Гуманизированный иммуноглобулин и содержащая его фармацевтическая композиция

013564 Область изобретения Данное изобретение относится к гуманизированным антителам, получаемым из трансгенных животных, отличных от человека. С помощью генетической инженерии создают животных, отличных от человека, так что они содержат один или более гуманизированных локусов иммуноглобулинов, которые у трансгенных животных, отличных от человека, способны подвергаться реаранжировке генов и конверсии генов, давая разнообразные гуманизированные иммуноглобулины. Данное изобретение, кроме того,относится к новым последовательностям, рекомбинантным векторам и трансгенным векторам, применимым для создания таких трансгенных животных. Гуманизированные антитела согласно данному изобретению обладают минимальной иммуногенностью по отношению к человеку и подходят для применения при терапевтическом лечении людей. Предпосылка изобретения Лечение инфекционных заболеваний, вызванных бактериями, грибами, вирусами и паразитами в основном основано на химиотерапии. Однако появление организмов, устойчивых к лекарственным средствам, требует постоянной разработки новых антибиотиков. Лечение пациентов со злокачественными новообразованиями и раковыми опухолями также основано на химиотерапии. Однако многие из указанных способов лечения неэффективны, и высока смертность среди пациентов с такими заболеваниями. Как в случае инфекционных болезней, так и в случае рака необходимы усовершенствованные и новые способы лечения. Терапия резистентного к стероидам отторжения трансплантированных органов требует применения биологических реагентов (препаратов моноклональных или поликлональных антител), которые снимают протекающий аллоиммунный ответ у реципиента с трансплантатом. Основной проблемой в случае препаратов антител, полученных от животных, является присущая нечеловеческим иммуноглобулинам иммуногенность у пациентов людей. Чтобы уменьшить иммуногенность нечеловеческих антител,было предложено генетическое конструирование отдельных генов антител у животных. В частности было показано, что в результате слияния экзонов вариабельных (V) областей животных с экзонами константных (С) областей человека можно получить ген химерного антитела. Однако указанный подход может только устранять иммуногенность, вызванную Fc-областью нечеловеческого антитела, тогда как остальные нечеловеческие Fab-последовательности могут еще оставаться иммуногенными. При другом подходе гены иммуноглобулинов человека, как тяжелых, так и легких цепей иммуноглобулинов, вводили в геном мышей. Хотя указанный способ генетической инженерии в результате приводит к экспрессии полипептидов иммуноглобулинов человека в организме генетически сконструированных мышей, уровень экспрессии человеческих иммуноглобулинов достаточно низок. Это может быть следствием видоспецифических регуляторных элементов в локусах иммуноглобулинов, которые необходимы для эффективной экспрессии иммуноглобулинов. Как показано на трансфицированных линиях клеток, регуляторные элементы, имеющиеся в генах иммуноглобулинов человека, могут в организме животных, отличных от человека, функционировать неправильно. Описано несколько регуляторных элементов в генах иммуноглобулинов. Особенно важное значение имеют энхансеры, расположенные ниже (3') константных областей тяжелой цепи, и интронные энхансеры в генах легких цепей. Кроме того, в генах иммуноглобулинов могут присутствовать другие регуляторные элементы, которые еще предстоит идентифицировать. Исследования на мышах показали, что мембранный и цитоплазматический концевой участок мембранной формы молекул иммуноглобулинов играют важную роль в регуляции уровней экспрессии химерных антител мышь-человека в сыворотке мышей, гомозиготных по гену C1 человека. Поэтому для экспрессии гетерологичных генов иммуноглобулинов у животных желательно заменить последовательности, которые содержат энхансерные элементы и экзоны, кодирующие трансмембранный (экзон M1) и цитоплазматический концевой участок (экзон М 2), последовательностями, которые в норме встречаются у животных в сходных положениях. Введение генов иммуноглобулина человека в геном мышей приводило к экспрессии разнообразного спектра антител человека у мышей, полученных генно-инженерным путем. Как у мышей, так и у человека разнообразие антител создается в результате реаранжировки генов. Указанный процесс приводит к созданию множества различных рекомбинантных сегментов V(D)J, кодирующих большое количество молекул антител с разными антигенсвязывающими участками. Однако у других животных, подобных кроликам, свиньям, коровам и птицам, разнообразие антител создается во многом отличающимся механизмом, называемым конверсией генов. Например, хорошо установлено, что у кролика и курицы VDJреаранжировка очень ограничена (почти 90% иммуноглобулинов формируются с 3'-проксимальным элементом VH1), и разнообразие антител создается в результате конверсии генов и гипермутирования. Напротив, конверсия генов мыши и человека происходит очень редко, если вообще происходит. Поэтому предполагается, что у животных, у которых разнообразие антител образуется за счет конверсии генов,способ генетической инженерии, основанный на реаранжировке генов, приведет у животных к низкому титру антител и ограниченному разнообразию антител. Таким образом, генетическая инженерия на крупных животных с целью получения неиммуногенных препаратов антител для лечения человека требует альтернативной стратегии генетической инженерии.-1 013564 Литература, относящаяся к изобретению Обзор применения препаратов поликлональных антител для лечения отторжения трансплантата недавно опубликован N. Bonnefoy-Berard et al., J. Heart Lung Transplant 1996; 15 (5): 435-442; С. Colby et al.,Ann. Pharmacother. 1996; 30 (10): 1164-1174; M.J. Dugan et al., Ann. Hematol. 1997; 75 (1-2): 41-46. Применение терапии поликлональными антителами при аутоиммунных заболеваниях описано W. Cendrowski,Boll Ist. Sieroter Milan 1997; 58 (4): 339-343; L.K. Kastrukoff et al., Can. J. Neurol. Sci. 1978; 5 (2): 175-178;J.E. Walker et al., J. Neurol. Sci. 1976; 29 (2-4) : 303-309. Истощение жировых клеток с использованием препаратов антител описано L. De Clercq et al., J. Anim. Sci. 1997; 75 (7): 1791-1797; J.T. Wright et al.,Obes. Res. 1995; 3 (3): 265-272. Регуляторные элементы генов иммуноглобулинов описаны Bradley et al. (1999), Transcriptional enhancers and the evolution of the IgH locus; Lauster, R. et al., Embo J. 12: 4615-23 (1993); Volgina et al., J. Immunol. 165: 6400 (2000); Hole et al., J. Immunol 146: 4377 (1991). Увеличение разнообразия антител в результате конверсии генов у курицы и кролика описано Bucchini et al., Nature 32 6: 409-11 (1987); Knight et al., Advances in Immunology 56: 179-218 (1994); Langmanet al., Res. Immunol. 144: 422-46 (1993). Создание мышей, экспрессирующих химерные антитела мышичеловека, описано Pluschke et al., Journal of Immunological Methods 215: 27-37 (1998). Создание мышей,экспрессирующих химерные антитела человека-мыши с мембранными и цитоплазматическими концевыми сегментами, полученными из антитела мыши, описано Zou et al., Science 262: 1271-1274 (1993); Zouet al. Curr. Biol. 4: 1099-1103. Создание мышей, экспрессирующих полипептиды иммуноглобулинов человека, описано Bruggemann et al. Curr. Opin. Biotechnol. 8 (4): 455-8 (1997); Lonberg et al. Int. Rev. Immunol. 13 (1): 65-93 (1995); Neuberger et al., Nature 338: 350-2 (1989). Создание трансгенных мышей с использованием клона ВАС описано Yang et al., Nat. Biotechnol. 15: 859-65 (1997). Создание трансгенных кроликов описано Fan, J. et al., Pathol. Int. 49: 583-94 (1999); Brem et al., Mol.Reprod. Dev. 44: 56-62 (1996). Клонирование кроликов на основе ядерного переноса описано Stice et al.,Biology of Reproduction 39: 657-664 (1988). Кролики с ослабленной экспрессией иммуноглобулинов описаны McCartney-Francis et al., Mol. Immunol. 24: 357-64 (1987); Allegrucci, et al., Eur. J. Immunol. 21: 411-7(1991). Получение трансгенной курицы описано Etches et al., Methods in Molecular Biology 62: 433-450; Painal., Adv. Exp. Med. Biol. 1977; 88 (2): 197-205. Клонирование животных из клеток описано Т. Wakayama et al., Nature 1998; 394: 369-374; J. В. Cibelli et al., Science 280: 1256-1258 (1998); J.B. Cibelli et al., Nature Biotechnology 1998; 16: 642-646; A. E.Schnieke et al., Science 278: 2130-2133 (1997); К. Н. Campbell et al., Nature 380: 64-66 (1996). Получение антител из трансгенных животных описано в патентах США No. 5814318, No. 5545807 иNo. 5570429. Примеры гомологичной рекомбинации для получения химерных хозяев-млекопитающих приведены в патенте США No. 5416260. Способ введения ДНК в эмбрион описан в патенте США No. 5567607. Поддержание и размножение эмбриональных стволовых клеток описано в патенте США No. 5453357. Обзор механизмов, вовлеченных в формирование разнообразия спектра антител у свиней, овец и коров, приведен в Butler, J. Е. (1998), Immunoglobulin diversity, B-cell and antibody repertoire developmentin large farm animals, Rev. Sci. Tech. 17: 43. Формирование разнообразия антител у овец описано в(1996), The sheep Ig variable region repertoire consists of a single VH family, J. Immunol. 156: 2163. Сущность изобретения Один вариант данного изобретения относится к гуманизированным антителам (гуманизированным иммуноглобулинам), содержащим по меньшей мере часть полипептидной последовательности иммуноглобулина человека. При этом антитело, которое обладает способностью связываться с антигеном, содержит по меньшей мере часть константной (С) области тяжелой цепи иммуноглобулина человека и аминокислотные последовательности варибельной области, кодируемые более чем одним вариабельным (V) сегментом гена иммуноглобулина, продуцируемая с использованием отличного от человека трансгенного животного,содержащая гуманизированный локус Ig, где указанный гуманизированный Ig-локус получен из Igлокуса отличного от человека трансгенного животного и содержит множество сегментов гена Ig, где по меньшей мере один из указанных сегментов гена является сегментом гена Ig человека, где указанные сегменты сближены друг с другом в нереаранжированной, частично реаранжированной или полностью реаранжированной конфигурации, и где указанный гуманизированный Ig-локус обладает способностью подвергаться конверсии генов и продуцировать репертуар гуманизированных иммуноглобулинов в орга-2 013564 низме отличного от человека трансгенного животного. Гуманизированные антитела согласно данному изобретению получают из трансгенных животных,отличных от человека, созданных генно-инженерным способом так, что они содержат один или более локусов гуманизированных Ig. Предпочтительно гуманизированные антитела согласно данному изобретению получают из трансгенных животных, отличных от человека, у которых разнообразие антител главным образом образуется в результате конверсии и гипермутирования генов, например, кролика, свиньи, курицы, овцы, коровы и лошади. Антитела можно получить посредством иммунизации трансгенных животных требуемым антигеном, таким как инфекционный агент (например, бактерии или вирусы) или их части или фрагменты. Такие гуманизированные антитела обладают пониженной иммуногенностью у приматов, в частности у человека, по сравнению с негуманизированными антителами, полученными от животных, отличных от человека. Поэтому гуманизированные антитела согласно данному изобретению подходят для применения в терапевтическом лечении людей. Другой вариант данного изобретения относится к препарату гуманизированных антител, которые могут быть моноклональными антителами или поликлональными антителами. Предпочтительные препараты антител согласно данному изобретению являются препаратами поликлональных антител, которые согласно данному изобретению обладают минимальной иммуногенностью по отношению к приматам,особенно человеку. Предпочтительный препарат поликлональных антител состоит из гуманизированных молекул иммуноглобулина, имеющих, по меньшей мере, полипептидную последовательность константной области тяжелой цепи или легкой цепи, кодируемую сегментом гена константной области человека. Более предпочтительно вариабельные домены тяжелых цепей или легких цепей молекул иммуноглобулинов также кодируются сегментами генов человека. В другом варианте данное изобретении относится к фармацевтическим композициям, которые включают препарат гуманизированных антител и фармацевтически приемлемый носитель. Один гуманизированный локус Ig, представленный в изобретении, является гуманизированным локусом тяжелой цепи, который включает в себя один или более сегментов гена V, один или более сегментов гена D, один или более сегментов гена J и один или более сегментов гена константной области, при этом по меньшей мере один сегмент гена является сегментом гена тяжелой цепи человека. Сегменты генов в гуманизированном локусе тяжелой цепи размещены по отношению друг к другу в нереаранжированной или частично или полностью реаранжированной конфигурации. Предпочтительный локус гуманизированной тяжелой цепи содержит сегмент гена константной области человека, предпочтительно С или С. Более предпочтительный гуманизированный локус содержит множественные сегменты гена V и по меньшей мере один сегмент гена V человека наряду с участком константной области тяжелой цепи человека. Сегмент гена V человека помещен ниже нечеловеческих сегментов гена V. Другой гуманизированный локус Ig представляет собой гуманизированный локус легкой цепи, который включает в себя один или более сегментов гена V, один или более сегментов гена J и один или более сегментов гена константной области, при этом по меньшей мере один сегмент гена является сегментом гена легкой цепи человека. Сегменты гена в локусе гуманизированной легкой цепи расположены по отношению к друг другу либо в нереаранжированной, либо в реаранжированной конфигурации. Предпочтительный локус гуманизированной легкой цепи содержит сегмент гена константной области человека, предпочтительно С или С. Более предпочтительно, локус гуманизированной легкой цепи, кроме того, содержит множественные сегменты гена V и по меньшей мере один сегмент гена V человека. Сегмент гена V человека помещен ниже сегментов нечеловеческого гена V. Еще более предпочтительно,локус гуманизированной легкой цепи включает в себя реаранжированный сегмент VJ человека, помещенный ниже ряда генных сегментов VL (например, 10-100) либо нечеловеческого, либо человеческого происхождения. Краткое описание чертежей Фиг. 1. 