Способ модуляции развития и функций т-клеток – хелперов

011686 Область техники, к которой относится изобретение Изобретение касается модуляторов активности интерлейкина IL-21, например человеческого IL-21,и их использования в модуляции развития и функции Т-лимфоцитов, например Т-клеток-хелперов (Тх). Уровень техники Субпопуляции Т-хелперов (Тх) отличаются своей способностью продуцировать особый набор цитокинов и запускать специфический иммунный ответ. Клетки Тх 1 продуцируют -интерферон и запускают опосредованный клетками иммунитет к внутриклеточным патогенам. В отличие от них клетки Тх 2 продуцируют цитокины интерлейкины IL-4, IL-5 и IL-13, активируют тучные клетки и эозинофилы и направляют В-клетки против внеклеточных патогенов. Нарушение регуляции ответов Тх может привести к иммунопатологии, при которой аберрантный ответ Тх 1 может быть причиной органо-специфической аутоиммунной реакции, а избыточный ответ Тх 2 может быть связан с аллергическими заболеваниями. Специфические цитокины, продуцируемые поляризованными клетками Тх, - это первичные эффекторы, которые запускают дифференцировку клеток-предшественников Тх, однако эти клетки также регулируют другие типы функциональной активности. Например, сообщается, что интерлейкин IL-4 является мощным фактором, осуществляющим промоцию дифференцировки клеток-предшественников Тх в Тх 2 эффекторы. Кроме того, IL-4 является антагонистом продукции -интерферона. Интерлейкин IL-10, другой цитокин, продуцируемый клетками Тх 2, как известно, ингибирует развитие клеток Тх 1 и индуцируемую -интерфероном функцию макрофагов. Напротив, -интерферон, продуцируемый Тх 1-клетками,усиливает развитие Тх 1 и ингибирует рост клеток Тх 2. Способность этих цитокинов осуществлять промоцию развития специфических субпопуляций Тх-клеток при одновременном ингибировании их альтернативных вариантов приводит к развитию прогрессивно поляризованного ответа. Сущность изобретения Изобретение частично основано на открытии, что цитокин интерлейкин-21 (IL-21) экспрессируется субпопуляцией клеток Т-хелперов (Тх) - Тх 2 и селективно ингибирует уровень -интерферона (ИФН) в ходе развития клеток Тх 1. Более конкретно, показано, что интерлейкин IL-21 предпочтительно экспрессируется клетками Тх 2, развивающимися in vitro и in vivo. В одном из вариантов реализации воздействиеIL-21 на развивающиеся клетки Тх специфически снижает уровень ИФН из развивающихся клеток Тх 1 и, таким образом, потенцирует ответ клеток Тх 2. Кроме того, воздействие IL-21 на развивающиеся клетки Тх уменьшает передачу сигнала через Stat4, например, путем снижения экспрессии белка Stat4 и/или соответствующей мРНК, что модулирует реактивность клеток Тх на другие цитокины, например, IL-12. Таким образом, выявлены способы и препараты для модуляции развития и активности клеток Тх. Способы и препараты, например, агонисты и антагонисты IL-21, описанные в данном изобретении, пригодны для терапии (т.е. излечения, улучшения состояния, замедления или предупреждения возникновения или предупреждения возобновления течения или рецидивов) или предупреждения заболеваний или состояний, связанных с Тх-клетками и/или -интерфероном, таких как заболевания, связанные с Тх 2-клетками,например астмы и аллергии, и заболеваний, связанных с компонентами антител (например, ревматоидный артрит, рассеянный склероз и волчанка); и заболеваний, связанных с Тх 1-клетками, например аутоиммунных заболеваний (например, рассеянный склероз, ревматоидный артрит, диабет первого типа, болезнь Крона, псориаз, бульбоспинальный паралич и др.). С одной стороны, в изобретении описан способ ингибирования, например, снижения уровня или устранения -интерферона (ИФН) в Тх-клетке или клеточной популяции. Способ обеспечивает, например, ингибирование активности -интерферона, его экспрессии, секреции или процессинга в Тх-клетках,например, в предшественниках Тх-клеток (клетках Тхп) или в клетках Тх 1 (например, в дифференцирующихся клетках Тх 1 или эффекторных клетках Тх), или в дочерней популяции Т-клеток. Способ включает в себя обеспечение контакта Т-клетки или клеточной популяции с агонистом цитокина IL-21 в количествах, достаточных для ингибирования ИФН (т.е. снижения уровня или устранения) в Т-клетке или клеточной популяции, причем агонистом является полипептид IL-21, аминокислотная последовательность которого по меньшей мере на 85% идентична последовательности SEQ ID NO:2 и который способен связываться с рецептором IL-21 (IL-21R). В некоторых вариантах реализации способ также включает в себя идентификацию Т-клетки или клеточной популяции, в которой требуется ингибирование уровня ИФН. С другой стороны, в изобретении описан способ запуска дифференцировки Тх-клетокпредшественников (Тхп) или клеточной популяции в Тх 2-клетку или клеточную популяцию. В одном из вариантов реализации способ включает в себя обеспечение контакта клетки Тхп или такой клеточной популяции с агонистом IL-21 в количестве, достаточном для того, чтобы индуцировать дифференцировку клетки Тхп или такой клеточной популяции в клетку Тх 2 или соответствующую клеточную популяцию, при этом агонист представляет собой полипептид IL-21, аминокислотная последовательность которого по меньшей мере на 85% идентична последовательности SEQ ID NO:2 и который способен связываться с IL-21R. В некоторых вариантах реализации способ включает в себя идентификацию клетки Тхп или соответствующей клеточной популяции, в которой необходимо получить дифференцировку в клетки Тх 2.-1 011686 Еще один аспект состоит в том, что изобретение связано со способом ингибирования клетки Тхп или такой клеточной популяции. Способ включает в себя обеспечение контакта клетки Тхп или такой клеточной популяции с агонистом IL-21 в количестве, достаточном для того, чтобы индуцировать дифференцировку клетки Тхп или такой клеточной популяции в клетку Тх 2 или соответствующую клеточную популяцию, при этом агонист представляет собой полипептид IL-21, аминокислотная последовательность которого по меньшей мере на 85% идентична последовательности SEQ ID NO:2 и который способен связываться с IL-21R. В одном из вариантов реализации способ также включает в себя идентификацию популяции Т-клеток, в которой необходимо вызвать дифференцировку клетки Тхп или соответствующую клеточной популяции в клетку Тх 1 или такую клеточную популяцию. В некоторых вариантах реализации этого способа полипептид включает в себя аминокислотную последовательность SEQ ID NO:2. В некоторых вариантах реализации этого способа стадия контактирования с агонистом выполнялась ex vivo, in vitro или in vivo. Подходящим субъектом для реализации способов ex vivo или in vivo является млекопитающее, в частности человек. Далее, в изобретении описан способ ингибирования дифференцировки Тх-клетки-предшественника или соответствующей популяции клеток в Тх 2-клетку или такую клеточную популяцию. Способ включает в себя контакт клетки Тхп или такой клеточной популяции с антагонистом интерлейкина-21 (IL21)/рецептора IL-21 (IL-21R), в количествах, достаточных для того, чтобы ингибировать дифференцировку клетки Тхп или такой клеточной популяции в клеточную популяцию Тх 2, а антагонист выбран из группы, включающей в себя антитела против IL-21R, антигенсвязывающий фрагмент антител против IL21R и растворимый фрагмент IL-21R. Способ, кроме того, включает в себя также идентификацию Тклеток и их популяций, в которых требуется вызвать ингибирование дифференцировки клеток Тхп или их популяций в клетки или популяции клеток Тх 2. В одном из вариантов реализации популяция Т-клеток включает в себя по меньшей мере одну клетку Тх 1. В некоторых вариантах реализации растворимый фрагмент IL-21R включает в себя внеклеточный участок рецептора IL-21 (IL-21R). Например, растворимый фрагмент, который способен связывать IL-21 и может включать в себя аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 85% идентичную последовательности аминокислот с 20-й по 235-ю в SEQ ID NO:4; альтернативный вариант реализации это растворимый фрагмент, содержащий аминокислоты с 1-й по 235-ю из последовательности SEQ IDNO:4. В соответствующих вариантах реализации растворимый фрагмент также содержит Fc-фрагмент. Еще в одном варианте реализации антагонист представляет собой антитела против IL-21R или антигенсвязывающий фрагмент антител против IL-21R. Еще в одном варианте реализации стадия контактирования с антагонистом выполняется ex vivo, in vitro или in vivo. Процесс контакта может выполняться в [организме] млекопитающего, в частности человека. Еще один аспект изобретения состоит в описании способа повышения уровня -интерферона(ИФН) в Т-клетке или популяции таких клеток. Способ в одном из вариантов реализации включает в себя контакт Т-клетки или популяции таких клеток с антагонистом IL-21/IL-21R, в количестве, достаточном для повышения уровня ИФН в Т-клетке или популяции таких клеток, причем антагонист выбран из группы, в которую входят антитела против IL-21R, антигенсвязывающий фрагмент антитела против IL21R и растворимый фрагмент IL-21R. Вариант реализации этого способа также включает в себя идентификацию популяции Т-клеток, в которой необходимо повысить уровень ИФН. В некоторых вариантах реализации растворимый фрагмент IL-21R включает в себя внеклеточный участок рецептора IL-21. Например, в некоторых вариантах реализации растворимый фрагмент включает в себя аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 85% идентичную аминокислотам с 20-й по 235-ю из последовательности SEQ ID NO:4 и способен связывать IL-21; в другом варианте реализации растворимый фрагмент включает в себя аминокислоты с 1-й по 235-ю из последовательностиSEQ ID NO:4. В других вариантах реализации растворимый фрагмент также включает в себя Fcфрагмент. Еще в одном варианте реализации антагонистом могут служить антитела против IL-21R или антигенсвязывающий фрагмент антител против IL-21R. Еще в одном варианте реализации стадия контактирования с антагонистом выполнялась ex vivo, invitro или in vivo. В некоторых вариантах реализации стадия контактирования выполняется в [организме] млекопитающего, например человека. Все технические и научные термины, использованные в данном документе, имеют те же значения,которые обычно вкладываются в них специалистами, работающими в данной отрасли знания, если значения не определены иначе специально. Хотя в практике или при тестировании данного изобретения могут использоваться способы и материалы, сходные или эквивалентные с описанными в этом документе, адекватные материалы и способы описаны ниже. Все публикации, заявки на патенты, патенты и иные ссылки, указанные в данном документе, включены во всей их полноте. В случае конфликта будет иметь силу данный перечень, включая дефиниции. Кроме того, материалы, способы и примеры являются исключительно иллюстративными и неограничительными. Другие особенности и преимущества изобретения будут ясны из нижеследующих подробного описания и формулы изобретения.-2 011686 Краткое описание чертежей На фиг. 1 А представлена картина нозерн-блот-гибридизации при изучении экспрессии IL-21, IL-4,ИФН и -актина под действием различных факторов направленной дифференцировки, описанных в прилагаемых примерах. Фиг. 1 В - гистограмма, показывающая уровень мРНК IL-21 по отношению к мРНК GAPDH (глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа) в клетках Тх 1 и Тх 2 после первичной и вторичной стимуляции. Фиг. 1 С - гистограмма, показывающая уровень мРНК IL-21 по отношению к мРНК GAPDH в первичных и вторичных клетках Тх 1 и Ех 2, культивируемых в присутствии или в отсутствие IL-4 и ИФН. Фиг. 1D - гистограмма, показывающая уровень мРНК IL-21, мРНК IL-4 и мРНК ИФН относительно мРНК GAPDH у мышей c57BL/g и BALB/c после инфекции Leishmania major. Фиг. 2 А - графическое представление продукции цитокинов IL-4 и IL-21 клетками Тхп, культивируемыми в нейтральных условиях, или клетками Тх 1 в условиях направленной дифференцировки. Фиг. 2 В - гистограмма, показывающая продукцию ИФН в клетках Тхп, обработанных IL-21 или ложно обработанных. Фиг. 3A - графическое представление продукции IL-4 и ИФН клетками Тхп, культивируемыми в условиях направленной дифференцировки в Тх 1 в присутствии или в отсутствие IL-22. Фиг. 3B - графическое представление продукции обработанных IL-4 и ИФН или ложно обработанных клеток Тхп в условиях направленной дифференцировки в Тх 1 на мышах дикого типа и линии Stat6-/-. Фиг. 3C - графическое представление экспрессии ИФН, IL-2 и TNF (фактор некроза опухоли ) в обработанных IL-21 или ложно обработанных Тх 1-клетках мышей дикого типа и мышей линии Stat6-/-. Фиг. 4 А - анализ вестерн-блоттинга уровней белка T-bet и актина в клетках Тхп, культивированных в условиях направленной дифференцировки в Тх 1 или Тх 2. Фиг. 4 В - гистограмма, показывающая относительные уровни мРНК IL-12R2 по отношению к уровням в клетках Тх 1. Фиг. 4 С представляет собой картину вестерн-блоттинга уровней полипептидов фосфорилированного Stat4, Stat4, Stat1 и IL-12 в клетках Тхп, стимулированных антителами против CD-3 в присутствии IL21 или пустых супернатантов. Фиг. 4D - гистограмма, на которой показан уровень мРНК Stat4, относительно мРНК GAPDH в ложно обработанных и обработанных IL-21 клетках Тхп, стимулированных антителами против CD3 в течение 48 ч в присутствии IL-21 или пустых супернатантов. IL-4 и ИФН. Фиг. 5 А - график, на котором показано специфическое опухание у мышей дикого типа и линииcrenulata (Keyhole Limpet и инъецированных затем TNP-KLH или фосфатным буфером. Фиг. 5 В - гистограмма, на которой показано продуцирование ИФН в CD4+ Т-клетках, выделенных из дренированных лимфатических узлов иммунизированных TNP-KLH мышей дикого типа и IL21-21R-/мышей, рестимулированных антигеном. Подробное описание изобретения Изобретение представляет собой способы и композиции для модуляции дифференцировки клеток Т-хелперов, их развития и активности путем модуляции взаимодействия между IL-21 и рецептором к IL21. IL-21 или агент, повышающий уровни IL-21 или рецепторов к IL-21 в клеточной популяции, вносятся в популяцию клеток Т-хелперов, чтобы снизить уровень ИФН в популяции клеток Тхп или Тх 1. IL-21 или агент, повышающий уровень IL-21, могут быть использованы для промоции развития клеток Тх 2 или потенциирования опосредованного клетками Тх 2 иммунного ответа и/или подавления развития клеток Тх 1.IL-21 или агент, повышающий уровень IL-21, могут также использоваться для ингибирования эффектов IL-21 на популяцию клеток Т-хелперов. IL-21 или агенты, повышающие уровень IL-21 или иначе действующие как агонисты IL-21, могут использоваться для подавления опосредованных Тх 1 заболеваний, таких как аутоиммунные заболевания, рассеянный склероз, ревматоидный артрит и диабет I типа. В одном из аспектов изобретения описан способ модуляции, например, повышения или уменьшения или ингибирования