед трансфекцией библиотекой векторов экспрессии антитела против RhD,кодирующих анти-RhD rpAb. Предпочтительно линия клеток-хозяев имеет только один участок рекомбинации, а если она имеет более чем одну последовательность распознавания рекомбиназы, то они должны быть негомологичными, как описано в разделе "Вектор для сайт-специфического встраивания",и должны обеспечивать только одно встраивание в геном. Клетки-хозяева для сайт-специфического встраивания, как описано выше, можно получать из любой клетки, способной встраивать DIMA в свои хромосомы или удерживать внехромосомные элементы,такие как мини-хромосомы, YAC (искусственные хромосомы дрожжей), MAC (искусственные хромосомы мыши) или НАС (искусственные хромосомы человека). MAC и НАС подробно описаны вWO 97/40183, приведенном здесь в качестве ссылки в полном объеме. Предпочтительно используют клетки млекопитающих, такие как клетки CHO, клетки COS, клетки BHK, клетки миеломы (например,Sp2/0 или клетки NSO), фибробласты, такие как NIH 3 Т 3, а также бессмертные клетки человека, такие как клетки HeLa, клетки HEK 293 или PER.С 6. Однако также можно использовать другие эукариотические или прокариотические клетки, такие как клетки растений, клетки насекомых, клетки дрожжей, грибы, E.coli и т.д., не являющиеся клетками млекопитающих. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения линию клеток, которую используют в качестве исходного вещества, субклонируют, проводя так называемые серийные разведения клеточной линии до уровня одной клетки с последующим делением и ростом каждой отдельной клетки до новой популяции клеток перед трансфицированием библиотекой представляющих интерес векторов. Если желательно, такое субклонирование также можно выполнять позже, в процессе селекции нужной линии клеток. Клетки-хозяева для сайт-специфического встраивания можно получать трансфекцией с использованием случайным образом встраивающейся плазмиды, которая содержит слабый промотор (например,усеченный ранний промотор SV40), кодон начала транскрипции, участок рекомбинации, расположенный со стороны 3' от стартового кодона. Предпочтительно встраивающаяся плазмида также содержит генмаркер, связанный с первым геном селекции. Одним из примеров такой встраивающейся плазмиды является pFRT/LacZeo2 от Invitrogen (Carlsbad, CA). Ген-маркер можно использовать для оценки относительной интенсивности экспрессии участка генома, используемого для вставки представляющей интерес последовательности нуклеиновой кислоты. Ген-маркер (например, бета-галактозидаза (LacZ), зеленый флуоресцентный белок (GFP) или маркер клеточной поверхности) можно связывать с первым геном селекции в виде слитого гена или транскрипционно связывать посредством IRES (участка внутренней посадки рибосом) таким образом, чтобы происходила совместная экспрессия первого гена селекции и генамаркера. Использование гена селекции, который обеспечивает клетке выживание (например, устойчивость к лекарственному средству или выживание при истощении питательных средств), в сочетании с маркером, предоставляющим возможность оценки относительных уровней экспрессии от линии клеток к линии клеток, является эффективным способом получения клеток с высокой продуктивностью, удерживающих в геноме встроенную плазмиду. Клетки с последовательностью рекомбинации, встроенной в участок с особенно активной транскрипцией, приводят к высокой экспрессии гена-маркера, напримерGFP или LacZ. Клетки с высокой экспрессией можно подвергать селекции, разделяя клетки с активацией флуоресценции (FACS), и клонировать. На этой также стадии следует проанализировать, является ли встроенный компонент единственным встроенным компонентом. Это можно выполнять посредствомPCR в режиме реального времени и саузерн-блоттинга. Получение клеток с участком FRT в заранее определенном положении генома было описано, например, в патенте США 5677177. Другой способ оценки относительных уровней экспрессии трансфицируемых встраивающейся плазмидой клеток состоит в проведении дополнительной стадии встраивания-удаления для клеток, получаемых, как описано выше. Совокупность выбранных клеток снова трансфицируют плазмидой, кодирующей рекомбиназу, которая соответствует участку рекомбинации встраивающейся плазмиды, и второй плазмидой, содержащей второй маркер селекции без стартового кодона, кодирующей области которой предшествует последовательность рекомбинации, также соответствующая первой встраивающейся плазмиде. Эта вторая плазмида также содержит кодирующую последовательность для флуоресцентного белка-маркера (например, GFP (или эквивалентных флуоресцентных белков, находящуюся под контро- 12014182 лем подходящего промотора. Рекомбиназа опосредует встраивание этой плазмиды в геном клеткихозяина, куда ранее была встроена посредством встраивающейся плазмиды сходная последовательность рекомбинации. Клетки с последовательностью рекомбинации, встроенной в участок с особенно активной транскрипцией, приводят к высокой экспрессии флуоресцентного белка. Клетки с высокой экспрессией подвергают селекции, разделяя клетки с активацией флуоресценции (FACS), и клонируют. Клоны с последовательно высокой экспрессией и содержащие одну копию встроенной плазмиды трансфицируют с использованием рекомбиназы и отбирают посредством первого маркера селекции, выявляя клетки, где вторая плазмидная последовательность была удалена рекомбиназой, что позволяет снова работать первому маркеру селекции. Такие клетки по-прежнему содержат первую последовательность рекомбинации,встроенную в транскрипционно горячий участок, и на этой стадии их можно использовать для экспрессии представляющих интерес генов. Линии клеток, которые достигают высокой экспрессии гена-маркера после встраивания одной копии плазмиды, используют для трансфекции библиотекой экспрессии антител против RhD. Предпочтительно участок рекомбинации в клетке-хозяине расположен в гене или области с особенно активной экспрессией, т.е. в так называемом горячем участке. Вектор для сайт-специфического встраивания. Подходящий вектор содержит приемлемый участок рекомбинации, связанный с подходящим геном селекции, который отличается от гена селекции, используемого для конструирования клетки-хозяина. Подходящие гены селекции, использующиеся для экспрессии в клетках млекопитающих, включают в себя, но ими не ограничиваются, гены селекции на питательные вещества, такие как ген тимидинкиназы(hisD). Кроме того, маркерами селекции являются гены устойчивости к антиметаболитам, относящиеся к устойчивости к лекарственным средствам, такие как ген дигидрофолатредуктазы (dhfr), селекцию которого можно осуществлять в среде с отсутствием гипоксантина и тимидина и дополнительно отбирать с использованием метотрексата, ген ксантин-гуанин-фосфорибозилтрансферазы (gpt), селекцию которого можно осуществлять с использованием микофеноловой кислоты, ген неомицин-фосфотрансферазы (neo),селекцию которого можно осуществлять с использованием G418 в эукариотических клетках и неомицина или канамицина в прокариотических клетках, ген гигромицин В-фосфотрансферазы (hyg, hph, hpt), селекцию которого можно осуществлять с использованием гигромицина, ген пуромицин-N-ацетилтрансферазы (pac), селекцию которого можно осуществлять с использованием пуромицина, или ген бластицидин S-деаминазы (Bsd), селекцию которого можно осуществлять с использованием бластицидина. Наконец, в качестве маркеров селекции также можно использовать гены, которые кодируют белки с возможностью разделения, например, проточной цитометрией, такие как зеленый флуоресцентный белок(GFP), рецептор фактора роста нервов (NGFR) или другие мембранные белки, или бета-галактозидаза(LacZ). В одном из аспектов настоящего изобретения отбираемому гену не предшествует промотор, и он не снабжен кодоном инициации трансляции. Промотор и кодон ATG находятся в выбранном участке сайтспецифической рекомбинации. При встраивании вектора в участок, отличный от выбранного участка рекомбинации в геноме клетки-хозяина, экспрессия второго гена селекции не может происходить из-за отсутствия промотора и кодона инициации. При встраивании в выбранный участок рекомбинации в геноме клетки-хозяина экспрессируется второй ген селекции, а экспрессия первого гена селекции прекращается. Встраивание можно осуществлять, например, с использованием так называемого участка(SEQ ID NO:1) или его вариантов) в геноме и в векторе для сайт-специфического встраивания вместе с использованием рекомбиназы Flp или ее мутантов из Saccharomyces cerevisiae. Однако с тем же успехом можно использовать другие системы рекомбиназ, в том числе системы рекомбиназы Cre и множества участков lox, таких как loxP бактериофага Р 1 или его вариантов, или мутантов, например lox66, lox71,lox76, lox75, lox43, lox44 и lox511 (С. Gorman and С. Bullock, Curr. Opinion in Biotechnology 2000, 11: 455460), или использовать интегразу фага ФС 31 или интегразу лямбда, которые осуществляют рекомбинацию между участком attP и участком attB (A.С. Groth et al. PNAS, 2000, 97: 5995-6000). Другие системы рекомбиназ, которые можно использовать по настоящему изобретению, представляют собой, но ими не ограничиваются, систему бета-рекомбиназы-six из бактериальной плазмиды pSM 19035 (Rojo and Alonso,1995), систему Gin-gix бактериофага Mu (Crisona et al. 1994), систему R-RS Zygosaccharomyces rouxii(Onouchi et al. 1995) или резолвазу Tn3, которая распознает участки рекомбинации res (Stark et al. 1994),или систему XerC/D E.coli (Blakely and Sherratt 1994). В другом варианте системы сайт-специфической рекомбинации, называемой опосредованным рекомбиназой обменом кассет (RMCE), используют негомологичные участки рекомбинации. В такой системе в геном-хозяин вводят два несовпадающих участка рекомбинации для получения специфичных участков-мишеней. Участки рекомбинации, которые соответствуют участкам, ограничивающим участокмишень, также фланкируют конструкцию, содержащую представляющий интерес ген. Такая система была описана в WO 99/25854, приведенной здесь в качестве ссылки в полном объеме. Было показано, что- 13014182 использование участков негомологичной рекомбинации подавляет удаление представляющего интерес гена из хромосомы. Несовпадающие участки рекомбинации могут состоять из любых описанных выше участков рекомбинации при условии обеспечения соответствующих рекомбиназ и неспособности участков рекомбинировать друг с другом. Например, несовпадающие участки рекомбинации могут состоять из участка FRT и мутантного участка FRT при использовании рекомбиназы Flp для встраивания (Schlakeand Bode, 1994, Biochemistry 33, 12746-12751), а также