3'-Фланкирующие последовательности С коровы. Праймеры показаны в заштрихованных прямоугольниках. 5'-праймер находится в СН 3, и 3'-праймер находится в M1. Последовательности клона 11, клона 3 и клона 5 указаны в SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 и SEQ ID NO: 5 соответственно. Фиг. 2. 3'-Фланкирующие последовательности С овцы. Праймеры показаны в заштрихованных прямоугольниках. 5'-праймер находится в СН 3, и 3'-праймер находится в М 2. Последовательности клона 11 и клона 1 указаны в SEQ ID NO: 8 и SEQ ID NO: 9 соответственно. Фиг. 3. Новая 3'-фланкирующая последовательность (SEQ ID NO: 10) гена С-гамма кролика. Фиг. 4. Новая нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO: 11) 3'-конца гена С-каппа-1 кролика. Фиг. 5. Новые нуклеотидные последовательности (SEQ ID NO: 12 и SEQ ID NO: 13) 5'-конца гена С-гамма кролика. Последовательности между SEQ ID NO: 12 и SEQ ID NO: 13 (пробел длиной примерно 1000 нуклеотидов) еще предстоит определить. Фиг. 6. Сравнение последовательностей человека, мыши, кролика, овцы, коровы и верблюда в M1 и М 2-участках 3'-конца гена С-гамма.-3 013564 Фиг. 7 а. Конструкция ДНК для замены С кролика на С человека. Фрагмент длиной 0,5 т.п.н., содержащий последовательность ДНК, кодирующую С человека, фланкирован последовательностями гена С 1 кролика. Верхняя последовательность (5'С) составляет 2,8 т.п.н., нижняя последовательность (3'С) составляет 2,6 т.п.н. Вектор также содержит кассету lox-neo для позитивной селекции и кассету Hsv-Tk для негативной селекции. Фиг. 7b. Конструкция ДНК для замены С кролика на C1 человека. Фрагмент длиной 1,8 т.п.н., содержащий последовательность ДНК, кодирующую C1 человека, фланкирован последовательностями гена С кролика. Верхняя последовательность (5'С) составляет 1,9 т.п.н., нижняя последовательность (3'С) составляет 3,1 т.п.н. Вектор также содержит кассету lox-neo для позитивной селекции и кассету Hsv-Tk для негативной селекции. Масштаб фигуры не выдержан. Фиг. 8. Фрагмент ДНК (SEQ ID NO: 51), содержащий сегмент гена C1 тяжелой цепи иммуноглобулина человека, фланкированный 50 нуклеотидами, полученными из фланкирующих участков гена С кролика. Фланкирующие последовательности, полученные из фланкирующих участков гена С кролика,подчеркнуты. Фиг. 9. Фрагмент ДНК (SEQ ID NO: 52), содержащий сегмент гена V, последовательность которого более чем на 80% идентична V-элементам кролика, и кодирующий полипептидную последовательностьV-элемента человека. Фланкирующие последовательности, полученные из фланкирующих участков генов VH1 и J кролика, подчеркнуты. Фиг. 10. Фрагмент ДНК (SEQ ID NO: 53), содержащий сегмент гена С тяжелой цепи иммуноглобулина человека, фланкированный 50 нуклеотидами, полученными из гена легкой цепи иммуноглобулина кролика каппа-1. Фланкирующие последовательности, полученные из фланкирующих участков гена С кролика, подчеркнуты. Фиг. 11. Фрагмент ДНК (SEQ ID NO: 54), содержащий сегмент гена V, последовательность которого более чем на 80% идентична V-элементам кролика, и кодирующий полипептидную последовательность V-элемента человека. Фланкирующие последовательности, полученные из фланкирующих участков генов V и J кролика, подчеркнуты. Фиг. 12. Фрагмент ДНК (SEQ ID NO: 57), содержащий ген, кодирующий константную область легкой цепи иммуноглобулина человека С-лямбда-2, фланкированный 50 нуклеотидами (подчеркнуты), полученными из фланкирующих последовательностей гена С-лямбда курицы. Фиг. 13. Модификация локуса легкой цепи курицы с использованием системы ЕТ. Геномный ВАСклон курицы с полноразмерным локусом легкой цепи модифицировали посредством гомологичной рекомбинации. На первой стадии С делетировали в результате инсерции кассеты для селекции, которую на второй стадии гомологичной рекомбинации заменяли на ген С человека. Фиг. 14. Фрагмент ДНК (SEQ ID NO: 58), содержащий сегмент гена VJ, последовательность которого на 80% идентична сегментам гена V курицы, и кодирующий полипептид VJ иммуноглобулина человека. Фланкирующие последовательности, полученные из фланкирующих участков генов V и J иммуноглобулина курицы, подчеркнуты. Фиг. 15. Модифицированный локус легкой цепи курицы. Подробное описание изобретения Один вариант данного изобретения относится к гуманизированным иммуноглобулинам (антителам). Под гуманизированным антителом или гуманизированным иммуноглобулином подразумевается молекула иммуноглобулина, имеющая по меньшей мере часть полипептидной последовательности иммуноглобулина человека (или полипептидной последовательности, кодируемой сегментом гена Ig человека). Молекулы гуманизированных иммуноглобулинов согласно данному изобретению можно выделить из трансгенных животных, отличных от человека, полученных генно-инженерным способом, так,что они продуцируют молекулы гуманизированных иммуноглобулинов. Такие гуманизированные молекулы иммуноглобулинов менее иммуногены по отношению к приматам, в частности к человеку, по сравнению с негуманизированными молекулами иммуноглобулинов, выделенными от животного, или выделенными из клеток, полученных от животного. Термин животные, отличные от человека в используемом в данном описании смысле включает в себя, но не ограничен указанным, кроликов, свиней, птиц (например, куриц, индеек, уток, гусей и тому подобных), овец, коз, коров и лошадей. Предпочтительными животными, отличными от человека, являются такие животные, у которых формирование разнообразия антител главным образом основано на конверсии генов и/или соматическом гипермутировании, например кролик, свиньи, птицы (например,курица, индейка, утка, гусь и тому подобные), овца, коза и корова. Особенно предпочтительными животными, отличными от человека, являются кролик и курица. У таких животных, как человек и мышь, имеется множество копий сегментов гена V, D и J в локусе тяжелой цепи и множество копий сегментов гена V и J в локусе легкой цепи. Разнообразие антител у указанных животных главным образом формируется в результате реаранжировки генов, т.е. различных комбинаций сегментов гена с образованием реаранжированной вариабельной области тяжелой цепи и-4 013564 вариабельной области легкой цепи. Однако у других животных (например, у кролика, курицы, овцы, козы и коровы) реаранжировка генов не играет значительной роли в создании разнообразия антител. Например, у кролика только очень ограниченное количество сегментов гена V, чаще всего сегменты гена V на 3'-конце V-области, используются в реаранжировке генов с образованием непрерывного участка VDJ. У курицы только один сегмент гена V (участок, прилежащий к D-области или 3'-проксимальный сегмент гена V), один D-сегмент и один J-сегмент используются при реаранжировке тяжелой цепи; и только один сегмент гена V (3'-проксимальный сегмент V) и один сегмент J используются при реаранжировке легкой цепи. Таким образом, у указанных животных существует небольшое разнообразие исходно реаранжированных последовательностей вариабельных областей, возникающих при формировании разнообразия воссоединением. Дальнейшее формирование разнообразия реаранжированных генов Ig достигается посредством конверсии генов, процесса, при котором короткие последовательности, полученные из расположенных выше сегментов гена V, заменяют короткие последовательности внутри сегмента генаV в реаранжированном гене Ig. Термин сегмент гена Ig в используемом в данном описании смысле относится к участкам ДНК,кодирующим различные части молекулы Ig, которые присутствуют в зародышевой линии животных и человека, и которые сходятся вместе в В-клетках, образуя реаранжированные гены Ig. Таким образом,сегменты гена Ig в используемом в данном описании смысле включают в себя сегменты генов V, сегменты генов D, сегменты генов J и генные сегменты С-области. Термин сегмент гена Ig человека в используемом в данном описании смысле включает в себя как последовательности сегмента гена Ig человека природного происхождения, так и вырожденные формы последовательностей сегмента гена Ig человека природного происхождения, а также синтетические последовательности, которые кодируют полипептидную последовательность, в значительной степени идентичную полипептиду, кодируемому последовательностью сегмента гена Ig человека природного происхождения. В значительной степени означает, что степень идентичности аминокислотных последовательностей составляет по меньшей мере примерно 85-95%. Предпочтительная молекула гуманизированного иммуноглобулина согласно данному изобретению содержит по меньшей мере часть полипептидной последовательности константной области тяжелой или легкой цепи человека. Более предпочтительно молекула иммуноглобулина содержит по меньшей мере часть полипептидной последовательности константной области тяжелой или легкой цепи человека и по меньшей мере часть полипептидной последовательности вариабельного домена человека. В другом варианте данное изобретение относится к препарату гуманизированных антител. Термин препарат гуманизированных антител означает продукт, представленный выделенным антителом, или продукт, представленный очищенным антителом, полученный из трансгенного животного,отличного от человека (например, из сыворотки, молока или яичного желтка животного) или из клеток,полученных из трансгенного животного, отличного от человека (например, В-клетки или клетки гибридомы). Препарат гуманизированного антитела может быть препаратом поликлональных антител, который включает в себя спектр гуманизированных молекул иммуноглобулина. Препарат гуманизированных антител также может представлять собой препарат моноклонального антитела. Хотя иммуногенность препарата гуманизированного моноклонального антитела по отношению к человеку также снижена по сравнению с препаратом негуманизированного моноклонального антитела,препараты гуманизированных поликлональных антител являются предпочтительными вариантами данного изобретения. Выяснено, что гуманизированные моноклональные антитела еще вызывают некоторую степень иммунного ответа (антиидиотипический ответ) у приматов (например, человека) при многократном введении в больших количествах вследствие уникального и нового идиотипа моноклонального антитела. Авторы данного изобретения однозначно показали, что общая иммуногенность поликлональных антител менее зависима от антиидиотипического ответа. Например, поликлональные антитела, полученные от животных, отличных от человека, в которых гуманизированы только элементы константной области (например, поликлональные антитела, имеющие константные области, кодируемые сегментами гена человека, и имеющие вариабельные домены, кодируемые эндогенными генами животного, отличного от человека), по существу, не иммуногены у приматов. Без намерения связать с какой-либо теорией, авторы данного изобретения предположили, что сниженная иммуногенность такого препарата гуманизированных поликлональных антител является следствием того факта, что препарат содержит очень большое количество различных антител, с большим количеством разных идиотипов, которые в большой степени определяются новыми аминокислотными последовательностями в гипервариабельных областях (CDR) тяжелой и легкой цепи. Поэтому при введении такого препарата примату, такому как человек, введенное количество каждой отдельной молекулы иммуноглобулина в препарате может быть слишком мало, чтобы вызвать иммунный ответ против каждой молекулы иммуноглобулина. Таким образом, препарат гуманизированных поликлональных антител, который имеет много разных идиотипов и вариабельных областей, обладает минимальной иммуногенностью по отношению к реципиенту, даже если все антитела в препарате поликлональных антител направлены к одному и тому же антигену. Чтобы далее снизить какую-либо потенциальную остаточную имму-5 013564 ногенность, можно получить препарат гуманизированных поликлональных антител, который состоит из молекул иммуноглобулина, имеющих как вариабельные домены, так и константные области, кодируемые сегментами гена Ig человека. В предпочтительном варианте данное изобретение относится к препарату антитела, который включает в себя гуманизированные молекулы иммуноглобулинов, имеющие по меньшей мере часть полипептидной последовательности константной области тяжелой или легкой цепи человека. Более предпочтительно, гуманизированные иммуноглобулины в препарате антител согласно данному изобретению дополнительно содержат по меньшей мере часть полипептидной последовательности вариабельного домена человека в дополнение по меньшей мере к части полипептидной последовательности