Бактериальная система селекции и ее применение

011823 Область техники, к которой относится изобретение Настоящее изобретение относится к новой системе селекции, содержащей бактериальную клетку,дефицитную по гену araD, кодирующему L-рибулозо-5-фосфат-4-эпимеразу (ЕС 5.1.3.4.), в которую встроен в качестве маркера селекции вектор, несущий ген araD, кодирующий активную L-рибулозо-5 фосфат-4-эпимеразу. Настоящее изобретение далее относится к новым векторам, содержащим мутантный ген araD со стоп-кодоном в положении 8, кодирующий L-рибулозо-5-фосфат-4-эпимеразу или ее каталитически активный фрагмент, для использования в системе селекции, и к новым бактериальным штаммам, дефицитным по гену araD. Настоящее изобретение, кроме того, относится к способу селекции бактериальных клеток, трансформированных вектором, несущим ген araD, кодирующий активную Lрибулозо-5-фосфат-4-эпимеразу в качестве маркера селекции, и интересующий ген, причем данный способ включает встраивание указанного вектора в клетку хозяина, дефицитную по гену araD, кодирующему L-рибулозо-5-фосфат-4-эпимеразу, и выращивание полученных клеток в среде роста, содержащей арабинозу. Предшествующий уровень техники Существенным требованием к эффективной генной инженерии бактерий и других клеток, размножаемых в клеточных культурах, является способность селекции клеток со специфичным изменением генотипа. Наиболее распространенной стратегией селекции в технологии рекомбинантной ДНК является включение маркера селекции в клонирующий вектор или плазмиду. Маркер селекции может представлять собой клонированный ген или последовательность ДНК, который обеспечивает отделение клеток хозяина, содержащих маркер селекции, от тех, которые его не содержат. Маркер селекции вместе с подходящей средой селекции поддерживает в клетках клонирующий вектор. Иначе по причине того, что репликация плазмид представляет собой энергетическое бремя для бактерии-хозяина, в растущей культуре бактерии, потерявшие плазмиду, будут иметь преимущество в плане роста над клетками с плазмидой. Для большинства целей ген устойчивости к антибиотику широко используется в качестве маркера селекции. Однако для продукции рекомбинантных терапевтических средств, где целью является генерировать такой продукт, как ДНК-вакцину, с высоким выходом для введения пациентам, применение генов устойчивости к антибиотикам представляет проблемы: распространение патогенов, устойчивых к антибиотикам, является серьезной мировой проблемой [Levy, S.В., J. Antimicrob. Chemother. 49 (2002) 25-30]. Поэтому гены устойчивости к антибиотикам не могут находить интенсивного применения в фармацевтической промышленности, и, например, согласно положениям Управления по контролю за продуктами и лекарствами США, в экспериментальных ДНК-вакцинах, проходящих третью фазу испытаний, не разрешено применение генов устойчивости к антибиотику. Альтернативно, предложены системы селекции без антибиотиков. Такие системы селекции без антибиотиков включают в себя системы бактериальных токсинов-антитоксинов [Engelberg-Kulka, H. andGlaser, G., Annu Rev Microbiol 53 (1999) 43-70], генов, ответственных за устойчивость в отношении тяжелых металлов, таких как теллур [Silver, S. and Phung, L.T., Annu Rev Microbiol 50 (1996) 753-789], и системы, в которых плазмида кодирует ген, дополняющий ауксотрофность хозяина [Wang, M.D., et al., J.Bacteriol. 169 (1987) 5610-5614]. В заявке на выдачу патента США 2000/0014476 A1, в общем, среди прочих описано применение не связанного с антибиотиками маркера селекции, который может представлять собой ген, продукт которого необходим для метаболизма клетки в некоторых условиях культивирования, такой как ген катаболизма, что дает возможность клетке ассимилировать некоторое вещество, присутствующее в среде культивирования (специфичный источник углерода или азота), и т.д. Не приведено конкретных примеров таких подходящих генов. Данный подход не обязательно может использоваться для коммерческой продукции,поскольку удаление из среды роста существенного компонента, такого как аминокислота или источник углерода, снижает выход, что нежелательно. Кроме того, манипуляция со средой роста в плане удаления существенного питательного компонента может значительно увеличивать стоимость среды роста, поскольку коммерчески доступные смеси питательных веществ должны замещаться отдельными питательными веществами. Для коммерческих терапевтических целей будет преимуществом применение гена, который является не существенным для роста хозяина, но манипуляция с которым, тем не менее, влияет на рост хозяина в некоторых обстоятельствах. Кроме того, в свете терапевтического применения преимуществом будет применение гена, делеция которого приводит к накоплению соединений, которые токсичны в отношении клетки хозяина, но не токсичны в отношении млекопитающих, включая людей. Также будет преимуществом применение меньших генов, что, в свою очередь, позволит конструировать меньшие плазмиды,для репликации которых требуется меньшее потребление энергии, и, таким образом, скорость роста бактериальной культуры и выход плазмиды повышаются. Краткое описание изобретения Целью настоящего изобретения является предоставление новой не связанной с антибиотиками системы селекции, которая свободна от проблем, указанных выше, для систем селекции для применения в продукции рекомбинантных терапевтических продуктов.-1 011823 Другой целью изобретения является предоставление новой не связанной с антибиотиками системы селекции, которая может безопасно использоваться в продукции рекомбинантных терапевтических продуктов в плане окружающей среды и безопасности пациента. Дальнейшей целью изобретения является предоставление новой, не связанной с антибиотиками системы селекции, которая может рентабельно применяться при продукции рекомбинантных терапевтических продуктов с использованием стандартных ростовых сред. Еще одной дальнейшей целью изобретения является предоставление новой, не связанной с антибиотиками системы селекции, которая обеспечивает повышенную скорость роста и улучшенный выход. Еще одной целью изобретения является предоставление нового вектора, содержащего маркер селекции, нетоксичный в отношении окружающей среды и способный к долгосрочному сохранению в хозяине. Еще одной целью изобретения является предоставление новой клетки хозяина, содержащей генный дефект, не вредный в отношении окружающей среды. Еще одной целью изобретения является предоставление способа селекции клеток, несущих интересующий ген для продукции рекомбинантных терапевтических продуктов. Неожиданно было обнаружено, что цели настоящего изобретения достигаются применением генаaraD, мутированной формы гена araD, комплементарной ему последовательности или его каталитически активного фрагмента, в качестве маркера селекции и применением конкретного бактериального хозяина,дефицитного в отношении гена araD. В соответствии с этим настоящее изобретение относится к новой системе селекции, содержащей бактериальную клетку, дефицитную по гену araD, кодирующему L-рибулозо-5-фосфат-4-эпимеразу (ЕС 5.1.3.4. ), в которую встроен в качестве маркера селекции вектор, несущий ген araD, кодирующий активную L-рибулозо-5-фосфат-4-эпимеразу. Другой вариант осуществления настоящего изобретения относится к системе селекции, в которой ген araD мутирован. Настоящее изобретение далее относится к новым векторам, содержащим мутантный ген araD со стоп-кодоном в положении 8, кодирующий L-рибулозо-5-фосфат-4-эпимеразу или ее каталитически активный фрагмент, для использования в системе селекции в качестве маркера селекции. Настоящее изобретение далее относится к новым бактериальным штаммам, дефицитным по генуaraD, кодирующему L-рибулозо-5-фосфат-4-эпимеразу. Настоящее изобретение, кроме того, относится к способу селекции бактериальных клеток, трансформированных вектором, несущим 1) ген araD, кодирующий активную L-рибулозо-5-фосфат-4 эпимеразу (ЕС 5.1.3.4.) в качестве маркера селекции, и 2) интересующий ген, причем данный