Иммуногенная композиция

012528 Настоящее изобретение относится к иммуногенным композициям, содержащим бактериальные капсульные сахариды, конъюгированные с белком-носителем, в частности капсульные сахариды N. meningitidis. Изобретение, кроме того, относится к вакцинам и к вакцинным наборам, содержащим такие сахаридные конъюгаты, к способам получения таких иммуногенных композиций и вакцин и к применению вакцин и иммуногенных композиций по изобретению в терапии. Изобретение также относится к способам иммунизации против инфекции с использованием сахаридных конъюгатов и к применению сахаридных конъюгатов в изготовлении лекарственного средства.Neisseria meningitidis представляет собой человеческий грамотрицательный патоген, который вызывает бактериальный менингит. На основе капсульного полисахарида, присущего данному организму,были идентифицированы двенадцать серогрупп N. meningitidis (А, В, С, Н, I, K, L, 29E, W135, X, Y и Z). Серогруппа А (MenA) является наиболее распространенной причиной эпидемического заболевания в странах Африки к югу от Сахары. Серогруппы В и С отвечают за большинство случаев заболевания в развивающихся странах, причем остальные случаи заболевания вызывают W135 и Y. Иммуногенные композиции, содержащие сахариды N. meningitidis, конъюгированные с белкаминосителями, известны в данной области; при этом белок-носитель осуществляет известный эффект превращения Т-независимого полисахаридного антигена в Т-зависимый антиген, способный инициировать ответ иммунологической памяти. Например, в WO 02/58737 раскрыта вакцина, содержащая очищенные капсульные полисахариды из серогрупп А, С, W135 и Y N. meningitidis, конъюгированные с белкомносителем. Однако в этой заявке указывается на то, что все полисахариды должны быть конъюгированы по существу одним и тем же способом (через один и тот же линкер с одним и тем же белком-носителем). Сохраняется необходимость в разработке улучшенных конъюгатных вакцин против нейссериального менингита. Настоящее изобретение относится к предложению менингококковой полисахаридной конъюгатной вакцины, где конъюгирование каждого полисахарида адаптировано (а не является единообразным) для получения эффективной комбинированной вакцины. В частности, полезно использовать линкерные молекулы для конъюгирования некоторых менингококковых сахаридов с их белкаминосителями в комбинации с другими сахаридами, конъюгированными непосредственно. Таким образом,полисахариды, которые являются менее хорошими иммуногенами, могут быть презентированы иммунной системе через линкер, и те, которые являются очень хорошими иммуногенами, могут быть непосредственно конъюгированы так, чтобы они не доминировали в иммунном ответе на данную комбинацию. Соответственно, в одном аспекте настоящего изобретения предложена иммуногенная композиция,содержащая по меньшей мере 2 разных капсульных сахарида N. meningitidis, где один или более чем один сахарид выбран из первой группы, состоящей из MenA, MenC, MenY и MenW, конъюгированного(ых) через линкер с белком(ами)-носителем(ями), и один или более чем один другой сахарид выбран из второй группы, состоящей из MenA, MenC, MenY и MenW, непосредственно конъюгированного(ых) с белком(ами)-носителем(ями). В вакцине MenAC, например, MenA может быть конъюгирован через линкер и MenC - непосредственно. В вакцине MenCY MenC может быть конъюгирован через линкер и MenY - непосредственно. В вакцине MenACWY MenA может быть конъюгирован через линкер и MenCWY - непосредственно, илиMenAC может быть конъюгирован через линкер и MenWY - непосредственно. Еще одним фактором, который следует учитывать в комбинированной вакцине, содержащей различные сахариды, конъюгированные с одним и тем же носителем, является вопрос подавления иммунного ответа носителем: может быть использовано слишком много носителя, и иммунный ответ может быть ослаблен. При единообразном подходе к конъюгированию носитель будет презентировать иммунной системе однотипную смесь В- и Т-клеточных эпитопов. Однако, если в зависимости от того или иного сахарида происходит конъюгация с разными химическими группам белка-носителя, эти белки-носители,вероятно, будут в некоторой степени отличаться тем, как они презентируют себя иммунной системе. Соответственно, в отдельном воплощении данного изобретения предложена иммуногенная композиция, содержащая по меньшей мере 2 разных сахарида, по отдельности конъюгированных с одним и тем же типом белка-носителя (например со столбнячным анатоксином), где один или более чем один сахарид конъюгирован с белком-носителем через первый тип химической группы на данном белке-носителе, и один или более чем один сахарид конъюгирован с белком-носителем через второй (другой) тип химической группы на белке-носителе. Первый и второй типы химической группы могут присутствовать в белке-носителе на первом и втором взаимоисключающих наборах аминокислот белка-носителя (например, на некоторых остатках аспарагиновой кислоты/глутаминовой кислоты в первом наборе и на некоторых остатках лизина во втором наборе). Один сахарид может быть конъюгирован с карбоксильной группой на носителе, и другой,например, на аминогруппе. Такое конъюгирование может включать конъюгирование на отдельных Ви/или Т-клеточных эпитопах для каждого отличного конъюгата. Например, в вакцине MenAC MenA может быть связан на белке-носителе с первым типом химической группы (такой как карбоксильная) и MenC связан со вторым типом (такой как амино). В вакцинеMenCY MenC может быть связан на белке-носителе с первым типом химической группы (такой как карбоксильная) и MenY связан со вторым (такой как амино). В вакцине MenACWY MenAC может быть свя-1 012528 зан с первым типом химической группы (такой как карбоксильная) на белке-носителе и MenWY связан со вторым (такой как амино), или MenA может быть связан с первым типом химической группы (такой как карбоксильная) на белке-носителе и MenCWY связан со вторым (такой как амино). Согласно другому аспекту данного изобретения предложен способ иммунизации хозяина, являющегося человеком, против заболевания, вызываемого Neisseria meningitidis, включающий введение данному хозяину иммунопротективной дозы иммуногенной композиции или вакцины по изобретению. Согласно другому аспекту данного изобретения предложена иммуногенная композиция по изобретению для применения в лечении или предупреждении заболевания, вызываемого Neisseria meningitidis. Согласно другому аспекту данного изобретения предложено применение иммуногенной композиции или вакцины по изобретению в изготовлении лекарственного средства для лечения или предупреждения заболеваний, вызываемых Neisseria meningitidis. Описание графических материалов Фиг. 1 - А - Гистограмма, демонстрирующая GMC (среднее геометрическое концентраций)-ответы в анти-MenY ELISA (твердофазный иммуносорбентный анализ). ENYTT012 представляет собой конъюгат MenY-TT, полученный из нативного полисахарида MenY. ENYTT014 представляет собой конъюгатMenY-TT, полученный из микрофлюидизированного полисахарида MenY, который подвергался 40 циклам микрофлюидизации. ENYTT015 бис представляет собой конъюгат MenY-TT, полученный из микрофлюидизированного полисахарида MenY, который подвергался 20 циклам микрофлюидизации. Б - Гистограмма, демонстрирующая GMT(среднее геометрическое титров)-ответы в анти-MenYSBA (сывороточном бактерицидном анализе) анализе. ENYTT012 представляет собой конъюгат MenYTT, полученный из нативного полисахарида MenY. ENYTT014 представляет собой конъюгат MenY-TT,полученный из микрофлюидизированного полисахарида MenY, который подвергался 40 циклам микрофлюидизации. ENYTT015 бис представляет собой конъюгат MenY-TT, полученный из микрофлюидизированного полисахарида MenY, который подвергался 20 циклам микрофлюидизации. Подробное описание изобретения В одном аспекте настоящего изобретения предложена иммуногенная композиция, содержащая по меньшей мере 2 разных капсульных сахарида N. meningitidis, один или более чем один из которых выбран из первой группы, состоящей из MenA, MenC, MenY и MenW, конъюгированного(ых) с белком(ами)-носителем(ями) через линкер, и один или более чем один другой сахарид выбран из второй группы, состоящей из MenA, MenC, MenY и MenW, непосредственно конъюгированного(ых) с белком(ами)-носителем(ями). Более конкретно первая группа может состоять из MenA и MenC, и вторая группа может состоять из MenC, MenY и MenW. Конкретными воплощениями данного изобретения являются иммуногенные композиции, содержащие: капсульный сахарид MenA, конъюгированный через линкер с белкомносителем, и капсульный сахарид MenC, непосредственно конъюгированный с белком-носителем; капсульный сахарид MenC, конъюгированный через линкер с белком-носителем, и капсульный сахаридMenY, непосредственно конъюгированный с белком-носителем; капсульные сахариды MenA и MenC,конъюгированные через линкер с белком(ами)-носителем(ями), и капсульные сахариды MenY и MenW,непосредственно конъюгированные с белком(ами)-носителем(ями); капсульный сахарид MenA, конъюгированный через линкер с белком-носителем, и капсульные сахариды MenC, MenY и MenW, непосредственно конъюгированные с белком(ами)-носителем(ями). В любое из этих воплощений также может быть включен конъюгат Hib, который связан с белком-носителем (смотрите перечень носителей, приведенный выше и ниже, например ТТ (столбнячным анатоксином) непосредственно или через линкер. Термин сахарид в данном описании изобретения может означать полисахарид или олигосахарид и включает оба из них. Полисахариды выделены из бактерий или выделены из бактерий и в некоторой степени доведены до нужного размера известными способами (смотрите, например, ЕР 497524 и ЕР 497525) и возможно посредством микрофлюидизации. Полисахариды можно доводить до нужного размера для того, чтобы уменьшить вязкость в полисахаридных образцах и/или улучшить фильтруемость конъюгированных продуктов. Олигосахариды имеют небольшое число повторяющихся элементов(обычно 5-30 повторяющихся элементов) и обычно представляют собой гидролизованные полисахариды. Каждый капсульный сахарид N. meningitidis (и/или Hib) можно конъюгировать с белком-носителем,независимо выбранным из группы, состоящей из ТТ, DT, CRM197, фрагмента С из ТТ и протеина D. Более полный список белков-носителей, которые можно использовать в конъюгатах по данному изобретению, представлен ниже. Несмотря на то, что один или более чем один капсульный сахарид N. meningitidis (и/или Hib) можно конъюгировать с белками-носителями, отличными друг от друга, в одном воплощении все они конъюгированы с одним и тем же белком-носителем. Например, все они могут быть конъюгированы с одним и тем же белком-носителем, выбранным из группы, состоящей из ТТ, DT,CRM197, фрагмента С из ТТ и протеина D. В данном контексте CRM197 и DT можно рассматривать как один и тот же белок-носитель, так как они отличаются только одной аминокислотой. В одном воплощении все присутствующие капсульные сахариды N. meningitidis (и/или Hib) конъюгированы с ТТ. Если белок-носитель является одинаковым для 2 или более сахаридов в композиции, эти сахариды могут быть конъюгированы с одной и той же молекулой белка-носителя (молекулы носителя, имеющие-2 012528 еще 2 разных сахарида, конъюгированных с ней) [смотрите, например, WO 04/083251; например, один белок-носитель может быть конъюгирован с MenA и MenC; MenA и MenW; MenA и MenY; MenC иHib и MenY]. Альтернативно, каждый из сахаридов по отдельности может быть конъюгирован с разными молекулами белка-носителя (при этом с каждой молекулой белка-носителя конъюгирован только один тип сахарида). Иммуногенные композиции по первому аспекту данного изобретения также могут иметь любые или все дополнительные признаки второго аспекта данного изобретения и наоборот. Во втором аспекте данного изобретения представлена иммуногенная композиция, содержащая по меньшей мере 2 разных сахаридных конъюгата, конъюгированных по отдельности с одним и тем же типом белка-носителя, где один или более чем один сахарид конъюгирован(ы) с белком-носителем через первый тип химической группы на белке-носителе, и один или более чем один сахарид конъюгирован(ы) с белком-носителем через второй (другой) тип химической группы на белке-носителе. В одном воплощении 2 конъюгата содержат один и тот же сахарид, связанный с одним и тем же носителем, но посредством разных конъюгационных химических взаимодействий. В альтернативном воплощении 2 разных сахарида конъюгированы с разными группами на белке-носителе. Под выражением по отдельности конъюгированные с одним и тем же типом белка-носителя подразумевается, что сахариды индивидуально конъюгированы с одним и тем же носителем (например,MenA конъюгирован со столбнячным анатоксином через аминогруппу на столбнячном анатоксине, иMenC конъюгирован со столбнячным анатоксином через карбоксильную группу на другой молекуле столбнячного анатоксина). Капсульный(е) сахарид(ы) можно конъюгировать с одним и тем же белком-носителем, независимо выбранным из группы, состоящей из ТТ, DT, CRM197, фрагмента С из ТТ и протеина D. Более полный перечень белков-носителей, которые можно использовать в конъюгатах по изобретению, представлен ниже. В данном контексте CRM197 и DT можно рассматривать как один и тот же белок-носитель, так как они отличаются только одной аминокислотой. В одном воплощении все присутствующие капсульные сахариды конъюгированы с ТТ. В одном воплощении первый и второй типы химической группы на белковом носителе присутствуют на отдельных В- и/или Т-клеточных эпитопах на белке-носителе. То есть они присутствуют на отличном друг от друга наборе В- и/или Т-клеточных эпитопов. Чтобы прогнозировать В-клеточные эпитопы для носителя, можно использовать известные способы, такие как любой из или оба из следующих двух способов: прогнозирование 20-структуры и/или прогнозирование антигенного индекса. Прогнозирование 20-структуры можно осуществить с использованием программы PSIPRED (от David Jones,Brunel Bioinformatics Group, Dept. Biological Sciences, Brunel University, Uxbridge UB8 3PH, UK). Антигенный индекс можно рассчитать на основе способа, описанного Jameson and Wolf (CABIOS 4:181-186[1988]). Параметрами, используемыми в этой программе, являются антигенный индекс и минимальная длина антигенного пептида. В качестве граничных значений в данной программе можно использовать антигенный индекс 0,9 для минимум 5 последовательных аминокислот. Эпитопами Т-хелперных клеток являются пептиды, связанные с молекулами HLA (главного комплекса гистосовместимости) II класса и распознаваемые Т-хелперными клетками. Прогнозирование полезных эпитопов Т-хелперных клеток может быть основано на известных методиках, таких как способ TEPITOPE, описанный Sturniolo at al. (Nature Biotech. 