константной области человека. Предпочтительные препараты гуманизированных антител согласно данному изобретению состоят из гуманизированных антител, полученных от трансгенных животных, отличных от человека, разнообразие антител которых главным образом формируется в результате конверсии генов, таких как кролик,птицы (например, курица, индейка, утка, гусь и тому подобные), овца, коза и корова; предпочтительно кролик и курица. После получения трансгенного животного, отличного от человека, способного продуцировать разнообразные гуманизированные молекулы иммуноглобулинов (как, кроме того, указано далее) гуманизированные иммуноглобулины и препараты гуманизированных антител против антигена легко можно получить посредством иммунизации животного антигеном. Для иммунизации трансгенного животногохозяина можно использовать множество антигенов. Такие антигены включают микроорганизм, например, вирусы и одноклеточные организмы (такие как бактерии и грибы), живые, аттенуированные или мертвые, фрагменты микроорганизмов или антигенные молекулы, выделенные из микроорганизмов. Предпочтительные бактериальные антигены для применения при иммунизации животного включают очищенные антигены Staphylococcus aureus, такие как капсульные полисахариды типа 5 и 8, рекомбинантные версии факторов вирулентности, таких как альфа-токсин, белки, связывающие адгезии, белки,связывающие коллаген, и белки, связывающие фибронектин. Предпочтительные бактериальные антигены также включают аттенуированный вариант S. aureus, Pseudomonas aeruginosa, энтерококк, энтеробактерию и Klebsiella pneumoniae, или надосадок культуры клеток указанных бактерий. Другие бактериальные антигены, которые можно использовать для иммунизации, включают очищенный липополисахарид(ЛПС), капсульные антигены, капсульные полисахариды и/или рекомбинантные варианты белков наружной мембраны, белки, связывающие фибронектин, эндотоксин и экзотоксин Pseudomonas aeruginosa,энтерококк, энтеробактерию и Klebsiella pneumoniae. Предпочтительные антигены для создания антител против грибов включают аттенуированные варианты грибов или белков их наружной мембраны, и указанные грибы включают, но не ограничены указанным, Candida albicans, Candida parapsilosis, Candida tropicalis и Cryptococcus neoformans. Предпочтительные антигены для применения при иммунизации для того, чтобы получить антитела против вирусов, включают белки оболочки и аттенуированные варианты вирусов, которые включают, но не ограничены указанным, респираторно-синцитиальный вирус (RSV) (в частности, F-белок), вирус гепатита С (HCV), вирус гепатита В (HBV), цитомегаловирус (CMV), EBV и HSV. Терапевтические антитела для лечения рака можно получить иммунизацией трансгенных животных выделенными клетками опухоли или линиями опухолевых клеток; ассоциированными с опухолями антигенами, которые включают, но не ограничены указанным, антиген Her-2-neu (антитела против которого применимы для лечения рака молочной железы); антигены CD20, CD22 и CD53 (антитела против которых применимы для лечения В-клеточных лимфом), (3) специфичный для простаты мембранный антиген(PMSA) (антитела против которого применимы для лечения рака простаты) и молекула 17-1 А (антитела против которой применимы для лечения рака толстой кишки). Антигены можно вводить трансгенному животному-хозяину любым обычным способом с адъювантом или без него и можно вводить согласно назначаемой схеме. После иммунизации сыворотку или молоко иммунизированных трансгенных животных можно фракционировать для очистки поликлональных антител, специфичных по отношению к антигену до фармацевтической степени очистки. В случае трансгенных птиц антитела также можно получить фракционированием яичных желтков. Концентрированную очищенную иммуноглобулиновую фракцию можно получить хроматографией (аффинной, ионообменной, гель-фильтрацией и т.д.), избирательным осаждением солями, такими как сульфат аммония, органическими растворителями, такими как этанол или полимерами, такими как полиэтиленгликоль. Для получения моноклональных антител выделяют клетки селезенки от иммунизированного трансгенного животного и используют либо в слиянии клеток с трансформированными линиями клеток для получения гибридом, либо кДНК, кодирующую антитела, клонируют стандартными способами молекулярной биологии и экспрессируют в трансфецированных клетках. Методики получения моноклональных антител хорошо разработаны в данной области. См., например, Европейскую патентную заявку 0583980 А 1 (Method For Generating Monoclonal Antibodies From Rabbits), патент США No. 4977081 (StableMethod of Use Thereof) и ЕР 0491057 Bl (Hybridoma Which Produces Avian Specific Immunoglobulin G),описания которых включены в данную заявку в виде ссылки. Продукция моноклональных антител invitro на основе клонированных молекул кДНК описана Andris-Widhopf et al., Methods for the generationof chicken monoclonal antibody fragments by phage display, J. Immunol. Methods 242: 159 (2000) и Burton,D. R., Phage display, Immunotechnology 1: 87 (1995), описания которых включены в данную заявку в виде ссылки. В следующем варианте данного изобретения очищенные моноклональные или поликлональные антитела смешивают с соответствующим фармацевтическим носителем, пригодным для введения приматам, в частности человеку, чтобы получить фармацевтические композиции. Фармацевтически приемлемыми носителями, которые можно использовать в данных фармацевтических композициях, могут быть любые и все растворители, дисперсионные среды, изотоничные агенты и тому подобное. За исключением случаев, когда любые обычные среды, агент, разбавитель или носитель вредят реципиенту или терапевтической эффективности находящихся в них антител, их применение в фармацевтических композициях согласно данному изобретению приемлемо. Носителем могут быть жидкие, полутвердые, например,пасты, или твердые носители. Примеры носителей включают масла, воду, физиологические растворы,спирт, сахар, гель, липиды, липосомы, смолы, пористые основы, связывающие вещества, наполнители,покрытия, консерванты и тому подобное, или их комбинации. Данное изобретение, кроме того, относится к новым нуклеотидным последовательностям и векторам, а также к применению последовательностей и векторов для получения трансгенного животного,отличного от человека, которое продуцирует гуманизированные иммуноглобулины. В общем, генетическая инженерия животного, отличного от человека, заключается в интеграции одного или более сегментов гена Ig в геном животного, чтобы создать один или более гуманизированных локусов Ig. Следует заметить, что в зависимости от подхода, используемого в генетической модификации, сегмент гена Ig человека можно интегрировать в эндогенный локус Ig животного (например, в результате направленной инсерции) или в другой локус животного. Другими словами, гуманизированный локус Ig может находиться в положении хромосомы, в котором обычно находится эндогенный локус Ig животного, или в положении хромосомы, отличном от положения, в котором обычно находится эндогенный локус Ig животного. Независимо от хромосомного положения гуманизированный локус Ig согласно данному изобретению обладает способностью подвергаться реаранжировке генов и конверсии генов у животного, отличного от человека, тем самым, продуцируя разнообразный спектр гуманизированных молекул иммуноглобулинов. Локус Ig, обладающий способностью подвергаться реаранжировке генов и конверсии генов, в данном описании также называется функциональным локусом Ig, и антитела в случае разнообразия, создаваемого функциональным локусом Ig, также называются в данном описании функциональными антителами или функциональным спектром антител. В одном варианте данное изобретение относится к новым последовательностям, применимым для создания гуманизированного локуса Ig и получения трансгенных животных, способных продуцировать гуманизированные молекулы иммуноглобулинов. В частности, данное изобретение относится к последовательностям из 5'- и 3'-фланкирующих участков сегментов гена Ig животного, отличного от человека,предпочтительно животного, создание разнообразия антител которого главным образом основано на конверсии генов (например, кролика, свиньи, овцы, козы, коровы, птиц, таких как курица, индейка, утка,гусь и тому подобные). 5'- и 3'-фланкирующие участки генов, кодирующих константную область, являются особенно важными, так как указанные последовательности содержат нетранслируемые регуляторные элементы (например, энхансеры), необходимые для высокой экспрессии Ig в сыворотке. 3'-Фланкирующий участок генов, кодирующих константную область тяжелой цепи, также содержит экзоны, кодирующие мембранный и цитоплазматический концевой участок мембранной формы иммуноглобулина (Volgina et al. J. Immunol. 165: 6400, 2000). Ранее было установлено, что мембранный и цитоплазматический концевой участок мембранной формы антител необходимы для достижения высокого уровня экспрессии антител в сыворотке мышей (Zou et al., Science 262: 1271, 1993). Таким образом, идентификация фланкирующих последовательностей позволяет осуществлять замену экзонов и промежуточных интронов гена С человеческим эквивалентом и сохранять эндогенные экзоны, кодирующие трансмембранную и цитоплазматическую концевую области, а также эндогенные некодирующие энхансерные последовательности. В одном варианте данное изобретение относится к 3'-фланкирующим последовательностям константных областей тяжелой цепи животных, отличных от человека. Более конкретно, представлены нуклеотидные последовательности ниже (3', 3-штрих) генов, кодирующих С кролика, С 1,2,3 коровы и С 1,2 овцы. Особенно предпочтительные нуклеотидные последовательности включают SEQ ID NO: 10(3' С кролика), SEQ ID NO: 3-5 (3' C1,2,3 коровы) и SEQ ID NO: 8-9 (3' C1,2 овцы). В другом варианте данное изобретение относится к 3'-фланкирующим последовательностям константных областей легкой цепи животных, отличных от человека. Более конкретно, данное изобретение относится к нуклеотидным последовательностям ниже (3', 3-штрих) генов, кодирующих С у кроликов. Особенно предпочтительные нуклеотидные последовательности включают SEQ ID NO: 11 (3' С кроли-7 013564 ка). В еще одном варианте данное изобретение относится к 5'-фланкирующим последовательностям константных областей тяжелой цепи животных, отличных от человека. Более конкретно, представлены нуклеотидные последовательности выше (5', 5-штрих) гена С кролика. Особенно предпочтительные последовательности включают SEQ ID NO: 12 и SEQ ID NO: 13. Другой вариант данного изобретения относится к 5'-фланкирующим последовательностям константных областей легкой цепи животных, отличных от человека. Данное изобретение относится к частям указанных выше новых фланкирующих последовательностей. Часть означает фрагмент фланкирующей нуклеотидной последовательности, способный опосредовать гомологичную рекомбинацию между сегментом гена Ig человека и сегментом гена Ig животногомишени. В общем, часть составляет по меньшей мере примерно 200 пар оснований, предпочтительно по меньшей мере примерно 400 пар оснований в случае рекомбинации в таких клетках животных, как клетки ES или фибробласты, и по меньшей мере 40 пар оснований, предпочтительно по меньшей мере 50 пар оснований в случае рекомбинации в Е. coli. Примеры частей указанных выше новых фланкирующих последовательностей включают SEQ ID NO: 5 9-60, 61-62, 63-64, 65-66, 67-68 и 69-70 (представленные подчеркнутыми последовательностями на фиг. 8-12 и 14, соответственно). В следующем аспекте данное изобретение относится к векторам, пригодным для замены сегмента гена Ig животного, отличного от человека, соответствующим сегментом гена Ig человека. Указанные векторы, также называемые в данном описании рекомбинантными векторами, включают сегмент генаIg человека, который связан с фланкирующими последовательностями на 5'-конце и 3'-конце, при этом степень гомологии фланкирующих последовательностей с фланкирующими последовательностями сегмента гена Ig животного-мишени достаточна для опосредования гомологичной рекомбинации между сегментами гена человека и гена животного. Как правило, по меньшей мере, примерно 200 оснований должны быть идентичными во фланкирующих областях в рекомбинантном векторе и фланкирующих областях гена-мишени для достижения эффективной гомологичной рекомбинации в клетках животных,таких как клетки ES и фибробласты; и по меньшей мере примерно 40 оснований должны быть идентичными для достижения эффективной гомологичной рекомбинации в Е. coli. Представлены рекомбинантные векторы, пригодные для замены генов константных областей тяжелой цепи иммуноглобулина животного, которые содержат от 5'- к 3'-концу нуклеотидную последовательность, гомологичную 5'-фланкирующему участку гена константной области тяжелой цепи животного-мишени, ген константной области тяжелой цепи человека (например, C1 человека) и нуклеотидную последовательность, гомологичную 3'-фланкирующему участку гена константной области тяжелой цепи животного-мишени. Представлены предпочтительные рекомбинантные векторы для замены генов константных областей тяжелой цепи кролика. Один такой вектор содержит в направлении 5'3', нуклеотидную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 12 или SEQ ID NO: 13, или их часть, сегмент гена константной области тяжелой цепи человека, нуклеотидную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 10, или часть SEQ ID NO: 10. Другой такой вектор содержит SEQ ID NO: 51 (фиг. 8), которая характеризуется тем, что содержит ген C1 человека, связанный с фланкирующими последовательностями из 5'- и 3'фланкирующих участков гена константной области тяжелой цепи кролика. Также представлены рекомбинантные векторы, которые применимы для замены генов константных областей легкой цепи иммуноглобулина животного. Такие векторы содержат в направлении 5'3' нуклеотидную последовательность, гомологичную 5'-фланкирующему участку гена константной области легкой цепи мишени, ген константной области легкой цепи человека (например, С или С человека) и нуклеотидную последовательность, гомологичную 3'-фланкирующему участку гена константной области легкой цепи мишени. Предпочтительные векторы включают векторы для замены генов константных областей легкой цепи кролика. Предпочтительный вектор содержит нуклеотидную последовательность, указанную в SEQID NO: 53, и указанная последовательность характеризуется тем, что содержит ген С человека, связанный с фланкирующими последовательностями из 5'- и 3'-фланкирующих участков гена С 1 легкой цепи кролика. Другие представленные рекомбинантные векторы включают векторы, применимые для замены элементов V-области Ig животного. Например, представлен рекомбинантный вектор, применимый для замены элемента V-области тяжелой цепи кролика, который содержит SEQ ID NO: 52. Представлен рекомбинантный вектор, применимый для замены элемента V-области легкой цепи кролика, который содержитSEQ ID NO: 54. Рекомбинантные векторы согласно данному изобретению могут включать дополнительные последовательности, которые облегчают селекцию клеток, которые успешно претерпели событие рекомбинации. Например, маркерные гены, кодирующие устойчивость к неомицину, блеомицину, пуромицину и тому подобному, можно включить в рекомбинантные векторы, чтобы облегчить селекцию клеток, которые успешно претерпели событие рекомбинации.