активности или уровня -интерферона (ИФН) в клетках, например, в Т-клетке или в клеточной популяции, например, популяции Т-клеток. Например, это способ модуляции одного или более показателей: активности ИФН, экспрессии, секреции или процессинга в Т-клетках, например,клетках-предшественниках Т-клеток (клеток Тхп) или клетках Тх 1 (например, дифференцирующихся клетках Тх 1 или в эффекторных клетках Тх) или в образующихся популяциях Т-клеток. Способ включает в себя (необязательно) идентификацию клетки, например, Т-клетки или клеточной популяции, в которой требуется достичь модуляции (например, повышения или понижения) активности или уровня ИФН; и обеспечение контакта указанных клеток или клеточной популяции с количествами модулятора IL-21,например, агониста или антагониста IL-21, достаточными, чтобы модулировать (например, повышать или понижать) активность или уровень ИФН в указанных клетках или клеточной популяции. Рассматриваемый способ может быть использован на культуре клеток, например, in vitro или exvivo. Например, иммунные клетки, например Т-клетки, описанные в данном изобретении, могут культи-3 011686 вироваться in vitro в культуральной среде, и стадия контакта с модулятором выполняться добавлением одного или более модуляторов IL-21 (например, агониста или антагониста IL-21) в культуральную среду. Одновременно способ может применяться на клетках (например, иммунных или Т-клетках, как описано в данном изобретении) целого организма, например, in vivo (как терапевтический или профилактический протокол). В одном из вариантов реализации предлагается способ снижения или ингибирования активности или уровня ИФН в клетке, например, Т-клетке (например, предшественнике Т-клеток (клетке Тхп или в клетке Тх 1 (например, дифференцирующейся клетке Тх 1 или эффекторной клетке Тх) или их клеточных популяциях. Способ включает в себя (необязательно) идентификацию клетки, например, Т-клетки или клеточной популяции, например, популяции Т-клеток, в которой требуется уменьшить или ингибировать активность или уровень ИФН; а также обеспечение контакта указанных клеток или клеточной популяции с такими количествами агониста IL-21, которых достаточно для уменьшения или ингибирования активности или уровня ИФН в указанной клетке или клеточной популяции. Предпочтительно агонист IL-21 специфически ингибирует уровень ИФН, например, не уменьшает и не ингибирует активность или уровень других цитокинов, таких как IL-2 или TNF. В одном из вариантов реализации агонист IL-21 ингибирует продукцию ИФН ИФН-продуцирующей клеткой, например ИФНпродуцирующей клеткой Тх 1. В другом варианте реализации изобретение представляет способ уменьшения уровня ИФН или его активности у субъекта. Способ включает в себя (необязательно) идентификацию субъекта, у которого нужно достичь уменьшения уровня или активности ИФН, и введение указанному субъекту таких количеств агониста IL-21, которые достаточны для уменьшения уровня или активности ИФН. ИФН может быть определен с использованием методик, известных в данной отрасли, например, внутриклеточного окрашивания цитокинов или с помощью методики ELISA (иммунодерментный анализ) для определения уровня вещества в супернатантах клеток. Агонист IL-21 может представлять собой IL-21-полипептид, человеческий IL-21-полипептид или его активных фрагмент (например, человеческий IL-21-полипептид, включающий в себя аминокислотную последовательность, показанную как SEQ ID NO:2 или кодируемую нуклеотидной последовательностью, указанной, как SEQ ID NO:1, или последовательностью, существенно гомологичной указанным). В другом варианте реализации агонист IL-21 представляется собой белок, включающий полипептид IL21, например, человеческий полипептид IL-21, или его фрагмент, связанный с другим полипептидом,например, полипептидом иммуноглобулина или его частью (например, Fc-участком полипептида иммуноглобулина); либо агонист IL-21 представляется собой антитело-агонист рецептора IL-21 либо низкомолекулярный агонист. В других вариантах реализации агонист IL-21 представляет собой агент, повышающий активность или уровень IL-21 путем, например, повышения экспрессии, процессинга и/или секреции функционального IL-21. Преимущественно субъектом являются млекопитающие, например человек, страдающий нарушениями, связанными с изменениями, например, повышением, уровня или активности ИФН, например,иммунными заболеваниями (например, заболеваниями, опосредованными Т-клетками), а агонист вносится в количествах, достаточных, чтобы ослабить или предупредить указанное заболевание. Типичные иммунные расстройства, при которых применение агонистов IL-21 может давать терапевтический эффект (например, улучшать состояние) или предупреждать их, включают в себя, например,заболевания, связанные с клетками Тх 1, такие как аутоиммунные заболевания, включая, но не ограничиваясь ими, рассеянный склероз, ревматоидный артрит, диабет I типа, воспалительная болезнь кишечника(IBD), псориаз и бульбоспинальный паралич (myasthenia gravis). В изобретении дополнительно описан способ повышения уровня или активности ИФН в клетке,например, Т-клетке, или в клеточной популяции, например, популяции Т-клеток. Например, изобретение включает в себя способ повышения активности ИФН, его экспрессии, секреции или процессинга в Тклетках, например, в клетке-предшественнике Т-клетки (клетки Тхп) или в клетке Тх 1 (например, в дифференцирующейся клетке Тх 1 или в эффекторной клетке Тх), или в таких клеточных популяциях. Способ включает в себя (необязательно) идентификацию клетки, например, Т-клетки, или клеточной популяции, например, популяции Т-клеток, в которых необходимо добиться повышения экспрессии ИФН; обеспечение контакта указанных клеток с антагонистом IL-21 в количествах, достаточных для ингибирования связывания или активности IL-21, например, ингибирования связывания IL-21 с рецептором IL-21,тем самым повышая уровень экспрессии ИФН в указанной клетке. Антагонистом IL-21 может быть, например, антитело (например, моноклональное антитело, или антитело единственной специфичности) к IL-21, например, человеческому IL-21, или к рецептору IL-21,например, человеческому полипептиду рецептора IL-21. Преимущественно антитела являются человеческими, гуманизированными, химерными или полученными in vitro против человеческого IL-21 или человеческого полипептида IL-21-рецептора. В других вариантах реализации антагонист включает в себя фрагмент полипептида IL-21, например, связывающий домен полипептида рецептора IL-21. В другом варианте антагонист включает в себя фрагмент полипептида рецептора IL-21, например, связывающий-4 011686 домен IL-21 или полипептида рецептора IL-21. В одном из вариантов реализации антагонист представляется собой белок, включающий в себя вышеуказанный IL-21 или полипептид рецептора IL-21, или их фрагменты, соединенные со вторым остатком, например, полипептидом (например, цепью иммуноглобулина). Другим аспектом изобретения является описание способа модуляции, например, повышения или снижения, активности клеток Тх 2 и/или их числа. Один из вариантов реализации представляет собой способ модуляции, например, промоции или ингибирования, одного или нескольких процессов: пролиферации, выживания и/или дифференцировки (например, дифференцировки предшественников Т-клеток,например, предшественников клеток Тх) в клетки Тх 2. Способ включает в себя (необязательно) идентификацию клеток, например, Т-клетки (например, клетки Тхп или клетки Тх 2) или клеточной популяции,в которой требуется добиться модуляции пролиферации, выживания и/или дифференцировки; и обеспечение контакта указанной клетки или клеточной популяции с модулятором IL-21, например, агонистом или антагонистом IL-21, в количествах, достаточных для модуляции одного или нескольких процессов: пролиферации, выживания и/или дифференцировки (например, модуляции дифференцировки указанной клетки Тхп в клетку Тх 2) в клетку Тх 2, таким образом модулируя активность и/или число клеток Тх 2. Предлагаемый способ может использоваться на клетках в культуре, например, in vitro или ex vivo. Например, иммунные клетки, например, Т-клетки, описанные в данном изобретении, могут культивироваться in vitro в культуральной среде, и стадия контакта может реализовываться добавлением одного или более модуляторов IL-21 (например, одного или более агонистов или антагонистов IL-21) в культуральную среду. В другом варианте способ может реализовываться на клетках (например, иммунных или Тклетках, как описано в данном изобретении) пациента, например, как часть протокола in vivo (терапевтического или профилактического). В одном из вариантов реализации с помощью предлагаемого способа уменьшается или ингибируется активность клеток Тх 2 и/или число этих клеток. Например, активность клетки Тх 2 и/или число этих клеток могут быть уменьшены или ингибированы путем ингибирования или уменьшения одного или нескольких процессов: пролиферации, выживания и/или дифференцировки (например, дифференцировки предшественников Т-клетки, например, предшественников Тх (Тхп в клетки Тх 2. Способ включает в себя (необязательно) идентификацию клетки, например, Т-клетки (например, Тхп или клетки Тх 2), или клеточной популяции, в которой требуется добиться ингибирования пролиферации, выживания и/или дифференцировки; и обеспечение контакта указанной клетки или клеточной популяции с антагонистомIL-21 в количествах, достаточных для ингибирования или уменьшения одного или более процессов пролиферации, выживания и/или дифференцировки (например, ингибирования или уменьшения дифференцировки указанной клетки Тхп в клетку Тх 2), таким образом ингибируя или уменьшая активность и/или число клеток Тх 2. Рассматриваемый способ может использоваться на клетках, например, Т-клетках (например, клетках Тхп или Тх 2) в культуре, например, in vitro или ex vivo. В другом варианте способ может применяться на клетках (например, иммунных или Т-клетках, как описано в данном изобретении), присутствующих в организме пациента, например, как часть протоколаin vivo (терапевтического или профилактического). Например, способ может использоваться для лечения или предупреждения заболеваний, опосредованных клетками Тх 2, например, астмы или аллергии. Соответственно, изобретение представляет собой способ лечения (например, излечения, подавления, облегчения, задержки развития или предупреждения возникновения или рецидива) или предупреждения у пациента заболеваний, связанных с клетками Тх 2. Способ включает в себя введение пациенту антагониста IL21 в количествах, достаточных для ингибирования или уменьшения активности и/или числа клеток Тх 2,таким образом излечивая или предупреждая связанные с клетками Тх 2 заболевания. Преимущественно субъектом применения способа являются млекопитающие, например человек,страдающий заболеваниями, связанными с нарушениями числа клеток Тх 2 или их активности, например,иммунными заболеваниями (например, заболеваниями, связанными с клетками Тх 2). Количество агента,достаточное для ингибирования или уменьшения активности клеток и/или их числа, - это количество,достаточное для ослабления или предупреждения указанного заболевания. Антагонист IL-21 может быть, например, антителом (например, моноклональным или моноспецифичным антителом) к IL-21, например, IL-21 человека или к рецептору IL-21, например, полипептиду рецептора IL-21 человека. В другом варианте реализации антагонист включает в себя фрагмент полипептида IL-21, например, домен, связывающийся с полипептидом рецептора IL-21. В другом варианте, антагонист включает в себя фрагмент полипептида рецептора IL-21, например, домен, связывающий IL-21,или полипептида рецептора IL-21. В одном из вариантов реализации антагонист представляет собой белок, содержащий вышеуказанный IL-21 или полипептид рецептора IL-21 или их фрагменты, соединенные со вторым фрагментом, например, полипептидом (например, цепью иммуноглобулина). Еще в одном варианте реализации предоставляется способ повышения активности клеток Тх 2 и/или числа этих клеток. Например, активность клеток Тх 2 и/или число этих клеток могут быть увеличены путем повышения одного или более процессов пролиферации, выживания и/или дифференцировки (например, дифференцировки предшественника Т-клетки, например, предшественника Тх (Тхп в клетку Тх 2.-5 011686 Способ включает в себя (необязательно) идентификацию клетки, например Т-клетки (например, клетки Тхп или клетки Тх 2), или популяции клеток, в которых требуется добиться усиления пролиферации, выживания и/или дифференцировки; контакт указанной клетки или клеточной популяции с агонистом IL-21 в количествах, достаточных для усиления одного или более из следующих процессов: пролиферации,выживания и/или дифференцировки (например, усиления дифференцировки указанных клеток Тхп в клетки Тх 2) в клетки Тх 2, повышая, таким образом активность клеток Тх 2 и/или увеличивая их число. Агонист IL-21 может представлять собой полипептид IL-21, например, полипептид IL-21 человека,или его активный фрагмент (например, полипептид IL-21 человека, содержащий аминокислотную последовательность, показанную как SEQ ID NO:2, или кодируемую нуклеотидной последовательностью, показанной как SEQ ID NO:1, или последовательностью, существенно гомологичной указанной). В другом варианте реализации агонист IL-21 может представлять собой белок, образуемый полипептидом IL-21,например, полипептидом IL-21 человека, или его фрагментом, соединенным с другим полипептидом,например, полипептидом иммуноглобулина или его частью (например, Fc-участком полипептида иммуноглобулина); агонистическое антитело к рецептору IL-21 или низкомолекулярный агонист. Еще один аспект изобретения предоставляет способ модуляции, например, повышения или понижения числа и/или активности клеток Тх 1. В одном из вариантов реализации предоставляется способ модуляции, например, промоции или ингибирования одного или нескольких из процессов пролиферации, выживания и/или дифференцировки (например, дифференцировки предшественника Т-клетки, например, предшественника клетки Тх (Тхп в клетку Тх 1. Способ включает в себя (необязательно) идентификацию клетки, например, Т-клетки (например, клетки Тхп или Тх 1), или клеточной популяции, в которой требуется добиться модуляции пролиферации, выживания и/или дифференцировки; и контакт указанной клетки или клеточной популяции с модулятором IL-21, например, агонистом или антагонистом, в количествах, достаточных, чтобы модулировать один или более из процессов пролиферации, выживания и/или дифференцировки (например, модуляции дифференцировки указанной клетки Тхп в клетку Тх 1) в клетку Тх 1, таким образом модулируя активность клетки Тх 1 и/или число таких клеток. Предлагаемый способ может быть использован на клетках в культуре, например, in vitro или exvivo. Например, иммунные клетки, например, Т-клетки, как описано в данном