17: 555-561 [1999]). Сахариды можно выбрать из группы, состоящей из: капсульного сахарида N. meningitidis серогруппы А (MenA), капсульного сахарида N. meningitidis серогруппы С (MenC), капсульного сахарида N. meningitidis серогруппы Y (MenY), капсульного сахарида N. meningitidis серогруппы W (MenW), капсульного сахарида Н. influenzae типа b (Hib), капсульного сахарида группы I стрептококка группы В, капсульного сахарида группы II стрептококка группы В, капсульного сахарида группы III стрептококка группы В,капсульного сахарида группы IV стрептококка группы В, капсульного сахарида группы V стрептококка группы В, капсульного сахарида типа 5 Staphylococcus aureus, капсульного сахарида типа 8 Staphylococcus aureus, сахарида Vi из Salmonella typhi, LPS (липополисахарида) N. meningitidis (такого как L3 и/илиL2), LPS М. catarrhalis, LPS H. influenzae, и из любого капсульного пневмококкового сахарида, например из серотипа 1, 2, 3, 4, 5, 6 А, 6 В, 7F, 8, 9N, 9V, 10 А, 11 А, 12F, 14, 15 В, 17F, 18 С, 19 А, 19F, 20, 22F, 23F или 33F. В одном воплощении иммуногенная композиция по изобретению состоит из двух или более разных сахаридов или содержит два или более разных сахарида из того же самого рода бактерий (например, Neisseria, Streptococcus, Staphylococcus или Haemophilus). Первая и вторая химические группы, присутствующие на белковом носителе, отличаются друг от друга и в идеале представляют собой природные химические группы, которые можно легко использовать с целью конъюгирования. Их можно независимо выбрать из группы, состоящей из карбоксильных групп,аминогрупп, сульфгидрильных групп, гидроксильных групп, имидазолильных групп, гуанидильных групп и индолильных групп. В одном воплощении первой химической группой является карбоксильная и второй - аминогруппа или наоборот. Эти группы более подробно описаны ниже.-3 012528 В конкретном воплощении иммуногенная композиция содержит по меньшей мере 2 разных капсульных сахарида N. meningitidis, где один или более чем один сахарид выбран из первой группы, состоящей из MenA и MenC, конъюгированных с белком-носителем через первый тип химической группы на белке-носителе (например, через карбоксил), и один или более чем один другой сахарид выбран из второй группы, состоящей из MenC, MenY и MenW, конъюгированных с белком-носителем через второй тип химической группы на белке-носителе (например, через амино). В другом воплощении иммуногенная композиция по изобретению содержит MenA, конъюгированный через первый тип химической группы (например, через карбоксил), и MenC, конъюгированный через второй тип химической группы (например, через амино). В другом воплощении иммуногенная композиция содержит MenC, конъюгированный через первый тип химической группы (например, через карбоксил), и MenY, конъюгированный через второй тип химической группы (например, через амино). В другом воплощении иммуногенная композиция содержит MenA, конъюгированный через первый тип химической группы (например, через карбоксил), и MenC, MenY и MenW, конъюгированные через второй тип химической группы (например, через амино). В другом воплощении иммуногенная композиция содержит MenA и MenC, конъюгированные через первый тип химической группы (например, через карбоксил), и MenY и MenW, конъюгированные через второй тип химической группы (например, через амино). В любом из приведенных выше воплощений также может присутствовать Hib, также конъюгированный с тем же типом белкового носителя. Hib может быть конъюгирован с данным носителем при помощи первого или второго типа химической группы. В одном воплощении он конъюгирован через карбоксильную группу. Общие принципы в аспектах данного изобретения Сахариды по изобретению (в частности, сахариды N. meningitidis и/или капсульный сахарид Hib),включенные в фармацевтические (иммуногенные) композиции по изобретению, конъюгированы с белком-носителем, таким как столбнячный анатоксин (ТТ), фрагмент С столбнячного анатоксина, нетоксичные мутанты столбнячного токсина [заметьте, что все такие варианты ТТ для целей данного изобретения считаются одним и тем же типом белка-носителя], дифтерийный анатоксин (DT), CRM197, другие нетоксичные мутанты дифтерийного токсина [такие как CRM176, CRM 197, CRM228, CRM 45 (Uchida et al J.Biol. Chem. 218; 3838-3844, 1973); CRM 9, CRM 45, CRM102, CRM 103 и CRM107 и другие мутации,описанные Nicholls and Youle в Genetically Engineered Toxins, Ed: Frankel, Maecel Dekker Inc, 1992; делеция или мутация Glu-148 на Asp, Gln или Ser и/или Ala 158 на Gly и другие мутации, раскрытые в US 4709017 или US 4950740; мутация по меньшей мере одного или более остатков Lys 516, Lys 526, Phe 530 и/или Lys 534 и другие мутации, раскрытые в US 5917017 или US 6455673; или фрагмент, раскрытый вUS 5843711] (заметьте, что все такие варианты DT для целей данного изобретения считаются одним и тем же типом белка-носителя), пневмококковый пневмолизин (Kuo et al. (1995) Infect Immun 63; 270613), ОМРС (менингококковый белок наружной мембраны - обычно экстрагированный из серогруппы В(WO 93/17712, WO 94/03208), коклюшные белки (WO 98/58668, ЕР 0471177), цитокины, лимфокины,факторы роста или гормоны (WO 91/01146), искусственные белки, содержащие множественные эпитопы человеческих Т-клеток CD4+из различных антигенов, происходящих от патогенов (Falugi et al. (2001) EurJ Immunol 31; 3816-3824), такие как белок N19 (Baraldoi et al. (2004) Infect Immun 72; 4884-7), поверхностный белок пневмококков PspA (WO 02/091998), белки захвата железа (WO 01/72337), токсин А или В из С. difficile (WO 00/61761) или протеин D (EP594610 и WO 00/56360). В одном воплощении в иммуногенной композиции по изобретению используется один и тот же тип белка-носителя (независимо) для по меньшей мере двух, трех, четырех или у каждого из сахаридов (например, капсульных сахаридов N. meningitidis и/или Hib), содержащихся в ней. В одном воплощении,когда присутствуют капсульные сахариды N. meningitidis и Hib, Hib может быть конъюгирован с тем же самым типом белка-носителя, что и по меньшей мере два, три, четыре или каждый из сахаридов N. meningitidis. Например, 2, 3 или 4 сахарида N. meningitidis (MenA, С, Y, W) независимо конъюгированы со столбнячным анатоксином с получением 2, 3 или 4 конъюгатов, и Hib возможно также конъюгирован с ТТ. В одном воплощении иммуногенная композиция по изобретению содержит сахарид N. meningitidis,конъюгированный с белком-носителем, выбранным из группы, состоящей из ТТ, DT, CRM197, фрагмента С из ТТ и протеина D. В одном воплощении иммуногенная композиция по изобретению содержит сахарид Hib, конъюгированный с белком-носителем, выбранным из группы, состоящей из ТТ, DT,CRM197, фрагмента С из ТТ и протеина D. Иммуногенная композиция по данному изобретению возможно содержит по меньшей мере один менингококковый сахаридный (например, MenA; MenC; MenW; MenY; MenA и MenC; MenA и MenW; MenA и MenY;-4 012528 Иммуногенная композиция по изобретению возможно содержит Hib-сахаридный конъюгат с отношением Hib к белку-носителю от 1:5 до 5:1, от 1:2 до 2:1, от 1:1 до 1:4; от 1:2 до 1:3,5; или около, или точно 1:2,5 или 1:3 (мас./мас.). Отношение сахарида к белку-носителю (мас./мас.) в конъюгате можно определить с использованием стерилизованного конъюгата. Количество белка определяют, используя анализ Лоури (например(1979, и количество сахарида определяют, используя ICP-OES (inductively coupled plasma-optical emission spectroscopy, спектроскопия индуктивно сопряженной плазмы - излучения в оптическом диапазоне) для MenA, анализа DMAP для MenC и резорцинового анализа для MenW и MenY (Monsigny et al. (1988)Anal. Biochem. 175, 525-530). В одном воплощении иммуногенная композиция по данному изобретению содержит сахаридный(е) конъюгат(ы) N. meningitidis и/или Hib-сахаридный конъюгат, где сахарид(ы) N. meningitidis и/или сахарид Hib конъюгирован с белком-носителем через линкер, например бифункциональный линкер. Данный линкер возможно является гетеробифункциональным или гомобифункциональным, имеющим, например,реакционноспособную аминогруппу и реакционноспособную карбоксильную группу, 2 реакционноспособные аминогруппы или две реакционноспособные карбоксильные группы. Данный линкер содержит,например, от 4 до 20, от 4 до 12, от 5 до 10 атомов углерода. Возможным линкером является ADH (гидразид адипиновой кислоты). Другие линкеры включают В-пропионамидо (WO 00/10599), нитрофенилэтиламин (Gever et al. (1979) Med. Microbiol. Immunol. 165; 171-288), галогеноалкилгалогениды (US4057685),гликозидные связи (US4673574, US4808700), гександиамин и 6-аминокапроновую кислоту (US4459286). Сахаридные конъюгаты, присутствующие в иммуногенных композициях по изобретению, можно получить при помощи любой известной методики связывания. Способ конъюгирования может основываться на активации сахарида 1-циано-4-диметиламинопиридиния тетрафторборатом (CDAP) с образованием цианатного эфира. Активированный сахарид может, таким образом, быть связан непосредственно или через спейсерную (линкерную) группу с аминогруппой на белке-носителе. Например, спейсер может представлять собой цистамин или цистеамин с получением тиолированного полисахарида, который может быть связан с носителем через тиоэфирную связь, полученную после взаимодействия с белкомносителем, активированным малеимидом (например, с использованием GMBS (N-сукцинимидил-4 малеимидобутирата, или с полностью ацетилированным белком-носителем (например, с использованием йодацетимида или N-сукцинимидилбромацетатбромацетата). Возможно цианатный эфир (возможно полученный с использованием CDAP-химии) связывают с гександиамином или с ADH, и аминопроизводное сахарида конъюгируют с белком-носителем с использованием карбодиимидной (например, EDAC(N-(3-диметиламинопропил)-N'этилкарбодиимид) химии через карбоксильную группу на белке-носителе. Такие конъюгаты описаны в опубликованной РСТ заявке WO 93/15760, Uniformed Services University, и WO 95/08348 и WO 96/29094. В других подходящих методиках используют карбииниды, гидразиды, активные эфиры, норборан,пара-нитробензойную кислоту, N-гидроксисукцинимид, S-NHS (эфир S-ацетилтиогликолевой кислотыN-гидроксисукцинимида), EDC, TSTU (N,N,N',N'-тетраметил-О-(N-сукцинимидил)урония тетрафторборат). Многие из них описаны в WO 98/42721. Конъюгирование может включать карбонильный линкер,который может быть образован путем взаимодействия свободной гидроксильной группы сахарида с CDI(1,1'-карбонилдиимидазолом) (Bethell et al. J. Biol. Chem. 1979, 254; 2572-4, Hearn et al. J. Chromatogr. 1981. 218; 509-18) с последующим взаимодействием с белком с образованием карбаматной связи. Может быть включены восстановление аномерного конца до первичной гидроксильной группы, возможная защита/снятие защиты с первичной гидроксильной группы, взаимодействие первичной гидроксильной группы с CDI с образованием промежуточного карбаматного производного CDI и связывание карбаматного производного CDI с аминогруппой на белке. Конъюгаты также можно получить способами прямого восстановительного аминирования, как описано в US 4365170 (Jennings) и US 4673574 (Anderson). Другие способы описаны в ЕР-0-161-188, ЕР 208375 и ЕР-0-477508. Другой способ включает сочетание производного сахарида с гидразидом адипиновой кислоты(ADH), активированного бромцианом (или CDAP), с белковым носителем путем карбодиимидной конденсации (Chu С. et al. Infect. Immunity, 1983 245 256), например с использованием EDAC. В одном воплощении гидроксильная группа (возможно активированная гидроксильная группа, например гидроксильная группа, активированная цианатным эфиром) на сахариде связана с амино или с карбоксильной группой на белке либо непосредственно, либо косвенно (через линкер). Когда присутствует линкер, гидроксильная группа на сахариде возможно связана с аминогруппой на линкере, например с использованием CDAP-конъюгирования. Другую аминогруппу в линкере (например ADH) можно конъюгировать с карбоксильной группой на белке, например с использованием карбодиимидной химии,например используя EDAC. В одном воплощении Hib или капсульный(е) сахарид(ы) N. meningitidis (или сахарид вообще) сначала конъюгируют с линкером, затем данный линкер конъюгируют с белкомносителем. Альтернативно, данный линкер можно конъюгировать с носителем до конъюгирования с сахаридом.-5 012528 В общем случае для сочетания/конъюгирования можно использовать следующие типы химических групп на белковом носителе: А) Карбоксильная (например, через аспарагиновую кислоту или глутаминовую кислоту). В одном воплощении эту группу непосредственно связывают с аминогруппами на сахаридах или с аминогруппой на линкере при помощи карбодиимидной химии, например с EDAC. Б) Аминогруппа (например, через лизин). В одном воплощении эта группа непосредственно связана с карбоксильными группами на сахаридах или с карбоксильной группой на линкере при помощи карбодиимидной химии, например с EDAC. В другом воплощении эта группа непосредственно связана с гидроксильными группами на сахаридах, активированными CDAP или CNBr, или с такими же группами на линкере; с сахаридами или линкерами, имеющими альдегидную группу; с сахаридами или линкерами,имеющими сукцинимидную эфирную группу. В) Сульфгидрильная (например, через цистеин). В одном воплощении эту группу связывают с бром- или хлорацетилированным сахаридом или линкером при помощи малеимидной химии. В одном воплощении эту группу активируют/модифицируют бисдиазобензидином. Г) Гидроксильная группа (например, через тирозин). В одном воплощении эту группу активируют/модифицируют бисдиазобензидином. Д) Имидазолильная группа (например, через гистидин). В одном воплощении эту группу активируют/модифицируют бисдиазобензидином. Е) Гуанидильная группа (например, через аргинин). Ж) Индолильная группа (например, через триптофан). Для сочетания на сахариде в общем случае можно использовать следующие группы: ОН, СООН или NH2. Альдегидные группы могут быть образованы в результате разных обработок, известных в данной области, таких как: обработка перйодатом, кислотный гидролиз, обработка пероксидом водорода и т.