-8 013564 В следующем аспекте данное изобретение относится к трансгенным конструкциям или векторам,несущим один или более гуманизированных локусов Ig. В одном варианте данное изобретение относится к трансгенным конструкциям, содержащим гуманизированный локус тяжелой цепи Ig, который включает один или более сегментов гена V, один или более сегментов гена D, один или более сегментов гена J и один или более сегментов гена константной области, при этом по меньшей мере один сегмент гена представляет собой сегмент гена тяжелой цепи человека. Сегменты генов в таком гуманизированном локусе тяжелой цепи расположены по отношению друг к другу в нереаранжированной конфигурации (или конфигурации гаметического типа) или в частично или полностью реаранжированной конфигурации. Гуманизированный локус тяжелой цепи обладает способностью подвергаться реаранжировке генов (если сегменты генов не полностью реаранжированы) и конверсии генов у животного, отличного от человека, продуцируя при этом разнообразный спектр тяжелых цепей, имеющих полипептидные последовательности человека, или гуманизированных тяжелых цепей. В предпочтительном варианте гуманизированный локус тяжелой цепи содержит, по меньшей мере,сегмент гена С-области, который является сегментом гена константной области человека, предпочтительно С или С (включая любые подклассы С 1, 2, 3 и 4). В другом более предпочтительном варианте гуманизированный локус тяжелой цепи трансгена содержит гуманизированную V-область и гуманизированную С-область, т.е., V-область, имеющую по меньшей мере один сегмент гена VH человека, и С-область, имеющую по меньшей мере один сегмент гена С человека (например, С или С человека). Предпочтительно гуманизированная V-область содержит по меньшей мере примерно 10-100 сегментов гена V тяжелой цепи (или VH), по меньшей мере один из которых является сегментом гена VH человека. Согласно данному изобретению сегмент гена VH человека, включенный в трансген, обладает по меньшей мере примерно 75-85% гомологией с участками гена VH животного-хозяина, в частности, с участками гена VH животного, включенными в вышерасположенный участок трансгена. Как описано выше, участок VH человека охватывает последовательности сегмента гена VH человека природного происхождения, вырожденные формы последовательностей сегмента гена VH человека природного происхождения, а также синтетические последовательности, которые кодируют полипептидную последовательность в значительной степени (т.е. по меньшей мере примерно на 85-95%) идентичную полипептидуV-домена тяжелой цепи человека. Предпочтительно сегмент(ы) гена VH человека помещают ниже нечеловеческих сегментов VH в трансгенном локусе. Предпочтительно нечеловеческие сегменты гена VH в трансгене представляют собой сегменты гена VH из 3'-VH-области в локусе Ig животного-хозяина, включая 3'-проксимальный VH1. В другом варианте данное изобретение относится к трансгенным конструкциям, содержащим гуманизированный локус легкой цепи, способный претерпевать реаранжировку генов и конверсию генов у животного-хозяина, продуцируя при этом разнообразный спектр легких цепей, имеющих полипептидные последовательности человека, или гуманизированных легких цепей. Гуманизированный локус легкой цепи включает один или более сегментов гена V, один или более сегментов гена J и один или более сегментов гена константной области, при этом по меньшей мере один сегмент гена является сегментом гена легкой цепи человека. Сегменты гена в гуманизированном локусе легкой цепи расположены друг относительно друга в нереаранжированной конфигурации (или конфигурации гаметического типа) или в полностью реаранжированной конфигурации. В предпочтительном варианте гуманизированный локус легкой цепи содержит, по меньшей мере,сегмент гена С-области, который является сегментом гена константной области человека, предпочтительно С или С. В другом предпочтительном варианте гуманизированный локус легкой цепи трансгена содержит гуманизированную V-область и гуманизированную С-область, например V-область, имеющую по меньшей мере один ген VL человека и/или по меньшей мере один реаранжированный сегмент VJ человека, и С-область, имеющую по меньшей мере один сегмент гена С человека (например, С или С). Предпочтительно гуманизированная V-область включает, по меньшей мере, примерно 10-100 сегментов гена V легкой цепи (или VL), по меньшей мере один из которых является сегментом гена VL человека. Сегмент гена VL человека, включенный в трансген, проявляет по меньшей мере примерно 7585% гомологии с сегментами гена VL животного-хозяина, в частности сегментами гена VL животного,включенными в вышерасположенный участок трансгена. Соответственно сегмент VL человека охватывает последовательности сегмента гена VL человека природного происхождения, вырожденные формы последовательностей сегмента гена VL человека природного происхождения, а также синтетические последовательности, которые кодируют полипептидную последовательность, в значительной степени (т.е. по меньшей мере примерно на 85-95%) идентичную полипептиду домена V легкой цепи человека. Предпочтительно сегмент(ы) гена VL человека помещают ниже нечеловеческих сегментов VL в трансгенном локусе. Нечеловеческие сегменты гена VL в трансгенной конструкции выбраны из сегментов гена VL в 3'-VL-области локуса легкой цепи животного-хозяина, включая 3'-проксимальный VL1.-9 013564 В еще одном предпочтительном варианте гуманизированный локус легкой цепи включает реаранжированный сегмент VJ человека, помещенный ниже ряда (например, 10-100) сегментов гена VL либо нечеловеческого, либо человеческого происхождения. Другой аспект данного изобретения относится к способам получения трансгенного вектора, содержащего гуманизированный локус Ig. Такие способы заключаются в выделении локуса Ig или его части от животного, отличного от человека, и встраивании требуемого сегмента(ов) гена Ig человека в выделенный локус Ig животного или выделенную часть локуса Ig животного. Сегмент(ы) гена Ig человека встраивают в выделенный локус Ig животного или его часть посредством лигирования или гомологичной рекомбинации таким образом, при котором сохраняется способность локуса претерпевать эффективную реаранжировку генов и конверсию генов у животного, отличного от человека. Предпочтительно фрагменты ДНК, содержащие локус Ig, которые необходимо гуманизировать, выделяют из животных, у которых разнообразие антител формируется в результате конверсии генов, например, кролика или курицы. Такие большие фрагменты ДНК можно выделить посредством скрининга библиотеки на основе плазмид, космид, YAC или ВАС и тому подобных, полученных из геномной ДНК животного, отличного от человека. Полная С-область животного может находиться в одном плазмидном или космидном клоне, который затем подвергают гуманизации. Клоны YAC могут нести фрагменты ДНК длиной до 2 миллионов оснований, таким образом, полный локус тяжелой цепи животного или его большую часть можно выделить в одном клоне YAC или реконструировать так, чтобы он находился в одном клоне YAC. Клоны ВАС способны нести фрагменты ДНК меньших размеров (примерно 150-250 т.п.н.). Однако множество клонов ВАС, содержащих перекрывающиеся фрагменты локуса Ig, можно гуманизировать отдельно и затем вместе инъецировать в клетку животного-реципиента, при этом перекрывающиеся фрагменты рекомбинируют в клетке животного-реципиента с образованием непрерывного локуса Ig. Сегменты гена Ig человека можно интегрировать в локус Ig в векторе (например, клоне ВАС) множеством способов, включая лигирование фрагментов ДНК или инсерцию фрагментов ДНК с помощью гомологичной рекомбинации. Интеграцию сегментов гена Ig человека осуществляют таким образом,чтобы сегмент гена Ig человека функционально связать с последовательностью животного-хозяина в трансгене, чтобы получить функциональный гуманизированный локус Ig, т.е. локус Ig, способный к реаранжировке генов и конверсии генов, которые приводят к продукции разнообразного спектра гуманизированных антител. Предпочтительно сегменты гена Ig человека интегрируют в локус Ig гомологичной рекомбинацией. Гомологичную рекомбинацию можно выполнить в бактериях, дрожжевых и других клетках с высокой частотой событий гомологичной рекомбинации. Например, дрожжевую клетку трансформируют YAC,содержащей локус Ig животного или его большую часть. Затем такую дрожжевую клетку дополнительно трансформируют рекомбинантным вектором, который описан выше, который несет сегмент гена Ig человека, связанный с 5'-фланкирующей последовательностью и 3'-фланкирующей последовательностью. 5'и 3'-фланкирующие последовательности в рекомбинантном векторе гомологичны фланкирующим последовательностям сегмента гена Ig животного в YAC. В результате гомологичной рекомбинации сегмент гена Ig животного в YAC заменяют сегментом гена Ig человека. Альтернативно, бактериальную клетку,такую, как Е. coli, трансформируют ВАС, содержащей локус Ig животного или его большую часть. Такую бактериальную клетку дополнительно трансформируют рекомбинантным вектором, который несет сегмент гена Ig человека, связанный с 5'-фланкирующей последовательностью и 3'-фланкирующей последовательностью. 5'- и 3'-фланкирующие последовательности в рекомбинантном векторе опосредуют гомологичную рекомбинацию и обмен между сегментом гена Ig человека в рекомбинантном векторе и сегментом гена Ig животного в ВАС. Гуманизированные YAC и ВАС легко можно выделить из клеток и использовать для получения трансгенных животных. В следующем аспекте данное изобретение относится к способам получения трансгенных животных,способных продуцировать гуманизированные иммуноглобулины. Согласно данному изобретению трансгенное животное, способное продуцировать гуманизированные иммуноглобулины, получают введением в реципиентную клетку или клетки животного одного или более трансгенных векторов, описанных в данной заявке выше, которые несут гуманизированный локусIg, и получением животного из генетически модифицированной реципиентной клетки или клеток. Предпочтительно реципиентные клетки являются клетками животных, отличных от человека, которые образуют разнообразие антител посредством конверсии генов и гипермутирования, например, птиц(таких как курица), кроликов, коров и тому подобных. У таких животных для продуцирования иммуноглобулинов предпочтительно используется 3'-проксимальный сегмент гена V. Интеграция сегмента генаV человека в локус Ig в трансгенном векторе либо путем замены 3'-проксимального сегмента гена V животного, либо путем помещения в непосредственной близости к 3'-проксимальному сегменту гена V,приводит к экспрессии полипептидных последовательностей V-области человека в большинстве иммуноглобулинов. Альтернативно реаранжированный сегмент V(D)J человека можно встроить в локус J иммуноглобулинового локуса в трансгенном векторе. Трансгенные векторы, содержащие гуманизированный локус Ig, вводят в реципиентную клетку или- 10013564 клетки, и затем они интегрируют в геном реципиентной клетки или клеток в результате случайной интеграции или направленной интеграции. В случае случайной интеграции трансгенный вектор, содержащий гуманизированный локус Ig,можно ввести в реципиентную клетку животного стандартным трансгенным способом. Например, трансгенный вектор можно непосредственно инъецировать в пронуклеус оплодотворенного ооцита. Трансгенный вектор также можно вводить совместной инкубацией спермы с трансгенным вектором до оплодотворения ооцита. Из оплодотворенных ооцитов могут развиваться трансгенные животные. Другой способ введения трансгенного вектора состоит в трансфекции эмбриональных стволовых клеток и затем инъецировании генетически