Моноклональное антитело человека к cd40 и способы его применения

Формула / Реферат | Похожие патенты | МПК / Метки | Текст | Код ссылки

Номер патента: 11449

Опубликовано: 27.02.2009

Авторы: Джиа Ксиао-Чи, Глэйдью Роналд П., Фенг Ксиао, Корвалан Хосе, Бедиан Вахе

Скачать PDF файл.

Формула / Реферат

1. Человеческое моноклональное антитело или его антигенсвязывающий участок, которые специфически связываются с CD40, причем указанное антитело или его антигенсвязывающая часть являются агонистом CD40, и антитело содержит тяжелую цепь и легкую цепь, при этом аминокислотные последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 указанной тяжелой цепи и аминокислотные последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 указанной легкой цепи выбраны из группы, состоящей из:

(a) аминокислотных последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3 вариабельного домена тяжелой цепи с последовательностью SEQ ID NO: 2 и аминокислотных последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3 вариабельного домена легкой цепи с последовательностью SEQ ID NO: 4 соответственно;

(b) аминокислотных последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3 вариабельного домена тяжелой цепи с последовательностью SEQ ID NO: 2 и аминокислотных последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3 вариабельного домена легкой цепи с последовательностью SEQ ID NO: 94 соответственно;

(c) аминокислотных последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3 вариабельного домена тяжелой цепи с последовательностью SEQ ID NO: 90 и аминокислотных последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3 вариабельного домена легкой цепи с последовательностью SEQ ID NO: 4 соответственно;

(d) аминокислотных последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3 вариабельного домена тяжелой цепи с последовательностью SEQ ID NO: 90 и аминокислотных последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3 вариабельного домена легкой цепи с последовательностью SEQ ID NO: 94 соответственно;

(e) аминокислотных последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3 вариабельного домена тяжелой цепи с последовательностью SEQ ID NO: 92 и аминокислотных последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3 вариабельного домена легкой цепи с последовательностью SEQ ID NO: 4 соответственно;

(f) аминокислотных последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3 вариабельного домена тяжелой цепи с последовательностью SEQ ID NO: 92 и аминокислотных последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3 вариабельного домена легкой цепи с последовательностью SEQ ID NO: 94 соответственно;

(g) аминокислотных последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3 вариабельного домена тяжелой цепи с последовательностью SEQ ID NO: 10 и аминокислотных последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3 вариабельного домена легкой цепи с последовательностью SEQ ID NO: 12 соответственно;

(h) аминокислотных последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3 вариабельного домена тяжелой цепи с последовательностью SEQ ID NO: 18 и аминокислотных последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3 вариабельного домена легкой цепи с последовательностью SEQ ID NO: 20 соответственно;

(i) аминокислотных последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3 вариабельного домена тяжелой цепи с последовательностью SEQ ID NO: 26 и аминокислотных последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3 вариабельного домена легкой цепи с последовательностью SEQ ID NO: 28 соответственно;

(j) аминокислотных последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3 вариабельного домена тяжелой цепи с последовательностью SEQ ID NO: 34 и аминокислотных последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3 вариабельного домена легкой цепи с последовательностью SEQ ID NO: 36 соответственно;

(k) аминокислотных последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3 вариабельного домена тяжелой цепи с последовательностью SEQ ID NO: 42 и аминокислотных последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3 вариабельного домена легкой цепи с последовательностью SEQ ID NO: 44 соответственно;

(l) аминокислотных последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3 вариабельного домена тяжелой цепи с последовательностью SEQ ID NO: 50 и аминокислотных последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3 вариабельного домена легкой цепи с последовательностью SEQ ID NO: 52 соответственно;

(m) аминокислотных последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3 вариабельного домена тяжелой цепи с последовательностью SEQ ID NO: 96 и аминокислотных последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3 вариабельного домена легкой цепи с последовательностью SEQ ID NO: 52 соответственно;

(n) аминокислотных последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3 вариабельного домена тяжелой цепи с последовательностью SEQ ID NO: 58 и аминокислотных последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3 вариабельного домена легкой цепи с последовательностью SEQ ID NO: 60 соответственно;

(o) аминокислотных последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3 вариабельного домена тяжелой цепи с последовательностью SEQ ID NO: 66 и аминокислотных последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3 вариабельного домена легкой цепи с последовательностью SEQ ID NO: 68 соответственно;

(p) аминокислотных последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3 вариабельного домена тяжелой цепи с последовательностью SEQ ID NO: 66 и аминокислотных последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3 вариабельного домена легкой цепи с последовательностью SEQ ID NO: 100 соответственно;

(q) аминокислотных последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3 вариабельного домена тяжелой цепи с последовательностью SEQ ID NO: 98 и аминокислотных последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3 вариабельного домена легкой цепи с последовательностью SEQ ID NO: 68 соответственно;

(r) аминокислотных последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3 вариабельного домена тяжелой цепи с последовательностью SEQ ID NO: 98 и аминокислотных последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3 вариабельного домена легкой цепи с последовательностью SEQ ID NO: 100 соответственно;

(s) аминокислотных последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3 вариабельного домена тяжелой цепи с последовательностью SEQ ID NO: 74 и аминокислотных последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3 вариабельного домена легкой цепи с последовательностью SEQ ID NO: 76 соответственно и

(t) аминокислотных последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3 вариабельного домена тяжелой цепи с последовательностью SEQ ID NO: 82 и аминокислотных последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3 вариабельного домена легкой цепи с последовательностью SEQ ID NO: 84 соответственно.

2. Моноклональное антитело или его антигенсвязывающий участок по п.1, которые обладают по меньшей мере одним из следующих свойств:

(a) не связываются с мышиными, крысиными, собачьими и/или кроличьими В-клетками;

(b) связываются с В-клетками человека, макаков-резус и/или обезьян циномолгус;

(c) обладают селективностью в отношении CD40, которая по меньшей мере в 100 раз выше, чем их селективность в отношении рецепторного активатора ядерного фактора каппа-цепи В-клеток (RANK), 4-1BB (CD137), рецептора 1 фактора некроза опухоли (TNFR-1) и рецептора 2 фактора некроза опухоли (TNFR-2);

(d) связываются с CD40 с K_D 4_10^-10 М или менее;

(e) имеют показатель для CD40 K_off, составляющий 2_10^-4 или менее;

(f) ингибируют рост опухоли in vivo в присутствии Т-клеток человека и/или дендритных клеток человека;

(g) ингибируют рост CD40-положительных опухолей в отсутствие иммунных клеток человека;

(h) повышают экспрессию ICAM, MHC-II, B7-2, CD71, CD23 и/или CD71 на поверхности В-клеток человека;

(i) увеличивают секрецию IL-12p40, IL-12p70 и/или IL-8 дендритными клетками человека;

(j) увеличивают экспрессию ICAM, MHC-II, B7-2 и/или CD83 на поверхности дендритных клеток человека;

(k) повышают экспрессию гамма-интерферона Т-клетками человека во время их аллогенной стимуляции;

(l) связывают человеческий CD40 в присутствии человеческого CD40L;

(m) связываются с эпитопом CD40 человека, который находится в пределах домена 1 или домена 2 внеклеточного домена CD40; и

(n) связываются с эпитопом CD40 человека, который находится в пределах домена 2 или домена 3 внеклеточного домена CD40.

3. Моноклональное антитело по п.1, в котором аминокислотные последовательности тяжелой цепи и легкой цепи выбраны из группы, состоящей из:

(a) аминокислотной последовательности тяжелой цепи и аминокислотной последовательности легкой цепи моноклонального антитела 3.1.1, причем в обеих указанных аминокислотных последовательностях отсутствует сигнальная последовательность;

(b) аминокислотной последовательности тяжелой цепи и аминокислотэющ последовательности легкой цепи моноклонального антитела 7.1.2, причем в обеих указанных аминокислотных последовательностях отсутствует сигнальная последовательность;

(c) аминокислотной последовательности тяжелой цепи и аминокислотной последовательности легкой цепи моноклонального антитела 10.8.3, причем в обеих указанных аминокислотных последовательностях отсутствует сигнальная последовательность;

(d) аминокислотной последовательности тяжелой цепи и аминокислотной последовательности легкой цепи моноклонального антитела 15.1.1, причем в обеих указанных аминокислотных последовательностях отсутствует сигнальная последовательность;

(e) аминокислотной последовательности тяжелой цепи и аминокислотной последовательности легкой цепи моноклонального антитела 21.4.1, причем в обеих указанных аминокислотных последовательностях отсутствует сигнальная последовательность;

(f) аминокислотной последовательности тяжелой цепи и аминокислотной последовательности легкой цепи моноклонального антитела 21.2.1, причем в обеих указанных аминокислотных последовательностях отсутствует сигнальная последовательность;

(g) аминокислотной последовательности тяжелой цепи и аминокислотной последовательности легкой цепи моноклонального антитела 22.1.1, причем в обеих указанных аминокислотных последовательностях отсутствует сигнальная последовательность;

(h) аминокислотной последовательности тяжелой цепи и аминокислотной последовательности легкой цепи моноклонального антитела 22.1.1Н-С109А, причем в обеих указанных аминокислотных последовательностях отсутствует сигнальная последовательность;

(i) аминокислотной последовательности тяжелой цепи и аминокислотной последовательности легкой цепи моноклонального антитела 23.5.1, причем в обеих указанных аминокислотных последовательностях отсутствует сигнальная последовательность;

(j) аминокислотной последовательности тяжелой цепи и аминокислотной последовательности легкой цепи моноклонального антитела 23.25.1, причем в обеих указанных аминокислотных последовательностях отсутствует сигнальная последовательность;

(k) аминокислотной последовательности тяжелой цепи и аминокислотной последовательности легкой цепи моноклонального антитела 23.28.1, причем в обеих указанных аминокислотных последовательностях отсутствует сигнальная последовательность;

(l) аминокислотной последовательности тяжелой цепи и аминокислотной последовательности легкой цепи моноклонального антитела 23.28.1L-C92A, причем в обеих указанных аминокислотных последовательностях отсутствует сигнальная последовательность;

(m) аминокислотной последовательности тяжелой цепи и аминокислотной последовательности легкой цепи моноклонального антитела 23.28.1H-D16E, причем в обеих указанных аминокислотных последовательностях отсутствует сигнальная последовательность;

(n) аминокислотной последовательности тяжелой цепи и аминокислотной последовательности легкой цепи моноклонального антитела 23.29.1, причем в обеих указанных аминокислотных последовательностях отсутствует сигнальная последовательность;

(о) аминокислотной последовательности тяжелой цепи и аминокислотной последовательности легкой цепи моноклонального антитела 24.2.1, причем в обеих указанных аминокислотных последовательностях отсутствует сигнальная последовательность;

(р) аминокислотной последовательности тяжелой цепи и аминокислотной последовательности легкой цепи моноклонального антитела 3.1.1Н-А78Т, причем в обеих указанных аминокислотных последовательностях отсутствует сигнальная последовательность;

(q) аминокислотной последовательности тяжелой цепи и аминокислотной последовательности легкой цепи моноклонального антитела 3.1.1H-A78T-V88A-V97A, причем в обеих указанных аминокислотных последовательностях отсутствует сигнальная последовательность;

(r) аминокислотной последовательности тяжелой цепи и аминокислотной последовательности легкой цепи моноклонального антитела 3.1.1L-L4M-L83V, причем в обеих указанных аминокислотных последовательностях отсутствует сигнальная последовательность;

(s) аминокислотной последовательности тяжелой цепи и аминокислотной последовательности легкой цепи моноклонального антитела 3.1.1H-A78T-V88A-V97A/3.1.1L-L4M-L83V, причем в обеих указанных аминокислотных последовательностях отсутствует сигнальная последовательность;

(t) аминокислотной последовательности тяжелой цепи и аминокислотной последовательности легкой цепи моноклонального антитела 23.29.1L-R174K, причем в обеих указанных аминокислотных последовательностях отсутствует сигнальная последовательность; и

(u) аминокислотной последовательности тяжелой цепи и аминокислотной последовательности легкой цепи моноклонального антитела 23.28.1H-D16E/23.28.1L-C92A, причем в обеих указанных аминокислотных последовательностях отсутствует сигнальная последовательность.

4. Моноклональное антитело или его антигенсвязывающий участок по п.1, в которых аминокислотные последовательности вариабельного домена указанной тяжелой цепи и вариабельного домена указанной легкой цепи выбраны из группы, состоящей из:

(а) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2 и аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 4 соответственно;

(b) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2 и аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 94 соответственно;

(d) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 90 и аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 94 соответственно;

(e) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 92 и аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 4 соответственно;

(f) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 92 и аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 94 соответственно;

(g) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 10 и аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 12 соответственно;

(h) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 18 и аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 20 соответственно;

(i) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 26 и аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 28 соответственно;

(j) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 34 и аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 36 соответственно;

(k) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 42 и аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 44 соответственно;

(l) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 50 и аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 52 соответственно;

(m) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 96 и аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 52 соответственно;

(n) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 58 и аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 60 соответственно;

(о) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 66 и аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 68 соответственно;

(р) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 66 и аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 100 соответственно;

(q) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 98 и аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 68 соответственно;

(r) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 98 и аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 100 соответственно;

(s) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 74 и аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 76 соответственно и

(t) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 82 и аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 84 соответственно.

5. Моноклональное антитело по п.1, в котором аминокислотные последовательности тяжелой цепи и легкой цепи выбраны из группы, состоящей из:

(a) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 6 и аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 8 соответственно, причем в обеих указанных аминокислотных последовательностях отсутствует сигнальная последовательность;

(b) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 14 и аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 16 соответственно, причем в обеих указанных аминокислотных последовательностях отсутствухт сигнальная последовательность;

(c) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 22 и аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 24 соответственно, причем обе аминокислотные последовательности без сигнальной последовательности;

(d) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 30 и аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 32 соответственно, причем в обеих указанных аминокислотных последовательностях отсутствует сигнальная последовательность;

(е) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 38 и аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 40 соответственно, причем обе аминокислотные последовательности без сигнальной последовательности;

(f) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 46 и аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 48 соответственно, причем в обеих указанных аминокислотных последовательностях отсутствует сигнальная последовательность;

(g) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 54 и аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 56 соответственно, причем в обеих указанных аминокислотных последовательностях отсутствует сигнальная последовательность;

(h) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 62 и аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 64 соответственно, причем в обеих указанных аминокислотных последовательностях отсутствует сигнальная последовательность;

(i) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 70 и аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 72 соответственно, причем в обеих указанных аминокислотных последовательностях отсутствует сигнальная последовательность;

(j) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 78 и аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 80 соответственно, причем в обеих указанных аминокислотных последовательностях отсутствует сигнальная последовательность;

(k) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 86 и аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 88 соответственно, причем в обеих указанных аминокислотных последовательностях отсутствует сигнальная последовательность.

6. Моноклональное антитело по п.5, содержащее:

(a) аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6 без сигнальной последовательности, в которой остаток 78 зрелой последовательности изменен с аланина на треонин, остаток 88 зрелой последовательности изменен с валина на аланин и остаток 97 зрелой последовательности изменен с валина на аланин, и

(b) аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8 без сигнальной последовательности, в которой остаток 4 зрелой последовательности изменен с лейцина на метионин, а остаток 83 зрелой последовательности изменен с лейцина на валин.

7. Моноклональное антитело по п.5, содержащее:

(a) аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 46 без сигнальной последовательности и

(b) аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 48 без сигнальной последовательности.

8. Фармацевтическая композиция, содержащая антитело или его антигенсвязывающий участок по любому из пп.1-7 и фармацевтически приемлемый носитель.

9. Применение антитела или его антигенсвязывающего участка по любому из пп.1-7 для производства лекарственного средства для лечения злокачественной опухоли у человека.

10. Применение антитела или антигенсвязывающего участка по любому из пп.1-7 для производства лекарственного средства для усиления иммунного ответа у человека.

11. Выделенная клеточная линия, которая продуцирует антитело или его антигенсвязывающий участок по любому из пп.1-7 либо тяжелую цепь или легкую цепь указанного антитела или его антигенсвязывающий участок.

12. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты, которая содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую тяжелую цепь или ее антигенсвязывающий участок или легкую цепь или ее антигенсвязывающий участок антитела или его антигенсвязывающий участок по любому из пп.1-7.

13. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты по п.12, содержащая нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из:

(а) нуклеотидной последовательности, кодирующей аминокислотную последовательность тяжелой цепи (или ее антигенсвязывающего участка) антитела, выбранного из группы, состоящей из 3.1.1, 3.1.1Н-А78Т, 3.1.1H-A78T-V88A-V97A, 3.1.1L-L4M-L83V, 3.1.1H-A78T-V88A-V97A/3.1.1L-L4M-L83V, 7.1.2, 10.8.3, 15.1.1, 21.4.1, 21.2.1, 22.1.1, 22.1.1Н-С109А, 23.5.1, 23.25.1, 23.28.1, 23.28.1L-C92A, 23.28.1H-D16E, 23.28H-D16E/23.28.1L-C92A, 23.28.1L-C92A, 23.29.1, 23.29.1L-R174K и 24.2.1, или указанную аминокислотную последовательность, не содержащую сигнальную последовательность;

(b) нуклеотидной последовательности, кодирующей аминокислотную последовательность легкой цепи (или ее антигенсвязывающего участка) антитела, выбранного из группы, состоящей из 3.1.1, 3.1.1Н-А78Т, 3.1.1H-A78T-V88A-V97A, 3.1.1L-L4M-L83V, 3.1.1H-A78T-V88A-V97A/3.1.1L-L4M-L83V, 7.1.2, 10.8.3, 15.1.1, 21.4.1, 21.2.1, 22.1.1, 22.1.1Н-С109А, 23.5.1, 23.25.1, 23.28.1, 23.28.1L-C92A, 23.28.1H-D16E, 23.28H-D16E/23.28.1L-С92А, 23.28.1L-C92A, 23.29.1, 23.29.1L-R174K и 24.2.1, или указанную аминокислотную последовательность, не содержащую сигнальную последовательность;

(c) нуклеотидной последовательности, кодирующей аминокислотную последовательность тяжелой цепи или ее вариабельный домен, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2, 6, 10, 14, 18, 22, 26, 30, 34, 38, 42, 46, 50, 54, 58, 62, 66, 70, 74, 78, 82, 86, 90, 92, 96 и 98, или указанные аминокислотные последовательности, не содержащие сигнальной последовательности, если она присутствует;

d) нуклеотидной последовательности, кодирующей тяжелую цепь или ее вариабельный домен, причем указанная нуклеотидная последовательность выбрана из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1, 5, 9, 13, 17, 21, 25, 29, 33, 37, 41, 45, 49, 53, 57, 61, 65, 69, 73, 77, 81, 85, 89, 91, 95 и 97, или указанная последовательность не содержит сигнальной последовательности, если она присутствует;

(e) нуклеотидной последовательности, кодирующей аминокислотную последовательность легкой цепи или ее вариабельный домен, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44, 48, 52, 56, 60, 64, 68, 72, 76, 80, 84, 88, 94, 100 и 102, или указанную аминокислотную последовательность, не содержащую сигнальной последовательности; и

f) нуклеотидной последовательности, кодирующей легкую цепь или ее вариабельный домен, причем указанная нуклеотидная последовательность выбрана из группы, состоящей из SEQ ID NO: 3, 7, 11, 15, 19, 23, 27, 31, 35, 39, 43, 47, 51, 55, 59, 63, 67, 71, 75, 79, 83, 87, 93, 99 и 101, или указанная последовательность не содержит сигнальной последовательности, если она присутствует.