д. Подходы с использованием непосредственного связывания: Подходы с использованием непрямого связывания через спейсер (линкер): Примечание: вместо EDAC, указанного выше, можно использовать любой подходящий карбодиимид. Таким образом, типы химических групп белкового носителя, которые обычно можно использовать для связывания с сахаридом, представляют собой аминогруппы (например, на остатках лизина), группы СООН (например, на остатках аспарагиновой и глутаминовой кислот) и группы SH (если они доступны)(например, на остатках цистеина). В одном воплощении сахарид Hib, когда он присутствует, конъюгирован с белком-носителем с ис-6 012528 пользованием CNBr, или CDAP, или комбинации CDAP и карбодиимидной химии (например, EDAC),или комбинации CNBr и карбодиимидной химии (например, EDAC). Возможно, Hib конъюгирован с использованием CNBr и карбодиимидной химии, возможно EDAC. Например, CNBr используют для связывания сахарида и линкера, и затем используют карбодиимидную химию для связывания линкера с белковым носителем. В одном воплощении по меньшей мере один капсульный сахарид N. meningitidis (или сахарид вообще) непосредственно конъюгирован с белком-носителем; возможно сахарид(ы) MenW и/или MenY и/или MenC непосредственно конъюгирован(ы) с белком-носителем. Например, MenW; MenY; MenC;MenW и MenY; MenW и MenC; MenY и MenC; или MenW, MenY и MenC непосредственно связаны с белком-носителем. Возможно, по меньшей мере один из капсульных сахаридов N. meningitidis непосредственно конъюгирован посредством CDAP. Например, MenW; MenY; MenC; MenW и MenY; MenW иMenC; MenY и MenC; или MenW, MenY и MenC непосредственно связаны с белком-носителем посредством CDAP (смотрите WO 95/08348 и WO 96/29094). В одном воплощении все капсульные сахариды N.meningitidis конъюгированы со столбнячным анатоксином. В одном воплощении отношение сахарида MenW и/или Y к белку-носителю составляет от 1:0,5 до 1:2 (мас./мас.) и/или отношение сахарида MenC к белку-носителю составляет от 1:0,5 до 1:4 или от 1:0,5 до 1:1,5 (мас./мас.), особенно когда эти сахариды непосредственно связаны с данным белком, возможно с использованием CDAP. В одном воплощении по меньшей мере один капсульный сахарид N. meningitidis (или в общем сахарид) конъюгирован с белком-носителем через линкер, например через бифункциональный линкер. Данный линкер возможно является гетеробифункциональным или гомобифункциональным, имеющим,например, реакционноспособную аминогруппу и реакционноспособную карбоксильную группу, 2 реакционноспособные аминогруппы или 2 реакционноспособные карбоксильные группы. Данный линкер содержит, например, от 4 до 20, от 4 до 12, от 5 до 10 атомов углерода. Возможным линкером являетсяADH. В одном воплощении MenA; MenC или MenA и MenC конъюгированы с белком-носителем (например, со столбнячным анатоксином) через линкер. В одном воплощении по меньшей мере один сахарид N. meningitidis конъюгирован с белкомносителем через линкер с использованием CDAP и EDAC. Например MenA; MenC или MenA и MenC конъюгированы с белком через линкер (например, с двумя гидразиновыми группами на его концах, такой как ADH) с использованием CDAP и EDAC, как описано выше. Например, CDAP используется для конъюгирования сахарида с линкером, и EDAC используется для конъюгирования линкера с белком. Возможно, конъюгирование через линкер приводит к соотношению сахарида к белку-носителю от 1:0,5 до 1:6; от 1:1 до 1:5 или от 1:2 до 1:4, для MenA; MenC или MenA и MenC. В одном воплощении капсульный сахарид MenA, когда он присутствует, по меньшей мере, частично О-ацетилирован, так что по меньшей мере 50, 60, 70, 80, 90, 95 или 98% повторяющихся единиц Оацетилированы по меньшей мере по одному положению. О-ацетилирование, например, присутствует по меньшей мере в положении О-3 у по меньшей мере 50, 60, 70, 80, 90, 95 или 98% повторяющихся единиц. В одном воплощении капсульный сахарид MenC, когда он присутствует, по меньшей мере, частично О-ацетилирован, так что по меньшей мере 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95 или 98% (29)-связанных повторяющихся единиц NeuNAc О-ацетилированы по меньшей мере по одному или по двум положениям. О-ацетилирование, например, присутствует в положении O-7 и/или О-8 по меньшей мере 30, 40, 50,60, 70, 80, 90, 95 или 98% повторяющихся единиц. В одном воплощении капсульный сахарид MenW, когда он присутствует, по меньшей мере, частично О-ацетилирован, так что по меньшей мере 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95 или 98% повторяющихся единиц О-ацетилированы по меньшей мере по одному или по двум положениям. О-ацетилирование, например, присутствует в положении О-7 и/или О-9 по меньшей мере 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95 или 98% повторяющихся единиц. В одном воплощении капсульный сахарид MenY, когда он присутствует, по меньшей мере, частично О-ацетилирован, так что по меньшей мере 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95 или 98% повторяющихся единиц О-ацетилированы по меньшей мере по одному или по двум положениям. О-ацетилирование присутствует в положении 7 и/или 9 по меньшей мере 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95 или 98% повторяющихся единиц. Процент О-ацетилирования относится к процентному содержанию повторяющихся единиц, содержащих О-ацетилирование. Его можно измерить в сахариде перед конъюгированием и/или после конъюгирования. В одном воплощении данного изобретения иммуногенная композиция, присутствующий сахарид или каждый присутствующий капсульный сахарид N. meningitidis конъюгированы с ТТ. В другом воплощении каждый капсульный сахарид N. meningitidis по отдельности конъюгирован с отдельным белком-носителем. В другом воплощении каждый конъюгат капсульного сахарида N. meningitidis имеет соотношение сахарид:носитель 1:5-5:1 или 1:1-1:4 (мас./мас.). В другом воплощении по меньшей мере-7 012528 один, два или три конъюгат(а) капсульного сахарида N. meningitidis непосредственно конъюгированы с белком-носителем. В другом воплощении MenW и/или MenY, MenW и/или MenC, MenY и/или MenC,или MenW и MenC, и MenY непосредственно конъюгированы с белком-носителем. В другом воплощении по меньшей мере один, два или три конъюгат(а) сахарида N. meningitidis непосредственно конъюгированы посредством CDAP-химии. В другом воплощении отношение сахарида MenW и/или Y к белкуносителю составляет от 1:0,5 до 1:2 (мас./мас.). В другом воплощении отношение сахарида MenC к белку-носителю составляет от 1:0,5 до 1:2 (мас./мас.). В другом воплощении по меньшей мере один, два или три капсульный(х) сахарид(а) N. meningitidis конъюгирован(ы) с белком-носителем через линкер (который может быть бифункциональным, например имеющим две реакционноспособные аминогруппы (такой как ADH) или две реакционноспособные карбоксильные группы, или реакционноспособную аминогруппу на одном конце и реакционноспособную карбоксильную группу на другом). Линкер может иметь от 4 до 12 атомов углерода. В другом воплощении определенный или каждый капсульный сахарид N.meningitidis, конъюгированный через линкер, конъюгирован с линкером при помощи CDAP-химии. В другом воплощении белок-носитель конъюгирован с линкером с использованием карбодиимидной химии, например с использованием EDAC. В другом воплощении определенный или каждый капсульный сахарид N. meningitidis конъюгирован с линкером до конъюгации белка-носителя с данным линкером. В другом воплощении MenA конъюгирован с белком-носителем через линкер (отношение сахарида MenA к белку-носителю может составлять от 1:2 до 1:5 (мас./мас В другом воплощении MenC конъюгирован с белком-носителем через линкер (отношение сахарида MenC к белку-носителю может составлять от 1:2 до 1:5 (мас./мас Авторы данного изобретения также отметили, что центром внимания в данной области было использование олигосахаридов для простоты получения конъюгатов. Авторы данного изобретения обнаружили, что используя нативные или слегка отсортированные по размеру полисахаридные конъюгаты,можно получить одно или более чем одно из следующих преимуществ: 1) конъюгат, обладающий высокой иммуногенностью, который фильтруется через 0,2 мкм фильтр; 2) можно усилить иммунную память(как в примере три); 3) изменение отношения полисахарида к белку в конъюгате, так что отношение полисахарида к белку (мас./мас.) в конъюгате может быть увеличенным (это может привести к уменьшению эффекта супрессии носителем); 4) иммуногенные конъюгаты, склонные к гидролизу (такие как конъюгаты MenA), можно стабилизировать, используя для конъюгирования более крупные полисахариды. Применение более крупных полисахаридов может приводить к большему поперечному связыванию с носителем конъюгата и может уменьшать высвобождение свободного сахарида из данного конъюгата. В конъюгатных вакцинах, описанных в предшествующем уровне техники, имеется тенденция к деполимеризации полисахаридов перед конъюгированием для улучшения конъюгирования. Авторы настоящего изобретения обнаружили, что менингококковые (или сахаридные) конъюгатные вакцины, сохраняющие больший размер сахарида, могут обеспечить хороший иммунный ответ против менингококкового заболевания. Иммуногенная композиция по данному изобретению, таким образом, может содержать один или более чем один сахаридный конъюгат, где средний размер каждого сахарида перед конъюгированием составляет более 50, 75, 100, 110, 120 или 130 кДа. В одном воплощении конъюгат после конъюгирования должен быть легко фильтруемым через фильтр 0,2 мкм так, что после фильтрации получается выход более 50, 60, 70, 80, 90 или 95% относительно данного образца до фильтрации. В частности, иммуногенная композиция по данному изобретению содержит капсульные сахаридыN. meningitidis по меньшей мере одной, двух, трех или четырех серогрупп А, С, W и Y, конъюгированные с белком-носителем, где средний размер (среднемассовая молекулярная масса; Mw) по меньшей мере одного, двух, трех или четырех, или каждого сахарида N. meningitidis составляет более 50, 60, 75, 100,110, 120 или 130 кДа. Иммуногенная композиция может содержать капсульные сахариды N. meningitidis из по меньшей мере одной, двух, трех или четырех серогрупп А, С, W и Y, конъюгированные с белком-носителем, где по меньшей мере один, два, три или четыре, или каждый сахарид N. meningitidis представляет собой либо нативный сахарид, либо уменьшенный вплоть до 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 раз по отношению к среднемассовой молекулярной массе нативного полисахарида. Для целей данного изобретения термин нативный полисахарид относится к сахариду, который не был подвергнут процессу, целью которого является уменьшение размера данного сахарида. Размер полисахарида может слегка уменьшаться в размере в процессе обычных процедур очистки. Такой сахарид все еще является нативным. Только если полисахарид был подвергнут процедурам уменьшения размера,данный полисахарид не рассматривается как нативный. Для целей данного изобретения выражение уменьшенный вплоть до 2 раз означает, что данный сахарид подвергнут процессу, предназначенному для уменьшения размера данного сахарида, но сохранения размера, равного более чем половине размера нативного полисахарида. х 3, х 4 и т.д. следует интерпретировать аналогично, т.е. сахарид подвергнут процессу, предназначенному для уменьшения размера данного полисахарида, но для сохранения размера, равного более чем трети, четверти и т.д. размера нативного полисахарида.