Гуманизированный иммуноглобулин, который специфически связывается с бета-амилоидным пептидом, и способы его применения

012407 Предпосылки создания изобретения Болезнь Альцгеймера (AD) является прогрессирующим заболеванием, приводящим к старческому слабоумию (сенильной деменции). См. в общем Selkoe, TINS, 16:403 (1993); Hardy et al., Международная заявка WO 92/13069; Selkoe, J. Neuropathol. Exp. Neurol. 53:438 (1994); Duff et al., Nature 373:476 (1995);Games et al., Nature 373:523 (1995). Вообще говоря, заболевание делится на две категории: позднее заболевание, которое возникает в старости (в 65 лет и старше), и раннее заболевание, которое развивается ранее старческого возраста, т.е. в 35-60 лет. В обоих типах заболевания патология одинакова, но в случаях, начинающихся в более раннем возрасте, наблюдается тенденция к более тяжлым и обширным нарушениям. Заболевание характеризуется по меньшей мере двумя типами патологических изменений в мозгу: нейрофибриллярные узлы и сенильные бляшки. Нейрофибриллярные узлы представляют собой внутриклеточные отложения связанного с микротрубочками тау-белка, состоящего из двух попарно скрученных нитей. Сенильные бляшки (т.е. амилоидные бляшки) представляют собой участки беспорядочного сплетения нервных клеток (нейропиль) до 150 мкм в ширину с внеклеточными амилоидными отложениями в центре, которые видны при изучении под микроскопом срезов тканей мозга. Аккумуляция амилоидных бляшек в мозге также связана с синдромом Дауна и другими когнитивными нарушениями. Основным составляющим бляшек является пептид, называемый A, или -амилоидный пептид. A пептид представляет собой внутренний фрагмент из 39-43 аминокислот размером 4 кДа, более протяжнного трансмембранного гликопротеина, называемого амилоидным белком-предшественником (АБП,APP). Образующийся в результате протеолитического процессирования APP под действием различных секретаз A первоначально обнаружен как в короткой форме протяжнностью 40 аминокислот, так и в длинной форме протяжнностью 42-43 аминокислоты. Участок гидрофобного трансмембранного доменаAPP обнаружен на карбоксиконце A, и он может быть ответственен за способность A к агрегации в бляшки, в особенности в случае длинной формы. Симптомы аккумуляции, обусловленные этим типом нервного истощения, характеризуют болезнь Альцгеймера. Несколько мутаций в белке APP коррелировали с болезнью Альцгеймера. См., например, Goate et(1992) (двойная мутация с заменой лизина 595-метионина 596 на аспарагин 595-лейцин 596). Полагают, что такие мутации вызывают болезнь Альцгеймера под действием повышенного или изменнного процессирования APP в A, в частности процессирование APP в повышенные количества длинной формы A (т.е.A1-42 и A1-43). Полагают, что мутации в других генах, таких как гены пресенилина, PS1 и PS2, опосредованно влияют на процессирование APP с образованием длинной формы A (см. Hardy, TINS, 20:154(1997. Для установления роли амилоидных бляшек в болезни Альцгеймера с успехом применялись мышиные модели (Games et al., см. выше, Johnson-Wood et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94:1550(1997. В частности, когда трансгенным мышам PDAPP (которые экспрессируют мутантную форму человеческогоAPP и у которых в раннем возрасте развивается болезнь Альцгеймера) инъецируют длинную форму A,у них наблюдают как ускорение прогрессирования болезни Альцгеймера, так и повышение титров антител к A пептиду (Schenk et al., Nature, 400, 173 (1999. Обсуждавшиеся выше наблюдения показывают,что A, в особенности в длинной форме, является одной из причин (причинным элементом) болезни Альцгеймера. Следовательно, существует необходимость в новых лекарственных веществах и реагентах для лечения болезни Альцгеймера, в частности в лекарственных веществах и реагентах, способных вызывать терапевтический эффект в физиологических (например, нетоксических) дозах. Сущность изобретения Настоящее изобретение включает новые иммунологические реагенты, в частности терапевтические антитела, для предупреждения и лечения амилоидогенного заболевания (например, болезни Альцгеймера). Данное изобретение основано, по меньшей мере частично, на идентификации и определении характеристик моноклонального антитела, 12 А 11, которое специфически связывается с A пептидом и эффективно снижает количество бляшек (нагрузку), ассоциированных с амилоидогенным заболеванием. Структурный и функциональный анализ этого антитела приводит к дизайну различных гуманизированных антител для профилактического и/или терапевтического применения. В частности, данное изобретение включает гуманизацию вариабельных участков этого антитела и, следовательно, охватывает цепи гуманизированного иммуноглобулина или антитела, интактные гуманизированные иммуноглобулины или антитела и функциональные фрагменты иммуноглобулина или антитела, в частности антигенсвязывающие фрагменты антитела по изобретению. Также охватываются полипептиды, содержащие гипервариабельные участки (CDR) моноклонального антитела по изобретению, а также полинуклеотидные реагенты, векторы и клетки-хозяева, пригодные для кодирования указанных полипептидов. Раскрываются способы лечения амилоидогенных заболеваний или нарушений (например, болезни Альцгеймера), так же как и фармацевтические композиции и наборы для таких применений.-1012407 Также охватываются способы идентификации остатков в моноклональных антителах, которые важны для соответствующей иммунологической функции и для идентификации остатков, подлежащих замене при дизайне гуманизированных антител с повышенной аффинностью и/или пониженной иммуногенностью, для использования в качестве терапевтических реагентов. Также охватываются антитела (например, гуманизированные антитела), имеющие изменнные эффекторные функции, и их терапевтическое применение. Краткое описание чертежей На фиг. 1 графически изображены результаты эксперимента, в котором изучается эффективность различных антител, включая 12 А 11, при очищении от A бляшек при анализе на фагоцитоз in и ex vivo. На фиг. 2 А графически показаны результаты эксперимента, в котором изучается эффективность различных антител, включая 12 А 11, при снижении уровней тотального А. Столбцы представляют собой средние (медианные) значения, а пунктирная горизонтальная линия показывает контрольный уровень. На фиг. 2 В графически показаны результаты эксперимента, в котором изучается эффективность различных антител, включая 12 А 11, при снижении дистрофии (дегенерации) нейритов. Столбцы изображают средние (медианные) значения, а пунктирная горизонтальная линия показывает контрольный уровень. Показаны данные для отдельных животных, выраженные в процентах нейритной дистрофии относительно среднего контрольного значения (принятого за 100%). На фиг. 3 А показана последовательность ДНК, включая мышиную последовательность 12 А 11 VL цепи, и предсказанная (расшифрованная) аминокислотная последовательность VL цепи (SEQ ID NO:5 и 2 соответственно). Зрелая VL цепь показана жирной сплошной линией. CDR показан очерченными нежирной линией прямоугольниками. На фиг. 3B показана последовательность ДНК, включая мышиную последовательность 12 А 11 VH цепи, и предсказанная (расшифрованная) аминокислотная последовательность VH цепи (SEQ ID NO:6 и 3 соответственно). Зрелая VH цепь показана жирной сплошной линией. CDR показан очерченными нежирной линией прямоугольниками. Последовательности ДНК включают сайты клонирования и последовательности Козака (против хода транскрипции (3'-5') от кодирующей последовательности) и сайты сплайсинга и клонирования (по ходу транскрипции (5'-3'). На фиг. 4 графически показаны результаты ELISA, полученные в эксперименте, в котором определяют связывание химерного 12 А 11, химерного и гуманизированного 3D6 и химерного и гуманизированного 12 В 4 с A1-42. На фиг. 5 А показано выравнивание аминокислотных последовательностей лгкой цепи мышиного(или химерного) 12 А 11 (SEQ ID NO:2), гуманизированного 12 А 11 (зрелый пептид, SEQ ID NO:7), депонированного в GenBank под номером ВАС 01733 (SEQ ID NO:8), антител и антитела зародышевой линии А 19 (Х 63397, SEQ ID NO:9). CDR области обведены рамкой. Остатки упаковки подчркнуты. Нумерация от первого метионинового остатка, номенклатура не по Kabat. На фиг. 5 В показано выравнивание аминокислотных последовательностей тяжлой цепи мышиного(или химерного) 12 А 11 (SEQ ID NO:4), гуманизированного 12 аА 11 (версия 1) (зрелый пептид,SEQ ID NO:10), депонированного в GenBank под номером ААА 69734 (SEQ ID NO:11) антител и депонированного в GenBank под номером 567123 (SEQ ID NO:12) антитела зародышевой линии. Остатки упаковки подчркнуты, канонические остатки закрашены сплошным, а остатки зоны Вернье выделены пунктиром. Нумерация от первого метионинового остатка, номенклатура не по Kabat. На фиг. 6 А, В показано выравнивание аминокислотных последовательностей тяжлых цепей гуманизированного 12 А 11 v1 (SEQ ID NO:10), v2 (SEQ ID NO:13), v2.1 (SEQ ID NO:14), v3 (SEQ ID NO:15),v4.1 (SEQ ID NO:16), v4.2 (SEQ ID, NO:17), v4.3 (SEQ ID NO:18), v4.4 (SEQ ID NO:19),v5.1 (SEQ ID NO:20), v5.2 (SEQ ID NO:21), v5.3 (SEQ ID NO:22), v5.4 (SEQ ID NO:23),v5.5 (SEQ ID NO:24), v5.6 (SEQ ID NO:25), v6.1 (SEQ ID NO:26), v6.2 (SEQ ID NO:27),v6.3 (SEQ ID NO:28), v6.4 (SEQ ID NO:29), v7 (SEQ ID NO:30) и v8 (SEQ ID NO:31). На фиг. 6C представлены обратные мутации, осуществлнные в гуманизированных 12 А 11 v1-v8 антител. На фиг. 7 показаны результаты анализа ELISA агрегированного A (1-42), сравниваются химерное 12 А 11, гуманизированное 12 А 11 v1, гуманизированное 12 А 11 v2, гуманизированное 12 А 11 v2.1 и гуманизированное 12 А 11 v3 антитела. На фиг. 8 показаны результаты конкурентного анализа ELISA конкурентного связывания A1-42,сравниваются мышиное 12 А 11, химерное 12 А 11 и h12 А 11 v1 антитела. Подробное описание изобретения Настоящее изобретение охватывает новые иммунологические реагенты и способы предупреждения и лечения болезни Альцгеймера или других амилоидогенных заболеваний. Изобретение базируется, по меньшей мере частично, на свойствах моноклонального иммуноглобулина, 12 А 11, эффективно связывающего бета-амилоидный белок (А) (например, связывающего растворимый и/или агрегированный А), опосредующего фагоцитоз (например, агрегированного А), снижающего количество (предрасположенность к образованию) бляшек и/или уменьшающего дистрофию (дегенерацию) нейритов (напри-2012407 мер, у пациента). Кроме того, изобретение основано на определении структурных характеристик первичной и вторичной структуры вариабельной области лгкой и тяжлой цепей 12A11 иммуноглобулина и идентификации остатков, важных для активности и иммуногенности. Охватываются иммуноглобулины, которые включают вариабельную область лгкой цепи и/или вариабельную область тяжлой цепи моноклонального иммуноглобулина 12 А 11 по данному описанию. Охватываются предпочтительные иммуноглобулины, например терапевтические иммуноглобулины, которые включают вариабельную область гуманизированной лгкой и/или вариабельную область гуманизированной тяжлой цепи. Предпочтительные вариабельная область лгкой и/или вариабельная область тяжлой цепи включают гипервариабельный участок (CDR) 12A11 иммуноглобулина (например, донорного иммуноглобулина) и вариабельные каркасные участки из человеческого акцепторного иммуноглобулина или в основном (практически) человеческого акцепторного иммуноглобулина. Выражение "в основном (практически) из человеческого акцепторного иммуноглобулина" означает, что основная часть или главные каркасные остатки взяты из человеческой акцепторной последовательности, однако при этом допускается замена остатков в некоторых положениях на остатки, выбранные для повышения активности гуманизированного иммуноглобулина (например, для изменения активности таким образом,чтобы она более похоже имитировала активность донорного иммуноглобулина) или выбранные для снижения иммуногенности гуманизированного иммуноглобулина. В одном варианте изобретение охватывает лгкую или тяжлую цепь гуманизированного иммуноглоблина, которая включает гипервариабельные участки (CDR) вариабельной области (т.е. включает один, два или три CDR участка последовательности вариабельной области лгкой цепи, представленной SEQ ID NO:2, или включает один, два или три CDR участка последовательности вариабельной области тяжлой цепи, представленной SEQ ID NO:4) и включает вариабельную каркасную область последовательности лгкой или тяжлой цепи человеческого акцепторного иммуноглобулина, необязательно содержащую по меньшей мере один каркасный остаток, обратно мутировавший в соответствующий мышиный остаток, при этом указанная обратная мутация практически не влияет на способность цепи направлять A-связывание. В одном варианте изобретение охватывает лгкую или тяжлую цепь гуманизированного иммуноглобулина, которая включает гипервариабельные участки (CDR) вариабельной области 12 А 11 (т.е. включает один, два или три CDR участка последовательности вариабельной области лгкой цепи, представленной SEQ ID NO:2, или включает один, два или три CDR участка последовательности вариабельной области тяжлой цепи, представленной SEQ ID NO:4) и включает вариабельную каркасную область последовательности лгкой или тяжлой цепи в основном (практически) человеческого акцепторного иммуноглобулина, необязательно содержащую по меньшей мере один каркасный остаток, обратно мутировавший в соответствующий мышиный остаток, при этом указанная обратная мутация практически не влияет на способность цепи направлять A-связывание. В другом варианте данное изобретение охватывает лгкую или тяжлую цепь гуманизированного иммуноглобулина, которая включает гипервариабельные участки (CDR) вариабельной области 12 А 11(например, включает один, два или три CDR участка последовательности вариабельной области лгкой цепи, представленной SEQ ID NO:2, и/или включает один, два или три CDR участка последовательности вариабельной области тяжлой цепи, представленной SEQ ID NO:4) и включает вариабельную каркасную область последовательности лгкой или тяжлой цепи в основном (практически) человеческого акцепторного иммуноглобулина, необязательно содержащую по меньшей мере один каркасный остаток,замещнный соответствующим аминокислотным остатком из последовательности вариабельной области лгкой или тяжлой цепи мышиного 12 А 11, где каркасный остаток выбирают из группы, состоящей из(а) остатка, который нековалентной связью непосредственно связывается с антигеном; (б) остатка, прилегающего к CDR; (в) остатка, взаимодействующего с CDR (например, идентифицированного моделированием лгкой или тяжлой цепи на разрешнной структуре гомологичной известной цепи иммуноглобулина); и (д) остатка, принимающего участие в интерфейсе (граничная поверхность) VL-VH. В другом варианте изобретение охватывает лгкую или тяжлую цепь гуманизированного иммуноглобулина, которая включает участки CDR вариабельной области и вариабельные каркасные участки последовательности лгкой или тяжлой цепи человеческого акцепторного иммуноглобулина, необязательно содержащие по меньшей мере один каркасный (остовной) остаток, замещнный на соответствующий аминокислотный остаток из последовательности вариабельной области лгкой или тяжлой цепи мышиного 12 А 11, где каркасный остаток способен влиять на конформацию или функцию вариабельной области лгкой цепи, как определено анализом трхмерной модели вариабельной области, например остаток, способный взаимодействовать с антигеном, остаток, проксимальный к сайту связывания антигена, остаток, способный взаимодействовать с CDR, остаток, прилегающий к CDR, остаток, находящийся в пределах 6 от остатка CDR, канонический остаток, остаток в зоне Вернье, остаток межцепной упаковки, необычный остаток или остаток сайта гликозилирования на поверхности структурной модели. В другом варианте данное изобретение охватывает, помимо описанных выше замен, замену по меньшей мере одного редкого (нетривиального) человеческого каркасного остатка. Например, редкий-3012407 остаток можно заменять аминокислотным остатком, обычным для человеческих последовательностей вариабельной области в этом положении. Или же редкий остаток можно заменять на соответствующий аминокислотный остаток гомологичной последовательности вариабельной области зародышевой линии. В другом варианте изобретение охватывает гуманизированный иммуноглобулин, который включает лгкую цепь и тяжлую цепи, описанные выше, или антигенсвязывающий фрагмент указанного иммуноглобулина. В типичном варианте изобретения гуманизированный иммуноглобулин связывается (например, специфически связывается) с бета-амилоидным пептидом (А) с аффинностью связывания по меньшей мере 107, 108 или 109 М-1. В другом варианте изобретения иммуноглобулин или антигенсвязывающий фрагмент включает тяжлую цепь изотипа 1. В другом варианте изобретения иммуноглобулин или антигенсвязывающий фрагмент связывается (например, специфически связывается) с (любым из) одним растворимым бета-амилоидным пептидом (A) или агрегированным A или с обоими. В другом варианте изобретения иммуноглобулин или антигенсвязывающий фрагмент захватывает растворимыйA (например, растворимый A1-42). В другом варианте изобретения иммуноглобулин или антигенсвязывающий фрагмент опосредует фагоцитоз (например, индуцирует фагоцитоз) бета-амилоидного пептида (A). Ещ в одном варианте изобретения иммуноглобулин или антигенсвязывающий фрагмент проникает через гематоэнцефалический барьер у субъекта. Ещ в одном варианте изобретения иммуноглобулин или антигенсвязывающий фрагмент снижает либо только нагрузку бета-амилоидного пептида (A) или только нейритную дистрофию у субъекта, либо и то, и другое. В другом варианте изобретение охватывает химерные иммуноглобулины, которые включают вариабельные области 12 А 11 (например, последовательности вариабельных областей, представленные какSEQ ID NO:2 или SEQ ID NO:4). Ещ в одном варианте изобретения иммуноглобулин или его антигенсвязывающий фрагмент дополнительно включает константные области из IgG1. Иммуноглобулины по данному описанию особенно пригодны для применения в терапевтических способах, имеющих целью предупреждение или лечение амилоидогенных заболеваний. В одном варианте изобретение охватывает способ предупреждения или лечения амилоидогенного заболевания (например, болезни Альцгеймера), которое включает введение пациенту эффективной дозы гуманизированного иммуноглобулина по данному описанию. В другом варианте изобретение охватывает фармацевтические композиции, которые включают гуманизированный иммуноглобулин по данному описанию и фармацевтический носитель. Также охватываются выделенные нуклеотидные молекулы, векторы и клетки-хозяева для продуцирования иммуноглобулинов и фрагментов или цепей иммуноглобулинов по данному описанию, а также способы продуцирования указанных иммуноглобулинов, фрагментов иммуноглобулинов или цепей иммуноглобулинов. Далее настоящее изобретение охватывает способ идентификации остатков 12 А 11, предрасположенных к замене при продуцировании гуманизированного 12 А 11 иммуноглобулина соответственно. Например, способ идентификации остатков вариабельной каркасной области, склонных к замене, включает моделирование трхмерной структуры вариабельной области 12 А 11 на разрешнной гомологичной структуре иммуноглобулина и анализ указанной модели на остатки, способные влиять на конформацию или функцию вариабельной области иммуноглобулина 