14. Вектор, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты по п.12 или 13, где указанный вектор необязательно содержит контролирующую экспрессию последовательность, оперативно связанную с молекулой нуклеиновой кислоты.

15. Клетка-хозяин, содержащая вектор по п.14 или молекулу нуклеиновой кислоты по п.13.

16. Способ получения анти-CD40-антитела или его антигенсвязывающего участка, предусматривающий культивирование клетки-хозяина по п.15 или клеточной линии по п.11 в соответствующих условиях и выделение указанного антитела или его антигенсвязывающего участка.

17. Применение антитела по п.1 для производства лекарственного средства для лечения CD40-отрицательной опухоли у человека.

Текст

Смотреть все

011449 Заявка на данный патент претендует на приоритет по предварительной заявке США 60/348980,поданной 9 ноября 2001 г. Характеристика известного уровня техники Антиген CD40 представляет собой гликопротеин клеточной поверхности в 50 кДа, который относится к семейству рецепторов фактора некроза опухолей (TNF-R). (Stamenkovic et al., EMBO J. 8:1403-10(1989. CD40 экспрессируется во многих типах нормальных и опухолевых клеток, включая Влимфоциты, дендритные клетки, моноциты, макрофаги, эпителий вилочковой железы, эндотелиальные клетки, фибробласты и клетки гладкой мускулатуры. (Paulie S. et al., Cancer Immunol. Immunother. 20:238 (1985); Banchereau J. et al., Adv. Exp. Med.Biol. 378:79-83 (1995); Alderson M.R. et al., J. of Exp. Med. 178:669-74 (1993); Ruggiero G. et al., J. of Immunol. 156:3737-46 (1996); Hollenbaugh D. et al., J. of Exp.Immunol. 161:3120-7 (1998. CD40 экспрессируется во всех В-лимфомах и в 70% всех солидных опухолей. Несмотря на конститутивную экспрессию, CD40 хорошо регулируется в антигенпрезентирующих клетках с помощью сигналов созревания, таких как LPS, IL-1, IFN- и GM-CSF. Активация CD40 играет решающую роль в регуляции гуморального и клеточного иммунных ответов. Антигенная презентация без активации CD40 может привести к толерантности, а CD40 сигнализация может способствовать обратимости такой толерантности, усилить антигенную презентацию с помощью всех антигенпрезентирующих клеток (АПК), привести к секреции хелперных цитокинов и хемокинов, повысить экспрессию костимулирующих молекул и передачу сигналов, а также стимулировать цитолитическую активность иммунных клеток.CD40 играет ключевую роль в пролиферации В-клеток, созревании и переключении класса иммуноглобулинов. (Foy T.M. et al., Ann. Rev. of Immunol. 14:591-617 (1996. Нарушение сигнального путиCD40 ведет к аномальному распределению изотипов сывороточного иммуноглобулина, к отсутствиюCD4+-Т-клеточного примирования и к дефектам вторичных гуморальных ответов. Например, Хсцепленный синдром избыточного образования IgM представляет собой заболевание, связанное с мутацией у человека гена CD40L, которое характеризуется неспособностью пораженных индивидов вырабатывать антитела, отличные от IgM-изотопа, и свидетельствующее о том, что для эффективного иммунного ответа необходимо продуктивное взаимодействие между CD40 и CD40L. Захват CD40 с помощью CD40L приводит к ассоциации цитоплазматического домена CD40 с TRAFet al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:9437-42 (1996); Pullen S.S. et al., J. of Biol. Chem. 274:14246-54 (1999. Такое взаимодействие с TRAF может завершать активацию обоих путей - NFB и Jun/AP1. (Tsukamoto N.et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:1234-9 (1999); Sutherland C.L. et al., J. of Immunol. 162:4720-30 (1999. В зависимости от типа клеток, данная сигнализация приводит к усилению секреции цитокинов, таких как(1999, IL-15 (Kuniyoshi J.S. et al., Cellular Immunol. 193:48-58 (1999 и хемокинов (MIP1, MIP1,RANTES и другие) (McDyer J.F. et al., J. of Immunol. 162:3711-7 (1999); Schaniel C. et al., J. of Exp. Med. 188:451-63 (1998); Altenburg A. et al., J. of Immunol. 162:4140-7 (1999); Deckers J.G. et al., J. of the Am. Society of Nephrology 9:1187-93 (1998, повышает экспрессию МНС класса I и II (Santos-Argumedo L. et al.,Cellular Immunol. 156:272-85 (1994, и повышает экспрессию адгезивных молекул (например, ICAM)et al., J. of Immunol. 155:4917-25 (1995. Цитокины индуцировали в результате захвата CD40, что повышает выживаемость и активацию Т-клеток. Помимо усиления клеточной и иммунной функции, эффекты CD40-активации включают в себя рекрутинг клеток и их дифференцировку с помощью хемокинов и цитокинов; активацию моноцитов,повышение цитолитической активности цитолитических Т-лимфоцитов (CTL) и природных киллерных(NK) клеток; индукцию апоптоза в CD40-позитивных злокачественных опухолях; усиление иммуногенности CD40-позитивных злокачественных опухолей; и образование антител, специфичных в отношении злокачественных опухолей. Установлена также роль CD40-активации в опосредованных клеткой иммунных ответах, которая рассматривается у Grewall et al., Ann. Rev. of Immunol. 16:111-35 (1998); Mackey et-1 011449 Исследования с использованием модельной системы перекрестного примирования показывают, чтоCD40-активация АПК может заменить потребность в хелперных Т-клетках, необходимых для образования цитолитических Т-лимфоцитов (CTL). (Bennett et al., Nature 393:478-480 (1998. Данные, полученные на мышах с недостатком CD40L, свидетельствуют о явной потребности в CD40-сигналах для инициации хелперных Т-клеток. (Grewal I.S. et al., Science 273:1864-7 (1996); Grewal I.S. et al., Nature 378:617-20 (1995. CD40-активация преобразует в противном случае толерогенные, антиген несущие Вклетки в компетентные АПК. (Buhlmann J.E. et al., Immunity 2:645-53 (1995. CD40-активация индуцирует созревание и дифференцировку клеток-предшественников пуповинной крови в дендритные клетки.(1998. CD40-активация индуцирует также дифференцировку моноцитов в функциональные дендритные клетки. (Brossart P. et al., Blood 92:4238-47 (1998. Кроме того, CD40-активация повышает цитолитическую активность NK-клеток с помощью АПК-CD40 индуцированных цитокинов. (Carbone E. et al., J. ofExp. Med. 185:2053-60 (1997); Martin-Fontecha A. et al., J. of Immunol. 162:5910-6 (1999. Данные наблюдения свидетельствуют о том, что CD40 играет существенную роль в инициации и усилении иммунных ответов путем индукции созревания АПК, секреции хелперных цитокинов, улучшенной регуляции костимулирующих молекул, а также в усилении эффекторных функций. Ключевая роль CD40-сигналов в инициации и развитии гуморального и цитотоксического иммунных ответов делает данную систему идеальной мишенью для иммунного усиления. Такое усиление может быть особенно важным для поддержания эффективных иммунных ответов на антигены злокачественных опухолей, которые, как правило, представляются иммунной системе через примирование перекрестнореагирующим антигеном активированных АПК. (Huang A.Y. et al., Ciba Foundation Symp. 187:229-44 (1994); Toes R.E.M. et al., Seminars in Immunol. 10:443-8 (1998); Albert M.L. et al., Nature 392:8 6-9 (1998); Bennett S.R. et al., J. of Exp. Med. 186:65-70 (1997. Несколько групп исследователей продемонстрировали эффективность CD40-активации в отношении противоопухолевых ответов in vitro и in vivo (Toes R.E.M. et al., Seminars in Immunol. 10:443-8(1998. Две группы исследователей, используя модель легочных метастазов почечно-клеточной карциномы и подкожные опухоли, вызванные с помощью трансформированных вирусом клеток, независимо показали, что активация CD40 может обратить толерантность к опухолеспецифичным антигенам, вызывая эффективную противоопухолевую инициацию Т-клеток. (Sotomayor Е.М. et al., Nature Medicine 5:780-787 (1999); Diehl L. et al., Nature Medicine 5:774-9 (1999. О противоопухолевой активности в отсутствие иммунных клеток сообщается также для обработанной с помощью CD40L и антитела к CD40 модельной линии злокачественных клеток молочной железы человека у SCID-мышей (Hirano A. et al.,Blood 93:2999-3007 (1999. На мышиных моделях недавно показана ликвидация лимфом CD40+ и CD40 в результате CD40-активации с помощью антител к CD40. (French R.R. et al., Nature Medicine 5:548-53(1999. Более того, в предыдущих исследованиях Glennie и соавторов сделан вывод о том, что сигнальная активность антител к CD40 более эффективна для индукции клиренса опухоли in vivo, чем сигнальная активность других антител к поверхностным маркерам, способных вызывать рекрутинг эффекторов.(Tutt A.L. et al., J. of Immunol. 161:3176-85 (1998. Согласно этим наблюдениям, при тестировании антитела к CD40 на активность против CD40+-злокачественных клеток in vivo в большинстве случаев, хоть и не всегда, туморицидная активность ассоциируется скорее с CD40-сигналом, чем с ADCC. (Funakoshi S.et al., J. of Immunotherapy with Emphasis on Tumor Immunol. 19:93-101 (1996. В другом исследовании дендритные клетки костного мозга обрабатывали ex vivo различными агентами, и тестировали in vivo противоопухолевую активность. Эти исследования показали, что ДК, стимулированные CD40L, являются наиболее зрелыми и наиболее эффективными клетками, повышающими противоопухолевый ответ. Существенная роль CD40 в противоопухолевом иммунитете показана также при сравнении ответов на противоопухолевые вакцины у мышей дикого типа и у мышей CD40-/-. Эти исследования показали,что мыши CD40-/- не способны реализовать противоопухолевый иммунитет, присущий нормальным мышам. (Mackey M.F. et al., Cancer Research 57:2569-74 (1997. В другом исследовании спленоциты мышей, носителей опухоли, стимулированные опухолевыми клетками и обработанные активирующими exvivo антителами к CD40, показали повышенную опухолеспецифичную CTL-активность. (Donepudi M. etal., Cancer Immunol. Immunother. 48:153-164 (1999. Эти исследования показали, что CD40 занимает ключевую позицию в противоопухолевом иммунитете, как в позитивных, так и в негативных по CD40 злокачественных опухолях. Поскольку CD40 экспрессируется в лимфомах, лейкозах, множественной миеломе, в большинстве карцином носоглотки, мочевого пузыря, яичника и печени, а также в некоторых карциномах молочной железы и прямой кишки, активация CD40 может иметь широкий диапазон клинического применения. Активация моноклональных антител к CD40 может способствовать ликвидации злокачественной опухоли с помощью нескольких важных механизмов. Первый из них заключается в активации хозяйских дендритных клеток для усиления процессинга опухолевого антигена и его презентации, а также повышения антигенной презентации или иммуногенности самих опухолевых CD40-позитивных клеток, что приводит к активации опухолеспецифичных CD4+- и CD8+-лимфоцитов. Дополнительная противоопухолевая активность может быть опосредована иными усиливающими иммунитет эффектами CD40-сигналов(выработка хемокинов и цитокинов, набор и активирование моноцитов, повышение CTL- и NKцитолитической активности), а также прямым уничтожением CD40+-опухолей в результате индукции апоптоза или путем стимуляции гуморального ответа, приводящего к ADCC. Клетки апоптозной и погибающей опухоли могут также являться важным источником опухолеспецифичных антигенов, которые процессируются и презентируются АПК, активированными CD40. В соответствии с изложенным существует острая необходимость в терапевтических, клинически пригодных антител против CD40-агонистов. Краткое описание чертежей На фиг. 1 А-1 Н представлены выравнивания предсказанных аминокислотных последовательностей для выделенных вариабельных доменов легкой и тяжелой цепей моноклонального антитела к CD40 с аминокислотными последовательностями соответствующих легкой и тяжелой цепей генов зародышевой линии. Различия между клонами и соответствующей последовательностью зародышевой линии оттенены. Последовательности зародышевых линий CDR1, CDR2 и CDR3 подчеркнуты. В выровненных последовательностях тяжелой цепи появление инсерций на CDR3-участке в последовательности зародышевой линии указаны знаком тире (-), появление в последовательности данного клона делеции в CDR3-участке указаны знаком тире (-). Фиг. 1 А: предсказанные аминокислотные последовательности вариабельной области легкой каппацепи из монАТ 3.1.1 и 7.1.2 с Vk=A3/A19 и J=Jk1 аминокислотные последовательности гена зародышевой линии; фиг. 1 В: аминокислотные последовательности предсказанной вариабельной области легкой каппацепи из клона 15.1.1 и аминокислотная последовательность (Vk=A3/A19 и J=Jk2) клеток зародышевой линии; фиг. 1 С: аминокислотные последовательности предсказанной вариабельной области легкой каппацепи из монАТ 10.8.3 и 21.4.1 и аминокислотная последовательность (Vk=L5 (DP5) и J=Jk4) клеток зародышевой линии; фиг. 1D: аминокислотная последовательность предсказанной вариабельной области тяжелой цепи из монАТ 3.1.1 и аминокислотная последовательность (VH=3-30+ (DP-49), D=D4+DIR3 и J=JH6) клеток зародышевой линии; фиг. 1E: аминокислотная последовательность предсказанной вариабельной области тяжелой цепи из монАТ 7.1.2 и аминокислотная последовательность (VH=3-30+ (DP-49), D=DIR5+D1-26 и J=JH6) клеток зародышевой линии; фиг. 1F: аминокислотные последовательности предсказанной вариабельной области тяжелой цепи из монАТ 10.8.3 и аминокислотная последовательность (VH=4.35 (VIV-4), D=DIR3 и J=JH6) клеток зародышевой линии; фиг. 1G: аминокислотные последовательности предсказанной вариабельной области тяжелой цепи из монАТ 15.1.1 и аминокислотная последовательность (VH=4-59 (DP-71), D=D4-23 и J=JH4) клеток зародышевой линии; фиг. 1 Н: аминокислотные последовательности предсказанной вариабельной области тяжелой цепи из монАТ 21.4.1 и аминокислотная последовательность (VH=1-02 (DP-75), D=DLR1 и J=JH4) клеток зародышевой линии. На фиг. 2 А-2 Н представлено выравнивание предсказанных аминокислотных последовательностей выделенных доменов легкой и тяжелой цепи моноклонального антитела к CD40 и аминокислотных последовательностей соответствующих легкой и тяжелой цепи генов зародышевой линии. Различия между клонами и данной последовательностью зародышевой линии выделены жирным шрифтом. Последовательности клеток зародышевой линии CDR1, CDR2 и CDR3 подчеркнуты. При выравнивании последовательностей тяжелой цепи появление вставок на CDR3-участке зародышевой линии указаны знаком тире(-), появление в последовательности данного клона делеции в CDR3-участке указаны знаком тире (-). Фиг. 2 А: предсказанные аминокислотные последовательности легкой каппа-цепи из монАТ 22.1.1,23.5.1 и 23.29.1 и аминокислотная последовательность (Vk=A3/A19 и J=Jk1) клеток зародышевой линии; фиг. 2 В: предсказанные аминокислотные последовательности легкой каппа-цепи из монАТ 21.2.1 и аминокислотная последовательность (Vk=A3/A19 и J=Jk3) клеток зародышевой линии; фиг. 2 С: предсказанные аминокислотные последовательности легкой каппа-цепи из монАТ 23.28.1,23.28.1L-C92A и 24.2.1 и аминокислотная последовательность (Vk=А 27 и J=Jk3) клеток зародышевой линии; фиг. 2D: предсказанная аминокислотная последовательность тяжелой цепи из монАТ 21.2.1 и аминокислотная последовательность (VH=3-30+, D=DIR3+D6-19 и J=JH4) клеток зародышевой линии; фиг. 2 Е: предсказанная аминокислотная последовательность тяжелой цепи из монАТ 21.1.1,22.1.1 Н-С 109 А и аминокислотная последовательность (VH=3-30+, D=D1-1 и J=JH6) клеток зародышевой линии; фиг. 2F: предсказанная тяжелая цепь аминокислотной последовательности из монАТ 23.5.1 и аминокислотная последовательность (VH=3-30+, D=D4-17 и J=JH6) клеток зародышевой линии; фиг. 2G: предсказанная аминокислотная последовательность тяжелой цепи из монАТ 23.29.1 и ами-3 011449 нокислотная последовательность (VH=3-30.3, D=D4-17 и J=JH6) клеток зародышевой линии; фиг. 2 Н: предсказанные аминокислотные последовательности тяжелой цепи из монАТ 23.28.1,23.28.1H-D16E и 24.2.1 и аминокислотная последовательность клеток зародышевой линии (VH=4-59,D=DIR1+D4-17 и J=JH5). На фиг. 3 представлена кривая зависимости "доза-эффект", которая иллюстрирует способность антитела против CD40 согласно изобретению (21.4.1) повышать образование IL-12p40 дендритными клетками человека. На фиг. 4 представлена кривая зависимости "доза-эффект", которая иллюстрирует способность антитела против CD40 согласно изобретению (21.4.1) повышать образование IL-12p70 дендритными клетками человека. На фиг. 5 представлен график, который иллюстрирует способность антитела против CD40 согласно изобретению (21.4.1) повышать иммуногенность стимулирующих клеток Jy и усиливать CTL-активность против клеток-мишеней Jy. На фиг. 6 представлена кривая ингибирования роста злокачественной опухоли, которая иллюстрирует снижение роста позитивных по CD40 злокачественных опухолей Daudi у SCID-beige мышей, обработанных антителом к CD40 (21.4.1) согласно изобретению. На фиг. 7 представлена кривая ингибирования роста злокачественной опухоли, которая иллюстрирует снижение роста негативных по CD40 злокачественных опухолей K562 у мышей SCID-beige, обработанных антителом к CD40 (21.4.1) согласно изобретению и дендритными клетками человека, а также Тклетками. На фиг. 8 показано ингибирование роста негативных по CD40 злокачественных опухолей K562 уSCID-мышей разными концентрациями агониста монАТ 23.29.1 к CD40. На фиг. 9 показано ингибирование роста негативных по CD40 злокачественных опухолей K562 разными концентрациями агониста монАТ 3.1.1 к CD40. На фиг. 10 показано ингибирование роста позитивных по CD40 злокачественных опухолей Raji в присутствии или отсутствие Т-клеток и дендритных клеток у SCID-мышей с помощью агониста монАТ кCD40. На фиг. 11 показано ингибирование роста позитивных по CD40 злокачественных опухолей Raji уSCID-мышей с помощью агониста антител к CD40. На фиг. 12 показано ингибирование роста клеток ВТ 474 злокачественной опухоли молочной железы у мышей SCID-beige с помощью агониста антител к CD40. На фиг. 13 показано ингибирование роста злокачественных опухолей РС-3 предстательной железы у мышей SCID-beige с помощью агониста антител к CD40. На фиг. 14 представлена кривая выживаемости для мышей SCID-beige, инъецированных (iv) злокачественными клетками Daudi и обработанных агонистом антител к CD40. На фиг. 15 представлен Вестерн-блот-анализ к CD40-агонисту антител для редуцированного (R) и нередуцированного (NR) CD40 человека. На фиг. 16 представлены результаты выравнивания D1-D4-доменов CD40 мыши и человека. На фиг. 17 представлены результаты выравнивания аминокислотных последовательностей CD40 мыши и человека, демонстрирующих положение сайтов слияния в данных химерах. На фиг. 18 схематически представлена группа диаграмм для химерных CD40-конструкций. Краткое изложение существа изобретения В настоящем изобретении представлено выделенное антитело или его антигенсвязывающая часть,которые связывает CD40 и действуют в качестве CD40-агониста. В настоящем изобретении представлена композиция, содержащая антитело к CD40 или его антигенсвязывающую часть, и фармацевтически приемлемый носитель. Кроме того, созданная композиция может включать в себя второй компонент, такой как противоопухолевый агент или визуализирующий агент. В настоящем изобретении разработаны также диагностические и терапевтические способы. В настоящем изобретении представлена выделенная клеточная линия, такая как гибридома, которая производит антитело к CD40 или его антигенсвязывающую часть. В настоящем изобретении представлены также молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие тяжелую и/или легкую цепь антитела к CD40 или его антигенсвязывающую часть. В настоящем изобретении представлены векторы и хозяйские клетки, содержащие молекулы нуклеиновых кислот, а также способы рекомбинантного получения полипептидов, кодируемых молекулами нуклеиновых кислот. Предусмотрены также не принадлежащие человеческому роду трансгенные животные, которые экспрессируют тяжелую и/или легкую цепь антитела к CD40 или его антигенсвязывающую часть. В настоящем изобретении разработан также способ лечения пациента, нуждающегося в этом, эффективным количеством молекул нуклеиновой кислоты, кодирующей тяжелую и/или легкую цепь антитела к CD40 или его антигенсвязывающую часть.