изобретении, могут культивироваться in vitro в культуральной среде, и стадия контакта может выполняться добавлением одного или более модуляторов IL-21 (например, агониста IL-21 или его антагониста) в культуральную среду. В то же время способ может применяться на клетках (например, иммунных или Т-клетках, как описано в данном изобретении), присутствующих в организме, например, как часть протокола in vivo (например,терапевтического или профилактического). В одном из вариантов реализации предлагается способ уменьшения или ингибирования активности и/или числа клеток Тх 1. Например, активность клетки Тх 1 и/или число таких клеток могут быть уменьшены или ингибированы путем ингибирования или снижения одного из процессов: пролиферации, выживания и (или) дифференцировки в клетки Тх 1 (например, дифференцировки предшественника Тклетки, например, предшественника Тх (Тхп. Способ включает в себя (необязательно) идентификацию клетки, например, предшественника Т-клетки (например, Тхп, клетки, продуцирующей ИФН, например,клетки Тх 1), или клеточной популяции, в которой необходимо добиться ингибирования пролиферации,выживания и/или дифференцировки; и контакт указанной клетки или клеточной популяции с агонистомIL-21, в количествах, достаточных для ингибирования или уменьшения одного или более процессов: пролиферации, выживания и/или дифференцировки в клетку Тх 1 (например, ингибирование или уменьшение дифференцировки указанных клеток Тхп в клетки Тх 1), таким образом ингибируя или уменьшая активность клеток Тх 1 и/или число таких клеток. Предлагаемый способ может использоваться на клетках, таких как Т-клетки (например, Тхп или клетки Тх 2), в культуре, например, in vitro или ex vivo. Другой вариант состоит в том, что способ может применяться на клетках (например, иммунных клетках или Т-клетках, описанных в данном изобретении), присутствующих в организме, например, как часть протокола in vivo (например, терапевтического или профилактического). Например, способ может быть использован для лечения или предупреждения у пациентов заболеваний, опосредованных клетками Тх 1, например, аутоиммунных заболеваний (например, среди прочих, рассеянного склероза, ревматоидного артрита, диабета I типа, болезни Крона, псориаза и бульбоспинального паралича). Соответственно,изобретение предоставляет способ лечения (например, излечения, подавления, ослабления, замедления или предупреждения возникновения, предупреждения возврата болезни или рецидива) или предупреждения заболевания, связанного с клетками Тх 1 у пациентов. Способ включает в себя введение пациенту агониста IL-21 в количествах, достаточных для ингибирования или уменьшения активности и/или числа клеток Тх 1, таким образом излечивая или предупреждая заболевания, связанные с клетками Тх 1. Преимущественно субъектом воздействия являются млекопитающие, например человек, страдающий заболеванием, связанным с нарушением количества или активности клеток Тх 1, например, иммунным заболеванием (например, заболеванием, связанным с клетками Тх 1, как описано в данном изобретении). Количество, достаточное для ингибирования или уменьшения активности и/или числа клеток Тх 1, это количество, достаточное для ослабления или предупреждения указанного заболевания.-6 011686 Агонистом IL-21 может служить полипептид IL-21, например, полипептид IL-21 человека или его активный фрагмент (например, полипептид IL-21 человека, содержащий аминокислотную последовательность, показанную как SEQ ID NO:2 или кодируемую нуклеотидной последовательностью, показанной как SEQ ID NO:1, или последовательностью, существенно гомологичной указанной). В других вариантах реализации агонист IL-21 представляет собой белок, включающий в себя полипептид IL-21, например, полипептид IL-21 человека, или его фрагмент, соединенный с другим полипептидом, например,полипептидом иммуноглобулина или его частью (например, Fc-участком полипептида иммуноглобулина); агонистическое антитело или низкомолекулярный агонист. В других вариантах реализации агонистIL-21 представляет собой агент, повышающий активность или уровень IL-21 путем, например, усиления экспрессии, процессинга и/или секреции функционального IL-21. Еще в одном варианте реализации предоставляется способ повышения активности клеток Тх 1 и/или числа этих клеток. Например, активность клеток Тх 1 и/или их число могут быть увеличены путем усиления одного из процессов пролиферации, выживания и/или дифференцировки в клетки Тх 1 (например, дифференцировки предшественника Т-клеток, например, предшественника Тх (Тхп. Способ включает в себя (необязательно) идентификацию клетки, например, Т-клетки (например, Тхп или клетки Тх 1) или их клеточной популяции, в которой требуется добиться повышения пролиферации, выживания и/или дифференцировки; и обеспечение контакта указанной клетки или клеточной популяции таких клеток с антагонистом IL21 в количествах, достаточных для усиления одного или более из процессов пролиферации, выживания и/или дифференцировки в клетки Тх 1 (например, усиления дифференцировки указанной клетки Тхп в клетку Тх 1), что повышает активность и/или число клеток Тх 1. Антагонистом IL-21 может служить, например, антитело (например, моноклональное или моноспецифическое антитело) к IL-21 или к рецептору IL-21, например, полипептиду рецептора IL-21 человека. Преимущественно антитела являются человеческими, гуманизированными, химерными или генерированными in vitro к IL-21 человека или полипептиду рецептора IL-21 человека. В других вариантах реализации антагонист включает в себя фрагмент полипептида IL-21, например, домен полипептида IL-21,связывающийся с рецептором к IL-21. В качестве альтернативы антагонист может включать в себя фрагмент полипептида рецептора IL-21, например, домен полипептида рецептора IL-21, связывающий IL-21. В одном из вариантов реализации антагонист представляет собой белок, включающий в себя вышеуказанный IL-21 или полипептид рецептора IL-21 или их фрагменты, соединенные со вторым фрагментом,например, полипептидом (например, цепью иммуноглобулина). Еще один аспект изобретения - это описание способа модуляции, например, уменьшения или ингибирования, активности интерлейкина-12 (IL-12) или его уровня в клетке, клеточной популяции или у пациента. Способ включает в себя (необязательно) идентификацию клетки, например, Т-клетки, клеточной популяции или субъекта, где требуется модуляция IL-12; и обеспечение контакта указанной клетки или клеточной популяции с модулятором IL-12, например, агонистом или антагонистом IL-12, или введение модулятора указанному субъекту, в количествах, достаточных для модуляции активности или уровня IL-12 в указанных клетках, клеточной популяции или у субъекта. В одном из вариантов реализации активность или уровень IL-12 снижаются благодаря контакту указанной клетки или клеточной популяции с агонистом IL-21, например, агонистом IL-21, как описано в данном изобретении, в количествах, достаточных для снижения активности или уровня IL-12. В другом варианте реализации активность или уровень IL-12 повышаются благодаря контакту указанных клетки или клеточной популяции или введению указанному субъекту антагониста IL-21, например, антагониста IL-21, как описано в данном изобретении, в количествах, достаточных для повышения активности или уровня IL-12. Еще один аспект изобретения состоит в описании способа модуляции, например, уменьшения или ингибирования или повышения Stat, например, активности или уровня Stat4 в клетке, клеточной популяции или у субъекта. Способ включает в себя (необязательно) идентификацию клетки, например, Тклетки, клеточной популяции или субъекта, в которых требуется добиться модуляции активности или уровня Stat; и обеспечение контакта указанной клетки или клеточной популяции с модулятором IL-12,например, агониста или антагониста IL-12, или введение модулятора IL-12 указанному субъекту в количестве, достаточном для модулирования активности или уровня Stat в указанной клетке, клеточной популяции или у субъекта. В одном из вариантов реализации активность или уровень Stat уменьшается путем контакта указанной клетки или клеточной популяции с агонистом IL-21, например, агонистом IL-21, как это описано в данном изобретении, или введением субъекту агониста IL-21 в количестве, достаточном для уменьшения активности или уровня Stat, например, белка Stat или его мРНК. В другом варианте реализации активность или уровень Stat повышается путем контакта указанной клетки или клеточной популяции с антагонистом IL-21, например, антагонистом IL-21, как это описано в данном изобретении, или введение его указанному субъекту в количестве, достаточном для повышения активности или уровня Stat, например, белка Stat или мРНК. Еще в одном варианте реализации изобретения описан способ снижения, ингибирования, подавле-7 011686 ния, ослабления или задержки аутоиммунного ответа (например, опосредованного Тх 1 аутоиммунного ответа) у пациента. Метод включает в себя введение пациенту, нуждающемуся в этом, агониста IL-21,например, агониста IL-21, как это описано в данном изобретении, в количестве, достаточном, чтобы уменьшить, ингибировать, подавить, ослабить или замедлить указанный аутоиммунный ответ у указанного пациента. Еще один аспект изобретения состоит в описании способа снижения, ингибирования, подавления,ослабления или замедления ответа, связанного с клетками Тх 2 (например, аллергического или астматического ответов) у пациента. Способ включает в себя введение пациенту, нуждающемуся в этом, антагониста IL-21, например, антагониста IL-21, как это описано в данном изобретении, в количестве, достаточном, чтобы уменьшить, ингибировать, подавить, ослабить или замедлить указанный ответ, связанный с клетками Тх 2, у указанного пациента. Другой аспект изобретения состоит в описании способа селективной идентификации клеток Тх 2 в клеточной популяции, например, популяции клеток Тх, способ включает в себя определение уровня нуклеиновой кислоты IL-21 (например, продукта гена IL-21) или полипептида в тестовом образце, например,клетке Тх, и сравнительном образце, например, клетке Тх 1; и сравнение уровня указанной нуклеиновой кислоты IL-21 в указанном тестовом образце с уровнем указанной нуклеиновой кислоты IL-21 в образце сравнения, например, клетке Тх 1, повышение уровня указанной нуклеиновой кислоты IL-21 в указанном тестовом образце по сравнению с указанным образцом сравнения показывает, что тестовый образец представляет собой клетку Тх 2. Понятие заболевания, связанные с клетками Тх 1, как это понимается в данном изобретении,представляет собой заболевание, связанное с нарушением, например, повышением или снижением активности клеток Тх 1 (например, усиленным или ослабленным ответом клетки Тх 1) или их числом по сравнению с образцом сравнения, например, нормальным контролем. Примеры заболеваний, связанных с клетками Тх 1, включают в себя, в частности, среди прочих, аутоиммунные заболевания (например, рассеянный склероз, ревматоидный артрит, диабет I типа, болезнь Крона, псориаз и бульбоспинальный паралич). Понятие заболевания, связанные с клетками Тх 2, как это понимается в данном изобретении,представляет собой заболевание, связанное с нарушением, например, повышением или снижением активности клеток Тх 2 (например, усиленным или ослабленным ответом клетки Тх 2) или их числом по сравнению с образцом сравнения, например, нормальным контролем. Примеры заболеваний, связанных с клетками Тх 2, включают в себя, например, астму, аллергию и заболевания, связанные с компонентами антител (например, ревматоидный артрит, рассеянный склероз и волчанка). Полипептид IL-21, использованный в способе, описанном в данном изобретении, может включать в себя аминокислотную последовательность, например, полипептид IL-21 млекопитающих (таких как грызуны, человек или нечеловекообразные приматы). Например, полипептид IL-21 может включать в себя аминокислотную последовательность полипептида IL-21 человека. Соответствующая аминокислотная последовательность - это последовательность полипептида IL-21, показанная как SEQ ID NO:2 (см. ниже). Полипептиды IL-21 и рецепторы IL-21, включая нуклеотидные и аминокислотные последовательности, описаны, например, в патенте США (US Patent6057128, Parrish-Novak et al., Nature 408:57-63,2000; Vosshenrich et al., Curr. Biol. 11:R157-77, 2001, Asao et al., J. Immunol. 167:1-5, 2001; и Ozaki et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:11439-44, 2000). Аминокислотная последовательность полипептидов IL-21 опубликована. Например, нуклеотидная и аминокислотная последовательности IL-21 человека доступна в Genbank Acc. No. X011082. Нуклеотидная последовательность IL-21 человека, полученная в данном источнике, представлена ниже. Аминокислотная последовательность, кодируемая последовательностью нуклеиновой кислоты IL21 человека, представлена ниже. Нуклеотидная последовательность нуклеиновой кислоты рецептора IL-21 человека представлена ниже. Выявленная нуклеотидная последовательность рецептора IL-21 кодирует полипептид со следующей аминокислотной последовательностью: Гомология нуклеотидной последовательности может быть определена как степень идентичности между двумя нуклеотидными или аминокислотными последовательностями. Гомология может быть определена с помощью известных компьютерных программ, таких как программное обеспечение GAP программного пакета GCG. См. Needleman and Wunsch 1970, J. Mol. Biol. 48:443-453. При использовании программного обеспечения GCG GAP со следующими установками сравнения нуклеотидных последовательностей: штраф за пропуск 5.0 и штраф за удлинение 0.3 - можно показать, что кодирующие участки указанных выше нуклеотидных последовательностей имеют степень идентичности с CDS (кодирующей) частью ДНК, показанной для SEQ ID NO:1 или SEQ ID NO:3, составляющей по меньшей мере 70, 75, 80,85, 90, 95, 98 и 99%. Аналогичным образом, аминокислотная последовательность, указанная в данном изобретении, имеет по меньшей мере 50, 60, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 98 или 99% степень идентичности по отношению к аминокислотным последовательностям, показанным в SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5 или SEQ-9 011686 Термин идентичность последовательностей относится к степени, с которой две полинуклеотидные или полипептидные последовательности идентичны при сравнении основание за основанием в конкретном участке сравнения. Процент идентичности последовательностей вычисляется путем сравнения двух оптимально совмещенных в области сравнения последовательностей и определения положений, в которых обнаруживаются совпадающие нуклеотидные основания (например, А, Т, С, G, U или I в случае нуклеиновых кислот) в обеих последовательностях, получения общего числа совпадающих положений и путем деления числа совпадающих положений на общее число положений в области