способ включает встраивание указанного вектора в клетку хозяина, дефицитную по гену araD, кодирующему Lрибулозо-5-фосфат-4-эпимеразу, и выращивание полученных клеток в среде роста, содержащей арабинозу. Описание чертежей На фиг. 1 показано применение арабинозы в качестве источника углерода для клеток E.coli (Lin,1987); на фиг. 2 - карта S6wtd1EGFP. Кодирующие последовательности d1EGFP, E2 и маркера устойчивости к канамицину аминогликозид-3'-О-фосфотрансферазы (kana) показаны стрелками. Дополнительные характеристики показаны закрашенными четырехугольниками: 10E2BS - десять участков связыванияBPV Е 2 с высоким сродством; CMV-tk - немедленный ранний промотор человеческого цитомегаловируса и лидерная последовательность гена HSV Th; интрон - интрон гена кроличьего бета-глобина с оптимизированными участками SD и SA; tkpa - сигнал полиаденилирования гена HSV Tk; RSV LTR - длинный концевой повтор вируса саркомы Рауса; bgh рА - сигнал полиаденилирования гена гормона роста крупного рогатого скота; pUCori бактериальная точка начала репликации, происходящая из плазмиды pUC18; на фиг. 3 - карта S6wtd1EGFPkana/araD1. Кодирующие последовательности d1EGFP, E2, маркера устойчивости к канамицину аминогликозид-3'-О-фосфотрансферазы (kana) и L-рибулозо-5-фосфат-4 эпимеразы (araD) показаны стрелками. Дополнительные характеристики показаны закрашенными четырехугольниками: 10E2BS - десять участков связывания BPV Е 2 с высоким сродством; CMV-tk - немедленный ранний промотор человеческого цитомегаловируса и лидерная последовательность гена HSV Th; интрон - интрон гена кроличьего бета-глобина с оптимизированными участками SD и SA; tkpa - сигнал полиаденилирования гена HSV Tk; RSV LTR - длинный концевой повтор вируса саркомы Рауса; bgh рА сигнал полиаденилирования гена гормона роста крупного рогатого скота; pUCori -бактериальная точка начала репликации, происходящая из плазмиды pUC18; на фиг. 4 - карта S6wtd1EGFPkana/araD2. Кодирующие последовательности d1EGFP, E2, маркера устойчивости к канамицину аминогликозид-3'-О-фосфотрансферазы (kana) и L-рибулозо-5-фосфат-4 эпимеразы (araD) показаны стрелками. Дополнительные характеристики показаны закрашенными четырехугольниками: 10E2BS - десять участков связывания BPV Е 2 с высоким сродством; CMV-tk - немедленный ранний промотор человеческого цитомегаловируса и лидерная последовательность гена HSV Th; интрон - интрон гена кроличьего бета-глобина с оптимизированными участками SD и SA; tkpa - сигнал полиаденилирования гена HSV Tk; RSV LTR - длинный концевой повтор вируса саркомы Рауса; bgh рА -2 011823 сигнал полиаденилирования гена гормона роста крупного рогатого скота; pUCori бактериальная точка начала репликации, происходящая из плазмиды pUC18; на фиг. 5 показана карта S6wtd1EGFP/araD1. Кодирующие последовательности d1EGFP, E2, и Lрибулозо-5-фосфат-4-эпимеразы (araD) показаны стрелками. Дополнительные характеристики показаны закрашенными четырехугольниками: 10E2BS - десять участков связывания BPV Е 2 с высоким сродством; CMV-tk - немедленный ранний промотор человеческого цитомегаловируса и лидерная последовательность гена HSV Th; интрон - интрон гена кроличьего бета-глобина с оптимизированными участкамиSD и SA; tkpa - сигнал полиаденилирования гена HSV Tk; RSV LTR - длинный концевой повтор вируса саркомы Рауса; bgh рА - сигнал полиаденилирования гена гормона роста крупного рогатого скота; pUCori - бактериальная точка начала репликации, происходящая из плазмиды pUC18; на фиг. 6 - карта S6wtd1EGFP/araD2. Кодирующие последовательности d1EGFP, E2, и L-рибулозо 5-фосфат-4-эпимеразы (araD) показаны стрелками. Дополнительные характеристики указаны закрашенными четырехугольниками: 10E2BS - десять участков связывания BPV Е 2 с высоким сродством; CMV-tk немедленный ранний промотор человеческого цитомегаловируса и лидерная последовательность генаHSV Th; интрон - интрон гена кроличьего бета-глобина с оптимизированными участками SD и SA; tkpa сигнал полиаденилирования гена HSV Tk; RSV LTR - длинный концевой повтор вируса саркомы Рауса;bgh рА - сигнал полиаденилирования гена гормона роста крупного рогатого скота; pUCori - бактериальная точка начала репликации, происходящая из плазмиды pUC18; на фиг. 7 А и 7 В - электрофоретический анализ плазмидной ДНК S6wtd1EGFP/araD1 (7A) иS6wtd1EGFP/araD2 (7B), выделенной из штамма E.coli AG1-дельта araD, выращенного в различных средах; на фиг. 8 - анализ профиля рестрикции плазмидной ДНК S6wtd1EGFP/araD1 и S6wtd1EGFP/araD2,выделенной из штамма E.coli AG1-дельта araD; на фиг. 9 - электрофоретический анализ S6wtd1EGFP/araD2 в анализе стабильности; на фиг. 10A и 10 В - анализ профиля рестрикции S6wtd1EGFP/araD2 в анализе стабильности; на фиг. 11 - параметры роста подпитываемой ферментации AG1araD S6wtd1EGFP/araD2, измеренные и зарегистрированные во время ферментации. Обозначения следующие: sPump - скорость подпитки;pO2 - концентрация кислорода; Temp - температура роста; mys - требуемая скорость роста; OD - оптическая плотность при 600 нм; на фиг. 12 - схема лизиса и очистки AG1araD S6wtd1EGFP/araD2; на фиг. 13 - последовательность локуса araD клона 13; на фиг. 14 - карта плазмиды p3hCG; на фиг. 15 - карта плазмиды paraDMgB; на фиг. 16 п- карта плазмиды p3araD1hCG; на фиг. 17 - карта плазмиды p3araD2hCG; на фиг. 18 - результаты анализа чувствительности к L-арабинозе штаммов E.coli с разрушеннымaraD; на фиг. 19 - результаты анализа чувствительности к L-арабинозе в М 9 и среде дрожжевого экстракта с различными концентрациями глюкозы и арабинозы; на фиг. 20 - карта плазмиды р 2 MG С 11; на фиг. 21 - карта плазмиды paraD MG С 145; на фиг. 22 - геномный фрагмент E.coli, содержащий ген sgbE; на фиг. 23 - геномный фрагмент E.coli, содержащий ген ulaF. Подробное описание изобретения Настоящее изобретение основано на попытке найти альтернативную, не связанную с антибиотиками систему селекции, которая может использоваться при продукции рекомбинантных терапевтических продуктов для введения in vivo, особенно, при продукции ДНК-вакцин. Неожиданно было обнаружено,ген araD, вовлеченный в пентозофосфатный путь в прокариотических и эукариотических организмах,таких как млекопитающие, включая человека, может успешно использоваться в качестве плазмидного маркера селекции ауксотрофной клетке хозяина. Применение ауксотрофии имеет то преимущество, что при этом не применяется образование токсичных веществ, которые могут позже контаминировать плазмидный препарат. Эффективная система селекции конструируется на основе генов araD/araC [Ariza, R.R., et al., Carcinogenesis 14 (1993) 303-305]. Однако данная система селекции использовалась в исследованиях механизмов мутагенеза, но ранее не использовалась в качестве маркеров селекции для сохранения плазмид.Ariza et al. использовали штамм, где ген araC содержал терминаторный кодон, и ген araD инактивирован. В плазмиду вводили продукт гена supF, который кодирует супрессорную тРНК. В присутствии активной супрессорной тРНК продуцировался ферментативно активный продукт araC, вызывающий остановку роста клеток (поскольку araD был неактивным). Данная система позволяет исследовать подавление мутаций тРНК supF: в случае инактивации supF мутацией клетки могут расти на арабинозе. Поэтому данная система селекции основана на гене araC, а не на гене araD. Ген araD не вводился в плазмиду, и систему-3 011823 на его основе не предназначали или характеризовали для целей продукции плазмиды. Ген araD кодирует фермент, ответственный за эпимеризацию рибулозо-5-фосфата с образованием ксилулозо-5-фосфата (фиг. 1) и поэтому позволяет использовать арабинозу в пентозофосфатном пути[Engelsberg, E., et al., J. Bacteriol. 