-8 012528 В одном аспекте данного изобретения иммуногенная композиция содержит капсульные сахаридыN. meningitidis по меньшей мере одной, двух, трех или четырех серогрупп А, С, W и Y, конъюгированные с белком-носителем, где по меньшей мере один, два, три или четыре, или каждый сахарид N. meningitidis представляет собой нативный полисахарид. В одном аспекте данного изобретения иммуногенная композиция содержит капсульные сахаридыN. meningitidis из по меньшей мере одной, двух, трех или четырех серогрупп А, С, W и Y, конъюгированные с белком-носителем, где по меньшей мере один, два, три или четыре, или каждый сахарид N.meningitidis уменьшен вплоть до 1,5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 раз. Иммуногенные композиции по изобретению возможно содержат конъюгаты капсульного сахаридаN. meningitidis серогруппы С (MenC), капсульного сахарида серогруппы А (MenA), капсульного сахарида серогруппы W135 (MenW), капсульного сахарида серогруппы Y (MenY), капсульных сахаридов серогрупп С и Y (MenCY), капсульных сахаридов серогрупп С и А (MenAC), капсульных сахаридов серогрупп С и W (MenCW), капсульных сахаридов серогрупп А и Y (MenAY), капсульных сахаридов серогрупп А иW (MenAW), капсульных сахаридов серогрупп W и Y (MenWY), капсульных сахаридов серогрупп А, С иW (MenACW), капсульных сахаридов серогрупп А, С и Y (MenACY); капсульных сахаридов серогруппA, W135 и Y (MenAWY), капсульных сахаридов серогрупп С, W135 и Y (MenCWY); или капсульных сахаридов серогрупп А, С, W135 и Y (MenACWY). Это является определением одной, двух, трех или четырех или по меньшей мере одной из серогрупп А, С, W и Y или каждого сахарида N. meningitidis,когда они упоминаются в данном описании изобретения. В одном воплощении средний размер по меньшей мере одного, двух, трех, четырех или каждого сахарида N. Meningitides составляет от 50 до 1500 кДа, от 50 до 500 кДа, от 50 до 300 кДа, от 101 до 1500 кДа, от 101 до 500 кДа, от 101 до 300 кДа при определении с помощью MALLS (многоугольный детектор рассеивания лазерного света). В одном воплощении сахарид MenA, когда он присутствует, имеет молекулярную массу 50-500 кДа, 50-100 кДа, 100-500 кДа, 55-90 кДа, 60-70 кДа или 70-80 кДа, или 60-80 кДа. В одном воплощении сахарид MenC, когда он присутствует, имеет молекулярную массу 100-200 кДа, 50-100 кДа, 100-150 кДа, 101-130 кДа, 150-210 кДа или 180-210 кДа. В одном воплощении сахарид MenY, когда он присутствует, имеет молекулярную массу 60-190 кДа, 70-180 кДа, 80-170 кДа, 90-160 кДа, 100-150 кДа или 110-140 кДа, 50-100 кДа, 100-140 кДа, 140-170 кДа или 150-160 кДа. В одном воплощении сахарид MenW, когда он присутствует, имеет молекулярную массу 60-190 кДа, 70-180 кДа, 80-170 кДа, 90-160 кДа, 100-150 кДа, 110-140 кДа, 50-100 кДа или 120-140 кДа. Молекулярная масса или средняя молекулярная масса сахарида в данном описании изобретения относится к среднемассовой молекулярной массе (Mw) сахарида, измеренной перед конъюгированием и измеренной посредством MALLS. Методика MALLS хорошо известна в данной области и ее обычно проводят, как описано в примере 2. Для MALLS-анализа менингококковых сахаридов можно использовать две колонки (TSKG6000 и 5000PWxl) в комбинации, и сахариды элюируют в воде. Сахариды определяют с использованием детектора рассеивания света (например, Wyatt Dawn DSP, оснащенный 10 мВт аргоновым лазером, при 488 нм) и инферометрического рефрактометра (например, Wyatt Otilab DSP, оснащенный ячейкой Р 100 и красным фильтром, при 498 нм). В одном воплощении сахариды N. meningitidis представляют собой нативные полисахариды или нативные полисахариды, у которых размер уменьшился в процессе обычного экстрагирования. В одном воплощении сахариды N. meningitidis доводят до заданного размера механическим расщеплением, например микрофлюидизацией или обработкой ультразвуком. Преимуществом микрофлюидизации или обработки ультразвуком является снижение размера более крупных нативных полисахаридов в степени, достаточной для того, чтобы обеспечить фильтруемый конъюгат (например, через фильтр 0,2 мкм). Уменьшение размера осуществляется не более чем в 20, 10, 8, 6, 5, 4, 3, 2 или 1,5. В одном воплощении иммуногенная композиция содержит конъюгаты N. meningitidis, которые получают из смеси нативных полисахаридов и сахаридов, размер которых уменьшают не более чем в 20 раз. Например, сахариды из MenC и/или MenA являются нативными. Например, сахариды из MenY и/илиMenW уменьшают не более чем в 20, 10, 8, 6, 5, 4, 3 или 2 раза. Например, иммуногенная композиция содержит конъюгат, полученный из MenY, и/или MenW, и/или MenC, и/или MenA, которые уменьшают не более чем в 10 раз и/или микрофлюидизируют. Например, иммуногенная композиция содержит конъюгат, полученный из нативного MenA, и/или MenC, и/или MenW, и/или MenY. Например, иммуногенная композиция содержит конъюгат, полученный из нативного MenC. Например, иммуногенная композиция содержит конъюгат, полученный из нативного MenC и MenA, которые уменьшают не более чем в 10 раз и/или микрофлюидизируют. Например, иммуногенная композиция содержит конъюгат, полученный из нативного MenC и MenY, который уменьшают не более чем в 10 раз и/или микрофлюидизируют. В одном воплощении полидисперсность сахарида составляет 1-1,5, 1-1,3, 1-1,2, 1-1,1 или 1-1,05 и,после конъюгирования с белком-носителем, полидисперсность конъюгата составляет 1,0-2,5, 1,0-2,0, 1,01,5, 1,0-1,2, 1,5-2,5, 1,7-2,2 или 1,5-2,0. Все измерения полидисперсности проводят посредством MALLS.-9 012528 Сахариды, возможно, уменьшают вплоть до 1,5, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 или 20 раз от размера полисахарида, выделенного из бактерии. В одном воплощении каждый сахарид N. meningitidis является либо нативным полисахаридом, либо уменьшен не более чем в 10 раз. В другом воплощении каждый капсульный сахарид N. meningitidis является нативным полисахаридом. В другом воплощении по меньшей мере один, два, три или четыре капсульный(х) сахарид(а) N. meningitidis уменьшают микрофлюидизацией. В еще одном воплощении каждый капсульный сахарид N. meningitidis уменьшают не более чем в 10 раз. В еще одном воплощении конъюгаты N. meningitidis получены из смеси нативных полисахаридов и сахаридов, которые уменьшают не более чем в 10 раз. В еще одном воплощении капсульный сахарид из серогруппы Y уменьшают не более чем в 10 раз. В еще одном воплощении капсульные сахариды из серогрупп А и С представляют собой нативные полисахариды, и сахариды из серогрупп W135 и Y уменьшены не более чем в 10 раз. В еще одном воплощении средний размер каждого капсульного сахарида N. meningitidis составляет от 50 до 300 кДа или от 50 до 200 кДа. В еще одном воплощении иммуногенная композиция содержит капсульный сахарид MenA, имеющий средний размер более 50, 75, 100 кДа, или средний размер 50-100 кДа,или 55-90 кДа, или 60-80 кДа. В еще одном воплощении иммуногенная композиция содержит капсульный сахарид MenC, имеющий средний размер более 50, 75, 100 или 100-200 кДа, 100-150 кДа, 80-120 кДа, 90-110 кДа, 150-200 кДа, 120-240 кДа, 140-220 кДа, 160-200 кДа или 190-200 кДа. В еще одном воплощении иммуногенная композиция содержит капсульный сахарид MenY, имеющий средний размер более 50, 75, 100 или 60-190 кДа, или 70-180 кДа, или 80-170 кДа, или 90-160 кДа, или 100-150 кДа, 110145 кДа, или 120-140 кДа. В еще одном воплощении иммуногенная композиция содержит капсульный сахарид MenW, имеющий средний размер более 50, 75, 100, или 60-190 кДа, или 70-180 кДа, или 80-170 кДа, или 90-160 кДа, или 100-150 кДа, 140-180 кДа, 150-170 кДа или 110-140 кДа. Иммуногенная композиция по изобретению может содержать капсульный сахарид Н. influenzae b(Hib), конъюгированный с белком-носителем. Он может быть конъюгирован с белком-носителем, выбранным из группы, состоящей из ТТ, DT, CRM197, фрагмента С из ТТ и протеина D, например ТТ. Сахарид Hib может быть конъюгирован с одним и тем же белком-носителем, что и по меньшей мере один,два, три или все конъюгаты капсульных сахаридов N. meningitidis, например ТТ. Отношение Hib к белкуносителю в конъюгате капсульного сахарида Hib может составлять от 1:5 до 5:1 (мас./мас.), например от 1:1 до 1:4, от 1:2 до 1:3,5 или около 1:3 (мас./мас.). Капсульный сахарид Hib может быть конъюгирован с белком-носителем через линкер (смотрите выше). Данный линкер может быть бифункциональным (с двумя реакционноспособными аминогруппами, такими как ADH, или с двумя реакционноспособными карбоксильными группами, или с реакционноспособной аминогруппой на одном конце и реакционноспособной карбоксильной группой на другом конце). Он может иметь от 4 до 12 атомов углерода. Сахарид Hib может быть конъюгирован с белком-носителем или с линкером с использованием CNBr илиCDAP. Белок-носитель может быть конъюгирован с сахаридом Hib через линкер с использованием способа, включающего карбодиимидную химию, например химию EDAC (таким образом используя карбоксильную химическую группу на носителе). Доза Hib-сахаридного конъюгата может составлять от 0,1 до 9 мкг, от 1 до 5 мкг или от 2 до 3 мкг сахарида. В еще одном воплощении иммуногенная композиция по изобретению содержит Hib-сахаридный конъюгат и по меньшей мере два конъюгата сахаридов N. meningitidis, где Hib-конъюгат присутствует с меньшей сахаридной дозой, чем средняя сахаридная доза по меньшей мере двух конъюгатов сахаридовN. meningitidis. Альтернативно, Hib-конъюгат присутствует с меньшей сахаридной дозой, чем сахаридная доза каждого из по меньшей мере двух конъюгатов сахаридов N. meningitidis. Например, доза Hibконъюгата может быть по меньшей мере на 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70 или 80% ниже, чем средняя или наименьшая сахаридная доза по меньшей мере двух дополнительных конъюгатов сахаридов N. meningitidis. Среднюю дозу определяют, складывая дозы всех дополнительных сахаридов и деля на число дополнительных сахаридов. Дополнительные сахариды представляют собой все сахариды, присутствующие в иммуногенной композиции, кроме Hib, и могут включать капсульные сахариды N. meningitidis. Доза представляет собой количество иммуногенной композиции или вакцины, которое вводят человеку.Hib-сахарид представляет собой полирибозилфосфатный (PRP) капсульный полисахарид Haemophilus influenzae типа b или производный от него олигосахарид. Подразумевается, что "по меньшей мере два дополнительных бактериальных сахаридных конъюгата" означают два дополнительных бактериальных сахаридных конъюгата помимо Hib-конъюгата. Два дополнительных бактериальных конъюгата могут включать конъюгаты капсульных сахаридов N. meningitidis. Иммуногенные композиции по данному изобретению могут содержать дополнительные сахаридные конъюгаты, происходящие от одного или более чем одного из: Neisseria meningitidis, Streptococcus pneumoniae, стрептококков группы А, стрептококков группы В, S. typhi, Staphylococcus aureus или Staphylococcus epidermidis. В одном воплощении иммуногенная композиция содержит капсульные сахариды,происходящие из одной или более чем одной из серогрупп А, С, W135 и Y Neisseria meningitidis. Еще одно воплощение включает капсульный сахарид, происходящий от Streptococcus pneumoniae. Пневмо- 10012528 кокковые капсульные сахаридные антигены возможно выбраны из серотипов 1, 2, 3, 4, 5, 6 А, 6 В, 7F, 8,9N, 9V, 10 А, 11 А, 12F, 14, 15 В, 17F, 18 С, 19 А, 19F, 20, 22F, 23F и 33F (возможно из серотипов 1, 3, 4, 5,6 В, 7F, 9V, 14, 18 С, 19F и 23F). Еще одно воплощение включает капсульные сахариды Staphylococcusaureus типа 5, типа 8 или 336. Еще одно воплощение включает капсульные сахариды Staphylococcus epidermidis типа I, типа II или типа III. Еще одно воплощение включает сахарид Vi из S. typhi. Еще одно воплощение включает капсульные сахариды типа la, типа Ic, типа II, типа III или типа V стрептококка группы В. Еще одно воплощение включает капсульные сахариды стрептококка группы А, возможно дополнительно содержащие по меньшей мере один протеин М и возможно различные типы протеина М. Иммуногенные композиции по данному изобретению также могут содержать вакцину DTPa илиDTPw (например, вакцину, содержащую DT, ТТ и либо цельноклеточную вакцину против коклюша (Pw),либо бесклеточную вакцину против коклюша (Ра) (содержащую, например, анатоксин коклюша, FHA(филаментозный гемагглютинин), пертактин и, возможно, агглютиногены 2 и 3). Такие комбинации также могут содержать вакцину против гепатита В (например, она может содержать поверхностный антиген вируса гепатита В [НерВ], возможно адсорбированный на фосфате алюминия). В одном воплощении иммуногенная композиция по изобретению содержит вакцину DTPwHepBHibMenAC, где компонент HibMenAC является таким, как описано выше. Иммуногенные композиции по изобретению возможно содержат дополнительные вирусные антигены, обеспечивающие защиту против заболевания, вызываемого вирусами кори и/или свинки и/или краснухи и/или ветряной оспы. Например, иммуногенная композиция по данному изобретению содержит антигены вирусов кори, свинки и краснухи (MMR), или кори, свинки, краснухи и ветряной оспы(MMRV). В одном воплощении эти вирусные антигены возможно присутствуют в том же контейнере,что и менингококковый(е) и/или Hib-сахаридный(е) конъюгат(ы). В одном воплощении эти вирусные антигены являются лиофилизированными. В одном воплощении иммуногенная композиция по изобретению дополнительно содержит антигенN. meningitidis серогруппы В. Данный антиген возможно представляет собой капсульный полисахарид N.meningitidis серогруппы В (MenB) или уменьшенный полисахарид, или производный от него олигосахарид, который может быть конъюгирован с белковым носителем. Антиген возможно представляет собой препарат везикул наружной мембраны N. meningitidis серогруппы В, как описано в ЕР 301992, WO 01/09350, WO 04/14417, WO 04/14418 and WO 04/14419. В общем случае иммуногенная композиция по изобретению может содержать дозу каждого сахаридного конъюгата от 0,1 до 20 мкг, от 2 до 10 мкг, от 2 до 6 мкг или от 4 до 7 мкг сахарида. В одном воплощении иммуногенная композиция по изобретению содержит каждый капсульный сахарид N. meningitidis в дозе 0,1-20 мкг; 1-10 мкг; 2-10 мкг, 2,5-5 мкг, около или точно 5 мкг; или около или точно 2,5 мкг. В одном воплощении иммуногенная композиция по изобретению содержит MenA,MenC, MenW и MenY (возможно конъюгированные со столбнячным анатоксином) в дозах 2,5, 2,5, 2,5 и 2,5 мкг соответственно, 5, 5, 5, и 5 мкг соответственно, или 5, 5, 2,5 и 2,5 мкг соответственно. В одном воплощении иммуногенная композиция по изобретению, например, содержит Hibсахаридный конъюгат с сахаридной дозой от 0,1 до 9 мкг; от 1 до 5 мкг или от 2 до 3 мкг, либо около или точно 2,5 мкг. В другом воплощении иммуногенная композиция по изобретению, например, содержитHib-сахаридный конъюгат с сахаридной дозой от 0,1 до 9 мкг; от 1 до 5 мкг или от 2 до 3 мкг, либо около или точно 2,5 мкг, и каждый из конъюгатов полисахаридов N. meningitides с сахаридной дозой от 2 до 20 мкг, от 3 до 10 мкг или от 4 до 7 мкг, либо около или точно 5 мкг. Для целей данного изобретения выражение около или приблизительно определяет значение,которое больше или меньше приведенной цифры не более чем на 10%. В одном воплощении иммуногенная композиция по изобретению может содержать сахаридную дозу Hib-сахаридного конъюгата, которая, например, составляет менее 90, 80, 75, 70, 60, 50, 40, 30, 20 или 10% от средней сахаридной дозы по меньшей мере двух, трех, четырех или каждого из конъюгатов сахаридов N. meningitidis. Сахаридная доза Hib-сахарида, например, составляет от 20 до 60%, от 30 до 60%,от 40 до 60% либо около или точно 50% от средней сахаридной дозы по меньшей мере двух, трех, четырех или каждого из конъюгатов сахаридов N. meningitidis. В одном воплощении иммуногенная композиция по данному изобретению содержит сахаридную дозу Hib-сахаридного конъюгата, которая, например, составляет менее 90, 80, 75, 70, 60, 50%, 40, 30, 20 или 10% от наименьшей сахаридной дозы по меньшей мере двух, трех, четырех или каждого из конъюгатов сахаридов N. meningitidis. Сахаридная доза Hib-сахарида, например, составляет от 20 до 60%, от 30 до 60%, от 40 до 60% либо около или точно 50% от наименьшей сахаридной дозы по меньшей мере