12 А 11 так, чтобы идентифицировать такие остатки, склонные к замене. Далее данное изобретение охватывает применение последовательности вариабельной области, представленной как SEQ ID NO:2 или SEQ ID NO:4, или е любого участка для создания трхмерного изображения 12 А 11 иммуноглобулина, цепи 12 А 11 иммуноглобулина или е домена. Настоящее изобретение охватывает далее иммуноглобулины, имеющие изменнную эффекторную функцию, такую как способность связываться с эффекторными молекулами, например комплементом или рецептором на эффекторной клетке. В частности, в иммуноглобулине по изобретению изменяли константную область, например Fc-область, причм по меньшей мере один аминокислотный остаток в Fcобласти заменяли отличным остатком или боковой цепью. В одном варианте изобретения модифицированный иммуноглобулин IgG класса содержит по меньшей мере одну аминокислотную замену в Fcобласти, так что иммуноглобулин имеет изменнную эффекторную функцию, например, по сравнению с немодифицированным иммуноглобулином. В особых вариантах иммуноглобулин по изобретению имеет изменнную эффекторную функцию, так что он становится менее иммуногенным (например, не вызывает нежелательной активности, нежелательного лизиса эффекторной клетки или нежелательного связывания комплемента с эффекторной клеткой), имеет улучшенный клиренс амилоида и/или имеет требуемый период полужизни. До начала описания изобретения для лучшего понимания его целесообразно ввести определения некоторых терминов, используемых далее в данном описании. Термин "иммуноглобулин" или "антитело" (применяемые в данном описании поочердно) относится к белку, имеющему основную четырхполипептидную структуру цепи, состоящую из двух тяжлых и двух лгких цепей, причм указанные цепи стабилизированы, например, межцепными дисульфидными связями, который (белок) способен специфически связываться с антигеном. Термин "одноцепочечный иммуноглобулин" или "одноцепочечное антитело" (применяемые в данном описании поочердно) относится к белку, имеющему двухполипептидную структуру, состоящую из-4012407 тяжлой и лгкой цепей, причм указанные цепи стабилизированы, например, межцепными пептидными линкерами, который (белок) способен специфически связываться с антигеном. Термин "домен" относится к глобулярной области полипептида тяжлой или лгкой цепи, содержащей пептидные петли (например, содержащей 3-4 пептидных петли), стабилизированные, например, с помощью -складок и/или межцепной дисульфидной связью. Домены называют далее в данном описании как "константные" или "вариабельные", в зависимости от относительной недостаточности вариаций последовательности внутри доменов различных членов класса в случае "константного" домена или от значительной вариации внутри доменов различных членов класса в случае "вариабельного" домена. "Домены" антитела или полипептида часто в уровне технике взаимозаменяемо (равнозначно) называют "области" ("участки"). "Константные" домены лгкой цепи антитела равнозначно называют "константные области лгкой цепи", "константные домены лгкой цепи", "CL" области или "CL" домены. "Константные" домены тяжлой цепи антитела равнозначно называют "константные области тяжлой цепи", "константные домены тяжлой цепи", "СН" области или "СН" домены. "Вариабельные" домены лгкой цепи антитела равнозначно называют "вариабельные области лгкой цепи", "вариабельные домены лгкой цепи", "VL" области или "VL" домены. "Вариабельные" домены тяжлой цепи антитела равнозначно называют "вариабельные области тяжлой цепи", "вариабельные домены тяжлой цепи", "VH" области или"VH" домены. Термин "область" может также относиться к части или участку цепи антитела или домену цепи антитела (например, часть или участок тяжлой или лгкой цепи или часть или участок константного или вариабельного домена, по определению в данном описании), а также к более дискретным частям или участкам указанных цепей или доменов. Например, лгкая и тяжлая цепи или вариабельные домены лгкой и тяжлой цепей включают "гипервариабельные участки" или "CDR", вкрапленные среди "каркасных (остовных) областей" или "FR", по данному описанию. Иммуноглобулины или антитела могут существовать в мономерной или полимерной форме, например IgM антитела, которые существуют в пентамерной форме, и/или IgGA антитела, которые существуют в мономерной, димерной или мультимерной форме. Термин "фрагмент" относится к части или участку антитела или цепи антитела, содержащим меньше аминокислотных остатков, чем интактное или полное антитело или цепь интактного или полного антитела. Фрагменты можно получать действием химических и ферментативных реагентов на интактное или полное антитело или на цепь интактного или полного антитела. Фрагменты можно получать также методами рекомбинантной ДНК. Примеры фрагментов включают фрагменты Fab, Fab', F(ab')2, Fabc и/илиFv. Термин "антигенсвязывающий фрагмент" относится к полипептидному фрагменту иммуноглобулина или антитела, который связывается с антигеном или конкурирует с интактным антителом (т.е. с интактным антителом, из которого они образованы) за связывание с антигеном (т.е. специфическое связывание). Термин "конформация" относится к третичной структуре белка или полипептида (например, антитела, цепи антитела, его домена или участка). Например, выражение "конформация лгкой (или тяжлой) цепи" относится к третичной структуре вариабельной области лгкой (или тяжлой) цепи, а выражение"конформация антитела" или "конформация фрагмента антитела" относится к третичной структуре антитела или его фрагмента."Специфическое связывание" антитела означает, что антитело проявляет заметное сродство (аффинность) к конкретному антигену или эпитопу и, как правило, не проявляет заметной кроссреактивности. В типичных вариантах изобретения антитело не проявляет кроссреактивности (например, не реагирует перекрстно с не-A пептидами или с удалнными эпитопами на А). "Заметное" или предпочтительное связывание включает связывание с аффинностью по меньшей мере 106, 107, 108, 109 или 10 М-1. Более предпочтительна аффинность выше 107 М-1, предпочтительно выше 10 М-1 и выше. Предполагается, что в объм настоящего изобретения также входят значения, промежуточные между представленными в данном описании, и предпочтительные значения аффинности связывания могут быть указаны в виде интервала аффинностей, например 106-1010 М-1, предпочтительно 107-1010 М-1, более предпочтительно 108-1010 М-1. Антитело, которое "не проявляет значительной кроссреактивности", представляет собой антитело, которое не связывается в заметной (ощутимой, оценимой) степени с нежелательным объектом(например, нежелательным белковым объектом). Например, антитело, которое специфически связывается с A, в значительной степени связывает A, но не реагирует в заметной степени с не-A белками или пептидами (например, не-A белками или пептидами, входящими в состав бляшек). Например, антитело,специфичное к конкретному эпитопу, в незначительной степени будет перекрстно реагировать с удалнными эпитопами на том же белке или пептидами. Специфическое связывание можно определить любым признанным в технике способом определения такого связывания. Предпочтительно специфическое связывание определяют по методу и/или анализами конкурентного связывания. Связывающие фрагменты получают методами рекомбинантной ДНК или ферментативным или химическим расщеплением интактных иммуноглобулинов.-5012407 Связывающие фрагменты включают Fab, Fab', F(ab')2, Fabc, Fv, одиночные цепи и одноцепочечные антитела. Предполагают, что у иммуноглобулина или антитела, иных, нежели "биспецифические" или"бифункциональные" иммуноглобулины или антитела, каждый из имеющихся в нм сайтов связывания идентичен. "Биспецифическое" или "бифункциональное антитело" представляет собой искусственное гибридное антитело, имеющее две различные пары тяжлой/лгкой цепей и два различных сайта связывания. Биспецифические антитела можно получать различными методами, включая слияние гибридом или связывание Fab'-фрагментов. См., например, SongsivilaiLachmann, Clin. Exp. Immunol. 79:315-321(1990); Kostelny et al., J. Immunol. 148, 1547-1553 (1992). Термин "гуманизированный иммуноглобулин" или "гуманизированное антитело" относится к иммуноглобулину или антителу, которое включает по меньшей мере одну гуманизированную цепь иммуноглобулина или антитела (т.е. по меньшей мере одну гуманизированную лгкую или тяжлую цепь). Термин "гуманизированная цепь иммуноглобулина" или "гуманизированная цепь антитела" (т.е."гуманизированная лгкая цепь иммуноглобулина" или "гуманизированная тяжлая цепь иммуноглобулина") относится к цепи иммуноглобулина или антитела (т.е. к лгкой или тяжлой цепи соответственно), имеющей вариабельную область, которая включает вариабельный каркасный участок в основном(практически) человеческого иммуноглобулина или антитела и гипервариабельные участки (CDR) (например, по меньшей мере один CDR, предпочтительно два CDR, более предпочтительно три CDR) в основном (практически) нечеловеческого иммуноглобулина или антитела и, кроме того, включает константные области (например, по меньшей мере одну константную область или е часть, в случае лгкой цепи, и предпочтительно три константные области в случае тяжлой цепи). Термин "гуманизированная вариабельная область" (например, "гуманизированная вариабельная область лгкой цепи" или "гуманизированная вариабельная область тяжлой цепи") относится к вариабельной области, которая включает вариабельный каркасный участок (область) в основном (практически) человеческого иммуноглобулина или антитела и гипервариабельные участки (области) (CDR) в основном (практически) нечеловеческого иммуноглобулина или антитела. Выражение "в основном (из) человеческого иммуноглобулина или антитела" или "в основном(практически) человеческий" означает, что при выравнивании с последовательностью человеческого иммуноглобулина или антитела в целях сравнения область идентична по меньшей степени на 80-90%,90-95% или 95-99% (т.е. локальная идентичность последовательностей) с человеческой каркасной последовательностью или с человеческой последовательностью константной области, допуская, например,консервативные замены, замены согласованной (консенсусной) последовательности, замены зародышевой линии, обратные мутации и т.п. Введение консервативных замен, замен согласованной последовательности, замен зародышевой линии обратных мутаций и т.п. часто называют "оптимизацией" гуманизированного антитела или гуманизированной цепи. Выражение "в основном (практически, главным образом) (из) нечеловеческого иммуноглобулина или антитела" или "практически нечеловеческий" означает наличие последовательности иммуноглобулина или антитела, по меньшей мере на 80-95%, предпочтительно по меньшей мере на 90-95%, более предпочтительно на 96%, 97%, 98% или 99% идентичной последовательности нечеловеческого организма, например, отличного от человека млекопитающего. Соответственно, все области или остатки гуманизированного иммуноглобулина или антитела или гуманизированной цепи иммуноглобулина или антитела, за исключением, возможно, CDR, практически(в основном) идентичны соответствующим областям или остаткам одной или более нативных последовательностей человеческих иммуноглобулинов. Термин "соответствующая область (участок)" или "соответствующий остаток" относится к области или к остатку во второй аминокислотной или нуклеотидной последовательности, которая (или который) занимает то же самое (т.е. эквивалентное) положение в качестве области или остатка в первой аминокислотной или нуклеотидной последовательности, когда первую и вторую последовательности оптимально выравнивают в целях сравнения. Термин "значительная идентичность", "значительная степень идентичности" означает, что две полипептидные последовательности при оптимальном выравнивании, таком как с помощью программ GAP или BESTFIT с применением средневзвешенных гэпов по умолчанию, имеют по меньшей мере 50-60%-ную идентичность последовательностей, предпочтительно по меньшей мере 60-70%-ную идентичность последовательностей, более предпочтительно по меньшей мере 70-80%-ную идентичность последовательностей, более предпочтительно по меньшей мере 80-90%-ную идентичность последовательностей, ещ более предпочтительно по меньшей мере 90-95%-ную идентичность последовательностей, и ещ более предпочтительно по меньшей мере 95%-ную идентичность последовательностей или более (например, последовательности идентичны на 99% или выше). Термин "практически идентичный" ("практическая идентичность") означает, что две полипептидные последовательности, при оптимальном выравнивании, таком как с помощью программ GAP илиBESTFIT с применением средневзвешенных гэпов по умолчанию, имеют по меньшей мере 80-90%-ную идентичность последовательностей, предпочтительно, по меньшей мере 90-95%-ную идентичность-6012407 последовательностей и ещ более предпочтительно по меньшей мере 95%-ную идентичность последовательностей или более (например, последовательности идентичны на 99% или выше). Для сравнения последовательностей, как правило, одну последовательность используют в качестве эталонной последовательности, с которой сравнивают тестируемые последовательности. При использовании алгоритма сравнения последовательностей тестируемые и эталонная последовательности вводят в компьютер, определяют координаты подпоследовательностей, если необходимо, и определяют параметры алгоритмической программы последовательности. Затем, используя алгоритм сравнения последовательностей, рассчитывают процент идентичности последовательностей для испытуемой(ых) последовательности(ей) относительно эталонной последовательности исходя из определнных параметров программы. Оптимальное выравнивание последовательностей для сравнения можно проводить, например, при использовании алгоритма локального выравнивания Смита-Ватермана, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981),алгоритма гомологического выравнивания Нидлмана-Вунша, J. Mol. Biol. 48:443 (1970), метода поиска подобия Пирсона и Липмана, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85:2444 (1988), с помощью компьютерных программ (GAP, BESTFIT, FASTA и TFASTA в Wisconsin Genetics Software Package, Genetics ComputerGroup, 575 Science Dr., Madison, WI) или визуальным исследованием (см. в целом Ausubel et al., CurrentProtocols in Molecular Biology). Одним примером алгоритма, подходящего для определения процента идентичности последовательностей и подобия последовательностей, является алгоритм BLAST, описанный Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403 (1990). Программа осуществления BLAST анализов является общедоступной с помощью National Center for Biotechnology Information (общедоступен через интернетсервер National Institutes of Health NCBI). Как правило, для проведения сравнения последовательностей можно применять параметры программы по умолчанию, хотя можно также использовать специальные параметры (характеристики). Для аминокислотных последовательностей программа BLASTP в качестве параметров по умолчанию использует длину слова (W) 3, ожидание (Е) 10 и матрицу BLOSUM62 (см.HenikoffHenikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:10915 (1989. Предпочтительно положения неидентичных остатков отличаются консервативными аминокислотными заменами. С целью классификации аминокислотных замен как консервативных или неконсервативных аминокислоты группируют следующим образом: группа I (гидрофобные боковые цепи): leu, met, ala, val, leu, ile; группа II (нейтральные гидрофильные боковые цепи): cys, ser, thr; группа III (кислые боковые цепи): asp, glu; группа IV (основные боковые цепи): asn, gln, his, lys, arg; группа V (остатки, влияющие на ориентацию цепи): gly, pro и группа VI (ароматические боковые цепи): trp, tyr, phe. Консервативные замены включают замены аминокислот одного и того же класса. Неконсервативные замены представляют собой замену члена одного из этих классов на член другого класса. Предпочтительно гуманизированные иммуноглобулины или антитела связывают антиген с аффинностью, которая в три, четыре или в пять раз выше аффинности соответствующего негуманизированного антитела. Например, если величина аффинности связывания негуманизированного антитела 109 М-1, аффинность связывания гуманизированных антител составляет по меньшей мере 3109 М-1, 4109 М-1 или 5109 М-1. При описании связывающих свойств цепи иммуноглобулина или антитела цепь можно описывать с учтом е способности "направлять связывание с антигеном (например, А). Говорят, что цепь"направляет (нацеливает, регулирует) связывание с антигеном", когда она сообщает интактному иммуноглобулину или антителу (или его антигенсвязывающему фрагменту) признак специфического связывания или аффинность связывания. Говорят, что мутация (например, обратная мутация) в значительной степени (заметно) влияет на способность тяжлой или лгкой цепи направлять связывание антигена, если она изменяет (например, понижает) величину аффинности связывания интактного иммуноглобулина или антитела (или его антигенсвязывающего фрагмента), содержащего боковую цепь, по меньшей мере, на порядок по сравнению с аффинностью антитела (или его антигенсвязывающего фрагмента), содержащего эквивалентную цепь, в которой отсутствует указанная мутация. Мутация "практически не влияет (например, понижает) на способность цепи направлять связывание антигена", если она изменяет (например,понижает) аффинность связывания интактного иммуноглобулина или антитела (или его антигенсвязывающего фрагмента), содержащего боковую цепь, только в два, три или четыре раза по сравнению с антителом (или его антигенсвязывающим фрагментом), содержащим эквивалентную цепь без указанной мутации. Термин "химерный иммуноглобулин" или "химерное антитело" относится к иммуноглобулину или антителу, вариабельная область которого образована из первого вида, а константные области образованы из второго вида. Химерные иммуноглобулины или антитела можно конструировать, например, методами рекомбинантной ДНК, при использовании генных сегментов, кодирующих иммуноглобулины, принадлежащих к различным видам. Не предполагается, что термины "гуманизированный иммуноглобулин" или "гуманизированное антитело" охватывают химерные иммуноглобулины или антитела по определению ниже. Хотя гуманизированные иммуноглобулины или антитела являются химерными по своей кон-7012407 струкции (т.е. содержат области из более одного вида белка), они включают дополнительные признаки(т.е. вариабельные области, содержащие донорные CDR остатки и акцепторные каркасные остатки), не обнаруженные в химерных иммуноглобулинах и антителах по данному описанию."Антиген" представляет собой объект (например, белковый объект или пептид), с которым антитело связывается специфически. Термин "эпитоп" или "антигенная детерминанта" относится к сайту на антигене, с которым иммуноглобулин или антитело (или его антигенсвязывающий фрагмент) специфически связывается. Эпитопы могут образовываться как из соседних (непрерывных) аминокислот, так и не из соседних (не непрерывных) аминокислот, расположенных рядом вследствие скручивания белка (третичная структура). Эпитопы, образованные из соседних аминокислот, как правило, сохраняются при экспозиции с денатурирующими растворителями, тогда как эпитопы, образованные за счт третичной структуры (скручивание), как правило, утрачиваются под действием денатурирующих растворителей. Как правило, эпитоп включает по меньшей мере 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 или 15 аминокислот в уникальной пространственной конформации. Способы определения пространственной конформации эпитопов включают, например,рентгеновскую кристаллографию и 2-мерный ядерный магнитный резонанс. См., например, Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, vol. 66, G.E. Morris, Ed. (1996). Антитела, которые распознают одинаковый эпитоп, можно идентифицировать простым иммуноанализом, показывающим способность одного антитела блокировать связывание другого антитела с антигеном-мишенью, т.