модифицированных эмбриональных стволовых клеток в развивающиеся эмбрионы. Альтернативно трансгенный вектор (голый или в комбинации с облегчающими введение реагентами) можно непосредственно инъецировать в развивающийся эмбрион. В конечном счете, химерных трансгенных животных получают из эмбрионов, которые содержат трансген гуманизированного Ig,интегрированный в геном, по меньшей мере, нескольких соматических клеток трансгенного животного. В предпочтительном варианте трансген, содержащий гуманизированный локус Ig, случайным образом интегрируют в геном реципиентных клеток (таких как оплодотворенный ооцит или развивающиеся эмбрионы), полученных из линий животных с нарушенной экспрессией эндогенных генов иммуноглобулина. Применение таких линий животных обеспечивает преимущественную экспрессию молекул иммуноглобулина из гуманизированного трансгенного локуса Ig. Примеры таких животных включают линии кроликов Alicia и Basilea, а также линию куриц агаммаглобулинемией. Альтернативно трангенных животных с гуманизированными трансгенами или локусами иммуноглобулинов можно скрестить с линиями животных с нарушенной экспрессией эндогенных иммуноглобулинов. Можно получить потомство,гомозиготное по нарушенному эндогенному локусу Ig и гуманизированному трансгенному локусу Ig. В случае направленной интеграции трансгенный вектор можно ввести в соответствующие реципиентные клетки животного, такие как эмбриональные стволовые клетки или уже дифференцированные соматические клетки. Затем клетки, в которых трансген был интегрирован в геном животного и заменил соответствующий эндогенный локус Ig посредством гомологичной рекомбинации, можно отобрать стандартными способами. Затем отобранные клетки можно слить с единичными клетками с удаленным ядром для ядерного переноса, например, ооцитами или эмбриональными стволовыми клетками, клетками, которые являются полипотентными и способны формировать функциональный организм новорожденного. Слияние выполняют согласно традиционным способам, которые хорошо разработаны. См., например, Cibelli et al., Science (1998) 280: 1256. Удаление ядер ооцитов и ядерный перенос также можно выполнять посредством микрохирургии с использованием инъекционных пипеток. (См., например, Wakayama et al., Nature (1998) 394: 369.). Затем полученные в результате яйцеклетки культивируют в соответствующей среде и переносят синхронизированным реципиентам для получения трансгенных животных. Альтернативно, отобранные генетически модифицированные клетки можно инъецировать в развивающиеся эмбрионы, затем развивающиеся в химерных животных. Кроме того, согласно данному изобретению трансгенное животное, способное продуцировать гуманизированные иммуноглобулины, также можно получить введением в реципиентную клетку или клетки одного или более рекомбинантных векторов, описанных в данной заявке выше, которые несут сегмент гена Ig человека, связанный с 5'- и 3'-фланкирующими последовательностями, которые гомологичны фланкирующим последовательностям сегмента эндогенного гена Ig, отбором клеток, в которых сегмент эндогенного гена Ig заменен сегментом гена Ig человека в результате гомологичной рекомбинации, и получением животного из отобранной генетически модифицированной реципиентной клетки или клеток. Подобно случаю с направленной инсерцией трансгенного вектора клетки, подходящие для применения реципиентных клеток в указанном способе, включают эмбриональные стволовые клетки или уже дифференцированные соматические клетки. Рекомбинантный вектор, несущий сегмент гена Ig человека,можно вводить в такие реципиентные клетки любыми подходящими способами, например трансфекцией. Затем клетки, в которых сегмент гена Ig человека заменил соответствующий сегмент эндогенного гена Ig в результате гомологичной рекомбинации, можно отобрать стандартными способами. Указанные генетически модифицированные клетки могут служить в качестве клеток-доноров ядер в процессе ядерного переноса при клонировании трансгенного животного. Альтернативно, отобранные генетически модифицированные эмбриональные стволовые клетки можно инъецировать в развивающиеся эмбрионы, которые затем могут развиться в химерных животных. Трансгенные животные, получаемые любым из указанных выше способов, составляют другой вариант данного изобретения. Трансгенные животные имеют по меньшей мере один, т.е. один или более, гуманизированных локусов Ig в геноме, из которых продуцируется функциональный спектр гуманизированных антител. В предпочтительном варианте данное изобретение относится к трансгенным кроликам, имеющим один или более гуманизированных локусов Ig в геноме. Трансгенные кролики согласно данному изобретению способны к реаранжировке и конверсии генов гуманизированных локусов Ig и экспрессии функционального спектра гуманизированных антител. В другом предпочтительном варианте данное изобретение относится к трансгенным курицам,- 11013564 имеющим один или более гуманизированных локусов Ig в геноме. Трансгенные курицы согласно данному изобретению способны к реаранжировке и конверсии генов гуманизированных локусов Ig и экспрессии функционального спектра гуманизированных антител. Клетки, полученные из трансгенных животных согласно данному изобретению, такие как В-клетки или линии клеток, полученные из трансгенного животного, иммунизированного против антигена, также являются частью данного изобретения. В следующем аспекте данное изобретение относится к способам лечения заболевания примата, в частности человека, посредством введения композиции очищенного гуманизированного антитела, предпочтительно композиции гуманизированных поликлональных антител, необходимой для лечения указанного заболевания. Композиции гуманизированных поликлональных антител, используемые для введения, в общем,характеризуются тем, что они содержат популяцию поликлональных антител, имеющую концентрации иммуноглобулинов от 0,1 до 100 мг/мл, более обычно от 1 до 10 мг/мл. Композиция антител может содержать иммуноглобулины разных изотипов. Альтернативно композиция антител может содержать антитела только одного изотипа или ряда выбранных изотипов. В большинстве случаев композиция антител состоит из немодифицированных иммуноглобулинов,т.е. гуманизированных антител, полученных от животного без дополнительной модификации, например,химическими веществами или ферментами. Альтернативно фракцию иммуноглобулинов можно подвергнуть такой обработке, как ферментативное расщепление (например, пепсином, папаином, плазмином, гликозидазами, нуклеазами, и.т.д.), нагревание, и т.д., и/или далее фракционировать. Композиции антител, как правило, вводят в сосудистую систему, для удобства внутривенно путем инъекции или инфузии через катетер, имплантированный в соответствующую вену. Композицию антител вводят с соответствующей скоростью, как правило, в пределах примерно от 10 мин до 24 ч, более обычно примерно от 30 мин до 6 ч, в соответствии со скоростью, при которой пациент может воспринимать жидкость. Введение эффективной дозы можно осуществлять путем однократной инфузии или серии инфузий. Многократные инфузии можно вводить раз в день, раз в неделю, раз в месяц или раз каждые три месяца, в зависимости от периода полужизни препарата антител и клинических показаний. В случае применений на эпителиальных поверхностях композиции антител наносят на поверхность, которую необходимо обработать, в количестве, достаточном для обеспечения планируемого конечного результата, и при необходимости нанесение можно повторять. Композиции антител можно использовать для связывания и нейтрализации антигенных единиц в тканях организма человека, которые вызывают заболевание или которые вызывают нежелательные или аномальные иммунные ответы. Антигенная единица в данном описании является определением, которое охватывает любые растворимые или связанные с клеточной поверхностью молекулы, включая белки,а также клетки или организмы, вызывающие инфекционные заболевания, или агенты, которые, по меньшей мере, способны связывать антитело и предпочтительно также способны стимулировать иммунный ответ. Введение композиции антител против инфекционного агента в виде монотерапии или в комбинации с химиотерапией приводит к удалению инфекционных частиц. Однократное введение антителснижает количество инфекционных частиц, как правило, от 10 до 100 раз, более обычно более чем в 1000 раз. Подобным образом, терапия антителами у пациентов со злокачественным заболеванием, используемая в виде монотерапии или в комбинации с химиотерапией, снижает количество злокачественных клеток, как правило, от 10 до 100 раз или более, чем в 1000 раз. Терапию можно повторять в течение длительного периода времени, чтобы обеспечить полное удаление инфекционных частиц, злокачественных клеток и т.д. В некоторых случаях терапия препаратами антител будет продолжаться в течение длительных периодов времени в отсутствие регистрируемых количеств инфекционных частиц или нежелательных клеток. Подобным образом, применение терапии антителами для модулирования иммунных ответов может заключаться в однократном или многократном введениях терапевтических антител. Терапия может продолжаться в течение длительных периодов в отсутствие каких-либо симптомов заболевания. Лечение субъекта можно применять вместе с химиотерапией в дозах, достаточных для ингибирования инфекционного заболевания или злокачественных новообразований. Для пациентов с аутоиммунным заболеванием или реципиентов трансплантатов терапию антителами можно применять вместе с иммуносупрессирующей терапией в дозах, достаточных для подавления иммунных реакций. Далее изобретение иллюстрируется следующими примерами, но не ограничено ими. Пример 1. Новые последовательности 3'-конца гена С коров, овец и кроликов. Геномную ДНК выделяли из крови симментальской коровы с использованием набора для выделения ДНК из крови QIAamp (QIAGEN). Геномный 3'-участок гена С коровы (т.е., 3'-фланкирующую последовательность гена С коровы) амплифицировали ПЦР, используя в качестве матрицы выделенную геномную ДНК и следующие праймеры: 5'-праймер: 5'cgcaagcttCCTACACGTGTGTGGTGATG3' (SEQ ID NO: l); 3'-праймер: 5'cgcaagcttAAGATGGWGATGGTSGTCCA3' (SEQ ID NO: 2) (универсальный вырож- 12013564 денный код: W=(A/T), S=(G/C. Часть 5'-праймера, указанная заглавными буквами взята из экзона 3 С, и часть, указанная строчными буквами, представляет концевой сайт рестрикции HindIII. Часть 3'-праймера, указанная заглавными буквами, представляла собой вырожденную последовательность, сконструированную в соответствии с опубликованными последовательностями экзона M1 человека и экзона M1 мыши, а часть, указанная прописными буквами, представляла собой концевой сайт рестрикции HindIII. ПЦР-фрагмент длиной 1,3 т.п.н. получали, используя ПЦР-систему на основе длинной матрицы EXPAND (Roche). Фрагмент очищали в геле, расщепляли HindIII и клонировали в клонирующем векторе Bluescript. Полученные в результате клоны разделялись на три популяции, которые отличаются друг от друга картиной фрагментов рестрикции, получаемых с помощью BamHI, EcoRI и XhoI. Один клон из каждой популяции секвенировали, и последовательности показаны на фиг. 1 (SEQ ID NO: 3-5). Геномную ДНК выделяли из крови мериносовых овец, используя набор для выделения ДНК из крови QIAamp (QIAGEN). Геномный 3'-участок гена С овцы (т.е., 3'-фланкирующую последовательность гена С овцы) амплифицировали ПЦР, используя в качестве матрицы выделенную геномную ДНК и следующие праймеры: 5'-праймер: 5'cgcggatccCCTACGCGTGTGTGGTGATG3' (SEQ ID NO: 6). 3'-праймер: 5'cgcggatccACCGAGGAGAAGATCC-АСТТ 3' (SEQ ID NO: 7). Часть 5'-праймера, указанная заглавными буквами, взята из экзона 3 С, и часть, указанная строчными буквами, представляла собой концевой сайт рестрикции BamHI. Часть 3'-праймера, указанную заглавными буквами, конструировали в соответствии с опубликованными последовательностями экзона М 2 человека и экзона М 2 мыши, а часть, указанная прописными буквами, представляла собой концевой сайт рестрикции BamHI. ПЦР-фрагмент длиной 2,9 т.п.н. получали, используя ПЦР-систему на основе длинной матрицы EXPAND (Roche). Фрагмент очищали в геле, расщепляли BamHI и клонировали в клонирующем векторе Bluescript. Полученные в результате клоны разделялись на две популяции, которые отличаются друг от друга картиной фрагментов рестрикции, полученных с помощью HindIII, EcoRI иXhoI. Один клон из каждой популяции секвенировали, и последовательности показаны на фиг. 2 (SEQ IDEcoRI-фрагмент длиной 10 т.п.н., содержащий ген С и его фланкирующие последовательности кролика аллотипа А 2, субклонировали из геномного космидного клона (cos 8.3 от Knight et al., J.Immunol. (1985) 1245-50, Organization and polymorphism of rabbit immunoglobulin heavy chain genes). Нуклеотидные 5'- и 3'-последовательности С определяли, используя стандартные способы, последовательности указаны на фиг. 3 и 5, SEQ ID NO: 10, 12, 13 соответственно. 3'-Последовательности С-каппа 1 кролика определяли из EcoRI/BamHI-субклона VJk2Ck вpSV2neo. Нуклеотидная последовательность представлена на фиг. 4, SEQ ID NO: 11. Аминокислотные последовательности, кодируемые экзонами M1 и М 2 коровы, овцы и кролика рассчитывали на основе указанной выше 3'-фланкирующей последовательности. Указанные аминокислотные последовательности сопоставляли с опубликованными последовательностями M1 и М 2 верблюда,человека и мыши, как показано на фиг. 6. Пример 2. Вектор для замены участка эндогенного гена С кролика сегментом C1 человека. Геномную ДНК выделяют из кроличьих зародышевых фибробластов гомозиготного по а 2 кролика. Последовательность ДНК, расположенную выше С кролика (т.