84: (1962) 137-146]. Если araD инактивируется, рибулозо-5-фосфат накапливается в бактериальной клетке, что ведет к остановке роста. Если хромосомная копия в клетке хозяина инактивируется araD, и интактная копия гена araD, мутантная форма гена araD, комплементарная ему последовательность или его каталитически активный фрагмент встраивается в плазмиду, в результате из-за двух эффектов достигается преимущество в росте содержащих плазмиду клеток в среде, содержащей L-арабинозу. Во-первых, содержащие плазмиду клетки могут использовать арабинозу в качестве источника углерода, и, во-вторых, не накапливается токсичный рибулозо-5-фосфат. Это обеспечивает применение богатых сред роста, дополненных арабинозой. В богатых средах клетки E.coli растут быстро, и выход плазмиды высок. В качестве источника аминокислот могут использоваться недорогие стандартные компоненты бактериальных сред роста, такие как дрожжевые экстракты. Следы рибулозо-5-фосфата, которые теоретически могут контаминировать препарат плазмиды, не являются проблемой при введении препарата in vivo, поскольку рибулозо-5-фосфат может эффективно метаболизироваться клетками человека и он не токсичен. Применение мутантных форм гена araD предоставляет особые преимущества. Системы селекции по изобретению, включающие в себя бактериальные клетки, дефицитные по гену araD, в которых вектор несет мутантную форму гена araD в качестве маркера селекции, продуцируют оптимальную концентрацию продукта гена araD L-рибулозо-5-фосфат-4-эпимеразы для предоставления неингибированного роста бактерий. Сходные преимущества достигаются использованием систем селекции, содержащих вектор,несущий интактный ген araD, но включающий в себя делеции или мутации в каком-либо участке генного локуса гена araD. Система селекции по изобретению включает в себя: 1) вектор, несущий ген araD, мутантную форму гена araD, комплементарную ему последовательность или его каталитически активный фрагмент, в качестве маркера селекции, и 2) конкретный бактериальный штамм, дефицитный по гену araD, в который был добавлен данный вектор. При культивировании конкретного хозяина, дефицитного по гену araD в присутствии арабинозы, единственно выжившими клетками являются те, которые содержат вектор,включающий в себя ген araD, мутантную форму гена araD, комплементарную ему последовательность или его каталитически активный фрагмент. В системе селекции по изобретению может использоваться любой экспрессирующий вектор, обычно применяемый при получении терапевтических продуктов, за счет чего ген araD, мутантная форма генаaraD, комплементарная ему последовательность, или его каталитически активный фрагмент встраивают вектор с использованием способов, в основном, известных в данной области. В настоящем контексте генSEQ ID NO: 19, или способную гибридизоваться с ней последовательность. Однако также рассматриваются любые применяемые гены araD. B настоящем контексте термин каталитически активный фрагмент гена araD представляет собой любой генный фрагмент, кодирующий полипептид или белок, способный к эпимеризации L-рибулозо-5-фосфата с образованием D-ксилулозо-5-фосфата. В конкретном варианте осуществления изобретения ген araD, комплементарная ему последовательность или его каталитически активный фрагмент встраивается в вектор, способный к долгосрочной сохранности и за счет этого способный предоставлять стабильную экспрессию требуемого(ых) антигена(ов). В другом конкретном варианте осуществления изобретения мутантная форма гена araD, комплементарная ей последовательность или его каталитически активный фрагмент встраивается в вектор, способный к долгосрочной сохранности и за счет этого способный предоставлять стабильную экспрессию требуемого(ых) антигена(ов). В конкретном предпочтительном варианте осуществления изобретения используемый вектор представляет собой экспрессирующий вектор, включающий в себя:(а) последовательность ДНК, кодирующей заякоренный в ядре белок, функционально связанный с гетерологичным промотором, причем указанный заякоренный в ядре белок включает в себя(ii) функциональный домен, который связывается с ядерным компонентом, или его функциональный эквивалент; и(b) мультимеризованную последовательность ДНК, образующую участок связывания заякоренного в ядре белка, где указанный вектор не содержит точку начала репликации вируса папилломы, и(c) ген araD, мутантную форму гена araD, комплементарную ему последовательность или его каталитически активный фрагмент. Такие векторы подробно описаны в международной патентной заявке WO 02/090558, которая включена сюда в качестве ссылки. Наиболее предпочтительно вектор, применяемый в способе селекции по настоящему изобретению,представляет собой экспрессирующий вектор, включающий в себя:(a) белок Е 2 вируса папилломы крупного рогатого скота типа 1 (BPV), и(b) множественные участки связывания белка Е 2 BPV, включенные в состав вектора в виде кластера, где данные участки могут быть в виде структуры начало-конец или могут включаться в состав вектора разнесенными между собой, где указанный вектор не имеет точки начала репликации вируса папилломы, и(c) ген araD, комплементарную ему последовательность или его каталитически активный фрагмент. В системе селекции по изобретению в принципе может использоваться любой известный хозяин,дефицитный по гену araD и подходящий для применения при получении терапевтических продуктов. В настоящей связи термин дефицитный означает хозяина, в котором ген araD или полностью подвергнут делеции или инактивирован любым известным способом. В предпочтительном осуществлении изобретения используется штамм Escherichia coli, предпочтительно коммерчески доступные штаммы E.coli DH5-альфа-Т 1, AG1 или JM109, из которых ген araD делетирован общеизвестными способами, такими как описанными ниже в примерах. В другом предпочтительном осуществлении изобретения штамм E.coli, предпочтительно штамм E.coli DH5-альфа-Т 1, AG1 или JM109, в которых сделаны комбинированные делеции для удаления других генов, кодирующих белки с активностью L-рибулозо-5-фосфат-4-эпимеразы. Альтернативно, могут использоваться коммерчески доступные штаммы E.coli, предпочтительно штаммы E.coli DH5-альфа-Т 1, AG1 или JM109, в которых ген araD и/или другие гены, кодирующие белки с активностью L-рибулозо-5-фосфат-4-эпимеразы инактивированы любым известным способом. В способе селекции клеток, несущих интересующий ген, для получения рекомбинантных терапевтических продуктов интересующий ген встраивают в клетки хозяина, дефицитные по araD и/или другим генам, кодирующим белки с активностью L-рибулозо-5-фосфат-4 эпимеразы, с использованием способа, хорошо известного в данной области, и данные клетки культивируют в среде роста, содержащей арабинозу в среде и условиях культивирования, подходящих для указанного хозяина. Может использоваться любая среда роста, подходящая для культивирования клеток E.coli. Для коммерческой продукции среду роста, естественно, оптимизируют в плане выхода. Примерами подходящих сред роста являются коммерчески доступные среды роста, такие как М 9 и LB (доступные от нескольких производителей, таких как Fermentas, Литва). Количество добавленной в среду роста арабинозы не критично, но, естественно, арабиноза должна присутствовать в количестве, достаточном для всего периода культивирования. Было обнаружено, что достаточным для селекции было такое малое количество, как 0,1%. Обычно арабинозу добавляют к среде в количестве примерно от 0,1 до 2,0%, предпочтительно в количестве примерно от 0,2 до 1,0%, наиболее предпочтительно примерно от 0,2 до 0,5%. Однако эффект L-арабинозы наблюдается при таких низких концентрациях, как 0,01%, и L-арабиноза может добавляться до 5% в среду роста. В конкретном осуществлении L-арабинозу используют в качестве средства для селекции и в качестве ограниченного источника углерода, 0,2% L-арабинозы является подходящим количеством для добавления в среду роста. Система селекции по изобретению подходит для применения в любой системе экспрессии. Она особенно подходит для применения в экспрессии рекомбинантных продуктов, таких как ДНК-вакцины,предназначенные для применения in vivo, поскольку избегаются проблемы, ассоциированные с применением генов устойчивости к антибиотикам. Сходным образом, система селекции по изобретению подходит для применения в продукции рекомбинантных