е. анализом конкурентного связывания. Конкурентное связывание определяется анализом, в котором тестируемый иммуноглобулин ингибирует специфическое связывание эталонного антитела (антитела сравнения) с обычным антигеном, таким как A. Известно множество типов анализа конкурентного связывания, например твердофазный прямой или непрямой радиоиммуноанализ(RIA), твердофазный прямой или непрямой ферментный иммуноанализ (EIA), конкурентный сэндвичанализ (см. Stahli et al., Methods in Enzymology, 9:242 (1983; твердофазный прямой EIA с мечением комплексом биотин-авидин (см. Kirkland et al., J. Immunol. 137:3614 (1986; твердофазный прямой анализ с меткой, твердофазный прямой сэндвич-анализ с меткой (см. Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory(см. Cheung et al., Virology, 176:546 (1990 и прямой RIA с меткой (Moldenhauer et al., Scand. J. Immunol. 32:77 (1990. Как правило, такой анализ включает применение очищенного антигена, связанного с тврдой поверхностью, или клетками, несущими любой из двух иммуноглобулинов: немеченый тестируемый иммуноглобулин и меченый эталонный иммуноглобулин. Конкурентное ингибирование измеряют, определяя количество метки, связанной с тврдой поверхностью или клетками, в присутствии тестируемого иммуноглобулина. Обычно тестируемый иммуноглобулин присутствует в избытке. Обычно, когда конкурентное антитело присутствует в избытке, оно ингибирует специфичное связывание эталонного антитела с обычным антигеном по меньшей мере на 50-55%, 55-60%, 60-65%, 65-70%, 70-75% или более. Эпитоп также распознатся иммунологическими клетками, например B-клетками и/или T-клетками. Клеточное распознавание эпитопа можно определить с помощью анализов in vitro, в которых измеряют антигензависимую пролиферацию, как определяют с помощью введения 3 Н-тимидина, секреции цитокинов, секреции антител или антигензависимого киллинга (анализ цитотоксических лимфоцитов). Примеры эпитопов или антигенных детерминант можно найти в (внутри) человеческом амилоидном белке-предшественнике (APP), но предпочтительно их находят внутри A пептида APP. Существует множество изоформ APP, например APP695, APP751 и APP770. Аминокислотам внутри (в) APP присваиваются номера в соответствии с последовательностью изоформы APP770 (см., например, GenBank AccessionNo. P05067). A (также называемый в данном описании бета-амилоидный пептид и А-бета) пептид представляет собой внутренний фрагмент протяжнностью 4 кДа, из 39-43 аминокислот APP (A39, A40,A41, A42 и A43). Например, A40 состоит из остатков 672-711, а A42 состоит из остатков 673-713APP. В результате протеолитического процессинга APP под действием различных секретаз in vivo или invitro A обнаруживают как в "короткой форме" протяжнностью 40 аминокислот, так и в "длинной форме" протяжнностью 42-43 аминокислоты. Предпочтительные эпитопы, или антигенные детерминанты,по данному описанию расположены в N-конце A пептида и включают остатки в пределах аминокислотA, предпочтительно остатки 1-3, 1-4, 1-5, 1-6, 1-7 или 3-7 A42 пептида. Дополнительные вышеупомянутые эпитопы или антигенные детерминанты включают остатки 2-4, 5, 6, 7 или 8 A, остатки 3-5, 6, 7, 8 или 9 A или остатки 4-7, 8, 9 или 10 A42. Когда говорят, что антитело связывается с эпитопом в пределах конкретных остатков, таких как A 3-7, это означает, что антитело специфически связывается с полипептидом, содержащим конкретные остатки (например, в данном примере A 3-7). Такое антитело не обязательно контактирует с каждым остатком в пределах A 3-7. Не обязательно каждая единичная аминокислотная замена или делеция в A 3-7 в значительной степени влияет на аффинность связывания. Термин "амилоидогенное заболевание" включает любое заболевание, ассоциированное с (или вызванное) образованием или отложением нерастворимых амилоидных фибрилл. Примеры амилоидогенных заболеваний включают, но без ограничения, системный амилоидоз, болезнь Альцгеймера, диабет-8012407 взрослых, болезнь Паркинсона, болезнь Хантингтона, фронтотемпоральную деменцию и прионные трансмиссивные губкообразные энцефалопатии (куру и болезнь Крейтцфельда-Якоба у людей и почесуха и BSE у овец и крупного рогатого скота соответственно). Различные амилоидогенные заболевания определяют или характеризуют в зависимости от природы полипептидного компонента отлагающихся фибрилл. Например, у субъектов или пациентов, больных болезнью Альцгеймера, -амилоидный белок(например, дикого типа, вариант или усечнный (процессированный) -амилоидный белок) является отличительным (характеризующим) пептидным компонентом амилоидного отложения. Следовательно,болезнь Альцгеймера является примером "заболевания, характеризующегося отложениями A", или "заболевания, ассоциированного с (обусловленного) отложениями A", например, в мозгу субъекта или пациента. Термины "-амилоидный белок", "-амилоидный пептид", "-амилоид", "A" и "A пептид" применяются в данном описании взаимозаменяемо, на равных основаниях."Иммуногенный агент" или "иммуноген" способен индуцировать иммунологический ответ против самого себя при введении млекопитающему, необязательно в сочетании с адъювантом. Термин "лечение", "обработка" по данному описанию определяется как применение или введение терапевтического агента пациенту либо применение или введение терапевтического агента в выделенную ткань или клеточную линию пациента, имеющего заболевание, симптом заболевания или предрасположенность к заболеванию, с целью лечения, исцеления, ослабления, облегчения, изменения, излечения, уменьшения интенсивности, улучшения или влияния на заболевание, симптомы заболевания или предрасположенности к заболеванию. Термин "эффективная доза", "эффективная дозировка" определяется как количество, достаточное для достижения или, по меньшей мере, частичного достижения желаемого эффекта. Термин "терапевтически эффективная доза" определяется как количество, достаточное для излечения или, по меньшей мере, частичного подавления заболевания и его осложнений у больного, уже страдающего этим заболеванием. Количества, эффективные для этой цели, зависят от опасности (тяжести) инфекции и общего состояния собственной иммунной системы пациента. Термин "пациент" ("больной") включает человека или другого млекопитающего субъекта, который получает либо профилактическое, либо терапевтическое лечение."Растворимый" или "диссоциированный" A относится к неагрегированному или дезагрегированному A полипептиду, включая мономерный растворимый, а также олигомерный растворимый A полипептид (например, растворимые A димеры, тримеры и т.п.). "Нерастворимый" A относится к агрегированному A полипептиду, например A, удерживаемому вместе за счт нековалентных связей. Полагают, что A (например, A42) агрегируется, по меньшей мере частично, вследствие присутствия гидрофобных остатков на С-конце пептида (часть трансмембранного домена APP). Растворимый A можно обнаружить in vivo в биологических жидкостях, таких как спинно-мозговая (цереброспинальная) жидкость и/или сыворотка. Или же растворимый A можно получать, растворяя лиофилизированный пептид в чистом ДМСО под действием ультразвука. Полученный раствор центрифугируют (например, при 14000g, 4 С, 10 мин) для удаления нерастворимых макрочастиц. Термин "эффекторная функция" относится к активности, которая расположена в Fc-области антитела (например, IgG антитела) и включает, например, способность антитела связывать эффекторные молекулы, такие как комплемент и/или Fc-рецепторы, которая может контролировать некоторые иммунные функции антитела, такие как активность эффекторной клетки, лизис, комплемент-опосредованная активность, клиренс антитела и период полужизни антитела. Термин "эффекторная молекула" относится к молекуле, которая способна связываться с Fcобластью антитела (например, IgG антитела), включая, но без ограничения, белок комплемента или Fcрецептор. Термин "эффекторная клетка" относится к клетке, способной связываться с Fc участком антитела(например, IgG антитела), как правило, за счт Fc-рецептора, экспрессированного на поверхности эффекторной клетки, включая, но без ограничения, лимфоциты, например антигенпрезентирующие клетки иT-клетки. Термин "Fc-область (участок)" относится к С-концевой области IgG антитела, в частности С-концевой области тяжлой(ых) цепи(ей) указанного IgG антитела. Хотя границы Fc-области тяжлой цепи IgG могут немного меняться, Fc-область, как правило, определяют как интервал примерно от аминокислотного остатка Cys226 до карбоксильного конца тяжлой(ых) цепи(ей) IgG. Термин "номенклатура Kabat", если не указано иначе, определяется как нумерация остатков, например, антитела с тяжлой цепью IgG с применением EU индекса по Kabat et al. (Sequences of Proteins ofImmunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991, специально вводимом в данное описание в качестве ссылки. Термин "Fc-рецептор" или " FcR" относится к рецептору, который связывается с Fc-областью антитела. Типичные Fc-рецепторы, которые связываются с Fc-областью антитела (например, IgG антитела),включают, но без ограничения, рецепторы подклассов FcRI, FcRII и FcRIII, включая аллельные варианты и формы альтернативного сплайсинга этих рецепторов. Обзоры по Fc-рецепторам см. в Ravetch andI. Иммунологические и терапевтические реагенты. Иммунологические и терапевтические реагенты по изобретению содержат иммуногены или антитела или их функциональные или антигенсвязывающие фрагменты по данному описанию или состоят из иммуногенов или антител или их функциональных или антигенсвязывающих фрагментов. Известно, что основная структурная единица антитела представляет собой тетраметр субъединиц. Каждый тетраметр состоит из двух идентичных пар полипептидньгх цепей, причм каждая пара имеет одну "лгкую" (около 25 кДа) и одну "тяжлую" (около 50-70 кДа) цепь. Аминоконцевой участок каждой цепи включает вариабельную область примерно из 100-110 или более аминокислот, главным образом ответственных за распознавание антигена. Карбоксиконцевой участок каждой цепи определяет константную область, прежде всего ответственную за эффекторную функцию. Лгкие цепи классифицируются либо как каппа , либо как лямбдаи имеют протяжнность около 230 остатков. Тяжлые цепи классифицируются как гамма , мю , альфа , дельтаили ипсилон , имеют протяжнность около 450-600 остатков и определяют изотип антитела как IgG, IgM,IgA, IgD и IgE, соответственно. Как тяжлые, так и лгкие цепи скручиваются в домены. Термин "домен" относится к глобулярной области белка, например иммуноглобулина или антитела. Домены иммуноглобулина или антитела включают, например, три или четыре пептидные петли, стабилизированные с помощью -складки и межцепной дисульфидной связи. Интактные лгкие цепи имеют, например, два домена (VL и CL), а интактные тяжлые цепи имеют, например, четыре или пять доменов (VH, CH1, CH2 иCH3). В пределах лгкой и тяжлой цепей вариабельные и константные области соединяются "J" (шарнирной) областью, состоящей примерно из 12 или более аминокислот, при этом тяжлая цепь может также включать "D" область, содержащую около 10 или более аминокислот (см. в общем FundamentalImmunology (Paul, W., 2nd ed. Raven Press, N.Y. (1989), Ch. 7, вводится в данное описание во всей полноте в качестве ссылки для всех целей). Вариабельные области каждой пары лгкой/тяжлой цепей образуют сайт связывания антитела. Следовательно, интактное антитело имеет два сайта связывания. За исключением бифункциональных,или биспецифических антител два сайта связывания в антителах одинаковы. У всех цепей наблюдается одинаковая общая структура относительно консервативных каркасных участков (областей) (FR), соединнных тремя гипервариабельными участками, также называемыми областями, определяющими комплементарность, или CDR. Природные цепи или цепи, полученные методом рекомбинантной ДНК, могут экспрессироваться при использовании лидерной последовательности, которая удаляется при клеточном процессинге, давая зрелую цепь. Зрелые цепи можно также получать методом рекомбинантной ДНК (рекомбинантного продуцирования) с использованием неприродной лидерной последовательности, например, для повышения секреции или изменения процессинга конкретной представляющей интерес цепи. Области CDR двух зрелых цепей каждой пары выравнивают по каркасным участкам, давая возможность связываться со специфичным эпитопом. От N-конца до С-конца как лгкая, так и тяжлая цепи содержат домены FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 и FR4. В уровне техники область "FR4" также называют D/J участок вариабельной области тяжлой цепи и J участок вариабельной области лгкой цепи. Отнесение аминокислот к каждому домену делается в соответствии с определениями Kabat et al.Sequences of Proteins of Immunological Interest, (National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1987 and 1991). Альтернативное определение структуры предложено Clothia et al., J. Mol. Biol. 196:901 (1987); Nature,342:878 (1989) и J. Mol. Biol. 186:651 (1989) (в целом далее в данном описании эти материалы обозначаются "Clothia et al." и вводятся ссылкой во всей полноте для всех целей). А. A антитела. Терапевтические агенты по изобретению включают антитела, которые специфически связываются сA или другими компонентами амилоидной бляшки. Предпочтительными антителами являются моноклональные антитела. Некоторые такие антитела специфически связываются с агрегированной формойA, не связываясь с растворимой формой. Некоторые антитела специфически связываются с растворимой формой, не связываясь с агрегированной формой. Некоторые антитела связываются как с агрегированной, так и с растворимой формами. Антитела, применяющиеся в терапевтических методах, предпочтительно имеют интактную константную область или по меньшей мере часть константной области, достаточную для того, чтобы взаимодействовать с Fc-рецептором. Предпочтительными антителами являются антитела, эффективно стимулирующие Fc-опосредованный фагоцитоз A в бляшках. Предпочтительным является человеческий изотип IgG1 вследствие его наиболее высокой из человеческих изотипов аффинности к FcRI рецептору на фагоцитарных клетках (например, в находящихся в мозгу макрофагах или микроглиальных клетках). Человеческий IgG1 является эквивалентом мышиного IgG2a, таким образом,последний пригоден для проверки in vivo эффективности на животных (например, на мышиных) моделях болезни Альцгеймера. Также можно использовать биспецифические Fab-фрагменты, в которых одно плечо антитела имеет специфичность к A, а другое - к Fc-рецептору. Предпочтительные антитела свя-10012407 зываются с A с аффинностью связывания, более высокой, чем (или равной) примерно 106, 107, 108, 109 или 1010 М-1 (включая промежуточные между этими величинами значения аффинности). Моноклональные антитела связываются со специфическим эпитопом в A, который может быть конформационным или неконформационным эпитопом. Профилактическую и терапевтическую эффективность антител можно проверить по методикам с применением трансгенной животной модели, описанным в примерах. Предпочтительные моноклональные антитела связываются с эпитопом в пределах остатков 1-10 A (при этом первый N-концевой остаток природного A обозначается 1), более предпочтительно с эпитопом в остатках 3-7 A. В некоторых методах используют множество моноклональных тел, имеющих специфичности связывания с различными эпитопами, например антитело, специфичное к эпитопу в пределах остатков 3-7 A, можно вводить совместно с антителом, специфичным к эпитопу вне остатков 3-7 A. Такие антитела можно вводить последовательно или одновременно. Можно также использовать (например, вводить или совместно вводить) антитела к амилоидным компонентам, иным, нежели A. Эпитопную специфичность антитела можно определить, например, путм создания на основе фагового дисплея библиотеки, в которой различные члены визуализируют различные субпоследовательностиA. Затем из библиотеки на основе фагового дисплея проводят селекцию членов, специфически связывающихся с испытуемым антителом. Выделяют семейство последовательностей. Как правило, такое семейство содержит обычную ядерную последовательность и фланкирующие последовательности изменяющейся протяжнности у разных членов. Наиболее короткая ядерная последовательность, проявляющая специфическое связывание с антителом, определяет эпитоп, связанный с антителом. Антитела также можно проверять на эпитопную специфичность конкурентным анализом с антителом, чья эпитопная специфичность уже определена. Например, антитела, которые конкурируют с антителом 12 А 11 за связывание с A, связываются с тем же или аналогичным эпитопом, что и 12 А 11, т.е. в пределах остатков 3-7A. Скрининг антител на эпитопную специфичность является полезным прогнозом терапевтической эффективности. Например, антитело, определнное как связывающееся с эпитопом в пределах остатков 1-7A, вероятно, является эффективным для предупреждения и лечения болезни Альцгеймера по методам настоящего изобретения. Антитела, которые специфически связываются с предпочтительным сегментом A, не связываясь с другими участками A, имеют ряд преимуществ перед моноклональными антителами, связывающимися с другими участками, или поликлональными сыворотками к интактному А. Во-первых, при равных массовых дозах антител, дозы антител, специфически связывающихся с предпочтительными сегментами,содержат более высокие молярные дозы антител, эффективно очищают (просветляют) амилоидные бляшки. Во-вторых, антитела, специфически связывающиеся с предпочтительными сегментами, могут индуцировать реакцию очищения в отношении амилоидных отложений, не индуцируя реакцию очищения в отношении интактного A полипептида, тем самым уменьшая возможные побочные эффекты. 1. Получение нечеловеческих антител. Настоящее изобретение охватывает нечеловеческие антитела, например антитела, имеющие специфичность к предпочтительным A эпитопам по изобретению. Такие антитела можно использовать при приготовлении различных терапевтических композиций по изобретению или предпочтительно для создания гипервариабельных участков с целью получения гуманизированных химерных антител (подробно описанных ниже). Получение нечеловеческих моноклональных антител, например мышиных, морских свинок, приматов, кролика или крысы, можно выполнять,например, иммунизацией животного с помощью A. Можно также использовать более протяжнный полипептид, содержащий A или иммуногенный фрагмент A, или антиидиотипические антитела к антителу к A (см. выше учебник HarlowLane, вводимый в данное описание в качестве ссылки для всех целей). Такой иммуноген можно получать из природного источника, пептидным синтезом или рекомбинантной экспрессией. Необязательно, иммуноген можно вводить слитым или в виде иного комплекса с белком-носителем, описанным ниже. Необязательно, иммуноген можно вводить с адъювантом. Термин"адъювант" относится к соединению, которое при совместном введении с антигеном повышает иммунный ответ на антиген, но при индивидуальном введении не вызывает иммунный ответ на антиген. Адъюванты могут усиливать иммунный ответ по нескольким механизмам, включая рекрутинг лимфоцитов,стимуляцию В- и/или T-клеток и стимуляцию макрофагов. Некоторые типы адъювантов можно использовать, как описано ниже. Для иммунизации лабораторных животных предпочтительно применять полный адъювант Фрейнда с последующим применением неполного адъюванта. Кроликов или морских свинок, как правило, применяют для получения поликлональных антител. Примерное получение поликлональных антител, например, для пассивной защиты можно осуществлять следующим образом. 