двух,трех, четырех или каждого из конъюгатов сахаридов N. meningitidis. В одном воплощении изобретения сахаридная доза каждого из по меньшей мере двух, трех, четырех или каждого из конъюгатов сахарида N. meningitidis возможно является одинаковой или приблизительно одинаковой. Примерами иммуногенных композиций по изобретению являются композиции, состоящие из или включающие: Конъюгат Hib и конъюгат MenA и конъюгат MenC, возможно с соотношениями сахаридных доз- 11012528 1:2:2, 1:2:1, 1:4:2, 1:6:3, 1:3:3, 1:4:4, 1:5:5, 1:6:6 (мас./мас.). Возможно сахаридная доза MenA выше, чем сахаридная доза MenC. Конъюгат Hib и конъюгат MenC и конъюгат MenY, возможно с соотношениями сахаридных доз 1:2:2, 1:2:1, 1:4:2, 1:4:1, 1:8:4, 1:6:3, 1:3:3, 1:4:4, 1:5:5, 1:6:6 (мас./мас.). Возможно сахаридная доза MenC выше, чем сахаридная доза MenY. Конъюгат Hib и конъюгат MenC и конъюгат MenW, возможно с соотношениями сахаридных доз 1:2:2, 1:2:1, 1:4:2, 1:4:1, 1:8:4, 1:6:3, 1:3:3, 1:4:4, 1:5:5, 1:6:6 (мас./мас.). Возможно сахаридная доза MenC выше, чем сахаридная доза MenW. Конъюгат Hib и конъюгат MenA и конъюгат MenW, возможно с соотношениями сахаридных доз 1:2:2, 1:2:1, 1:4:2, 1:4:1, 1:8:4, 1:6:3, 1:3:3, 1:4:4, 1:5:5, 1:6:6 (мас./мас.). Возможно сахаридная доза MenA выше, чем сахаридная доза MenW. Конъюгат Hib и конъюгат MenA и конъюгат MenY, возможно с соотношениями сахаридных доз 1:2:2, 1:2:1, 1:4:2, 1:4:1, 1:8:4, 1:6:3, 1:3:3, 1:4:4, 1:5:5, 1:6:6 (мас./мас.). Возможно сахаридная доза MenA выше, чем сахаридная доза MenY. Конъюгат Hib и конъюгат MenW и конъюгат MenY, возможно с соотношениями сахаридных доз 1:2:2, 1:2:1, 1:1:2, 1:4:2, 1:2:4, 1:4:1, 1:1:4, 1:3:6, 1:1:3, 1:6:3, 1:3:3, 1:4:4, 1:5:5, 1:6:6 (мас./мас.). Возможно сахаридная доза MenY выше, чем сахаридная доза MenW.MenA, MenC, MenW и MenY с соотношениями сахаридных доз 1:1:1:1, или 2:1:1:1, или 1:2:1:1, или 2:2:1:1, или 1:3:1:1, или 1:4:1:1 (мас./мас.). Другой аспект данного изобретения представляет собой вакцину, содержащую иммуногенную композицию по изобретению и фармацевтически приемлемый эксципиент. В одном воплощении иммуногенная композиция по изобретению забуферена, или ее значение рН подведено до рН 7,0-8,0, рН 7,2-7,6, либо около или точно рН 7,4. Иммуногенная композиция или вакцины по изобретению возможно лиофилизированы в присутствии стабилизирующего агента, например полиола, такого как сахароза или трегалоза. Возможно иммуногенная композиция или вакцина по изобретению содержит адъювант в количестве, достаточном для усиления иммунного ответа на иммуноген. Подходящие адъюванты включают, без ограничения ими, соли алюминия (фосфат алюминия или гидроксид алюминия), смеси сквалена (SAF-1),мурамилпептид, производные сапонина, препараты клеточной стенки микобактерий, монофосфориллипид А, производные миколевой кислоты, поверхностно-активные вещества на основе неионных блоксополимеров, Quit А, субъединицу В холерного токсина, полифосфазен и производными, и иммуностимулирующие комплексы (ISCOM), например описанные в Takahashi et al. (1990) Nature 344:873-875. Для комбинаций N. meningitidis или HibMen, обсуждавшихся выше, может быть полезно не испрользовать адъювант на основе какой-либо соли алюминия или вообще какой-либо адъювант. Как и в случае всех иммуногенных композиций или вакцин, иммунологически эффективные количества иммуногенов следует определять эмпирически. Факторы, которые следует учитывать, включают иммуногенность, независимо от того, будет или нет иммуноген образовать комплекс или ковалентно связываться с адъювантом, или белком-носителем, или другим носителем, путь введения и число иммунизирующих дозировок, подлежащих введению. Активный агент может присутствовать в фармацевтической композиции или вакцине по данному изобретению в варьирующих концентрациях. Обычно минимальная концентрация вещества представляет собой количество, необходимое для обеспечения его предполагемого использования, в то время как максимальная концентрация представляет собой максимальное количество, которое будет оставаться в растворе или будет гомогенно суспендированным в исходной смеси. Например, минимальным количеством терапевтического агента возможно является количество, которое обеспечит одну терапевтически эффективную дозировку. Для биоактивных веществ минимальная концентрация представляет собой количество, необходимое для биоактивности при переразведении, и максимальная концентрация является точкой, в которой уже не может поддерживаться гомогенная суспензия. В случае однодозовых единиц это количество представляет собой количество для одного терапевтического применения. В общем случае ожидается, что каждая доза будет содержать 1-100 мкг белкового антигена, возможно 5-50 мкг или 525 мкг. Например, дозы бактериальных сахаридов составляют 10-20 мкг, 5-10 мкг, 2,5-5 мкг или 1-2,5 мкг сахарида в конъюгате. Вакцинные препараты по настоящему изобретению можно использовать для защиты или лечения млекопитающего (например, пациента, являющегося человеком), подверженного инфекции, путем введения указанной вакцины системным образом или через слизистую. Пациент, являющийся человеком,возможно представляет собой младенца (до 12 месяцев), ребенка, начинающего ходить (12-24, 12-16 или 12-14 месяцев), ребенка (2-10, 3-8 или 3-5 лет), подростка (12-21, 14-20 или 15-19 лет) или взрослого. Такие введения могут включать инъекцию внутримышечным, внутрибрюшинным, внутрикожным или подкожным путем; или путем введения через слизистую в рот/пищеварительный тракт, в дыхательные пути или мочеполовой тракт. Предпочтительным является интраназальное введение вакцин для лечения пневмонии или среднего отита (так как может быть более эффективно предупреждено носительство пневмококков в носоглотке, и, таким образом, инфекция ослаблена на ее самой ранней стадии). Несмот- 12012528 ря на то, что вакцину по данному изобретению можно вводить в виде одной дозы, ее компоненты также можно вводить совместно в то же самое время или в разное время (например, если в вакцине присутствуют сахариды, их можно вводить отдельно в то же самое время или через 1-2 недели после введения вакцины на основе бактериального белка для оптимальной координации иммунных ответов по отношению друг к другу). Помимо одного пути введения можно использовать 2 разных пути введения. Например, вирусные антигены можно вводить ID (внутрикожно), в то время как бактериальные белки можно вводить IM (внутримышечно) или IN (интраназально). Если присутствуют сахариды, их можно вводитьIM (или ID), и бактериальные белки можно вводить IN (или ID). Кроме того, вакцины по изобретению можно вводить IM для примирующих доз и IN для бустерных доз. Получение вакцин в общем описано в Vaccine Design ("The subunit and adjuvant approach" (eds Powell M.F.Newman M.J.) (1995) Plenum Press New York). Инкапсуляция в липосомах описана Fullerton,патент США 4235877. Другим аспектом данного изобретения является вакцинный набор для совместного или последовательного введения, содержащий две мультивалентные иммуногенные композиции для того, чтобы обеспечить хозяину защиту против заболевания, вызываемого Bordetella pertussis, Clostridium tetani, Corynebacterium diphtheriae и Neisseria meningitidis и, возможно, Haemophilus influenzae. Например, данный набор возможно содержит первый контейнер, содержащий одно или более чем одно из следующего: столбнячный анатоксин (ТТ),дифтерийный анатоксин (DT) и цельноклеточный или бесклеточный коклюшный компонент,и второй контейнер, содержащий: иммуногенную композицию по данному изобретению, как описано выше(например, иммуногенные композиции, содержащие комбинации конъюгатов сахаридов Men или HibMen). Другим аспектом данного изобретения является вакцинный набор для совместного или последовательного введения, содержащий две мультивалентные иммуногенные композиции для обеспечения защиты хозяина против заболевания, вызываемого Streptococcus pneumoniae и Neisseria meningitidis, и возможно Haemophilus influenzae. Например, данный набор возможно содержит первый контейнер, содержащий: один или более чем один конъюгат белка-носителя и капсульного сахарида из Streptococcus pneumoniae [где капсульный сахарид возможно происходит из серотипа пневмококка, выбранного из группы,состоящей из 1, 2, 3, 4, 5, 6 А, 6 В, 7F, 8, 9N, 9V, 10 А, 11 А, 12F, 14, 15 В, 17F, 18 С, 19 А, 19F, 20, 22F, 23F и 33F],и второй контейнер, содержащий: иммуногенную композицию по изобретению, как описано выше (например, иммуногенные композиции, содержащие комбинации конъюгатов сахаридов Men или HibMen). Примеры Hib-конъюгата и конъюгатов полисахаридов N. meningitidis такие, как описано выше. Обычно вакцина на основе Streptococcus pneumoniae в вакцинном наборе по настоящему изобретению (или в любой из иммуногенных композиций по изобретению, описанных выше) будет содержать сахаридные антигены (возможно конъюгированные), где сахариды происходят по меньшей мере из четырех серотипов пневмококков, выбранных из группы, состоящей из 1, 2, 3, 4, 5, 6 А, 6 В, 7F, 8, 9N, 9V,10 А, 11 А, 12F, 14, 15 В, 17F, 18 С, 19 А, 19F, 20, 22F, 23F и 33F. Возможно эти четыре серотипа включают 6 В, 14, 19F и 23F. Возможно в данную композицию включены по меньшей мере 7 серотипов, например,происходящие из серотипов 4, 6 В, 9V, 14, 18 С, 19F и 23F. Возможно в данную композицию включено более 7 серотипов, например по меньшей мере 10, 11, 12, 13 или 14 серотипов. Например, в одном воплощении композиция включает 10 или 11 капсульных сахаридов, происходящих из серотипов 1, 4, 5,6 В, 7F, 9V, 14, 18 С, 19F и 23F и, возможно, 3 (все возможно конъюгированные). В одном воплощении данного изобретения включены по меньшей мере 13 сахаридных антигенов (возможно конъюгированных), хотя в данном изобретении также предполагаются и дополнительные сахаридные антигены, например 23-валентные (например, серотипы 1, 2, 3, 4, 5, 6 В, 7F, 8, 9N, 9V, 10 А, 11 А, 12F, 14, 15 В, 17F,18 С, 19 А, 19F, 20, 22F, 23F и 33F). Пневмококковые сахариды независимо конъюгированы с любым известным белком-носителем, например CRM197, со столбнячным анатоксином, дифтерийным анатоксином, протеином D или с любыми другими белками-носителями, упомянутыми выше. Возможно, вакцинные наборы по изобретению содержат третий компонент. Например, набор возможно содержит первый контейнер, содержащий один или более чем один из столбнячного анатоксина (ТТ),дифтерийного анатоксина (DT) и цельноклеточных или бесклеточных коклюшных компонентов,и второй контейнер, содержащий один или более чем один конъюгат белка-носителя и капсульного сахарида из Streptococcus pneumoniae [где капсульный сахарид возможно происходит из серотипа пневмококка, выбранного из группы,- 13012528 состоящей из 1, 2, 3, 4, 5, 6 А, 6 В, 7F, 8, 9N, 9V, 10 А, 11 А, 12F, 14, 15 В, 17F, 18 С, 19 А, 19F, 20, 22F, 23F и 33F],и третий контейнер, содержащий иммуногенную композицию по данному изобретению, как описано выше (например, иммуногенные композиции, содержащие комбинации конъюгатов сахаридов Men или HibMen). Еще одним аспектом данного изобретения является способ получения иммуногенной композиции или вакцины по изобретению, включающий стадию смешивания сахаридов по изобретению, например смешивания капсульных сахаридов N. meningitidis из по меньшей мере одной, двух, трех или всех четырех серогрупп А, С, W и Y, конъюгированных с белком-носителем, с фармацевтически приемлемым эксципиентом. Еще одним аспектом данного изобретения является способ иммунизации человека-хозяина против заболевания, вызываемого бактериями, например инфекции, вызываемой N. meningitidis и, возможно,Haemophilus influenzae, включающий введение этому хозяину иммунопротективной дозы иммуногенной композиции, или вакцины, или набора по изобретению, возможно используя однократную дозу. Независимым аспектом данного изобретения является способ иммунизации человека-хозяина иммуногенной композицией, содержащей по меньшей мере 2 разных конъюгата капсульных сахаридов N.meningitidis, выбранных из группы, состоящей из серогруппы А, С, W и Y (возможно MenA, С, W и Y),где введение однократной дозы (возможно подросткам, взрослым или детям) приводит к тому, что согласно анализу крови, проведенному через один месяц после введения, имеется более 50, 60, 70, 80, 90 или 95% отвечающих субъектов в анализе SBA, определяющем уровни ответа против MenA, MenC,MenW и/или MenY. Возможно анализ SBA является таким, как описано в примере 9, с отвечающими субъектами, оцениваемыми, как описано в примере 9. Еще одним независимым аспектом данного изобретения является иммуногенная композиция, содержащая конъюгаты MenA, MenC, MenW и/или MenY, которые способны вызывать иммунный ответ после однократной дозы так, что более 50, 60, 70, 80, 90 или 95% инокулированных субъектов-людей(детей, подростков или взрослых) классифицируются как отвечающие субъекты при SBA-анализе крови,взятой через месяц после инокуляции (возможно с использованием критериев, описанных в примере 9). Такая иммуногенная композиция, возможно, имеет дополнительные структурные характеристики,описанные здесь. Еще одним аспектом данного изобретения является иммуногенная композиция по изобретению для применения в лечении или предупреждении заболевания, вызываемого бактериями, например инфекцииN. meningitidis и возможно Haemophilus influenzae. Еще одним аспектом данного изобретения является применение иммуногенной композиции, или вакцины, или набора по изобретению в изготовлении лекарственного средства для лечения или предупреждения заболеваний, вызываемых бактериями, например инфекции N. meningitidis и, возможно, Haemophilus influenzae. Авторы данного изобретения подразумевают, что в данном описании изобретения термины включающий, включают и включает, в каждом случае, возможно заменимы терминами состоящий из,состоят из и состоит из соответственно. Все ссылки или патентные заявки, процитированные в данной патентной заявке, включены в нее посредством ссылки. Изобретение проиллюстрировано в сопровождающих примерах. Примеры, приведенные ниже,осуществляют с использованием стандартных методик, которые хорошо известны и обычны