белков. Возможная контаминация арабинозы в конечном продукте, возникающая в результате процесса получения, не имеет последствий, поскольку арабиноза является съедобным сахаром, содержащимся в натуральных продуктах питания и в качестве добавки, и, таким образом, нетоксична для млекопитающих,включая людей. Кроме того, ген araD меньше по размерам, чем обычно используемые гены устойчивости к антибиотикам, например, против ампициллина и тетрациклина, и сходен по размерам по сравнению с генами устойчивости к канамицину и хлорамфениколу. Это дает дополнительное преимущество, поскольку позволяет конструировать небольшие плазмиды, для которых потребление энергии для репликации меньше, чем для больших плазмид. За счет этого скорость роста бактериальной культуры и выход плазмиды повышаются. Настоящее изобретение может быть лучше понято со ссылкой на следующие неограничивающие примеры, которые предоставлены для иллюстрации изобретения. Следующие примеры представлены для более полной иллюстрации предпочтительных осуществлений изобретения. Однако они никоим образом не должны подразумевать ограничение широты объема изобретения. Пример 1. Клонирование плазмид селекции araD. Для клонирования конструкций селекции araD использовали плазмиду S6wtd1EGFP (фиг. 2). Она содержит точку начала репликации pMB1 и маркер устойчивости к канамицину вкачестве функциональных элементов остова плазмиды. Устойчивость к канамицину в данной плазмиде обеспечивается геном, который происходит из транспозона Tn903 E.coli. Ген araD амплифицируют с использованием полимеразной цепной реакции (ПЦР) из хромосомыE.coli DH5 по стандартной процедуре. Продукт ПЦР клонировали в выбранные плазмиды в двух различных ориентациях с парами праймеров s6araDL1 + s6araDR1 или s6araDL1 + s6araDR1, с получениемCGCCATGGAAAAGCCCGCTCATTAGGCGGGCTGTCATTACTGCCCGTAATATGC (SEQ ID NO. 5); Праймеры сконструировали так, что промотор Р 2 из плазмиды pBR322 (используемый для управления гена устойчивости к тетрациклину в pBR322) и последовательность терминации из оперона trpE.coli добавлялись во время ПЦР выше (в положении апстрим) и ниже (в положении даунстрим) кодирующей последовательности araD, соответственно. Продукты ПЦР длиной 814 и 815 п.н. клонировали в вектор pUC18, линеаризованный посредствомHincII (Fermentas, Литва), и правильные последовательности подтверждали секвенированием с использованием универсальных секвенирующих праймеровaraD R421: GGTTGCTGGAATCGACTGAC (SEQ ID NO. 11). Мутации в амплифицированных последовательностях подвергали репарации путем рекомбинации различных клонов. Для клонирования araD в S6wtd1EGFP, вектор линеаризовали путем частичного расщепления ферментом рестрикции PagI (положение 4761) (Fermentas, Литва) и 5'-концы ДНК дефосфорилировали щелочной фосфатазой кишечника теленка (CIAP; Fermentas, Литва). Фрагменты araD1 и araD2 вырезали изpUC18 посредством NcoI (Fermentas, Литва) и лигировали в S6wtd1EGFP/PagI. Обе смеси лигирования трансформировали в компетентные клетки E.coli DH5 и высевали на чашки со средой LB, содержащей 50 мкг/мл канамицина и инкубировали при 37 С в течение ночи. Колонии вначале анализировали путем ПЦР на колониях, после чего ДНК выделяли и расщепляли различными ферментами рестрикции. Клонирование приводило к образованию плазмид S6wtd1EGFPkana/araD1, S6wtd1EGFPkana/araD2,которые показаны на фиг. 3 и 4. Для удаления гена-маркера устойчивости к канамицину из плазмид S6wtd1EGFPkana/araD1 иS6wtd1EGFPkana/araD2 расщепляли рестрикционной эндонуклеазой BcuI (Fermentas, Литва), и векторный фрагмент длиной 6473 п.н. лигировали самого на себя. Смеси лигирования трансформировали в штамм E.coli AG1 AaraD (см. пример 3) и высевали на чашки, содержащие среду М 9, дополненную 2% L-арабинозой и инкубировали при 37 С в течение 36 ч. Колонии вначале анализировали путем ПЦР на колониях, после чего ДНК выделяли и расщепляли различными ферментами рестрикции. Клонирование приводило к образованию плазмид S6wtd1EGFP/araD1,S6wtd1EGFP/araD2, которые, соответственно, показаны на фиг. 5 и 6. Бактериальные колонии, содержащие S6wtd1EGFP/araD1 и S6wtd1 EGFP/araD2, выращивали в двух различных средах: LB, дополненной 2,5% L-арабинозой, и М 9, дополненной 0,2% L-арабинозой, при 37 С при интенсивном встряхивании. Клетки собирали, и из них выделяли плазмидную ДНК с использованием набора QIAprep Spin Miniprep (QIAGEN) и анализировали электрофорезом в агарозе (фиг. 7 А и 7 В соответственно). Образцы плазмидной ДНК из культур в средах LB и М 9 анализировали путем электрофореза в агарозном геле до и после расщепления: рестрикционной эндонуклеазой PagI (Fermentas, Литва) (фиг. 8). Предсказанные размеры фрагментов, полученные при расщеплении PagI, составляли 3954 и 2519 п.н. для(M15 на фиг. 8C) и ДНК фага лямбда, расщепленную EcoRI/HindIII (Fermentas, Литва) (М 3 на фиг. 8C) использовали в качестве маркеров молекулярной массы. Все проанализированные бактериальные клоны содержали правильную плазмиду при анализе рестрикционным ферментом, но выход ДНК был очень низким, когда плазмиды выращивали в среде LB. Два из анализированных бактериальных клонов из четырех клонов S6wtd1EGFP/araD2 (13 и 14 на фиг. 8 В) имели более высокую скорость роста при выращивании в среде М 9, дополненной 0,2% L-арабинозой (фиг. 7 и 8), что приводило к более высокому выходу плазмиды на культуру.-6 011823 Проводили дальнейший анализ данных двух клонов с улучшенным ростом. Данные две плазмиды имели ту же структуру, как и другие плазмиды, по оценке анализа рестрикции. Плазмиды экстрагировали из бактерий и далее характеризовали путем секвенирования локуса гена araD. Последовательность локуса araD клона 13 (SEQ ID NO. 18; SEQ ID NO. 19) показывала, что последовательность, кодирующая ген araD, несет стоп-кодон вместо кодона глутамина в положении 8 L-рибулозо-5-фосфат-4 эпимеразы. Данная мутация происходила вследствие замены цитидина (С) в кодоне 8 L-рибулозо-5 фосфат-4-эпимеразы (кодирующая araD последовательность) (5'-CAG-3') на тимидин (T), что приводит к образованию стоп-кодона (5'-TAG-3'). Плазмида, несущая такую мутацию в гене araD, эффективно предоставляла способность к росту в селективной среде в присутствии L-арабинозы, хотя кодирующая последовательность содержит стоп-кодон. Было продемонстрировано, что стоп-кодон UAG эффективно считывается рибосомой Escherichia coli, когда такой стоп-кодон находится в начале кодирующей последовательности [например, см. обзор Murgola, E.J., Annu. Rev. Genet. 19 (1985) 57-80]. Хотя это и не связано какой-либо теорией, авторы предположили, что высокий выход плазмиды, который является указанием на быстрый неингибированный рост бактерий, требует оптимальной концентрации продукта генаaraD L-рибулозо-5-фосфат-4-эпимеразы. Анализ последовательности локуса araD клона 14 показал, что кодирующая последовательностьaraD совершенно такая, как предсказано. Однако наблюдались перестройки последовательности вблизи промотора araD, покрывающей участки связывания белка Е 2 (см. фиг. 13, SEQ ID NO. 18). Эти данные,кроме того, указывали на то, что такие перестройки вблизи промотора могут приводить к отрицательной регуляции промоторной активности, то есть к уровню продукта araD. Пример 2. Клонирование плазмид селекции с мутантным araD. Для клонирования конструкций селекции с мутантным araD плазмиду p3hCG (фиг. 14), несущую устойчивость к канамицину [ген-маркер устойчивости к канамицину, происходящий из транспозона Tn5(neo)] расщепляли рестрикционными эндонуклеазами BcuI и HindIII, концы заполняли с использованием фрагмента Кленова (Fermentas, Литва), и фрагмент размером 4647 п.н. очищали из геля после электрофореза в агарозном геле. Точку начала репликации pMB1 и последовательность araD, несущую мутацию С на T, которая приводит к образованию стоп-кодона в последовательности, кодирующей ген araD, вырезали из плазмиды paraDMgB (фиг. 15) рестрикционными эндонуклеазами BcuI b Есо 52I, концы заполняли с использованием фрагмента Кленова (Fermentas, Литва), и 5'-концы ДНК дефосфорилировали щелочной фосфатазой кишечника теленка (CIAP; Fermentas, Литва). Фрагмент размером 1532 п.