сравнения(например, в размере окна) и умножения на 100 для получения значения в процентах идентичности последовательности. Термин существенная идентичность используется в данном изобретении для описания характеристики полинуклеотидной последовательности, в которой полинуклеотид включает в себя последовательность, по меньшей мере на 80% идентичную, предпочтительно по меньшей мере на 85% идентичную, часто - на 90-95%, а наиболее часто - по меньшей мере на 98 или 99% идентичную последовательности сравнения в рассматриваемой области. Величина процента позитивных остатков рассчитывается путем сравнения двух оптимально совмещенных последовательностей в области сравнения, с определением числа положений, в которых идентичные или консервативные замещены аминокислот, как это определено выше, обнаруживаются в обеих последовательностях, составляя число совпадающих положений, делением числа совпадающих положений на общее число положений в области сравнения (например, в размере окна), и умножением на 100, что дает процент позитивных остатков. Агенты, которые повышают уровни IL-21 или рецептора IL-21 в клетке или клеточной популяции,могут дополнительно включать в себя агонисты IL-21 или агонисты рецептора IL-21. Такие агонисты могут быть идентифицированы идентифицирующими тестовыми соединениями, которые вызывают один или более видов активности, которые проявляет IL-21 на популяции клеток Т-хелперов. Субъект может быть млекопитающим, например человеком, иным приматом, собакой, кошкой, коровой, лошадью, свиньей или грызуном (включая крысу или мышь). Может использоваться любой нужный способ введения IL-21. Подходящими способами являются внутривенный (и болюсы, и вливания),внутрибрюшинный, подкожный или внутримышечный, все применяемые способы хорошо известны специалистам в данной области фармацевтической технологии. Инъекции могут быть приготовлены в обычных формах как растворов, так и суспензий. Парентеральное инъекционное введение обычно используется для подкожных, внутримышечных или внутривенных инъекций и вливаний. Антагонисты IL-21. Чтобы ингибировать опосредованный IL-21 эффект клеток Т-хелперов, агент, который блокирует или ингибирует взаимодействие IL-21 с рецептором к IL-21, может быть добавлен Т-клетке или популяции Т-клеток, например клеток Т-хелперов. Для удобства эти ингибиторы обозначены в данном документе как антагонисты IL-21. Примеры IL-21 включают в себя, например, растворимые фрагменты IL21 или рецептора IL-21, гибридные белки, содержащие эти фрагменты, и антитела к этим фрагментам. Антагонисты IL-21 пригодны для блокирования IL-21 в опосредованных Тх 2 заболеваниях, включая заболевания, опосредованные антителами. Эти болезни включают в себя астму, аллергию, ревматоидный артрит, рассеянный склероз и волчанку. Гибридные белки IL-21 и рецептора IL-21.IL-21 или рецептор IL-21, или активные фрагменты этих белков могут быть присоединены к молекулам-переносчикам, таким как иммуноглобулины, для использования способами, описанными в данном документе. Например, растворимые формы рецептора IL-21 могут быть присоединены через линкерные последовательности к участку Fc иммуноглобулина или к Fc-участку иммуноглобулина. Могут использоваться и другие гибридные белки, такие как с GST (т.е. глутатион S-трансферазой), LexA или MBP(т.е. белком, связывающим мальтозу). В другом варианте реализации гибридные белки IL-21 или рецептор IL-21 могут быть присоединены к одному или более дополнительным фрагментам. Например, гибридные белки IL-21 или рецепторIL-21 могут быть дополнительно связаны с гибридным белком GST, в котором последовательность гибридного белка рецептора IL-21 соединена с С-концом последовательности GST. Такие гибридные белки могут облегчать очистку гибридных белков IL-21 или рецептора IL-21. В другом варианте реализации гибридный белок включает в себя гетерологическую сигнальную последовательность (т.е. полипептидную последовательность, которая не представлена в естественном полипептиде, кодируемом нуклеиновыми кислотами IL-21 или рецептора IL-21) на его N-конце. Например,естественная сигнальная последовательность IL-21 или рецептора IL-21 может быть удалена и замещена сигнальной последовательностью другого белка. Химерный или гибридный белок, используемый в данном изобретении, может быть получен путем стандартной рекомбинантной технологии ДНК. Например, фрагменты ДНК, кодирующие различные полипептидные последовательности, сшиты воедино в соответствии со стандартной технологией, например, используя для сшивки "тупые" или смещенные концы двунитевой ДНК, переваривание ферментами рестрикции для получения соответствующих концов, заполнение липких концов адекватным образом, обработку щелочной фосфатазой с целью устранить нежелательное соединение и ферментативную- 10011686 сшивку. В другом варианте реализации с помощью стандартных технологий, включая автоматический синтезатор ДНК, может быть синтезирован гибридный ген. В ином случае может быть выполнена ПЦРамплификация фрагментов гена с помощью якорных праймеров, которая вызывает комплементарное перекрывая между двумя последовательными фрагментами гена, которое затем могут подвергнуться отжигу и реамплификации, с получением химерной последовательности гена (см., например, Ausubel et al.(eds.) Current Protocols in Molecular Biology, John WileySons, 1992). Далее, коммерчески доступны многие векторы экспрессии, кодирующие гибридные участки (например, участок Fc тяжелой цепи иммуноглобулина). Нуклеиновые кислоты, кодирующие IL-21 или рецептор IL-21, могут быть клонированы в таком векторе экспрессии так, что гибридный участок связывается с белком иммуноглобулина. В некоторых вариантах реализации участки IL-21 или рецептора IL-21 представлены как вариант полипептида рецептора IL-21, имеющий мутацию в природной последовательности IL-21 или рецептораIL-21 (дикий тип), что приводит к повышению аффинности (по сравнению с не содержащей мутации последовательностью) связывания измененного IL-21 с рецептором к IL-21 или повышению аффинности(по сравнению с не содержащей мутации последовательностью) измененного полипептида рецептора IL21 с IL-21. В некоторых вариантах реализации полипептид IL-21 или участок полипептида рецептора IL-21 представлены как вариант IL-21 или полипептида рецептора IL-21, имеющих мутацию в природной последовательности IL-21 или рецептора IL-21 (дикий тип), которая приводит к тому, что последовательности IL-21 или рецептора IL-21 более резистентны к протеолизу (по сравнению с немутировавшей последовательностью). Сигнальный пептид, который может быть включен в гибридный белок - это MPLLLLLLLLPSPLHP(SEQ ID NO:5). Если это желательно, одна или более аминокислот могут быть дополнительно встроены между первым полипептидным участком, включающим в себя участок IL-21 или рецептора IL-21, и вторым полипептидным участком. Второй полипептид предпочтительно растворим. В некоторых вариантах реализации второй полипептид увеличивает время полужизни (например, полужизни сыворотки) присоединенного полипептида. В некоторых вариантах реализации второй полипептид включает в себя последовательность, которая облегчает ассоциацию гибридного полипептида со вторым полипептидом рецептора IL-21. В предпочтительных вариантах реализации второй полипептид включает в себя, по меньшей мере, участок полипептида иммуноглобулина. Иммуноглобулиновые гибридные полипептиды известны в данной области и описаны, например, в Патенте США 5516964; 5225538; 5428130; 5514582; 5714147 и 5455165. В некоторых вариантах реализации второй полипептид включает в себя полноразмерный полипептид иммуноглобулина. В ином варианте второй полипептид включает в себя не полноразмерный полипептид иммуноглобулина, например, тяжелую цепь, легкую цепь, Fab, Fab2, Fv или Fc. Предпочтительно,чтобы второй полипептид включал в себя тяжелую цепь полипептида иммуноглобулина. В некоторых вариантах реализации второй полипептид имеет меньшую эффекторную функцию,чем эффекторная функция участка Fc тяжелой цепи иммуноглобулина дикого типа. Эффекторная функция Fc включает в себя, например, связывание с рецептором Fc, фиксацию комплемента и активность,истощающая Т-клетки (см., например, Патент США 6136310). Способы определения активности, истощающей Т-клетки, эффекторной функции Fc и стабильности антител в этой области техники известны. В одном из вариантов реализации второй полипептид имеет низкую или отсутствующую аффинность к комплементарному белку CIq. Предпочтительная последовательность второго полипептида включает в себя аминокислотную последовательность SEQ ID NO:6. Эта последовательность включает в себя участок Fc. Подчеркнуты аминокислоты, которые отличаются от аминокислот, обнаруженных в соответствующем положении последовательности иммуноглобулина дикого типа: Антитела к IL-21 и к рецептору IL-21. Термин антитело, как он используется в данном документе, относится к молекулам иммуноглобулина и иммунологически активным участкам молекул иммуноглобулина (Ig), например, молекул, которые содержат антигенсвязывающий сайт, который специфически связывается (иммунно реагирует) с антигеном. Такие антитела включают в себя, например, поликлональные, моноклональные, химерные,одноцепочечные, фрагменты Fab, Fab' и F(ab')2 и библиотеку экспрессии Fab. В общем, молекула антитела,полученная от человека, относится к одному из классов IgG, IgM, IgA, IgE и IgD, которые отличаются один от другого природой тяжелой цепи, представленной в молекуле. Определенные классы имеют также подклассы, такие как IgG1, IgG2 и другие. Кроме того, у человека легкая цепь может представлять собой -цепь или -цепь. Ссылки в данном документе на антитела включают в себя все классы, подклассы и типы человеческих антител. Антитела к полипептидам IL-21 или рецептора IL-21 также включают в- 11011686 себя антитела к гибридным белкам, содержащим полипептиды IL-21 или рецептора IL-21 или фрагменты полипептидов IL-21 или рецептора IL-21. Полипептид IL-21 или полипептид рецептора IL-21 может быть использован как антиген или часть или фрагмент его, и дополнительно может быть использован как иммуноген, чтобы генерировать антитела, которые иммуноспецифически связываются с антигеном, используя стандартную технологию приготовления поликлональных и моноклональных антител. Антигенные пептидные фрагменты антигена для использования в качестве иммуногена включают в себя, например, по меньшей мере 7 аминокислотных остатков аминокислотной последовательности амино-концевого участка, такие как аминокислотные последовательности, показанные в SEQ ID NO:1 или 3, и охватывают его эпитоп, так что выработанное против пептида антитело образует специфический иммунный комплекс с полноразмерным белком или с каким-то фрагментом, содержащим эпитоп. Предпочтительно, антигенный пептид содержит не менее чем 10 аминокислотных остатков, или не менее чем 15 аминокислотных остатков, или не менее чем 20 аминокислотных остатков, или не менее чем 30 аминокислотных остатков. Предпочтительные эпитопы,окруженные антигенным пептидом, - это область белка, которая расположена на его поверхности, обычно в гидрофильной части. В некоторых вариантах реализации не менее чем один эпитоп, окруженный антигенным пептидом, это участок IL-21 или полипептида рецептора IL-21, который расположен на поверхности белка, например, в гидрофильном участке. Анализ гиброфобности IL-21 или полипептида рецептора IL-21 покажет,какой участок IL-21 или полипептида рецептора IL-21 особенно гидрофилен, и следовательно, вероятно,кодирует поверхностные остатки, пригодные для нацеливания продукции антител. Как средства для нацеливания продукции антител графики гидропатии, показывающие участки гидрофильности и гидрофобности, могут быть получены любым известным в этой области способом, включая, например, способы Kyte - Doolittle или Норр - Woods с преобразованием или без преобразования Фурье. См., например,Норр and Woods (1981) Proc. Nat. Acad. Sci USA 78: 3824-3828; Kyte and Doolittle (1982) J. Mol. Biol. 157:105-142. Антитела, специфичные к одному или более доменам в антигенном белке или его производном, фрагментах, аналогах или гомологах, также могут быть получены. Белок, предмет данного изобретения или его производное, фрагмент, аналог, гомолог или ортолог может быть использован для генерирования антител, которые иммуноспецифически связывают эти белковые компоненты. Различные процедуры, известные в данной области техники, могут быть использованы для получения поликлональных или моноклональных антител против белка согласно изобретению или против его производных, фрагментов, аналогов, гомологов или ортологов. См., например, ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL, Harlow and Lane (1988) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY. Некоторые из этих антител обсуждены ниже. Поликлональные антитела. Для получения поликлональных антител могут быть иммунизированы различные подходящие организмы хозяина (например, кролик, коза, мышь или другие млекопитающие) путем одной или более инъекций нативным белком, его синтетическим вариантом или производными указанных. Соответствующий иммуногенный препарат может содержать, например, естественный иммуногенный белок, химически синтезированный полипептид, представляющий иммуногенный белок, или рекомбинантно экспрессированный иммуногенный белок. Кроме того, белок может быть конъюгирован со вторым белком,про который известно, что он иммуногенен для иммунизируемого млекопитающего. Примеры таких иммуногенных белков включают в себя, но не ограничиваются гемоцианином моллюска Megatura crenulata(Keyhole Limpet), сывороточным альбумином, бычьим тироглобулином и соевым ингибитором трипсина. Препарат может также включать в себя адъювант. Различные адъюванты, используемые для повышения иммунологического ответа, включают в себя, но не ограничиваются, адъювантом Фройнда (полным или неполным), минеральными гелями (например, гидратом окиси алюминия), поверхностноактивные вещества (например, лизолецитин, плюроновые полиолы, полианионы, пептиды, масляные эмульсии, динитрофенол и т.