е. 5'-фланкирующую последовательность С кролика) амплифицируют ПЦР, используя следующие праймеры: 5' taattatgcggccgcCTTCAGCGTGAACCACGCCCTC 3' (SEQ ID NO: 39) с 5'-NotI-сайтом и 5'GTCGACGCCCCTCGATGCACTCCCAGAG 3' (SEQ ID NO: 40). Последовательность ДНК, расположенную ниже С кролика (т.е. 3'-фланкирующую последовательность С кролика) амплифицируют со следующими праймерами: 5' ggtaccCTCTCCCTCCCCCACGCCGCAGC 3' (SEQ ID NO: 41) с 5'-KpnI-сайтом и 5' atatctcagaACTGGCTGTCCCTGCTGTAGTACACGG 3' (SEQ ID NO: 42) с 5'-XhoI-сайтом. Геномную ДНК человека выделяют из лимфоцитов периферической крови человека. Фрагмент ДНК, кодирующий C1 человека, амплифицируют с использованием следующих праймеров: 5' GTCGACACTGGACGCTGAACCTCGCGG 3' (SEQ ID NO: 43) и 5' GGTACCGGGGGCTTGCCGGCCGTCGCAC 3' (SEQ ID NO: 44). Фрагменты расщепляют ферментами рестрикции и клонируют в векторе Bluescript. Затем кассетуlox neo встраивают в сайт SalI, а кассету Hsv-tk в сайт XhoI. Схематичный чертеж конечной конструкции показан на фиг. 7 а. Пример 3. Вектор для замены сегмента эндогенного гена С кролика сегментом С человека. Геномную ДНК выделяют из кроличьих зародышевых фибробластов гомозиготного по b5 кролика. Последовательность ДНК выше С 1 (т.е. 5'-фланкирующую последовательность С 1 кролика) амплифицируют ПЦР, используя следующие праймеры: 5' gcggccgcTGGCGAGGAGACCAAGCTGGAGATCAAACG 3' (SEQ ID NO: 45) с 5'-NotI-сайтом 5' GTCGACGCAGCCCAAAGCTGTTGCAATGGGGCAGCG 3' (SEQ ID NO: 46).- 13013564 Последовательность ДНК ниже С 1 кролика (т.е., 5'-фланкирующую последовательность С 1 кролика) амплифицируют со следующими праймерами: 5' atatggtaccGCGAGACGCCTGCCAGGGCACCGCC 3' (SEQ ID NO: 47) с 5'-KpnI-сайтом 5' GGATCCCGAGCTTTATGGGCAGGGTGGGGG 3' (SEQ ID NO: 48). Геномную ДНК человека выделяют из лимфоцитов периферической крови человека. Фрагмент ДНК, кодирующий С человека, амплифицируют с использованием следующих праймеров: 5' ATATGTCGACCTGGGATAAGCATGCTGTTTTCTGTCTGTCCC 3' (SEQ ID NO: 49) 5' CTAGGTACCAGCAGGTGGGGGCACTTCTCCC 3' (SEQ ID NO: 50). Фрагменты расщепляют ферментами рестрикции и клонируют в векторе Bluescript. Затем кассетуlox neo встраивают в сайт SalI, а кассету Hsv-tk в сайт XhoI. Схематический чертеж конечной конструкции показан на фиг. 7b Пример 4. Замена сегментов эндогенных генов С и С в фибробластах зародыша кролика соответствующими сегментами гена человека. Клетки, фибробласты зародыша кролика, получают стандартными способами. После одного пассажа фибробласты трансфицируют 5 мкг линеаризованного с помощью NotI вектора, направленного к мишени, как показано на фиг. 5 а для С или на фиг. 5b для С, и высевают в 96-луночные планшеты (2103 клеток/лунку). После позитивной селекции с использованием 600 мкг/мл G418 и негативной селекции с использованием 200 нМ FIAU, реплики устойчивых колоний переносят на два 96-луночных планшета для анализа ДНК и криоконсервирования соответственно. Проводят ПЦР и/или Саузерн-блот-анализ,чтобы идентифицировать клетки с сегментом гена C1 человека, интегрированным в геном. Клетки,имеющие интегрированный ген C1 человека, используют для клонирования кроликов, как описано в примере 5. Пример 5. Клонирование кроликов. Взрослых кроликов Dutch Belton подвергают суперовуляции посредством подкожной инъекции фолликулостимулирующего гормона (FSH) каждые 12 ч (0,3 мг 2 и 0,4 мг 4). Овуляцию индуцируют внутривенным введением 0,5 мг лютеинизирующего гормона (LH) через 12 ч после последней инъекцииFSH. Ооциты извлекают промывкой яйцеводов через 17 ч после инъекции LH. Из ооцитов механически удаляют ядра через 16-19 ч после созревания. Удаление хромосом оценивают с использованием красителя бисбензимида (HOECHST 33342, Sigma, St. Louis, МО) в ультрафиолетовом свете. Ооциты, из которых удалены ядра, сливают с активно делящимися фибробластами, используя один электрический импульс 180 В/см в течение 15 мкс (Electrocell Manipulator 200, Genetronics, San Diego, CA). Через 3-5 ч ооциты химически активируют кальциевым ионофором (6 мкМ) в течение 4 мин ( 407 952, Calbiochem,San Diego, CA) и 2 мМ 6-диметиламинопурином (DMAP, Sigma) в среде CR2 (специализированная среда,Lavalett, NJ) с 3 мг/мл бычьего сывороточного альбумина (не содержащего жирных кислот, Sigma) в течение 3 ч. После активации эмбрионы пять раз промывают в среде для культивирования эмбрионов хомячка (HECM)-Hepes и затем культивируют в среде CR2, содержащей 3 мг/мл БСА, не содержащего жирных кислот, в течение 2-48 ч при 37,8 С и 5% СО 2 в воздухе. Затем эмбрионы переносят синхронизированным реципиентам. Потомство анализируют с помощью ПЦР в отношении сегмента трансгена. Примр 6. Конструирование фрагмента ДНК, содержащего часть локуса тяжелой цепи кролика с сегментом гена C1 человека и сегментом гена VH, кодирующим полипептидную последовательность VHдомена человека. Секвенировали верхние и нижние участки (т.е. 5'-фланкирующие и 3'-фланкирующие участки) гена С тяжелой цепи кролика от кролика с аллотипом а 2. Фрагмент ДНК (SEQ ID NO: 51) создают посредством ПЦР с использованием перекрывающихся олигонуклеотидов, при этом фрагмент ДНК содержит в направлении 5'3' последовательность, полученную из 5'-фланкирующего участка гена С кролика, генC1 человека и последовательность, полученную из 3'-фланкирующего участка гена С кролика (фиг. 8). Геномную ВАС-библиотеку, полученную из кролика аллотипа а 2, создают стандартными способами и проводят скрининг с использованием зондов, специфичных по отношению к С кролика. Идентифицируют ВАС-клон, содержащий сегменты гена тяжелой цепи кролика. Ген С кролика в указанном ВАС-клоне заменяют геном C1 человека посредством гомологичной рекомбинации в Е. coli, используя фрагмент ДНК SEQ ID NO: 51 и систему рЕТ. Указанную замену осуществляют в две последовательные стадии рекомбинации: сначала сегмент гена С кролика заменяют маркерным геном; затем маркерный ген заменяют сегментом гена C1 человека. Модифицированный ВАС-клон, содержащий гены тяжелой цепи кролика и встроенный ген C1 человека далее модифицируют заменой 3'-проксимального сегмента VH1 синтетическим сегментом генаVH (фиг. 9). Указанный синтетический сегмент гена VH (SEQ ID NO: 52) получают, используя перекрывающиеся олигонуклеотиды, и участок включает в себя 5'-фланкирующую последовательность, 3'фланкирующую последовательность и последовательность, кодирующую полипептид, почти идентичный полипептидной последовательности вариабельного домена тяжелой цепи иммуноглобулина человека, описанной Huang and Stollar (J. Immunol. 151: 5290-5300, 1993). Кодирующую последовательность синтетического сегмента гена VH конструируют на основе опубликованной последовательности генаVH1 кролика (а 2, Knight and Becker, Cell 60: 963-970, 1990), и последовательность идентична сегментам гена VH кролика более чем на 80%. 5'- и 3'-фланкирующие последовательности в синтетическом сегменте VH получают из выше- и нижерасположенных участков гена VH1 кролика аллотипа а 2. Синтетический ген VH SEQ ID NO: 52 используют для замены гена VH1 кролика в ВАС-клоне посредством гомологичной рекомбинации с использованием системы рЕТ или red. Модифицированный ВАС-клон амплифицируют и очищают, используя стандартные методики. Пример 7. Конструирование фрагмента ДНК, содержащего часть локуса легкой цепи кролика с сегментом гена С человека и сегментом гена VJ, кодирующим полипептидную последовательность доменаVL человека. Секвенировали выше- и нижерасположенные участки (т.е. 5'-фланкирующие и 3'-фланкирующие участки) гена С 1 легкой цепи кролика от кролика с аллотипом b5. Фрагмент ДНК (SEQ ID NO: 53) создают посредством ПЦР с использованием перекрывающихся олигонуклеотидов, при этом фрагмент ДНК содержит в направлении 5'3' последовательность, полученную из 5'-фланкирующего участка гена С 1 кролика, ген С 1 человека и последовательность, полученную из 3'-фланкирующего участка гена С 1 кролика (фиг. 10). Геномную ВАС-библиотеку, полученную из кролика аллотипа b5, создают стандартными способами и проводят скрининг с использованием зондов, специфичных по отношению к С 1 кролика. Идентифицируют ВАС-клон, содержащий сегменты гена легкой цепи кролика. Ген С 1 кролика в указанном ВАС-клоне заменяют геном С 1 человека в фрагменте ДНК SEQ ID NO: 53 посредством гомологичной рекомбинации в Е. coli с использованием системы рЕТ или red-. Указанную замену осуществляют в две последовательные стадии рекомбинации: сначала сегмент гена С 1 кролика заменяют маркерным геном; затем маркерный ген заменяют сегментом гена С 1 человека. Модифицированный ВАС-клон, содержащий гены легкой цепи кролика и встроенный ген С 1 человека, далее модифицируют встраиванием реаранжированного фрагмента ДНК VJ в J-область локуса легкой цепи кролика. Реаранжированный фрагмент ДНК VJ кодирует полипептид вариабельного домена иммуноглобулина человека, описанный Pritsch et al. (Blood 82 (10): 3103-3112, 1993) и Lautner-Rieske etal. (Eur. J Immunol. 22 (4), 1023-1029, 1992 (фиг. 7). Нуклеотидную последовательность реаранжированного участка VJ конструируют, чтобы максимально увеличить гомологию последовательностей на уровне нуклеотидов с последовательностью V-каппа кролика, опубликованной Lieberman et al. (J. Immunol. 133 (5), 2753-2756, 1984). Указанная реаранжированная последовательность ДНК VJ более чем на 80% идентична известным генам V кролика. Используя перекрывающиеся олигонуклеотиды в ПЦР, реаранжированный фрагмент ДНК VJ связывают с 5'- и 3'-фланкирующей последовательностью, получая фрагмент ДНК SEQ ID NO: 54 (фиг. 11). 5'-Фланкирующую последовательность получают из 5'-конца V кролика, 3'-фланкирующую последовательность получают из 3'-конца J2 кролика. Затем фрагмент ДНКSEQ ID NO: 54 встраивают в локус легкой цепи кролика посредством гомологичной рекомбинации в Е.coli, используя систему рЕТ или red. Встраивание осуществляют таким образом, что область легкой цепи кролика, содержащую сегмент гена V1 кролика, участки J1 и J2 кролика и последовательности между ними заменяют реаранжированным фрагментом ДНК VJ. И в этом случае указанное встраивание осуществляют заменой участка V-J кролика маркерным геном с последующей заменой маркерного гена реаранжированным фрагментом ДНК VJ. Модифицированный ВАС-клон амплифицируют и очищают,используя стандартные методики. Пример 8. Трансгенные кролики, экспрессирующие трансген легкой и/или тяжелой цепи гуманизированного иммуноглобулина. Трансгенных кроликов получают, как описано Fan et al. (Pathol. Int. 49: 583-594, 1999). Коротко, самок кроликов подвергают суперовуляции, используя стандартные способы, и спаривают с самцами кроликов. Зиготы в стадии пронуклеуса собирают из яйцевода и помещают в соответствующую среду, такую как фосфатно-солевой буфер Дюльбекко с добавлением 20% фетальной бычьей сыворотки. Экзогенную ДНК (например, гуманизированный ВАС-клон, описанный в примере 4 и/или 5, который был линеаризован перед инъекцией) микроинъецируют в мужской пронуклеус с помощью пары манипуляторов. Выжившие, судя по морфологическим признакам, зиготы переносят в яйцеводы псевдобеременных кроликов. Псевдобеременность индуцируют инъекцией хорионического гонадотропина человека (hCG). Примерно 0,1-1% инъецированных зигот развиваются в живых трансгенных кроликах. Интеграцию трансгена в геном подтверждают Саузерн-блот-анализом с использованием зонда, специфичного для трансгена. кДНК получают с использованием РНК, выделенной из В-клеток (крови, селезенки и/или лимфатических узлов) трансгенного кролика. Используют праймеры, специфичные по отношению к трансгену человека (участку гена СН человека или синтетическому участку гуманизированного гена VH) , для получения на основе кДНК амплифицированных продуктов. Исследование амплифицированных продуктов свидетельствует о том, что трансген реаранжируется в трансгенном животном, и реаранжированный трансген транскрибируется у животного. Амплифицированные продукты секвенируют, и наличие донорных последовательностей вышерасположенных генов V свидетельствует о том, что трансген, введен- 15013564 ный в зародышевую линию животного, подвергается конверсии генов. Наличие антител, содержащих IgG человека и/или антигенные детерминанты легкой цепи каппа человека, в сыворотке трансгенных кроликов-родоначальников определяют с использованием анализаELISA. Пример 9. Получение гуманизированных антител из трансгенных кроликов, имеющих генетический фон линии кроликов Alicia и/или Basilea. У кроликов линии Alicia отсутствует сегмент гена VH1, и поэтому у них нарушена экспрессия тяжелой цепи Ig. Получают трансгенных кроликов-родоначальников, способных экспрессировать гуманизированные молекулы тяжелой цепи на генетическом фоне линии кроликов Alicia, например, используя эмбриональные фибробласты, полученные от кроликов Alicia в указанных выше примерах 4-5, или, используя зиготы от самок кроликов Alicia, которых скрещивали с самцами кроликов Alicia в приведенном выше примере 8. Также получают трансгенных животных, которые являются гомозиготными по фенотипу Ig Alicia, а также гомозиготными по гуманизированному трансгену тяжелой цепи. Сыворотку проверяют в ELISA на наличие гуманизированной тяжелой цепи (например, константной области тяжелой цепи человека). Концентрация антител с гуманизированными тяжелыми цепями Ig у указанных гомозиготных животных Alicia значительно выше, например, примерно в 10-100 раз выше, чем концентрация,которая продуцируется с трансгена, интегрированного