участка loxP и мутантного несовместимого участка loxP при использовании рекомбиназы Cre (Langer et al. 2002, Nucleic Acids Res. 30, 3067-3077) или участка FRT и участка loxP при использовании рекомбиназ Flp и Cre для встраивания (Lauth et al. 2002,Nucleic Acids Res. 30, 21, p. 115). Кроме того, была описана система с использованием двух различных участков FRT, Verhoeyen etal., Hum. Gene Ther. 2001, 12, 933-44. В этом способе встраивающуюся плазмиду переносят в клеткихозяева ретровирусной инфекцией. Плазмида состоит из сочетания гена-репортера и первого генамаркера селекции, а также необходимых для инфекции ретровирусных элементов. Ретровирусные 3'LTR содержат два различных участка FRT. Нефункциональный второй ген-маркер селекции, у которого отсутствует промотор и кодон инициации трансляции, расположен со стороны 3' от этих участков. В ходе процесса ретровирусной инфекции последовательность 3'LTR копируется в 5'LTR. Это приводит к фланкированию гена-репортера и первого гена-маркера селекции двумя различными участками FRT с каждой стороны. Последовательность между внешними участками FRT можно заменить на участок нуклеиновой кислоты, кодирующий антитело против RhD, под контролем сильного промотора. Кассета, содержащая участок нуклеиновой кислоты, кодирующий антитело против RhD, фланкирована тем же набором участков FRT. Реакцию катализирует рекомбиназа Flp. В трансфицируемой плазмиде элемент обмена IRES и кодон инициации трансляции расположены в направлении ниже участка нуклеиновой кислоты. После замены встроенной кассеты нефункциональный ген-маркер селекции, расположенный в последовательности 3'LTR вне пределов сайтов FRT, активируют посредством кодона инициации трансляции, обеспечиваемого кассетой, которая состоит из участка нуклеиновой кислоты, кодирующего антитело противRhD. Состояние обмена можно дополнительно улучшать, вводя во встраивающийся вектор маркер отрицательной селекции (например, тимидинкиназу). Встраивающийся вектор можно также переносить в клетки-хозяева стандартной трансфекцией. В этом случае встраивающаяся кассета фланкирована участком FRT на 5'-конце и отличающимся участкомFRT' на 3'-конце. Второй ген-маркер устойчивости, не содержащий ATG, расположен ниже участка 3'-FRT'. Обмен на участок нуклеиновой кислоты, кодирующий антитело против RhD, происходит, как описано для ретровирусной системы. Другая система, которая предотвращает удаление участка нуклеиновой кислоты, кодирующего антитело против RhD, после его сайт-специфического встраивания в хромосому, представляет собой интегразу ФС 31, также указанную выше. Эта система была подробно описана в патентных заявкахWO 01/07572 и WO 02/08409, приведенных здесь в качестве ссылки в полном объеме. Предпочтительно встраивающийся вектор представляет собой вектор, кодирующий изотип, где константные области (предпочтительно включающие интроны) присутствуют в векторе перед вставкой содержащего VH и VL участка из вектора селекции. Присутствующие в векторе константные области могут представлять собой полную константную область тяжелой цепи (от CH1 до CH3 или до CH4) или константную область, кодирующую Fc часть антитела (от CH2 до CH3 или до CH4). Также перед переносом может присутствовать константная область легкой цепи каппа или лямбда. Выбор количества константных областей, при наличии таковых, зависит от используемой системы скрининга и переноса. Константные области тяжелой цепи могут быть выбраны из изотипов IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2,IgM, IgD и IgE. Предпочтительные изотипы представляют собой IgG1 и/или IgG3. Кроме того, вектор для сайт-специфического встраивания участка нуклеиновой кислоты, кодирующего антитело против RhD, содержит подходящие промоторы или эквивалентные последовательности,обеспечивающие высокие уровни экспрессии каждой из цепей VH и VL. Предпочтительно промоторы являются промоторами млекопитающих. Последовательности, кодирующие VH и VL, помещают в виде пар в используемый для встраивания вектор (одну пару на молекулу вектора), таким образом обеспечивая соместное удержание пары в процессе встраивания. Предпочтительно промоторы расположены в пределах участка нуклеиновой кислоты, кодирующего антитело против RhD. Для двунаправленной экспрессии в векторе экспрессии используют схему промотора "голова-к-голове" (фиг. 7). В случае однонаправленной экспрессии для достижения экспрессии можно использовать два промотора, один впереди генетического элемента VH и один впереди генетического элемента VL или один промотор впереди VH или VL в сочетании с последовательностью IRES между генетическими элементами тяжелой и легкой цепей. В вектор экспрессии можно включать последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую функциональную лидерную последовательность, для направления продукта гена в эндоплазматическую сеть или в конкретное положение в клетке, такое как органелла. Сильную сигнальную последовательность полиаденилирования можно располагать с 3'-стороны последовательностей, кодирующих тяжелую и легкую цепи. Сигнал полиаденилирования обеспечивает терминацию и полиаденилирование образую- 14014182 щегося транскрипта РНК и связан с устойчивостью транскрипта. Для повышения экспрессии в участке встраивания вектор экспрессии для сайт-специфического встраивания может нести дополнительные регулирующие транскрипцию элементы, такие как энхансеры или UCOE (распространенные открывающие хроматин элементы). Энхансеры представляют собой последовательности нуклеиновых кислот, специфично взаимодействующие с вовлеченными в транскрипцию белками клетки. UCOE открывают хроматин или поддерживают хроматин в открытом состоянии и способствуют воспроизводимой экспрессии функционально связанного гена (что подробно описано вWO 00/05393, приведенной здесь в качестве ссылки в полном объеме). Если один или несколько описанных выше регуляторных элементов встраивают в хромосому клетки-хозяина, то их называют гетерологичными регуляторными элементами. Получение системы экспрессии для высокоэффективной экспрессии поликлонального белка. В данной области известны способы введения в клетку последовательности нуклеиновой кислоты. Как правило, эти способы предусматривают использование вектора ДНК для введения представляющей интерес последовательности в клетку, геном или внехромосомный элемент. Трансфекцию клеток можно осуществлять множеством известных в данной области способов, в том числе осаждением фосфатом кальция, электропорацией, микроинъекцией, слиянием липосом, слиянием теней RBC, слиянием протопластов и т.п. Для трансфекции линии клеток-хозяев используют библиотеку векторов экспрессии антител противRhD, где каждый отдельный вектор содержит одну отдельную копию участка нуклеиновой кислоты, который кодирует отдельный член анти-RhD rpAb. В совокупности эта библиотека векторов экспрессии антител против RhD кодирует анти-RhD rpAb. Подходящие векторы для сайт-специфического встраивания были описаны в предыдущем разделе. Отдельные векторы, которые составляют библиотеку участков нуклеиновых кислот, кодирующих антитела против RhD, можно смешивать в одну композицию или отдельные векторы, кодирующие отдельный член анти-RhD rpAb, можно сохранять в отдельных композициях или в смесях приблизительно от 5 до 50 отдельных векторов библиотеки в композиции. Получение линии рекомбинантных поликлональных продуцирующих клеток и получение рекомбинантного поликлонального антитела из такой клеточной линии можно осуществлять несколькими различными способами трансфекции и производства. Эти способы представлены на фиг. 1 А и более подробно описаны ниже. Один из способов получения линии рекомбинантных поликлональных продуцирующих клеток состоит в использовании для трансфекции линии клеток-хозяев библиотеки векторов, смешанных вместе в одну композицию. Этот способ называют полной трансфекцией или трансфекцией в полном объеме (все отдельные члены библиотеки трансфицируют в линию клеток-хозяев в одной пробирке). Как правило,ранее описанная схема вектора и клетки-хозяина обеспечивает получение линии поликлональных клеток после соответствующей селекции. В такой клеточной линии в геном большинства отдельных клеток встроена одна копия участка нуклеиновой кислоты, кодирующего отдельный член анти-RhD rpAb, из библиотеки векторов экспрессии антитела против RhD. Одну копию участка нуклеиновой кислоты встраивают в один специфичный участок генома каждой клетки совокупности клеток, тем самым получая линию поликлональных клеток, которая содержит отдельные клетки, экспрессирующие отдельные члены анти-RhD rpAb. Предпочтительно перед началом производства анти-RhD rpAb получают замороженный исходный источник линии поликлональных клеток. Другой способ получения линии рекомбинантных поликлональных продуцирующих клеток состоит в разделении антител против RhD на фракции, содержащие приблизительно от 5 до 50 отдельных векторов библиотеки, перед трансфекцией библиотеки векторов экспрессии. Предпочтительно фракция библиотеки содержит от 10 до 15 отдельных векторов. Затем каждую композицию трансфицируют в аликвоту клеток-хозяев. Этот способ называют частичной трансфекцией. Количество трансфицируемых аликвот зависит от размера библиотеки и количества отдельных векторов каждой фракции. Например, если библиотека состоит из 50 отдельных различных членов, которые разделяют на фракции, содержащие 10 отдельных различных членов в композиции, то библиотекой композиции, содержащей отдельную фракцию исходной библиотеки, можно трасфецировать 5 аликвот клеток-хозяев. Партии клеток-хозяев отбирают для сайт-специфического встраивания. Предпочтительно отдельные партии отбирают по отдельности. Однако перед селекцией их также можно объединять. Для получения желаемой линии поликлональных клеток для производства аликвоты можно смешивать перед получением замороженного исходного источника, непосредственно после их извлечения из исходного источника или через непродолжительное время пролиферации. Необязательно, аликвоты клеток во время получения хранят по отдельности, а перед получением композицию поликлонального антитела образуют сочетанием продуктов каждой партии,а не аликвот. Третий способ получения линии рекомбинантных поликлональных продуцирующих клеток представляет собой высокоффективный способ, в котором клетки-хозяева индивидуально трансфицируют с использованием отдельных векторов, составляющих библиотеку векторов экспрессии антител противRhD. Этот способ называют индивидуальной трансфекцией. Предпочтительно индивидуально трансфицируемые клетки-хозяева отбирают для сайт-специфического встраивания