н. очищали из геля после электрофореза в агарозном геле и лигировали с фрагментом длиной 4647 п.н., полученным выше. Штамм Escherichia coli AG1, дефицитный по araD, трансформировали данной смесью для лигирования и высевали на агаровые чашки, содержащие селективную среду М 9 с 0,5% дрожжевым экстрактом, 2% L-арабинозой и 25 мкг/мл канамицина. Колонии инспектировали через 24 ч после высевания и показали, что размер колоний был одинаковым. Плазмиды экстрагировали из бактерий и далее характеризовали секвенированием генного локуса araD. Клонирование приводило к получению плазмид p3araD1hCG и p3araD2hCG, которые показаны на фиг. 16 и 17 соответственно. Согласно анализу последовательности бактерии содержали неперестроенные плазмиды с мутацией С на T в кодоне 8 (p3araD1hCG; фиг. 16; p3araD2hCG, фиг. 17). Когда эксперимент повторяли с последовательностью дикого типа, и трансформированные планшеты проверяли через 24 ч после трансформации, результаты были другими. Наблюдали два типа колоний: во-первых, колонии большого размера, и малые колонии, которые имели замедленный рост. Анализ последовательности данных плазмид указывал на то, что кодирующая последовательность гена araD несет стоп-кодон вместо кодона глутамина (плазмида 3 А, araD2) или что мутация произошла в последовательности Шайна-Дальгарно в участке связывания рибосомы (AGGAG замещен на AGTAG) (плазмида 2 А, araD2). Плазмида 7 (araD1) имела правильную последовательность во всех областях локуса генаaraD, однако, бактерии росли очень медленно, и это приводило к 10-кратному более низкому выходу плазмиды при росте в жидкой среде. Пример 3. Конструирование чувствительных в отношении арабинозы штаммов Escherichia coliaraD. Три штамма E.coli, DH5-альфа T1, AG1 и JM109, использовали для конструирования мутантов[PNAS 97 (2000) 6640-6645]. Данный способ использует систему рекомбинации фагаRed. B кратком изложении, стратегия данной системы состоит в замещении хромосомной последовательности с подлежащим селекции геном устойчивости к антибиотику, которое генерируется посредством ПЦР с использованием праймеров с продлением гомологии. Это выполняется путем опосредованной Red рекомбинацией в данных фланкирующих гомологичных участках. Для трансформации pKD46 (Datsenko and Wanner, supra), кодирующей систему рекомбинации фагаE.coli, клетки делали химически компетентными с использованием растворов RF1 и RF2: Клетки выращивали в 2 мл среды LB до OD600 0,2-0,5. Культуру центрифугировали и осадок ресуспендировали в 1 мл RF1. Смесь держали на льду в течение 10 мин и центрифугировали. Осадок ресуспендировали в 100 мкл RF2, и суспензию держали на льду в течение 30-45 мин. Примерно 50 нг pKD43 добавляли и клетки держали на льду в течение дополнительных 30 мин с последующим тепловым шоком в течение 5 мин при 37 С. После инкубации в течение 10 мин на льду 900 мкл среды SOB добавляли к трансформированным клеткам и смесь инкубировали при 37C в течение 1 ч. Клетки высевали на средуLB, содержащую ампициллин (100 мкг/мл). Колонии изымали с чашек для трансформации и выращивали в 2 мл той же среды до OD600, равной приблизительно 1, и получали маточные растворы с глицерином (2 мл культуры + 0,6 мл 50% глицерина). Маточные растворы хранили при -80C. Для разрушения гена araD получали линейный продукт ПЦР, содержащий ген устойчивости к канамицину. Плазмиду pKD13 (Datsenko and Wanner, PNAS vol. 97, no 12, June 2000) использовали в качестве матрицы для ПЦР. Использованные праймеры представляли собой ara(prl) и ara(pr4):TCGACC-3' (SEQ ID NO. 13) Данные праймеры имели последовательности, комплементарные в отношении pKD13 для отжига в ПЦР и в отношении гена araD для гомологичной рекомбинации. Реакционная смесь для ПЦР была следующей: нативный буфер PFU (5 мкл), 10 мМ dNTP (5 мкл),праймер ara(pr1) 10 мкМ (1 мкл), праймер ara(pr4) 10 мкМ (1 мкл), pKD13 100 нг (2 мкл), DMSO (4 мкл),PFU 2,5 Ед (1 мкл) и вода mQ до 50 мкл. Процедура ПЦР была следующей: денатурация 45 с, 96 С, отжиг 45 с, 50C, синтез 2 мин 30 с,72 С, 25 циклов. Полученный продукт ПЦР составлял 1,4 тыс.п.н. Пять реакций проводили одновременно; ДНК очищали от 2% агарозного геля с использованием набора для очистки Ultrapure (MoBio Laboratories Inc.) и элюировали 60 мкл воды. ДНК концентрировали путем осаждения этанолом и растворяли в 5 мкл воды. Конечная концентрация составляла 0,6 мкг/мкл. Аликвоту 1,5 мкл использовали в одной электропорации. Продукт ПЦР подвергали электропорации в клетки E.coli DH5-альфаТ 1pKD46, AG1pKD46(Datsenko and Wanner, supra) и JM109pKD46. Во-первых, 200 мл среды YENB, содержащей 10 мМ Lарабинозы для индукции рекомбинантной системы и 100 мкг/мл ампициллина, инокулировали ночной культурой клеток E.coli DH5-альфаТ 1pKD46, AG1pKD46 и JM109pKD46. Культуры выращивали при 30C до OD600, равной 0,8 (DH5-альфаТ 1 и JM109) и 0,6 (AG1). Бактерии собирали центрифугированием при 4000 g в течение 10 мин при 4 С, промывали дважды 20 мл стерильной воды и один раз 20 мл стерильной воды, содержащей 10% глицерин. Клетки суспендировали в 300 мкл воды, содержащей 10% глицерин. 40 мкл компетентных клеток использовали в одной электропорации. Электропорацию проводили на BioRad E.coli Pulser с использованием кювет размером 0,2 см и при 2,5 кВ. Очищенный продукт ПЦР (1,5 мкл) добавляли к компетентным клеткам, держали на льду в течение 1 мин, и немедленно после электропорации, 2 мл теплой среды SOB добавляли к клеткам и смесь инкубировали при 37C в течение 1 ч. Клетки высевали на среду LB, содержащую канамицин (25 мкг/мл). 100 пг большой плазмиды устойчивости к канамицину (GTU-MultiHIV C-clade) использовали в-8 011823 качестве положительного контроля, к негативному контролю плазмиду не добавляли. Эффективность трансформации составляла 106 для AG1 и 107 для JM109 для положительного контроля. На чашке с отрицательным контролем колоний не было, 215 колоний получали на чашке JM109 + продукт ПЦР, 70 колоний на чашке AG1 + продукт ПЦР, и 50 колоний на чашке DH5-альфаТ 1 + продукт ПЦР. Пример 4. Тестирование штаммов E.coli DH5-альфа T1 araD, AG12araD и JM1092araD. Колонии, полученные после электропорации, как описано в примере 2, тестировали в присутствии гена канамицина путем ПЦР на колонии с использованием праймеровaraVIisR (5'-TGATAGAGCAGCCGGTGAGT-3'; SEQ ID NO. 15), которые содержат участки отжига на гене araD вблизи участка вставки. Продукт ПЦР размером 272 п.н. ожидался от штаммов E.coli DH5 альфаТ 1, AG1 и JM109 без вставки в araD, и продукт длиной 1545 п.н., если продукт ПЦР встроен в генaraD. Проверяли три колонии DH5-альфаТ 1araD, девять колоний AG1araD и 14 колоний JM109araD из 15 проверяли и каждый давал продукт длиной 1545 п.н. Поэтому делали вывод, что данные штаммы содержали вставку гена устойчивости к канамицину. Для подтверждения вставки гена канамицина проводили другую ПЦР на колониях с использованием праймеров kanaSF (5'-TCAGATCCTTGGCGGCAAGA-3'; SEQ ID NO. 16) и araVR (5'TGTAATCGACGCCGGAAGGT-3'; SEQ ID NO. 17). Данные праймеры продуцируют продукт длиной 435 п.