125 нетрансгенных мышей иммунизируют с помощью 100 мкг A1-42 плюс адъювант CFA/IFA и подвергают эвтаназии через 4-5 месяцев. Собирают кровь иммунизированных мышей.IgG отделяют от других компонентов крови. Антитела, специфичные к иммуногену, можно частично очистить аффинной хроматографией. В среднем от одной мыши получают 0,5-1,0 мг иммуноген-11012407 специфичного антитела, что в целом дат 60-120 мг. Мышей обычно используют для получения моноклональных антител. Моноклональные антитела против фрагмента можно получать, инъецируя мышам фрагмент или более протяжнную форму A, получая гибридомы и проводя скрининг гибридом на антитело, которое специфически связывается с A. Необязательно, проводят скрининг антител на связывание с конкретным участком или заданным фрагментом А без связывания с другими неперекрывающимися фрагментами A. Последний скрининг можно выполнять, определяя связывание антитела с коллекцией мутантов с делецией A пептида и определяя, какие мутанты с делецией связываются с антителом. Связывание можно оценивать, например, Вестерн-блоттингом или методом ELISA. Наименьший фрагмент, проявляющий специфическое связывание с антителом, определяет эпитоп антитела. Или же эпитопную специфичность можно определить конкурентным анализом, в котором тестируемое и эталонное антитела конкурируют за связывание с A. Если тестируемое и конкурентное антитела конкурируют, значит, они связываются с одним и тем же эпитопом или эпитопами, достаточно проксимальными, так что связывание одного антитела мешает связыванию другого. Предпочтительным изотипом для таких антител является мышиный изотип IgG2a или эквивалентный изотип других видов. Мышиный изотип IgG2a является эквивалентом человеческого изотипаIgG1 (например, человеческого (h) IgG1). 2. Химерные и гуманизированные антитела. Настоящее изобретение также охватывает химерные и/или гуманизированные антитела (т.е. химерные и/или гуманизированные иммуноглобулины), специфичные к бета-амилоидному пептиду. Химерные и/или гуманизированные антитела имеют специфичность связывания и аффинность, одинаковую с или аналогичную специфичности связывания и аффинности мышиного или другого нечеловеческого антитела, которое обеспечивает исходный материал для конструкции химерного или гуманизированного антитела. а) Получение химерных антител. Термин "химерное антитело" относится к антителу, гены лгкой и тяжлой цепи которого создают,как правило, методами рекомбинантной ДНК из сегментов генов иммуноглобулинов, принадлежащих к разным видам. Например, вариабельные (V) сегменты генов мышиного моноклонального антитела можно соединять с человеческими константными (С) сегментами, такими как IgG1 и IgG4. Предпочтительным является человеческий изотип IgG1. Таким образом, типичное химерное антитело представляет собой химерный белок, состоящий из V или антигенсвязывающего домена мышиного антитела и из С или эффекторного домена человеческого антитела. б) Получение гуманизированных антител. Термин "гуманизированное антитело" относится к антителу, содержащему по меньшей мере одну цепь, включающую каркасные остатки вариабельной области, главным образом, цепи человеческого антитела (называемого акцепторым иммуноглобулином или антителом), и по меньшей мере один гипервариабельный участок, главным образом, мышиного антитела (называемого донорным иммуноглобулином или антителом). См., Queen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:10029-10033 (1989), патенты США 5530101, 5585089, 5693761, 5693762, Selick et al., Международная заявка WO 90/07861 и Winter, патент США 5225539 (вводимые в данное описание в качестве ссылки для всех целей). Константная(ые) область(и), если она(и) присутствует(ют), также состоят в основном (практически) или полностью из человеческого иммуноглобулина. Наиболее вероятно, что замена мышиных CDR на каркасный участок человеческого вариабельного домена приведт к сохранению их корректной пространственной ориентации, если каркасный участок вариабельной области принимает конформацию, такую же или аналогичную конформации каркасного участка мышиного вариабельного домена, из которого происходят CDR. Этого достигают, получая человеческие вариабельные домены из человеческих антител, каркасные последовательности которых проявляют высокую степень идентичности каркасным участкам вариабельных доменов, из которых образованы CDR. Каркасные участки вариабельных доменов тяжлой и лгкой цепей можно получать из одинаковых или различных последовательностей человеческого антитела. Последовательности человеческого антитела могут быть последовательностями природных человеческих антител или могут быть консенсусными последовательностями нескольких человеческих антител. См. Kettleborough et al., Protein Engineering 4:773 (1991); Kolbinger et al., Protein Engineering 6:971 (1993) и Carter et al., Международная заявкаWO 92/22653. После идентификации гипервариабельных участков мышиного донорного иммуноглобулина и соответствующих человеческих акцепторных иммуноглобулинов следующей стадией является определение, какие, если таковые есть, остатки из этих компонентов следует заменить для оптимизации свойств полученного гуманизированного антитела. Вообще говоря, замену человеческих аминокислотных остатков на мышиные следует свести к минимуму, так как введение мышиных остатков повышает риск того,что антитело вызовет реакцию человеческого антитела против мышиного антитела (HAMA) у людей. Можно применять признанные в технике методы определения иммунного ответа для мониторингаHAMA ответа у конкретного пациента или в ходе клинических испытаний. У пациентов, которым вводят-12012407 гуманизированные антитела, можно проводить оценку иммуногенности в начале и в ходе проведения указанной терапии. HAMA ответ измеряют, например детектируя антитела к гуманизированному терапевтическому реагенту, в сывороточных образцах пациента по методу, известному специалисту в данной области техники, включая метод поверхностного плазмонного резонанса (Biacore) и/или твердофазныйELISA анализ. Некоторые аминокислоты их каркасных остатков вариабельной области выбирают для замены с учтом их возможного влияния на CDR конформацию и/или связывание с антигеном. Необычное наложение мышиных CDR участков и каркасного участка человеческой вариабельной области может вызвать необычные конформационные ограничения (затруднения), которые, если не корректировать путм замены некоторых аминокислотных остатков, приводят к утрате аффинности связывания. Выбор аминокислотных остатков для замены определяют, частично, компьютерным моделированием. Аппаратное и программное компьютерное обеспечение указано в данном описании для получения трхмерных изображений молекул иммуноглобулинов. Как правило, молекулярные модели получают,опираясь на решнные структуры цепей иммуноглобулинов или их доменов. Цепи, которые следует моделировать, сравнивают для установления сходства их аминокислотных последовательностей с аминокислотными последовательностями цепей или доменов решнных трхмерных структур, и цепи или домены, в которых имеется наибольшее сходство (подобие) последовательностей, выбираются в качестве исходных для построения молекулярной модели. Цепи или домены с идентичностью последовательностей по меньшей мере 50% выбирают для моделирования и предпочтительно для моделирования выбирают цепи или домены с идентичностью последовательностей по меньшей мере 60, 70, 80, 90% или более. Решнные начальные (исходные) структуры модифицируют таким образом, чтобы допустить различия между действительными аминокислотами в моделируемых цепях или доменах иммуноглобулина и в исходной структуре. Затем модифицированные структуры собирают в составной иммуноглобулин. Наконец, модель уточняют на основе минимизации энергии и подтверждают, что все атомы находятся на соответствующих расстояниях друг от друга и что длины связей и углы находятся в химически допустимых пределах. Выбор аминокислотных остатков для замены можно также определить, частично изучая характеристики аминокислот в конкретных местоположениях, или эмпирическим изучением эффектов замены или мутагенеза конкретных аминокислот. Например, если имеется отличие аминокислоты между каркасным остатком мышиной вариабельной области и выбранным каркасным остатком человеческой вариабельной области, человеческую каркасную аминокислоту обычно заменяют на эквивалентную каркасную аминокислоту из мышиного антитела, когда имеются основания ожидать, что аминокислота:(3) иным образом взаимодействует с CDR участком (например, находится на расстоянии около 3-6 от участка CDR, как определено на компьютерной модели) или(4) принимает участие в VL-VH интерфейсе (поверхности раздела). Остатки, которые "непосредственно связываются с антигеном нековалентной связью (нековалентно)", включают аминокислоты в положениях в каркасных участках (областях), которые имеют хорошую возможность непосредственно взаимодействовать с аминокислотами на антигене в соответствии с известными химическими силами, например, за счт водородных связей, сил Ван-дер-Ваальса, гидрофобных взаимодействий и т.п.CDR и каркасные области определяют по Kabat et al. или по Clothia et al., см. выше. Если каркасные остатки, определяемые по Kabat et al., см. выше, составляют остатки структурной петли, определяемые по Clothia et al., см. выше, мышиное антитело можно выбрать для замены в гуманизированное антитело. Остатки, которые "прилегают к CDR участку (области)", включают аминокислотные остатки в положениях, непосредственно прилегающих к одному или более CDR в первичной последовательности гуманизированной цепи иммуноглобулина, например в положениях, непосредственно прилегающих к CDR поKabat или CDR по Clothia (см., например, Clothia and Lesk, JMB, 196:901 (1987. Весьма вероятно, что эти аминокислоты взаимодействуют с аминокислотами в CDR и, будучи выбраны из акцептора, искажают донорные CDR и снижают аффинность. Кроме того, прилегающие аминокислоты могут взаимодействовать непосредственно с антигеном (Amit et al., Science, 233:747 (1986), вводится в данное описание в качестве ссылки), и выбор этих аминокислот из донора может быть желательным для всех сохранений контактов с антигеном, которые обеспечивают аффинность начального (исходного) антитела. Остатки, которые "иным образом (иначе) взаимодействуют с CDR областью", включают такие остатки, которые, по определению с помощью анализа вторичной структуры, имеют пространственную ориентацию, достаточную для того, чтобы влиять на CDR область. В одном варианте изобретения остатки, которые "иным образом взаимодействуют с CDR областью", определяют анализом трхмерной модели донорного иммуноглобулина (например, компьютерной модели). Анализ трхмерной модели, как правило, исходного (начального) донорного антитела показывает, что некоторые аминокислоты вне CDR расположены близко к CDR и имеют хорошую возможность взаимодействовать с аминокислотами вCDR за счт водородных связей, сил Ван-дер-Ваальса, гидрофобных взаимодействий и т.д. В этих ами-13012407 нокислотных положениях может быть предпочтительным выбрать аминокислоту донорного иммуноглобулина, нежели аминокислоту акцепторного иммуноглобулина. Аминокислоты согласно этому критерию, как правило, имеют в боковой цепи атом в пределах около 3 от некоего атома в CDR и должны содержать атом, который мог бы взаимодействовать с атомами CDR за счт известных химических сил,таких как перечисленные выше. Для атомов, которые могут образовывать водородную связь, расстояние 3 измеряют между ядрами атомов, но для атомов, которые не образуют связь, расстояние 3 измеряют между их ван-дерваальсовыми поверхностями. Следовательно, в последнем случае ядра должны быть в пределах около 6(3 плюс сумма ван-дер-ваальсовых радиусов) для атомов, рассматриваемых как способные взаимодействовать. Во многих случаях ядра находятся на расстоянии от 4 или 5 до 6 . При определении, может ли аминокислота реагировать с CDR предпочтительно не рассматривать последние 8 аминокислотCDR2 тяжлой цепи как часть CDR областей, так как с точки зрения структуры эти 8 аминокислот ведут себя скорее как часть каркаса. Аминокислоты, которые способны взаимодействовать с аминокислотами в CDR, можно определить и другим способом. Площадь доступной для растворителя поверхности каждой каркасной аминокислоты вычисляют двумя путями: (1) для интактного антитела и (2) для гипотетической молекулы, состоящей из антитела с удалнными CDR. Заметная разница между этими показателями, примерно 10 квадратных ангстрем или более, показывает, что доступ каркасной кислоты к растворителю, по меньшей мере, частично блокирован областями CDR, и, следовательно, аминокислота находится в контакте с CDR. Площадь доступной для растворителя поверхности аминокислоты можно вычислить на основе трхмерной модели антитела, используя известные из уровня технике алгоритмы (например, Connolly, J. Appl. Cryst. 16:548 (1983) и Lee and Richards, J. Mol. Biol. 55:379 (1971), каждая из этих статей вводится в данное описание в качестве ссылки). Иногда каркасные аминокислоты могут также взаимодействовать с областямиCDR не непосредственно, влияя на конформацию другой каркасной аминокислоты, которая, в свою очередь, контактирует с CDR. Известно, что каркасные аминокислоты в некоторых положениях важны для определения CDR конформации (например, способные взаимодействовать с CDR) во многих антителах (Clothia and Lesk,см. выше, Clothia et al., см. выше и Tramontano et al., J. Mol. Biol. 215:175 (1990), каждый из этих материалов вводится в данное описание в качестве ссылки). Эти авторы определяли консервативные каркасные остатки, важные для CDR конформации, анализируя структуры нескольких известных антител. Анализируемые антитела на основании конформации областей CDR относятся к ограниченному числу структурных или "канонических" классов. Консервативные каркасные остатки среди членов канонических классов называются "каноническими" остатками. Канонические остатки включают остатки 2, 25, 29,30, 33, 48, 64, 71, 90, 94 и 95 лгкой цепи и остатки 24, 26, 29, 34, 54, 55, 71 и 94 тяжлой цепи. Дополнительные остатки (например, остатки, определяющие структуру CDR) можно определить по методологииMartin and Thorton (1996), J. Mol. Biol. 263:800. Следует отметить, что аминокислоты в положениях 2, 48,64 и 71 лгкой цепи и 26-30, 71 и 90 тяжлой цепи (номенклатура Kabat), как известно, могут взаимодействовать с областями CDR во многих антителах. Аминокислоты в положениях 35 лгкой цепи и 93 и 103 в тяжлой цепи также, по-видимому, взаимодействуют с областями CDR. Дополнительные остатки, которые могут влиять на конформацию областей CDR, можно определить по методу Foote and Winter(1992), J. Mol. Biol. 224:487. Такие остатки называются остатки "вернье" (vernier) и представляют собой остатки в каркасной области, "лежащие в основании" (т.е. образующие "платформу" под) CDR. Во всех этих пронумерованных положениях выбор донорной аминокислоты для гуманизированного иммуноглобулина предпочтительнее акцепторной аминокислоты. С другой стороны, некоторые остатки, способные взаимодействовать с областью CDR, такие как первые 5 аминокислот лгкой цепи, можно иногда выбирать из акцепторного иммуноглобулина без потери аффинности в гуманизированном иммуноглобулине. Остатки, которые "принимают участие в VL-VH" интерфейсе (границе раздела)" или "остатки упаковки" включают остатки в поверхности раздела (интерфейсе) между VL и VH по определению, например в Novotny and Haber, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:4592-66(96) (1985) или Clothia et al., см. выше. Как правило, необычные остатки упаковки должны сохраняться в гуманизированном антителе, если они отличаются от остатков в человеческих каркасных участках. В целом, одна или более аминокислот, удовлетворяющих вышеуказанным критериям, могут быть заменены. В некоторых вариантах изобретения все или большинство аминокислот, удовлетворяющих вышеуказанным критериям, заменяются. Иногда, когда имеется некоторая неясность насчт того, удовлетворяет ли конкретная аминокислота вышеуказанным критериям, получают альтернативные вариантные иммуноглобулины, один из которых содержит эту конкретную замену, а другой не содержит. Альтернативные вариантные иммуноглобулины, полученные таким образом, можно исследовать любым из аналитических методов на заданную активность по данному описанию, и выбирают предпочтительный иммуноглобулин. Обычно области CDR в гуманизированных антителах практически идентичны и более обычно идентичны соответствующим областям CDR донорного антитела. Однако в некоторых вариантах изобретения может быть желательным модифицировать одну или более областей CDR с целью модификации-14012407 антигенсвязывающей специфичности антитела и/или уменьшения иммуногенности антитела. Как правило, один или более остатков CDR изменяют для модификации связывания с целью достижения более предпочтительной скорости on ("включения") связывания, более предпочтительной скорости off ("выключения") связывания или обеих, так что достигается идеальная константа связывания. С применением этой стратегии можно получить антитело со сверхвысокой аффинностью связывания, например 1010 М-1 или выше. Коротко, донорную CDR последовательность называют основной последовательностью, в которой затем меняют один или более остатков. Методы созревания аффинности по данному описанию можно использовать для изменения области(ей) CDR, с последующим скринингом полученных связывающих молекул на заданное изменение связывания. Можно использовать также способ изменения донорного CDR, как правило мышиного CDR, чтобы эта область стала менее иммуногенной, так чтобы свести к минимуму или избежать возможного ответа человеческого антитела против мышиного антитела(HAMA). Следовательно, при изменении областей CDR можно проводить мониторинг и оценку изменения аффинности связывания, а также иммуногенности, так чтобы оптимизировать антитело для достижения наивысшего общего (объединнного) связывания и низкой иммуногенности (см., например, патент США 6656467 и опубликованную патентную заявку США US 20020164326 А 1). В другом способе CDR участки антитела анализируют с целью определения вклада каждого отдельного участка CDR в связывание антитела и/или иммуногенность, систематически заменяя каждый из донорных участков CDR на человеческий эквивалент. Затем полученную панель гуманизированных антител оценивают на аффинность связывания и потенциальную иммуногенность каждого участка (области) CDR. Таким образом определяют два клинически важных свойства кандидатной связывающей молекулы, т.