по отдельности. Однако их- 15014182 также можно объединять в совокупность перед селекцией. Получаемые после селекции отдельные клоны клеток можно анализировать на предмет время пролиферации и схемы встраивания, и предпочтительно клетки со сходными скоростями роста и одним сайт-специфически встроенным компонентом используют для получения замороженной исходной библиотеки. Отдельные клоны клеток можно смешивать с получением желаемой линии поликлональных клеток перед получением исходного источника, непосредственно после их извлечения из источника или через непродолжительное время пролиферации. Альтернативно, индивидуально трансфицируемые клетки-хозяева смешивают еще раньше, а именно перед проведением селекции. Общей особенностью указанных выше способов получения является то, что все отдельные члены,составляющие анти-RhD rpAb, можно получать в одном или ограниченном количестве биореакторов,приблизительно от 5 до максимум 10. Единственное различие состоит в стадии, которую выбирают для получения совокупности клеток, составляющих линию рекомбинантных поликлональных продуцирующих клеток. Линия клеток-хозяев, используемая для экспрессии и получения анти-RhD rpAb, имеет по крайней мере одну последовательность нуклеиновой кислоты, распознаваемую ферментом рекомбиназой. Получение такой линии клеток-хозяев было описано в разделе "Клетка-хозяин". Вектор для сайт-специфического встраивания предпочтительно встраивают в заранее определенный участок генома, опосредующий высокоэффективную экспрессию, так называемый горячий участок. При необходимости повышения уровней экспрессии можно выполнять амплификацию гена с использованием селекции на предмет гена DHFR или гена глутаминсинтетазы (GS). Для этого требуется использование векторов, содержащих такой маркер селекции. Следующее описание представляет собой один из примеров того, как можно получить линию продуцирующих рекомбинантное поликлональное антитело клеток, в которой смешивание цепей минимально, если вообще происходит. Конструируют участки нуклеиновых кислот, содержащие общую кассету промотора для конститутивной экспрессии, которая имеет два расположенных в противоположном направлении транскрипции промотора, например конструкция "голова-к-голове", окруженных вариабельной тяжелой цепью и полноразмерной легкой цепью каппа, что позволяет переносить всю конструкцию в вектор для сайтспецифического встраивания, где указанный вектор содержит участок FRT и ген устойчивости к неомицину, а также константную область тяжелой цепи. Предполагают, что также можно использовать кассету промотора для индуцируемой экспрессии. Кроме того, для однонаправленной транскрипции промоторы можно располагать "голова-к-хвосту". Для эксперимента используют клетки CHO-Flp-In (Invitrogen,Carlsbad, CA), стабильно экспрессирующие слитый ген lacZ-зеоцин, придавая клеткам устойчивость к антибиотику зеоцину. Клетки содержат в подходящей среде, содержащей зеоцин. Всю партию клеток совместно трансфицируют с использованием экспрессирующей рекомбиназу Flp плазмиды и библиотеки векторов экспрессии антител против RhD для сайт-специфического встраивания, которые кодируют анти-RhD rpAb, а также различного маркера селекции (неомицин). После трансфекции клетки культивируют в присутствии неомицина. Предпочтительно клетки, проявляющие устойчивость к неомицину, затем адаптируют к росту в суспензии, а также в условиях отсутствия сыворотки, что можно выполнять в одну или две стадии и при наличии или отсутствии давления селекции. Альтернативно, клетки адаптируют для роста в суспензии в условиях отсутствия сыворотки перед трансфекцией клеток. После адаптации линии поликлональных клеток к соответствующим условиям можно приступать к увеличению их количества, используя различные системы культивирования, такие как общепринятые небольшие флаконы для культивирования, многослойные фабрики клеток Nunc, небольшие биореакторы с высоким выходом(MiniPerm, INTEGRA-CELLine, извитые пакеты, BelloCell) и вращающиеся флаконы для реакторов с системой полых волокон и биореакторов. Подходящее время продукции и выбор размера конечного биореактора зависят от желаемого выхода белка исходя из партии и уровней экспрессии для линии клеток. Время может изменяться от 2 дней до 3 месяцев. Клетки тестируют на предмет продукции антител с помощью ELISA. Выделяют экспрессируемое рекомбинантное поликлональное антитело против RhD из супернатанта. Анти-RhD rpAb очищают и характеризуют. Примеры процедур очистки и характеризации описаны далее. Разнообразие/поликлональность клонов. Одна из характеристик поликлонального антитела заключается в том, что оно состоит из множества отдельных молекул антител, где каждая молекула антитела гомологична другим молекулам поликлонального антитела, но при этом оно также обладает разнообразием, характеризующимся различиями аминокислотных последовательностей отдельных членов поликлонального антитела. Как правило, эти различия относятся к вариабельной области, особенно областям CDR, CDR1, CDR2 и CDR3. Также эта вариабельность поликлонального антитела может быть описана в виде разнообразия на функциональном уровне, например различной специфичности и аффинности в отношении различных антигенных детерминант на одном и том же или разных антигенах, расположенных на одной или нескольких мишенях. В рекомбинантном поликлональном антителе разнообразие составляет вариант разнообразия, наблюдаемого в получаемом от донора продукте иммуноглобулина. Такой вариант тщательно отбирают и характери- 16014182 зуют в отношении его способности связывать желаемые антигены-мишени, в данном случае - резусантиген D. Одна из трудностей получения рекомбинантного поликлонального антитела может состоять в сохранении разнообразия клонов в конечном продукте. Разнообразие клонов можно анализировать с помощью RFLP или секвенирования продуктов (RT)-PCR из клеток, экспрессирующих анти-RhD rpAb. Также разнообразие можно анализировать на уровне белка с помощью функциональных тестов (например, ELISA) для продуцируемого клеточной линией рекомбинантного поликлонального антитела противRhD, посредством антиидиотипических антител против отдельных членов или посредством способов хроматографии. Отклонение клонов, при его наличии, можно оценивать сравнением разнообразия клонов в используемой для трансфекции исходной библиотеке с разнообразием, наблюдаемым в совокупности клеток(линии поликлональных клеток), которые экспрессируют анти-RhD rpAb. Разнообразие клонов анти-RhD rpAb можно оценить как распределение отдельных членов поликлональной композиции. Это распределение можно оценивать как общее количество различных отдельных членов в конечной композиции поликлонального антитела по сравнению с количеством различных кодирующих последовательностей, исходно вводимых в линию клеток в ходе трансфекции. В этом случае достаточное разнообразие считают достигнутым, если по крайней мере 50% исходно используемых в трансфекции кодирующих последовательностей можно выявить в виде различных отдельных членов конечного анти-RhD rpAb. Предпочтительно по крайней мере 75% последовательностей, кодирующих антитело против RhD,используемых для трансфекции, можно выявить в виде антител в конечной композиции. Еще более предпочтительно по крайней мере от 85 до 95%, а наиболее предпочтительно 100% кодирующих антитело против RhD последовательностей, используемых для трансфекции, можно выявить в виде антител в конечной композиции. Распределение отдельных членов композиции анти-RhD rpAb можно также оценивать по взаимному распределению отдельных членов. В этом случае достаточное разнообразие клонов считают достигнутым, если ни один из членов композиции не составляет более чем 75% общего количества отдельных членов в конечной композиции рекомбинантного поликлонального антитела против RhD. Предпочтительно количество отдельного члена не превышает более чем 50%, еще более предпочтительно 25% и наиболее предпочтительно 10% общего количества отдельных членов в конечной поликлональной композиции. Оценку разнообразия клонов по распределению отдельных членов в поликлональной композиции можно осуществлять с помощью анализа RFLP, анализа последовательности или анализа белка, таких как способы, описанные далее для характеристики поликлональной композиции. Разнообразие клонов может снижаться в результате смещения клонов, которое может происходить а) в процессе клонирования, b) как результат различий в пролиферации клеток или с) вследствие смешивания многочисленных встроенных компонентов. При возникновении таких смещений каждую из этих причин утраты разнообразия клонов легко устранять незначительными изменениями способов, как описано здесь. Для ограничения смещений, вызываемых клонированием вариабельных доменов в соответствующие векторы, перенос представляющих интерес генов из одного вектора в другой можно конструировать таким образом, чтобы ограничивать смещение при клонировании. Смещение при клонировании можно снижать способами переноса вещества и тщательной селекцией используемого для амплификации штамма E.coli. Другая возможность состоит в проведении отдельного переноса каждого полинуклеотида,кодирующего отдельный член поликлонального антитела, из векторов селекции в векторы для сайтспецифического встраивания. Существует вероятность того, что различия в скоростях клеточной пролиферации отдельных клеток в клеточной линии в течение продолжительного периода времени вызовут отклонение экспрессии антиRhD rpAb, увеличивая или снижая присутствие некоторых членов анти-RhD rpAb, экспрессируемого клеточной линией. Одна из причин таких различий в скоростях пролиферации может состоять в гетерогенности популяции клеток, составляющих начальную линию клеток, которую используют для исходной трансфекции. Известно, что у отдельных клеток в клеточной линии в течение продолжительного периода времени возникают различия. Для обеспечения более гомогенного исходного вещества перед трансфекцией представляющей интерес библиотекой можно проводить субклонирование линии клеток с использованием серийных разведений клеточной линии до уровня одной клетки и делением каждой отдельной клетки до новой популяции клеток (так называемое субклонирование клеток серийными разведениями). Затем одну или несколько из этих популяций клеток на основе их пролиферации и свойствах экспрессии отбирают в качестве исходного вещества. Кроме того, на скорость пролиферации отдельных клеток в поликлональной клеточной линии может влиять давление селекции, используемое для обеспечения выживания только тех клеток, которые получили сайт-специфически встроенные компоненты. Это может быть обусловлено предпочтением клеток, подвергающихся определенным генетическим изменениям для приспособления к давлению селекции. Таким образом, выбор маркера селекции может также влиять на смещение, вызываемое скоростью- 17014182 пролиферации. Если это происходит, то следует тестировать различные маркеры селекции. В случаях,когда селекция основана на токсичном для клеток веществе, следует осторожно тестировать оптимальную концентрацию, а также проверять, необходима ли селекция на протяжении всего получения или только на начальной стадии. Дополнительный подход для обеспечения определенной популяции клеток состоит в разделении клеток с активацией флуоресценции (FACS) после процедур трансфекции и селекции. Для обогащения на предмет высокопродуктивных клеток, получаемых из совокупности трансфицированных конструктами IgG клеток, можно использовать антитела с флуоресцентной меткой (Brezinsky et al. 3. 