н., если ген устойчивости к канамицину встраивали в ген araD. Тестировали шесть колоний из штаммов AG1araD и JM109araD и три колонии из штамма DH5-альфа T1araD, и все давали правильный продукт. Шесть колоний AG1araD и JM109araD, и три колонии DH5-альфаТ 1araD высевали на среду LB,содержащую 25 мкг/мл канамицина и инкубировали при 37 С в течение ночи для элиминации плазмидыpKD46, которая имеет точку начала репликации, чувствительную к температуре. Клетки тестировали на чувствительность к ампициллину путем получения реплик на среде LB и на среде LB, содержащей ампициллин. Колонии не росли на среде, содержащей ампициллин, и был сделан вывод, что бактерии больше не содержали плазмиду pKD46. Чувствительность к арабинозе тестировали на продуцированных штаммах AG1araD иJM109araD. Одной колонией AG1araD и одной колонией JM109araD каждой инокулируют 2 мл LB. Культуры выращивали в течение 8 ч, разбавляли 1:100 в среду М 9, содержащей 0,2% глицерина, 25 мкг/мл канамицина, 0,01% тиамина (0,05% пролина для JM109araD), и в среду роста добавляли различные концентрации L-арабинозы. Культуры выращивали в течение ночи при 37 С в шейкерном инкубаторе и измеряли OD600 (табл. 1). Таблица 1 Тестирование чувствительности к арабинозе Как можно видеть из табл. 1, такого маленького количества, как 0,1% L-арабинозы достаточно для ингибирования роста штаммов araD по изобретению. Чувствительность арабинозы далее тестировали на AG1araD, DH5-альфа-Т 1araD и JM109araD,как указано выше, но с использованием более низких концентраций L-арабинозы. Результаты приведены на фиг. 18. Как можно видеть на фиг. 18, такого маленького количества, как 0,0005% L-арабинозы, достаточно для ингибирования роста штаммов araD по изобретению. Кроме того, чувствительность к L-арабинозе тестировали в среде М 9 и дрожжевом экстракте с различными концентрациями глюкозы и арабинозы (0,2% глюкоза, 0,2% арабиноза, 2% арабиноза). Культуры инкубировали при 37 С в шейкерном инкубаторе в течение ночи. Затем измеряли OD600 для количественного анализа плотности клеток. Результаты даны на фиг. 19. Обе концентрации арабинозы (0,2 и 2%) ингибировали рост штаммов araD по изобретению. Однако рост штаммов с интактным геном araD не ингибировался. Кроме того, выход плазмидной ДНК штаммов araD тестировали. Плазмидой S6wtd1EGFParaD2,полученной в примере 1, трансформировали штаммы AG1araD и JM109araD. Компетентные клетки получали с растворами RF1 и RF2, как описано в примере 3. Колонии из трансформированных чашек инокулировали в 2 мл среды M9, содержащей 0,5% дрож-9 011823 жевого экстракта и 25 мкг/мл канамицина + 0,01% тиамина + L-арабинозы (2% и 0,2%). Культуры инкубировали при 37 С в течение 17 ч. Затем измеряли OD600 для количественного анализа плотности клеток, и экстрагировали плазмидную ДНК набором Qiagen Miniprep. Коэффициент 2,8(OD600/мл) использовали при выделении минипрепаратов для получения сравнимых результатов. Результаты показаны в табл. 2. Концентрацию ДНК измеряли на спектрофотометре как OD при 260 нм. Для микроскопического анализа каплю бактериальной культуры наносили на стеклянное предметное стекло и накрывали покровным стеклом. Культуру визуально контролировали при 100 увеличении в объективе с масляной иммерсией. Таблица 2 Выход плазмидной ДНК штаммов araD По данным результатам 0,2% L-арабинозы достаточно для получения числа копий плазмиды на том же уровне, что и с 2% арабинозой. Для этого лучшей кажется плазмида AG1araD, поскольку выход плазмиды и также плотность клеток с ней несколько выше. Пример 5. Получение штамма Escherichia coli с дополнительными мутациями в генах, потенциально кодирующих L-рибулозо-5-фосфат-4-эпимеразу. Хромосома E.coli содержит две дополнительных кодирующих последовательности L-рибулозо-5 фосфат-4-эпимеразы в различных оперонах. Гены ulaF и sgbE из пути деградации L-аскорбата кодируют гены с эпимеразной активностью (Wen Shan Yew, Jhon A.Gerit, J. Bacteriol. 184 (2002) 302-306). Для повышения жесткости селекции и для препятствия или выключения возможных механизмов адаптации штаммов E.coli вследствие других генов с эпимеразной активностью, разрушали кодирующие последовательности генов UlaF и SgbE в геноме E.coli. Такие механизмы адаптации могут реализовываться при долгосрочной продукции плазмиды в подходящих условиях. Гены UlaF и SgbE в штаммах E. Coli DH5 альфаТ 1araD и AG1araD разрушали с использованием рекомбинантной системы фагаRed, как описано в примере 3. Во-первых, элиминировали ген устойчивости к канамицину в штаммах E.coli AG1araD иDH5T1araD. Экспрессирующая плазмида pKD20 с рекомбиназой FLP (Datsenko and Wanner, supra) устойчива к ампициллину и чувствительна к температуре. Устойчивых к канамицину мутантов трансформировали рСР 20 (ген устойчивости к канамицину фланкирован FRT), и устойчивых к ампициллину трансформантов отбирали при 30C (48 ч), после чего те же колонии неселективно очищали при 42 С(два раза по 24 ч). Затем их тестировали на потерю устойчивости к канамицину и ампициллину. Инактивацию хромосомного гена ulaF (SEQ ID NO. 20) посредством системы рекомбинации фагаulaFalum AAACGGCTGCGGAATTAGACCAGTTATCTCCCGAGGAAGGAAATTAATTCCGGGGATCCGTCGACC (SEQ ID NO. 22) Много колоний наблюдали на обеих чашках трансформации. Пятнадцать колоний, полученных в результате электропорации, тестировали на присутствие гена устойчивости к канамицину посредством ПЦР на колониях с использованием ulaFvalisR и ulaFvalisF:ulaFvalisF GCCGTACCTGATTGAGATGTGGAG (SEQ ID NO. 24) Данные праймеры содержали участки отжига на гене UlaF вблизи участка встраивания. От штаммов E.coli DH5-альфа-T1araD и AG1araD ожидали продукт ПЦР размером 864 п.н. без вставки UlaF, и продукт длиной 1527 п.н., если продукт ПЦР встраивали в ген UlaF. Для подтверждения вставки гена- 10011823 устойчивости к канамицину проводили другую ПЦР на колониях с использованием праймеров ulaFvalisR(SEQ ID NO. 23) и kanaSF (SEQ ID NO. 16). Данные праймеры образуют продукт размером 428 п.н., если ген устойчивости к канамицину был встроен в ген UIaF. Тестировали четыре колонии штаммов AG1araDulaF и DH5-альфа-T1araDulaF, и все давали правильный продукт. Одну колонию из каждого штамма использовали далее. Элиминацию гена устойчивости к канамицину в штаммах E.coli AG1araDulaF и DH5-альфаТ 1araDulaF проводили, как описано выше. Инактивацию хромосомного гена sgbE (SEQ ID NO. 25) посредством системы рекомбинации фагаRed проводили, как описано в примере 3. Используемые праймеры представляли собой sgbEalum и sgbEylem:CTGCTTC (SEQ ID NO. 27) Много колоний наблюдали на обеих чашках трансформации. Пятнадцать колоний, полученных после электропорации, тестировали на присутствие гена устойчивости к канамицину посредством ПЦР на колониях с использованием праймеров sgbEvalisR и sgbEvalisF:sgbEvalisF ATTGAAGCGCGTATGCAGGAGG (SEQ ID NO. 29) От штаммов E.coli DH5-альфа-Т 1araDulaFsgbE и AG1araDulaFsgbE ожидали продукт ПЦР размером 792 п.н. без вставки в SgbE, и продукт длиной 1413 п.н., если продукт ПЦР был вставлен в генSgbE. Для подтверждения вставки гена канамицина проводили другую ПЦР на колониях с использованием sgbEvalisR (SEQ ID NO. 28) и kanaSF (SEQ ID NO. 16). Тестировали пятнадцать колоний из обоих штаммов, и четыре дали правильный продукт. Чувствительность к арабинозе тестировали на продуцированных штаммах E.coli DH5-альфа-Т 1araDulaFsgbE и AG1araDuiaFsgbE и сравнивали со штаммами E.coli DH5-альфа-TlaraD иAG1araD. Одной колонией из каждого штамма инокулировали 2 мл среды М 9, содержащей 0,5% дрожжевого экстракта, 25 мкг/мл канамицина, 0,2% только глюкозы или 0,2% или 2% L-арабинозы соответственно. Результаты показаны в табл. 3. Таблица 3 Тестирование чувствительности к арабинозе Как видно из табл. 3, не было существенной разницы между чувствительностью к арабинозе штаммов по изобретению. Сходным образом, когда выход ДНК штаммов araD и araDulaFsgbE тестировали, как описано в примере 3 (результаты не показаны), не обнаруживали отличий между штаммамиE.coli AG1 araD и AG1 araDulaFsgbE или DH5-альфа-Т 1araD и DH5-альфа-T1araDulaFsgbE. Пример 6. Стабильность S6wtd1EGFP/araD2. Важной характеристикой вектора для вакцинации является стабильность во время размножения в бактериальных клетках. Для тестирования стабильности S6wtd1EGFP/araD2 в бактериях плазмидой трансформировали штаммы E.coli AG1araD и JM109araD, полученные в примере 3, и за интактностью вектора следили путем анализа плазмидной ДНК во время четырех поколений. Плазмиду S6wtd1EGFP/araD2 смешивали с компетентными клетками Е. coli AG1araD иJM109araD и инкубировали на льду в течение 30 мин. Впоследствии суспензию клеток подвергали тепловому шоку в течение 3 мин при 37 С с последующим быстрым охлаждением на льду. Один миллилитр среды LB добавляли к образцу, и смесь инкубировали в течение 45 мин при 37 С с интенсивным помешиванием. Наконец, часть клеток высевали на