-4 011449 Подробное описание изобретения Определения и общие методики. За исключением особо оговоренных случаев, научные и технические термины, используемые в связи с настоящим изобретением, подразумевают их обычное понимание рядовыми специалистами в данной области. Кроме того, если не оговорено в контексте, употребление терминов в единственном числе подразумевает также и множественное толкование, и наоборот. Вообще терминология и методы, используемые применительно к культуре клеток и культуре тканей, к молекулярной биологии, иммунологии, микробиологии, генетике, а также к белковой химии и химии нуклеиновых кислот и описанной здесь гибридизации, представляют собой хорошо известную терминологию и методы, обычно используемые в данной области. Способы и методы настоящего изобретения, как правило, осуществляют в соответствии с традиционными способами, хорошо известными в данной области, а также описанными в разных общих и более конкретных ссылках, которые цитируются и обсуждаются в настоящем описании, если не указано иначе. См., например, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989) и Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, GreeneLaboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1990), которые включены здесь путем ссылки. Ферментативные реакции и методы выделения очисткой осуществляют в соответствии с предписаниями производителей, как обычно принято в данной области или как описано здесь. Терминология, используемая в этой связи, а также лабораторные операции и методы аналитической химии, синтетической органической химии, а также медицинской и фармацевтической химии, описываемые здесь, относятся к лабораторным операциям и методам, хорошо известным и обычно используемым в данной области. Стандартные методы используют для химического синтеза, химического анализа, для получения фармацевтического препарата, в технологии приготовления лекарственного средства, а также для доставки и лечения пациентов. Если не указано иначе, нижеследующие термины имеют следующие значения. Термин "полипептид" подразумевает природные или синтетические белки, белковые фрагменты и полипептидные аналоги белковой последовательности. Полипептид может быть мономерным или полимерным. Термин "выделенный белок", "выделенный полипептид" или "выделенное антитело" представляет собой белок, полипептид или антитело, которое в силу своего происхождения или источника получения(1) не ассоциируется с естественно связанными компонентами, которые сопровождают его в своем нативном состоянии, (2) свободно от других белков из одних и тех же видов, (3) экспрессируется клетками разных видов или (4) не встречается в природе. Таким образом, полипептид, который химически синтезирован или синтезирован в клеточной системе, отличной от клетки, из которой он естественным образом произошел, должен быть "выделенным" из своих естественно связанных компонентов. Любой белок можно также практически освободить от естественно связанных компонентов путем выделения, применяя методы выделения очистки белка, хорошо известные в данной области. Примеры выделенных антител включают в себя антитело к CD40, которое выделяют путем очистки по сродству с использованием CD40, антитело к CD40, которое синтезируют с помощью гибридомной или иной линии клеток in vitro, и антитело человека к CD40, получаемое из трансгенной мыши. Белок или полипептид является "практически чистым", "практически гомогенным" или "практически очищенным", если по меньшей мере около 60-75% образца представлено одним видом полипептида. Данный белок или полипептид может быть мономерным или мультимерным. Практически чистый полипептид или белок обычно содержит около 50, 60, 70, 80 или 90% мас./мас. белкового образца, чаще около 95% и предпочтительно свыше 99% чистоты. Степень очистки белка или степень гомогенности можно показать несколькими способами, хорошо известными в данной области, такими как электрофорез белкового образца в полиакриламидном геле с последующей визуализацией одиночной полипептидной полосы после окраски геля красителем, хорошо известным в данной области. Для некоторых целей, что касается выделения очисткой, высокое разрешение можно получить путем использования ВЭЖХ или иными способами, хорошо известными в данной области. Используемый здесь термин "полипептидный фрагмент" относится к полипептиду, который имеет аминоконцевую и/или карбоксиконцевую делецию, а остальная аминокислотная последовательность идентична по соответствующим положениям встречающейся в природе последовательности. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения длина фрагментов составляет по меньшей мере 5,6, 8 или 10 аминокислот. В других вариантах осуществления настоящего изобретения длина фрагментов составляет по меньшей мере 14, по меньшей мере 20, по меньшей мере 50 или по меньшей мере 70, 80,90, 100, 150 или 200 аминокислот. Используемый здесь термин "полипептидный аналог" относится к полипептиду, который включает в себя сегмент, практически идентичный части аминокислотной последовательности и который обладает,по меньшей мере, следующими характеристиками:(3) способен хорошо регулировать экспрессию молекул на поверхности клетки, таких как ICAM,МНС-II, В 7-1, В 7-2, CD71, CD23 и CD83, или(4) способен повышать секрецию цитокинов, таких как IFN-1, IL-2, IL-8, IL-12, IL-15, IL-18 и IL23. Как правило, полипептидные аналоги включают в себя консервативную аминокислотную замену(или вставку, или делецию) во встречающейся в природе последовательности. Как правило, аналоги содержат в длину по меньшей мере 20 или 25 аминокислот, предпочтительно по меньшей мере 50, 60, 70,80, 90, 100, 150 или 200 аминокислот или больше, и часто могут обладать такой же длиной, как и естественно встречающийся полноразмерный полипептид. Предпочтительными аминокислотными заменами являются те, которые:(1) уменьшают чувствительность к протеолизу,(2) уменьшают чувствительность к окислению,(3) изменяют сродство к связыванию при образовании белковых комплексов и(4) придают или модифицируют другие физикохимические или функциональные характеристики таких аналогов. Аналоги могут содержать различные изменения последовательности, отличающиеся от изменений в естественно встречающейся пептидной последовательности. Например, одиночную или множественные аминокислотные замены (предпочтительно консервативные аминокислотные замены) можно создать в естественно встречающейся последовательности (предпочтительно на участке полипептида, находящемся вне домена(ов), образующего межмолекулярные контакты). Консервативная аминокислотная замена не должна существенно изменять структурные характеристики родительской последовательности (например, замена аминокислоты не должна приводить к разрушению спирали, которая существует в данной родительской последовательности, или разрушать другие виды вторичной структуры, которая характеризует данную родительскую последовательность). Примеры общеизвестных вторичных и третичных полипептидных структур описаны в Proteins, Structures and Molecular Principles (Creighton, Ed., W.H.Freeman and Company, New York (1984; Introduction to Protein Structure (C. Branden and J. Tooze, eds.,Garland Publishing, New York, N.Y. (1991; and Thornton et al., Nature 354:105 (1991), каждая из которых включена в данное описание путем ссылки. Непептидные аналоги обычно используют в фармацевтической промышленности в виде лекарственных средств с характеристиками, аналогичными характеристикам данного матриксного пептида. Данные виды непептидного фармацевтического соединения называют "пептидными миметиками" илиEvans et al., J. Med. Chem. 30:1229 (1987), включены здесь путем ссылки. Такие соединения часто создают с помощью компьютерного молекулярного моделирования. Пептидные миметики, которые структурно сходны с терапевтически пригодными пептидами, можно использовать для получения эквивалентного терапевтического или профилактического эффекта. Вообще пептидомиметики структурно сходны с образцовым полипептидом (т.е. полипептидом, который обладает требуемым биохимическим свойством или фармакологической активностью), таким как антитело человека, но обладает одним или несколькими пептидными связями, необязательно замещенными связью, выбранной из группы, состоящей из-CH2NH-, -CH2S-, CH2-CH2-, -CH=CH-(цис и транс), -COCH2-, -CH(OH)CH2- и -CH2SO-, способами, хорошо известными в данной области. Для получения более стабильных пептидов можно также использовать системную замену одной или нескольких аминокислот консенсусной последовательности Dаминокислотой такого же типа (например, D-лизин вместо L-лизина). Кроме того, связанные пептиды,содержащие консенсусную последовательность или практически идентичную вариацию консенсусной последовательности, можно получить способами, хорошо известными в данной области (Rizo andGierasch, Ann. Rev. Biochem. 61:387 (1992), включены сюда в виде ссылки); например, путем добавления внутренних цистеиновых остатков, способных образовывать межмолекулярные дисульфидные мостики,которые циклизуют данный пептид."Антитело" относится к полному антителу или к его антигенсвязывающему участку, которые конкурируют с интактным антителом за специфическое связывание. См., главным образом, Fundamental Immunology, Ch. 7 (Paul, W., ed., 2nd ed. Raven Press, N.Y. (1989 (включенную во всей полноте для всех целей). Антигенсвязывающие участки можно получить с помощью методов рекомбинантной ДНК или путем ферментативного или химического расщепления интактных антител. Антигенсвязывающие участки включают в себя, в частности, Fab, Fab', F(ab')2, Fd, Fv, dAb и фрагменты, определяющие участок комплементарности (CDR), одноцепочечные антитела (scFv), химерные антитела, диательца и полипептиды,которые содержат, по меньшей мере, участок антитела, который достаточен для придания специфичности связывания антигена с данным полипептидом. От N-конца до С-конца вариабельные домены тяжелой и легкой цепи включают в себя участки FR1,CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 и FR4. Отнесение аминокислот к каждому из доменов производят в соответствии с определениями Kabat, Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of-6 011449 Здесь антитело, которое обозначается числом, представляет собой моноклональное антитело, которое получено из гибридомы с тем же числом. Например, моноклональное антитело 3.1.1 получают из гибридомы 3.1.1. Здесь Fd-фрагмент означает фрагмент антитела, который состоит из доменов VH и CH 1; Fvфрагмент состоит из доменов VL и VH одноплечевого антитела; и dAb-фрагмент (Ward et al., Nature 341:544-546 (1989, который состоит из VH-домена. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения данное антитело представляет собой одноцепочечное антитело (scFv), в котором домены VL и VH спарены с помощью синтетического линкера с образованием моновалентных молекул, что позволяет им образовывать одноцепочечный белок. (Bird et al., Science 242:423-426 (1988) и Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883 (1988. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения данные антитела представляют собой диательца, т.е. представляют собой бивалентные антитела, в которых домены VH и VL экспрессируются в одной полипептидной цепи, но использующие линкер, который слишком короток, чтобы позволить образовать пару между этими двумя доменами в этой же цепи, тем самым вынуждая эти домены образовывать пару с комплементарными доменами другой цепи и создавая два антигенсвязывающих сайта (см.,например, Holliger P. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448 (1993) и Poljak R.J. et al., Structure 2:1121-1123 (1994. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения один или несколькоCDR антитела согласно изобретению могут быть ковалентно или нековалентно включены в молекулу с превращением ее в иммуноадгезин, который специфически связывается с CD40. В таких вариантах осуществления настоящего изобретения CDR может встраиваться в качестве участка большей полипептидной цепи, может ковалентно присоединяться к другой полипептидной цепи или может встраиваться нековалентно. В вариантах осуществления настоящего изобретения с одним или несколькими связывающими сайтами эти связывающие сайты могут быть идентичны друг другу, а могут быть и разными. В качестве используемого здесь термин "антитело человека" подразумевает любое антитело, в котором все вариабельные и константные доменные последовательности представляют собой последовательности человека. Данные антитела можно получить разнообразными способами, как описано ниже. Используемый здесь термин "химерное антитело" подразумевает антитело, которое содержит области из двух или нескольких разных антител. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения один или несколько CDR получают из антитела человека к CD40. В другом варианте осуществления настоящего изобретения все указанные CDR получают из антитела человека к CD40. В другом варианте осуществления настоящего изобретения указанные CDR из более чем одного антитела человека кCD40 объединяют в химерное антитело. Например, химерное антитело может включать в себя CDR1 легкой цепи первого антитела человека к CD40, CDR2 легкой цепи второго антитела человека к CD40, а также CDR3 и CDR3 легкой цепи третьего антитела человека к CD40, a CDR из тяжелой цепи можно получить из одного или нескольких других антител к CD40. Кроме того, каркасные области можно получить из одних и тех же антител к CD40 или из одного или нескольких разных антител человека."Активирующее антитело" (именуемое также здесь "агонист антитела"), использование которого подразумевает антитело, которое при добавлении к клетке, ткани или организму, экспрессирующимCD40, повышает одну или несколько активностей CD40 по меньшей мере приблизительно на 20%. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения данное антитело активирует CD40 активность по меньшей мере на 40, 50, 60, 70, 80, 85%. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения активирующее антитело добавляют в присутствии CD40L. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения активность активирующего антитела измеряют с использованием анализа повышающей регуляции молекулярной поверхности клеток цельной крови. См. пример VII. В другом варианте осуществления настоящего изобретения активность активирующего антитела измеряют с использованием анализа дендритных клеток для измерения высвобождения IL-12. См. пример VIII. В другом варианте осуществления настоящего изобретения активность активирующего антитела измеряют с использованием in vivo-модели злокачественной опухоли. См. пример X. Фрагменты или аналоги антител или иммуноглобулиновых молекул могут легко получить рядовые специалисты в данной области, следуя указаниям данного описания. Предпочтительны амино- и карбоксиконцевые фрагменты или аналоги, встречающиеся вблизи границ функциональных доменов. Структурные и функциональные домены можно идентифицировать путем сравнения нуклеотидной и/или аминокислотной последовательности с последовательностью, опубликованной или зарегистрированной в базах данных. Для идентификации мотивов последовательности или предсказанной белковой конформации доменов, которые встречаются в белках известной структуры и/или функции, предпочтительно используют методы компьютерного сравнения. Способы идентификации белковых последовательностей,которые упакованы в известную трехмерную структуру, известны. См. Bowie et al., Science 253:164(1991). Используемый здесь термин "поверхностный плазмонный резонанс" относится к оптическому феномену, который позволяет анализировать в реальном времени биоспецифичные взаимодействия путем детектирования изменений концентрации белка в биосенсорной матрице, например, с использованиемJonsson B. et al., J. Mol. Recognit. 8:125-131 (1995); и Johnsson B. et al., Anal. Biochem. 198:268-277 (1991). Термин "KD" относится к константе диссоциации конкретного взаимодействия антиген-антитело. Термин "эпитоп" включает в себя любую белковую детерминанту, способную специфически связываться с иммуноглобулином или Т-клеточным рецептором. Эпитопные детерминанты обычно состоят из химически активных сгруппированных на поверхности молекул, таких как аминокислоты или сахарные боковые цепочки, и обычно обладают специфичными трехмерными структурными характеристиками, а также определенными значениями заряда. Считается, что антитело специфически связывает антиген при константе диссоциации 1 мкМ, предпочтительно 100 нМ и наиболее предпочтительно 10 нМ. Используемые здесь двадцать стандартных аминокислот и их аббревиатуры соответствуют общепринятому использованию. См. Immunology - A Synthesis (2nd Edition, E.S.Golub and D.R.Gren, Eds.,Sinauer Associates, Sunderland, Mass. (1991, которая включена здесь путем ссылки. Приводимый здесь термин "полинуклеотид" подразумевает полимерную форму нуклеотидов, состоящую по меньшей мере из 10 оснований в длину, любых рибонуклеотидов или дезоксинуклеотидов,либо модифицированную форму, состоящую из нуклеотидов любого типа. Данный термин включает в себя одноцепочечные и двухцепочечные формы. Используемый здесь термин "выделенный полинуклеотид" подразумевает полинуклеотид геномного, кДНК-го или синтетического происхождения или их некоторую комбинацию, который в силу того,что он является "выделенным полинуклеотидом" (1), не связывается со всеми или с частью полинуклеотидов, с которыми "выделенный полинуклеотид" обнаруживается в природе, (2) присоединяется путем сшивки к полинуклеотиду, с которым в природе он не связывается, или (3) не встречается в природе в виде части большей последовательности. Используемый здесь термин "олигонуклеотид" включает в себя естественно встречающиеся и модифицированные нуклеотиды, соединенные вместе с помощью естественно встречающихся или не встречающихся в природе олигонуклеотидных связей. Олигонуклеотиды представляют собой полинуклеотидную подгруппу, как правило, длиной в 200 оснований или меньше. Предпочтительно олигонуклеотиды содержат 10-60 оснований и наиболее предпочтительно 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20-40 оснований. Олигонуклеотиды, как правило, являются одноцепочечными, например, праймеры и зонды; хотя олигонуклеотиды могут быть и двухцепочечными,например, для использования в конструировании генного мутанта. Олигонуклеотиды согласно изобретению могут представлять собой либо смысловые, либо антисмысловые олигонуклеотиды. Используемый здесь термин "естественно встречающиеся олигонуклеотиды" включают в себя дезоксирибонуклеотиды и рибонуклеотиды. Используемый здесь термин "модифицированные нуклеотиды" включают в себя нуклеотиды с модифицированными или замещенными сахарными группами и т.п. Приводимый здесь термин "олигонуклеотидные связи" включает в себя олигонуклеотидные связи, такие как тиофосфатная, дитиофосфатная, фосфоселеноатная, фосфодиселеноатная, фосфоанилотиоатная, фосфоаниладатная, фосфоамидатная и т.