2003. ImmunolMethods, 277, 141-155). Также этот способ можно использовать для разделения клеток, экспрессирующих сходные уровни иммуноглобулина, тем самым получая гомогенную по продуктивности популяцию клеток. Аналогично, клетки со сходной скоростью пролиферации можно отбирать способами FACS с использованием мечения флуоресцентным красителем, сложным эфиром сукцинимидил-5,6 карбоксилфлуоресцеиндиацетатом (CFSE). Кроме того, с течением продолжительного периода времени смещение в конечном продукте также может быть вызвано различиями в уровнях экспрессии отдельных членов рекомбинантного поликлонального антитела против RhD. Если линию поликлональных клеток получают смешиванием отдельно трансфицируемых клонов после селекции (3-й способ на фиг. 1 А), то для отдельных клонов на уровне культуры клеток можно устанавливать следующие критерии селекции перед смешиванием: скорость пролиферации должна составлять от 24 до 32 ч, продуктивность должна превышать 1,5 пг антитела на клетку в сутки, а в культуре должны наблюдать гомогенную популяцию клеток, оцениваемую способом внутриклеточного окрашивания. По желанию, перед смешиванием отдельных клонов можно получать более гомогенную клеточную популяцию для каждого отдельного клона с использованием описанного Brezinsky способа окрашивания поверхностей, устанавливая дискриминационное окно для конкретной части популяции в отношении анализа FACS. Даже если возникает смещение, вызываемое скоростью пролиферации или вызываемое продуктивностью, то утрата или избыточное присутствие отдельных членов может быть не особенно важной в зависимости от требований к разнообразию конечного продукта рекомбинантного поликлонального антитела против RhD. Среди клеток с одним сайт-специфически встроенным компонентом клетки различаются только последовательностью вариабельных областей подлежащих экспрессии антител. Поэтому различные клеточные эффекты, обусловленные различием в участке встраивания и регуляторных элементах гена, устраняются, а встроенные участки оказывают минимальные эффекты на скорость клеточной пролиферации. Ни смешивание, ни множественные встраивания, вероятно, не вызывают проблемы в скорости пролиферации линии продуцирующих клеток, поскольку они являются редкими событиями. Как правило,случайные встраивания происходят с эффективностью приблизительно 10-5, тогда как сайтспецифическое встраивание происходит с эффективностью приблизительно 10-3. Если множественные встраивания неожиданно вызывают проблему, то альтернатива состоит в повторе трансфекции библиотекой векторов экспрессии антител против RhD, поскольку вероятность повторного развития события очень мала, как описано выше. С учетом статистических данных полная трансфекция большого количества клеток также представляет собой способ преодоления нежелательного смещения клонов. В этом способе линию клеток-хозяев трансфицируют в полном объеме библиотекой векторов экспрессии антител против RhD. Такая библиотека содержит много копий каждого отдельного члена библиотеки. Предпочтительно эти копии следует встраивать в большое количество клеток-хозяев. Предпочтительно по крайней мере 100, 1000, 10000 или 100000 отдельных клеток трансфицируют копиями отдельных членов библиотеки различных участков нуклеиновых кислот. Таким образом, если библиотека отдельных различных участков нуклеиновых кислот состоит из 1000 отдельных членов, каждый из которых встраивают в 1000 отдельных клеток, то в результате трансфекции образуются 106 клонов, содержащих сайт-специфически встроенный участок,который кодирует антитело против RhD. При этом способе гауссово распределение скоростей удвоения отдельных клеток влияет на общую популяцию только в очень малой степени. Это повышает вероятность сохранения композиции клонов постоянной, даже если небольшой процент продуцирующих клеток проявляет отклоняющиеся свойства роста и/или экспрессии. Альтернативно, можно использовать описанные ранее способы частичной трансфекции или индивидуальной трансфекции. Получение рабочего банка поликлональных клеток (pWCB). В разделе "Получение системы экспрессии для экспрессии поликлонального белка на высоком уровне" описаны три альтернативных способа получения линии поликлональных продуцирующих клеток. В разделе описано получение замороженной исходной библиотеки, состоящей из совокупности клеток, которые получают полной или частичной трансфекцией, где каждая отдельная клетка в исходной библиотеке способна экспрессировать отдельный член библиотеки векторов экспрессии антител противRhD. Предпочтительно ранее описанные требования к разнообразию клонов удовлетворяют совокупностью клеток таким образом, чтобы практически все члены библиотеки могли экспрессироваться из фла- 18014182 кона замороженной исходной библиотеки при размораживании и увеличении количества клеток в линии поликлональных продуцирующих клеток. В способах полной трансфекции и частичной трансфекции замороженную исходную библиотеку также можно рассматривать в качестве рабочего банка поликлональных клеток (pWCB) в том смысле, что отдельный флакон замороженной исходной библиотеки можно размораживать и увеличивать количество клеток в линии поликлональных продуцирующих клеток. Альтернативно, в описанном ранее третьем способе получения линии рекомбинантных поликлональных продуцирующих клеток замороженную исходную библиотеку составляют из отдельных линий клеток, которые были индивидуально трансфицированы отдельным членом библиотеки векторов экспрессии антител против RhD. Трансфектанты отбирают по устойчивой экспрессии из их генома участка нуклеиновой кислоты, получаемого из встроенного вектора. Предпочтительно участки нуклеиновых кислот сайт-специфически встраивают в один или несколько участков в геноме трансфектантов и еще более предпочтительно - в один участок генома. Трансфицируемые клетки, получаемые, например, из колоний клонов, после селекции можно выделять и поддерживать в виде отдельных клонов или объединять для получения совокупности клонов, экспрессирующих одинаковое антитело против RhD. По настоящему изобретению отдельный клон клеток, а также совокупность клонов, экспрессирующих одинаковое антитело, называют отдельной клеточной линией. Таким образом, если библиотека векторов экспрессии антител против RhD содержит 25 отдельных членов, то замороженная исходная библиотека в этом третьем способе состоит из 25 отдельных клеточных линий (не смеси клеточных линий), где каждая экспрессирует отдельный член из библиотеки векторов экспрессии антител против RhD. Таким образом, использование для производства одного флакона этой исходной библиотеки приводит к получению моноклонального антитела против RhD. В настоящем изобретении представлен пример библиотеки векторов экспрессии антител противRhD. Однако получение замороженной исходной библиотеки не зависит от антигенной специфичности поликлонального белка, получаемого из библиотеки, которая состоит из кодирующих вариабельную область участков нуклеиновых кислот, и ее можно использовать вместе с любой другой библиотекой, состоящей из участков нуклеиновых кислот, которые кодируют VH и VL антител или участков нуклеиновых кислот, которые кодируют - и - или - и -рецепторы Т-клеток (TcR). Составленная из кодирующих вариабельную область участков нуклеиновых кислот библиотека также может в дополнение к вариабельным областям кодировать одну или несколько константных областей. Таким образом, библиотека,состоящая из участков нуклеиновых кислот, которые кодируют VH и VL антител, может давать молекулыFv, одноцепочечные Fv, Fab или полноразмерные молекулы антител, а библиотека, состоящая из кодирующих вариабельную область TcR участков, может приводить к молекулам, которые состоят из фрагментов вариабельного домена TcR, растворимых TcR или полноразмерных TcR. В случаях, когда замороженная исходная библиотека состоит из отдельных линий клеток, целесообразно получать pWCB, который можно использовать для получения линии поликлональных продуцирующих клеток посредством размораживания и увеличения количества содержимого отдельного флакона. Используемые для получения такого pWCB отдельные линии клеток получают из i) отдельного клона или ii) совокупности клонов (совокупности получаемых после селекции отдельных колоний). Клоны получали из клеток-хозяев, индивидуально трансфицируемых с использованием и отбираемых на предмет устойчивой экспрессии отдельного члена библиотеки, которая содержит кодирующие вариабельную область участки нуклеиновых кислот, такие как участки, кодирующие VH и VL антител, или участки, кодирующие - и - или - и -TcR. Селекцию на стабильность экспрессии проводят известными в данной области способами, например с использованием генов-маркеров селекции. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения отдельные линии клеток получают из клонируемых или субклонируемых клеток, например подвергая клеточную линию, получаемую из i) или ii) (см. предыдущее описание), серийным разведениям или анализу FACS отдельных клеток и селекции, или посредством селекции клонов с высокой экспрессией, например с использованием робота, подобного ClonePix FL (см. ниже). Используемые для получения pWCB отдельные линии клеток, как описано выше, можно предварительно хранить в замороженной исходной библиотеке отдельных клеточных линий, из которой флакон с каждой отдельной клеточной линией размораживают и увеличивают количество клеток перед получением pWCB. Предпочтительно отдельные линии клеток экспрессируют полноразмерные антитела со свойствами, отличающимися от свойств антител, которые продуцируются другими членами pWBC, например различной антигенной специфичностью, различной аффинностью, различным вариабельными областями или областями CDR и/или различными константными областями. Каждая используемая для получения pWCB линия клеток продуцирует различный член поликлонального белка. Предпочтительно каждый отдельный член поликлонального белка связывает конкретный антиген. Кроме того, предпочтительно, чтобы каждый отдельный член продуцировался с одного специфичного участка в геноме каждой клетки-хозяина. pWCB получают смешиванием заранее определенного количества клеток каждой отдельной клеточной линии. Предпочтительно клетки смешивают в равных количествах (соотношение 1:1), хотя также могут быть желательны другие соотношения (см. далее). Смесь кле- 19014182 ток замораживают в виде аликвот, распределяя в определенное количество флаконов с определенным количеством клеток в каждом флаконе. Флаконы замораживают и хранят как pWCB для последующих производственных целей. Предпочтительно количество флаконов, составляющее pWCB, превышает 10,25, 50, 75, 100, 200, 500 или 1000. Отдельные флаконы pWCB можно размораживать в различные периоды времени, получая различные партии линии поликлональных продуцирующих клеток, способных продуцировать поликлональный белок с практически одним и тем же составом от партии к партии (см. пример 5). В альтернативном способе по настоящему изобретению линию поликлональных продуцирующих клеток можно увеличивать из подгруппы pWCB, получаемой из pWCB. Подгруппу pWCB получают размораживанием отдельного флакона pWCB и увеличением количества клеток до числа поколений, достаточных для получения общего количества клеток, которые можно замораживать в новые серии партий(подгруппы pWCB) приблизительно с таким же количеством клеток в каждой партии подгруппы pWCB,как во флаконе pWCB, исходно используемом для получения подгрупп pWCB. Преимущество этого способа состоит в том, что pWCB здесь служит в качестве главного банка клеток, как известно из других способов получения рекомбинантных белков. Таким образом, в этом способе pWCB можно также называть главным банком поликлональных клеток (рМСВ). Когда подгруппу pWCB исчерпывают, то можно получать новую подгруппу pWCB из партии pWCB/pMCB. Поэтому для этого способа необходимо значительно меньшее количество работы, чем необходимое для увеличения количества отдельных линий клеток из замороженной исходной библиотеки и смешивания нового pWCB. Кроме того, в случае исчерпания подгруппы pWCB повышена вероятность получения дальнейших партий линии поликлональных продуцирующих клеток, способных продуцировать поликлональный белок с практически одинаковым составом от партии к партии. Принцип получения pWCB/pMCB и подгрупп pWCB из индивидуально трансфицируемых клеток-хозяев представлен на фиг. 1 В. По сравнению с непосредственным получением pWCB или рМСВ полной трансфекцией или частичной трансфекцией, преимущество получения pWCB или рМСВ смешиванием отдельных линий клеток, которые были получены индивидуальной трансфекцией, состоит в том, что существует возможность проводить дополнительный анализ и селекцию индивидуально трансфицируемых клеточных линий перед получением pWBC или рМСВ. Это может обеспечить более стабильную линию поликлональных продуцирующих клеток, удовлетворяющую описанным ранее требованиям разнообразия. В дальнейшем под pWCB следует понимать как pWCB или рМСВ. В дополнительном варианте осуществления настоящего изобретения у отдельных линий клеток, которые отобрали по стабильной экспрессии отдельного члена библиотеки участков нуклеиновых кислот,кодирующих вариабельную область, как описано выше, дополнительно определяют скорость пролиферации и/или продуктивность перед получением pWCB. В предпочтительном варианте осуществления для получения pWCB отбирают линии клеток со сходными скоростями пролиферации или продуктивностью. Еще более предпочтительно для получения pWCB отбирают линии клеток со сходной продуктивностью,а также сходными скоростями пролиферации. Предпочтительно перед определением скорости пролиферации и/или продуктивности линии клеток адаптируют для культивирования в суспензии без сыворотки. Альтернативно, используемые для трансфекции родительские клетки перед трансфекцией адаптируют для культивирования в суспензии без сыворотки. Скорость пролиферации можно оценить известными в данной области способами, например, как описано в примере 2 настоящего изобретения. Скорость пролиферации линий клеток млекопитающих должна составлять от 18 до 100 ч, предпочтительно от 22 до 40 ч и наиболее предпочтительно от 24 до 32 ч. Продуктивность должна превышать 0,5 пг белка на клетку в сутки (пг/(клеткасутки,предпочтительно превышать 1, 1,5, 3, 5 или 8 пг/(клеткасутки). Кроме того, клеточная линия должна обладать гомогенной экспрессией популяции клеток при оценке способом внутриклеточного окрашивания. По желанию, для каждой отдельной линии клеток можно получать более гомогенную клеточную популяцию посредством клонирования, например посредством описанных ниже способов разделенияFACS. В других вариантах осуществления настоящего изобретения отдельные линии клеток разделяют посредством FACS для выявления клеток с гомогенным уровнем экспрессии после трансфекции и процедур селекции. Следовательно, дополнительный вариант осуществления настоящего изобретения представляет собой возможность разделения на предмет отдельных клонов с высокой экспрессией или подсовокупности клеток с высокими уровнями экспрессии, устанавливая дискриминационное окно для конкретной части популяции в отношении анализа FACS. Получение клонированных клеток анализом FACS и селекцией особенно эффективно при получении отдельных линий клеток из совокупности клонов. Для разделения клеток, экспрессирующих на высоких уровнях желаемый белок, например антитело или TcR, можно использовать антитела с флуоресцентной меткой, получая тем самым гомогенную по продуктивности популяцию клеток. Этот способ основан на наблюдении, что секретируемые белки можно выявлять на поверхности секретирующих их клеток, а количество поверхностного белка, очевидно,соответствует уровням экспрессии для отдельной клетки. Следовательно, высокопродуктивные клетки- 20014182 можно разделять по отдельным клеткам после окрашивания с меченым антителом с последующим анализом посредством FACS. Способ был описан Brezinsky (Brezinsky et al. J. 2003. Immunol Methods, 277,141-155). Альтернативный способ разделения основан на связывании лиганда, специфичного к экспрессируемому клетками белку, с поверхностью клеток. Например, антитело против Fc или антиидиотипическое антитело можно связывать через биотин с поверхностью популяции секретирующих белок клеток. Затем секретируемые отдельной клеткой антитела захватываются антителами против Fc на поверхности этой клетки. После этого высокопродуктивные клетки можно разделять с помощью FACS после окрашивания с меченым антителом. Этот способ был описан в ЕР 667896. Для получения линий клеток с гомогенными высокими уровнями экспрессии анализируют отдельные клетки с высоким уровнем экспрессии, основываясь на графике FACS, который получают одним из описанных способов. Затем отдельные клеточные клоны размножают и, возможно, анализируют в отношении скорости пролиферации и продуктивности, как описано выше. Альтернативно, отбирают разделением подсовокупность клеток с наиболее высоким уровнем экспрессии, как выявлено, с помощью графика FACS. По желанию, подсовокупность клеток из отдельной линии клеток можно сходным образом анализировать в отношении скоростей пролиферации и продуктивности. В альтернативном варианте осуществления изобретения для селекции клонов с высокими уровнями экспрессии и/или сходными свойствами роста используют робот, такой как робот ClonePixFL (Genetix,UK). Такую селекцию осуществляют следующим образом: колонии, получаемые после трансфекции и селекции, растят в полутвердой среде, позволяющей выявлять высокопродуктивные колонии посредством сбора секретируемого белкового продукта в непосредственной близости от колонии. Уровень продукции для каждой колонии определяют способами иммунофлуоресцентного мечения экспрессируемого клетками белка с последующей селекцией лучших клонов с использованием программного обеспечения обработки изображений, основываясь на заранее определенных критериях селекции, таких как уровень экспрессии и свойства роста. Кроме того, размер каждой колонии (отражающий скорость пролиферации клеток) можно оценивать с помощью робота с получением изображения светового излучения. Затем колонии с желаемыми свойствами продукции и/или роста отделяют с помощью робота и переносят в 96-луночные планшеты для дальнейшего увеличения количества клеток. Предпочтительно для получения pWCB селектируют отдельные линии клеток со сходной продуктивностью. В предпочтительном варианте осуществления составляющие pWCB отдельные линии клеток получают из клонированных клеток с высоким уровнем экспрессии, например, получаемых разделением по отдельным клеткам, серийными разведениями или селекцией роботом, или из совокупности клеток с высоким уровнем экспрессии. Линиями клонированных клеток по настоящему изобретению называют отдельные линии клеток,получаемые из отдельной колонии клеток, которые выделяют после трансфекции и селекции, а также отдельные линии клеток, получаемые из клона, который получают, например, разделением на отдельные клетки с использованием FACS. В предпочтительном варианте осуществления такие линии клонированных клеток используют для получения pWCB. В другом варианте осуществления настоящего изобретения после получения pWCB отдельные линии клеток смешивают в различных соотношениях. Отдельные линии клеток можно смешивать в соответствии с заранее определенными критериями на основе свойств отдельных линий клеток и/или отдельного члена белка, экспрессируемого указанной клеточной линией, например специфической продуктивности или аффинности связывания. Например, отдельные линии клеток, экспрессирующие определенные антитела, которые связывают конкретные важные антигены или эпитопы, можно получать в избытке по сравнению с остальными клеточными линиями, членами pWCB, например, в количествах выше в 2, 3, 5 или 10 раз. Например, один из членов линии клеток можно добавлять в пропорции 2:1 относительно других членов, например 4106 клеток члена 1 и 2106 клеток каждого из остальных членов клеточной линии. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения получают pWCB для продукции рекомбинантного поликлонального антитела против RhD. Еще более предпочтительно такойpWCB получают таким образом, чтобы линии клеток, продуцирующие антитела с реактивностью к антигену RhD группы VI, составляли по крайней мере 5, 8, 10, 12, 15, 20 или 25% от общего количества включаемых в pWCB клеток. Этот способ различных соотношений отдельных линий клеток в pWCB также можно использовать для преодоления различий в скорости пролиферации и продуктивности отдельных клеточных линий,особенно, если они не были отобраны на предмет сходства этих свойств. Таким образом, если одна или несколько отдельных линий клеток имеют более низкую скорость пролиферации, т.е. более длительное время удвоения, по сравнению с другими членами рабочего банка поликлональных клеток, характеризующимися более высокой скоростью пролиферации, но при этом такая низкая скорость пролиферации не связана с особенно высокой продуктивностью, то такой конкретный член(ы) можно добавить к pWCB в увеличенном количестве для компенсации его медленного роста. Например, линию клеток со скоростью пролиферации 50 ч можно добавлять в соотношении 2:1, если остальные составляющие pWCB ли- 21014182 нии клеток имеют скорости пролиферации от 22 до 30 ч. Сходным образом, соотношение линий клеток с коротким временем удвоения можно снижать для обеспечения отсутствия их преобладания в процессе получения. Кроме того, соотношения отдельных линий клеток в pWCB можно адаптировать на основе анализа продуктов поликлонального белка, продуцируемых линиями поликлональных продуцирующих клеток, которые получают из pWCB. Такие изменения можно осуществлять, например, на основе графиков IEX или эквивалентных способов характеризации. Если в таком анализе наблюдают, что один или несколько конкретных членов белка продуцируются в повышенном количестве по сравнению с остальными членами, то можно получать новый pWCB, в котором снижено соотношение линий клеток, продуцирующих эти конкретные члены белка. Наоборот, если конкретный член продуцируется в пониженном количестве, то можно получать pWCB с повышенным соотношением линии клеток, продуцирующих этот член. Очистка анти-RhD rpAb из супернатанта культуры. Выделение анти-RhD rpAb из супернатантов культур возможно с применением различных способов хроматографии, в которых используют различия в физико-химических свойствах белков, например различия в молекулярной массе, суммарном заряде, гидрофобности или аффинности к специфическому лиганду или белку. Таким образом, белки можно разделять в соответствии с молекулярной массой, используя гель-фильтрационную хроматографию, или в соответствии с суммарным зарядом, используя ионообменную (катион/анион) хроматографию или, альтернативно, используя хроматофокусирование. Для очистки IgG (поликлонального, а также моноклонального) из различных источников, например асцитной жидкости, супернатантов культур клеток и сыворотки, часто используют аффинную хроматографию в сочетании с последующими стадиями очистки, такими как ионообменная хроматография, гидрофобные взаимодействия и гель-фильтрация. Аффинная очистка, где разделение основано на обратимом взаимодействии между антителами против RhD и связанным с хроматографическим матриксом специфичным лигандом, представляет собой легкий и быстрый способ, обеспечивающий высокую избирательность, как правило, высокую емкость и концентрацию в малом объеме. Специфичные лиганды в виде пептидов, способные связываться с антителами против RhD, можно получать в соответствии с описанным в ЕР 1106625 способом с использованием пептидного фагового дисплея. Белки А и G, два белка поверхности бактериальной клетки, обладают высоким сродством к области Fc, и их использовали в фиксированном виде для общепринятых применений, в том числе для очистки поликлонального IgG и его подклассов из различных видов, а также для абсорбции и очистки иммунных комплексов. Для удаления белков клетки-хозяина, пропущенного белка А и ДНК после аффинной хроматографии можно проводить последующие стадии хроматографии, например ионообменной и/или хроматографии гидрофобного взаимодействия. При аффинной и катионообменной хроматографии для белка А было выявлено, что величины рН выше 5, могут вызывать осаждение анти-RhD rpAb. Таким образом, буферы следует добавлять осторожно, используя соответствующие буферные средства, например Tris или ацетат. Гель-фильтрацию, как конечную стадию очистки, можно использовать для удаления примесей, таких как димеры и другие комплексы, и переноса образца в буфер для хранения. В зависимости от источника и условий экспрессии может быть необходимо проводить дополнительную стадию очистки для достижения необходимого уровня чистоты антитела. Так, для очистки антител для терапевтического применения часто используют хроматографию гидрофобных взаимодействий или ионообменную хроматографию в сочетании с хроматографией для белка А и гель-фильтрационной хроматографией. Для очистки других классов антител следует использовать альтернативный способ аффинной хроматографии, поскольку белки А и G не связывают IgA и IgM. Можно использовать иммуноаффинную очистку (связанные с твердой фазой моноклональные антитела против IgA или к IgM) или, альтернативно, можно использовать многостадийные способы очистки, включая ионообменное и гидрофобное взаимодействие. Структурная характеристика анти-RhD rpAb. Для структурной характеристики поликлональных антител необходимо высокое разрешение вследствие сложности смеси (разнообразие клонов, гетерогенность и гликозилирование). Общепринятые способы, такие как гель-фильтрация, ионообменная хроматография или электрофорез, могут не обладать достаточным разрешением для выявления различий среди отдельных антител в рекомбинантном поликлональном антителе против RhD. Для анализа профиля сложных смесей белков использовали двумерный электрофорез в полиакриламидном геле (2D-PAGE) с последующей масс-спектрометрией (MS) или жидкостной хроматографией (LC)-MS (например, протеомика). Для 2D-PAGE, в котором сочетают разделение на основе заряда и массы белка, была подтверждена эффективность для выявления различий среди поликлональных, олигоклональных и моноклональных иммуноглобулинов в образцах сыворотки. Однако этот способ имеет некоторые ограничения. Для анализа сложных пептидных смесей все более широко используют способы хроматографии, особенно капиллярной и LC в сочетании с MS с ионизацией способом электрораспыления. LC-MS использовали для характеристики моноклональных антител, а в последнее время также для анализа профиля легких цепей поликлонального антитела. Для анализа очень сложных образцов необходима большая разрешающая способность хроматографической системы, которую можно получать разделением в двух направлениях (или более). Такой способ основан на ионооб- 22014182 менной хроматографии в первом направлении и хроматографии с обращенной фазой (или гидрофобного взаимодействия) во втором направлении, необязательно, в сочетании с MS. Функциональная характеристика анти-RhD rpAb. Анти-RhD rpAb можно, например, функционально характеризовать посредством сравнительных исследований с продуктами иммуноглобулинов против резус-фактора D или моноклональных антител против RhD. Такие исследования можно проводить in vitro, а также in vivo. Способы функциональной характеристики рекомбинантного поликлонального антитела противFACS), анализ антителозависимой клеточной цитотоксичности (ADCC) и розеткообразования. Кратко,описанные анализы осуществляют следующим образом. Анализ ADCC (на основе 51Cr). В качестве эффекторных клеток используют РВМС человека, а в качестве мишеней используютRhD-отрицательные и RhD-положительные RBC (0 в системе АВ 0). Сначала RBC (RhD(+) и RhD(- метят 51Cr, промывают, а затем сенсибилизируют с использованием антител против RhD (например, с использованием рекомбинантного поликлонального антитела против RhD, антител против резус-фактора D или моноклонального антитела против RhD) в различных разведениях. К сенсибилизированным RBC добавляют эффекторные клетки (РМВС) (соотношение 20:1) и инкубируют в течение ночи. Клетки осаждают центрифугированием и супернатанты переносят из лунок в Lumaplate (PerkinElmer). Включают контрольные образцы для самопроизвольного высвобождения (RBC только с 51Cr) и для общего высвобождения (к меченым 51Cr RBC добавляют Triton-X-100). Lumaplate сушат и подсчитывают в Topcounter(PerkinElmer). Анализ фагоцитоза (на основе 51Cr). Фагоцитоз можно измерять в сочетании с анализом ADCC. После селекции супернатанта в анализеADCC остающийся супернатант удаляют и лизируют эритроциты, добавляя гипотонический буфер. Клетки промывают и удаляют супернатант. Во все лунки добавляют PBS+1% Triton-X-100 и фиксированные количества переносят в Lumaplate, сушат и подсчитывают, как ранее. Анализ фагоцитоза (на основе FACS). Анализ основан на адгезии фагоцитов. Для анализа можно использовать линию монобластных клеток лейкоза человека U937. Клетки U937 дифференцируют с использованием РМА 10 нМ. Через 2 суток 60% среды удаляют и заменяют средой без РМА. Клеточную мембрану эритроцитов (RhD(+) и RhD(окрашивают РКН 26 (РЕ) в соответствии с протоколом производителя (Sigma). Сенсибилизируют RBC антителами к RhD в различных разведениях, а избыток антител удаляют промывкой. На 3 сутки удаляют промывкой не прикрепившиеся клетки из клеток U937 и в лунки добавляют сенсибилизированные RBCRBC удаляют промывкой посредством нескольких стадий. Прикрепившиеся, но не захваченные фагоцитами RBC лизируют добавлением гипотонического буфера с последующей дополнительной промывкой. Клетки U937 отделяют от лунок инкубацией с трипсином. Анализируют клетки посредством FACS. Анализ розеткообразования. Анализ розеткообразования представляет собой просто анализ связывания рецептора Fc. Сенсибилизированные эритроциты инкубируют с дифференцированными клетками U937, получаемыми, как описано выше. RBC (RhD(-) и RhD(+ сенсибилизируют антителами к RhD в различных разведениях и перед смешиванием их с клетками U937 удаляют промывкой избыток антител. Инкубацию проводят в течение 1 ч и удаляют промывкой несвязавшиеся RBC. Подсчитывают процент клеток с двумя или болееRBC, прикрепившимися к поверхности. Функциональная характеризация антител против RhD in vivo, описанная Miescher (Miescher, S., etal. 2004, Blood, 103, 4028-4035), предусматривает инъекцию клеток RhD(+) индивидуумам RhD(-) с последующим введением антитела против RhD. Анализировали клиренс RBC и чувствительность доноров к антителу к RhD. Терапевтические композиции. В определенном варианте осуществления изобретения фармацевтическая композиция, содержащая в качестве активного ингредиента рекомбинантное поликлональное антитело против RhD, или рекомбинантный поликлональный Fab против RhD, или другой рекомбинантный поликлональный фрагмент