чашки со средой М 9, содержащей 0,5% дрожжевого экс- 11011823 тракта, 2% L-арабинозы и 25 мкг/мл канамицина. На следующие сутки клетки из одной колонии переносили на новую чашку, содержащую ту же среду. Данную процедуру повторяли по мере роста четырех пассажей. Две колонии из каждого пассажа обоих бактериальных штаммов использовали для инокуляции 2 мл среды М 9, содержащей 0,5% дрожжевого экстракта, 2% L-арабинозы и 25 мкг/мл канамицина, и инкубировали в течение ночи при 37 С с интенсивным перемешиванием. Клетки собирали, и плазмиду ДНК экстрагировали из бактерий с использованием набора QIAprep Spin Miniprep (QIAGEN). Образцы плазмидной ДНК до (фиг. 9) и после расщепления рестрикционной эндонуклеазной HindIII (фиг. 10)(Fermentas, Литва) анализировали путем электрофореза в агарозном геле по сравнению с исходной ДНКS6wtd1EGFP/araD2, использованной для трансформации (в качестве контроля на фиг. 9 и 10) . ДНК фага лямбда, расщепленную EcoRI/HindIII (Fermentas, Литва), использовали в качестве маркера молекулярной массы (М 3 на фиг. 10). Образцы расщепляли HindIII, показанные на фиг. 10A для E.coli AG1araD и на фиг. 10 В для штамм JM109araD, наблюдали профили, идентичные исходной плазмидной ДНК S6wtd1EGFP/araD2. Предсказанные размеры фрагментов, полученных при расщеплении HindIII, составляют 3274, 1688 и 1510 п.н. Следует заключить, что вектор вакцинации S6wtd1EGFP/araD2 стабилен при размножении в штаммах E.coli AG1araD и JM109araD. Пример 7. Сравнение системы селекции на основе антибиотиков с системой селекции на основе Lарабинозы по изобретению. При сравнении системы селекции на основе антибиотиков с системой селекции на основе Lарабинозы по изобретению использовали следующие среды роста. Для E.coli AG1, несущей плазмиду р 2 MG С 11: среда 1: среда М 9 плюс 0,5% дрожжевого экстракта, 0,2% глюкозы и 25 мкг/мл канамицина (селективная среда); среда 2: среда М 9 плюс 0,5% дрожжевого экстракта и 0,2% глюкозы (неселективная среда); среда 3: среда М 9 плюс 0,5% дрожжевого экстракта, 0,2% L-арабинозы и 25 мкг/мл канамицинаE.coli AG1araD, несущую мутацию С на T в кодоне 8. Трансформированные бактериальные колонии выращивали при 37 С в течение ночи в инкубаторе. На следующее утро колонии инокулировали в селективную и неселективную жидкие среды, как указано выше. Инокулированные культуры выращивали в шейкере в 2 мл соответствующей среды, пока они не достигали стационарной фазы, и измеряли плотность культур при OD600. Плазмиду экстрагировали из культур и выход плазмидной ДНК определяли измерением плазмидной ДНК при 260 нм. Выход плазмиды рассчитывали на основе выходов 50 мкг при оптической плотности при 260 нм, равной 1. Затем аликвоту 20 мкл из стационарных культур инокулировали в свежую среду (100-кратное разведение) и культуры выращивали до стационарной фазы (8-12 ч). Измеряли плотность культур приOD600, плазмиду выделяли и определяли выход, и аликвоту опять инокулировали в 2 мкл жидкой среды. Данную процедуру повторяли 7 раз (препараты с 1 до 7). Результаты экспериментов предоставлены ниже в табл. 5. Таблица 5 Сравнение системы селекции на основе антибиотиков с системой селекции на основе L-арабинозы по изобретению Из этих данных можно заключить, что плазмида, несущая ген устойчивости к канамицину и наделяющая E.coli данной устойчивостью в присутствии канамицина, теряется в последовательных стадиях разведения/роста культуры при неселективных, а также при селективных условиях. Выход плазмиды из 1 мл культуры падает в 3 раза в селективных условиях и 10 раз в неселективных условиях на седьмой раунд разведения (препараты 1/1 по сравнению с 1/7 и 2/1 по сравнению с 2/7, соответственно, в табл.5). Тот же основной результат получают, когда источник углерода из E.coli, несущей плазмиду с устойчивостью к канамицину, представляет собой L-арабинозу вместо глюкозы (препараты 3/1 по сравнению с 3/7 и 4/1 по сравнению с 4/7, соответственно, в табл. 5). Однако, когда в плазмиде используется система селекции araD по изобретению, выход плазмидной ДНК высок как в селективных (препарат 5/1 по сравнению с 5/7 в табл.5), так и в неселективных (препарат 6/1 по сравнению 6/7 в таблице 5) условиях. Как в селективных, так и в неселективных условиях выход плазмидной ДНК падал в течение 7 поколений примерно на 20%. Это ясно указывает на то, что плазмиды, несущие систему селекции araD по изобретению,значительно более стабильны и эффективно растут в селективных, а также в неселективных условиях. Пример 8. Подпитываемая ферментация AG12araD S6wtd1EGFP/araD2. Основанную на гене araD систему также тестировали в подпитываемой ферментации для целей продукции бактерий, содержащих плазмиды. Единственную колонию снимали с чашки AG1araDL-арабинозы и 25 мкг/мл канамицина и инкубировали в течение ночи при 37C с интенсивным перемешиванием. Через 18 ч OD600 среды инокуляции составляет 6,4. 160 мл среды инокуляции добавляли в ферментер, содержащий 5 л исходной среды ферментера (8 г/л KH2PO4; 10 г/л NaCl; 5 г/л NH4Cl; 5 г/л дрожжевого экстракта; 2 г/л L-арабинозы; 2 г/л MgSO4, 25 мг/л канамицина и 0,1 г/л тиамина; рН 6,7,доведенный посредством NH4OH). Через 5,5 ч роста начиналась автоматическая подпитка с заданной скоростью роста, равной 0,15 ч-1 (обеспечивает рост, ограниченный источником углерода) средой для подпитки ферментера (300 г/л L-арабинозы; 150 г/л дрожжевого экстракта; 50 мг/л канамицина; 0,2 г/л тиамина). Скорость подпитки контролировалась компьютером по формуле F(t)=mySSin/Sf, в которойmyS представляет собой требуемую скорость роста, Sin представляет собой количество источника углерода, добавленного в данный момент времени и Sf представляет собой концентрацию источника углерода в среде подпитки. За ростом следили измерением OD600 и отбирали образцы плазмидной ДНК. Данные, зарегистрированные во время ферментации, представлены на фиг. 11. Ферментацию заканчивали при потреблении 1 л среды подпитки. Конечная OD600 составляла 45. Бактериальную массу собирали путем центрифугирования и промывали один раз 2 л буфера STE. Выход бактериальной биомассы составлял 410 г влажной массы. Данные по содержанию плазмидной ДНК показаны в табл. 6. Таблица 6 Выход плазмидной ДНК во время ферментации AG1araD S6wtd1EGFP/araD2 Данные в табл. 6 указывают на то, что система селекции L-арабинозы хорошо работает при высоких плотностях клеток. Возможно, это происходит, поскольку большее число копий плазмиды в бактериаль- 13011823 ной клетке дает преимущество в условиях ограничения L-арабинозы, заставляя бактерии быстрее использовать сахар. Пример 9. Очистка AG1araD S6wtd1EGFP/araD2. Очистку AG1araD S6wtd1EGFP/araD2 проводили следующим образом (фиг. 12):a) Обработка питательной среды. Клеточный лизат получали по руководству Qiagen's Plasmid Purification Handbook, за исключением того, что РНКазу не использовали. 200 г клеточной массы E.coli ресуспендировали в 2000 мл буфера для ресуспендирования и позже использовали равные объемы Р 2 и Р 3 для лизиса и нейтрализации. Клеточный дебрис удаляли путем центрифугирования при 6000 g в течение 30 мин при 4C. Клеточный лизат проливали через бумажное полотенце, добавляли 1/10 10% Triton X-114 (Sigma) и раствор оставляли на льду в течение 1 ч. (Triton X114, как было показано, эффективно снижал уровень эндотоксинов в белке, Liu et al., Clinical Biochemistry, 1997). Через 1 ч нуклеиновые кислоты осаждали 0,6 объемами холодного изопропанола. Надосадочную жидкость декантировали и осадок хранили в течение ночи при -20C.b) Очистка плазмидной ДНК. Очистку плазмидной ДНК проводили по трехстадийному способу Amersham Pharmacia для очистки сверхспирализованных плазмид, в который были внесены небольшие модификации. Стадия 1. Осадок перерастворяли в 1500 мл ТЕ (10 мМ Tris-Cl, 1 мМ EDTA; рН 8,0) и загружали для удаления РНК и смены буфера на Sepharose 6 FF (Amersham Pharmacia), ранее уравновешенную буфером А - 2 М (NH4)2SO4, 100 мМ Tris Cl, 10 мМ EDTA, pH 7,5. Стадия 2. Прошедший через колонку объем направляли на колонку PlasmidSelect (Amersham Pharmacia) (уравновешенную буфером А) и после отмывки и элюции буфером В 2 (1,6 М NaCl, 2 М (NH4)2SO4,100 мМ Tris Cl, 10 мМ EDTA, рН 7,5), захватывали сверхспирализованную плазмидную ДНК. Стадия 3. Элюированную плазмиду разбавляли пятью объемами дистиллированной, деионизированной воды и загружали на SOURCE 30Q (Amersham Pharmacia), уравновешенную буфером Cl (0,4 МNaCl, 100 мМ Tris Cl, 10 мМ EDTA, рН 7,5). После промывки очищенную плазмиду элюировали буфером С 2 (1 M NaCl, 100 мМ Tris Cl, 10 мМ EDTA, рН 7,5) и собирали пик элюции. Объем фракции составлял 150 мл, и он содержал 100 мг лишенной эндотоксинов (10 EU/мг) плазмиды S6wtd1EGFP/araD2. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Система селекции, содержащая бактериальную клетку, дефицитную по гену araD, кодирующемуL-рибулозо-5-фосфат-4-эпимеразу (ЕС 5.1.3.4.), в которую встроен в качестве маркера селекции вектор,несущий ген araD, кодирующий активную L-рибулозо-5-фосфат-4-эпимеразу. 2. Система селекции по п.1, в которой ген araD мутирован. 3. Система селекции по п.2, в которой мутация вводит стоп-кодон в положение 8 гена araD. 4. Система селекции по любому из пп.1-3, в которой бактериальная клетка представляет собой клетку Escherichia coli. 5. Система селекции по п.4, в которой E.coli представляет собой штамм E.coli JM109. 6. Система селекции по п.4, в которой E.coli представляет собой штамм E.coli DH5-альфа. 7. Система селекции по п.4, в которой E.coli представляет собой штамм E.coli AG1. 8. Система селекции по любому из пп.4-7, в которой E.coli дополнительно дефицитна по гену ulaF. 9. Система селекции по любому из пп.4-7, в которой E.coli дополнительно дефицитна по гену sgbE. 10. Система селекции по любому из пп.4-7, в которой E.coli дополнительно дефицитна по гену ulaF и гену sgbE.- 24011823 11. Вектор, содержащий мутантный ген araD со стоп-кодоном в положении 8, кодирующий Lрибулозо-5-фосфат-4-эпимеразу или ее каталитически активный фрагмент, для использования в системе селекции по любому из пп.1-10. 12. Вектор по п.11, представляющий собой экспрессирующий вектор, который дополнительно содержит:(а) последовательность ДНК, кодирующую заякоренный в ядре белок, функционально связанный с гетерологичным промотором, причем указанный заякоренный в ядре белок содержит (i) ДНКсвязывающий домен, который связывается со специфичной последовательностью ДНК, и (ii) функциональный домен, который связывается с ядерным компонентом, и(b) мультимеризованную последовательность ДНК, образующую участок связывания для заякоренного в ядре белка, где указанный вектор не содержит точки начала репликации вируса папилломы. 13. Вектор по п.12, в котором:(a) заякоренный в ядре белок представляет собой белок Е 2 вируса папилломы крупного рогатого скота типа 1 (BPV) и(b) мультимеризованная последовательность ДНК формирует множественные участки связывания белка Е 2 типа 1 BPV, причем участки связывания встроены в вектор в виде кластера, при этом указанные участки могут быть в виде структуры начало-конец или могут быть встроены в вектор разнесенными между собой. 14. Вектор по п.13, в котором мультимеризованная последовательность ДНК имеет делецию. 15. Вектор по п.13, в котором последовательность Шайна-Дальгарно мутирована. 16. Применение вектора, содержащего ген araD, кодирующий L-рибулозо-5-фосфат-4-эпимеразу или ее каталитически активный фрагмент, или мутантную форму указанного гена araD в качестве маркера селекции в системе селекции по любому из пп.1-10. 17. Применение вектора по п.16, где вектор представляет собой экспрессирующий вектор, который дополнительно содержит:(a) последовательность ДНК, кодирующую заякоренный в ядре белок, функционально связанный с гетерологичным промотором, причем указанный заякоренный в ядре белок содержит (i) ДНКсвязывающий домен, который связывается со специфичной последовательностью ДНК, и (ii) функциональный домен, который связывается с ядерным компонентом, и(b) мультимеризованную последовательность ДНК, образующую участок связывания для заякоренного в ядре белка, где указанный вектор не содержит точки начала репликации вируса папилломы. 18. Применение вектора по п.17, в котором:(a) заякоренный в ядре белок представляет собой белок Е 2 вируса папилломы крупного рогатого скота типа 1 (BPV) и(b) мультимеризованная последовательность ДНК формирует множественные участки связывания белка Е 2 типа 1 BPV, причем участки связывания встроены в вектор в виде кластера, где указанные участки могут быть в виде структуры начало-конец или могут быть встроены в вектор разнесенными между собой. 19. Применение вектора по п.18, в котором мультимеризованная последовательность ДНК имеет делецию. 20. Применение вектора по п.18, в котором последовательность Шайна-Дальгарно мутирована. 21. Штамм E.coli DH5-альфа-Т 1, дефицитный по гену araD и гену ulaF, для использования в системе селекции, не содержащей антибиотиков, для получения рекомбинантных продуктов. 22. Штамм E.coli DH5-альфа-Т 1, дефицитный по гену araD и гену sgbE, для использования в системе селекции, не содержащей антибиотиков, для получения рекомбинантных продуктов. 23. Штамм E.coli DH5-альфа-Т 1, дефицитный по гену araD, гену ulaF и гену sgbE, для использования в системе селекции, не содержащей антибиотиков, для получения рекомбинантных продуктов. 24. Штамм E.coli AG1, дефицитный по гену araD и гену ulaF, для использования в системе селекции, не содержащей антибиотиков, для получения рекомбинантных продуктов. 25. Штамм E.coli AG1, дефицитный по гену araD и гену sgbE, для использования в системе селекции, не содержащей антибиотиков, для получения рекомбинантных продуктов. 26. Штамм E.coli AG1, дефицитный по гену araD, гену ulaF и гену sgbE, для использования в системе селекции, не содержащей антибиотиков, для получения рекомбинантных продуктов. 27. Штамм E.coli JM109, дефицитный по гену araD и гену ulaF, для использования в системе селекции, не содержащей антибиотиков, для получения рекомбинантных продуктов. 28. Штамм E.coli JM109, дефицитный по гену araD и гену sgbE, для использования в системе селекции, не содержащей антибиотиков, для получения рекомбинантных продуктов. 29. Штамм E.coli JM109, дефицитный по гену araD, гену ulaF и гену sgbE, для использования в системе селекции, не содержащей антибиотиков, для получения рекомбинантных продуктов. 30. Применение штамма E.coli DH5-альфа-Т 1, дефицитного по гену araD и гену ulaF, в системе селекции по любому из пп.1-4. 31. Применение штамма E.coli DH5-альфа-Т 1, дефицитного по гену araD и гену sgbE, в системе се- 25011823 лекции по любому из пп.1-4. 32. Применение штамма E.coli DH5-альфа-Т 1, дефицитного по гену araD, гену ulaF и гену sgbE, в системе селекции по любому из пп.1-4. 33. Применение штамма E.coli AG1, дефицитного по гену araD и гену ulaF, в системе селекции по любому из пп.1-4. 34. Применение штамма E.coli AG1, дефицитного по гену araD и гену sgbE, в системе селекции по любому из пп.1-4. 35. Применение штамма E.coli AG1, дефицитного по гену araD, гену ulaF и гену sgbE, в системе селекции по любому из пп.1-4 . 36. Применение штамма E.coli JM109, дефицитного по гену araD и гену ulaF, в системе селекции по любому из пп.1-4. 37. Применение штамма E.coli JM109, дефицитного по гену araD и гену sgbE, в системе селекции по любому из пп.1-4. 38. Применение штамма E.coli JM109, дефицитного по гену araD, гену ulaF и гену sgbE, в системе селекции по любому из пп.1-4. 39. Способ селекции бактериальных клеток, трансформированных вектором, несущим ген araD, кодирующий активную L-рибулозо-5-фосфат-4-эпимеразу (ЕС 5.1.3.4.) в качестве маркера селекции, и интересующий ген, причем данный способ включает встраивание указанного вектора в клетку хозяина,дефицитную по гену araD, кодирующему L-рибулозо-5-фосфат-4-эпимеразу, и выращивание полученных клеток в среде роста, содержащей арабинозу. 40. Способ по п.39, в котором ген araD мутирован. 41. Способ по п.40, в котором мутация вводит стоп-кодон в положение 8 гена araD.