д.), адъюванты, используемые для человека, такие как Bacille CalmetteGuerin и Corynebacterium parvum или сходные иммуностимуляторные агенты. Дополнительные примеры адъювантов, которые могут быть использованы, включают в себя адъювант MPL-TDM (монофосфорил липид А, синтетическая трегалоза дикориномиколат). Молекулы поликлонального антитела, направленного против иммуногенного белка, могут быть выделены из млекопитающих (например, из крови) и затем очищены с помощью известных технологий,таких как аффинная хроматография, использующая белок А или белок G, которые представляют собой в первую очередь фракцию иммуноглобулинов IgG иммунной сыворотки. Затем, или как альтернатива,специфический антиген, который является мишенью поиска иммуноглобулина, или его эпитоп могут быть иммобилизованы на колонке, чтобы очистить иммуноспецифические антитела с помощью иммуноаффинной хроматографии. Очистка иммуноглобулинов обсуждается, например, Вилкинсоном. Wilkinson(2000) The Scientist, 14:25-28. Моноклональные антитела. Термин моноклональные антитела (МА) или композиции моноклональных антител, как это ис- 12011686 пользуется в данном изобретении, относится к популяции молекул антител, которые содержат только один молекулярный вид молекулы антитела, состоящей из уникальной легкой цепи продукта гена, и уникальную тяжелую цепь продукта гена. В частности, участки, определяющие комплементарность(КОУ) моноклонального антитела, идентичны у всех молекул популяции. МА, таким образом, содержат антигенсвязывающий сайт, способный к иммунореактивности с особым эпитопом антигена, характеризующейся уникальной аффинностью связывания с ним. Моноклональные антитела могут быть приготовлены с использованием способов гибридом, так, как это описано Kohler and Milstein (1975) Nature, 256:495. Способом гибридом мышь, хомячок или другое подходящее животное-хозяин обычным образом иммунизируется иммунизирующим агентом, чтобы активировать лимфоциты, которые продуцируют или способны продуцировать антитела, которые будут специфически связываться с иммунизирующим агентом. В качестве альтернативы, лимфоциты могут быть иммунизированы in vitro. Иммунизирующий агент обычно включает белковый антиген, его фрагмент или его химерный белок. Обычно используются либо лимфоциты периферической крови, если нужны клетки человеческого происхождения, либо клетки селезенки или лимфатического узла, если в качестве источника используется млекопитающее, кроме человека. Затем лимфоциты сливают с иммортализованной клеточной линией,используя подходящий для слияния агент, такой как полиэтиленгликоль, чтобы образовать клетку гибридомы. Goding, MONOCLONAL ANTIBODIES: PRINCIPLES AND PRACTICE, Academic Press, (1986)pp. 59-103. Иммортализованные клеточные линии - это обычно трансформированные клетки млекопитающих, особенно клетки миеломы, происходящие от грызунов, быка или человека. Обычно используются клеточные линии миеломы крыс или мышей. Клетки гибридомы могут культивироваться в подходящей культуральной среде, которая предпочтительно содержит одно или более веществ, ингибирующих рост или выживание неслившихся, иммортализованных клеток. Например, если у парентеральных клеток отсутствует фермент гипоксантин-гуанин-фосфорибозил трансфераза (ГГПРТ или ГПРТ), культуральная среда для гибридом обычно включает в себя гипоксантин, аминоптерин и тимидин (среда ГАТ), упомянутые вещества предупреждают рост ГГПРТ-дефицитных клеток. Предпочтительно линии иммортализованных клеток - это такие, которые эффективно сливаются,поддерживают стабильно высокий уровень экспрессии антител отобранными клетками, продуцирующими антитела, и чувствительны к среде, такой как среда ГАТ. Более предпочтительными иммортализованными клеточными линиями являются мышиные линии миеломы, которые могут быть получены, например, в Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, California и в American Type Culture Collection, Manassas, Virginia. Также описано использование миеломы человека и мышино-человеческой клеточной линии гетеромиеломы для продукции моноклональных человеческих антител (Kozbor (1984) J. Immunol.,133:3001; Brodeur et al., MONOCLONAL ANTIBODY PRODUCTION TECHNIQUES AND APPLICATIONS, Marcel Dekker, Inc., New York, (1987) pp. 51-63). Культуральная среда, в которой культивируются клетки гибридомы, может затем быть исследована на присутствие моноклональных антител, направленных против антигена. Предпочтительно специфичность связывания моноклональных антител, продуцируемых клетками гибридомы, определяется по иммунопреципитации или по анализу связывания in vitro, такому как радиоиммуноанализ (RIA) или ферментсвязанный иммуносорбентный анализ (ELISA). Такие технологии и анализы известны в данной области. Аффинность связывания моноклональных антител может определяться, например, анализом Скэтчарда по Munson and Pollard (1980) Anal. Biochem, 107:220. Предпочтительно выделяются антитела, имеющие высокую степень специфичности и высокую аффинность связывания с антигеном-мишенью. После идентификации желаемых клеток гибридомы, клоны могут быть субклонированы путем ограничивающих процедур разведения и выращивания стандартными способами. Подходящие для этих целей культуральные среды включают в себя, например модифицированную Dulbecco среду Игла и среду RPMI-1640. В качестве альтернативы, клетки гибридомы могут выращиваться in vivo как асцит у млекопитающих. Моноклональные антитела, секретируемые субклонами, могут быть выделены и очищены из культуральной среды или асцитной жидкости с помощью стандартной процедуры очистки иммуноглобулинов, такой, например, как метод протеин А-сефарозы, хроматографии на гидроксиапатите, гельэлектрофореза, диализа или аффинной хроматографии. Моноклональные антитела могут быть получены методом рекомбинантной ДНК, как это описано в патенте США 4816567. ДНК, кодирующая моноклональные антитела согласно изобретению, может быть без затруднений выделена и секвенирована с использованием стандартных процедур (например, с использованием олигонуклеотидных зондов, которые способны специфически связываться с генами, кодирующими тяжелую и легкую цепи мышиных антител). Клетки гибридомы согласно изобретению служат предпочтительным источником для такой ДНК. После выделения, ДНК может быть помещена в векторы экспрессии, которые затем трансфицируются в клетки хозяина, такие как клетки обезьяны COS,клетки яичников китайского хомячка (СНО) или клетки миеломы, которые иным образом не продуциру- 13011686 ют белок иммуноглобулина, чтобы получить синтез моноклональных антител в рекомбинантных клетках хозяина. ДНК также может быть модифицирована, например, вставкой кодирующей последовательности постоянных доменов тяжелой и легкой цепей человека вместо гомологичной последовательности мыши(патент США 4816567; Morrison (1994) Nature 368, 812-813) или ковалентной сшивкой кодирующей последовательности иммуноглобулина со всей кодирующей последовательностью неиммуноглобулинового полипептида или его частью. Такой неиммуноглобулиновый полипептид может быть замещен на постоянные домены антител согласно изобретению или может быть замещен различными доменами сайта, включая антиген, антитела согласно изобретению для создания химерного бивалентного антитела. Гуманизированные антитела. Антитела против белковых антигенов согласно изобретению могут далее включать гуманизированные антитела или антитела человека. Эти антитела пригодны для введения человеку без возбуждения иммунного ответа человека против введенного иммуноглобулина. Гуманизированные формы антител являются химерными иммуноглобулинами, цепями иммуноглобулина или их фрагментами (такими какFv, Fab, Fab', F(ab')2 или другими антигенсвязывающими последовательностями антител), которые в основном включают в себя последовательность человеческого иммуноглобулина и содержат минимальную последовательность, полученную из иммуноглобулина, не принадлежащего человеку. Гуманизация может быть выполнена в соответствии со способом Винтера с сотрудниками (Winter) (Jones et al. (1986)Nature, 321:522-525; Riechmann et al. (1988) Nature, 332:323-327; Verhoeyen et al. (1988) Science, 239:15341536) путем замещения последовательностей CDR или CDR грызунов на соответствующие последовательности человеческих антител. (См. патент США 5225539.) В некоторых случаях остатки каркасного участка Fv человеческого иммуноглобулина замещаются соответствующими остатками из последовательности, не принадлежащей человеку. Гуманизированные антитела могут также включать в себя остатки, которые не встречаются ни в антителах реципиента, ни в импортированной последовательностиCDR, ни в каркасной последовательности. В общем, гуманизированное антитело включает в себя практически целиком не менее чем один, обычно два из вариабельных доменов, в которых все или почти все из участков CDR соответствуют таковым из иммуноглобулина, не принадлежащего человеку, и все или практически все каркасные участки - это консенсусная последовательность иммуноглобулина человека. Гуманизированное антитело оптимально также включает в себя по меньшей мере часть консервативного участка иммуноглобулина (Fc), обычно - это человеческий иммуноглобулин (Jones et al., 1986; Riechmannet al., 1988; и Presta (1992) Curr. Op. Struct. Biol., 2:593-596). Человеческие антитела. Полностью человеческие антитела - это молекулы антител, в которых практически целиком последовательности легкой и тяжелой цепей, включая CDR, происходят из человеческих генов. Такие антитела в данном документе именуются человеческими антителами или полностью человеческими антителами. Человеческие моноклональные антитела могут быть приготовлены с помощью технологии триомы; технологии человеческой В-клеточной гибридомы (см. Kozbor et al. (1983) Immunol Today 4:72) и технологии гибридомы EBV для получения человеческих моноклональных антител (см. Cole et al., 1985 In:MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96). Человеческие моноклональные антитела могут использоваться в практике применения данного изобретения и могут быть получены с использованием человеческих гибридом (см. Cote et al. (1983) Proc Natl Acad. Sci. USA 80:2026-2030) или путем трансформации человеческих В-клеток вирусом Эпштейна-Барр (Epstein-Barr)in vitro (см. Cole et al. (1985) In: MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY, Alan R. Liss,Inc., pp. 77-96). Кроме того, человеческие антитела также могут быть получены с использованием дополнительных технологий, включая библиотеки фагов. См. Hoogenboom and Winter (1991) J. Mol. Biol., 227:381; Markset al. (1991) J. Mol. Biol., 222:581. Сходным образом, человеческие антитела могут быть получены введением локусов человеческого иммуноглобулина трансгенным животным, например, мыши, у которой эндогенные гены иммуноглобулинов частично или полностью инактивированы. При введении в организм вещества наблюдается продукция человеческих антител, которые очень близки к наблюдаемым у человека во всех отношениях, включая перестройку гена, упорядоченность структуры и набор антител. Такой подход описан, например, в патентах США 5545807; 5545806; 5569825; 5625126; 5633425; 5661016 и уMarks et al. (Bio/Technology 10, 779-783 (1992; Lonberg et al. (Nature 368 856-859 (1994; Morrison (Nature 368, 812-813 (1994; Fishwild et al., (Nature Biotechnology 14, 845-51 (1996; Neuberger (Nature Biotechnology 14, 826 (1996 и Lonberg and Huszar (Intern. Rev. Immunol. 13 65-93 (1995. Человеческие антитела, кроме того, могут быть получены с использованием трансгенных животных, неидентичных человеку, которые модифицированы так, что продуцируют полностью человеческие антитела, а не эндогенные антитела данного животного в ответ на введение антигена. См. опубликованный договор о патентной кооперации РСТ WO 94/02602. Эндогенные гены, кодирующие тяжелую и легкую цепи иммуноглобулина в организме неидентичного человеку хозяина, инактивировались, и активные локусы, кодирующие тяжелую и легкую цепи человеческого иммуноглобулина, встраивались в геном хозяина. Человеческие гены встраиваются, например, с помощью искусственных хромосом дрож- 14011686 жей, содержащих требуемый сегмент человеческой ДНК. Животное, которое обладает всеми требуемыми модификациями, затем получают как потомство скрещивания промежуточных трансгенных животных, обладающих неполным набором модификаций. Предпочтительным вариантом реализации такого неидентичного человеку животного являются мыши, именуемые Xenomouse, как это изложено в публикациях договоров о патентной кооперации РСТ WO 96/33735 и WO 96/34096. Такие животные продуцируют В-клетки, которые секретируют полностью человеческие иммуноглобулины. Антитела могут быть получены непосредственно из животного после иммунизации иммуногеном, представляющим интерес, как, например, при приготовлении поликлональных антител, или, в качестве альтернативы, из иммортализованных В-клеток, полученных у животного, таких как гибридомы, продуцирующие моноклональные антитела. Дополнительно, гены, кодирующие иммуноглобулины человека с вариабельными участками, могут быть восстановлены и экспрессированы, чтобы получить антитела непосредственно,или могут быть затем модифицированы для получения аналогов антител, таких как одиночная цепь молекул Fv. Пример способа получения организма-хозяина, неидентичного человеку, обычно мыши, у которого отсутствует экспрессия эндогенной тяжелой цепи иммуноглобулина, изложен в патенте США 5939598. Этого можно достигнуть способом, включающим в себя делецию генов J-сегмента из не менее чем одного эндогенного локуса, кодирующего тяжелую цепь, в эмбриональной стволовой клетке, чтобы предупредить перестройку локуса, а также предотвратить транскрипцию перестроенного локуса, кодирующего тяжелую цепь иммуноглобулина; делеция осуществляется нацеливанием вектора, содержащего ген, кодирующий избранный маркер; в результате из эмбриональной стволовой клетки образуется трансгенная мышь, соматические и генеративные клетки которой содержат ген, кодирующий избранный маркер. Способ получения интересующего антитела, такого как человеческое антитело, изложен в патенте США 5916771. Он включает в себя введение вектора экспрессии, который содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую тяжелую цепь, в одну клетку млекопитающего-хозяина в культуре,введение вектора экспрессии, содержащего нуклеотидную последовательность, кодирующую легкую цепь, в другую клетку млекопитающего-хозяина в культуре, и слиянии двух клеток с образованием гибридной клетки. Гибридная клетка экспрессирует антитело, содержащее и тяжелую цепь, и легкую цепь. Дальнейшее усовершенствование этой процедуры - способ идентификации клинически значимого эпитопа на иммуногене и соответственный способ отбора антитела, которое с высокой аффинностью иммуноспецифически связывается со значимым эпитопом, изложен в публикации договора о патентной кооперации РСТ WO 99/53049.Fab-фрагменты и одноцепочечные антитела. В соответствии с данным изобретением, технология может быть адаптирована для получения одноцепочечных антител против белка согласно изобретению (см., например, патент США 4946778). Кроме того, способ может быть адаптирован для конструирования библиотек экспрессии Fab (см., например,Huse et al. (1989) Science 246: 1275-1281), что позволяет быструю и эффективную идентификацию моноклональных Fab-фрагментов с желательной специфичностью к белку или его производным, фрагментам,аналогам или гомологам. Фрагменты антител, которые содержат идиотипы к белковому антигену, могут быть получены с помощью технологий, известных в данной области (но не исчерпываются ими): (1) фрагмент F(ab')2, полученный пепсиновым перевариванием