для специалистов в данной области, за исключением тех противоположных случаев, когда они подробно описаны. Данные примеры являются иллюстративными, но не ограничивают данное изобретение. Примеры Пример 1. Получение полисахаридных конъюгатов Ковалентное связывание PRP-полисахарида Haemophilus influenzae (Hib) с ТТ проводили с использованием химии сочетания, разработанной Chu et al. (Infection and Immunity 1983, 40 (1); 245-256). PRPполисахарид Hib активировали путем добавления CNBr и инкубации при рН 10,5 в течение 6 мин. рН снижали до рН 8,75, добавляли дигидразид адипиновой кислоты (ADH), и инкубацию продолжали в течение еще 90 мин. Активированный PRP связывали с очищенным столбнячным анатоксином через карбодиимидную конденсацию, используя 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимид (EDAC). EDAC добавляли к активированному PRP до достижения конечного соотношения 0,6 мг EDAC/мг активированного PRP. рН доводили до 5,0 и добавляли очищенный столбнячный анатоксин до достижения соотношения 2 мг ТТ/мг активированного PRP. Полученный раствор оставляли стоять в течение трех суток при слабом перемешиванием. После фильтрации через 0,45 мкм мембрану, конъюгат очищали на колонке с сефакрилом S500HR (Pharmacia, Sweden), уравновешенной в 0,2 М NaCl. Конъюгаты MenC-ТТ получали, используя нативные полисахариды (более 150 кДа при измерении посредством MALLS), или их слегка микрофлюидизировали. Конъюгаты MenA-ТТ получали, используя либо нативный полисахарид, либо слегка микрофлюидизированный полисахарид с молекулярной массой более 60 кДа, измеренной методом MALLS из примера 2. Конъюгаты MenW и MenY-TT получали, ис- 14012528 пользуя полисахариды, доведенные до размера приблизительно 100-200 кДа, измеренного с помощьюMALLS (см. пример 2). Доведение до заданного размера осуществляли посредством микрофлюидизации с использованием гомогенизирующей установки Emulsiflex C-50. Полисахариды затем фильтровали через фильтр 0,2 мкм. Активацию и связывание проводили, как описано в WO 96/29094 и WO 00/56360. Описывая кратко,полисахарид в концентрации 10-20 мг/мл в 2 М NaCl, pH 5,5-6,0, смешивали с раствором CDAP (100 мг/мл свежеприготовленного раствора в смеси ацетонитрил/WFI, 50/50) до конечного соотношенияCDAP/полисахарид 0,75/1 или 1,5/1. Через 1,5 мин рН увеличивали при помощи гидроксида натрия до рН 10,0. Через три минуты добавляли столбнячный анатоксин до достижения соотношения белок/полисахарид 1,5/1 для MenW, 1,2/1 для MenY, 1,5/1 для MenA или 1,5/1 для MenC. Реакция продолжалась в течение 1-2 ч. После стадии связывания добавляли глицин до конечного соотношения глицин/PS 7,5/1 (мас./мас.) и рН доводили до рН 9,0. Оставляли данную смесь стоять в течение 30 мин. Конъюгат осветляли, используя 10 мкм фильтр Kleenpak, и затем загружали на колонку Sephacryl S400HR, используя буфер для элюирования из 150 мМ NaCl, 10 мМ или 5 мМ Tris, рН 7,5. Клинические партии фильтровали на стерилизующей мембране Opticap 4. Полученные конъюгаты имели среднее отношение полисахарид:белок 1:1-1:5 (мас./мас.). Пример 1 а. Получение конъюгатов полисахаридов MenA и MenC по изобретению. Конъюгаты MenC-ТТ получали, используя нативные полисахариды (более 150 кДа при измерении с помощью MALLS), или их слегка микрофлюидизировали. Конъюгаты MenA-ТТ получали, используя либо нативный полисахарид, либо слегка микрофлюидизированный полисахарид с молекулярной массой более 60 кДа, измеренной методом MALLS из примера 2. Доведение до заданного размера осуществляли посредством микрофлюидизации с использованием гомогенизирующей установки Emulsiflex С-50. Полисахариды затем фильтровали через фильтр 0,2 мкм. Для того чтобы конъюгировать капсульный полисахарид MenA со столбнячным анатоксином через спейсер, использовали следующий способ. Ковалентное связывание полисахарида и спейсера (ADH) проводят при помощи химии связывания, при этом полисахарид в контролируемых условиях активируют цианилирующим агентом, 1-циано-4-диметиламинопиридиния тетрафторборатом (CDAP). Данный спейсер взаимодействует с цианилированным PS через его гидразиновые группы с образованием стабильной изомочевинной связи между спейсером и полисахаридом. 10 мг/мл раствора MenA (рН 6,0) [3,5 г] обрабатывали свежеприготовленным раствором 100 мг/мл(мас./мас.). Через 1,5 мин рН повышали до рН 10,0. Через три минуты добавляли ADH с получением соотношения ADH/MenA 8,9. Понижали рН раствора до 8,75, и продолжали реакцию в течение 2 ч, поддерживая это значение рН (поддерживая температуру 25 С). Раствор PSAAH концентрировали до четверти от его исходного объема и затем подвергали диафильтрации с 30 объемами 0,2 М NaCl, используя мембрану Filtron Omega с порогом отсечения 10 кДа, и ретентат фильтровали. Перед реакцией конъюгирования (карбодиимидная конденсация), раствор очищенного ТТ и растворPSAAH разводили до достижения концентрации 10 мг/мл PSAAH и 10 мг/мл ТТ.EDAC (1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимид) добавляли к раствору PSAAH (2 г сахарида), чтобы достичь конечного соотношения 0,9 мг EDAC/мг PSAAH. рН доводили до 5,0. При помощи перистальтического насоса (за 60 мин) добавляли очищенный столбнячный анатоксин до достижения 2 мг ТТ/мг PSAAH. Полученный раствор оставляли на 60 мин при +25 С при перемешивании с получением конечного времени связывания 120 мин. Раствор нейтрализовали добавлением 1 М Tris-HCl, рН 7,5(1/10 конечного объема) и оставляли стоять в течение 30 мин при +25 С, затем в течение ночи при температуре от +2 до +8 С. Конъюгат осветляли, используя фильтр 10 мкм, и очищали с использованием колонки SephacrylS400HR (Pharmacia, Sweden). Колонку уравновешивали в 10 мМ Tris-HCI (рН 7,0), 0,075 М NaCl, и конъюгат (приблизительно 660 мл) загружали на колонку (температура от +2 до+8 С). Пул элюирования выбирали как функцию оптической плотности при 280 нм. Сбор начинали, когда поглощение возрастало до 0,05. Сбор продолжали, пока Kd не достигал 0,30. Конъюгат стерилизовали фильтрацией при +20 С,затем хранили при температуре от +2 до+8 С. Полученный конъюгат имел соотношение полисахарид:белок 1:2-1:4 (мас./мас.). Для того чтобы конъюгировать капсульный полисахарид MenC со столбнячным анатоксином через спейсер, использовали следующий способ. Ковалентное связывание данного полисахарида и спейсера(ADH) проводят при помощи химии сочетания, при этом полисахарид активируют в контролируемых условиях цианилирующим агентом, 1-циано-4-диметиламино-пиридиния тетрафторборатом (CDAP). Спейсер взаимодействует с цианилированным PS через его гидразиновые группы с образованием стабильной изомочевинной связи между спейсером и полисахаридом. Раствор MenC с концентрацией 20 мг/мл (рН 6,0) (3,5 г) обрабатывали свежеприготовленным рас- 15012528 твором 100 мг/мл CDAP в смеси ацетонитрил/вода (50/50 (об./об. с получением соотношенияCDAP/MenC 1,5 (мас./мас.). Через 1,5 мин рН увеличивали до рН 10,0. При активационной рН добавляли 5 М NaCl до достижения конечной концентрации 2 М NaCl. Через три минуты добавляли ADH до достижения соотношения ADH/MenC 8,9. рН раствора снижали до 8,75, и реакцию продолжали в течение 2 ч(поддерживая температуру 25 С). Раствор PSCAH концентрировали до минимум 150 мл и затем подвергали диафильтрации с 30 объемами 0,2 М NaCl, используя мембрану Filtron Omega с порогом отсечения 10 кДа, и ретентат фильтровали. Перед реакцией конъюгации раствор очищенного ТТ и раствор PSCAH (2 г) разбавляли в 0,2 МNaCl до достижения концентрации 15 мг/мл PSCAH и 20 мг/мл ТТ. Очищенный столбнячный анатоксин добавляли к раствору PSCAH для того, чтобы достигнуть соотношения 2 мг ТТ/мг PSCAH. рН доводили до 5,0. При помощи перистальтического насоса добавлялиEDAC (16,7 мг/мл в Tris 0,1 М рН 7,5) (за 10 мин) до достижения конечного соотношения 0,5 мгEDAC/мг PSCAH. Полученный раствор оставляли стоять в течение 110 мин при+25 С при перемешивании и регулировании рН с получением окончательного времени связывания 120 мин. Раствор затем нейтрализовали добавлением 1 М Tris-HCl рН 9,0 (1/10 конечного объема) и оставляли стоять в течение 30 мин при+25 С, затем в течение ночи при температуре от +2 до +8 С. Конъюгат осветляли, используя 10 мкм фильтр, и очищали, используя колонку Sephacryl S400HR(Pharmacia, Sweden). Колонку уравновешивали в 10 мМ Tris-HCl (pH 7,0), 0,075 М NaCl и на колонку загружали конъюгат (приблизительно 460 мл) (при температуре от +2 до +8 С). Пул элюирования выбирали как функцию оптической плотности при 280 нм. Сбор начинали, когда поглощение возрастало до 0,05. Сбор продолжали, пока Kd не достигал 0,20. Конъюгат стерилизовали фильтрацией при +20 С, затем хранили при температуре от +2 до +8 С. Полученный конъюгат имел соотношение полисахарид:белок 1:2-1:4 (мас./мас.). Пример 2. Определение молекулярной массы с использованием MALLS. Детекторы присоединяли к гель-фильтрационной колонке для ВЭЖХ, из которой элюировали пробы. С одной стороны детектор рассеивания лазерного света измерял интенсивности света, рассеиваемого раствором макромолекул под 16 углами, и с другой стороны интерферометрический рефрактометр, подключенный в сеть, обеспечивал определение величины элюированной пробы. Из этих интенсивностей можно было определить размер и форму макромолекул в растворе. Среднемассовая молекулярная масса (Mw) определяется как сумма масс всех частиц, умноженная на их соответствующую молекулярную массу и деленная на сумму масс всех частиц. а) Среднемассовая молекулярная масса: -Mw б) Среднечисленная молекулярная масса: -Mn в) Среднеквадратический радиус: -Rw- и R2w представляет собой квадрат радиуса, определяемый как(-mi- представляет собой массу рассеивающего центра i, и -ri- представляет собой расстояние между рассеивающим центром i и центром тяжести макромолекулы). г) Полидисперсность определяется как отношение -Mw/Mn-. Менингококковые полисахариды анализировали MALLS путем загрузки на две колонки ВЭЖХ(TSKG6000 и 5000PW1), используемые в комбинации. 25 мкл полисахарида загружали на колонку и элюировали 0,75 мл фильтрованной воды. Полисахариды определяли с использованием детектора рассеивания света (Wyatt Dawn DSP, оснащенного 10 МВт аргоновым лазером, 488 нм) и инферометрического рефрактометра (Wyatt Otilab DSP, оснащенный ячейкой Р 100 и красным фильтром, 498 нм). Полидисперсности молекулярной массы и выходы всех проб рассчитывали способом Дебая (Debye), используя порядок 1 полиномиального приближения в программе Astra 4.72. Пример 3. Клиническое исследование, сравнивающее иммунизацию Meningitec или конъюгатомMenC-ТТ большего размера. Открытое контролируемое исследование, фазу II, проводили для сравнения конъюгатной вакцины менингококковой серогруппы С (MenC) от GSK Biologicals с конъюгатной вакциной Haemophilus influenzae b менингококковой серогруппы С (Hib-MenC) или Meningitec от GSK Biologicals. Каждая дозаMeningitec содержит 10 мкг олигосахарида менингококковой серогруппы С, конъюгированного с 15 мкг CRM197, и производится Wyeth. Конъюгаты GSK MenC содержали нативные полисахариды, приблизительно 200 кДа, конъюгированные со столбнячным анатоксином (ТТ).- 16012528 Данное исследование состояло из пяти групп, каждая из которых, как планировалось, содержала 100 субъектов, распределенных в две параллельные подгруппы следующим образом. В этом настоящем исследовании все субъекты в обеих подгрупах получали одну пятую (1/5) дозыMencevax ACWY и сопутствующую дозу Infanrix hexa в 12-15-месячном возрасте (Месяц исследования 0). У всех субъектов отбирали две пробы крови (Месяц исследования 0 и Месяц ислледования 1). Подгруппа 1 состояла из четырех групп из исследования первичной вакцинации, которые получали первичную иммунизацию в возрасте 3, 4 и 5 месяцев следующими вакцинами: Группа K: MenC (10 мкг), неадсорбированная (non-ads), конъюгат столбнячного анатоксина (ТТ) иInfanrix hexa (MenC10-TT+Infanrix hexa) Группа L: Hib (10 мкг)-MenC (10 мкг), non-ads, конъюгат ТТ и Infanrix penta (Hib10-MenC10TT+Infanrix penta) Группа M: Hib (5 мкг)-MenC (5 мкг), non-ads, конъюгат ТТ и Infanrix penta (Hib5-MenC5TT+Infanrix penta) Группа N: Meningitec и Infanrix hexa (Meningitec+Infanrix hexa) Две группы, вакцинируемых Hib-MenC-TT (группы L и М), в исследовании бустерной иммунизации не имели информации относительно точного препарата вакцины-кандидата. Подгруппа 2 (Группа О) состояла из подобранных по возрасту субъектов, ранее невакцинированных вакциной менингококковой серогруппы С (не подвергавшиеся иммунизации), но которые получали обычные педиатрические вакцины согласно указаниям Постоянной комиссии Германии по иммунизации. Критерии оценки: Иммуногенность: Определение титров бактерицидных антител против менингококков С (SBAMenC) при помощи бактерицидного теста (граничное значение: разведение 1:8) и измерение посредствомELISA антител против менингококков серогруппы С (граничное значение в анализе: 0,3 мкг/мл), полисахарида Hib PRP (граничное значение в анализе: 0,15 мкг/мл) и столбнячного анатоксина (граничное значение в анализе: 0,1 IU (международных единиц)/мл) в пробах крови, полученных перед вакцинацией и приблизительно через один месяц после вакцинации у всех субъектов. Статистические методы: Демографические показатели: Определение среднего возраста в месяцах (со средним диапазоном и стандартным отклонением [SD]), расового и полового состава АТР и общей вакцинированной группы. Иммуногенность: Проводили два анализа иммуногенности на основе группы АТР в отношении иммуногенности (в отношении анализов иммунной памяти и бустерного ответа) или группы АТР в отношении безопасности(в отношении анализа персистентности). Они включали: Оценку иммунной памяти в отношении MenC и бустерного ответа на Hib и столбняк (до и через один месяц после введения 1/5 дозы беспримесной полисахаридной вакцины): Определение среднего геометрического титров и концентраций (GMT и GMC) с 95%-ными доверительными интервалами (95% Cl) Определение процентной доли субъектов с титром/концентрацией антител выше предложенных граничных значений с точным 95%-ным Cl (индексы серопозитивности/серопротекции) Исследование титров/концентрации антител после вакцинации с использованием обратных интегральных кривых Вычисление стандартизированного асимптотического 95%-ного Cl для разницы в индексе серопозитивности/серопротекции между первично иммунизированной группой (группы K, L, М и N) и первично неиммунизированной группой (группа О) Определение среднего геометрического отдельного отношения титра SBA-MenC к концентрации анти-PSC антитела с 95%-ным Cl Определение 95%-ного Cl для соотношения GMT/C после вакцинации между группами K, L, М и контрольной группой N для анти-PRP и антистолбнячных антител и между каждой первично иммунизированной группой (группы K, L, М и N) и первично неиммунизированной группой (группа О) для SBAMenC и анти-PSC антитела с использованием модели ANOVA (дисперсионный анализ).