против RhD, предназначена для профилактики гемолитической болезни новорожденных, лечения идиопатической тромбоцитопенической пурпуры (ITP) или предотвращения повышения чувствительности к резус-антигену D после ошибочных переливаний крови RhD(+) индивидуумам RhD(-). Фармацевтическая композиция дополнительно содержит фармацевтически приемлемый эксципиент. Рекомбинантное поликлональное антитело против RhD или его поликлональные фрагменты можно вводить в фармацевтически приемлемом разбавителе, носителе или эксципиенте, в стандартной лекарственной форме. Для получения подходящих препаратов или композиций для введения женщинам-матерям или пациентам можно использовать общепринятые фармацевтические способы. В предпочтительном варианте осуществления введение осуществляют с профилактической целью. Можно использовать лю- 23014182 бой подходящий способ введения, например введение может быть парентеральное, внутривенное, внутриартериальное, подкожное, внутримышечное, внутрибрюшинное, интраназальное введение, введение с помощью аэрозоля, суппозитория или пероральное введение. Например, терапевтические препараты могут находиться в виде жидких растворов или суспензий; препараты для перорального введения могут находиться в виде таблеток или капсул, жевательной резинки или пасты, а в случае интраназальных препаратов - в виде порошков, капель для носа или аэрозолей. Фармацевтические композиции по настоящему изобретению получают известным, по существу,способом, например общепринятыми способами растворения, лиофилизации, смешивания, гранулирования или получения препарата со сладким наполнителем. Фармацевтические композиции можно составлять в соответствии с общепринятой фармацевтической практикой (см., например, в Remington: The Science and Practice of Pharmacy (20th ed.), ed. A.R. Gennaro, 2000, Lippincott WilliamsWilkins,Philadelphia, PA и Encyclopedia of Pharmaceutical Technology, eds. J. Swarbrick and J.C. Boylan, 1988-1999,Marcel Dekker, New York, NY). Растворы активного ингредиента, а также суспензии, а особенно изотонические водные растворы и суспензии, предпочтительно используют, по возможности, в случае, например, лиофилизированных композиций, которые содержат активный ингредиент отдельно или вместе с носителем, например маннитом,где такие растворы или суспензии следует получать перед использованием. Фармацевтические композиции можно стерилизовать и/или они могут содержать эксципиенты, например консерванты, стабилизаторы, увлажнители и/или эмульгаторы, растворители, соли для регуляции осмотического давления и/или буферы, и их можно получать, по существу, известными способами, например общепринятыми способами растворения или лиофилизации. Указанные растворы или суспензии могут содержать повышающие вязкость вещества, такие как карбоксиметилцеллюлоза натрия, карбоксиметилцеллюлоза, декстран, поливинилпирролидон или желатин. Композиции для инъекции получают общепринятым способом в стерильных условиях; также это относится к использованию для введения композиций в ампулы или флаконы и герметизации контейнеров. Фармацевтические композиции для перорального введения можно получать сочетанием активного ингредиента с твердыми носителями, по желанию гранулируя получаемую смесь, и перерабатыванием смеси, по желанию или необходимости после добавления соответствующих эксципиентов, в таблетки,пилюли или капсулы, которые можно покрывать шеллаком, сахаром или ими обоими. Также можно включать их в пластичные носители, позволяющие активным ингредиентам диффундировать или высвобождаться в измеряемых количествах. Фармацевтические композиции содержат приблизительно от 1 до приблизительно 95%, предпочтительно приблизительно от 20 до приблизительно 90% активного ингредиента. Фармацевтические композиции по изобретению могут находиться в виде, например, стандартной лекарственной формы, такой как в виде ампул, флаконов, суппозиториев, таблеток, пилюль или капсул. Препараты можно вводить индивидууму человеку в терапевтически или профилактически эффективных количествах (например, количествах, предотвращающих, устраняющих или ослабляющих патологическое состояние) для обеспечения лечения заболевания или состояния. Предпочтительная доза подлежащего введению терапевтического средства, вероятно, зависит от таких факторов, как тип и степень выраженности заболевания, общее состояние здоровья конкретного пациента, состав эксципиентов композиции и способ ее введения. Терапевтическое применение композиций по изобретению. Фармацевтические композиции по настоящему изобретению можно использовать для лечения,улучшения состояния или профилактики заболевания у млекопитающего. Состояния, которые можно лечить или предотвращать с использованием фармацевтических композиций, включают в себя профилактику гемолитической болезни новорожденных, лечение идиопатической тромбоцитопенической пурпуры (ITP) или предотвращение повышения чувствительности к резус-антигену D после ошибочных переливаний крови RhD(+) индивидуумам RhD(-). В одном из аспектов настоящее изобретение относится к способу лечения, улучшения состояния или профилактики заболевания у животного, при котором вводят эффективное количество рекомбинантного поликлонального антитела против RhD или фрагмента. Другой вариант осуществления настоящего изобретения относится к применению анти-RhD rpAb или фрагмента поликлонального антитела для получения композиции для профилактики гемолитической болезни новорожденных или лечения идиопатической тромбоцитопенической пурпуры (ITP). Применение для диагностики и выявления во внешней среде. Другой вариант осуществления изобретения относится к наборам для диагностики. Наборы по настоящему изобретению содержат анти-RhD rpAb по изобретению, где белок можно метить визуализируемой меткой или оставлять без метки для выявления в отсутствие метки. Набор можно использовать для выявления индивидуумов RhD(+) или индивидуумов с конкретной группой резус-фактора D. Выявление последних можно осуществлять с помощью композиции анти-RhD rpAb, которые взаимодействуют только с этой конкретной группой резус-фактора D.- 24014182 Примеры В следующих примерах описано, как рекомбинантное поликлональное антитело против RhD экспрессируют и получают в линии высокопродуктивных клеток, где в предварительно охарактеризованный хромосомный "горячий" участок посредством сайт-специфического встраивания встроены участки нуклеиновых кислот или вектор(ы), содержащий(е) VH и VL. В примерах в качестве клетки-хозяина использовали клетки CHO. Их преимущества включают в себя доступность приемлемой среды для роста, их способность эффективно расти до высокой плотности в культуре и экспрессировать белки млекопитающих, такие как антитела, в биологически активной форме. В целом трансформацию E.coli и трансфекцию клеток млекопитающих по изобретению проводили в соответствии с общепринятыми способами. Следующие примеры иллюстрируют настоящее изобретение, но их не следует рассматривать как ограничивающие объем изобретения. Пример 1. Получение рекомбинантного поликлонального антитела против резус-фактора D. Доноры. Доноров регистрировали в Aalborg Sygehus Nord. Всего было иммунизировано 8 женщин RhD(-) эритроцитами RhD(+), полученными от индивидуумов RhD(+). Доноры имели различную историю иммунизации в отношении числа повторных введений антигена и источника эритроцитов RhD(+) для иммунизации. История иммунизации различных доноров представлена в табл. 1. Таблица 1 Мононуклеарные клетки собирали с помощью леикафереза через 5-7 суток после последнего повторного введения антигена. Клетки осаждали центрифугированием и сразу переносили в раствор для лизиса клеток из коммерчески доступного набора для получения РНК (NucleoSpin RNA L,Machery-Nagel,740 962.20 в каталоге). После лизиса клеток суспензию замораживали перед дальнейшей обработкой. Получение библиотеки дисплея Fab против резус-фактора D. Получаемый от каждого донора материал хранили по отдельности в течение всего получения библиотеки и пэннинга. Лизаты клеток размораживали и РНК получали в соответствии с инструкциями набора (NucleoSpin RNA L). Целостность РНК анализировали электрофорезом в агарозном геле, подтверждая, таким образом, отсутствие разрушения рибосомальных РНК 18S/28S. РНК подвергали синтезу кДНК в реакции с олиго(dT)-праймерами, используя приблизительно 10 мкг общей РНК в реакции с использованием ThermoScript (Invitrogen) в соответствии с инструкциями производителя. кДНК использовали в качестве матрицы в реакциях PCR, используя следующие праймеры. Прямые праймеры VH (жирным шрифтом выделен участок XhoI)- 25014182 Обратные праймеры VH (жирным шрифтом выделен участок AscI) Прямой праймер С (жирным шрифтом выделен участок NotI) Обратные праймеры V (жирным шрифтом выделен участок NheI) Прямой праймер С (жирным шрифтом выделен участок NotI)PCR проводили с отдельными парами праймеров, достигая 36 реакций для VH, 6 реакций для каппа и 22 реакций для лямбда. Все продукты PCR для VH, каппа и лямбда объединяли по отдельности, и после очистки с использованием колонок NucleoSpin (Machery-Nagel,740 590.250 в каталоге) продукты перед клонированием расщепляли (VH: AscI/XhoI, каппа и лямбда: NheI/NotI) с последующей стадией очистки из геля представляющих интерес полос (набор PerfectPrep Gel Cleanup, Eppendorf,0032 007.759 в каталоге). Легкие цепи (отдельно каппа и лямбда) встраивали посредством лигирования в обработанныйNheI/NotI вектор на основе фагового дисплея Em351 (фиг. 2) и амплифицировали в синих E.coli XL1(Stratagene). Из отбираемых в течение ночи на агаровых планшетах с карбенициллином клеток E.coli выделяли плазмидную ДНК, составляющую библиотеку легких цепей (две библиотеки для каждого донора,каппа и лямбда соответственно). Эту библиотеку ДНК подвергали расщеплению AscI/XhoI, а после очистки из геля продукты PCR VH (подвергаемые расщеплению такими же ферментами и очистке из геля) лигировали в две библиотеки легких цепей от каждого донора и амплифицировали в клетках E.coli TG1(Stratagene), применяя селекцию с использованием карбенициллина на агаровых планшетах. После роста в течение ночи бактерии счищали с планшетов и получали исходные источники в глицерине для надлежащего хранения библиотеки. Получение плазмидной ДНК, содержащей комбинаторную библиотеку вариабельных тяжелых цепей-легких цепей (VH:LC), также проводят для обеспечения библиотеки на будущее. На этом этапе комбинаторные библиотеки, содержащиеся в клетках TG1 (две от каждого донора),готовы для фагового дисплея и пэннинга. Размеры комбинаторных библиотек (в совокупности 16) составляли 106 или