молекулы антитела; (2) фрагмент Fab, полученный редукцией дисульфидных мостиков фрагмента F(ab')2; (3) фрагмент Fab, полученный обработкой молекулы антитела папаином и восстанавливающим агентом, и (4) фрагменты Fv. Биспецифические антитела. Биспецифические антитела - это моноклональные, предпочтительно человеческие или гуманизированные, антитела, которые обладают специфичностью связывания не менее чем с двумя различными антигенами. В данном случае одна из специфичностей связывания относится к антигенному белку согласно изобретению. Второй мишенью связывания является другой антиген, предпочтительно белок клеточной поверхности или рецептор, или субъединица рецептора. Способ получения биспецифических антител известен в данной области техники. Традиционно рекомбинантное получение биспецифических антител основывается на коэкспрессии двух пар легкая цепь- тяжелая цепь иммуноглобулина, где две тяжелые цепи обладают разной специфичностью. (Milsteinand Cuello (1983) Nature, 305:537-539). Вследствие случайного сочетания легких и тяжелых цепочек иммуноглобулина такие гибридомы (квадромы) могут продуцировать десять различных молекул антител,из которых только одна обладает надлежащей биспецифической структурой. Очистка надлежащей молекулы обычно достигается с помощью аффинной хроматографии. Сходные процедуры изложены в WO 93/08829 и у Traunecker et al. (1991) EMBO J., 10:3655-3659. Вариабельные домены антитела с желаемыми специфичностями (антигенсвязывающий активный центр антитела) могут быть объединены с последовательностями консервативных доменов иммуноглобулина. Объединение предпочтительно с константным доменом тяжелой цепи иммуноглобулина, включающим в себя, по меньшей мере, шарнирный участок и участки СН 2 и CH3. Предпочтительно, чтобы в первом консервативном участке тяжелой цепи (СН 1) был сайт, необходимый для связывания легкой це- 15011686 пи, присутствующей не менее чем в одном из слияний. ДНК, кодирующие слияния тяжелых цепей иммуноглобулина и, если это желательно, легких цепей иммуноглобулина, встраиваются в отдельные векторы экспрессии и котрансфицируются в подходящий организм хозяина. Дальнейшие детали получения биспецифических антител см., например, у Suresh et al. (1986) Methods in Enzymology, 121:210. В соответствии с другим подходом, описанным в WO 96/27011, интерфейс между парой молекул антител может быть сконструирован так, чтобы максимально увеличить процент гетеродимеров, получаемых из рекомбинантной клеточной культуры. Предпочтительный интерфейс включает в себя по меньшей мере часть участка CH3 консервативного домена антитела. Согласно этому способу одна или более малых боковых цепей аминокислот из интерфейса первой молекулы антитела замещаются большими боковыми цепами (например, содержащими тирозин или триптофан). Компенсаторные полости идентичного или сходного с большой боковой цепью (цепями) размера создаются на границе второй молекулы антитела путем замещения крупной аминокислотной боковой цепи на меньшую (например, содержащую аланин или треонин). Это обеспечивает механизм, повышающий выход гетеродимера по сравнению с нежелательным продуктом, которым являются гомодимеры. Биспецифические антитела могут быть приготовлены как полноразмерные антитела или фрагменты антител (например, биспецифические антитела F(ab')2). Технологии получения биспецифических антител из фрагментов антител были описаны в литературе. Например, биспецифические антитела могут быть приготовлены с использованием химической сшивки. У Brennan et al. (1985) Science 229:81 описана процедура, согласно которой интактные антитела протеолитически расщепляются для получения фрагментов F(ab')2. Эти фрагменты восстанавливаются в присутствии дитиол-комплексообразующего агента арсенита натрия для стабилизации соседствующих дитиолов и предупреждения формирования межмолекулярных дисульфидных мостиков. Полученные фрагменты Fab' затем преобразовывали в тринитробензойные производные (TNB). Одно из производных Fab'-TNB затем обратно преобразовывали в Fab'-тиол восстановлением меркаптоэтиламином и смешиванием в эквимолекулярных количествах с другим производным Fab'-TNB для образования биспецифического антитела. Полученные биспецифические антитела могут быть использованы как агенты для селективной иммобилизации ферментов. Дополнительно фрагменты Fab' могут быть получены непосредственно из E.coli и химически связаны с образованием биспецифических антител. Shalaby et al. (1992) J. Exp. Med. 175:217-225 описывает производство полностью гуманизированных биспецифических молекул антитела F(ab')2. Каждый фрагмент Fab' секретируется E.coli отдельно и используется для непосредственного химического связыванияin vitro с образованием биспецифических антител. Биспецифические антитела, сформированные таким образом, были способны связываться с клетками, сверхэкспрессирующими рецептор ErbB2 (гомолог 2 вирусного онкогена эритробластной лейкемии), и нормальными человеческими Т-клетками, так же как запускать литическую активность человеческих цитотоксических лимфоцитов против мишеней рака молочной железы человека. Также описаны различные технологии приготовления и выделения фрагментов биспецифических антител непосредственно из рекомбинантных клеточных культур. Например, биспецифические антитела были получены с использованием лейциновой застежки-молнии. Kostelny et al. (1992) J. Immunol. 148Fab' двух разных антител путем соединения генов. Гомодимеры антитела восстанавливали в области шарнира с образованием мономеров и затем реокислением, ведущим к образованию гетеродимеров. Этот способ может также быть использован для получения гомодимеров антитела. Двутелая технология,описанная Hollinger et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448, предоставляет альтернативный механизм изготовления фрагментов биспецифических антител. Фрагменты включают в себя вариабельный домен тяжелой цепи (VH), соединенный с вариабельным доменом легкой цепи (VL) линкером, который слишком короток, чтобы допустить спаривание между доменами одной и той же цепи. Соответственно, домены VH и VL одного фрагмента вынуждены спариваться с доменами VH и VL другого фрагмента, образуя таким образом два антигенсвязывающих сайта. Также сообщена другая стратегия приготовления биспецифических фрагментов антител путем использования димера одиночной цепи Fv (sFv). См.Gruber et al. (1994) J. Immunol. 152:5368. Предполагается получение антител с числом детерминант более чем два. Например, могут быть изготовлены триспецифические антитела. Tutt et al. (1991) J. Immunol. 147:60. Типичные биспецифические антитела могут связываться с двумя различными эпитопами, по меньшей мере один из которых происходит от белкового антигена согласно изобретению. Другой вариант антиантигенное плечо молекулы иммуноглобулина может сочленяться с плечом, которое связывается с триггерной молекулой на лейкоците, такой как рецепторная молекула Т-клетки (например, CD2, CD3,CD28 или В 7) или Fc-рецептор к IgG (Fc-R), такой как Fc RI (CD64), Fc RII (CD32) и Fc RIII (CD16), как с центром клеточного защитного механизма клетки, экспрессирующей специфический антиген. Биспецифические антитела могут также использоваться для направления цитотоксических агентов в клетки, которые экспрессируют специфический антиген. Эти антитела обладают антигенсвязывающим плечом и плечом, которое связывается с цитотоксическим агентом или радионуклидным хелатором, таким какEOTUBE, DPTA, DOTA или ТЕТА. Другие биспецифические антитела, представляющие интерес, связываются с белковым антигеном, описанным в данном изобретении, а затем - с тканевым фактором (ТФ). Фармацевтические композиции. Модуляторы IL-21, описанные в данном изобретении, могут с удобством включаться в фармацевтические композиции. Композиции особенно удобны для внутреннего приема и включают в себя эффективные количества фармакологически активного соединения по изобретению самого по себе или в комбинации с одним или более фармацевтически допустимыми переносчиками. Вещества особенно удобны тем, что имеют очень низкую токсичность или не имеют ее вообще. В практике соединения или их фармацевтически допустимые соли вводятся в количествах, которые будут достаточными, чтобы вызвать желаемые изменения, например, повышение или понижение уровняIL-21, и в фармацевтической форме, наиболее подходящей для этих целей. Например, для перорального введения в форме таблетки или капсулы (например, желатиновой капсулы) активный компонент лекарства может сочетаться с пероральным, нетоксичным фармацевтически допустимым инертным носителем, таким как этанол, глицерин, вода или подобные. Далее, когда желательно или необходимо, в смесь могут быть включены подходящие линкерные вещества, скользящие вещества, расщепляющие агенты, красящие агенты. Подходящие линкерные вещества включают в себя крахмал, магний-алюминий силикат, крахмальную паста, желатин, метилцеллюлозу, натрийкарбоксиметилцеллюлозу и/или поливинилпирролидон, природные сахара, такие как глюкоза или лактоза, кукурузный подсластитель, природные и синтетические камеди, такие как гуммиарабик, смола астрагала или альгинат натрия, полиэтиленгликоль, парафины и подобные вещества. Скользящие вещества, используемые в таких фармакологических формах, включают в себя олеат натрия, стеарат натрия,стеарат магния, безоат натрия, ацетат натрия, поваренную соль, кремнезем, тальк, стеариновую кислоту,ее магниевую или кальциевую соли и/или полиэтиленгликоль и тому подобное. Расщепляющие агенты включают в себя крахмал, метилцеллюлозу, агар, бентонит, ксантановые крахмалы, агар, альгиновую кислоту или ее натриевую соль, не ограничиваясь ими, шипучие смеси и им подобное, не ограничиваясь ими. Разжижители включают в себя, например, лактозу, декстрозу, сахарозу, маннит, сорбит, целлюлозу и/или глицин. Инъекционные композиции являются предпочтительно водными изотоническими растворами или суспензиями, а суппозитории преимущественно изготавливаются из жировых эмульсий или суспензий. Композиция может быть стерилизована и/или может содержать вспомогательные вещества, такие как консерванты, стабилизирующие, увлажняющие или эмульгирующие агенты, промоторы растворения,соли для регуляции осмотического давления и/или буферы. Кроме того, они могут также содержать другие терапевтически ценные вещества. Композиции приготавливаются в соответствии со стандартными методами смешивания, гранулирования или покрытия, соответственно, и содержат около 0,1%-75%,предпочтительно около 1-50% активного ингредиента. Соединения согласно изобретению могут также вводиться в таких пероральных фармацевтических формах, как таблетки или капсулы временного и пролонгированного действия, пилюли, порошки, гранулы, эликсиры, тинктуры, суспензии, сиропы и эмульсии. Жидкие, особенно инъекционные композиции могут быть, например, приготовлены путем растворения, диспергирования и т.д. Активное соединение растворяется или смешивается с фармацевтически чистым растворителем, таким, например, как вода, солевой раствор, водная декстроза, глицерин, этанол и подобное, чтобы образовать инъекционный раствор или суспензию. Кроме того, могут быть сформированы твердые формы, пригодные для растворения в жидкости перед инъекцией. Инъекционные композиции являются преимущественно водными изотоническими растворами или суспензиями. Композиции могут быть стерилизованы и/или содержать вспомогательные вещества, такие как консерванты, стабилизаторы, увлажняющие или эмульгирующие агенты, промоторы растворения, соли для регуляции осмотического давления и/или буферы. Кроме того, они могут содержать другие терапевтически значимые вещества. Соединения согласно изобретению могут вводиться во внутривенной (в виде болюсов или вливаний), внутрибрюшинной, подкожной или внутримышечной формах, все используемые формы известны специалистам в области фармации. Инъекционные формы могут быть приготовлены в стандартных формах в виде растворов или суспензий. Парентеральное инъекционное введение обычно используется для подкожных, внутримышечных или внутривенных инъекций и вливаний. Кроме того, еще один подход к парентеральному введению использует имплантацию медленно выделяющих или пролонгированного действия систем, которые обеспечивают поддержание постоянного уровня фармацевтической формы, в соответствии с патентом США 3710795, включенным в данное изобретение в виде ссылки. Кроме того, соединения согласно изобретению предпочтительно могут быть введены в интраназальной форме путем местного использования подходящих интраназальных носителей, или трансдермальным путем, с использованием известных специалистам в данной области трансдермальных кожных наклеек. При введении через интраназальную систему поступление вещества будет, конечно, непрерывным, а не прерывистым, в течение всего периода введения. Другие предпочтительные препараты местно- 17011686 го действия включают в себя кремы, мази, лосьоны, аэрозольные спреи и гели, концентрация активного ингредиента в которых находится в пределах от 0,1 до 15 объемных или весовых процентов. В качестве наполнителя для твердых композиций могут быть использованы фармацевтически приемлемые вещества, которые включают в себя маннит, лактозу, крахмал, стеарат магния, натрий-сахарин,тальк, целлюлозу, глюкозу, сахарозу, карбонат магния и подобные. Активные соединения, определенные выше, могут также изготавливаться в виде суппозиториев с использованием, например, полиалкиленгликолей, например, пропиленгликоля в качестве носителя. В некоторых вариантах реализации суппозитории предпочтительно изготавливаются из жировых эмульсий или суспензий. Соединения согласно изобретению могут также вводиться в форме липосомной системы введения,такой как малые однослойные везикулы, большие однослойные везикулы и многослойные везикулы. Липосомы могут быть сформированы из различных фосфолипидов, содержащих холестерин, стериламин или фосфатидилхолины. В некоторых вариантах реализации пленка липидных компонентов гидратируется водным раствором лекарства для образования липидного слоя, инкапсулирующего лекарство, как это описано в патенте США 5262564. Соединения согласно изобретению могут также доставляться с использованием моноклональных антител как индивидуальных носителей, с которыми связаны молекулы соединения. Соединения согласно изобретению могут также быть связаны с растворимыми полимерами как адресными носителями лекарства. Такие полимеры могут включать в себя поливинилпирролидон, сополимер пирана, полигидроксипропил-метакриламид-фенол, полигидроксиэтиласпанамидфенол или полиэтиленоксидполилизин с замещениями пальмитоиловыми остатками. Кроме того, соединения согласно изобретению могут быть связаны с классом биодеградирующих полимеров, пригодных для достижения контролируемого выделения лекарства, например, полимолочная кислота, поликапролактон, полигидроксимасляная кислота,полиортоэфиры, полиацетали, полидигидропираны, полицианакрилаты и поперечно сшитые или амфипатически блокированные сополимеры гидрогелей. Молекулы нуклеиновой кислоты согласно изобретению могут быть встроены в векторы и использованы как векторы генной терапии. Векторы генной терапии могут доставляться субъекту путем, например, внутривенной инъекции, местного введения (см., например, патент США 5328470) или стереотаксической инъекции (см., например., Chen et al., 1994. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:3054-3057). Фармацевтический препарат вектора генной терапии может включать в себя вектор генной терапии в приемлемом разбавителе или может содержать медленно выделяющую основу, в которую погружен носитель, доставляющий ген. Альтернативный вариант, в котором интактный полный вектор доставки гена может быть получен из рекомбинантных клеток, например, ретровирусные векторы, фармацевтический препарат может включать в себя одну или более клеток, которые продуцируют систему доставки гена. Если желательно, вводимая фармацевтическая композиция может также содержать минорные количества нетоксичных вспомогательных веществ, таких как увлажняющие или эмульгирующие агенты,агенты, забуферивающие pH, и другие вещества, такие как, например, ацетат натрия, триэтаноламин олеат и т.п. Режим применения соединений выбирается в соответствии с различными факторами, включающими в себя тип, вид, возраст, вес, пол и медицинское состояние пациента; тяжесть излечиваемого заболевания; способ введения; функции почек и печени пациента; и выбор конкретного соединения или его соли. Врачи и ветеринары обычной квалификации легко могут определить и прописать эффективное количество лекарства, требующееся для предупреждения, противодействия или остановки развития заболевания. Пероральные дозировки согласно изобретению, когда они используются для достижения показанного действия, находятся в пределах около 0,05-1000 мг/день перорально. Композиции предпочтительно изготавливаются в форме шероховатых таблеток, содержащих 0,5, 1,0, 2,5, 5,0, 10,0, 15,0, 25,0, 50,0,100,0, 250,0, 500,0 и 1000,0 мг активного ингредиента. Эффективный уровень соединений по изобретению в плазме находится в пределах от 0,002 до 50 мг на кг веса в день. Соединения согласно изобретению могут быть введены в виде разовой ежедневной дозы, или дневная доза может быть введена дробно в два, три или четыре приема в день. Все вышеуказанные фармацевтические композиции могут содержать 0,1-99%, предпочтительно 170% IL-21, рецептора IL-21, агонист IL-21 или антагонист IL-21. Если желательно, фармацевтические композиции могут быть снабжены вспомогательными веществами. Вспомогательные вещества обсуждены выше. В некоторых вариантах реализации вспомогательные вещества могут быть использованы для усиления иммунологического ответа, причем это зависит от вида организма-хозяина, включая адъювант Фройнда (полный или неполный), минеральные гели, такие как гидроокись алюминия, поверхностно-активные вещества, такие как лизолецитин, плюроновые полиолы, полианионы, пептиды, масляные эмульсии, гемоцианин из моллюска Megatura crenulata, динитрофенол и потенциально пригодные человеческие адъюванты, такие как BCG (бацилла Калмета-Герэна) или Corynebacterium parvum. В общем, животных инъецируют антигеном с помощью нескольких инъекций в серии, предпочтительно, включая по меньшей мере три бустер-дозы. Изобретение далее будет проиллюстрировано нижеследующими неограничивающими примерами.- 18011686 Примеры 1-8 выполнены с использованием нижеследующих материалов и способов. Примеры Мышь. Если не указано иное, во всех экспериментах использовались мыши C57BL/6 в возрасте 6-8 недель. Мышей, дефицитных по Stat6, получали на основе С 57BL/6-дефицитных мышей так, как это описано уKaplan, M.H., et al., Immunity 4:313-319, 1996. Приготовление и культура лимфоцитов. Лимфоциты культивировали в среде RPMI 1640, дополненной, как описано в Kaplan, M.H., et al.,Immunity 4:313-9, 1996. Интактные клетки Тхп очищались из лимфатических узлов и селезенки клеточным сортингом с использованием анти-CD4 и анти-CD26L (Pharmingen; BD Life Sciences, San Diego, CA) до чистоты 95-98%. Антитела и цитокины.T-bet (Тх 1-специфический фактор транскрипции, контролирующий экспрессию Тх 1 цитокинов,ИФН) специфическая антисыворотка изготавливалась так, как это описано в Szabo, S.J. et al., Cell 100: 655-69, (2000). Антитела, специфичные к Stat4, Statl и актина были получены от фирмы Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). Антитела, специфичные к фосфорилированному Stat4, были получены отZymed (South San Francisco, CA). Антитела к анти-CD3 и -CD28, IL-4 и ИФН, использовавшиеся в дифференцировке культур Тх, были получены от Pharmingen. Рекомбинантный IL-4 был получен от Preprotech. Рекомбинантный IL-2 был получен от Chiron (Emeryville, CA). Рекомбинантный IL-12 был получен от Hoffman-LaRoche (Nutley, NJ). Приготовляли и концентрировали мышиный IL-21, экспрессированный в клетках COS супернатанте. Одна единица активности была определена как концентрация супернатанта,требующаяся для вызова 50%-ной пролиферации клеток BAF3, трансфицированных рецептором к IL-21. Ложно трансфицированная культура COS, приготовленная и концентрированная параллельно с IL-21,использовалась как контроль. Клеточная дифференцировка клеток Т-хелперов in vitro. Исходные Т-клетки (1-2106/мл) помещались на планшеты, покрытые анти-CD3, анти-CD28(1 мкг/мл) в присутствии 10 нг/мл IL-4, 10 мкг/мл анти-ИФН (условия для Тх 2) или 1 нг/мл IL-12,10 мкг/мл анти-IL-4 (условия для Тх 1). Через три дня клетки наращивали с помощью IL-2 (100 ед/мл). Через одну неделю в культуре клетки стимулировали ФМА (форбол-миристат ацетатом)/иономицином, и продукцию цитокинов определяли внутриклеточным окрашиванием цитокинов, как это описано у Bird,J.J. et al., Immunity 9: 229-237, 1998. Анализ РНК. Тотальную РНК выделяли с использованием RNeasy (Qiagen; Valencia, CA). Для анализа нозернблоттинга РНК выделяли на геле 1,5% агароза/6% формальдегид и переносили на мембрану GeneScreen(New England Nuclear). Мембрану гибридизовали с меченными радиозотопом кДНК-зондами к IL-21, IL4, ИФН, -актину. Для ПЦР в реальном времени (RT-PCR) 1 мкг РНК использовали в качестве затравки с олиго (dT) и конвертировали в кДНК с помощью Superscript (Invitrogen Life Technologies; Carlsbad, CA). 25 нг кДНК использовали как матрицу для ПЦР-реакции с использованием смеси SYBR Green 2X илиStat4 обратный: 5'agtgtccgtttgcaccgtc-3' (SEQ ID NO:13). Праймеры и зонды TaqMan для IL-4, ИФН и GAPDH опубликованы ранее (Overbergh, L. et al., Cytokine 11:305-12 1999). Анализ с помощью иммуноблоттинга. Тотальные клеточные экстракты готовили путем лизиса клеток в 50 мМ Трис, 0,5% NP40, 5 мМ ЭДТА, 50 мМ NaCl и очистки лизата с помощью центрифугирования. Белковые экстракты разделяли на 8-10% полиакриламидном геле и переносили на мембрану Optitran (Schleicher and Schuell; Keene, NH). Иммуноблоттинги блокировали на один час при комнатной температуре в 5% молоке в TBST (50 мМ Трис pH 7,5, 100 мМ NaCl, 0,03% Tween 20) и инкубировали с указанными антителами в течение ночи при 4 С. Блоттинги отмывали TBST и инкубировали с антикроличьими антителами, конъюгированными с пероксидазой хрена (Zymed), при комнатной температуре. После отмывки блоттингов с помощьюTBST выполнялось детектирование с помощью усиленной хемилюминесценции (Amersham; Piscataway,NJ), в соответствии с инструкцией производителя. Пример 1. IL-21 предпочтительно экспрессируется в клетках Тх, чье развитие индуцировано по пути клеток Тх 2 in vitro.- 19011686 Определяли экспрессию IL-21 в субпопуляции клеток Тх. Анализ нозерн-блоттинга выполняли на мРНК из исходных клетках Тхп (предшественниках Тх), дифференцировавшихся в клетки Тх 1 или Тх 2 в течение одной недели и рестимулированных в течение 4 ч, чтобы вызвать продукцию цитокинов. Результаты показаны на фиг. 1A-1D. Для получения результата, показанного на фиг. 1 А, клетки Тхп культивировались в условиях направленной дифференцировки к Тх 1 и Тх 2 в течение 6 дней. Клетки либо оставлялись без стимуляции (-) или рестимулировались с помощью ФМА/иономицина (Ф+И) в течение 4 ч. РНК очищали и оценивали экспрессию цитокинов с помощью нозерн-блоттинга. Представленные результаты репрезентативны по трем независимым экспериментам. Последовательность, кодирующая IL21, была детектирована только стимулированных клетках Тх 2, напротив, в культуре Тх 1 она обнаружена не была. Эти результаты показывают, что IL-21 является цитокином, специфичным для Тх 2. Чтобы определить, увеличивается ли потенциал экспрессии IL-21, когда клетка развивается по пути Тх 2, экспрессию IL-21 в первично стимулированных клетках Тхп сравнивали с экспрессией сигнала IL21 во вторично стимулированных клетках Тх 2. Результаты показаны на фиг. 1 В. Для получения показанного результата клетки Тхп культивировали при нейтральных условиях и в условиях направленной дифференцировки в Тх 1 и Тх 2. РНК очищали через 24 ч после первичной и вторичной анти-CD3 стимуляции. Экспрессию цитокинов оценивали в дупликатах с помощью RT-PCR и по отношению кGAPDH. Наблюдавшийся сигнал IL-21, как IL-4, был после первичной стимуляции клеток Тхп относительно низким. Напротив, экспрессия IL-21 значительно возрастала после того, как клетка дифференцировалась по пути Тх 2. Эти результаты показывают, что экспрессия гена IL-21 регулируется другими Тх 2 специфическими цитокинами. Определено влияние среды цитокинов на экспрессию IL-21. Клетки Тх 1 и Тх 2 культивировали в присутствии IL-4 и ИФН, соответственно, до вторичной стимуляции. Клетки были чувствительны к этим цитокинам, о чем свидетельствует активация Stat6 и Statl цитокином IL-4 и ИФН. Проверяли способность IL-4 восстанавливать экспрессию IL-21. Результаты показаны на фиг. 1 С. Клетки Тхп культивировали в условиях направленной дифференцировки в Тх 1 и Тх 2 в течение 5 дней.IL-4 или ИФН добавляли к указанной культуре за 24 ч до вторичной стимуляции с помощью анти-CD3. РНК очищали через 24 ч после вторичной стимуляции и оценивали экспрессию IL-21 в дупликатах относительно GAPDH с помощью RT-PCR. Добавление IL-4 клеткам Тх 1 не способно было восстановить экспрессию IL-21 до уровня, наблюдаемого в клетках Тх 2. Далее, добавление ИФН в культуры Тх 2 не оказывало ингибирующего эффекта на экспрессию IL-21. Эти результаты показывают, что экспрессияIL-21 в клетки Тх 2, вероятно, стабилизируется в начале дифференцировки в Тх 2 и непосредственно не модулируется IL-4 и ИФН. Пример 2. Клетки Тх 2 экспрессируют IL-21 в ходе иммунного ответа Тх 2 in vivo. Экспрессию IL-21 в клетках Тх 2 в ходе иммунного ответа in vivo определяли в модельной системе патогенных простейших. Инфицирование простейшим Leishmania major предоставляет хорошо охарактеризованную модель изучения ответа клеток Тх in vivo (Reiner, S.L., et al., Annu Rev Immunol 13:151177, 1995). Некоторые инбредные линии мышей, такие как C57BL/6, будучи инфицированы L.major дают эффективный защитный эффект клеток Тх 1 против патогена. Напротив, другие инбредные линии мышей, такие как BALB, развивают в первую очередь Тх 2-ответ и не способны бороться с инфекцией. И мыши C57BL/6, и BALB/c инфицировались L.major. Группы из восьми мышей BALB/c иC57BL/6 инфицировались L.major в подушечки передних лап. Через 6 недель CD4+ Т-клетки, дренированные из лимфатических узлов, очищались и стимулировались с помощью анти CD3. РНК выделяли через 6 ч после стимуляции, а экспрессия цитокина определялась относительно GAPDH с помощью RTPCR. Результаты показаны на фиг. 1D. Как ожидалось, клетки CD4+ из инфицированных мышейC57BL/6 экспрессировали больше ИФН, чем клетки инфицированных мышей BALB/c. В соответствии с преимущественным Тх 2-ответом, CD4+ Т-клетки инфицированных мышей BALB/c производили значительно больше IL-4, чем Т-клетки мышей C57BL/6. Аналогично тому, что наблюдалось в условиях направленной дифференцировки в Тх 2 in vitro, IL-21 также преимущественно экспрессировался в ходе Тх 2 ответа у мыши BALB/c in vivo. Эти результаты вместе с данными in vitro (пример 1), показывают, что IL21 является цитокином Тх 2. Пример 3. IL-21 специфически ингибирует продукцию ИФН в развивающихся клетках Тх. Поскольку IL-21 обладает сходством профиля экспрессии в клетках Тх и структурным сходством сIL-4, определяли способность IL-21, так же как IL-4, непосредственно влиять на дифференцировку клеток Тх. Чтобы определить эффект IL-21 на дифференцировку Тхп, клетки Тхп культивировались при нейтральных условиях и в условиях направленной дифференцировки в Тх 1 и Тх 2. Очищенные исходные клетки Тхп подвергали первичному воздействию антигена при нейтральных условиях и в условиях направленной дифференцировки в Тх 1 и Тх 2 в присутствии и в отсутствие IL-21. Цитокиновый потенциал этих клеток оценивали с помощью внутриклеточного окрашивания цитокинов- 20011686 через неделю в культуре. Результаты показаны на фиг. 2 А и 2 В. Для получения показанных на фиг. 2 А результатов клетки культивировались в присутствии IL-21 или в пустом супернатанте. Продукция цитокинов оценивалась через неделю с помощью внутриклеточного окрашивания цитокинов в течение 4 ч после рестимуляции с помощью ФМА/иономицина. Результаты представляют по меньшей мере десять экспериментов. Как и в случае IL-4, добавление IL-21 к нейтральной культуре и культуре Тх 1 приводило к значительному уменьшению числа клеток, продуцирующих ИФН (фиг. 2 А, нейтральные условия и направленная дифференцировка в Тх 1). Снижение количества клеток, продуцирующих ИФН в культуре Тх 1,подтверждено анализом с помощью ELISPOT. Однако, в отличие от того, что наблюдалось с IL-4, IL-21 сам по себе был неспособен потенцировать продукцию клеток Тх 2, продуцирующих IL-4 (фиг. 2 А, нейтральные условия). Обработка IL-21 не имела ни стимулирующего, ни ингибирующего эффекта на генерацию клеток, продуцирующих IL-4, в условиях направленной дифференцировки Тх 2 (фиг. 2 А, Тх 2). Определяли способность IL-21 влиять на продукцию ИФН в недавно стимулированных клетках Тхп. Очищенные исходные клетки Тхп культивировались в нейтральных условиях и в условиях направленной дифференцировки Тх 1 в присутствии или в отсутствие IL-21 в течение 48 ч. В полученных культуральных супернатантах с помощью ELISA проверяли продукцию ИФН. Было обнаружено, что IL-21 уменьшает количество ИФН, продуцируемого в начале дифференцировки в культуре (фиг. 2 В). Следовательно, присутствие IL-21 в период первичного воздействия антигена на клетки Тх влияет на способность и дифференцирующихся клеток Тх 1, и эффекторных клеток продуцировать ИФН. Пример 4. IL-21 непосредственно не ингибирует продукцию ИФН эффекторными клетками Тх 1. Чтобы определить, подавляет ли IL-21 продукцию IL-21 непосредственно или воздействует на дифференцировку клеток ИФН, очищенные исходные клетки Тхп культивировались