- 17012528 Результаты Таблица 1. Титры SBA-MenC и концентрация анти-PSC антитела после бустерной вакцинации Группа K: субъекты, первично иммунизированные MenC10-ТТ+Infanrix hexa; группа L: субъекты, первично иммунизированные Hib10-MenC10-TT+Infanrix penta; группа М: субъекты, первично иммунизированные Hib5-MenC5-ТТ+ Infanrix penta; группа N: субъекты, первично иммунизированные Meningitec+Infanrix hexa; группа О: контрольные субъекты (т.е. субъекты, первично неиммунизированные конъюгатной вакциной MenC) N: число субъектов с действительными результатами. Более высоких титров анти-MenC антител и более высоких титров SBA достигали при первичной иммунизации конъюгатными вакцинами с полисахаридом MenC большего размера (группы K, L и М) по сравнению с конъюгатной вакциной Meningitec с олигосахаридом. Таблица 2. Среднее геометрическое отношения SBA MenC титр/анти-PSC концентрация Во всех четырех первично иммунизированных группах (группы K, L, М и N) GMR значительно возрастало от момента (до) до момента (после) повторной вакцинации, что указывало на наличие созревания антитела и функциональность. GMR в группе М (первичной иммунизированные Hib5-MenC5-ТТ) было выше, чем в группе N (первично иммунизированные Meningitec). Таблица 3. Персистенция в возрасте 12-15 месяцев непосредственно перед введением бустер-вакцин- 18012528 Группа K: субъекты, первично иммунизированные MenC10-ТТ+Infanrix hexa; группа L: субъекты, первично иммунизированные Hib10-MenC10-ТТ+Infanrix penta; группа М: субъекты, первично иммунизированные Hib5-MenC5-TT+Infanrix penta; группа N: субъекты, первично иммунизированные Meningitec+Infanrix hexa; N: число субъектов с действительными результатами. Более высоких титров SBA против MenC достигали путем первичной иммунизации MenC большего размера (группы K, L и М) по сравнению с первичной иммунизацией MenC-олигосахаридным конъюгатом Meningitec. Иммунологическая память (группа АТР в отношении иммуногенности) Введение 1/5 дозы беспримесной полисахаридной вакцины ACWY вызывало очень высокий титрSBA-MenC во всех четырех первично иммунизированных группах, причем 98,7-100% и 97,5-100% субъектов, первично иммунизированных согласно режиму вакциной-кандидатом, демонстрировали титры 1:8 и 1:128 соответственно. В группе, первично иммунизированной согласно режиму Meningitec,имелась тенденция к меньшей процентной доле субъектов с титрами 1:128 (91,8%). По сравнению с этим, 17,6% первично неиммунизированных субъектов имели титры SBA MenC 1:8 и 1:128. Пример 4. Клиническое исследование, фаза II, конъюгатной вакцины HibMenAC-TT, смешанной сDTPw-HepB/ Дизайн исследования: Открытое, рандомизированное (1:1:1:1:1) одноцентровое исследование с пятью группами. Эти пять групп получали следующий режим вакцинации, соответственно, в возрасте 6, 10 и 14 недель:Tritanrix-HepB/Hib-MenAC 2,5/2,5/2,5: далее упоминаемая как 2,5/2,5/2,5Tritanrix-HepB/Hib-MenAC 2,5/5/5: далее упоминаемая как 2,5/5/5Tritanrix-HepB/Hib-MenAC 5/5/5: далее упоминаемая как 5/5/5Tritanrix-HepB+Hiberix: далее упоминаемая как HiberixTritanrix-HepB/Hiberix+Meningitec: далее упоминаемая как Meningitec Пробы крови отбирали в момент введения первой дозы вакцины (До) и через один месяц после введения третьей дозы вакцины (После дозы 3).Tritanrix представляет собой вакцину DTPw, которую поставляет на рынок GlaxoSmithKline Biologicals S.A. В каждой из пяти групп использовали 105 субъектов, что суммарно составляет 525 субъектов в данном исследовании. Таблица 4. Состав GSK вакцинных препаратов вакцина 2,5/2,5/2,5 представляла собой дозовое разведение вакцины Hib-MenAC 5/5/5 отGSK Biologicais, содержащее по 2,5 мкг каждого из PRP-TT, MenA-ТТ и MenC-ТТ.Hib-MenAC-вакцинные препараты смешивали непосредственно перед применением с TritanrixHepB. Комбинированная вакцина, дифтерия-столбняк-цельноклеточный Bordetella pertussis-гепатит В(DTPw-HB) (Tritanrix-HepB) от GSK Biologicals, содержит не менее 30 международных единиц (IU) дифтерийного анатоксина, не менее 60 IU столбнячного анатоксина, не менее 4 IU убитых клеток Bordetellapertussis и 10 мкг рекомбинантного поверхностного антигена вируса гепатита В. Контрольная терапия, доза, способ введения, номер партии: Режим вакцинации/место: Одна группа получала вакцину Tritanrix-НерВ внутримышечно в левое бедро и Hiberix внутримышечно в правое бедро в возрасте 6, 10 и 14 недель. Другая группа получала вакцину TritanrixHepB/Hiberix внутримышечно в левое бедро и вакцину Meningitec внутримышечно в правое бедро в возрасте 6, 10 и 14 недель. Вакцина/композиция/доза/номер партии: Использованная вакцина Tritanrix-HepB была такой, как описано выше. Одна доза (0,5 мл) конъюгатной вакцины GSK Biologicals Haemophilus influenzae типа b: Hiberix содержала 10 мкг PRP, конъюгированного со столбнячным анатоксином. В группе Hiberix ее смешивали со стерильным разбавителем и в группе Meningitec ее смешивали с Tritanrix-HepB.- 19012528 Одна доза (0,5 мл) вакцины Wyeth Lederle MENINGITEC содержала: 10 мкг капсульного олигосахарида менингококка группы С, конъюгированного с 15 мкг белка Corynebacterium diphtheria CRM197, и алюминий в виде солей. Результаты - иммунные ответы, генерируемые против Hib, MenA и MenC Таблица 5 а. Анти-PRP (мкг/мл) Заключение Сравнение результатов оценки иммуногенности, достигаемых с использованием олигосахариднойMenC-CRM197 конъюгатной вакцины и трех GSK препаратов, которые содержат полисахаридные конъюгаты MenA-ТТ и MenC-ТТ, показало, что полисахаридные Men-конъюгаты могли вызывать хороший иммуногенный ответ, аналогичный ответу, который достигался с использованием олигосахаридной конъюгатной вакцины Meningitec. Все протестированные препараты давали ответ на MenC у 100% пациентов. Пример 5. Клиническое исследование, фаза II, введения Hib MenCY совместно с Infanrix penta согласно режиму введения в возрасте 2, 3 и 4 месяцев. Дизайн исследования: Открытое (частично двойное слепое), рандомизированное, контролируемое многоцентровое исследование, фаза II, с 5 группами, получающими режим первичной вакцинации с тремя дозами вакцин следующим образом: Группа Hib-MenCY 2,5/5/5: Hib-MenCY (2,5/5/5 )+Infanrix penta Группа Hib-MenCY 5/10/10: Hib-MenCY (5/10/10)+Infanrix penta Группа Hib-MenCY 5/5/5: Hib-MenCY (5/5/5)+Infanrix penta Группа Hib-MenC: Hib-MenC (5/5)+Infanrix penta Группа Menjugate: Menjugate+Infanrix hexa (контроль).Hib-MenCY 2,5/5/5, Hib-MenCY 5/10/10 и Hib-MenC вводили двойным слепым образом, в то время как группа Hib-MenCY 5/5/5 и группа Menjugate были открытыми. Препараты Hib-MenCY 2,5/5/5,5/10/10 и 5/5/5 содержат нативные полисахариды MenC и полисахариды MenY, которые микрофлюидизированы.(3,5 мл) от всех субъектов до и через один месяц после первичной вакцинации (месяц исследования 0 и месяц 3). Исследуемая вакцина, доза, способ введения, номер партии: Три дозы инъецировали внутримышечно с одномесячными интервалами приблизительно в возрасте Иммуногенность: Измерение титров/концентраций антител по отношению к каждому антигену вакцины: До первой дозы (месяц 0) и приблизительно через один месяц после третьей дозы (месяц 3) у всех субъектов в отношении: SBA-MenC и SBA-Men Y, анти-PSC и анти-PSY, анти-PRP, анти-Т, анти-FHA,анти-PRN и анти-РТ. Используя сывороточную бактерицидную активность против N. meningitidis серогрупп С и Y (граничное значение для SBA-MenC и SBA-Men Y: 1:8 и 1:128); анализы ELISA с граничными значениями: 0,3 мкг/мл и 2 мкг/мл для антител против полисахаридов N. meningitides серогрупп С и Y (анти-PSC IgG и анти-PSY IgG); 0,15 мкг/мл и 1,0 мкг/мл для Hib-полисахарида полирибозилрибитол-фосфата (IgG анти-PRP); 5EL.U/мл для анти-FHA, анти-PRN, анти-РТ; 0,1 IU/мл антистолбнячного анатоксина (анти-ТТ). Только через один месяц после третьей дозы (месяц 3) у всех субъектов в отношении: анти-D, анти-HBs и анти-полио 1, 2 и 3. Используя анализы ELISA с граничными значениями: 0,1 IU/мл для антидифтерии (анти-D); 10 мIU/мл для антигепатита В (анти-HBs); и граничное значение для теста по микронейтрализации: 1:8 для антител к полиовирусам типа 1, 2 и 3 (антиполио 1, 2 и 3). Статистические методы: Индексы серопротекции/серопозитивности и среднее геометрическое концентраций/титров(GMC/GMT) с 95%-ными доверительными интервалами (95% CI) рассчитывали на группу для SBAMenC, анти-PSC, SBA-MenY, анти-PSY, анти-PRP, антистолбнячного антитела, анти-РТ, анти-FHA и анти-PRN до или через один месяц после вакцинации; для антидифтерийного антитела, анти-HBs, антиПолио 1, анти-Полио 2 и анти-Полио 3 - через один месяц после вакцинации. Также рассчитывали ответ на вакцину (появление антител у субъектов, которые исходно были серонегативными, или, по меньшей мере, поддержание концентраций антител у субъектов, которые исходно были серопозитивными) с 95%Cl для анти-РТ, анти-PRN и анти-FHA через один месяц после вакцинации. Также представлены обратные интегральные кривые для каждого антитела на 3 месяц. Различия между группами Hib-MenCY иHib-MenC по сравнению с контрольной группой Menjugate оценивали исследовательским образом для каждого антитела, за исключением SBA-MenY и анти-PSY, в показателях (1) различия между группойMenjugate (минус) и группами Hib-MenCY и Hib-MenC в отношении процентной доли субъектов,имеющих значения выше указанных граничных значений, или с ответом на вакцину с их стандартизированным асимптотическим 95% CI, (2) GMC или GMT отношений группы Menjugate к группам HibMenCY и Hib-MenC с их 95% Cl. Те же самые сравнения провели для оценки различия между каждой парой препаратов Hib-MenCY для анти-PRP, SBA-MenC, анти-PSC, SBA-MenY, анти-PSY и анти-ТТ антител. Общий процент местных и общих стимулированных симптомов рассчитывали на группу согласно типу симптома, их интенсивности и отношению к вакцинации (как процентные количества субъектов,для которых сообщалось об общих, местных и любых стимулированных симптомах в пределах 8 суток после вакцинации, и их точные 95% Cl). Проценты нестимулированных симптомов рассчитывали на группу. Для симптомов уровня 3 указывали начало 48 ч, медицинскую помощь, продолжительность,отношение к вакцинации и результаты. Серьезные нежелательные явления описывали полностью. Индексы серопротекции/серопозитивности и GMC/T (группа АТР в отношении иммуногенности) Таблица 7 а. Анти-PRP (мкг/мл)LL = нижняя граница; UL = верхняя граница. Заключение Конъюгаты полисахаридов MenC и Y вызывали хороший иммунный ответ у всех субъектов, причем у 100% субъектов продуцировались более чем 0,3 мкг/мл ответы против MenC и MenY.- 22012528 Пример 6. Клиническое исследование, фаза II, сравнивающее три препарата MenACWY-TT с Meningitec MenC-CRM197 олигосахарид-конъюгатной вакциной. В этом примере описывается фаза II открытого (частично слепого), рандомизированного исследования с контролируемым интервалом доз для оценки иммуногенности трех разных препаратов конъюгатной вакцины с менингококками серогрупп А, С, W-135, Y и столбнячным анатоксином (MenACWYTT) от GlaxoSmithKline Biologicals по сравнению с MenC олигосахарид-СРМ 197 конъюгатной вакциной(Meningitec), при введении в виде одной дозы детям в возрасте 12-14 месяцев. Данное клиническое исследование было открытым (частично двойным слепым), контролируемым,многоцентровым исследованием, в котором подходящих субъектов в возрасте 12-14 месяцев рандомизировали (1:1:1:1) в одну из четырех параллельных групп из 50 субъектов для получения однократной первичной дозы при посещении 1 следующим образом: Форма 1 Т: MenACWY-TT с дозой 2,5 мкг MenA-полисахарида, конъюгированного со столбнячным анатоксином (ТТ), 2,5 мкг МепС-полисахарида, конъюгированного с ТТ, 2,5 мкг MenW-полисахарида,конъюгированного с ТТ, и 2,5 мкг MenY-полисахарида, конъюгированного с ТТ. Форма 2 Т: MenACWY-TT с дозой 5 мкг MenA-полисахарида, конъюгированного с ТТ, 5 мкг MenCполисахарида, конъюгированного с ТТ, 5 мкг MenW-полисахарида, конъюгированного с ТТ, и 5 мкгMenC-полисахарида, конъюгированного с ТТ, 2,5 мкг MenW-полисахарида, конъюгированного с ТТ, и 2,5 мкг MenY-полисахарида, конъюгированного с ТТ. Контроль Т: 10 мкг MenC-олигосахарида, конъюгированного с 12,5-25 мкг CRM197(Meningitec). Три разных препарата MenACWY-TT вводили двойным слепым способом. Режим вакцинации/место: Одну дозу вакцины вводили внутримышечно в левую дельтовидную мышцу при посещении 1 (месяц исследования 0) согласно рандомизированному назначению. Все вакцины-кандидаты поставляли в виде лиофилизированных осадков в сосуде для одной дозы (0,5 мл после растворения поставляемым разбавителем - физиологическим раствором). Иммуногенность: Измерение титров/концентраций антител против антигенных компонентов менингококковой вакцины в пробах крови, полученных до исследования дозы вакцины (месяц 0) и приблизительно через один месяц после исследования дозы вакцины (месяц 1) у всех субъектов. Определение титров бактерицидного антитела против N. meningitidis серогрупп А, С, W-135 и Y (SBA-MenA, SBA-MenC, SBA-MenW иSBA-MenY) при помощи бактерицидного теста (граничные значения в анализе: разведение 1:8 и 1:128) и измерение при помощи ELISA антител против N. meningitidis серогрупп А, С, W-135 и Y (анти-PSA, анти-PSC, анти-PSW и анти-PSY, граничные значения в анализе 0,3 мкг/мл и 2 мкг/мл) и против столбнячного анатоксина (анти-столбнячное, граничное значение в анализе 0,1 IU/мл). Результаты Ответ антител в