более. Обогащение для фагов, которые несут связывающие резус-антиген D фрагменты Fab. Несущие на своей поверхности Fab фаги получали следующим образом: 50 мл 2YT/1% глюкоза/100 мкг/мл карбенициллина инокулировали с использованием клеток TG1, содержащих комбинаторную библиотеку VH:VL, до достижения OD600 приблизительно 0,08. Культуру встряхивали в течение 1,5 ч и добавляли фаг-помощник (VSCM 13). Культуру инкубировали при 37 С в течение 0,5 ч в отсутствие встряхивания и в течение 0,5 ч при встряхивании. Бактерии осаждали центрифугированием (3200g,10 мин, 4 С), ресуспендировали в 50 мл 2YT/100 мкг/мл карбенициллин/70 мкг/мл канамицина и встряхивали культуру в течение ночи при 30 С. Фаги из супернатанта культуры осаждали добавлением 1/5 объема PEG/1,5 M NaCl, инкубированием во льду в течение 30 мин и центрифугированием при 8000g в течение 30 мин при 4 С. Осажденные фаги ресуспендировали в PBS и использовали непосредственно для пэннинга. Пэннинг фрагментов Fab, связывающих резус-антиген D, выполняли двустадийной процедурой. ВPBS 3 раза промывали 108 эритроцитов (RBC) RhD(-) (центрифугировали при 2000g, 45 с) и ресуспендировали в 150 мкл буфера для пэннинга (2% обезжиренного молока в 0,85PBS). Для осуществления стадии отрицательной селекции к клеткам RhD(-) (ресуспендированным в буфере для пэннинга) добавляли 50 мкл свежеполученных фагов и инкубировали при 4 С в течение 1 ч в устройстве для вращения вертикального типа. Через 1 ч инкубации клетки осаждали центрифугированием (2000g, 45 с) и содержащий фаги супернатант инкубировали с 2107 RBC RhD(+) (промывали 3 раза в PBS). Смесь фаг:RBCRhD(+) инкубировали в течение 1 ч в устройстве для вращения вертикального типа при 4 С. Несвязавшиеся фаги удаляли, промывая 5 раз 1 мл буфера для пэннинга и 5 раз PBS. Связавшиеся фаги элюировали добавлением 200 мкл Н 2 О (лизирующей клетки). 100 мкл элюата добавляли к экспоненциально растущим клеткам TG1, остаток хранили при -80 С. Инфицированные элюированными фагами клетки TG1 высевали на планшеты с агаром карбенициллин/глюкоза и инкубировали в течение ночи при 37 С. На следующие сутки колонии счищали с планшетов и инокулировали 10 мл культуральной среды для получения фагов для второго цикла пэннинга. Второй цикл пэннинга проводили так, как описано для первого цикла. Обогащение для фагов, которые несут связывающие резус-антиген D группы VI фрагменты Fab. В отдельной серии пэннингов проводили селекцию для получения клонов с реактивностью к антигену RhD группы VI. Отрицательную селекцию проводили на крови RhD(-), как описано, а положительную селекцию выполняли на RhDVI-положительных эритроцитах. В остальном процедура соответствовала описанной ранее. Селекция Fab, связывающих RhD. После каждого цикла пэннинга отбирали отдельные колонии для анализа свойств их связывания с эритроцитами в анализах агглютинации. Кратко, отдельные колонии инокулировали в 2YT/100 мкг/мл карбенициллин/1% глюкоза и встряхивали в течение ночи при 37 С. На следующие сутки инокулировали планшеты DeepWell с использованием 900 мкл 2YT/100 мкг/мл карбенициллин/0,1% глюкоза и 10 мкл ночной культуры. Планшеты встряхивали в течение 2 ч при 37 С перед выполнением индукции Fab посредством добавления 300 мкл 2YT/100 мкг/мл карбенициллин/0,25 мМ IPTG в лунку. Планшет встряхивали в течение ночи при 30 С. На следующие сутки бактерии осаждали центрифугированием (3200g,4 С, 10 мин), ресуспендировали в 100 мкл 0,8 М NaCl, 0,2PBS, 8 мМ EDTA и инкубировали в течение 15 мин на льду для проведения периплазматической экстракции фрагментов Fab. Переносили планшет на-20 С и, наконец, размораживали суспензию и центрифугировали в течение 10 мин при 4 С и 3200g. Периплазматический экстракт анализировали ELISA на содержание Fab и анализами агглютинации для оценки связывающей способности отдельных фрагментов Fab. Анализ агглютинации проводили следующим образом: RBC RhD(-) и RhD(+) смешивали в пропорции 1:1 и 3 раза промывали в PBS. После последней промывки смесь клеток ресуспендировали в 1% BSA в PBS при плотности 1% клеток, добавляли 50 мкл в каждую лунку 96-луночного планшета. В лунки добавляли периплазматические экстракты. В качестве положительного контроля использовали иммуноглобулин Rhesogamma P (Aventis) в соответствии с инструкциями производителя. Планшеты инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре при осторожном встряхивании. Клетки трижды промывалиPBS перед добавлением второго антитела (конъюгат козьего Fab к человеку/FITC, Sigma F5512) в разведении 1:100. Планшеты оставляли для агглютинации в течение 1 ч при комнатной температуре в отсутствие встряхивания. Положительные в анализе агглютинации фрагменты Fab определяли внешним осмотром и регистрировали посредством получения изображения. Определение дискретных значений связывающей активности фрагментов Fab проводили анализом FACS для агглютинирующих образцов. Когда проводили скрининг на клоны с реактивностью к эритроцитам RhDVI+, то такие клетки использовали в сочетании с клетками RhD(-) в процедуре, в остальном аналогичной указанной выше процедуре. Селекция различных последовательностей, кодирующих Fab к RhD. В общем было выявлено 1700 связывающих антиген RhD клонов. Все положительные клоны подвергали секвенированию ДНК. Из них были отобраны 56 клонов на основе их уникального набора последовательностей CDR тяжелых цепей. В случае множества клонов, в которых использовали одну и ту же тяжелую цепь и различные легкие цепи, отбирали клон, для которого в анализе FACS наблюдали наивысшую активность связывания. Таким образом, из всех положительных клонов была отобрана подбиблиотека, содержащая последовательности, которые кодируют пары вариабельной тяжелой цепи (VH) и легкой цепи (LC), отражая широкое разнообразие при высокой специфичности к антигену RhD. Связывающую активность этих 56 клонов повторно подтверждали в анализах агглютинации для подтверждения отсутствия ошибочно выбранных положительных клонов. Выбранные клоны затем анализировали на мутации, обусловленные, например, перекрестным примированием внутри семейства, поскольку такие мутации могут приводить к общим структурным изменениям экспрессируемого антитела, возможно создавая новые эпитопы и таким образом приводя к повышенной иммуногенности конечного продукта. Клоны с такими мутациями исправляли, как описано в последующем разделе, относящемся к переносу VH:LC из фагмидного вектора в вектор экспрессии для млекопитающего. Выравнивание исправленных последовательностей нуклеиновых кислот для VH и легких цепей (LC) представлено на фиг. 3-6 соответственно. Дополнительное выравнивание полипептидных цепей VH и VL представлено на фиг. 5 и 6 соответственно. Выравнивание полипептидов проводили и нумеровали в соответствии со структурными критериями, определенными Chothia (Chothia et al. 1992, J. Mol. Biol. 227,776-798; Tomlinson et al. 1995, EMBO J. 14, 4628-4638 и Williams et al. 1996, J. Mol. Biol., 264, 220-232). На фигурах дополнительно указано положение трех областей CDR в вариабельных областях. Положения областей CDR в аминокислотных последовательностях обобщены в табл. 2. Нумерация областей CDR3 в выравниваниях полипептидов (фиг. 5 и 6) не следует Chothia (переход, обозначенный на фигурах звездочкой). Для обеспечения идентификации области CDR3 в отношении аминокислотного положения применяли непрерывную нумерацию после звездочки. На основе этой нумерации из фигур можно получать последовательность области CDR3 для каждого отдельного клона. Таблица 2 Пары вариабельной тяжелой цепи и полной легкой цепи, которые скринировали как Fab и селектировали на их способности связывать антиген RhD, можно устанавливать по совпадающим номерам их клонов. Все 56 пар VH:LC перечислены в табл. 3 согласно номеру клона, SEQ ID нуклеиновой кислоты Перенос выбранных последовательностей, кодирующих VH и легкую цепь, в вектор экспрессии млекопитающего. В результате мутаций, например, из-за перекрестного примирования внутри семейства было необходимо исправить большое количество выбранных последовательностей. Исправление осуществляли вместе с переменой системы экспрессии с фагового дисплея на систему экспрессии млекопитающего. По этой причине перенос выполняли отдельно для каждого отдельного клона. Перенос и исправление проводили следующим образом: сначала кодирующую VH последовательность, расположенную в векторе Em351, повторно амплифицировали с помощью PCR с использованием высокоточной полимеразы Phusion (Finnzymes) и соответствующего набора праймеров для исправления. Фрагмент VH PCR расщепляли с использованием AscI и XhoI и подвергали очистке на геле. Вектор экспрессии Neo (фиг. 7) расщепляли соответствующими ферментами и очищали на геле, удаляя таким образом последовательность нуклеиновой кислоты, которая расположена между лидерной последовательностью и константными областями тяжелой цепи. Исправленный фрагмент VH и вектор экспрессии Neo лигировали и амплифицировали в клетках E.coli Top10. Из отобранных в течение ночи на карбенициллине клеток E.coli выделяли плазмидную ДНК вектора экспрессии Neo, содержащего VH. После переноса кодирующей VH последовательности повторно амплифицировали соответствующую последовательность LC с помощью PCR с использованием высокоточной полимеразы Phusion(Finnzymes) и соответствующего набора праймеров для исправления. Фрагмент LC PCR расщеплялиNheI и NotI и подвергали очистке на геле. Содержащий VH вектор экспрессии Neo расщепляли соответствующими ферментами и очищали из геля, удаляя таким образом последовательность нуклеиновой кислоты, которая расположена между лидерной каппа-последовательностью и сигнальной BGH-поли(А)последовательностью. Исправленный фрагмент LC и содержащий VH вектор экспрессии Neo лигировали и амплифицировали в клетках E.coli Top10. Для каждого отдельного клона получали исходные источники в глицерине, а также из бактериальных культур получали высококачественный препарат плазмид,подходящий для трансфекции клеток млекопитающих. Исходно выбранные посредством фагового дисплея пары VH:LC повторно получали в векторе экспрессии для млекопитающего посредством проведения отдельного переноса для каждого клона. В случаях, когда исправление не требовалось, участок нуклеиновой кислоты переносили без проведения PCR перед расщеплением соответствующими ферментами рестрикции. Получаемые описанным переносом векторы экспрессии для млекопитающих подходят для экспрессии полноразмерного рекомбинантного поликлонального антитела против RhD. Хотя на этой стадии векторы хранят по отдельности, их все равно считают библиотекой векторов экспрессии антител против