в условиях направленной дифференцировки Тх 1. IL-21 или пустой супернатант добавлялся или в начале культивирования(день 0) или за 24 ч до рестимуляции и анализа (день 5). Продукция цитокинов оценивалась по внутриклеточному окрашиванию цитокинов. Результаты показаны на фиг. 3A. В отличие от наблюдавшегося, когда IL-21 добавлялся в день 0, добавление IL-21 в культуру клеток Тх 1 в конце периода дифференцировки не имело эффекта на продукцию ИФН, даже хотя клетки Тх 1 экспрессировали рецептор IL-21 и были чувствительны к IL-21. Этот факт показывает, что IL-21 ослабляет способность клеток Тхп дифференцироваться в продуцирующие ИФН клетки Тх 1, но не ингибирует непосредственно продукцию ИФН эффекторными клетками Тх 1. Пример 5. Ингибирование ИФН со стороны IL-21 не зависит от Stat6. Способность IL-4 ингибировать дифференцировку клеток Тх 1 зависит от экспрессии Stat6 (Kaplan,M.H., et al., Immunity 4:313-9, 1996, Takeda, K. et al., Nature 380: 627-30 1996, и Shimoda, K. et al., Nature 380: 630-3, 1996). Чтобы определить, зависит ли опосредованное IL-21 ингибирование продукции ИФН от Stat6, определяли способность IL-21 влиять на дифференцировку Тх 1 в клетки, у которых отсутствует Stat6. Клетки Тхп, очищенные из мыши дикого типа или из Stat6-дефицитной мыши, культивировались в течение одной недели в условиях направленной дифференцировки в Тх 1 в присутствии IL-21 или пустого супернатанта. Продукцию цитокинов оценивали по внутриклеточному окрашиванию цитокинов. Результаты показаны на фиг. 3B. В отсутствии Stat6 IL-21 был так же эффективен в предупреждении генерации клеток, продуцирующих ИФН, как в присутствии Stat6. Следовательно, в отличие от IL4, IL-21 не зависит от сигнализации Stat6 в предупреждении генерации клеток Тх 1, продуцирующих ИФН. Кроме того, эти результаты показывают, что подавление ИФН, вызванное IL-21 непосредственно не опосредовано действием IL-4. Пример 6. IL-21 не ингибирует другие цитокины Тх 1. Чтобы определить, влияет ли IL-21 на особенности развития Тх 1 помимо ингибирования продукции ИФН, проверяли способность обработанных IL-21 клеток Тх 1 продуцировать другие цитокины, связанные Тх 1. Клетки Тхп культивировались в условиях направленной дифференцировки Тх 1 в присутствии IL-21 или пустого супернатанта, после чего оценивали продукцию цитокинов с помощью внутриклеточного окрашивания после вторичной стимуляции. Результаты показаны на фиг. 3C. Удивительно, что, хотя число клеток, продуцирующих ИФН, существенно уменьшается, когда при первичном воздействии антигена присутствует IL-21, та же клеточная популяция имеет нормальное число клеток, продуцирующих ИНФ и IL-2. Эти результаты показывают,что хотя IL-21 эффективно подавляет способность клеток Тх 1 продуцировать ИФН, эти же клетки сохраняют способность продуцировать клетки Тх 1 и не прекращают продуцировать цитокины Тх 2. Пример 7. IL-21 не влияет на экспрессию T-bet.T-bet - это недавно идентифицированный фактор транскрипции, который специфически экспрессируется в дифференцирующихся клетках Тх 1 и который также способен значительно индуцировать ИФН. Чтобы определить, влияет ли обработка IL-21 дифференцирующихся клеток Тх 1 на индукцию- 21011686 экспрессии T-bet в клетках Тх, клетки Тхп культивировали в условиях направленной дифференцировки в Тх 1 или Тх 2. Белковые экстракты собирали в начале (исходные) и через 48 ч культивирования (Тх 1 и Тх 2). Экспрессию T-bet и актина определяли с помощью вестерн-блоттинга. Результаты показаны на фиг. 4 А. IL-21 или пустой супернатант добавляли в указанные культуры. Как ожидалось, экспрессия T-bet индуцировалась в культуре Тх 1 и оставалась малой в условиях направленной дифференцировки Тх 2. Внесение IL-21 не оказывало эффекта на экспрессию T-bet в клетках Тх 1. Этот результат показывает, что опосредованная IL-21 экспрессия ИФН не является результатом уменьшения экспрессии T-bet. Пример 8. IL-21 ингибирует сигнализацию IL-12. Сообщается, что сигнализация IL-12 играет важную роль в развитии клеток Тх 1. У клеток Тх, у которых отсутствует рецептор к IL-12, резко подорвана способность продуцировать ИФН (Wu, С., et al., JImmunol 159: 1658-665, 1997). Кроме того, экспрессия цепи рецептора IL-12R2 специфически снижена в развивающихся клетках Тх 2, а этот эффект опосредуется IL-4 (Szabo, S.J., et al., J Exp Med 185:817-24,1997). Чтобы определить влияет ли IL-21, так же как IL-4, на экспрессию цепи IL-12b2 в клетках Тх 1,РНК из исходных клеток Тхп культивированные в условиях направленной дифференцировки в Тх 1 и Тх 2 в присутствии и в отсутствие IL-21 анализировались на экспрессию 12R2 с помощью RT-PCR. Клетки Тхп культивировались в условиях направленной дифференцировки в Тх 1 и Тх 2 в течение одной недели.IL-21 или пустой супернатант включали в указанные культуры. РНК получали через 24 ч после вторичной стимуляции с использованием анти-CD3 и оценивали экспрессию IL-12R2 с помощью RT-PCR. Результаты показаны на фиг. 4 В. Результаты представляют три независимых эксперимента. Как ожидалось, экспрессия IL-12R2 была высока в клетках Тх 1 по сравнению с клетками Тх 2, однако, добавление IL-21 в культуру Тх 1 не влияло на экспрессию IL-12R2. Следовательно, в отличие от результатов, сообщенных о IL-4, IL-21 не вызывает снижения экспрессии IL-12R2. Далее, высокий уровень экспрессии IL-12R2, связанный с высокими уровнями TNF и IL-2, предполагает, что клетки Тх 1, обработанные IL-21, сохраняют многие характеристики Тх 1 с особым отличием в виде сниженной продукции ИФН.Stat4 специфически активируется цитокином IL-21 и, как сообщается, является критически важным посредником в генерации продуцирующих ИФН Тх 1 клеток (Wurster, A.L., et al., Oncogene 19: 2577-84,2000). Чтобы определить, влияет ли IL-21 на способность IL-12 активировать STAT-4, исходные клетки Тхп активировались в течение 48 ч в присутствии или в отсутствие IL-21. Клетки затем стимулировались с помощью IL-12, и степень фосфорилирования Stat4 определяли с помощью вестерн-блоттинга. Клетки Тхп стимулировали с помощью анти-CD3 в течение 48 ч в присутствии IL-21 или пустого супернатанта. Белковые экстракты оценивались по фосфорилированному Stat4 (p-Stat4), Stat4 и Stat1 с помощью вестерн-блоттинга. Результаты представляют четыре независимых эксперимента. Результаты показаны на фиг. 4 С. Хотя обнаружено, что клетки, обработанные IL-21, экспрессируют нормальный уровень IL-12R2, в таких клетках фосфорилирование Stat4 в ответ на стимуляцию IL-12 снижалось. Сниженный уровень фосфорилированного Stat4 также отражается в снижении общего уровня белка Stat4. Для сравнения, обработка IL-21 на белок Stat1 не влияла. Также проверяли уровень РНК Stat4. Клетки Тхп культивировали, как описано для фиг. 4 С, после чего получали РНК, и в дупликатах оценивали экспрессию Stat4 с помощью RT-PCR. Результаты показаны на фиг. 4D. Результаты представляют три независимых эксперимента. Обнаружен пониженный уровень РНК Stat4. IL-21 вызывал снижение уровня белка Stat4, вероятно, вследствие снижения уровня мРНК Stat4. Эти данные предполагают, что IL-21 препятствует реактивности развивающихся клеток Тх 1 на IL-12 вследствие уменьшения экспрессии гена Stat4. Пример 9. Сигнализация IL-21 требуется для ограничения ответа Тх 1 in vivo. Чтобы определить, играет ли роль эндогенно продуцируемый IL-21 в ограничении функции клетки Тх 1 in vivo, проверяли уровень реакция гиперчувствительности замедленного типа (DTH) у IL-21Rдефицитной мыши. DTH - это классический опосредованный клетками Тх 1 воспалительный ответ. IL21R-дефицитная мышь путем обратного скрещивания была получена так, как описано у Kasian et al., Immunity 16: 559-560, 2002. Восьминедельных самцов мышей иммунизировали подкожно 100 мг TNP-KLH(2,4,6-тринитрофенил-гемоцианином из моллюска Megatura crenulata (Keyhole Limpet; Biosearch Technologies, Novato, CA), эмульгированном в DFA, в основание хвоста. Через шесть дней мышей сенсибилизировали 50 мкг TNP-KLH в подушечку одной передней лапы и фосфатным буфером (PBS) - в контралатеральную подушечку. Толщину подушечки измеряли через 24 ч после инъекции. Результаты представлены на фиг. 5 А. Специфическое опухание подушечки у мыши дикого типа иIL-21R-дефицитной (IL-21R-/-) мыши определяли, вычитая неспецифическое опухание подушечки, вызванное инъекцией фосфатного буфера, из опухания, вызванного TNP-KLH. Каждая точка данных относится к одной мыши. Горизонтальные линии показывают средние значения. Результаты отражают выборки данных из двух независимых экспериментов. Результаты показывают, что животные дикого типа отвечают на антигенную стимуляцию сильным опуханием подушечки. Удивительно, но IL-21Rдефицитная мышь дала значительно более сильную реакцию гиперчувствительности замедленного типа(DTH), что выразилось в среднем во вдвое более сильном опухании. Также была проверена продукция ИФН у иммунизированной мыши. Результаты показаны на фиг. 5 В. Очищенные CD4+ Т-клетки из дренированных лимфатических узлов иммунизированной мыши стимулировали in vitro 250 мг/мл TNP-KLH. Супернатанты анализировали на предмет содержания ИФН с помощью ELISA. Представленные результаты - это средние данные по двум мышам каждого генотипа,выполненные в дупликатах. Повышенная реакция гиперчувствительности замедленного типа (DTH) у IL21R-дефицитных животных коррелировала со значительным повышением продукции ИФН клеткамиCD4+, очищенными из дренированных лимфатических узлов и рестимулированных антигеном in vitro. Эти результаты показывают, что IL-21 вовлечен в ограничение ответа клеток Тх 1 путем подавления продукции ИФН. Дополнительные варианты реализации находятся в рамках формулы изобретения. СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Способ ингибирования уровня -интерферона (ИФН) в Т-клетке-хелпере (Тх) или популяции Тхклеток или их предшественников, предусматривающий обеспечение контактирования указанной Тклетки или популяции Т-клеток или их предшественников с полипептидом IL-21, который содержит аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 85% идентичную последовательности SEQ IDNO:2, и который способен связываться с IL-21R, где полипептид IL-21 используют в количестве, достаточном для ингибирования ИФН в указанной Тх-клетке или популяции Тх-клеток или их предшественников. 2. Способ по п.1, дополнительно предусматривающий идентификацию Тх-клетки или популяции Тх-клеток, в которой желательно ингибирование уровней ИФН. 3. Способ стимуляции дифференцировки предшественников Т-клеток-хелперов (Тхп) или популяции Тхп-клеток в Тх 2-клетки или популяцию Тх 2-клеток, предусматривающий обеспечение контактирования указанных Тхп-клеток или популяции Тхп-клеток с полипептидом IL-21, который содержит аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 85% идентичную последовательности SEQ IDNO:2, и который способен связываться с IL-21R, где полипептид IL-21 используют в количестве, достаточном для стимуляции дифференцировки указанных Тхп-клеток или популяции Тхп-клеток в Тх 2 клетки или популяцию Тх 2-клеток.- 29011686 4. Способ по п.3, дополнительно предусматривающий идентификацию Тхп-клеток или популяции Тхп-клеток, дифференцировку которых в Тх 2-клетки или популяцию Тх 2-клеток необходимо обеспечить. 5. Способ ингибирования дифференцировки Тхп-клетки или популяции Тхп-клеток в Тх 1-клетку или популяцию Тх 1-клеток, предусматривающий обеспечение контактирования указанной Тхп-клетки или популяции Тхп-клеток с полипептидом IL-21, который содержит аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 85% идентичную последовательности SEQ ID NO:2, и который способен связываться с IL-21R, где полипептид IL-21 используют в количестве, достаточном для ингибирования дифференцировки указанной Тхп-клетки или популяции Тхп-клеток в Тх 1-клетку или популяцию Тх 1 клеток. 6. Способ по п.5, дополнительно предусматривающий идентификацию Тхп-клетки или популяции Тхп-клеток, в которых необходимо обеспечить ингибирование указанной дифференцировки. 7. Способ по любому из пп.1, 3 или 5, согласно которому полипептид IL-21 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:2. 8. Способ по любому из пп.1, 3 или 5, согласно которому стадию контактирования осуществляют exvivo, in vitro или in vivo. 9. Способ по любому из пп.1, 3 или 5, согласно которому стадию контактирования осуществляют у млекопитающего in vivo. 10. Способ по п.9, согласно которому млекопитающим является человек. 11. Способ ингибирования дифференцировки Тхп-клетки или популяции Тхп-клеток в Тх 2-клетку или популяцию Тх 2-клеток, предусматривающий обеспечение контактирования указанной Тхп-клетки или популяции Тхп-клеток с антагонистом интерлейкина-21 (IL-21)/IL-21-рецептора (IL-21R), в количестве, достаточном для ингибирования дифференцировки указанной Тхп-клетки или популяции Тхпклеток в указанную Тх 2-клетку или популяцию Тх 2-клеток, где антагонист выбран из группы, состоящей из анти-IL-21R-антитела, антигенсвязывающего фрагмента анти-IL-21R-антитела и растворимого фрагмента IL-21R. 12. Способ по п.11, дополнительно предусматривающий идентификацию Тхп-клетки или популяции Тхп-клеток, в которой необходимо обеспечить ингибирование указанной дифференцировки. 13. Способ повышения уровня -интерферона (ИФН) в Т-клетке-хелпере (Тх) или популяции Тхклеток либо их предшественников, предусматривающий обеспечение контактирования указанной Тхклетки или популяции Тх-клеток либо их предшественников с антагонистом IL-21/(IL-21R) в количестве,достаточном для повышения уровня ИФН в указанной Тх-клетке или популяции Тх-клеток либо их предшественников, где антагонист выбран из группы, состоящей из анти-IL-21R-антитела, антигенсвязывающего фрагмента анти-IL-21R-антитела и растворимого фрагмента IL-21R. 14. Способ по п.13, дополнительно предусматривающий идентификацию Тх-клетки или популяции Тх-клеток либо их предшественников, в которых необходимо обеспечить повышение уровня ИФН. 15. Способ по п.11 или 13, где растворимый фрагмент IL-21R содержит внеклеточный участок рецептора IL-21. 16. Способ по п.15, где растворимый фрагмент содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 85% идентична аминокислотам 20-235 последовательности SEQ ID NO:4 и которая способна связываться с IL-21. 17. Способ по п.15, где растворимый фрагмент содержит аминокислоты 1-235 последовательностиSEQ ID NO:4. 18. Способ по п.15, где растворимый фрагмент дополнительно содержит Fc-фрагмент. 19. Способ по п.11 или 13, где антагонист является анти-IL-21R-антителом или его антигенсвязывающим фрагментом. 20. Способ по п.12, где популяция Т-клеток включает в себя по меньшей мере одну Тх 1-клетку. 21. Способ по п.11 или 13, где стадию контактирования выполняют ex vivo, in vitro или in vivo. 22. Способ по п.21, согласно которому стадию контактирования осуществляют у млекопитающегоin vivo. 23. Способ по п.22, где млекопитающим является человек.