показателях процентного количества отвечающих SBA-MenA, SBA-MenC, SBAMenW и SBA-MenY субъектов через один месяц после вакцинации (первичная конечная точка) показан в табл. 8. Ответ определяется как больше или равный 4-кратному увеличению для серопозитивных субъектов или сероконверсии для серонегативных субъектов перед вакцинацией. Таблица 8. Ответы на вакцину для SBA-антитела через один месяц после вакцинации В табл. 9 показано число субъектов, достигших титров SBA, превышающих граничные значения 1:8- 23012528 и 1:128, а также GMT. Таблица 9. Индексы серопозитивности и GMT для антител SBA через один месяц после вакцинации Вакцинация всеми тремя препаратами ACWY-TT полисахаридных конъюгатов приводила к хорошим ответам SBA против MenA, MenC, MenW и MenY, причем у 95-100% субъектов титры были выше,чем 1:8. В частности, препараты 5/5/5/5 и 2,5/10/2,5/2,5 полисахаридных конъюгатов продуцировали более сильный ответ против MenC, чем олигосахаридная вакцина Meningitec, что видно по большей доле субъектов, имеющих титр выше 1:128, и по показателям GMT. Таблица 10. Индексы серопозитивности и GMC для анти-полисахаридных антител через один месяц после вакцинации Все три препарата ACWY-TT полисахаридной конъюгатной вакцины продуцировали хороший иммунный ответ против MenA, MenC, MenW и MenY, причем у 93-100% субъектов достигались титры выше 0,3 мкг/мл. Более высокие показатели GMC достигались с использованием препаратов 5/5/5/5 и 2/5/10/2,5/2,5 ACWY-TT полисахаридной конъюгатной вакцины по сравнению с Meningitec. Пример 7. Сравнение иммуногенности нативного и доведенного до определенного размера MenYполисахаридных конъюгатов. Мыши (самки DBA/2 в возрасте 6-8 недель) получали две инъекции PSY-ТТ с интервалом 2 недели подкожно. Пробы крови отбирали через 14 суток после второй инъекции для того, чтобы провести антиPSY ELISA и SBA с использованием штамма MenY S1975. Мыши получали 1 мкг PSY-TT на инъекцию Результаты Результаты (фиг. 1) демонстрируют тенденцию к большей иммуногенности конъюгатов, полученных с использованием PSY, доведенного до определенного размера. На фиг. 1 А показаны результаты поGMC, полученные в ELISA для антисыворотки, полученной против конъюгатов, приготовленных из нативного MenY (ENYTT012), микрофлюидизированного MenY - 40 циклов (ENYTT014) и микрофлюидизированного MenY - 20 циклов (ENYTT015 бис). Более высокие значения GMC получали, когда MenYTT был приготовлен из микрофлюидизированного MenY. Аналогичные результаты были получены, когда антисыворотку оценивали при помощи SBAанализа (фиг. 1 Б). Снова более высокие значения GMT достигались с использованием конъюгатов, полученных из микрофлюидизированного MenY. Пример 8. Клиническое исследование, оценивающее эффект линкера в MenA в конъюгатной вакцине MenACWY. Одну дозу разных препаратов MenACWY вакцины вводили подросткам в возрасте 15-19 лет в 5 группах из 25 субъектов в рандомизированном клиническом исследовании 1:1:1:1.1. Тестируемыми препаратами были:F1 - MenACWY, конъюгированный со столбнячным анатоксином, с MenA-конъюгатом, содержащим спейсер АН - 5/5/5/5 мкг.F2 - MenACWY, конъюгированный со столбнячным анатоксином, с MenA-конъюгатом, содержащим спейсер АН - 2,5/5/2,5/2,5 мкг.F3 - MenACWY, конъюгированный со столбнячным анатоксином, с MenA-конъюгатом, содержащим спейсер АН - 5/5/2,5/2,5 мкг.F4 - MenACWY, конъюгированный со столбнячным анатоксином, без спейсера в любом конъюгате 5/5/5/5 мкг. Контрольная группа - Mencevax ACWY. Пробу крови у пациентов брали на 30-е сутки после инокуляции. Пробы крови использовали для оценки процентного количества SBA-MenA, SBA-MenC, SBAMenW135 и SBA-MenY отвечающих субъектов через один месяц после введения дозы вакцины. Ответ на вакцину определяли как (1) для исходно серонегативных субъектов - титр антитела после вакцинации 1/32 в месяц 1, или (2) для исходно серопозитивных субъектов - титр антитела, превышающий в 4 раза титр антитела перед вакцинацией. Результаты Как показано в табл. 12, применение спейсера в конъюгате MenA приводило к повышенному иммунному ответу против MenA. Процентное количество отвечающих субъектов возрастало от 66 до 9095%, когда добавлялся спейсер АН. Это отражалось в увеличении SBA GMT от 4335 до 10000 и в увеличении GMC от 5 до 20-40. Неожиданно применение спейсера АН также приводило к усиленному иммунному ответу на MenC, что видно по увеличению процентного количества отвечающих субъектов и увеличению SBA GMT. При введении спейсера также можно было видеть увеличение SBA-GMT против Пример 9. Клиническое исследование, оценивающее эффект линкера в MenA- и MenC-конъюгатах в MenACWY конъюгатной вакцине. Одну дозу разных препаратов вакцины MenACWY вводили подросткам в возрасте 15-19 лет в 5 группах из 25 субъектов в рандомизированном клиническом исследовании 1:1:1:1:1. Тестируемыми препаратами были:F1 - MenACWY, конъюгированный со столбнячным анатоксином, с MenA- и MenC-конъюгатами,содержащими спейсер АН - 2,5/2,5/2,5/2,5 мкг.F2 - MenACWY, конъюгированный со столбнячным анатоксином, с MenA- и MenC-конъюгатами,содержащими спейсер АН - 5/5/2,5/2,5 мкг.F3 - MenACWY, конъюгированный со столбнячным анатоксином, с MenA- и MenC-конъюгатами,содержащими спейсер АН - 5/5/5/5 мкг.F4 - MenACWY, конъюгированный со столбнячным анатоксином, с MenA-конъюгатом, содержащим спейсер АН - 5/5/5/5 мкг. Контрольная группа - Mencevax ACWY. Пробу крови у пациентов брали на 30-е сутки после инокуляции. Пробы крови использовали для оценки процентного количества SBA-MenA, SBA-MenC, SBAMenW135 и SBA-MenY отвечающих субъектов через один месяц после введения дозы вакцины. Ответ на вакцину определяли как (1) для исходно серонегативных субъектов - титр антитела после вакцинации 1/32 в месяц 1 или (2) для исходно серопозитивных субъектов - титр антитела, превышающий в 4 раза титр антитела перед вакцинацией. Результаты Введение спейсера АН в MenC-конъюгат приводило к увеличению иммунного ответа против MenC,как показано в табл. 13. Это продемонстрировано увеличением SBA GMT от 1943 до 4329 и увеличением анти-PSC GMC от 7,65 до 13,13. Поддерживались хорошие иммунные ответы против MenA, MenW и ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Иммуногенная композиция, содержащая по меньшей мере 2 разных капсульных сахарида N. meningitidis, один или более чем один из которых выбран из первой группы, состоящей из MenA, MenC,MenY и MenW, конъюгированного(ых) через линкер с белком(ами)-носителем(ями), и один или более чем один другой сахарид выбран из второй группы, состоящей из MenA, MenC, MenY и MenW, непосредственно конъюгированного(ых) с белком(ами)-носителем(ями). 2. Иммуногенная композиция по п.1, содержащая по меньшей мере 2 разных капсульных сахаридаN. meningitidis, один или более чем один из которых выбран из первой группы, состоящей из MenA иMenC, конъюгированного(ых) через линкер с белком(ами)-носителем(ями), и один или более чем один другой сахарид выбран из второй группы, состоящей из MenC, MenY и MenW, непосредственно конъюгированного(ых) с белком(ами)-носителем(ями). 3. Иммуногенная композиция по п.2, содержащая капсульный сахарид MenA, конъюгированный через линкер с белком-носителем, и капсульный сахарид MenC, непосредственно конъюгированный с белком-носителем. 4. Иммуногенная композиция по п.2, содержащая капсульный сахарид MenC, конъюгированный через линкер с белком-носителем, и капсульный сахарид MenY, непосредственно конъюгированный с белком-носителем. 5. Иммуногенная композиция по п.2, содержащая капсульные сахариды MenA и MenC, конъюгированные через линкер с белком(ами)-носителем(ями), и капсульные сахариды MenY и MenW, непосредственно конъюгированные с белком(ами)-носителем(ями). 6. Иммуногенная композиция по п.2, содержащая капсульный сахарид MenA, конъюгированный через линкер с белком-носителем, и капсульные сахариды MenC, MenY и MenW, непосредственно конъюгированные с белком(ами)-носителем(ями). 7. Иммуногенная композиция, содержащая по меньшей мере 2 разных сахарида, конъюгированных по отдельности с одним и тем же типом белка-носителя, где один или более чем один сахарид конъюгирован с белком-носителем через первый тип химической группы на белке-носителе и один или более чем один сахарид конъюгирован с белком-носителем через второй тип химической группы на белкеносителе. 8. Иммуногенная композиция по п.7, где один или более чем один сахарид, конъюгированный с- 27012528 белком-носителем через первый тип химической группы на белке-носителе, отличается от одного или более чем одного сахарида, конъюгированного с белком-носителем через второй тип химической группы на белке-носителе. 9. Иммуногенная композиция по п.7 или 8, содержащая по меньшей мере 2 разных сахарида, конъюгированных по отдельности с одним и тем же белком-носителем, где один или более чем один сахарид конъюгирован с белком-носителем через карбоксильную группу на белке-носителе и один или более чем один сахарид конъюгирован с белком-носителем через аминогруппу на белке-носителе. 10. Иммуногенная композиция по пп.7-9, где первый и второй тип химической группы на белкеносителе присутствуют на отдельных В- и/или Т-клеточных эпитопах на белке-носителе. 11. Иммуногенная композиция по пп.7-10, где сахариды выбраны из группы, состоящей из капсульного сахарида N. meningitidis серогруппы А (MenA), капсульного сахарида N. meningitidis серогруппы С(MenC), капсульного сахарида N. meningitidis серогруппы Y (MenY), капсульного сахарида N. meningitidis серогруппы W (MenW), капсульного сахарида группы I стрептококка группы В, капсульного сахарида группы II стрептококка группы В, капсульного сахарида группы III стрептококка группы В, капсульного сахарида группы IV стрептококка группы В, капсульного сахарида группы V стрептококка группы В, капсульного сахарида типа 5 Staphylococcus aureus, капсульного сахарида типа 8 Staphylococcus aureus,сахарида Vi из Salmonella typhi, LPS (липополисахарида) N. meningitidis (такого как L3 и/или L2), LPS M.catarrhalis, LPS H. influenzae и из любого капсульного пневмококкового сахарида, например из серотипа 1, 2, 3, 4, 5, 6 А, 6 В, 7F, 8, 9N, 9V, 10 А, 11 А, 12F, 14, 15 В, 17F, 18 С, 19 А, 19F, 20, 22F, 23F или 33F. 12. Иммуногенная композиция по любому из пп.1-11, где каждый капсульный сахарид N. meningitidis конъюгирован с белком-носителем, независимо выбранным из группы, состоящей из ТТ (столбнячного анатоксина), DT (дифтерийного анатоксина), CRM197, фрагмента С из ТТ и протеина D. 13. Иммуногенная композиция по любому из пп.1-12, где каждый капсульный сахарид N. meningitidis конъюгирован с одним и тем же белком-носителем, выбранным из группы, состоящей из ТТ, DT,CRM197, фрагмента С из ТТ и протеина D. 14. Иммуногенная композиция по любому из пп.1-13, где каждый капсульный сахарид N. meningitidis конъюгирован с ТТ. 15. Иммуногенная композиция по любому из пп.1-14, где каждый капсульный сахарид N. meningitidis конъюгирован по отдельности с отдельным белком-носителем. 16. Иммуногенная композиция по любому из пп.1-15, где по меньшей мере один, два или три конъюгата капсульных сахаридов N. meningitidis непосредственно конъюгированы с белком-носителем. 17. Иммуногенная композиция по п.16, где MenW и/или MenY, MenW и/или MenC, MenY и/илиMenC, или MenW и MenC и MenY непосредственно конъюгированы с белком-носителем. 18. Иммуногенная композиция по п.16 или 17, где по меньшей мере один, два или три конъюгата сахаридов N. meningitidis непосредственно конъюгированы посредством химии CDAP (1-циано-4 диметиламинопиридиния тетрафторборат). 19. Иммуногенная композиция по любому из пп.1-18, где по меньшей мере один, два или три капсульных сахарида N. meningitidis конъюгированы с белком-носителем через линкер. 20. Иммуногенная композиция по п.19, где линкер является бифункциональным. 21. Иммуногенная композиция по любому из пп.1-20, содержащая капсульные сахариды N. meningitidis из по меньшей мере двух серогрупп А, С, W135 и Y, конъюгированные с белком-носителем, с получением конъюгата капсульного сахарида N. meningitidis, где средний размер каждого сахарида N. meningitidis составляет более 50, 75, 100, 110, 120 или 130 кДа. 22. Иммуногенная композиция по любому из пп.1-21, дополнительно содержащая капсульный сахарид Н. influenzae b (Hib), конъюгированный с белком-носителем, причем указанный белок-носитель возможно выбран из группы, состоящей из ТТ, DT, CRM197, фрагмента С из ТТ или протеина D. 23. Иммуногенная композиция по п.22, содержащая конъюгат сахарида Hib и по меньшей мере два дополнительных конъюгата бактериальных сахаридов, где конъюгат Hib присутствует в более низкой дозе, чем средняя доза по меньшей мере двух дополнительных конъюгатов бактериальных сахаридов. 24. Вакцина, содержащая иммуногенную композицию по любому из пп.1-23 и фармацевтически приемлемый эксципиент. 25. Вакцинный набор для совместного или последовательного введения, включающий две мультивалентные иммуногенные композиции, обеспечивающие защиту хозяина против заболевания, вызываемого Bordetella pertussis, Clostridium tetani, Corynebacterium diphthehae, Haemophilus influenzae и Neisseriameningitidis, причем указанный набор содержит первый контейнер, содержащий столбнячный анатоксин(ТТ), дифтерийный анатоксин (DT) и цельноклеточные или бесклеточные коклюшные компоненты, и второй контейнер, содержащий иммуногенную композицию по любому из пп.1-23. 26. Способ изготовления вакцины по п.24, включающий стадию смешивания иммуногенной композиции по любому из пп.1-23 с фармацевтически приемлемым эксципиентом. 27. Способ иммунизации хозяина, являющегося человеком, против заболевания, вызываемого инфицированием Neisseria meningitidis, включающий введение данному хозяину иммунопротективной дозы иммуногенной композиции или вакцины по пп.1-23.- 28012528 28. Применение иммуногенной композиции по пп.1-23 в лечении или предупреждении заболевания,вызываемого инфицированием Neisseria meningitidis. 29. Применение иммуногенной композиции по любому из пп.1-23 в изготовлении лекарственного средства для лечения или предупреждения заболеваний, вызываемых инфицированием Neisseria meningitidis.