в геном кроликов дикого типа (не относящихся кAlicia). Линия Basilea не экспрессирует легкую цепь к 1, а вместо этого экспрессирует исключительно легкие цепи 2 и . Получают трансгенных кроликов-родоначальников, способных экспрессировать гуманизированные молекулы легкой цепи на генетическом фоне линии кроликов Basilea, например, используя эмбриональные фибробласты, полученные от кроликов Basilea в указанных выше примерах 4-5, или, используя зиготы от самок кроликов Basilea, которых скрещивали с самцами кроликов Basilea в приведенном выше примере 8. Получают трансгенных животных, которые являются гомозиготными по фенотипу легкой цепи Basilea, а также гомозиготными по гуманизированному трансгену легкой цепи. Сыворотку проверяют в ELISA на наличие гуманизированной легкой цепи. Концентрация гуманизированной легкой цепи у гомозиготных животных Basilea значительно выше, примерно в 10-100 раз выше, чем концентрация гуманизированной легкой цепи у трансгенного кролика с генетическим фоном дикого типа (не относящегося к Basilea). Трансгенных кроликов-родоначальников скрещивают друг с другом, чтобы получить трансгенных кроликов со следующими особенностями: (1) имеющих по меньшей мере один трансген гуманизированной легкой цепи, (2) имеющих по меньшей мере один трансген гуманизированной тяжелой цепи, (3) гомозиготных по локусу тяжелой цепи Alicia и (4) гомозиготных по локусу легкой цепиBasilea. Пример 10. Конструирование фрагмента ДНК, содержащего модифицированный локус легкой цепи курицы, имеющий сегмент гена С-лямбда-2 человека и сегмент гена VJ, кодирующий домен VL человека. Проводили скрининг геномной ВАС-библиотеки, полученной от кустарниковой дикой курицы, с помощью радиоактивно меченых зондов, специфичных по отношению к С-лямбда легкой цепи курицы иVpsi25 курицы (сегмент гена V на самом 5'-конце локуса легкой цепи). Идентифицировали ВАС-клон,содержащий полный локус легкой цепи лямбда. Ген С курицы в данном ВАС-клоне заменяют геном С 2 человека посредством гомологичной рекомбинации в Е. coli, используя систему рЕТ (Zhang et al.,Nat. Biotechnol. 18 (12): 1314-7, 2000), следующим образом. Создают первый фрагмент ДНК, содержащий кассету для селекции канамицином, посредством ПЦР с использованием праймеров, специфичных по отношению к гену Tn5. 5'-Праймер (5' catacacagccatacatacgcgtgtggccgctctgcctctctcttgcaggTATGGACAGCAAGCGAACCG 3', SEQ ID NO: 55) конструировали так, чтобы он включал в себя 50 п.н. на 5'-конце (строчные буквы), полученных из 5'фланкирующего участка гена С легкой цепи курицы. 3'-Праймер (5' atcagggtgacccctacgttacactcctgtcaccaaggagtgggagggac TCAGAAGAACTCGTCAAGAAG 3', SEQ ID NO: 56) конструировали так, чтобы он включал примерно 50 п.н. на конце (строчные буквы), полученных из 3'-фланкирующего участка гена С легкой цепи курицы. Второй фрагмент ДНК (SEQ ID NO: 57) синтезировали с использованием перекрывающихся олигонуклеотидов, при этом фрагмент ДНК содержит в направлении 5'3' последовательность, полученную из 5'-фланкирующего участка гена С-лямбда легкой цепи курицы, гена С-лямбда-2 человека и последовательность, полученную из 3'-фланкирующего участка гена С-лямбда курицы (фиг. 12). Клетки Е. coli ВАС-клона легкой цепи курицы трансформировали рекомбинантной плазмидой, экспрессирующей функции recE и recT под контролем индуцируемого промотора. Затем клетки, трансформированные рекомбинантной плазмидой, трансформировали первым фрагментом ДНК, описанным выше, и затем проводили селекцию в среде, содержащей канамицин. Идентифицировали клоны, устойчивые к канамицину, и замену участка С курицы кассетой для селекции канамицином посредством гомологичной рекомбинации подтверждали расщеплением ферментом рестрикции.- 16013564 На второй стадии гомологичной рекомбинации клетки, позитивные в отношении кассеты для селекции канамицином, трансформировали вторым фрагментом ДНК, описанным выше. Проводили скрининг трансформированных клеток по признаку отсутствия устойчивости к канамицину в качестве показателя замены кассеты для селекции канамицином геном С 2 человека. Обмен подтверждали расщеплением ферментами рестрикции и/или секвенированием. Методика ЕТ-клонирования суммирована на фиг. 13. ВАС-клон, содержащий локус легкой цепи курицы и встроенный сегмент гена С-лямбда-2 человека дополнительно модифицировали встраиванием реаранжированного фрагмента ДНК VJ. Реаранжированный фрагмент ДНК VJ кодирует полипептид вариабельного домена иммуноглобулина человека, описанный Kametani et al. (J. Biochem. 93 (2), 421-429, 1983) как NIG-64 V-I-области цепи лямбда Ig (P01702)(фиг. 14). Нуклеотидная последовательность реаранжированного фрагмента VJ конструировали так, чтобы достичь максимальной гомологии последовательностей на уровне нуклеотидсв с последовательностью V-ламбда-2 курицы, опубликованной McCormack et al. (Cell 56, 785-791, 1989). Полученная реаранжированная последовательность ДНК VJ более чем на 8 0% идентична известным генам V легкой цепи курицы. Реаранжированный фрагмент ДНК VJ связывали с 5'-фланкирующей последовательностью и 3'-фланкирующей последовательностью, получая в результате фрагмент ДНК SEQ ID NO: 58 (фиг. 14). 5'-Фланкирующую последовательность получали из 5'-конца V-лямбда-1 курицы и 3'-фланкирующую последовательность получали из 3'-конца J курицы. Фрагмент ДНК SEQ ID NO: 58 затем встраивали в локус легкой цепи курицы в Е. coli, используя систему рЕТ, как показано на фиг. 15. Встраивание осуществляли таким образом, чтобы участок локуса легкой цепи курицы от 5'-конца сегмента гена V-лямбда-1 курицы до 3'-конца области J курицы заменить реаранжированным синтетическим фрагментом ДНК VJ. И в этом случае указанное встраивание осуществляли заменой V-J-области курицы маркерным геном с последующей заменой маркерного гена реаранжированным фрагментом ДНК VJ. Модифицированная область локуса легкой цепи курицы показана на фиг. 15. Модифицированный ВАС-клон амплифицировали и очищали, используя стандартные способы. Пример 11. Конструирование фрагмента ДНК, содержащего часть локуса тяжелой цепи курицы с сегментом гена C1 человека и сегментом гена VH, кодирующим полипептидную последовательность домена VH человека. Геномную ВАС-библиотеку кустарниковой дикой курицы получали стандартными способами и подвергали скринингу с помощью зондов, специфичных по отношению к С курицы. Идентифицируют ВАС-клон, содержащий сегменты гена тяжелой цепи курицы. Секвенируют выше- и нижерасположенные участки (т.е. 5'-и 3'-фланкирующие участки) гена С тяжелой цепи. Ген С курицы в данном ВАСклоне заменяют геном C1 человека посредством гомологичной рекомбинации в Е. coli, используя систему рЕТ, следующим образом. Создают первый фрагмент ДНК, содержащий кассету для селекции канамицином, посредством ПЦР с использованием праймеров, специфичных по отношению к гену Tn5. 5'- и 3'-праймеры конструируют так, чтобы они включали около 50 п.н. на конце, полученных из 5'- и 3'-фланкирующих участков гена С тяжелой цепи курицы. Второй фрагмент ДНК создают посредством ПЦР, используя перекрывающиеся олигонуклеотиды,при этом указанный второй фрагмент ДНК содержит в направлении 5'3' последовательность длиной примерно 50 п.н., полученную из 5'-фланкирующего участка гена С курицы, ген C1 человека и последовательность длиной примерно 50 п.н., полученную из 3'-фланкирующего участка гена С курицы. Клетки E.coli ВАС-клона CY курицы трансформируют рекомбинантной плазмидой, экспрессирующей функции recE и recT под контролем индуцируемого промотора. Затем клетки, трансформированные рекомбинантной плазмидой, далее трансформируют первым фрагментом ДНК и проводят селекцию в среде, содержащей канамицин. Идентифицируют клоны, устойчивые к канамицину, и замену сегмента СУ курицы кассетой для селекции канамицином посредством гомологичной рекомбинации подтверждают расщеплением ферментом рестрикции. На второй стадии гомологичной рекомбинации клетки, позитивные в отношении кассеты для селекции канамицином, теперь трансформируют вторым фрагментом ДНК, описанным выше. Проводят скрининг трансформированных клеток по признаку потери устойчивости к канамицину в качестве показателя замены кассеты для селекции канамицином геном C1 человека. Обмен подтверждают расщеплением ферментом рестрикции и/или секвенированием. ВАС-клон, содержащий встроенный ген C1 человека, далее модифицируют заменой 3'проксимального сегмента VH1 (т.е. 3'-проксимального гена VH1 в V-области) синтетическим сегментом гена VH. Указанный синтетический сегмент гена VH конструируют на основе опубликованной последовательности гена VH1 курицы (Arakawa et al., EMBO J. 15 (10): 2540-2546, 1996). Синтетический сегмент гена более чем на 80% идентичен сегментам гена VH курицы и кодирует аминокислотную последовательность, которая идентична аминокислотной последовательности полипептида вариабельного домена тяжелой цепи иммуноглобулина человека, описанной Matthyssens and Rabbitss (в Steinberg CM andVH, содержащий 5'- и 3'-фланкирующие последовательности, синтезируют ПЦР, используя перекрывающиеся олигонуклеотиды. 5'- и 3'-фланкирующие последовательности получают из выше- и нижерасположенных участков гена VH1 курицы. Полученный синтетический сегмент VH используют для замены гена VH1 курицы в ВАС-клоне посредством гомологичной рекомбинации с использованием системы рЕТ. Модифицированный ВАС-клон амплифицируют и очищают, используя стандартные способы. Пример 12. Трансгенная курица, экспрессирующая трансгены гуманизированной легкой и/или тяжелой цепи иммуноглобулина. Трансгенную курицу получают, используя способы, которые описаны Etches et al., Methods in Molecular Biology 62: 433-450; Pain et al., Cells Tissues Organs 1999; 165 (3-4): 212-9; Sang, H., Transgenicegg. Вкратце, модифицированные ВАС-клоны переводят в линейную форму и смешивают с реагентом для трансфекции, чтобы стимулировать захват ДНК клетками. Инъецируют композиции в эмбрион курицы в многоклеточной стадии в непосредственной близости к зародышевому диску. Отверстие в яичной скорлупе закрывают и яйца инкубируют. После вылупления химерных куриц идентифицируют с помощью ПЦР и Саузерн-блот-анализа с использованием специфичных для трансгена последовательностей. Интеграцию трансгена в геном подтверждают Саузерн-блот-анализом, используя специфичный для трансгена зонд. Животных, трансгенных по тяжелой и легкой цепям, скрещивают друг с другом, получая трансгенных куриц, экспрессирующих антитела, имеющие гуманизированные тяжелые и легкий цепи. кДНК получают, используя РНК, выделенную из В-клеток (крови, селезенки и/или лимфатических узлов) трансгенных куриц. Используют праймеры, специфичные для трансгена (например, для сегментов гена СН человека и/или синтетических участков гуманизированного гена VH), чтобы получить амплифицированные продукты кДНК. Исследование амплифицированных продуктов свидетельствует о том,что трансген реаранжирован у трансгенного животного, и реаранжированный трансген транскрибируется у животного. Амплифицированные продукты секвенируют, и наличие донорских последовательностей из вышерасположенных областей генов V свидетельствует о том, что трансген, введенный в зародышевую линию животного, подвергается конверсии генов. Наличие антител, содержащих антигенные детерминанты IgG человека и/или легкой цепи каппа человека, в сыворотке трансгенных куриц определяют с использованием анализа ELISA. Пример 13. Получение функциональных гуманизированных антител у трансгенной курицы с агаммаглобулинемическим фенотипом. Получают трансгенных куриц со следующими характерными особенностями: (1) имеющих по меньшей мере один трансген гуманизированной легкой цепи, (2) имеющих по меньшей мере один трансген гуманизированной тяжелой цепи и (3) гомозиготных по фенотипу агаммаглобулинемии. Указанные животные продуцируют антитела в кровь и яйца, и антитела можно очистить из любого источника. Как правило, концентрации антител в яйцах составляют примерно от 5 до 50% от концентрации антител в крови. Животных, которые содержат высокие уровни гуманизированных антител в яйцах, можно отобрать и скрестить для получения потомства. Альтернативно можно получить трансгенных животных,которые специфично секретируют гуманизированные антитела в яйца. Пример 14. Создание трансгенных куриц, экспрессирующих гуманизированный иммуноглобулин. Эмбриональные стволовые клетки куриц выделяют и культивируют, как описано Pain et al. (Development 122, 2339-2348; 1996). Эмбрионы куриц получают из яиц сразу же после их откладки. Полностью извлекают бластодерм с помощью осторожного отсасывания, эмбрионы подвергают медленной механической диссоциации и клетки высевают в полную среду ESA на инактивированные питающие клеткиSTO. Среда ESA состоит из среды MEM, содержащей 10% FCS, 2% сыворотки курицы, 1% бычьего сывороточного альбумина, 10 нг/мл овальбумина, 1 мМ пируват натрия, 1% заменимых аминокислот, 1 мкМ каждого из нуклеотидов аденозина, гуанозина, цитидина, уридина, тимидина, 0,16 мМ меркаптоэтанола, полную среду ESA дополняют 10 нг/мл bFGF, 20 нг/мл h-IGF-1, 1% об./об. SCF птиц и 1% об./об. h-LIF, 1% об./об. h-IL-11. Культуры клеток инкубируют при 37 С в 7,5 СО 2 и при 90% влажности. Через 48 ч к культуре добавляют свежие бластодермальные клетки в половине исходного объема полной среды ESA. После дополнительной инкубации в течение трех дней культуральную среду частично (50%) заменяют свежей полной средой ESA и после этого каждый день полностью. Для сбора клеток культуры промывают PBS и инкубируют в растворе проназы (0,025% мас./об.). Диссоциированные клетки трансфицируют различными линеаризованными трансгенными конструкциями, содержащими гуманизированный локус Ig. Трансфицированные клетки инкубируют с питающими клетками STO (как описано выше) в присутствии антибиотиков для селекции. Клетки переносят на свежие питающие клетки дважды в неделю. Выделяют устойчивые к антибиотикам клетки и с помощью ПЦР подтверждают интеграцию фрагментов гуманизированного гена Ig в случайный сайт или в соответствующие локусы генов иммуноглобулинов курицы. Затем генетически модифицированные клетки инъецируют в реципиентные эмбрионы. В качестве- 18013564 реципиентных эмбрионов свежие отложенные яйца облучают (6 Гр - кобальтовый источник). От 100 до 200 генетически модифицированных клеток инъецируют в подзародышевую полость, используя микропипетку. Отверстие в яичной скорлупе закрывают и яйца инкубируют. Соматический химеризм вылупившихся куриц оценивают с помощью ПЦР. Химеризм зародышевой линии оценивают скрещиванием соматических химер. Пример 15. Иммунизация трансгенных животных. Полученных генно-инженерным способом куриц иммунизируют внутримышечно очищенным поверхностным антигеном гепатита В (HBsAg) (5 мкг в неполном адъюванте Фрейнда) в 0, 14 и 28 день. На 35 день у животных берут кровь и получают сыворотку. Планшеты для ELISA (NUNC, Denmark) покрывают 1 мкг/мл HBsAg в PBS в течение 1 ч при комнатной температуре. Затем доступные места связывания блокируют инкубацией с 1% обезжиренным сухим молоком (NFM) в PBS (300 мкл/лунку). Сыворотку курицы разбавляют в PBS/1% NFM и добавляют к покрытым лункам. После инкубации в течение 1 ч планшеты 3 раза промывают PBS/0,05% твин 20 и связанный Ig выявляют, используя антитело козы против Ig человека, конъюгированное с пероксидазой хрена. Конъюгированное антитело козы регистрируют, используя дигидрохлорид орто-фенилендиамина (Sigma) в концентрации 1 мг/мл. Колориметрическую реакцию останавливают добавлением 1 М раствора HCl и оптическую плотность измеряют при 490 нм. В качестве контроля используют сыворотку неиммунизированной курицы. Сыворотка неиммунизированных куриц не реагирует с HBsAg. При разведении 1:250 оптическая плотность, измеренная в непокрытых и покрытых HBsAg лунках, составляет ниже 0,2. Напротив, сыворотка иммунизированных куриц содержит гуманизированные антитела, реагирующие с HBsAg. При разведении сыворотки 1:250 измеренная оптическая плотность составляет 2,3. При дальнейшем разведении сыворотки измеряемая оптическая плотность снижается до 0,1 (при разведении в 25600 раз). Не выявляются антитела, реагирующие с конъюгатом антитело козы против IgG курицы-HRP. Это свидетельствует о том, что полученные генноинженерным способом курицы после иммунизации продуцируют гуманизированные антитела противHBsAg. Полученных генно-инженерным способом кроликов иммунизируют внутримышечно очищенным поверхностным антигеном гепатита В (HBsAg) (10 мкг в неполном адъюванте Фрейнда) в 0 и 14 день. На 28 день у животных берут кровь из уха и получают сыворотку. Планшеты для ELISA (NUNC, Denmark) покрывают 1 мкг/мл HBsAg в PBS в течение 1 ч при комнатной температуре. Затем доступные места связывания блокируют инкубацией с 1% обезжиренным сухим молоком (NFM) в PBS (300 мкл/лунку). Сыворотку кролика разбавляют в PBS/1% NFM и добавляют к покрытым лункам. После инкубации в течение 1 ч планшеты 3 раза промывают PBS/0,05% твин 20 и связанный Ig выявляют, используя антитело козы против Ig человека, конъюгированное с пероксидазой хрена. Конъюгированное антитело козы регистрируют, используя дигидрохлорид орто-фенилендиамина (Sigma) в концентрации 1 мг/мл. Колориметрическую реакцию останавливают добавлением 1 М раствора HCl и оптическую плотность измеряют при 490 нм. В качестве контроля используют сыворотку неиммунизированных кроликов. Сыворотка неиммунизированных кроликов не реагирует с HBsAg. При разведении 1:100 оптическая плотность, измеренная в непокрытых и покрытых HBsAg лунках, составляет ниже 0,4. Напротив, сыворотка иммунизированных кроликов содержит частично человеческие антитела, реагирующие с HBsAg. При разведении сыворотки 1:100 измеренная оптическая плотность составляет 2,8. При дальнейшем разведении сыворотки измеряемая оптическая плотность снижается до 0,2 (при разведении в 25600 раз). Не выявляются антитела, реагирующие с конъюгатом антитело козы против IgG кролика-HRP. Это свидетельствует о том,что полученные генно-инженерным способом кролики после иммунизации продуцируют гуманизированные антитела против HBsAg. Пример 16. Опосредованная комплиментом цитотоксичность инфицированной вирусом линии клеток с использованием гуманизированных антител. Линию клеток карциномы печени человека, экспрессирующую HBsAg, метят 0,1 мКи 51Cr в 100 мклPBS в течение 1 ч при 37 С. Две тысячи клеток, меченых 51Cr, инкубируют с сывороткой полученных генно-инженерным способом кроликов или куриц, экспрессирующих гуманизированные иммуноглобулины против HbsAg. Через два часа при 37 определяют высвобождение 51Cr в надосадок, измеряя радиоактивность с использованием сцинтилляционного счетчика. Для определения максимального высвобождения добавляют 1% тритон Х 100. Степень лизиса клеток рассчитывают следующим образом: % лизиса = имп/мин экспериментальноеимп/мин спонтанное / имп/мин суммарноеимп/мин спонтанное. Инкубация меченых клеток с сывороткой (разведенной 1:30) неиммунизированных кроликов не приводит к лизису клеток ( 10%). Однако инкубация клеток с сывороткой иммунизированных кроликов вызывает 80% лизис. Инактивация комплемента в сыворотке тепловой обработкой (56 С в течение 30 мин) делает сыворотку иммунизированных кроликов неактивной. Полученные результаты свидетельствуют о том, что гуманизированные антитела, продуцируемые полученными генно-инженерным способом кроликами, связываются с HBsAg-позитивными клетками и вызывают зависимый от комплемента лизис. Пример 17. Иммунизация трансгенных животных против Staphylococcus aureus. Полученных генно-инженерным способом куриц иммунизируют внутримышечно рекомбинантным фрагментом белка коллагенового адгезина Staphylococcus aureus (100 мкг в неполном адъюванте Фрейн- 19013564 да) в 0, 14 и 28 день. На 35 день у животных берут кровь и получают сыворотку. Планшеты для ELISA(NUNC, Denmark) покрывают 2 мкг/мл белка коллагенового адгезина в PBS в течение 1 ч при комнатной температуре. Затем доступные места связывания блокируют инкубацией с 1% обезжиренным сухим молоком (NFM) в PBS (300 мкл/лунку). Сыворотку курицы разбавляют в PBS/1% NFM и добавляют к покрытым лункам. После инкубации в течение 1 ч планшеты 3 раза промывают PBS/0,05% твин 20 и связанный Ig выявляют, используя антитело козы против Ig человека, конъюгированное с пероксидазой хрена. Конъюгированное антитело козы регистрируют, используя дигидрохлорид орто-фенилендиамина(Sigma) в концентрации 1 мг/мл. Колориметрическую реакцию останавливают добавлением 1 М раствора HCl и оптическую плотность измеряют при 490 нм. В качестве контроля используют сыворотку неиммунизированной курицы. Сыворотка неиммунизированных куриц не реагирует с белком коллагенового адгезина. При разведении 1:250 значение оптической плотности, измеренное в непокрытых и покрытых белком коллагенового адгезина лунках, ниже 0,2. Напротив, сыворотка иммунизированных куриц содержит гуманизированные антитела, реагирующие с коллагеновым адгезином. При разведении сыворотки 1:250 измеренная оптическая плотность составляет 2,3. При дальнейшем разведении сыворотки измеряемая оптическая плотность снижается до 0,1 (при разведении в 25600 раз). Не выявляются антитела, реагирующие с конъюгатом антитело козы против IgG курицы-HRP. Это свидетельствует о том, что полученные генно-инженерным способом курицы после иммунизации продуцируют гуманизированные антитела против коллагенового адгезина Staph. aureus. Полученных генно-инженерным способом кроликов иммунизируют внутримышечно рекомбинантным фрагментом белка коллагенового адгезина Staphylococcus aureus (100 мкг в неполном адъюванте Фрейнда) в 0 день и 14 день. На 35 день у животных берут кровь и получают сыворотку. Планшеты дляELISA (NUNC, Denmark) покрывают 2 мкг/мл белка коллагенового адгезина в PBS в течение 1 ч при комнатной температуре. Затем доступные места связывания блокируют инкубацией с 1% обезжиренным сухим молоком (NFM) в PBS (300 мкл/лунку). Сыворотку кролика разбавляют в PBS/1% NFM и добавляют к покрытым лункам. После инкубации в течение 1 часа планшеты 3 раза промывают PBS/0,05% твин 20 и связанный Ig выявляют, используя антитело козы против Ig человека, конъюгированное с пероксидазой хрена. Конъюгированное антитело козы регистрируют, используя дигидрохлорид ортофенилендиамина (Sigma) в концентрации 1 мг/мл. Колориметрическую реакцию останавливают добавлением 1 М раствора HCl и оптическую плотность измеряют при 490 нм. В качестве контроля используют сыворотку неиммунизированного кролика. Сыворотка неиммунизированных кроликов не реагирует с белком коллагенового адгезина. При разведении 1:250 значение оптической плотности, измеренное в непокрытых и покрытых белком коллагенового адгезина лунках, ниже 0,2. Напротив, сыворотка иммунизированных кроликов содержит гуманизированные антитела, реагирующие с коллагеновым адгезином. При разведении сыворотки 1:250 измеренная оптическая плотность составляет 2,3. При дальнейшем разведении сыворотки измеряемая оптическая плотность снижается до 0,1 (при разведении в 25600 раз). Не выявляются антитела, реагирующие с конъюгатом антитело козы против IgG кролика-HRP. Это свидетельствует о том, что полученные генно-инженерным способом кролики после иммунизации продуцируют гуманизированные антитела против коллагенового адгезина Staph. aureus. Пример 18. Защита от инфекции Staphylococcus aureus в мышиной модели. Нативных мышей пассивно иммунизируют в/б в -1 день 16 мг иммуноглобулиновой фракции, содержащей антитела, специфичные по отношению к белку коллагенового адгезина S. aureus (из примера 17) или иммуноглобулиновой фракцией неиммунизированных животных. В 0 день мышам в/в вводят 4107 КОЕ S. aureus на мышь и регистрируют смертность в течение следующих 7 дней. Коэффициент смертности в контрольных группах составляет 80% и 10% в группе, обработанной иммуноглобулиновой фракцией, содержащей антитела, специфичные по отношению к белку коллагенового адгезина S. aureus. Результаты свидетельствуют о том, что антитела против коллагенового адгезина могут защищать мышей от летального заражения S. aureus. Пример 19. Антиген-специфичные гибридомы, полученные от трансгенных животных. Трансгенных животных иммунизируют антигеном (например, KLH, эритроцитами человека или эритроцитами овцы). Клетки селезенки извлекают в разных временных точках после иммунизации и сливают с линиями клеток миеломы, полученными от кролика и курицы, соответственно. После слияния клетки высевают в 96-луночные планшеты и надосадки тестируют по наличию гуманизированных антител. Чтобы показать, что антитела содержат последовательности иммуноглобулина человека, гибридомы красят флуоресцентно мечеными антителами, реагирующими с тяжелой и легкой цепью иммуноглобулинов человека. Проводят ограниченное разведение, чтобы очистить гибридомы до моноклональности. Пример 20. Оценка иммуногенности. Собирают образцы сыворотки от пяти макак-крабоедов в 0 день. Затем вводят очищенный препарат частично человеческих поликлональных антител (5 мг/кг) пяти макакам-крабоедам путем внутривенного введения. Введение повторяют шесть раз с двухнедельными интервалами. За обезьянами ведут тщательное наблюдение в отношении побочных эффектов (например, анафилактический шок, отражающийся повышением температуры тела). Через семь месяцев из образцов крови собирают сыворотку. Аффинные- 20013564 смолы, содержащие очищенный IgG человека или частично очищенный IgG человека, получают стандартным способом, используя CNBr-активированную сефарозу. Образцы сыворотки обезьян (3 мл) добавляют к IgG-аффинной смоле (4 мл), содержащей 10 мг человеческого или частично человеческогоIgG. Затем колонки промывают PBS. Связанный иммуноглобулин обезьян элюируют с колонки 0,1 М глицином/HCl, рН 2,5 и 2 раза диализуют против PBS. Содержание белка в элюированных фракциях определяют с использованием анализа ВСА, используя в качестве стандарта IgG человека. Суммарное количество белка в указанных фракциях свидетельствует о том, что терапия частично человеческим IgG не приводит к значительному гуморальному ответу у обработанных животных. Пример 21. Лечение животных с использованием гуманизированных антител. Гуманизированные поликлональные иммуноглобулины очищают из сыворотки полученных генноинженерным способом кроликов или из яичного желтка полученных генно-инженерным способом куриц путем осаждения сульфатом аммония и ионообменной хроматографии. Мышам SCID инъецируют один миллион клеток карциномы печени человека, экспрессирующих HBsAg. Затем внутрибрюшинно один раз в день инъецируют 25 мкг иммуноглобулина. Животные, обработанные антителами, выделенными из сыворотки неиммунизированного кролика, погибают примерно через 60 дней. Полученный результат сходен с результатом для необработанных реципиентов клеток карциномы печени. Напротив, мыши,обработанные антителами, выделенными из сыворотки иммунизированного кролика, живут более 150 дней. Это свидетельствует о том, что антитела человека, продуцируемые полученными генноинженерным способом кроликами, способны удалять клетки карциномы человека из организма мышей