е. связывание с антигеном и низкую иммуногенность. Если доступны сыворотки пациента против соответствующей мышиной или CDR-трансплантированной (гуманизированной) формы антитела, тогда можно подвергнуть скринингу всю панель антител, представляющих систематические изменения человеческих CDR, с целью определения антиидиотипического ответа пациентов против каждого донорногоCDR (технические подробности см. Iwashi et al., Mol. Immunol. 36:1079-91 (1999. Такой подход позволяет идентифицировать основные (существенные, важные) донорные CDR области, отличить их от неосновных (несущественных) донорных CDR. Несущественные донорные CDR области можно затем заменить на человеческие эквивалентные CDR. Если существенную (основную) область CDR нельзя заменить без неприемлемой утраты функции, идентификацию остатков, определяющих специфичность (SDR) областей CDR, проводят, например, с помощью сайт-направленного мутагенеза. Таким образом, CDR можно затем воссоздать (реконструировать) так, чтобы сохранились только участки SDR и чтобы области CDR были человеческими и/или минимально иммуногенными в остальных аминокислотных положениях по всей области CDR. Такой подход, если "трансплантируется" только часть донорного CDR, также сокращенно называется CDR-графтинг (прививка, трансплантация, grafting) (технические подробности см., например, Tamura et al., J. of Immunology, 164(3):1432-41. (2000); Gonzales et al., Mol Immunol. 40:337-349 (2003); Kashmiri et al., Crit. Rev. Oncol. Hematol. 36:3-16 (2001) и De Pascslis et al., J. of Immunology, 169(6):3076-84 (2002. Кроме того, иногда можно сделать одну или более аминокислотных замен остатков CDR, не оказывая существенного влияния на аффинность связывания полученного гуманизированного иммуноглобулина. Под консервативными заменами полагают такие комбинации, как gly, ala; val, ile, leu; asp, glu; asn,gln; ser, thr; lys, arg и phe, tyr. Дополнительные кандидаты на замену представляют собой акцепторные человеческие каркасные аминокислоты, необычные или "редкие" для человеческого иммуноглобулина в данном положении. Эти аминокислоты можно заменять аминокислотами в эквивалентном положении мышиного донорного антитела или в эквивалентном положении более типичных человеческих иммуноглобулинов. Например, замена может быть желательной, когда аминокислота в человеческой каркасной области акцепторного иммуноглобулина является редкой для этого положения, а соответствующая аминокислота в донорном иммуноглобулине является обычной для этого положения в человеческих последовательностях иммуноглобулина или когда аминокислота в акцепторном иммуноглобулине является редкой для этого положения и соответствующая аминокислота в донорном иммуноглобулине является также редкой по сравнению с другими человеческими последовательностями. Когда при выборе остатков для обратной мутации учитывают вклад в CDR конформацию, следует также принимать во внимание, является ли остаток редким для акцепторных человеческих последовательностей. Например, если обратная мутация приводит к замене остатка, редкого для акцепторных человеческих каркасных последовательностей, гуманизированное антитело можно тестировать на активность с или без (обратной мутации). Если обратная мутация не является необходимой для активности, е можно исключить, чтобы не волноваться по поводу иммуногенности. Например, обратные мутации в следующих остатках могут ввести остаток, редкий в акцепторных человеческих каркасных последовательностях: uk=v2 (2,0%), L3 (0,4%), Т 7 (1,8%),Q18 (0,2%), L83 (1,2%), I85 (2,9%), А 100 (0,3%) и L106 (1,1%) и vh=Т 3 (2,0%), K5 (1,8%), I11 (0,2%), S23(1,5%), F24 (1,5%), S41 (2,3%), K71 (2,4%), R75 (1,4%), I82 (1,4%), D83 (2,2%) и L109 (0,8%). Эти критерии помогают гарантировать, что атипическая аминокислота в человеческой каркасной области не нарушит структуру антитела.-15012407 Кроме того, с помощью замены необычной человеческой акцепторной аминокислоты на аминокислоту донорного антитела, что является типичным для человеческих антител, гуманизированное антитело можно сделать менее иммуногенным. Термин "редкий", по данному описанию, указывает, что аминокислота встречается в этом положении менее чем примерно в 20%, предпочтительно менее чем примерно в 10%, более предпочтительно менее чем примерно в 5%, ещ предпочтительно менее чем примерно в 3%, ещ предпочтительно менее чем примерно в 2% и ещ предпочтительно менее чем примерно в 1% последовательностей в репрезентативной выборке последовательностей, а термин "обычный", по данному описанию, показывает, что аминокислота встречается более чем примерно в 25%, но более обычно более чем примерно в 50% последовательностей в репрезентативной выборке. Например, при решении, является ли человеческая акцепторная последовательность "редкой" или "обычной", часто предпочтительно рассматривать только последовательности человеческих вариабельных областей, а при решении, является ли мышиная аминокислота"редкой" или "обычной", предпочтительно рассматривать только последовательности мышиных вариабельных областей. Кроме того, все человеческие последовательности вариабельной области лгких и тяжлых цепей группируют в "подгруппы" последовательностей, которые особенно гомологичны друг с другом и имеют одинаковые аминокислоты в некоторых важных положениях (Kabat et al., см. выше). При решении, является ли аминокислота в человеческой акцепторной последовательности "редкой" или"обычной" среди человеческих последовательностей, часто предпочтительно рассматривать только эти человеческие последовательности в той же подгруппе, к которой относится акцепторная последовательность. Дополнительными кандидатами на замену являются акцепторные человеческие каркасные аминокислоты, которые обычно идентифицируют как часть CDR области по альтернативному определению,предложенному Clothia et al., см. выше. Дополнительными кандидатами на замену являются акцепторные человеческие каркасные аминокислоты, которые обычно идентифицируют как часть CDR области определяемых AbM и/или контактов. Дополнительными кандидатами на замену являются акцепторные каркасные остатки, которые соответствуют редкому или необычному донорному каркасному остатку. Редкие или необычные донорные каркасные остатки представляют собой такие остатки, которые являются редкими или необычными (по данному описанию) для мышиных антител в данном положении. Для мышиных антител подгруппу можно определить по Kabat и по положениям идентифицированных остатков, которые отличаются от консенсусной последовательности. Эти донор-специфические различия могут указать на соматические мутации в мышиной последовательности, которые повышают активность. Необычные остатки, предположительно влияющие на связывание (например, канонические остатки упаковки и/или вернье-остатки),сохраняют, тогда как остатки, предположительно неважные для связывания, можно заменить. Редкие остатки в последовательности 12 А 11 UK включают I85 (3,6%). Редкие остатки в последовательности 12 А 11 vh включают Т 3 (1,0%), I11 (1,7%), L12 (1,7%), S41 (2,8%), D83 (1,8%) и А 85 (1,8%). Дополнительными кандидатами на замену являются остатки не зародышевой линии, встречающиеся в акцепторной каркасной области. Например, когда цепь акцепторного антитела (т.е. человеческую цепь антитела, имеющую значительную степень идентичности последовательности с последовательностью цепи донорного антитела) выравнивают с цепью антитела зародышевой линии (также в значительной степени идентичной донорной цепи), несовпадающие остатки акцепторной каркасной цепи и каркасной цепи зародышевой линии можно заменить на соответствующие остатки последовательности зародышевой линии. Иные, нежели обсуждавшиеся выше специфичные аминокислотные замены, каркасные области гуманизированных иммуноглобулинов обычно практически (в основном) идентичны и более обычно идентичны каркасным областям человеческих антител, из которых они образованы. Конечно, многие аминокислоты каркасной области вносят малый или не прямой вклад в специфичность или аффинность антитела. Поэтому многие отдельные консервативные замены каркасных остатков можно допустить без заметного изменения специфичности или аффинности полученного гуманизированного иммуноглобулина. Так, в одном варианте изобретения вариабельная каркасная область гуманизированного иммуноглобулина по меньшей мере на 85% идентична последовательности человеческой вариабельной каркасной области или консенсусу таких последовательностей. В другом варианте изобретения вариабельная каркасная область гуманизированого иммуноглобулина по меньшей мере на 90% , предпочтительно на 95%,более предпочтительно на 96, 97, 98 или на 99% идентична последовательности человеческой вариабельной каркасной области или консенсусу таких последовательностей. В целом, однако, такие замены нежелательны. В примерах вариантов изобретения гуманизированные антитела по изобретению проявляют аффинность специфичного связывания с антигеном по меньшей мере 107, 108, 109 или 1010 M-1. В других вариантах антитела по изобретению могут иметь аффинность связывания по меньшей мере 1010, 1011 или 1012 М-1. Обычно верхний предел аффинности связывания гуманизированных антител с антигеном в три,четыре или в пять раз выше аффинности связывания донорного иммуноглобулина. Часто нижний предел аффинности связывания также в три, четыре или в пять раз выше аффинности связывания донорного-16012407 иммуноглобулина. Или же аффинность связывания можно сравнивать с аффинностью связывания гуманизированного антитела, не содержащего замен (например, антитела, содержащего донорные CDR и акцепторные FR, но не содержащее FR замен). В таких примерах связывание оптимизированного антитела(с заменами) предпочтительно по меньшей мере в два-три раза или в три-четыре раза выше, чем связывание незамещнного антитела. С целью проведения сравнения можно определить активность различных антител, например, методом Biacore (т.е. методом поверхностного плазмонного резонанса с применением немеченых реагентов) и методами анализа конкурентного связывания. с) Получение гуманизированных 12A11 антител. Предпочтительный вариант настоящего изобретения включает гуманизированное антитело кN-концу A для применения в терапевтических и/или диагностических методах по данному описанию. Особенно предпочтительным исходным материалом для получения гуманизированных антител является моноклональное антитело 12A11. 12A11 специфично к N-концу A и, как было показано, (1) имеет высокую авидность к агрегированному A 1-42; (2) способно захватывать растворимый A и (3) опосредует фагоцитоз (например, индуцирует фагоцитоз) амилоидной бляшки (см. пример I). In vivo эффективность антитела 12 А 11 описана в примере II. Клонирование и секвенирование кДНК, кодирующей вариабельные области тяжлой и лгкой цепи антитела 12 А 11, описаны в примере III. Подходящие последовательности человеческого акцепторного антитела можно идентифицировать с помощью компьютерного сравнения аминокислотных последовательностей мышиных вариабельных областей с последовательностями известных человеческих антител. Сравнение проводят отдельно для тяжлой и лгкой цепей, но принципы сравнения аналогичны. В частности, вариабельные домены человеческих антител, каркасные последовательности которых имеют высокую степень идентичности последовательностей с мышиными VL и VH каркасными областями, идентифицируют по запросу, например,из базы данных Kabat или из базы данных белковых последовательностей IgG, используя NCBI IgGBLAST (общедоступный через Интернет-сервер National Institutes of Health NCBI) с соответствующими мышиными каркасными последовательностями. В одном варианте изобретения выбирают акцепторные последовательности, более чем на 50% идентичные мышиным донорным последовательностям, например донорные каркасные (FR) последовательности. Предпочтительно выбирают последовательности акцепторного антитела с идентичностью последовательностей 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95% и выше. Компьютерное сравнение 12 А 11 показало, что лгкая цепь 12 А 11 (подгруппа мышей II) проявляет наибольшую идентичность последовательности с человеческими лгкими цепями подтипа каппа II и что тяжлая цепь 12 А 11 (подгруппа мышей IIb) проявляет наибольшую идентичность последовательности с человеческими тяжлыми цепями подтипа II, определение по Kabat et supra. Человеческие каркасные области лгкой и тяжлой цепей можно образовать из человеческих антител этих субтипов или из консенсусных последовательностей таких субтипов. При первой попытке гуманизации вариабельные каркасные области лгкой цепи были образованы из человеческих антител субгруппы II. Исходя из предыдущих экспериментов, поставленных с целью достичь высоких уровней экспрессии гуманизированных антител, имеющих вариабельные каркасные области тяжлых цепей, образованные из человеческих антител субгруппы II, было найдено, что уровни экспрессии таких антител иногда низки. Соответственно,на основании рассуждений, описанных в Saldanha et al., (1999), Mol. Immunol., 36:709-19, предпочтительно выбирают каркасные области человеческих антител субгруппы II, нежели человеческой субгруппы II. Как было идентифицировано при использовании нерезервированной NCBI базы данных, человеческое антитело K64 субгруппы II (AIMS4) (депонировано под номером ВАС 01733) имеет значительную идентичность последовательности с вариабельными областями лгкой цепи антитела 12 А 11. Как было идентифицировано при использовании нерезервированной NCBI базы данных, человеческое антитело М 72 субгруппы III (депонировано под номером AAA69734) имеет значительную идентичность последовательности с вариабельными областями тяжлой цепи антитела 12 А 11 (см. также Schroeder and Wang(1990), Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 872:6146-6150). Альтернативные акцепторные последовательности лгкой цепи включают, например, номер депонирования в PDB 1KFA (gi24158782), номер депонирования в PDB 1KFA (gi24158784), номер депонирования в EMBL CAE75574.1 (gi38522587), номер депонирования в EMBL CAE75575.1 (gi38522590), номер депонирования в EMBL САЕ 84952.1 (gi39838891),номер депонирования в DJB BAC01734.1 (gi21669419), номер депонирования в DJB BAC01730.1(gi21669431) и номер депонирования в DBJ BAC01733.1 (gi21669417). Альтернативные акцепторные по-17012407 следовательности тяжлой цепи включают, например, номер депонирования в GenBank AAB35009.1(gi4456494), GenBank AAA68892.1 (gi186190). В примерах изобретения гуманизированные антитела по изобретению включают области CDR и FR 12A11 из акцепторной последовательности, перечисленной выше. Остатки в пределах каркасных областей, важных для CDR конформации и/или активности по данному описанию, выбирают для обратной мутации (при различии между донорной и акцепторной последовательностями). Затем выбирают остатки для замены следующим образом. Если аминокислоты в вариабельной каркасной области 12 А 11 и в эквивалентной человеческой вариабельной каркасной области различаются,аминокислоту в человеческой каркасной области, как правило, следует заменить на мышиную аминокислоту, если резонно ожидать, что аминокислота:(1) непосредственно связывается с антигеном нековалентной связью (нековалентно);(2) прилегает к CDR области или является частью CDR области по альтернативному определению,предложенному Chothia et al., см. выше, или иным образом взаимодействует с CDR областью (например,в пределах около 3 от CDR области) или(3) принимает участие в VL-VH интерфейсе. Структурный анализ вариабельных областей тяжлой и лгкой цепей антитела 12 А 11 и гуманизация антитела 12 А 11 описаны в примере V. Коротко говоря, изучают трхмерные модели решнных структур мышиных антител 1KTR для лгкой цепи и 1JRH и 1ETZ для тяжлой цепи. Альтернативные трхмерные модели, которые можно изучить для идентификации остатков, важных для CDR конформации (например, остатков вернье зоны), включают номер депонирования в PDB 2JEL (gi3212688), номер депонирования в PDB 1TET (gi494639), номер депонирования в PDB IJP5 (gi16975307), номер депонирования в PDB 1CBV (gi493917), номер депонирования в PDB 2PCP (gi4388943), номер депонирования в(gi17942615) и номер депонирования в PDB 1KEL (gi1942968) для лгкой цепи и номер депонирования в(gi229915), номер депонирования в PDB 1KIP (gi1942788), номер депонирования в PDB 1KIQ (gi1942791) и номер депонирования в PDB 1VFA (gi576325) для тяжлой цепи. Информация о трхмерной структуре антител по данному описанию является общедоступной, например, из Банка данных белков Research Collaboratory for Structural Bioinformatics' Protein Data Bank(PDB). PDB имеет свободный доступ через Интернет (www) и описан Berman et al. (2000) Nucleic AcidsResearch, 28:235. Изучение решнных трхмерных структур позволяет идентифицироватьCDR-взаимодействующие остатки в (в пределах) 12 А 11. Или же трхмерные модели для VH и VL цепей антитела 12 А 11 можно получить с помощью компьютерной программы. Коротко говоря, трхмерную модель строят на основании ближайших решнных структур мышиного антитела для тяжлой и лгкой цепей. Для этой цели в качестве матрицы для моделирования лгкой цепи 12 А 11 можно использовать 1KTR, а в качестве матриц для моделирования тяжлой цепи можно использовать 1ETZ и 1JRH. Модель можно дополнительно уточнять с помощью ряда стадий минимизации энергии, чтобы отбросить нежелательные атомные контакты и оптимизировать взаимодействия за счт электростатических и ван-дерваальсовых сил. Дополнительный трхмерный анализ и/или моделирование можно осуществлять, используя 2JEL (2,5 ) и/или 1 ТЕТ (2,3 ) для лгкой цепи и 1GGI (2,8 ) для тяжлой цепи (или другие антитела, представленные выше), учитывая сходство между этими решнными мышиными структурами и соответствующими цепями 12 А 11. Компьютерная модель структуры 12A11 может далее служить в качестве исходной для прогнозирования трхмерной структуры антитела, содержащего гипервариабельные участки 12 А 11, замещнные в человеческих каркасных структурах. Можно создать дополнительные модели, представляющие собой структуру с дополнительно введнными аминокислотными заменами.-18012407 Вообще желательна замена одной, большинства или всех аминокислот, отвечающих вышеуказанным критериям. Соответственно, гуманизированные антитела по настоящему изобретению обычно содержат замену каркасного остатка человеческой лгкой цепи, соответствующего остатку 12 А 11 по меньшей мере в 1, 2, 3 или более выбранных положениях. Гуманизированные антитела также обычно содержат замену каркасного остатка человеческой тяжлой цепи, соответствующего остатку 12 А 11 по меньшей мере в 1, 2, 3 или более выбранных положениях. Однако иногда существует некая неопределнность относительно того, отвечает ли конкретная аминокислота вышеуказанным критериям, тогда получают альтернативные вариантные иммуноглобулины, один из которых содержит конкретную замену, а другой не содержит. В примерах (в случаях), когда замена на мышиный остаток вводит остаток, редкий в человеческих иммуноглобулинах в конкретном положении, может быть желательно проверить антитело на активность с конкретной заменой или без не. Если активность (например, аффинность связывания и/или специфичность связывания) примерно одинакова с заменой или без не, может быть предпочтительным антитело без замены, так как в этом случае можно меньше ожидать НАМА ответа по данному описанию. Другими кандидатами на замену являются акцепторные человеческие каркасные аминокислоты,необычные для человеческого иммуноглобулина в данном положении. Эти аминокислоты можно заменять на аминокислоты в эквивалентном положении более типичных человеческих иммуноглобулинов. Или же, аминокислоты из эквивалентных положений в мышином 12A11 можно вводить в человеческие каркасные области, когда такие аминокислоты являются типичными для человеческого иммуноглобулина в эквивалентных положениях. Другие кандидаты на замену представляют собой остатки незародышевой линии, встречающиеся в каркасной области. С помощью компьютерного сравнения 12A11 с известными последовательностями зародышевой линии можно идентифицировать зародышевые последовательности с наибольшей степенью идентичности тяжлой или лгкой цепи. Выравнивание каркасной области и последовательности зародышевой линии показывает, какие остатки можно выбрать для замены на соответствующие остатки зародышевой линии. Не совпадающие остатки выбранной акцепторной области лгкой цепи и одной из этих последовательностей зародышевой линии можно выбрать для замены на соответствующий остаток зародышевой линии. Редкие мышиные остатки идентифицируют, сравнивая донорную VL и/или VH последовательности с последовательностями других членов субгруппы (подгруппы), к которой принадлежат донорные VL и/или VH последовательности (по номенклатуре Kabat), и идентифицируя положения остатков, которые отличаются от консенсусных. Эти донор-специфические отличия могут указать на соматические мутации, которые повышают активность. Необычные или редкие остатки, близкие к сайту связывания, могут,вероятно, контактировать с антигеном, поэтому желательно сохранить мышиный остаток. Однако, если необычный мышиный остаток не важен для связывания, применение соответствующего акцепторного остатка является предпочтительным, так как мышиный остаток может создать иммуногенные неоэпитопы в гуманизированном антителе, которые повышают активность. В ситуации, когда необычный остаток в донорной последовательности в действительности является обычным остатком в соответствующей акцепторной последовательности, предпочтительный остаток, несомненно, является акцепторным остатком.-19012407 В табл. 1 А кратко изложен анализ последовательностей VH и VL областей 12 А 11. Таблица 1 Краткие сведения о последовательности V области антитела 12 А 11 1 Не канонический класс, но может образовывать изогнутое основание по правилам Представлены последовательности зародышевой линии, которые можно использовать при выборе аминокислотных замен. Информация о трхмерной структуре антител по данному описанию является общедоступной, например, из банка данных белков Research Collaboratory for Structural Bioinformatics' Protein Data Bank(PDB). PDB имеет свободный доступ через Интернет (www) и описан Berman et al. (2000), Nucleic AcidsResearch, p. 235-242. Последовательности зародышевой линии, которые упоминаются в данном описании, являются общедоступными, например в базе данных последовательностей Национального центра информации по биотехнологии (National Center for Biotechnology Information (NCBI) в коллекциях V генов Igh, Ig каппа и Ig лямбда зародышевой линии (отделение Национальной медицинской библиотеки(National Library of Medicine, NLM) при Национальном институте здоровья (National Institutes of Health(NIH. Поиск гомологий в базе данных NCBI "Ig Germline Genes" обеспечивается IgG BLAST. В примере варианта изобретения гуманизированное антитело по настоящему изобретению содержит (i) лгкую цепь, содержащую вариабельный домен, включающий мышиные 12 А 11 VL CDR области и человеческий акцепторный каркасный участок, причм в каркасном участке имеется ноль, один, два,три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять или более остатков, заменнных на соответствующий остаток 12 А 11, и (ii) тяжлую цепь, содержащую 12 А 11 VL CDR области и человеческий акцепторный каркасный участок, причм в каркасном участке имеется по меньшей мере один, два, три, четыре, пять,шесть, семь, восемь, девять или более остатков, заменнных на соответствующий остаток 12 А 11, и, необязательно, по меньшей мере один, предпочтительно два или три остатка, замещнных на соответст-20012407 вующий остаток человеческой зародышевой линии. В другом примере варианта изобретения гуманизированное антитело по настоящему изобретению содержит (i) лгкую цепь, содержащую вариабельный домен, включающий мышиные 12 А 11 VL CDR области и человеческий акцепторный каркасный участок, причм в каркасном участке имеется по меньшей мере один, два, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять или более остатков, полученных в результате обратной мутации (т.е. заменнных на соответствующий остаток 12A11), причм обратная(ые) мутация(и) в канонических остатках, остатках упаковки и/или в вернье-остатках, и (ii) тяжлую цепь,содержащую 12 А 11 VL CDR области и человеческий акцепторный каркасный участок, причм в каркасном участке имеется по меньшей мере один, два, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять или более остатков обратной мутации, причм обратная(ые) мутация(и) в канонических остатках, остатках упаковки и/или в вернье-остатках. В некоторых вариантах изобретения обратные мутации только в остатках упаковки и/или канонических остатках или, главным образом, в канонических остатках и/или остатках упаковки (например, только 1 вернье-остаток или 2 вернье-остатка из вернье-остатков, различающихся между донорной и акцепторной последовательностью, получен обратной мутацией). В других вариантах изобретения гуманизированные антитела включают наименьшее число обратных мутаций, возможных при сохранении аффинности связывания, сравнимой с аффинностью связывания донорного антитела (или его химерной версии). Для того чтобы прийти к таким версиям (вариантам),можно исключить различные комбинации обратных мутаций, а полученные антитела проверить на эффективность (например, аффинность связывания). Например, обратные мутации (например, 1, 2, 3 или 4 обратные мутации) в вернье-остатках можно исключить или обратные мутации в комбинациях вернье и упаковки, вернье и канонических или упаковки и канонических можно исключить. В другом варианте изобретения гуманизированное антитело по настоящему изобретению имеет структурные признаки по данному описанию и дополнительно имеет по меньшей мере одну (предпочтительно две, три, четыре или все) из следующих активностей: (1) связывает растворимый A; (2) связывает агрегированный A1-42 (например, по определению ELISA); (3) захватывает растворимый A; (4) связывает A в бляшках (например, окрашивание AD и/или PDAPP бляшек); (5) связывается с A с аффинностью не меньшей аффинности, в два-три раза более низкой, чем аффинность химерного 12 А 11 (например, 12 А 11, имеющего последовательности мышиной вариабельной области и последовательности человеческой константной области); (6) опосредует фагоцитоз A (например, в ex vivo анализе на фагоцитоз по данному описанию) и (7) проникает через гематоэнцефалический барьер (например, наблюдается кратковременная локализация в мозгу на животной модели PDAPP по данному описанию). В другом варианте изобретения гуманизированное антитело по данному изобретению имеет структурные признаки по данному описанию, так что оно связывает A таким образом или с аффинностью,достаточной, чтобы выявить по меньшей мере один из следующих in vivo эффектов: (1) снижение предрасположенности к образованию (количества, содержания) A бляшек; (2) предупреждение образования бляшек; (3) снижение уровней растворимого A; (4) снижение нейритной патологии, связанной с амилоидогенным нарушением; (5) уменьшение или облегчение по меньшей мере одного физиологического симптома, обусловленного амилоидогенным нарушением; и/или (6) улучшение когнитивной функции. В другом варианте изобретения гуманизированное антитело по данному изобретению имеет структурные особенности по данному описанию и специфично связывается с эпитопом, содержащим остатки 3-7 A. Ещ в одном варианте изобретения гуманизированное антитело по данному изобретению имеет структурные признаки по данному описанию, так что оно связывается с N-концевым эпитопом в пределах A (например, связывается с эпитопом в пределах аминокислот 3-7 A) и способно снижать (1) уровни A пептида; (2) предрасположенность к образованию (количество, содержание) A бляшек и (3) нейритную нагрузку или нейритную дистрофию, связанную с амилоидогенным нарушением. Активности, описанные выше, можно определять, применяя любой из ряда анализов по данному описанию или описанных в уровне техники (например, анализы связывания, анализы на фагоцитоз и т.д.). Активности можно анализировать либо in vivo (например, с применением меченых аналитических компонентов и/или методов визуализации), либо in vitro (например, используя пробы или образцы, взятые у субъекта). Активности можно анализировать либо непосредственно, либо опосредованно. В некоторых предпочтительных вариантах изобретения анализируют нейрологические показатели (конечные точки), например амилоидная нагрузка, нейритная нагрузка и т.д Такие показатели можно анализировать в живых субъектах (например, на животных моделях болезни Альцгеймера или на людях, например,проходящих иммунотерапию), используя методы неинвазивного обнаружения. Или же такие показатели можно анализировать в субъектах post mortem (посмертно). Анализ таких показателей на животных моделях и/или на людях post mortem применим при оценке эффективности различных агентов (например,гуманизированных антител) для аналогичного применения в иммунотерапии. В других предпочтительных вариантах изобретения поведенческие или нейрологические характеристики можно оценивать как индикаторы вышеуказанных нейропатологических активностей или показателей (конечных точек).-21012407 3. Получение вариабельных областей. Если мысленно выбирать CDR и каркасные компоненты гуманизированных иммуноглобулинов,множество методов годится для получения таких иммуноглобулинов. В общем, один или более мышиных гипервариабелъных участков (областей) (CDR) тяжлой и/или лгкой цепи антитела можно гуманизировать, например помещать в окружение одной или более человеческих каркасных областей с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР, PCR) с применением праймеров. Коротко говоря, создают праймеры, способные отжигаться (связываться) с нацеленным(и) мышиным(и) CDR участком(ами), которые также содержат последовательность, перекрывающую человеческую каркасную область и способную с ней отжигаться (связываться). Соответственно, в подходящих условиях праймеры могут амплифицировать мышиный CDR при использовании матричной нуклеиновой кислоты, кодирующей мышиное антитело, и добавлять к амплифицированной матрице участок человеческой каркасной последовательности. Аналогично, можно создать праймеры, способные связываться (отжигаться) с нацеленной(ыми) человеческой(ими) каркасной(ыми) областью(ями), при этом реакция ПЦР с применением этих праймеров приводит к амплифицировнной(ым) человеческой(им) каркасной(ым) области(ям). Если каждый продукт амплификации затем денатурировать, объединить и отжечь с другим продуктом, мышиный CDR участок,перекрывающийся с человеческой каркасной последовательностью с амплифицированной человеческой каркасной последовательностью, может быть генетически связан. Соответственно, в одной или более таких реакций один или более мышиных CDR можно генетически связать с имеющимися человеческими каркасными областями. В некоторых вариантах изобретения праймеры могут также содержать нужные последовательности,распознаваемые рестриктазами, для того, чтобы облегчить сборку результирующих ПЦРамплифицированных последовательностей методом рекомбинантной ДНК (генетической инженерии) в генетический сегмент большего размера, например вариабельный сегмент лгкой или тяжлой цепи, тяжлую цепь или вектор. Кроме того, праймеры, применяемые для амплификации либо мышиных CDR участков, либо человеческих каркасных областей, могут иметь нужные ошибочные спаривания (несовпадения), так что в мышиный CDR или в человеческую каркасную область вводится другой кодон. Типичные ошибочные спаривания вводят изменения в человеческие каркасные области, которые сохраняют или улучшают структурную ориентацию мышиного CDR и, тем самым, аффинность связывания по данному описанию. Следует понимать, что вышеописанный способ можно использовать для введения одного, двух или всех трх мышиных CDR участков в имеющееся окружение человеческих каркасных областей. Методы амплификации и связывания различных последовательностей с применением ПЦР с праймерами описаны, например, в Sambrook, Fritsch and Maniatis, Molecular Cloning: Cold Spring Harbor Laboratory PressAusubel et al., John WileySons (1992). Вследствие вырожденности генетического кода различные нуклеотидные последовательности кодируют каждую аминокислотную последовательность иммуноглобулина. Нужные нуклеотидные последовательности можно получать с помощью de novo твердофазного синтеза ДНК или ПЦР мутагенеза ранее полученного варианта нужного полинуклеотида. Опосредованный олигонуклеотидами мутагенез является предпочтительным методом получения вариантов с заменами, делециями и инсерциями ДНК целевых полипептидов. См. Adelman et al., DNA 2:183 (1983). Коротко говоря, ДНК целевого полипептида изменяют гибридизацией олигонуклеотида, кодирующего нужную мутацию, с однотяжевой (одноцепочечной) ДНК матрицей. После гибридизации используют ДНК-полимеразу для синтеза полной второй комплементарной цепи матрицы, которая вводит олигонуклеотидный праймер и кодирует выбранное изменение в ДНК целевого полипептида. 4. Выбор константных областей. Вариабельные сегменты антител, полученных по вышеприведнному описанию (например, вариабельные области тяжлой и лгкой цепей химерных или гуманизированных антител), как правило, связываются, по меньшей мере, с участком константной области иммуноглобулина (Fc), обычно константной области человеческого иммуноглобулина. Последовательности ДНК человеческой константной области можно выделять по общеизвестным методикам из различных человеческих клеток, но предпочтительно из иммортализованных B-клеток (Kabat et al., см. выше, и Liu et al., Международная заявкаWO87/02671) (каждый из этих материалов вводится ссылкой во всей полноте для всех целей). Обычно антитело содержит константные области как лгкой, так и тяжлой цепей. Константная область тяжлой цепи обычно включает СН 1, шарнирную, СН 2, СН 3 и СН 4 области. Антитела по данному описанию включают антитела, имеющие все типы константных областей, включая IgM, IgG, IgD, IgA и IgE, и любые изотипы, включая IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4. Если нужно, чтобы антитело (например, гуманизированное антитело) проявляло цитотоксическую активность, константный домен обычно представляет собой фиксирующий комплемент класса, как правило, IgG. Предпочтительным является человеческий изотипIgG1. Константные области лгкой цепи могут быть лямбда или каппа. Гуманизированное антитело может содержать последовательности более чем одного класса или изотипа. Антитела могут экспрессиро-22012407 ваться в виде тетрамеров, содержащих две лгких и две тяжлых цепи, в виде отдельных тяжлых цепей,лгких цепей, в виде Fab, Fab', F(ab')2 и Fv или в виде одноцепочечных антител, в которых вариабельные домены тяжлой и лгкой цепей связаны через спейсер. 5. Экспрессия рекомбинантных антител. Химерные и гуманизированные антитела обычно получают рекомбинантной экспрессией. Нуклеиновые кислоты, кодирующие вариабельные области лгкой и тяжлой цепей, необязательно, связанные с константными областями, встраивают в векторы экспрессии. Лгкую и тяжлую цепи можно клонировать в одни и те же или в различные экспрессирующие векторы. ДНК сегменты, кодирующие цепи иммуноглобулина, функционально связаны с контролирующими (экспрессию) последовательностями в экспрессирующем(их) векторе(ах), которые обеспечивают экспрессию полипептидов иммуноглобулина. Последовательности, контролирующие экспрессию, включают, но без ограничения, промоторы (например, связанные с природными или гетерологичные промоторы), сигнальные последовательности, энхансерные элементы и последовательности терминации транскрипции. Предпочтительно последовательности, контролирующие экспрессии, представляют собой промоторные системы эукариот в векторах, способные трансформировать или трансфецировать эукариотические клетки-хозяева (например, COS клетки). Когда вектор введн в подходящего хозяина, хозяин сохраняется в условиях, пригодных для экспрессии высоких уровней нуклеотидных последовательностей, и сбора, и очистки перекрстнореактивных антител. Эти экспрессирующие векторы обычно реплицируются в организмах хозяев либо в виде эписом,либо в виде составной части хромосомной ДНК хозяина. Обычно экспрессирующие векторы (векторы экспрессии) содержат селективные маркры (например, резистентности (устойчивости) к ампициллину,резистентности к гигромицину, резистентности к канамицину и резистентности к неомицину) для обнаружения клеток, трансформированных заданными последовательностями ДНК (см., например, Itakura etal., патент США 4704362). Е.coli являются одними из прокариотических клеток-хозяев, особенно применимых для клонирования полинуклеотидов (например, последовательностей ДНК) по настоящему изобретению. Другие микробные хозяева для применения включают бациллы, такие как Bacillus subtilus, и другие энтеробактерии,такие как Salmonella, Serratia и различные виды Pseudomonas. В этих прокариотических хозяевах можно также получать экспрессирующие векторы, которые, как правило, содержат последовательности, контролирующие экспрессию, совместимые с клеткой-хозяином (например, ориджин репликации). Кроме того, присутствует некоторое количество из множества общеизвестных промоторов, таких как промоторная система лактозы, промоторная система триптофана (trp), промоторная система бета-лактамазы или промоторная система фага лямбда. Промоторы, как правило, контролируют экспрессию, необязательно с использованием операторной последовательности, и имеют последовательности сайта связывания рибосом и т.п. для инициации и завершения транскрипции и трансляции. Другие микробы, такие как дрожжи, также применимы для экспрессии. Клетки дрожжейSaccharomyces являются предпочтительными клетками-хозяевами с использованием подходящих векторов, содержащих последовательности, контролирующие экспрессию (например, промоторы), ориджин репликации, последовательности терминации и т.п., по желанию. Типичные промоторы включают 3-фосфоглицерат киназу и другие гликолитические ферменты. Индуцибельные дрожжевые промоторы включают, среди прочего, промоторы из алкогольдегидрогеназы, изоцитохрома С и ферментов, отвечающих за утилизацию мальтозы и галактозы. Помимо микроорганизмов, для экспрессии и продуцирования полипептидов по настоящему изобретению (например, полинуклеотидов, кодирующих иммуноглобулины или их фрагменты) можно также использовать культуру тканевых клеток млекопитающих. См. Winnacker, From Genes to Clones, VCHPublishers, N.Y., N.Y. (1987). На самом деле предпочтительными являются клетки эукариот, так как в уровне техники получен ряд подходящих клеток-хозяев, способных секретировать гетерологичные белки(например, интактных иммуноглобулинов), они включают СНО клеточные линии, различные клеточные линии COS, клетки HeLa, предпочтительно клеточные линии миеломы, или трансформированные Bклетки, или гибридомы. Предпочтительно клетки не являются человеческими клетками. Экспрессирующие векторы для этих клеток могут включать последовательности, контролирующие экспрессию, такие как ориджин репликации, промотор и энхансер (Queen et al., Immunol. Rev. 89:49 (1986, и необходимые сайты информации о процессинге, такие как сайты связывания рибосом, сайты сплайсинга при образовании РНК и последовательности терминации транскрипции. Предпочтительными последовательностями,контролирующими экспрессию, являются промоторы из генов иммуноглобулинов, SV40, аденовируса,вируса бычьей папилломы, цитомегаловируса и т.п. Со et al., J. Immunol. 148:1149(1992). Или же кодирующие антитело последовательности можно встраивать в трансгены для введения в геном трансгенного животного и последующей экспрессии в молоке трансгенного животного (см., например, Deboer et al., патент США 5741957, Rosen, патент США 5304489 и Meade et al., патент США 5849992). Подходящие трансгены включают кодирующие последовательности для лгкой и/или тяжлой цепей, функционально связанные с промотором и энхансером из специфичного гена желез млекопитающих, такого как казеин или бета-лактаглобулин.-23012407 Или же антитела (например, гуманизированные антитела) по изобретению могут продуцироваться в трансгенных растениях (например, в табаке, кукурузе, сое и люцерне). Усовершенствованные векторы"растительных антител" ("plantibody") (Hendy et al. (1999), J. Immunol. Methods 231:137-146) и стратегии очистки в сочетании с увеличением трансформируемых видов сельскохозяйственных культур сделают эти методы практическими и эффективными способами получения рекомбинантных иммуноглобулинов не только для терапии человека и животных, но также для промышленного применения (например, каталитические антитела). Кроме того, показано, что антитела, продуцируемые в растениях, безопасны и эффективны и позволяют избежать применения животных материалов и, следовательно, риска комбинации с агентом трансмиссивной губкообразной энцефалопатии (TSE). Кроме того, различия типов гликозилирования растительных антител и антител, продуцированных в клетках млекопитающих, оказывают малое влияние или не оказывают никакого влияния на связывание антигена или специфичность. Кроме того,нет доказательства токсичности или наблюдаемых НАМА у пациентов, получающих местно перорально растительное секреторное димерное IgA антитело (см. Larrick et al. (1998), Res. Immunol. 149:603-608). Для экспрессии рекомбинантных антител в трансгенных растениях можно применять различные методы. Например, тяжлую и лгкую цепи антитела можно независимо клонировать в экспрессирующие векторы (например, векторы Agrobacterum tumefaciens) с последующей трансформацией растительной ткани in vitro с использованием рекомбинантной бактерии или непосредственной трансформацией,используя, например, частицы, покрытые векторами, которые затем физически вводят в растительную ткань, используя, например, баллистику. Затем целые растения, экспрессирующие отдельные цепи, восстанавливают с последующим их половым скрещиванием, что приводит, наконец, к продуцированию полностью собранного и функционального антитела. Аналогичные протоколы использованы для экспрессии функциональных антител в растениях табака (см. Hiatt et al. (1989), Nature 342:76-87). В различных вариантах изобретения могут использоваться сигнальные последовательности для промотирования экспрессии, связывания и скручивания цепей несобранного антитела направлением цепей в соответствующую растительную среду (например, водную среду апоплазмы или других специфических растительных тканей, включая клубень, плод или семя) (см. Fiedler et al. (1995), Bio/Technology, 13:1090-1093). Растительные биореакторы можно также использовать для повышения выхода антител и для значительного снижения стоимости. Векторы, содержащие полинуклеотидные последовательности, представляющие интерес (например,последовательности, кодирующие тяжлую и лгкую цепи, и последовательности, контролирующие экспрессию), можно перенести в клетку-хозяина общеизвестными методами, которые меняются в зависимости от типа клетки-хозяина. Например, трансфекцию с помощью хлористого кальция обычно используют для прокариотических клеток, тогда как обработку фосфатом кальция, электропорацию, липофекцию,метод бомбардировки микрочастицами или вирусную трансфекцию можно использовать для других клеток-хозяев (см. в общем Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Press,2nd ed., (1989), вводится в данное описание ссылкой во всей полноте для всех целей). Другие способы,применяемые для трансформации клеток млекопитающих, включают применение полибрена, слияние протопластов, липосомы, электропорацию и микроинъекцию (общие сведения Sambrook et al., см. выше). Для получения трансгенных животных трансгены можно микроинъецировать в оплодотворнные ооциты или можно включить в геном стволовых клеток эмбриона, ядра таких клеток переносят в безъядерные ооциты. Если тяжлую и лгкую цепи клонируют в различных экспрессирующих векторах, векторы котрансфецируют, чтобы экспрессировать и собрать интактные иммуноглобулины. После экспрессии целые антитела, их димеры, отдельные лгкие и тяжлые цепи или другие формы иммуноглобулинов по настоящему изобретению можно очищать стандартными методами, известными в уровне техники, включая осаждение сульфатом аммония, аффинную хроматографию на колонке, колоночную хроматографию,очистку методом ВЭЖХ, электрофорез в геле и т.п. (см. в общем Scopes, Protein Purification, SpringerVerlag, N.Y., (1982. Для фармацевтических целей предпочтительными являются практически чистые иммуноглобулины с гомогенностью по меньшей мере 90-95%, наиболее предпочтительно с гомогенностью 98-99% или выше. 6. Фрагменты антител. Также в объме настоящего изобретения рассматриваются фрагменты антител. В одном варианте изобретения охватываются фрагменты нечеловеческих и/или химерных антител. Обычно эти фрагменты проявляют специфическое связывание с антигеном с аффинностью по меньшей мере 107 и более обычно 108 или 109 М-1. Фрагменты гуманизированного антитела включают отдельные тяжлые цепи, лгкие цепи, Fab, Fab', F(ab')2, Fabc и Fv. Фрагменты получают методами рекомбинантной ДНК или ферментативным или химическим делением иммуноглобулинов.-24012407 7. Эпитопное картирование. Для того чтобы определить, какая антигенная детерминанта или эпитоп A распознатся антителом,можно осуществить эпитопное картирование. В одном варианте изобретения эпитопное картирование осуществляют в соответствии с анализом Replacement NET (rNET). Анализ эпитопной карты rNET дат информацию о вкладе отдельных остатков в пределах эпитопа в общую активность связывания антитела. В rNET анализе используются синтезированные систематические "однозамещнные" (с единственной заменой) пептидные аналоги. Связывание тестируемого антитела определяют против нативного пептида(нативный антиген) и против 19 альтернативных "однозамещнных" пептидов, причм в каждом пептиде имеется замена в первом положении на одну из 19 ненативных для этого положения аминокислот. Получают профиль, отражающий влияние замены в этом положении на различные ненативные остатки. Таким образом получают профили в последовательных положениях вдоль антигенного пептида. Объединнный профиль, или эпитопную карту (отражающую замену в каждом положении на все 19 ненативных остатков), можно затем сравнить с картой, созданной подобным образом, для второго антитела. Практически аналогичные или идентичные карты указывают на то, что сравниваемые антитела имеют одинаковую или сходную эпитопную специфичность. 8. Тестирование антител на терапевтическую эффективность на животных моделях. Каждой мыши из групп 7-9-месячных мышей PDAPP инъецируют по 0,5 мг поликлональных антител против A или специфичных моноклональных антител против A в PBS. Все препараты антител очищают так, чтобы они имели низкие уровни эндотоксина. Моноклональные антитела можно получать против фрагмента, инъецируя мыши фрагмент или более протяжнную форму A, получая гибридомы и проводя скрининг гибридом на антитело, которое специфично связывается с нужным фрагментом A, не связываясь с другими неперекрывающимися фрагментами A. Мышей инъецируют интраперитонеально, как требуется, через 4 месяца для поддержания в кровотоке концентрации антител, определяемой титром ELISA, более 1/1000 от определнного методомpost mortem. В группе имеется десять мышей. 9. Скрининг антител на активность очищения. Изобретение также включает способы скрининга антитела на активность очищения от амилоидного отложения, или любого другого антигена, или ассоциированного биологического организма, для которого требуется активность очищения. Для скрининга на активность против амилоидного отложения образец ткани мозга больного болезнью Альцгеймера или животной модели с патологией, характерной для болезни Альцгеймера, контактирует с фагоцитарными клетками, несущими Fc-рецептор, такими как микроглиальные клетки, и испытуемым антителом в среде in vitro. Фагоцитарные клетки могут быть первичной культурой или клеточной линией и могут быть мышиного (например, клетки BV-2 или С 8-В 4) или человеческого происхождения (например, клетки ТНР-1). В некоторых способах компоненты объединяют в одном микроскопическом препарате для упрощения мониторинга микроскопических исследований. В некоторых способах в лунках микротитрационного планшета проводят серийные реакции. В таком формате отдельные миниатюрные микроскопические препараты можно помещать в отдельные лунки или можно использовать немикроскопический формат детектирования, такой как детектированиеA методом ELISA. Предпочтительно делают ряд измерений количества амилоидного отложения в invitro реакционной смеси, начиная с исходного значения до начала реакции, и в ходе реакции делают одно или более измерений. Антиген можно обнаруживать окрашиванием, например, с помощью меченого флуоресцентной меткой антитела к A или другому компоненту амилоидных бляшек. Антитело, используемое для окрашивания, может быть или может не быть тем же самым, что и антитело, тестируемое на(очищающую) активность очищения. Уменьшение амилоидных отложений относительно начальной линии показывает, что испытуемое антитело обладает очищающей активностью. Такие антитела, повидимому, применимы для предупреждения или лечения болезни Альцгеймера и других амилоидогенных заболеваний. Антитела, особенно применимые для предупреждения или лечения болезни Альцгеймера и других амилоидогенных заболеваний, включают антитела, способные очищать (осветлять) как компактные, так и диффузные амилоидные бляшки, например антитело 12 А 11 по настоящему изобретению или его химерные или гуманизированные варианты. Аналогичные методы можно применять для скрининга антител на активность клиринга (очищения,осветления) других типов биологических объектов (организмов). Анализ можно использовать для обнаружения активности очищения фактически от любого вида биологических организмов. Как правило,биологический организм играет некоторую роль в болезни человека или животного. Биологический объект (организм) может быть в виде тканевых образцов или в изолированной (выделенной) форме. Если биологический организм находится в виде тканевого образца, то он предпочтительно не фиксирован, для того чтобы обеспечить свободный доступ к компонентам тканевого образца и для того чтобы избежать нарушения конформации компонентов, сопутствующего фиксации. Примеры тканевых образцов, которые можно тестировать в данном анализе, включают раковые ткани, предраковые ткани, ткани, содер-25012407 жащие доброкачественные опухоли, такие как бородавки или родимые пятна, ткани, инфицированные патогенными микроорганизмами, ткани, инфильтрированные воспалительными клетками, ткани, несущие патологические матрицы в межклеточном пространстве (например, фибринозный перикардит), ткани, несущие аберрантные антигены, и рубцовые ткани. Примеры выделенных биологических объектов (организмов), которые можно использовать, включают A, вирусные антигены или вирусы, протеогликаны, антигены других патогенных микроорганизмов, опухолевые антигены и адгезивные молекулы. Такие антигены можно получать, среди прочего, из природных источников, рекомбинантной экспрессией или химическим синтезом. Тканевый образец или выделенный биологический объект контактирует с фагоцитарными клетками, несущими Fc-рецепторы,такими как моноциты или микроглиальные клетки, и испытуемым антителом в среде. Антитело можно направлять на испытуемый биологический объект или на антиген, ассоциированный с объектом. В последнем случае целью испытания является определить, фагоцитируется ли объект антигеном. Обычно,хотя не обязательно, антитело и биологический объект (иногда с ассоциированным антигеном) контактируют друг с другом перед добавлением к фагоцитарным клеткам. Затем проводят мониторинг концентрации биологического объекта и/или (если он присутствует) ассоциированного антигена, остающегося в среде. Снижение количества или концентрации антигена или ассоциированного биологического объекта в среде показывает, что наблюдается осветляющий (очищающий) ответ антитела против антигена и/или ассоциированного биологического объекта в сочетании с фагоцитарными клетками. 10. Химерные/гуманизированные антитела с изменнной эффекторной функцией. Для вышеописанных антител по изобретению, содержащих константную область (Fc-область) может быть также желательно изменить эффекторную функцию молекулы. Как правило, эффекторная функция антитела находится в константной, или Fc, области молекулы, которая может опосредовать связывание с различными эффекторными молекулами, например белками комплемента или Fc-рецепторами. Связывание комплемента с Fc является важным, например, при опсонизации и лизисе клеточных патогенов и активации воспалительных реакций. Связывание антитела с Fc-рецепторами, например, на поверхности эффекторных клеток может включать ряд важных и разнообразных биологических реакций (ответов), включая, например, поглощение и деструкцию покрытых антителом патогенов или частиц, клиренс иммунных комплексов, лизис покрытых антителом клеток-мишеней киллерными клетками (т.е. антителозависимая клеточная цитотоксичность, или ADCC), высвобождение воспалительных медиаторов, перенос антител через плаценту и контроль продуцирования иммуноглобулина. Соответственно, в зависимости от конкретного терапевтического или диагностического применения могут быть желательны вышеупомянутые иммунные функции или только выбранные иммунные функции. Путм изменения Fc-области антитела достигаются различные аспекты эффекторной функции молекулы, включая усиление или подавление различных реакций иммунной системы, при положительных эффектах в диагностике и терапии. Можно получать антитела по изобретению, которые реагируют только с определнными типами Fcрецепторов, например, с помощью делеции или изменения сайта связывания с Fc-рецептором, расположенного в Fc-области антитела, антитела по изобретению можно модифицировать таким образом, чтобы они связывались только с определнными Fc-рецепторами или, по желанию, чтобы совершенно отсутствовало Fc-рецепторное связывание,. Другие желательные изменения Fc-области антитела по изобретению перечислены ниже. Как правило, номенклатуру Kabat используют для того, чтобы показать, какой(ие) аминокислотный(ые) остаток(ки) Fc-области (например, IgG антитела) изменяют (например, с помощью аминокислотной замены), чтобы достичь нужного изменения эффекторной функции. Номенклатуру также используют для сравнения антител на протяжении вида так, чтобы нужную эффекторную функцию, наблюдаемую, например, в мышином антителе, затем можно было систематически ввести в человеческое, гуманизированное или химерное антитело по изобретению. Например, наблюдалось, что антитела (например, IgG антитела) можно разделить на группы, которые, как было найдено, проявляют прочное, промежуточное или слабое связывание с Fc-рецептором (например, Fc-рецептором на человеческих моноцитах (FcyRI). Путм сравнения аминокислотных последовательностей в различных группах аффинности был идентифицирован моноцитсвязывающий сайт в области шарнирного звена (Leu234-Ser239). Более того, человеческий FcyRI рецептор связывается с человеческим IgG1 и мышиным IgG2a в качестве мономера, но связывание мышиного IgG2b в 100 раз слабее. Сравнение последовательности этих белков в области шарнирного звена показывает, что последовательность от 234 до 238, т.е. Leu-Leu-Gly-Gly-Pro (SEQ ED NO:32) в сильных связующих становитсяLeu-Glu-Gly-Gly-Pro (SEQ ID NO:33) в мышином гамма 2b, т.е. слабым связующим. Следовательно, если требуется пониженное FcRI рецепторное связывание, можно сделать соответствующее изменение в человеческой шарнирной последовательности. Понятно, что для достижения таких же или аналогичных результатов можно сделать другие изменения. Например, аффинность FcRI рецепторного связывания можно изменить, заменяя конкретный остаток на остаток с неадекватной функциональной группой в его боковой цепи или путм введения несущей заряд функциональной группы (например, Glu или Asp) или,например, ароматического неполярного остатка (например, Phe, Tyr или Trp).-26012407 Эти изменения равным образом можно применить к мышиной, человеческой системам или системе крысы при условии гомологии последовательностей между различными иммуноглобулинами. Показано,что для человеческого IgG, который связывается с человеческим FcRI рецептором, замена Leu 235 наGlu нарушает взаимодействие мутанта с рецептором. Таким образом, сайт связывания с этим рецептором может включаться и выключаться с помощью соответствующей мутации. Мутации в прилегающих или близких сайтах в области шарнирного звена (например, замены остатков 234, 236 или 237 на Ala) показывают, что изменения в остатках 234, 235, 236 или 237, по меньшей мере, влияют на аффинность к FcRI рецептору. Следовательно, антитела по изобретению могут также содержать изменнную по сравнению с немодифицированным антителом Fc-область с изменнной Fc аффинностью связывания с FcRI рецептором. Такое антитело обычно имеет модификацию в аминокислотном остатке 234, 235, 236 или 237). Подобным образом можно менять аффинность к другим Fc-рецепторам для регулирования иммунного ответа различными способами. В качестве дополнительного примера литические свойства IgG антител после связывания С 1 компонента комплемента могут изменяться. Первый компонент системы комплемента C1 содержит три белка, известных как C1q, C1r и C1s, которые прочно связаны вместе. Показано, что C1q ответственен за связывание комплекса из трх белков с антителом. Следовательно, C1q-связывающую активность антитела можно изменять, вводя в антитело изменнный СН 2 домен, в котором по меньшей мере один из аминокислотных остатков 318, 320 и 322 тяжлой цепи заменн на остаток с отличной боковой цепью. Нумерация (номенклатура) остатков в тяжлой цепи - это номенклатура EU указателя (см. выше Kabat et al.). Другие подходящие замены с целью изменения, например ослабления или уничтожения специфического C1q-связывания, включают замену любого из остатков 318 (Glu), 320 (Lys) и 322 (Lys) на Ala. Кроме того, с помощью мутаций в этих остатках было показано, что C1q-связывание сохраняется до тех пор, пока в остатке 318 имеется боковая цепь, связывающаяся водородной связью, а боковая цепь в обоих остатках, 320 и 322, имеет положительный заряд.C1q-связывающую активность можно упразднить заменой любого из трх специфичных остатков на остаток с неподходящей функциональностью в боковой цепи. Не обязательно заменять ионные остатки только на Ala для уничтожения C1q-связывания. Также можно использовать другие алкилзамещнные неионные остатки, такие как Gly, Ile, Leu или Val, или такие ароматические неполярные остатки, как Phe,Tyr, Trp и Pro, вместо любого из трх остатков, чтобы отменить C1q-связывание. Кроме того, можно также использовать такие неионные полярные остатки, как Ser, Thr, Cys и Met вместо остатков 320 и 322,но не 318, чтобы упразднить C1q-связывающую активность. Отмечается также, что ионные или неионные полярные остатки боковых цепей способны образовывать водородные связи аналогично связям, образуемым остатком Glu. Следовательно, замена остатка 318(Glu) на полярный остаток может модифицировать, но не уничтожить C1q-связывающую активность. Известно также, что замена остатка 297 (Asn) на Ala приводит к исчезновению литической активности, в то же время лишь немного снижая (ослабляя примерно в три раза) аффинность к C1q. Это изменение аннулирует сайт гликозилирования и присутствие углевода, требующееся для активации комплемента. Любая другая замена в этом сайте также нарушает сайт гликозилирования. Данное изобретение также включает антитело с изменнной эффекторной функцией, причм антитело содержит модифицированную шарнирную область. Модифицированная шарнирная область может представлять собой полную шарнирную область из СН 1 домена антитела другого класса или подкласса. Например, константный домен (СН 1) антитела класса IgG может быть связан с шарнирной областью антитела класса IgG4. Или же новая шарнирная область может содержать часть природного шарнира или повторяющуюся структурную единицу (повторяющееся звено), в которой каждая единица повтора образована из природной шарнирной области. В одном примере природную шарнирную область изменяют,превращая один или более цистеиновых остатков в нейтральный остаток, такой как аланин, или превращая соответствующим образом расположенные остатки в цистеиновые остатки. Такие замены проводят с применением методов, известных в химии белков, и предпочтительно методами рекомбинантной ДНК,по данному описанию. В одном варианте изобретения число цистеиновых остатков в шарнирной области антитела уменьшают, например, до одного. Эта модификация имеет то преимущество, что упрощает сборку антитела,например молекул биспецифического антитела, и молекул антитела, в которых Fc участок заменн на эффекторную или репортрную молекулу, так как он необходим только для образования единичной дисульфидной связи. Эта модификация также обеспечивает специфическую мишень для связывания шарнирной области либо с другой шарнирной областью, либо с эффекторной или репортрной молекулой,непосредственно или опосредованно, например, химическими способами. Напротив, число цистеиновых остатков в шарнирной области антитела увеличивают, например, по меньшей мере на один по сравнению с числом обычно имеющихся цистеиновых остатков. Увеличение-27012407 числа цистеиновых остатков можно использовать для стабилизации взаимодействия между прилегающими шарнирами. Другим преимуществом этой модификации является то, что она облегчает применение тиольных групп цистеина для связывания эффекторных или репортрных молекул с изменнным антителом, например с радиоактивной меткой. Следовательно, изобретение включает обмен шарнирными областями между классами антител, в частности IgG классами, и/или увеличение или уменьшение числа цистеиновых остатков в шарнирной области для получения изменнной эффекторной функции (см., например, патент США 5677425, который специально вводится в данное описание). Определение изменнной эффекторной функции антитела осуществляют методами анализов по данному описанию или другими известными в уровне техники методами. Важно отметить, что полученное в результате антитело может проверяться одним или более аналитическими методами для оценки любого изменения биологической активности по сравнению с исходным антителом. Например, способность антитела с изменнной Fc-областью связывать комплемент или Fcрецепторы можно оценивать методами анализа по данному описанию, а также любым методом анализа,известным в уровне техники. Получение антител по изобретению осуществляют любым подходящим методом, включая методы по данному описанию, а также методами, известными специалистам в данной области техники. Так,можно синтезировать подходящую белковую последовательность, например образующую часть релевантного константного домена или целый релевантный домен, например Fc-область, т.е. СН 2 и/или СН 3 домен(ы) антитела, и включающую соответствующим образом изменнный(е) остаток(ки), а затем химически ввести (связать) в подходящее место в молекуле антитела. Предпочтительно для получения изменнного антитела применяют методы рекомбинантной ДНК. Предпочтительные методы включают, например, получение подходящих праймеров для применения в полимеразной цепной реакции (ПЦР) таким образом, чтобы по меньшей мере часть тяжлой цепи IgG,например Fc или константная область (например, СН 2 и/или СН 3), изменялась в одном или более остатков. Затем сегмент можно функционально связывать с остальной частью антитела, например вариабельной областью антитела, и требующимися регуляторными элементами экспрессии в клетке. Настоящее изобретение также включает векторы, применяемые для трансформации клеточной линии, векторы, применяемые для продуцирования трансформирующих векторов, клеточных линий,трансформированных трансформирующими векторами, клеточных линий, трансформированных препаративными векторами, и методы их получения. Предпочтительно клеточная линия, трансформированная для продуцирования антитела с изменнной Fc-областью (т.е. изменнной эффекторной функцией), является иммортализованной клеточной линией млекопитающего (например, СНО клетки). Хотя клеточная линия, используемая для продуцирования антитела с изменнной Fc-областью,предпочтительно является клеточной линией млекопитающего, можно в качестве альтернативы использовать любую другую подходящую клеточную линию, такую как бактериальная клеточная линия или клеточная линия дрожжей. 11. Созревание аффинности. Антитела (например, гуманизированные антитела) по изобретению можно модифицировать с целью получения улучшенной функции, используя любые методы созревания аффинности. Обычно идентифицируют кандидатную молекулу с аффинностью связывания с данной молекулой-мишенью, а затем дополнительно улучшают или дают "созреть" методами мутагенеза, получая в результате один или более родственных кандидатов с более желательным связывающим взаимодействием с молекулой-мишенью. Как правило, модифицируется именно аффинность антитела (или авидность, т.е. объединнные аффинности антитела к целевому антигену), однако используя методы созревания аффинности либо отдельно,либо параллельно с аффинностью, можно также модифицировать другие свойства молекулы, такие как устойчивость (стабильность), эффекторная функция, клиренс, секреция или транспортная функция молекул. В примерах вариантов изобретения аффинность антитела (например, гуманизированного антитела по настоящему изобретению) повышается. Например, антитела, имеющие аффинность связывания по меньшей мере 107, 108 или 109 М-1, могут в результате созревания иметь аффинность по меньшей мере 109, 1010 или 1012 M-1. Один способ созревания аффинности, связывающей молекулы, представляет собой синтез нуклеиновой кислоты, кодирующей связывающую молекулу, или е часть, которая (нуклеиновая кислота) кодирует нужное изменение или нужные изменения. Синтез олигонуклеотидов общеизвестен в уровне техники и легко автоматизируется для получения одной или более нуклеиновых кислот, имеющих любое(ые) заданное(ые) изменение(я) кодона(ов). Сайты рестрикции, молчащие мутации и применение предпочтительного кодона также можно ввести подобным образом. Или же один или более кодонов можно изменить, чтобы представить субпопуляцию конкретных аминокислот, например субпопуляцию, которая исключает цистеины, способные образовывать дисульфидные связи, и ограничивается определнной областью, например CDR областью или е частью. Или же область может быть представлена частично или-28012407 полностью произвольным (случайным, рандомизированным) набором аминокислот (подробнее см., например, в патентах США 5830650; 5798208; 5824514; 5817483; 5814476; 5723323; 4528266; 4359266; 435953; 5840479 и 5869644). Понятно, что вышеуказанные способы можно осуществлять частично или полностью с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР), которая хорошо известна в технике и имеет преимущество, так как вводит олигонуклеотиды, например праймеры, или одноцепочечные нуклеиновые кислоты, например с заданным(и) изменением(ями), в двухцепочечную нуклеиновую кислоту, и в амплифицированных количествах применима для других манипуляций, таких как методы генетической инженерии в подходящий экспрессирующий или клонирующий вектор. Такую ПЦР можно также проводить в условиях, допускающих ошибку включения нуклеотидов, с целью введения тем самым дополнительной вариабельности в амлифицированные нуклеиновые кислоты. Экспериментальные подробности проведения ПЦР и относящиеся к ней наборы, реагенты и дизайн праймеров можно найти, например, в патентах США 4683202; 4683195; 6040166 и 6096551. Методы введения CDR областей в каркасные области антитела с помощью ПЦР с применением праймеров описаны, например, в патенте США 5858725. Методы ПЦР амплификации с применением праймеров библиотек антител (и библиотек, полученных этим методом) с применением минимального набора праймеров, способных находить гомологию последовательностей с большим набором молекул антитела, так что можно эффективно амплифицировать больший набор молекул антитела, описаны, например, в патентах США 5780225; 6303313 и 6479243. Можно также использовать неПЦР методы сайт-направленного мутагенеза, они включают "Kunkel" мутагенез, который использует однонитевые урацилсодержащие матрицы и праймеры, которые гибридизуются и вводят мутацию при прохождении через штамм Е.coli (см., например, патент США 4873192). Дополнительные методы изменения последовательности антитела или его части включают нуклеотидный синтез или ПЦР нуклеиновых кислот в неоптимальных (т.е. склонных к ошибкам) условиях, денатурацию и ренатурацию (отжиг) таких нуклеотидов, расщепление с помощью экзонуклеаз и/или эндонуклеаз с последующей повторной сборкой лигированием или ПЦР (шаффлинг нуклеиновых кислот) или комбинацию одного или более вышеприведнных методов, описанных, например, в патентах США 6440668; 6238884; 6171820; 5965408; 6361974; 6358709; 6352842; 4888286; 6337186; 6165793; 6132970; 6117679; 5830721 и 5605793. В конкретном варианте изобретения библиотеки антител (или библиотеки созревания аффинности),содержащие семейство молекул кандидатных антител, имеющих разнообразие в некоторых участках молекулы кандидатного антитела, например, в одной или более CDR области (или е части), в одной или более каркасной области и/или в одной или более константной области (например, в константной области, имеющей эффекторную функцию), можно экспрессировать и подвергнуть скринингу на заданные свойства известными методами (см., например, патенты США 6291161; 6291160; 6291159 и 6291158). Например, можно создать экспрессирующие библиотеки вариабельных доменов антител, имеющих разнообразие (множественность) CDR3 последовательностей, и методы получения библиотек человеческих антител, имеющих разнообразие (множественность) CDR3 последовательностей, вводя с помощью мутагенеза множественность (разнообразие) CDR3 последовательностей и восстанавливая библиотеку (см.,например, патент США 6248516). Наконец, для экспрессии зрелых по аффинности антител нуклеотидные кислоты, кодирующие молекулы кандидатного антитела, можно вводить в клетки в подходящем экспрессирующем формате, например в виде тяжлой и лгкой цепей полноразмерного антитела (например, IgG), Fab-фрагментов антитела (например, Fab, F(ab')2) или в виде одноцепочечных антител (scFv), используя стандартный вектор и методы трансфекции/трансформации клеток (см., например, патенты США 6331415; 6103889; 5260203; 5258498 и 4946778).B. Нуклеиновая кислота, кодирующая иммунологические и терапевтические агенты. Иммунные ответы (реакции) на амилоидные отложения можно также вызывать, вводя нуклеиновые кислоты, кодирующие антитела и составляющие их цепи, применяемые для пассивной иммунизации. Такие нуклеиновые кислоты могут представлять собой ДНК или РНК. Нуклеотидный сегмент, кодирующий иммуноген, как правило, связан с регуляторными элементами, такими как промотор и энхансер,которые разрешают экспрессию ДНК сегмента в предполагаемой клетки-мишени пациента. Для экспрессии в гемоцитах, желательной для индукции иммунного ответа, типичные промоторный и энхансерный элементы включают промотор и энхансер генов лгкой и тяжлой цепей иммуноглобулина и/или ранний промотор и энхансер основного интермедиата CMV (Stinski, патенты США 5168062 и 5385839). Связанные регуляторные элементы и кодирующие последовательности часто клонируют в вектор. Для введения двухцепочечных антител две цепи можно клонировать в один и тот же вектор или в различные векторы. Ряд вирусных векторных систем является доступным, включая ретровирусные системы (см., например, Lawrie and Tumin, Cur. Opin. Genet. Develop. 3:102-109 (1993; аденовирусные векторы (см., например, Bett et al., J. Virol. 67:5911 (1993; аденоассоциированные вирусные векторы (см., например,Zhou et al., J. Exp. Med. 179:1867 (1994, вирусные векторы семейства поксвирусов, включая вирус коровьей оспы и вирус оспы птиц, вирусные векторы рода альфа-вирусов, такие как векторы Синдбисвируса (Sindbis) и вируса лесов Семлики (Semliki) (см., например, Dubensky et al., J. Virol. 70:508 (1996,-29012407 вируса венесуэльского лошадиного энцефалита (см., например, Johnston et al., патент США 5643576) и рабдовирусов, таких как везикулярный вирус стоматита (см. Rose, патент США 6168943) и вирусы папилломы (Ohe et al., Human Gene Therapy, 6:325 (1995); Woo et al., Международная заявка 94/12629 иXiaoBrandsma, Nucleic Acids. Res. 24, 2630-2622 (1996. ДНК, кодирующая иммуноген, или вектор, содержащий эту ДНК, могут быть упакованы в липосомы. Подходящие липиды и родственные аналоги описаны Eppstein et al., патент США 5208036, Feigner etal., патент США 5264618, Rose, патент США 5279833 и Epand et al., патент США 5283185. Векторы и ДНК, кодирующие иммуноген, можно также адсорбировать на носителях, состоящих из макрочастиц,или ассоциировать с этими носителями, примеры которых включают полимеры полиметилметакрилат и полилактиды и сополимеры лактидов с гликолидами, см., например, McGee et al., J. Micro Encap. (1996). Векторы генной терапии или "голые" полинуклеотиды (например, ДНК) можно доставлять in vivo введением отдельному пациенту, как правило, с помощью системного введения (например, внутривенной, интраперитонеальной, назальной, желудочной, интрадермальной, внутримышечной, подкожной или интракраниальной инфузией) или местным применением (см., например, Anderson et al., патент США 5399346). Термин "голый полинуклеотид" относится к полинуклеотиду, доставляемому не в виде ассоциата с агентом, содействующему доставке. "Голые полинуклеотиды" иногда клонируют в плазмидный вектор. Такие векторы могут дополнительно содержать агенты, облегчающие доставку (содействующие доставке), такие как бупивакаин (Weiner et al., патент США 5593972). ДНК можно также вводить с помощью генной пушки. См. выше XiaoBrandsma. ДНК, кодирующую иммуноген, осаждают на поверхности металлических микробусин. "Микроснаряды" ускоряются под действием ударной волны или расширяющегося газообразного гелия и проникают в ткани на глубину семи слоев клеток. Например, годится устройство генной доставки Accel, производимое в Agricetus, Inc. Middleton WI. Или же "голые ДНК" могут проникать через кожу в ток крови при простом нанесении пятна с помощью химического или механического раздражения (см. Howell et al., Международная заявка WO 95/05853). В другом варианте векторы, кодирующие иммуногены, можно доставлять в клетки ex vivo, такие как клетки, эксплантированные из отдельного пациента (например, лимфоциты, аспираты костного мозга, биопсия тканей), или универсальные гемопоэтические стволовые клетки, с последующей реимплантацией клеток в организм пациента, обычно после селекции клеток, которые включают вектор.II. Профилактические и терапевтические методы. Настоящее изобретение относится, среди прочего, к лечению болезни Альцгеймера и других амилоидогенных заболеваний путм введения пациенту терапевтических иммунологических реагентов (например, гуманизированных иммуноглобулинов) к специфическим эпитопам в A в условиях, в которых возникает благоприятный терапевтический ответ (например, индукция фагоцитоза A, снижение количества бляшек, ингибирование образования бляшек, снижение нейритной дистрофии, улучшение когнитивной функции и/или реверсия, лечение или предупреждение прогрессирования когнитивного заболевания) у пациента, например, для предупреждения или лечения амилоидогенного заболевания. Изобретение также относится к применению описанных иммунологических реагентов (например, гуманизированных иммуноглобулинов) в производстве медицинского препарата для лечения или предупреждения амилоидогенного заболевания. В одном аспекте изобретение охватывает методы предупреждения или лечения заболевания, ассоциированного с амилоидными отложениями A в мозгу пациента. Такие заболевания включают болезнь Альцгеймера, синдром Дауна и когнитивную недостаточность. Последняя может встречаться с другими признаками амилоидогенного заболевания или без таких признаков. Некоторые методы по изобретению включают введение пациенту эффективной дозы антитела, которое специфически связывается с компонентом амилоидного отложения. Такие методы особенно применимы для предупреждения или лечения болезни Альцгеймера у людей. Типичные методы включают введение эффективной дозы антитела,которое связывается с A. Предпочтительные методы включают введение эффективной дозы антитела,которое специфически связывается с эпитопом в пределах остатков 1-10 A, например антител,которые специфически связываются с эпитопом в пределах остатков 1-3 A, антител,которые специфически связываются с эпитопом в пределах остатков 1-4 A, антител,которые специфически связываются с эпитопом в пределах остатков 1-5 A, антител,которые специфически связываются с эпитопом в пределах остатков 1-6 A, антител,которые специфически связываются с эпитопом в пределах остатков 1-7 A, или антител,которые специфически связываются с эпитопом в пределах остатков 3-7 A. Ещ в одном аспекте изобретение включает введение антител, которые связываются с эпитопом,содержащим свободный N-концевой остаток A. Ещ в одном аспекте изобретение включает введение антител, которые связываются с эпитопом в пределах остатков 1-10 A, причм остаток 1 и/или остаток 7A представляет собой аспарагиновую кислоту. Ещ в одном аспекте изобретение охватывает введение антител, которые специфически связываются с A пептидом, не связываясь с полноразмерным амилоидным белком-предшественником (APP). Ещ в одном аспекте изотип антитела представляет собой IgG1.