п. См., например, LaPlanche et al., Nucl. Acids Res. 14:9081 (1986); Stec etEckstein, Ed., Oxford University Press, Oxford England (1991; патент США 5151510; Uhlmann and Peyman, Chemical Reviews 90:543 (1990), раскрытие которых включено тем самым путем ссылки. При необходимости, олигонуклеотид может включать метку для детектирования. Последовательности, "присоединенные путем сшивки", включают в себя и экспрессирующие контрольные последовательности, которые соприкасаются с представляющим интерес геном, и экспрессирующие контрольные последовательности для контроля за интересующим геном и которые действуют в транс-положении или на расстоянии. Используемый здесь термин "экспрессирующая контрольная последовательность" подразумевает полинуклеотидные последовательности, которые необходимы для воздействия на экспрессию и процессинг кодирующих последовательностей, с которыми они лигированы. Экспрессирующие контрольные последовательности включают в себя соответствующие последовательности инициации транскрипции, терминации, промоторную и энхансерную последовательности; эффективные сигналы процессинга РНК, такие как сигналы сплайсинга и полиаденилирования; последовательности, которые стабилизируют цитоплазматическую мРНК; последовательности, которые повышают эффективность трансляции (т.е. консенсусную Козак-последовательность); последовательности, которые повышают стабильность белка; и, при необходимости, последовательности, которые повышают секрецию белка. Природа таких контрольных последовательностей различна и зависит от организма хозяина; у прокариот такие контрольные последовательности, как правило, содержат промотор, сайт связывания рибосом, и последовательность терминации транскрипции; у эукариот, как правило, такие контрольные последовательности включают в себя промоторы и последовательность терминации транскрипции. Термин "контрольные последовательности" подразумевает включение, как минимум, всех компонентов,присутствие которых существенно для экспрессии и процессинга, и может также включать в себя дополнительные компоненты, присутствие которых создает преимущество, например, лидерные последова-8 011449 тельности и последовательности партнеров слияния. Используемый здесь термин "вектор" подразумевает молекулу нуклеиновой кислоты, способную переносить другую нуклеиновую кислоту, к которой она прикреплена. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения вектор представляет собой плазмиду, т.е. кольцевую двухцепочечную ДНК-петлю, в которую могут быть лигированы дополнительные ДНК-сегменты. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения вектор представляет собой вирусный вектор, в вирусный геном которого могут быть дополнительно лигированы ДНК-сегменты. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения векторы могут автономно реплицироваться в клетке-хозяине, в которую они интродуцированы (например, бактериальные векторы, обладающие бактериальным ориджином репликации или эписомные векторы млекопитающих). В других вариантах осуществления настоящего изобретения векторы (например, неэписомные векторы млекопитающих) могут интегрироваться в геном клеткихозяина после внедрения в хозяйскую клетку и, таким образом, реплицироваться одновременно с хозяйским геномом. Вместе с тем, некоторые векторы способны управлять экспрессией генов, к которым они присоединены путем сшивки. Такие векторы именуют здесь "рекомбинантные экспрессирующие векторы" (или просто "экспрессирующие векторы"). Используемый здесь термин "рекомбинантная клетка-хозяин" (или просто "клетка-хозяин") подразумевает клетку, в которую внедрен рекомбинантный экспрессирующий вектор. Следует иметь в виду,что "рекомбинантная клетка-хозяин" и "клетка-хозяин" подразумевает не только отдельную клетку пациента, но также и потомство такой клетки. Поскольку из-за какой-либо мутации или влияния окружающей среды в последующих поколениях могут происходить некоторые модификации, то такое потомство в действительности не может быть идентично родительской клетке, но все же его включают в рамки используемого здесь термина "клетка-хозяин". Приводимый здесь термин "селективно гибридизуется" подразумевает обнаружение и специфическое связывание. Полинуклеотиды, олигонуклеотиды и их фрагменты в соответствии с настоящим изобретением селективно гибридизуются с цепями нуклеиновой кислоты в условиях гибридизации и отмывки, которые минимизируют существенный уровень детектируемого связывания с неспецифическими нуклеиновыми кислотами. "Очень жесткие" или "исключительно жесткие" условия можно использовать для осуществления условий селективной гибридизации, которые известны в данной области и рассматриваются здесь. Один из примеров "очень жестких" или "исключительно жестких" условий представляет собой инкубацию полинуклеотида с другим полинуклеотидом, где один из полинуклеотидов может быть прикреплен к твердой поверхности, такой как мембрана, в гибридизационном буфере, состоящем из 6 ХSSPE или SSC, 50% формамида, 5 Х раствора Денхардта, 0,5% SDS, 100 мкг/мл денатурированной, фрагментированной ДНК спермы лосося, при температуре гибридизации 42 С в течение 12-16 ч, с последующей двукратной отмывкой при 55 С с использованием буфера для отмывки, состоящего из 1X SSC,0,5% SDS. См. также Sambrook et al., выше, pp. 9.50-9.55. Термин "процентная идентичность последовательности" применительно к последовательностям нуклеиновой кислоты подразумевает нуклеотидные остатки в двух последовательностях, которые одинаковы при выравнивании на максимальное соответствие. Длина идентичной сравниваемой последовательности может быть удлинена по меньшей мере почти на девять нуклеотидов, как правило, по меньшей мере почти на 18 нуклеотидов, в большинстве случаев, как правило, по меньшей мере почти на 24 нуклеотида, обычно по меньшей мере почти на 28 нуклеотидов, чаще по меньшей мере почти на 32 нуклеотида и предпочтительно по меньшей мере почти на 36, 48 или более нуклеотидов. Существует ряд различных алгоритмов, известных в данной области, которые можно использовать для измерения идентичности нуклеотидной последовательности. Например, полинуклеотидные последовательности можно сравнивать с использованием FASTA, Gap или Bestfit, которые представляют собой программы в Wisconsin Package Version 10.0, Genetics Computer Group (GCG), Madison, Wisconsin. FASTA, которая включает в себя, например, программы FASTA2 и FASTA3, производит выравнивания и определяет процентную идентичность областей с наилучшим перекрыванием между запрашиваемой и исследуемой последовательностями (Pearson, Methods Enzymol. 183:63-98 (1990); Pearson, Methods Mol. Biol. 132:185-219(2000); Pearson, Methods Enzymol. 266:227-258 (1996); Pearson, J. Mol. Biol. 276:71-84 (1998); включенные здесь путем ссылки). Если не оговорено иначе, используют параметры по умолчанию для конкретной программы или алгоритма. Например, процентную идентичность между последовательностями нуклеиновых кислот можно определить с использованием FASTA и ее параметрами по умолчанию (размер слова из 6 и NOPAM-фактор для матрицы оценок) или с использованием GAP и его параметров по умолчанию, которые разработаны для GCG Version 6.1, включенные здесь путем ссылки. Ссылка на нуклеотидную последовательность включает в себя комплементарную ей последовательность, если не оговорено иначе. Таким образом, следует иметь в виду, что ссылка на нуклеиновую кислоту, обладающую конкретной последовательностью, относится также к комплементарной ей цепи и ее комплементарной последовательности. В молекулярной биологии исследователи используют взаимозаменяемые термины "процентная идентичность последовательности", "процентное сходство последовательности" и "процентная гомоло-9 011449 гия последовательности". В данном патенте эти термины имеют то же значение и относятся только к последовательностям нуклеиновых кислот. Термин "существенно сходный" или "существенно сходная последовательность" в отношении нуклеиновой кислоты или ее фрагмента означает, что оптимальное выравнивание, при соответствующем числе нуклеотидных вставок или делеций, с другой нуклеиновой кислотой (или с ее комплементарной цепью), означает идентичность нуклеотидной последовательности по меньшей мере на 85%, предпочтительно по меньшей мере почти на 90% и наиболее предпочтительно по меньшей мере почти на 95, 96, 97,98 или 99% нуклеотидных оснований, и это измеряется с помощью хорошо известного алгоритма идентичности последовательностей, такого как FASTA, BLAST или Gap, рассматриваемого выше. Применительно к полипептидам термин "существенно идентичный" подразумевает, что две пептидные последовательности при оптимальном выравнивании с помощью таких программ как GAP илиBESTFIT, использующих по умолчанию взвешенные пробелы, обладают по меньшей мере 70-, 75- или 80-процентной идентичностью последовательностей, предпочтительно по меньшей мере 90- или 95 процентной идентичностью последовательностей и наиболее предпочтительно по меньшей мере 97-, 98 или 99-процентной идентичностью последовательностей. Предпочтительно остальные неидентичные позиции отличаются по консервативным аминокислотным заменам. "Консервативная аминокислотная замена" представляет собой замену, в которой аминокислотный остаток замещается другим аминокислотным остатком, обладающим боковой цепью в виде R-группы, с аналогичными химическими характеристиками (например, зарядом или гидрофобностью). В целом, консервативная аминокислотная замена не должна существенно изменять функциональные характеристики белка. В случае, когда две или более аминокислотные последовательности отличаются друг от друга консервативными аминокислотными заменами, процентная идентичность последовательности или степень сходства может быть повышена введением поправок на консервативную природу данной замены. Способы такого повышения хорошо известны специалистам в данной области. См., например, Pearson, methods Mol. Biol. 243:307-31 (1994). Примеры аминокислотных групп, которые обладают боковыми цепями со сходными химическими характеристиками, включают в себя: 1) алифатические боковые цепи: глицин, аланин, валин, лейцин и изолейцин; 2) алифатические с гидроксильной группой боковые цепи: серин и треонин; 3) амидсодержащие боковые цепи: аспарагин и глутамин; 4) ароматические боковые цепи: фенилаланин, тирозин и триптофан; 5) основные боковые цепи: лизин, аргинин и гистидин; 6) кислотные боковые цепи: аспарагиновая и глутаминовая кислота; и 7) серосодержащие боковые цепи: цистеин и метионин. Предпочтительные аминокислотные группы с консервативными заменами представляют собой валин-лейцин-изолейцин,фенилаланин-тирозин, лизин-аргинин, аланин-валин, глутамин-аспарагиновая кислота и аспарагинглутамин. В качестве альтернативы, консервативная замена представляет собой любое изменение, обладающее положительной величиной в логарифмической матрице правдоподобия РАМ 250, раскрытой у Gonnet et al., Science 256:1443-45 (1992), включенной здесь путем ссылки. "Умеренно консервативная" замена представляет собой любое изменение, обладающее неотрицательной величиной в логарифмической матрице правдоподобия РАМ 250. Сходство последовательностей полипептидов, которое также именуют идентичностью последовательностей, как правило, измеряют с использованием программ анализа последовательности. Белковая аналитическая программа сопоставляет сходные последовательности с использованием измерения сходства, выравниваемые по разным заменам, делециям и иным модификациям, в том числе и консервативным аминокислотным заменам. Например, GCG содержит программы, такие как "Gap" и "Bestfit", которые можно использовать с параметрами по умолчанию для определения гомологии последовательностей или идентичности последовательностей между близкородственными полипептидами, такими как гомологичные полипептиды разных видов организмов или между белком дикого типа и его мутантом. См.,например, GCG Version 6.1. Полипептидные последовательности можно также сравнивать с помощьюFASTA, используя параметры по умолчанию или рекомендуемые параметры, программа для GCG Version 6.1. FASTA (например, FASTA2 и FASTA3) обеспечивает выравнивание и процентную идентичность последовательности в областях наилучшего перекрывания между запрашиваемой и исследуемой последовательностями (Pearson, Methods Enzymol. 183:63-98 (1990); Pearson, Methods Mol. Biol. 132:185219 (2000. Другой предпочтительный алгоритм для сравнения последовательности согласно изобретению с базой данных, содержащей большое число последовательностей из разных организмов, представляет собой компьютерная программа BLAST, в частности, blastp или blastn, с использованием параметров по умолчанию. См., например, Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990); Altschul et al., NucleicAcids Res. 25:3389-402 (1997); включенные здесь путем ссылки. Длины полипептидных последовательностей, сравниваемых на предмет гомологии, составляет, как правило, по меньшей мере около 16 аминокислотных остатков, обычно по меньшей мере около 20 остатков, чаще обычно по меньшей мере около 24 остатков, обычно, как правило, по меньшей мере около 28 остатков и предпочтительно свыше около 35 остатков. Если поисковая база данных содержит последовательности большого числа разных организмов, она является предпочтительной для сравнения аминокислотных последовательностей.- 10011449 Используемые здесь термины "метка" или "меченый" относятся к внедрению другой молекулы в данное антитело. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения метка представляет собой детектируемый маркер, например, включенную в аминокислоту радиоактивную метку или присоединенную к полипептиду биотинилированную составляющую, которая может обнаруживаться с помощью маркируемого авидина (например, стрептавидина, содержащего флуоресцентный маркер или ферментативную активность, которую можно детектировать оптическим или колориметрическим способами). В другом варианте осуществления настоящего изобретения метка или маркер могут быть терапевтическими, например, лекарственным конъюгатом или токсином. В данной области известны и могут использоваться различные способы мечения полипептидов и гликопротеинов. Примеры меток для полипептидов включают в себя, не ограничиваясь ими, радиоизотопы или радионуклиды (например, 3H, 14C,15N, 35S, 90Y, 99Tc, 111In, 125I, 131I), флуоресцентные метки (например, FITC, родамин, фосфатные лантаноиды), ферментные метки (например, пероксидаза хрена, -галактозидаза, люцифераза, щелочная фосфатаза), хемилюминесцентные маркеры, биотинильные группы, предопределенные полипептидные эпитопы,узнаваемые вторичным репортером (например, лейциновая застежка парных последовательностей, связывающие сайты вторичных антител, металлосвязывающие домены, эпитопные метки), магнитные агенты, такие как хелатные соединения гадолиния, токсины, такие как коклюшный токсин, таксол, цитохалазин В, грамицидин D, этидийбромид, эметин, митомицин, этопозид, тенопозид, винкристин, винбластин,колхицин, доксорубицин, даунорубицин, дигидроксиантрациндион, митоксантрон, митрамицин, актиномицин D, 1-дегидротестостерон, глюкокортикоиды, прокаин, тетракаин, лидокаин, пропранолол и пуромицин, а также его аналоги и гомологи. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения метки присоединяют с помощью "ножки" разной длины для уменьшения возможного пространственного затруднения. Термин пациент включает человека и животных. В рамках данного описания и формулы изобретения слово "включать" или его варианты, такие как"включает" или "включающий", подразумевает включение установленного целого числа или группы чисел, а не исключение любого иного целого числа или группы целых чисел. Антитела человека к CD40 и их характеристика. Антитела человека помогают избежать некоторых проблем, связанных с ассоциацией антител, которыми обладают вариабельная и/или константная области антител животных, не являющихся человеком(например, грызунов). Такие осложнения включают в себя быстрый клиренс антител или иммунную реакцию против этого антитела. Поэтому в одном из вариантов осуществления настоящего изобретения созданы гуманизированные антитела к CD40. В другом варианте осуществления настоящего изобретения получены антитела человека к CD40. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения антитела человека к CD40 получают путем иммунизации грызуна, геном которого включает в себя гены иммуноглобулина человека, с тем, чтобы данный грызун продуцировал антитела человека. Предполагается, что антитела человека к CD40 минимизируют иммуногенность и аллергические реакции, свойственные антителам, не принадлежащим человеку, или моноклональным антителам, не производимым человеком (монАТ), и, следовательно, повышают эффективность и безопасность вводимых антител. Использование полностью человеческих антител можно рассматривать предположительно для создания существенного преимущества при лечении хронических и возвратных заболеваний человека, таких как воспаление и злокачественная опухоль, которые могут потребовать повторного введения антител. В настоящем изобретении создано одиннадцать активирующих моноклональных антител человека к CD40 (монАТ) и производящих их гибридомных клеточных линий. В табл. А приведен список идентификаторов последовательностей (SEQ ID NO:) нуклеиновых кислот, кодирующих полноразмерные тяжелые и легкие цепи (включая лидерную последовательность), соответствующие полноразмерные выведенные аминокислотные последовательности, а также нуклеотидная и выведенная на ее основе аминокислотная последовательность вариабельных областей тяжелой и легкой цепи. Кроме того, в настоящем изобретении предусмотрены монАТ 23.25.1 человека к CD40 и линия гибридомных клеток, которая их продуцирует. Кроме того, в настоящем изобретении предусмотрены варианты тяжелой и/или легкой цепи некоторых вышеперечисленных монАТ человека к CD40, содержащих одну или несколько аминокислотных замен. В настоящем изобретении созданы два варианта монАТ 3.1.1 тяжелых цепей. В одном из них 78 остаток аланина заменен на треонин, в другом 78 остаток аланина заменен на треонин, а 88 и 97 остатки валина заменены аланином. В настоящем изобретении создан также вариант монАТ 3.1.1 легкой цепи, в котором 4 остаток лейцина и 83 остаток лейцина заменены, соответственно, на метионин и валин. Сочетания измеренной тяжелой или легкой цепи с легкой или тяжелой цепью дикого типа обозначается, соответственно, как мутантная цепь. Таким образом, антитело, содержащее легкую цепь дикого типа и тяжелую цепь, включающую изменение аланина на треонин по остатку 78, обозначено в виде 3.1.1 Н-А 78 Т. Однако в других вариантах осуществления настоящего изобретения включены антитела, содержащие любое сочетание измененной тяжелой цепи и измененной легкой цепи из 3.1.1. Далее в настоящем изобретении создан вариант монАТ 22.1.1 тяжелой цепи, в которой 109 остаток цистеина заменен на аланин. Моноклональное антитело, включающее измененную тяжелую цепь и легкую цепь 22.1.1, обозначено монАТ 22.1.1 Н-С 109 А. Еще в настоящем изобретении созданы два варианта тяжелой цепи и вариант легкой цепи монАТ 23.28.1. В одном из вариантов тяжелой цепи 16 остаток аспарагиновой кислоты заменен на глутаминовую кислоту. монАТ, включающее вариантную тяжелую цепь и легкую цепь 23.28.1, обозначено 23.28.1 H-D16E. Настоящее изобретение включает также 23.28.1 вариант легкой цепи, в которой 92 остаток цистеина заменен на аланин. монАТ, включающее 23.28.1 тяжелую цепь и вариант легкой цепи, обозначено 23.28.1 L C92A. В настоящем изобретении созданы также монАТ, включающие любой из вариантов тяжелой цепи 23.28.1 с вариантом легкой цепи 23.28.1. Легкая цепь, продуцируемая гибридомой 23.29.1, содержит мутацию в константной области по остатку 174. Легкая цепь, продуцируемая данной гибридомой, в этом положении несет аргинин вместо канонического лизина. В соответствии с этим в настоящем изобретении создана также легкая цепь 23.2 9.1 с каноническим лизином по остатку 174 и монАТ, обозначенным 23.29.1L-R174K, содержащим тяжелую цепь 23.29.1 и измененную легкую цепь. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения антитело к CD40 представляет собой 3.1.1, 3.1.1 Н-А 78 Т, 3.1.1H-A78T-V88A-V97A, 3.1.1L-L4M-L83V, 7.1.2, 10.8.3, 15.1.1, 21.4.1,21.2.1, 22.1.1, 22.1.1 Н-С 109 А, 23.5.1, 23.25.1, 23.28.1, 23.28.1H-D16E, 23.28.1L-C92A, 23.29.1, 23.29.1LR174K и 24.2.1. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения антитело к CD40 содержит легкую цепь, включающую в себя аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 8, 16, 24, 32, 40, 48, 56, 64, 72, 80, 88 или 102, либо ее вариабельную область, или же кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты, выбранной из SEQ ID NO: 7, 15, 23, 31, 39, 47, 55, 63, 71, 79, 87 или 101. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения антитело к CD40 включает в себя легкую цепь, содержащую, по меньшей мере, CDR2 одного из перечисленных антител, одну из идентифицированных выше аминокислотных последовательностей (как показано на фиг. 1 А-1 С и 2 А-2 С), либо кодируемую одной из идентифицированных выше последовательностей нуклеиновой кислоты. В другом варианте осуществления настоящего изобретения данная легкая цепь дополнительно содержит CDR1 иCDR3, независимо выбранные из вариабельной области легкой цепи, которая включает в себя не более десяти аминокислот из аминокислотной последовательности, кодируемой геном зародышевой линии VkA3/A19, L5 или А 27, либо включает в себя CDR1 и CDR3, независимо выбранные из CDR1 и CDR3 (1) антитела, выбранного из 3.1.1, 3.1.1L-L4M-L83V, 7.1.2, 10.8.3, 15.1.1, 21.4.1, 21.2.1, 22.1.1, 23.5.1, 23.25.1,23.28.1, 23.28.1L-C92A, 23.29.1, 23.29.1L-R174K или 24.2.1; (2) аминокислотной последовательности SEQID NO: 4, 12, 20, 28, 36, 44, 52, 60, 68, 76, 84, 94, 100 или 102 или (3) кодируемой последовательностью нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 3, 11, 19, 27, 35, 43, 51, 59, 67, 75, 83, 93, 99 или 101. В другом предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения антитело к CD40 включает в себя тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из SEQID NO: 6, 14, 22, 30, 38, 46, 54, 62, 70, 78 или 86, либо ее вариабельную область, или кодируемую последовательностью нуклеиновой кислоты, выбранной из SEQ ID NO: 5, 13, 21, 29, 37, 45, 53, 61, 69, 77 или 85. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения антитело против CD40 включает в себя тяжелую цепь, содержащую, по меньшей мере, CDR3 одного из перечисленных антител, одну из вышеуказанных аминокислотных последовательностей (как показано на фиг. 1 А-1 С и 2 А-2 С), либо кодируемую одной из вышеуказанных последовательностей нуклеиновой кислоты. В другом варианте осуществления настоящего изобретения данная тяжелая цепь дополнительно включает CDR1 и CDR2,независимо выбранные из вариабельной области тяжелой цепи, которая включает не более восемнадцати аминокислот из аминокислотной последовательности, кодируемой геном зародышевой линии VH3-30+,4-59, 1-02, 4.35 или 3-30.3, либо включает CDR1 и CDR2, независимо выбранные из CDR1 или CDR2 (1) антитела, выбранного из 3.1.1, 3.1.1 Н-А 78 Т, 3.1.1H-A78T-V88A-V97A, 7.1.2, 10.8.3, 15.1.1, 21.4.1, 21.2.1,22.1.1, 22.1.1 Н-С 109 А, 23.5.1, 23.25.1, 23.28.1, 23.28.1H-D16E, 23.29.1 и 24.2.1; (2) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2, 10, 18, 26, 34, 42, 50, 58, 66, 74, 82, 90, 92, 96 или 98, либо (3) кодируемой последовательностью нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 1, 9, 17, 25, 33, 41, 49, 57, 65, 73, 81, 89, 91,95 или 97. В другом варианте осуществления настоящего изобретения антитело к CD40 включает в себя тяжелую цепь и легкую цепь, как указано выше. Используемое здесь антитело 3.1.1 Н-А 78 Т идентично антителу 3.1.1 за тем исключением, что остаток 78 тяжелой цепи представляет собой треонин вместо аланина. Аналогично, в антителе 3.1.1H-A78TV88A-V97A остаток 78 заменен на А, а остатки 88 и 97 заменены в данной тяжелой цепи с валина на аланин. Антитело 3.1.1L-L4M-L83V идентично антителу 3.1.1, за тем исключением, что остаток 4 представляет собой метионин вместо лейцина, а остаток 83 представляет собой в данной легкой цепи валин вместо лейцина. Антитело 22.1.1 Н-С 109 А идентично антителу 22.1.1, за тем исключением, что остаток 109 данной тяжелой цепи заменен с цистеина на аланин. Антитела 23.28.1 Н-D16E и 23.28.1L-C92A идентичны антителу 23.28.1, за тем исключением, что остаток 16 данной тяжелой цепи заменен с аспартата на глутамат, а остаток 92 данной легкой цепи заменен, соответственно, с цистеина на аланин. Антитело 23.29.1L-R174K идентично антителу 23.29.1, за тем исключением, что остаток 174 данной легкой цепи заменен с аргинина на лизин. Классы и подклассы антител к CD40. Классы и подклассы антител к CD40 можно определить любым способом, известным в данной области. Вообще класс и подкласс любого антитела можно определить с использованием антител, которые специфичны для конкретного класса и подкласса любого антитела. Такие антитела коммерчески доступны. Класс и подкласс можно определить с помощью ИФА или Вестерн-блота, также как и другими методами. В качестве альтернативы, класс и подкласс можно определить путем секвенирования всех или части константных доменов данной тяжелой и/или легкой цепей определенных антител, сравнивая их аминокислотные последовательности с известными аминокислотными последовательностями разных классов и подклассов иммуноглобулинов и определяя класс и подкласс антител. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения антитело к CD40 представляет собой моноклональное антитело. Антитело к CD40 может представлять собой молекулу IgG, IgM, IgE, IgA или IgD. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения антитело к CD40 представляет собой IgG и соответствует подклассу IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4. В другом предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения антитела к CD40 представлены подклассом IgG2. Видовая и молекулярная селективность. В другом аспекте настоящего изобретения антитела к CD40 демонстрируют и видовую, и молекулярную селективность. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения антитело к CD40 связывается с CD40 приматов и человека. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения антитело к CD40 связывается с CD40 человека, cynomolgus или резус-обезьяны. В других вариантах осуществления настоящего изобретения антитело к CD40 не связывается с CD40 мыши, крысы, собаки или кролика. Следуя указаниям настоящего описания, можно определить видовую селективность антитела к CD40, применяя способы, хорошо известные в данной области. Например, можно определить видовую селективность с использованием Вестерн-блота, FACS, ИФА или РИА. (См., например, примерIV). В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения антитело к CD40 обладает селективностью в отношении CD40, которая в 100 раз выше, чем его селективность в отношении RANK (рецепторный активатор ядерного фактора каппа-цепи В-клеток), 4-1 ВВ (CD137), TNRF-1 (Рецептор-1 Фактора Некроза Опухоли) и TNRF-2 (Рецептор-2 Фактора Некроза Опухоли). В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения антитело к CD40 не обнаруживает какого-либо существенного специфичного связывания с любым другим белком, отличающимся от CD40. Можно определить селективность антитела к CD40 в отношении CD40, используя способы, хорошо известные в данной области, сле- 13011449 дуя указаниям данного описания. Например, можно определить селективность, используя Вестерн-блот,FACS, ИФА или РИА. (См., например, пример V). Идентификация СР 40-эпитопов, распознаваемых антителом к CD40. Далее, в настоящем изобретении создано моноклональное антитело человека к CD40, которое связывает CD40 и перекрестно конкурирует, и/или связывается, с тем же эпитопом и/или связывается сCD40 с той же KD, что и антитело человека к CD40, выбранное из антител 3.1.1, 3.1.1 Н-А 78 Т, 3.1.1HA78T-V88A-V97A, 3.1.1L-L4M-L83V, 7.1.2, 10.8.3, 15.1.1, 21.4.1, 21.2.1, 22.1.1, 22.1.1 Н-С 109 А, 23.5.1,23.25.1, 23.28.1, 23.28.1H-D16E, 23.28.1L-C92A, 23.29.1, 23.29.1L-R174K или 24.2.1; или антитело человека к CD40, которое включает в себя вариабельную область тяжелой цепи, имеющей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, 10, 18, 26, 34, 42, 50, 58, 66, 74, 82, 90, 92, 96 или 98, либо антитело человека к CD40, которое включает в себя вариабельную область легкой цепи, имеющей последовательность SEQ ID NO: 4, 12, 20, 28, 36, 44, 52, 60, 68, 76, 84, 94, 100 или 102. Представляется возможным определить, действительно ли связывается антитело с одним и тем же эпитопом или перекрестно конкурирует за связывание с антителом против CD40, используя любой способ, известный в данной области. В одном из вариантов осуществления согласно изобретению можно позволить данному антителу к CD40 настоящего изобретения связать CD40 в условиях насыщения, а затем измерить способность тестируемого антитела связывать CD40. Если тестируемое антитело способно связывать CD40 одновременно с антителом к CD40, тогда это тестируемое антитело свяжется с другим эпитопом в качестве антитела к CD40. Однако если тестируемое антитело не способно одновременно связываться с CD40, тогда тестируемое антитело свяжется с тем же самым эпитопом, перекрывающимся эпитопом, или эпитопом, который находится в непосредственной близости к эпитопу, связанному антителом человека к CD40. Данный эксперимент можно осуществить с использованием ИФА, РИА, FACS или поверхностного плазмонного резонанса. (См., например, пример VI). В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения данный эксперимент осуществляют с использованием поверхностного плазмонного резонанса. В более предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения используют BIAcore. Связывание антител против CD40 с CD40 по сродству. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения антитело против CD40 связывается с CD40 с высоким сродством. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения антитело против CD40 связывается с CD40 с KD 210-8 М или с KD меньшего значения. В других предпочтительных вариантах осуществления настоящего изобретения антитело против CD40 связывается с CD40 с KD 210-9, 210-10, 4,010-11 М или с KD меньшего значения. В наиболее предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения антитело связывается с CD40 с KD 2,510-12 М или с KD меньшего значения. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения антитело связывается с CD40 практически с той же KD, что и антитело, выбранное из 3.1.1, 3.1.1 Н-А 78 Т, 3.1.1H-A78T-V88A-V97A,3.1.1L-L4M-L83V, 7.1.2, 10.8.3, 15.1.1, 21.4.1, 21.2.1, 22.1.1, 22.1.1 Н-С 109 А, 23.5.1, 23.25.1, 23.28.1,23.28.1H-D16E, 23.28.1L-C92A, 23.29.1, 23.29.1L-R174K или 24.2.1. В другом предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения антитело связывается с CD40 практически с той же KD, что и антитело, которое включает в себя CDR2 легкой цепи, и/или CDR3 тяжелой цепи антитела, выбранного из 3.1.1, 3.1.1 Н-А 78 Т, 3.1.1 Н-A78T-V88A-V97A, 3.1.1L-L4M-L83V, 7.1.2, 10.8.3, 15.1.1, 21.4.1, 21.2.1,22.1.1, 22.1.1 Н-С 109 А, 23.5.1, 23.25.1, 23.28.1, 23.28.1H-D16E, 23.28.1L-C92A, 23.29.1, 23.29.1L-R174K и 24.2.1. Еще в одном предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения антитело связывается с CD40 практически с той же KD, что и антитело, которое включает в себя вариабельную область тяжелой цепи, имеющей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, 10, 18, 26, 34, 42, 50,58, 66, 74, 82, 90, 92, 96 или 98, или которое включает в себя легкую цепь, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4, 12, 20, 28, 36, 44, 52, 60, 68, 76, 84, 94, 100 или 102. В другом предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения антитело связывается с CD40 практически с той же KD, что и антитело, которое включает в себя CDR2 вариабельной области легкой цепи,имеющей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4, 12, 20, 28, 36, 44, 52, 60, 68, 76, 84, 94, 100 или 102, либо CDR3 вариабельной области тяжелой цепи, имеющей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, 10, 18, 26, 34, 42, 50, 58, 66, 74, 82, 90, 92, 96 или 98. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения данное антитело против CD40 имеет низкую скорость диссоциации. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения антитело против CD40 имеет Koff 2,010-4 или менее. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения Koff составляет 210-7 или менее. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения Koff практически такая же, что и для описанного здесь антитела, включая антитело, выбранное из 3.1.1, 3.1.1 Н-А 78 Т, 3.1.1H-A78T-V88A-V97A, 3.1.1L-L4M-L83V, 7.1.2, 10.8.3, 15.1.1, 21.4.1, 21.2.1, 22.1.1,22.1.1 Н-С 109 А, 23.5.1, 23.25.1, 23.28.1, 23.28.1H-D16E, 23.28.1L-C92A, 23.29.1, 23.29.1L-R174K и 24.2.1. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения антитело связывается с CD40 практически с таким же значением Koff, что и у антитела, которое включает в себя CDR3 тяжелой цепи или CDR2 легкой цепи антитела, выбранного из 3.1.1, 3.1.1 Н-А 78 Т, 3.1.1H-A78T-V88A-V97A, 3.1.1L-L4M-L83V,- 14011449 7.1.2, 10.8.3, 15.1.1, 21.4.1, 21.2.1, 22.1.1, 22.1.1 Н-С 109 А, 23.5.1, 23.25.1, 23.28.1, 23.28.1H-D16E, 23.28.1LC92A, 23.29.1, 23.29.1L-R174K и 24.2.1. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения антитело связывается с CD40 практически с таким же значением Koff, что и у антитела, которое включает в себя вариабельную область тяжелой цепи, имеющей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, 10, 18, 26, 34, 42, 50, 58, 66, 74, 82, 90, 92, 96 или 98, либо которая включает в себя вариабельную область легкой цепи, имеющей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4, 12, 20, 28, 36, 44, 52,60, 68, 76, 84, 94, 100 или 102. В другом предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения антитело связывается с CD40 практически с такой же Koff, что и у антитела, которое включает в себя CDR2 вариабельной области легкой цепи, имеющей аминокислотную последовательность SEQ IDNO: 4, 12, 20, 28, 36, 44, 52, 60, 68, 76, 84, 94, 100 или 102, либо CDR3 вариабельной области тяжелой цепи, имеющей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6, 14, 22, 30, 38, 46, 54, 62, 70, 78, 86,90, 92, 96 или 98. Связывание по сродству и скорость диссоциации антитела против CD40 с CD40 можно определить любым способом, известным в данной области. Связывание по сродству можно измерить конкурентными ИФА, РИА или поверхностным плазмонным резонансом, таким как BIAcore. Скорость диссоциации можно также измерить с помощью поверхностного плазмонного резонанса. Предпочтительно, связывание по сродству и скорость диссоциации измеряют поверхностным плазмонным резонансом. Более предпочтительно связывание по сродству и скорость диссоциации измеряют с использованиемBIAcore. См., например, пример XIV. Использование генов легкой и тяжелой цепи. Антитело к CD40 согласно изобретению может включать в себя легкую каппа- или лямбда-цепь человека или аминокислотную последовательность, полученную из них. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения, включающих легкую каппа-цепь, вариабельный домен (VL) легкой цепи частично кодируется геном человека А 3/А 19 (DPK-15), L5 (DP5) или А 27 (DPK-22)Vk. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения VL антитела к CD40 содержит одну или несколько аминокислотных замен в сравнении с аминокислотной последовательностью клеток зародышевой линии. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения VL антитела к CD40 содержит 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 аминокислотных замен в сравнении с аминокислотной последовательностью клеток зародышевой линии. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения одна или несколько из этих замен клеток зародышевой линии находятся в CDR-участках легкой цепи. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения эти аминокислотные замены, по сравнению с клетками зародышевой линии, находятся в одной или в нескольких одинаковых положениях, как и замены в сравнении с клетками зародышевой линии для одного или нескольких VL антител 3.1.1, 3.1.1LL4M-L83V, 7.1.2, 10.8.3, 15.1.1, 21.4.1, 21.2.1, 22.1.1, 23.5.1, 23.25.1, 23.28.1, 23.28.1L-C92A, 23.29.1,23.29.1L-R174K и 24.2.1. Например, VL антитела к CD40 может содержать одну или несколько аминокислотных замен, в сравнении с клетками зародышевой линии, обнаруживаются в антителе 21.4.1, а другие аминокислотные замены, в сравнении с клетками зародышевой линии, обнаруживаются в антителе 10.8.3, которое использует тот же Vk-ген, что и ген антитела 21.4.1. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения аминокислотные изменения происходят в одном или нескольких одних и тех же положениях, но вызывает их иная мутация, чем в данном эталонном антителе. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения аминокислотные изменения, по сравнению с зародышевой линией, происходят в одном или нескольких одних и тех же положениях, что и в любой из VL антител 3.1.1, 3.1.1L-L4M-L83V, 7.1.2, 10.8.3, 15.1.1, 21.4.1, 21.2.1, 22.1.1, 23.5.1, 23.25.1,23.28.1, 23.28.1L-C92A, 23.29.1, 23.29.1L-R174K и 24.2.1, но данные изменения могут соответствовать консервативным аминокислотным заменам в этом положении(ях) относительно аминокислоты в эталонном антителе. Например, когда конкретное положение в одном из этих антител изменяется по отношению к клеткам зародышевой линии и представлено глутаматом, в этом положении можно консервативно заменить аспартат. Аналогично, если аминокислотное замещение в сравнении с замещением клеток зародышевой линии представлено серином, в этом положении можно консервативно заменить треонин на серин. Консервативные аминокислотные замены рассматриваются выше. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения легкая цепь антитела человека кCD40 включает в себя аминокислотную последовательность, которая представляет собой ту же аминокислотную последовательность, что и аминокислотная последовательность VL антитела 3.1.1 (SEQ IDNO: 28), 21.4.1 (SEQ ID NO:), 21.2.1 (SEQ ID NO: 36), 21.4.1 (SEQ ID NO: 44), 22.1.1 (SEQ ID NO: 52),23.5.1 (SEQ ID NO: 60), 23.28.1 (SEQ ID NO: 68), 23.28.1L-C92A (SEQ ID NO: 100), 23.29.1 (SEQ ID NO: 76), 23.29.1L-R174K (SEQ ID NO: 102) или 24.2.1 (SEQ ID NO: 84), или указанная аминокислотная последовательность имеет до 1, 2, 3, 4, 6, 8 или 10 консервативных аминокислотных замен и/или в общей сложности до 3-х неконсервативных аминокислотных замен. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения легкая цепь антитела человека кCD40 включает в себя, по меньшей мере, легкую цепь CDR2 и может также включать в себя участкиCDR1 и CDR3 в последовательности клеток зародышевой линии, как описано здесь. В другом варианте- 15011449 осуществления настоящего изобретения легкая цепь может включать CDR1 и CDR2 из антитела, независимо выбранного из 3.1.1, 3.1.1L-L4M-L83V, 7.1.2, 10.8.3, 15.1.1, 21.4.1, 21.2.1, 22.1.1, 23.5.1, 23.25.1,23.28.1, 23.28.1L-C92A, 23.29.1 и 24.2.1, или CDR-участки, каждый, обладающий менее 8, менее 6, менее 4 или менее 3 консервативных замен и/или в общей сложности тремя или менее неконсервативными аминокислотными заменами. В других вариантах осуществления настоящего изобретения легкая цепь указанного антитела к CD40 включает в себя, по меньшей мере, легкую цепь CDR2, и может также включать в себя CDR1- и CDR3-участки, каждый из которых независимо выбран из CDR1- и CDR3-участков антитела, обладающего вариабельной областью легкой цепи, содержащей аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 4, 12, 20, 28, 36, 44, 52, 60, 68, 76, 84, 94 или 100, или кодируемую молекулой нуклеиновой кислоты, выбранной из SEQ ID NO: 3, 11, 19, 27, 35, 43, 51, 59, 67, 75, 83, 93 или 99. Что касается тяжелой цепи, то в некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения вариабельная область аминокислотной последовательности тяжелой цепи частично кодируется геном человека VH 3-30+, VH 4-59, VH 1-02, VH 4.35 или VH 3-30.3. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения VH антитело к CD40 содержит одну или несколько аминокислотных замен, делеций или вставок (добавок) по сравнению с аминокислотной последовательностью клеток зародышевой линии. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения вариабельный домен тяжелой цепи содержит 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 или 18 мутаций по сравнению с аминокислотной последовательностью клеток зародышевой линии. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения мутация(ии) представляют собой неконсервативные замены по сравнению с аминокислотной последовательностью клеток зародышевой линии. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения данные мутации находятся в CDR-участках данной тяжелой цепи. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения аминокислотные изменения произведены в одном или нескольких одинаковых положениях по сравнению с мутациями в последовательности клеток зародышевой линии в любой одной или в нескольких VH антител 3.1.1, 3.1.1 Н-А 78 Т, 3.1.1 Н-A78T-V88A-V97A,7.1.2, 10.8.3, 15.1.1, 21.4.1, 21.2.1, 22.1.1, 22.1.1 Н-С 109 А, 23.5.1, 23.25.1, 23.28.1, 23.28.1H-D16E, 23.29.1 и 24.2.1. В других вариантах осуществления настоящего изобретения аминокислотные изменения происходят в одном или в нескольких одинаковых позициях, но содержат другую мутацию по сравнению с эталонным антителом. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения тяжелая цепь включает в себя аминокислотную последовательность вариабельного домена (VH) антитела 3.1.1 (SEQ ID NO: 2), 3.1.1 НА 78 Т (SEQ ID NO: 90), 3.1.1H-A78T-V88A-V97A (SEQ ID NO: 92), 7.1.2 (SEQ ID NO: 10), 10.8.3 (SEQ IDID NO: 98), 23.29.1 (SEQ ID NO: 74) и 24.2.1 (SEQ ID NO: 82) или указанную аминокислотную последовательность, обладающую до 1, 2, 3, 4, 6, 8 или 10 консервативных аминокислотных замен и/или до 3 неконсервативных аминокислотных замен. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения тяжелая цепь включает в себя тяжелую цепь CDR1-, CDR2- и CDR3-участков антитела 3.1.1, 3.1.1 Н-А 78 Т, 3.1.1H-A78T-V88A-V97A,7.1.2, 10.8.3, 15.1.1, 21.4.1, 21.2.1, 22.1.1, 22.1.1 Н-С 109 А, 23.5.1, 23.25.1, 23.28.1, 23.28.1H-D16E, 23.29.1 и 24.2.1 (как показано на фиг. 1D-1 Н или 2D-2H), или указанных CDR-участков, каждый, обладающий менее 8, менее 6, менее 4 или менее 3 консервативных аминокислотных замен или до трех или меньше неконсервативных аминокислотных замен. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения тяжелая цепь включает в себяCDR3 и может также включать CDR1- и CDR2-участки последовательности клеток зародышевой линии,как описано выше, или может включать CDR1 и CDR2 антитела, каждое из которых независимо выбрано из антитела, включающего в себя тяжелую цепь антитела, выбранного из 3.1.1, 3.1.1 Н-А 78 Т, 3.1.1 НA78T-V88A-V97A, 7.1.2, 10.8.3, 15.1.1, 21.4.1, 21.2.1, 22.1.1, 22.1.1 Н-С 109 А, 23.5.1, 23.25.1, 23.28.1,23.28.1H-D16E, 23.29.1 и 24.2.1. В другом варианте осуществления настоящего изобретения данная тяжелая цепь включает в себя CDR3 и может также содержать CDR1- и CDR2-участки, каждый из которых независимо выбран из CDR1- и CDR2-участков вариабельной области тяжелой цепи, включающей в себя аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 2, 10, 18, 26, 34, 42, 50, 58, 66, 74, 82,90, 92, 96 или 98 (как показано на фиг. 1D-1 Н или на фиг. 2D-2 Н) или кодируемую последовательностью нуклеиновой кислоты, выбранной из SEQ ID NO: 1, 9, 17, 25, 33, 41, 49, 57, 65, 73, 81, 89, 91, 95 или 97. В другом варианте осуществления настоящего изобретения антитело включает в себя тяжелую цепь, как описано выше, и легкую цепь, как описано выше. Один из видов аминокислотной замены, которую можно произвести, представляет собой замену одного или нескольких цистеинов в данном антителе, которые могут быть химически реакционноспособными, на другой остаток, такой, каким, без ограничения, являются аланин или серин. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения замену цистеина осуществляют в каркасной области вариабельного домена или в константном домене антитела. В другом варианте осуществления настоящего изобретения указанный цистеин находится в неканонической области данного антитела. Другой вид- 16011449 аминокислотной замены, которую можно произвести, заключается в замене любого потенциального из протеолитических сайтов в данном антителе, в частности, тех из них, которые находятся в каркасной области вариабельного домена, в константном домене антитела или в неканонической области данного антитела. Замена цистеиновых остатков и удаление протеолитических сайтов может снизить риск любой гетерогенности в данном антительном продукте и, таким образом, увеличить его гомогенность. Другой вид аминокислотной замены заключается в элиминации пар аспарагин-глицин, которые образуют потенциальные сайты дезамидирования, путем изменения одного или обоих остатков. Это предпочтительно осуществлять в каркасных областях, константном домене или неканонических областях антитела. Активация CD40 с помощью антитела к CD40. Другой аспект настоящего изобретения включает в себя антитело к CD40, которое представляет собой активирующее антитело, т.е. CD40-агонист. Активирующее антитело усиливает или заменяет действие CD40L относительно CD40. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения активирующее антитело представляет собой, по существу, имитатор CD40L, и конкурирует с CD40L за связывание с CD40. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения антитело не конкурирует с CD40L за связывание с CD40, но усиливает эффект связывания CD40L с CD40. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения антитело к CD40 активирует CD40 в присутствии или в отсутствие CD40L. Ингибирование опухолевого роста in vivo антителами к CD40. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления настоящего изобретения предусмотрено антитело к CD40, которое ингибирует пролиферацию опухолевых клеток in vitro или рост опухоли invivo. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения данное антитело подавляет рост опухоли по меньшей мере на 50, 55, 60, 65, 70, 75%. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения данное антитело подавляет рост опухоли на 75%. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения ингибирование роста опухоли детектируется через 14 дней после начала ее обработки антителом. В других вариантах осуществления настоящего изобретения ингибирование роста опухоли детектируется через 7 дней после начала ее обработки антителом. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения животному вводят другой противоопухолевый агент вместе с антителом к CD40. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения противоопухолевый агент дополнительно ингибирует рост опухоли. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения противоопухолевый агент представляет собой адриамицин или таксол. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения совместное введение противоопухолевого агента и антитела к CD40 ингибирует рост опухоли по меньшей мере на 50% через 22-24 дня после начала обработки, по сравнению с ростом опухоли у необработанного животного. Индукция апоптоза антителами к CD40. Другая цель настоящего изобретения - создать антитело к CD40, которое индуцирует клеточную смерть в CD40-позитивных клетках. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения данное антитело вызывает апоптоз CD40-позитивных клеток либо in vivo, либо in vitro. Усиление экспрессии молекул клеточной поверхности. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения антитело к CD40 усиливает экспрессию молекул В-клеточной поверхности, в том числе, но не ограничиваясь ими, ICAM, MHC-II, В 7-2,CD71, CD23 и CD83. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения концентрация антитела 1 мкг/мл усиливает экспрессию молекулы ICAM В-клеточной поверхности в цельной крови, повышая ее содержание по меньшей мере в 2 раза или более предпочтительно по меньшей мере в 4 раза. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения концентрация антитела 1 мкг/мл усиливает экспрессию молекулы MHC-II В-клеточной поверхности в цельной крови, повышая ее содержание по меньшей мере в 2 раза или более предпочтительно по меньшей мере в 3 раза. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения концентрация антитела 1 мкг/мл усиливает экспрессию молекулы CD23 поверхности В-клетки в цельной крови, повышая ее содержание по меньшей мере в 2 раза или более предпочтительно по меньшей мере в 5 раз. См., например, пример VII, табл. 25. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения антитело к CD40 усиливает экспрессию молекул, в том числе, но не ограничиваясь этим, MHC-II, ICAM, B7-2, CD83 и В 7-1, на поверхности дендритных клеток. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения диапазон повышенного содержания аналогичен диапазону повышенного содержания, наблюдаемого в В-клетках. См., например, табл. 25 и 26 ниже. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения антитело предпочтительно повышает экспрессию молекул поверхности дендритных клеток, таких как В 7-2 иMHC-II, по сравнению с экспрессией этих молекул на поверхности В-клеток. См., например, табл. 27. Усиление секреции клеточных цитокинов. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения антитело усиливает клеточную секрецию цитокинов, включая, но не ограничиваясь ими, IL-8, IL-12, IL-15, IL-18 и IL-23. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения антитело усиливает секрецию цитокинов дендритными клетками и прилипающими моноцитами. В некоторых вариантах осуществления- 17011449 настоящего изобретения образование цитокинов усиливается в результате костимуляции одним или несколькими LPS, IFN- или IL-1. Еще в одном аспекте настоящего изобретения в опыте с дендритными клетками антитело вместе с LPS костимулирует усиление образования IL-12p70 в отношении ЕС 50 почти на 0,48 мкг/мл. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения антитело усиливает образование IL-12p40 в дендритных клетках в отношении ЕС 50 почти на 0,21 мкг/мл. (См., например, пример VIII). В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения антитело усиливает секрецию гамма-IFN Т-клетками в опыте с Т-клетками/дендритными клетками, как описано в примере VIII. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения антитело усиливает секрецию гамма-IFN в опыте с Т-клетками/дендритными клетками, что касается ЕС 50, почти на 0,3 мкг/мл. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения антитело усиливает секрецию гамма-IFN в опыте с Тклетками/дендритными клетками, что касается ЕС 50, почти на 0,2 мкг/мл. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения антитело усиливает секрецию гамма-IFN в опыте с Тклетками/дендритными клетками, что касается ЕС 50, почти на 0,03 мкг/мл. Способы получения антител и антителопродуцирующих клеточных линий. Иммунизация. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения антитела человека получают путем иммунизации животного, не являющегося человеком, антигеном CD40, содержащего в своем геноме некоторые или все локусы тяжелой и легкой цепи иммуноглобулина человека. В предпочтительных вариантах осуществления настоящего изобретения не являющееся человеком животное представляет собойXenoMouse-мыши представлены генно-инженерными мышиными линиями, которые содержат большие фрагменты тяжелой цепи и легкой цепи иммуноглобулиновых локусов человека и являются дефектными в отношении выработки мышиных антител. См., например, Green et al., Nature Genetics 7:1321 (1994) и патенты США 5916771, 5939598, 5985615, 5998209, 6075181, 6091001, 6114598, 6130364,6162963 и 6150584. См. также WO 91/10741, WO 94/02602, WO 96/34096, WO 96/33735, WO 98/16654,WO 98/24893, WO 98/50433, WO 99/45031, WO 99/53049, WO 00/09560 и WO 00/037504. В другом аспекте в настоящем изобретении разработан способ получения антител у животных, не принадлежащих человеческому роду и не относящихся к мышам, путем иммунизации антигеном CD40, а также у не принадлежащих человеческому роду трансгенных животных, которые включают иммуноглобулиновые локусы человека. Таких животных можно получить, используя способы, описанные в цитированных выше документах. Способы, раскрытые в этих документах, можно модифицировать, как описано в патенте США 5994619. В предпочтительных вариантах осуществления настоящего изобретения не принадлежащие человеческому роду животные представляют собой крыс, овец, свиней, коз, крупный рогатый скот и лошадей.XenoMouse-мыши, подобно взрослому человеку, продуцируют набор полноразмерных человеческих антител и синтезируют антиген-специфичные антитела человека. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения XenoMouse-мыши содержат приблизительно 80% набора антител человеческого гена V, полученного в результате введения участка искусственной дрожжевой хромосомы(YАС) с конфигурацией клеток зародышевой линии и размером до одной т.н., содержащей локусы тяжелой и легкой каппа-цепи человека. См. Mendez et al., Nature Genetics 15:146-156 (1997), Green and Jakobovits, J. Exp. med. 188:483-495 (1998) и WO 98/24893, раскрытие которых включено здесь путем ссылки. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения не принадлежащее человеческому роду животное, включающее иммуноглобулиновые гены человека, представляет собой животное, которое обладает иммуноглобулиновым "минилокусом" человека. В таком "минилокусном" методе экзогенный Ig-локус имитируется путем включения индивидуальных генов из Ig-локуса. В соответствии с этим один или несколько VH-генов, один или несколько DH-генов, один или несколько JH-генов, константный домен mu, и второй константный домен (предпочтительно константный гамма-домен) вводят в конструкцию для внедрения в животное. Данный метод описан, в частности, в патентах США 5545807,5545806, 5569825, 5625126, 5633425, 5661016, 5770429, 5789650, 5814318, 5591669, 5612205, 5721367,5789215 и 5643763, включенных таким образом путем ссылки. Преимущество мини-локусного метода заключается в быстроте, с которой могут быть образованы и внедрены животным конструкции, содержащие части IG-локуса. Вместе с тем, потенциальное неудобство данного мини-локусного метода заключается в отсутствие достаточного разнообразия иммуноглобулинов, необходимого для поддержания полного развития В-клеток, что может снижать продукцию антител. В другом аспекте в настоящем изобретении разработан способ получения гуманизированных антител к CD40. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения, не являющихся человеком животных иммунизируют CD40-антигеном, как описано ниже, в условиях, которые предоставляют возможность для получения антител. Из иммунизированных животных выделяют антителопродуцирующие клетки, сливают с миеломными клетками для получения гибридом, из которых выделяют нуклеиновые- 18011449 кислоты, кодирующие тяжелую и легкую цепи представляющего интерес CD40-антитела. Данные нуклеиновые кислоты последовательно создают, используя генно-инженерные методы, известные специалистам в данной области и, как описано ниже, уменьшают размер нечеловеческой последовательности, т.е. гуманизируя данное антитело для уменьшения иммунной реакции у людей. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения антиген CD40 отделяют и/или выделяют очисткой. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения антиген CD40 представляет собой CD40 человека. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения антиген CD40 представляет собой фрагмент CD40. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения фрагмент антигена CD40 представляет собой внеклеточный домен CD40. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения фрагмент антигена CD40 включает в себя по меньшей мере один эпитоп из CD40. В других вариантах осуществления настоящего изобретения антиген CD40 представляет собой клетку, которая на своей поверхности экспрессирует или сверхэкспрессирует CD40 или его иммуногенный фрагмент. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения антигенCD40 представляет собой слитый белок CD40. Иммунизацию животных можно осуществить любым способом, известным в данной области. См.,например, Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Press, 1990. Способы иммунизации отличных от человека животных, таких как мыши, крысы, овцы, козы, свиньи,крупный рогатый скот и лошади, хорошо известны в данной области. См., например, Harlow and Lane,выше, а также патент США 5994619. В предпочтительном варианте осуществления антиген CD40 вводят с адъювантом для стимуляции иммунного ответа. Образцы адъювантов включают в себя полный или неполный адъювант Фрейнда, RIBI (мурамильные дипептиды) или ISCOM (иммуностимулирующие комплексы). Такие адъюванты могут защитить данный полипептид от рассасывания путем его связывания в локальный осадок, или же они могут содержать вещества, которые стимулируют хозяина выделять факторы, вызывающие хемотаксис макрофагов и других компонентов данной иммунной системы. Предпочтительно при введении полипептида режим иммунизации растягивать на несколько недель и включать два или более введения данного полипептида. Пример I описывает получение моноклональных антител к CD40. Получение антител и антителопродуцирующих клеточных линий. После иммунизации животного антигеном CD40 из этого животного можно получить антитела и/или антителопродуцирующие клетки. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения сыворотку, содержащую антитело к CD40, получают от животного путем взятия крови или умерщвления животного. Эту сыворотку можно использовать в качестве полученной от животного для получения из нее иммуноглобулиновой фракции или для выделения путем очистки из сыворотки антител к CD40. Специалистам в данной области хорошо известно, что сыворотка или иммуноглобулины, полученные данным способом, являются поликлональными. Неудобство использования получаемых из сыворотки поликлональных антител заключается в том, что количество получаемых антител ограничено, и данное поликлональное антитело обладает совокупностью разных характеристик. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения антителопродуцирующие иммортализованные клеточные линии получают из клеток, выделенных из иммунизированного животного. После иммунизации животное умерщвляют, а лимфатические узлы и/или В-клетки селезенки иммортализуют. Способы иммортализации клеток включают в себя, не ограничиваясь этим, перенесение их вместе с онкогенами, заражение их онкогенным вирусом, культивирование их в условиях, в которых отбирают иммортализованные клетки, воздействие на них канцерогенных и мутагенных соединений, слияние их с иммортализованной клеткой, например, с миеломной клеткой, и инактивация опухолевого генасупрессора. См., например, Harlow and Lane выше. Если используют слияние с миеломными клетками, то такие миеломные клетки предпочтительно не секретируют иммуноглобулиновые полипептиды (несекретирующая клеточная линия). Иммортализованные клетки скринируют с использованием CD40, его участка, или с использованием клетки, экспрессирующей CD40. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения начальное скринирование осуществляют с использованием иммуноферментного анализа или радиоиммуноанализа. Пример ИФА-скринирования описан в WO 00/37504, включенной здесь путем ссылки. Клетки, продуцирующие антитело к CD40, например гибридомы, отбирают, клонируют и в дальнейшем скринируют на предмет выявления нужных характеристик, включая устойчивый рост, высокий выход и требуемые свойства антител, что рассматривается далее ниже. Гибридомы можно размножить invivo в организме сингенных животных, в организме животных с недостаточной иммунной системой, например у голых мышей, или в культуре клеток in vitro. Способы селекции, клонирования и размножения гибридом хорошо известны рядовым специалистам в данной области. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения иммунизированное животное представляет собой не принадлежащее человеческому роду животное, которое экспрессирует иммуноглобулиновые гены человека, а его В-клетки селезенки сливают с миеломной клеточной линией животного того же вида, что и указанное иммунизированное животное, не являющееся человеком. В более предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения иммунизированное животное явля- 19011449 ется XenoMouse-животным, а миеломная клеточная линия представлена несекретирующей мышиной миеломой. В еще более предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения миеломная клеточная линия представляет собой P3-X63-AG8.653. См., например, пример I. Кроме того, в настоящем изобретении созданы гибридомы, вырабатывающие антитела человека кCD40. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения данные гибридомы представляют собой мышиные гибридомы, которые описаны выше. В других вариантах осуществления настоящего изобретения такие гибридомы создают в организме животных (но не человека), в организме таких животных, как крысы, овцы, свиньи, козы, крупный рогатый скот или лошади, но не мыши. В другом варианте осуществления настоящего изобретения гибридомы представляют собой гибридомы человека. Нуклеиновые кислоты, векторы, хозяйские клетки и способы создания рекомбинантных антител. Нуклеиновые кислоты. Настоящее изобретение включает в себя молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие антитела против CD. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения разные молекулы нуклеиновой кислоты кодируют тяжелую цепь и легкую цепь иммуноглобулина к CD. В других вариантах осуществления настоящего изобретения одна и та же молекула нуклеиновой кислоты кодирует тяжелую цепь и легкую цепь иммуноглобулина к CD40. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения молекула нуклеиновой кислоты,кодирующая вариабельный домен легкой цепи, включает в себя генную последовательность человека А 3/А 19 (DPK-15), L5 (DP5) или А 27 (DPK-22) Vk или полученную из них последовательность. В других вариантах осуществления настоящего изобретения молекула нуклеиновой кислоты включает в себя нуклеотидную последовательность гена А 3/А 19 Vk и гена Jk1, Jk2 или Jk3, либо последовательность, полученную из них. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения данная молекула нуклеиновой кислоты включает в себя нуклеотидную последовательность гена L5 Vk и гена Jk4. В других вариантах осуществления настоящего изобретения молекула нуклеиновой кислоты включает в себя нуклеотидную последовательность гена А 27 Vk и гена Jk3. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения молекула нуклеиновой кислоты,кодирующая легкую цепь, кодирует аминокислотную последовательность, содержащую 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7,8, 9 или 10 мутаций из аминокислотной последовательности клеток зародышевой линии. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения молекула нуклеиновой кислоты включает в себя нуклеотидную последовательность, кодирующую аминокислотную последовательность VL, содержащую 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 неконсервативных аминокислотных замен и/или 1, 2 или 3 неконсервативных замен по сравнению с последовательностью из клеток зародышевой линии. Замены могут находиться вCDR-участках, в каркасных участках или в константном домене. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения молекула нуклеиновой кислоты,кодирующая вариабельный домен легкой цепи (VL), кодирует аминокислотную последовательность VL,содержащую одну или несколько мутаций по сравнению с последовательностью из клеток зародышевой линии, которые идентичны мутациям, обнаруживаемым в VL одного из антител 3.1.1, 3.1.1L-L4M-L83V,7.1.2, 10.8.3, 15.1.1, 21.4.1, 21.2.1, 22.1.1, 23.5.1, 23.25.1, 23.28.1, 23.28.1L-C92A, 23.29.1 и 24.2.1. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения молекула нуклеиновой кислоты кодирует по меньшей мере три аминокислотные мутации, по сравнению с последовательностью из клеток зародышевой линии, обнаруживаемые в VL одного из антител 3.1.1, 3.1.1L-L4M-L83V, 7.1.2, 10.8.3, 15.1.1, 21.4.1,21.2.1, 22.1.1, 23.5.1, 23.25.1, 23.28.1, 23.28.1L-C92A, 23.29.1 и 24.2.1. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения молекула нуклеиновой кислоты включает в себя нуклеотидную последовательность, которая кодирует аминокислотную последовательность VL моноклонального антитела 3.1.1 (SEQ ID NO: 4), 3.1.1L-L4M-L83V (SEQ ID NO: 94), 7.1.2 (SEQNO: 100), 23.29.1 (SEQ ID NO: 76) или 24.2.1 (SEQ ID NO: 84) либо ее часть. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения указанная часть включает в себя, по меньшей мере, CDR3-участок. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения нуклеиновая кислота кодирует аминокислотную последовательность легкой цепи CDR указанного антитела. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения указанная часть представляет собой смежную часть, включающую в себяCDR1-CDR3. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения молекула нуклеиновой кислоты включает в себя нуклеотидную последовательность, которая кодирует аминокислотную последовательность одной из SEQ ID NO: 4, 12, 20, 28, 36, 44, 52, 60, 68, 76, 84, 94 или 100, или указанную последовательность без сигнальной последовательности. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления настоящего изобретения молекула нуклеиновой кислоты включает в себя нуклеотидную последовательность из SEQ ID NO: 3, 11, 19, 27, 35, 43, 51, 59, 67, 75, 83, 93 или 99 или ее часть, причем в указанной последовательности необязательно отсутствует сигнальная последовательность. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения указанная часть кодирует VL- 20011449 область. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения указанная часть кодирует, по меньшей мере, область CDR2. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения нуклеиновая кислота кодирует аминокислотную последовательность легкой цепи CDR указанного антитела. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения указанная часть кодирует прилежащий участок из CDR1-CDR3. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения молекула нуклеиновой кислоты кодирует аминокислотную последовательность VL, которая идентична по меньшей мере на 70, 75, 80, 85,90, 95, 97, 98, 99% VL-аминокислотной последовательности одного из антител 3.1.1, 3.1.1L-L4M-L83V,7.1.2, 10.8.3, 15.1.1, 21.4.1, 21.2.1, 22.1.1, 23.5.1, 23.25.1, 23.28.1, 23.28.1L-C92A, 23.29.1 или 24.2.1, либоVL-аминокислотной последовательности любой из SEQ ID NO: 4, 12, 20, 28, 36, 44, 52, 60, 68, 76, 84, 94 или 100. Молекулы нуклеиновой кислоты согласно изобретению включают в себя нуклеиновые кислоты,которые гибридизуются в жестких условиях, таких, которые описаны выше, с последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей аминокислотную последовательность из числа SEQ ID NO: 4, 12, 20, 28,36, 44, 52, 60, 68, 76, 84, 94 или 100, либо которая обладает последовательностью нуклеиновой кислотыSEQ ID NO: 3, 11, 19, 27, 35, 43, 51, 59, 67, 75, 83, 93 или 99. В других вариантах осуществления настоящего изобретения последовательность нуклеиновой кислоты кодирует полноразмерную легкую цепь антитела, выбранного из 3.1.1, 3.1.1L-L4M-L83V, 7.1.2,10.8.3, 15.1.1, 21.4.1, 21.2.1, 22.1.1, 23.5.1, 23.25.1, 23.28.1, 23.28.1L-C92A, 23.29.1, 23.29.1L-R174K или 24.2.1, либо легкую цепь, включающую в себя аминокислотную последовательность из числа SEQ IDNO: 8, 16, 24, 32, 40, 48, 56, 64, 72, 80, 88, 94, 100 или 102, либо легкую цепь, содержащую такую мутацию, как раскрытая здесь мутация. Кроме того, нуклеиновая кислота может включать в себя нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 7, 15, 23, 31, 39, 47, 55, 63, 71, 79 или 87, либо молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую легкую цепь, содержащую одну из мутаций, которая раскрыта здесь. В другом предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения молекула нуклеиновой кислоты кодирует вариабельный домен тяжелой цепи (VH), который включает в себя генную последовательность VH человека 3-30+, 4-59, 1-02, 4.35 или 3-30.3 или последовательность, полученную из нее. В различных вариантах осуществления настоящего изобретения молекула нуклеиновой кислоты включает в себя VH-ген человека 3-30+, ген D4 (DIR3) и ген JH6 человека; VH-ген человека 3-30+, ген D4D6-19 (DIR3) и ген JH4 человека; VH-ген человека 3-30+, ген D1-1 и ген JH6 человека; VH-ген человека 330+, ген D4-17 и ген JH6 человека; VH-ген человека 3-30.3, ген D4-17 и ген JH6 человека; VH-ген человека 4-59, ген D4-17 (DIR1) и ген JH5 человека, или последовательность, полученную из этих генов человека. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения молекула нуклеиновой кислоты кодирует аминокислотную последовательность, содержащую 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15,16, 17 или 18 мутаций по сравнению с аминокислотной последовательностью генов клеток зародышевой линии человека V, D или J. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения указанные мутации находятся в VH-области. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения указанные мутации находятся в CDR-участках. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения молекула нуклеиновой кислоты кодирует одну или несколько аминокислотных мутаций, в сравнении с последовательностью из клеток зародышевой линии, которые идентичны аминокислотным мутациям, обнаруживаемым в VH моноклонального антитела 3.1.1, 3.1.1 Н-А 78 Т, 3.1.1H-A78T-V88A-V97A, 7.1.2, 10.8.3, 15.1.1, 21.4.1, 21.2.1, 22.1.1,22.1.1 Н-С 109 А, 23.5.1, 23.25.1, 23.28.1, 23.28.1H-D16E, 23.29.1 и 24.2.1. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения нуклеиновая кислота кодирует по меньшей мере три аминокислотные мутации по сравнению с последовательностями из клеток зародышевой линии, которые идентичны по меньшей мере трем аминокислотным мутациям, обнаруживаемым в одном из вышеперечисленных моноклональных антител. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения молекула нуклеиновой кислоты включает в себя нуклеотидную последовательность, которая кодирует по меньшей мере часть аминокислотной последовательности VH антитела 3.1.1 (SEQ ID NO: 2), 3.1.1 Н-А 78 Т (SEQ ID NO: 90), 3.1.1HA78T-V88A-V97A (SEQ ID NO: 92), 7.1.2 (SEQ ID NO: 10), 10.8.3 (SEQ ID NO: 18), 15.1.1 (SEQ ID NO: 26), 21.2.1 (SEQ ID NO: 34), 21.4.1 (SEQ ID NO: 42), 22.1.1 (SEQ ID NO: 50), 22.1.1H-C109A (SEQ ID NO: 96), 23.5.1 (SEQ ID NO: 58), 23.28.1 (SEQ ID NO: 66), 23.28.1H-D16E (SEQ ID NO: 98), 23.29.1 (SEQ IDNO: 74) или 24.2.1 (SEQ ID NO: 82), либо указанная последовательность обладает консервативными аминокислотными мутациями и/или в общей сложности тремя или менее неконсервативными аминокислотными заменами. В различных вариантах осуществления настоящего изобретения данная последовательность кодирует один или несколько CDR-участков, предпочтительно CDR3-участок, все три CDRучастка, смежную часть, включающую в себя CDR1-CDR3, или полную VH-область с сигнальной последовательностью или без нее. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения молекула нуклеиновой кислоты включает в себя нуклеотидную последовательность, которая кодирует аминокислотную последователь- 21011449 ность из числа SEQ ID NO: 2, 10, 18, 26, 34, 42, 50, 58, 66, 74, 82, 90, 92, 96 или 98, или указанную последовательность без сигнальной последовательности. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления настоящего изобретения молекула нуклеиновой кислоты включает в себя по меньшей мере часть нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 1, 9, 17, 25, 33, 41, 49, 57, 65, 73, 81, 89, 91, 95 или 97,либо указанную последовательность без сигнальной последовательности. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения указанная часть кодирует VHобласть (с сигнальной последовательностью или без нее), CDR3-участок, все три CDR-участка или прилежащую смежную область, содержащую CDR1-CDR3. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения молекула нуклеиновой кислоты кодирует аминокислотную последовательность VH, которая идентична по меньшей мере на 70, 75, 80, 85,90, 95, 97, 98 или 99% аминокислотной последовательности VH, представленной на фиг. 1 А-1 С или 2 А 2 С, или аминокислотной последовательности VH из любой SEQ ID NO: 2, 10, 18, 26, 34, 42, 50, 58, 66, 74,82, 90, 92, 96 или 98. Молекулы нуклеиновой кислоты согласно изобретению включают в себя нуклеиновые кислоты, которые гибридизуются в жестких условиях, таких, которые описаны выше, с последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, 10,18, 26, 34, 42, 50, 58, 66, 74, 82, 90, 92, 96 или 98, или которая обладает последовательностью нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 1, 9, 17, 25, 33, 41, 49, 57, 65, 73, 81, 89, 91, 95 или 97. Последовательность нуклеиновой кислоты согласно изобретению включает в себя молекулу нуклеиновой кислоты, которая гибридизуется в жестких условиях, таких, которые описаны выше, с последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей только что описанную выше VH. В другом варианте осуществления настоящего изобретения нуклеиновая кислота кодирует полноразмерную тяжелую цепь антитела, выбранного из 3.1.1, 3.1.1 Н-А 78 Т, 3.1.1H-A78T-V88A-V97A, 7.1.2,10.8.3, 15.1.1, 21.4.1, 21.2.1, 22.1.1, 22.1.1 Н-С 109 А, 23.5.1, 23.25.1, 23.28.1, 23.28.1H-D16E, 23.29.1 и 24.2.1, или тяжелую цепь, обладающую аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 6, 14, 22, 30,38, 46, 54, 62, 70, 78 или 86, либо тяжелую цепь, содержащую мутацию, такую как одна из мутаций, рассматриваемых здесь. Кроме того, нуклеиновая кислота включает в себя нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 5, 13, 21, 29, 37, 45, 53, 61, 69, 77, 85 или 89 или последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую тяжелую цепь, содержащую мутацию, такую как одна из рассматриваемых здесь мутаций. Молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая тяжелую или полную легкую цепь антитела к CD40 или их части, может быть выделена из любого источника, который производит такое антитело. В различных вариантах осуществления настоящего изобретения молекулы нуклеиновой кислоты выделяют из Вклетки, выделенной из животного, иммунизированного CD40, или из иммортализованной клетки, произведенной от такой В-клетки, экспрессирующей антитело к CD40. Способы выделения мРНК, кодирующей антитело, хорошо известны в данной области. См., например, Sambrook et al. Выделенную мРНК можно применять для получения кДНК при использовании в полимеразной цепной реакции (ПЦР) или для кДНК-клонирования антительных генов. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения молекулу нуклеиновой кислоты выделяют из гибридомы, содержащей в качестве одного из своих партнеров слияния иммуноглобулин-продуцирующую клетку, выделенную из трансгенного животного, не принадлежащего человеческому роду. В еще более предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения клетку, продуцирующую иммуноглобулин человека, выделяют изXenoMouse-животного. В другом варианте осуществления настоящего изобретения клетка, продуцирующая иммуноглобулин человека, происходит от любого трансгенного животного, как описано выше,но не от человека и не от мыши. В другом варианте осуществления настоящего изобретения нуклеиновую кислоту выделяют из нетрансгенного животного, но не человека. Молекулы нуклеиновой кислоты,выделяемые из такого нетрансгенного животного, могут использоваться, например, для получения гуманизированных антител. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения нуклеиновая кислота, кодирующая тяжелую цепь антитела к CD40 согласно изобретению, может включать в себя нуклеотидную последовательность, кодирующую VH-домен согласно изобретению, объединенную в одной рамке считывания с нуклеотидной последовательностью, кодирующей тяжелую цепь константного домена из любого источника. Аналогичным образом, молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая легкую цепь антитела к CD40 согласно изобретению, может включать в себя нуклеотидную последовательность, кодирующую VLдомен согласно изобретению, объединенную в одной рамке считывания с нуклеотидной последовательностью, кодирующей легкую цепь константного домена из любого источника. В дополнительном аспекте настоящего изобретения молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие вариабельный домен тяжелой (VH) и легкой (VL) цепей, преобразуют в полноразмерные антительные гены. В одном из вариантов настоящего изобретения молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие домены VH или VL, преобразуют в полноразмерные гены антител путем встраивания в экспрессирующий вектор константные домены, уже кодирующие, соответственно, тяжелую цепь или легкую цепь, и встраивают так, чтобы в данном векторе присоединить путем сшивки VH-сегмент к CH-сегменту(ам), aVL-сегмент присоединить путем сшивки к CL-сегменту. В другом варианте осуществления настоящего- 22011449 изобретения, используя стандартные методы молекулярной биологии, молекулы нуклеиновой кислоты,кодирующие домены VH и/или VL, преобразуют в полноразмерные гены антител путем сшивки (например, лигирования) молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей домены CH и/или CL. Последовательности нуклеиновой кислоты константных доменов тяжелой и легкой цепи иммуноглобулиновых генов известны в данной области. См., например, Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5thEd., NIH Publ.91-3242, 1991. Молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие полноразмерные тяжелую и/или легкую цепи, можно затем экспрессировать во встроенной клетке и выделить антитело к CD40. Молекулы нуклеиновой кислоты можно использовать для рекомбинантной экспрессии больших количеств антител к CD40. Ниже описано, как данные молекулы нуклеиновой кислоты можно использовать для получения химерных антител, биспецифических антител, одноцепочечных антител, иммуноадгезинов, диателец, мутировавших антител и производных антител. Если данные молекулы нуклеиновой кислоты получены не из человека, а из нетрансгенного животного, то эти молекулы нуклеиновой кислоты можно использовать для гуманизации антитела, что также описано ниже. В другом варианте осуществления настоящего изобретения молекулу нуклеиновой кислоты согласно изобретению используют в качестве зонда или ПЦР-праймера для специфичной антительной последовательности. Например, нуклеиновую кислоту можно использовать в качестве зонда в диагностических способах или в качестве ПЦР-праймера для амплификации участков ДНК, которые можно было бы использовать, в частности, для выделения дополнительных молекул нуклеиновой кислоты, кодирующих вариабельные домены антител к CD40. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения молекулы нуклеиновой кислоты представляют собой олигонуклеотиды. В других вариантах осуществления настоящего изобретения олигонуклеотиды происходят из высоковариабельных участков тяжелой и легкой цепей представляющего интерес антитела. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения олигонуклеотиды кодируют полностью или частично один или несколько CDR антитела 3.1.1, 3.1.1 Н-А 78 Т, 3.1.1H-A78T-V88A-V97A, 3.1.1L-L4M-L83V, 7.1.2, 10.8.3, 15.1.1, 21.4.1, 21.2.1, 22.1.1,22.1.1 Н-С 109 А, 23.5.1, 23.25.1, 23.28.1, 23.28.1H-D16E, 23.28.1L-C92A, 23.29.1 или 24.2.1. Векторы. В настоящем изобретении созданы векторы, включающие в себя молекулы нуклеиновой кислоты,которые кодируют тяжелую цепь антитела к CD40 согласно изобретению или его антигенсвязывающую часть. В настоящем изобретении созданы также векторы, включающие в себя молекулы нуклеиновой кислоты, которые кодируют легкую цепь таких антител или их антигенсвязывающую часть. Кроме того,в настоящем изобретении созданы векторы, включающие в себя молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие слитые белки, модифицированные антитела, антительные фрагменты и их зонды. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения антитела к CD40 или антигенсвязывающие части согласно изобретению экспрессируются путем встраивания ДНК, кодирующих неполные или полноразмерные легкую и тяжелую цепи, полученные, как описано выше, в экспрессирующие векторы, так, чтобы эти гены оказались присоединенными путем сшивки к требуемым экспрессионным контрольным последовательностям, таким как транскрипционные и трансляционные контрольные последовательности. Экспрессирующие векторы включают в себя плазмиды, ретровирусы, аденовирусы,аденоассоциированные вирусы (AAV), растительные вирусы, такие как вирус мозаики цветной капусты,вирус табачной мозаики, космиды, YAC, производные EBV эписомы и т.п. Ген антитела лигируют в вектор так, чтобы транскрипционная и трансляционная контрольные последовательности в векторе выполняли свою предполагаемую функцию регуляции транскрипции и трансляции антительного гена. Выбирают экспрессирующий вектор и экспрессионные контрольные последовательности, которые совместимы с используемой экспрессирующей хозяйской клеткой. Ген легкой цепи антитела и ген тяжелой цепи антитела можно встроить в разные векторы. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения оба гена встраивают в один и тот же экспрессирующий вектор. Антительные гены встраивают в экспрессирующий вектор с помощью стандартных способов (например, лигированием комплементарных сайтов рестрикции фрагмента антительного гена и вектора или лигированием по тупым концам, если сайты рестрикции не представлены). Удобным вектором является вектор, который кодирует функционально полную, иммуноглобулиновую последовательность CH или CL человека с соответствующими сконструированными сайтами рестрикции, так, чтобы последовательности VH или VL можно было легко встроить и экспрессировать, как описано выше. В таких векторах сплайсинг обычно происходит между донорным сайтом сплайсинга, во встраиваемом J-участке, и акцепторным сайтом сплайсинга, предшествующим человеческому С-домену,а также на участках сплайсинга, которые находятся в CH-экзонах человека. Полиаденилирование и терминация транскрипции происходят в нативных хромосомных сайтах правее от кодирующих областей. Рекомбинантный экспрессирующий вектор может также кодировать сигнальную последовательность,которая обеспечивает секрецию антительной цепи из хозяйской клетки. Ген антительной цепи можно клонировать в вектор так, чтобы сигнальный пептид оказывался присоединенным к аминоконцу иммуноглобулиновой цепи. Сигнальный пептид может представлять собой иммуноглобулиновый сигнальный пептид или гетерологичный сигнальный пептид (т.е. сигнальный пептид неиммуноглобулинового белка). Помимо генов антительных цепей, рекомбинантные экспрессирующие векторы несут регуляторные- 23011449 последовательности, которые контролируют экспрессию генов антительных цепей в хозяйской клетке. Специалистам в данной области следует иметь в виду, что создание экспрессирующего вектора, включая выбор регуляторных последовательностей, может зависеть от таких факторов, как выбор клетки-хозяина,которая будет трансформирована, уровня экспрессии требуемого белка и т.д. Предпочтительные регуляторные последовательности экспрессии клетки-хозяина млекопитающего включают в себя вирусные элементы, которые контролируют высокие уровни белковой экспрессии в клетках млекопитающего, такие как промоторы и/или энхансеры, полученные из ретровирусных LTR, цитомегаловируса (CMV) (такой как CMV-промотор/энхансер), вируса 40 иммунодефицита обезьян (SV40) (такой как SV40 промотор/энхансер), аденовируса (например, большой поздний промотор аденовируса (AdMLP, полиомы и сильные промоторы млекопитающего в виде иммуноглобулинового и актинового промоторов. Более полное описание вирусных регуляторных элементов и их последовательностей см., например, в патентах США 5168062, 4510245 и 4968615. Способы экспрессии антител у растений, включая описание промоторов и векторов, а также трансформация растений, известны в данной области. См., например,патент США 6517529, включенный здесь путем ссылки. Способы экспрессии полипептидов в бактериальных клетках или клетках грибов, например, в дрожжевых клетках, также хорошо известны в данной области. Помимо генов антительных цепей и регуляторных последовательностей, рекомбинантные экспрессирующие векторы согласно изобретению могут нести дополнительные последовательности, такие, например, как последовательности, которые регулируют репликацию данного вектора в хозяйских клетках(например, ориджины репликации) и селективные маркерные гены. Селективный маркерный ген обеспечивает селекцию хозяйских клеток, в которые вектор встроен (см., например, патенты США 4399216,4634665 и 5179017). Например, типично селективный маркерный ген придает резистентность к лекарственным средствам, таким как G418, гигромицин или метотрексат, хозяйской клетке, в которую встроен данный вектор. Предпочтительные селективные маркерные гены включают в себя ген дигидрофолатредуктазы (DHFR) (для использования в dhfr-хозяйских клетках с селекцией/амплификацией по метотрексату), neo-ген (для G418-селекции), и ген глутаматсинтетазы. Негибридомные хозяйские клетки и способы рекомбинантного получения белка. Молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие антитела к CD и векторы, включающие эти молекулы нуклеиновой кислоты, можно использовать для трансфекции хозяйских клеток соответствующего млекопитающего, растения, бактерии или дрожжевой клетки. Трансформацию можно осуществлять с помощью любого известного способа внедрения полинуклеотидов в хозяйскую клетку. Способы внедрения гетерологичных полинуклеотидов в клетки млекопитающих хорошо известны в данной области и включают в себя опосредованную декстраном трансфекцию, кальций-фосфатное осаждение, polybreneопосредованную трансфекцию, слияние протопластов, электропорацию, инкапсулирование полинуклеотида(ов) в липосомы и прямую микроинъекцию ДНК в ядро. Кроме того, молекулы нуклеиновой кислоты можно внедрить в клетки млекопитающего с помощью вирусных векторов. Способы трансформации клеток хорошо известны в данной области. См., например, патенты США 4399216, 4912040, 4740461 и 4959455 (патенты, которые таким образом включены здесь путем ссылки). Способы трансформации растительных клеток хорошо известны в данной области, включая, например, опосредованную Agrobacterium трансформацию, трансформацию путем бомбардировки микрочастицами, прямую инъекцию, электропорацию и вирусную трансформацию. Способы трансформации бактериальных и дрожжевых клеток хорошо известны в данной области. Клеточные линии млекопитающих, доступные в качестве хозяйских для экспрессии, хорошо известны в данной области и включают в себя многочисленные линии иммортализованных клеток, доступных из Американской коллекции типовых культур (АТСС). В частности, они включают в себя овариальные клетки китайского хомячка (СНО), NSO, SP2-клетки, клетки HeLa, клетки почки детеныша хомяка(ВНК), клетки почки обезьяны (COS), клетки гепатоцеллюлярной карциномы (например, Hep G2), А 549 клетки и ряд других клеточных линий. Особенно предпочтительными клеточными линиями являются клеточные линии, выбранные путем определения того, какие клеточные линии обладают высокими уровнями экспрессии. Другие клеточные линии, которые можно использовать, являются клеточными линиями насекомых, например, такие как Sf9-клетки. Когда рекомбинантные экспрессирующие векторы,кодирующие антительные гены, внедряют в хозяйские клетки млекопитающего, соответствующие антитела продуцируются путем культивирования хозяйских клеток в течение периода времени, достаточного для осуществления экспрессии данного антитела в этих хозяйских клетках или, более предпочтительно,путем секреции антитела в культуральную среду, в которой выращивают хозяйские клетки. Антитела можно извлечь из культуральной среды с использованием стандартных способов выделения белка путем очистки. Растительные хозяйские клетки включают в себя, например, Nicotiana, Arabidopsis, ряску, кукурузу, пшеницу, картофель и др. Бактериальные хозяйские клетки включают в себя Е. coli и виды Streptomyces. Дрожжевые клетки включают в себя Schizosaccharomyces pombe, Saccharomyces cerevisiae и Pichiapastoris. Далее, экспрессию антител согласно изобретению (или другие их составляющие) в продуцирующих клеточных линиях можно усилить с использованием ряда известных методов. Например, экспрессирую- 24011449 щая система глутаминсинтетазного гена (GS-система) представляет собой обычное решение усиления экспрессии в определенных условиях. GS-система рассматривается целиком или частично в связи с Европейскими патентами 0216846, 0256055 и 0323997 и Европейской патентной заявкой 89303964.4. Возможно, что антитела, экспрессируемые разными клеточными линиями или в трансгенных животных, будут обладать отличающимся друг от друга гликозилированием. Однако все антитела, кодируемые созданными здесь молекулами нуклеиновой кислоты или содержащие представленные здесь аминокислотные последовательности, являются частью настоящего изобретения, независимо от гликозилирования антител. Трансгенные животные и растения. Антитела к CD40 согласно изобретению можно получить трансгенно путем создания млекопитающего или растения, которое является трансгенным в отношении представляющих интерес иммуноглобулиновых последовательностей тяжелой и легкой цепей и многократного получения из них антитела. В связи с трансгенной продукцией у млекопитающих, антитела к CD40 можно получить и извлечь из молока коз, коров или иных млекопитающих. См., например, патенты США 5827690, 5756687, 5750172 и 5741957. В других вариантах осуществления настоящего изобретения не принадлежащих человеческому роду трансгенных животных, которые содержат иммуноглобулиновые локусы человека, иммунизируютCD40 или его иммуногенной частью, как описано выше. Способы создания антител у растений описаны,например, в патентах США 6046037 и 5959177. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения не принадлежащие человеческому роду трансгенные животные или растения получают путем внедрения в данное животное или растение с помощью стандартных трансгенных методик одной или нескольких молекул нуклеиновой кислоты, кодирующих антитело к CD40 согласно изобретению. См. Hogan и патент США 6417429 выше. Трансгенные клетки, используемые для создания трансгенного животного, могут представлять собой эмбриональные стволовые клетки или соматические клетки. Трансгенные, не принадлежащие человеческому роду, животные могут представлять собой химерные, нехимерные гетерозиготы и нехимерные гомозиготы. См., например, Hogan et al., Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual 2ed., Cold SpringPress (2000); и Pinkert, Transgenic Animal Technology: A Laboratory Handbook, Academic Press (1999). В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения не принадлежащие человеческому роду трансгенные животные имеют направленный разрыв и замену в конструкции-мишени, которая кодирует представляющую интерес тяжелую цепь и/или легкую цепь. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения трансгенные животные содержат и экспрессируют молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие тяжелую и легкую цепи, специфически связывающие CD40, предпочтительноCD40 человека. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения трансгенные животные содержат молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие модифицированное антитело, такое как одноцепочечное антитело, химерное антитело или гуманизированное антитело. Антитела к CD40 можно создать в любом трансгенном животном. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения не принадлежащие человеческому роду животные представляют собой мышей, крыс, овец, свиней, коз,крупный рогатый скот или лошадей. Не принадлежащее человеческому роду трансгенное животное экспрессирует указанные кодируемые полипептиды в крови, молоке, моче, слюне, слезах, слизи и других организменных жидкостях. Библиотеки фагового дисплея. В настоящем изобретении разработан способ получения антитела к CD40 или его антигенсвязывающей части, включающий в себя стадии синтеза библиотеки антител человека в фаге, скрининга библиотеки для CD40 или его части, выделения фага, который связывает CD40, и получения антитела из данного фага. В примере осуществления один из способов получения библиотеки антител, основанный на использовании методики фагового дисплея, включает в себя определенные стадии иммунизации не принадлежащего человеческому роду животного, содержащего иммуноглобулиновые локусы человека для CD40 или его антигенной части, для создания иммунного ответа, извлечения антителопродуцирующих клеток из данного иммунизированного животного; стадии выделения РНК из извлеченных клеток,обратного транскрибирования РНК с образованием кДНК, амплификации кДНК с использованием праймера, встраивания кДНК в вектор фагового дисплея, так, чтобы антитела экспрессировались в фаге. Рекомбинантные антитела к CD40 согласно изобретению можно получить данным путем. Рекомбинантные антитела к CD40 согласно изобретению можно выделить путем скринирования рекомбинантной комбинаторной библиотеки антител. Предпочтительно данная библиотека представляет собой scFv-библиотеку фагового дисплея, образуемую с использованием VL- и VH-кДНК, получаемых из мРНК, выделяемой из В-клеток. Методы получения и скринирования таких библиотек известны в данной области. Существуют коммерчески доступные наборы для создания библиотек фагового дисплея (например, Pharmacia Recombinant Phage Antibody System,по каталогу 27-9400-01; и Stratagene SurfZAPphage display kit,по каталогу 240612). Существуют также и другие способы и реагенты, которые можно использовать для создания и скринирования антительных дисплейных библиотек (см., например, патент США 5223409; публикации РСТWO 92/18619, WO 91/17271, WO 92/20791, WO 92/15679, WO(1991); и Barbas et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:7978-7982 (1991. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения для выделения антител человека кCD40 с требуемыми характеристиками антитело человека к CD40, как описано здесь, впервые используют для отбора последовательностей тяжелой и легкой цепи, обладающих подобной связывающей активностью по отношению к CD40, применяя способы эпитопного импринтинга, описанные в публикации РСТWO 93/06213. Библиотеки антител, используемые в данном способе, предпочтительно представляют собой scFv-библиотеки, полученные и скринированные, как описано в публикации РСТWO 92/01047, McCafferty et al., Nature 348:552-554 (1990); и Griffiths et al., EMBO J. 12:725-734 (1993). Библиотеку антител scFv предпочтительно скринируют с использованием в качестве антигена CD40 человека. После того как исходные домены VL и VH человека выбраны, осуществляют эксперименты "смешать и сопоставить", в которых различные пары исходно выбранных VL- и VH-сегментов скринируют в отношении CD40-связывания с выбранными предпочтительными VL/VH-парными сочетаниями. Кроме того, для последующего улучшения качества данного антитела, в сегментах VL и VH из предпочтительной пары (пар) VL/VH случайным образом вызывают мутации, предпочтительно в CDR3-участке VH и/или VL; в процессе, аналогичном соматическому мутационному процессу in vivo, ответственному за созревание по сродству антител в течение естественного иммунного ответа. Созревание по сродству invitro можно осуществить путем амплификации доменов VH и VL с использованием ПЦР-праймеров, комплементарных, соответственно, VH CDR3 или VL CDR3, в которой праймеры "скрепляют" с помощью случайной смеси из четырех нуклеотидных оснований в определенных положениях, так, что результирующие ПЦР-продукты кодируют сегменты VH и VL, в которые были интродуцированы случайные мутации по VH и/или VL CDR3-участков. Эти случайным образом мутировавшие сегменты VH и VL можно скринировать повторно в отношении связывания с CD40. После скринирования и выделения из рекомбинантной дисплейной библиотеки иммуноглобулина кCD40 согласно изобретению нуклеиновые кислоты, кодирующие отобранное антитело, можно извлечь из дисплейного пакета (например, из фагового генома) и субклонировать в другие экспрессирующие векторы с помощью стандартных методов рекомбинантной ДНК. При необходимости, извлеченную нуклеиновую кислоту в последующем можно использовать для создания других форм антител согласно изобретению, как описано ниже. Чтобы экспрессировать рекомбинантное антитело человека, выделенное путем скринирования комбинаторной библиотеки, ДНК, кодирующую антитело, клонируют в рекомбинантный экспрессирующий вектор и внедряют в хозяйские клетки млекопитающего, как описано выше. Переключение класса. Другая цель настоящего изобретения заключается в разработке способа преобразования данного класса или подкласса антитела к CD40 в другой класс или подкласс. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая VL или VH, которая не включает какие-либо последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующие CL или CH, выделяют с использованием способов, хорошо известных в данной области. Затем молекулу нуклеиновой кислоты присоединяют путем сшивки к последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей CL или CH требуемого класса или подкласса иммуноглобулинов. Это можно осуществить с использованием вектора или молекулы нуклеиновой кислоты, которая содержит CL- или CH-цепь, как описано выше. Например, антитело кCD40, которое изначально представляет собой IgM, можно переключить (переделать) в класс IgG. Далее,класс переключения можно использовать для преобразования одного IgG-подкласса в другой, например,из IgG1 в IgG2. Другой способ получения антитела согласно изобретению, содержащего требуемый изотип, включает в себя стадии выделения нуклеиновой кислоты, кодирующей тяжелую цепь антитела кCD40, и нуклеиновой кислоты, кодирующей легкую цепь антитела к CD40, выделение последовательности, кодирующей VH-участок, лигирование данной VH-последовательности с последовательностью, кодирующей константный домен тяжелой цепи требуемого изотипа, экспрессию гена легкой цепи и конструирование тяжелой цепи в клетке, и сборку антитела к CD40 с требуемым изотипом. Деиммунизированные антитела. Другой путь получения антител со сниженной иммуногенностью заключается в деиммунизации антител. В другом аспекте настоящего изобретения данное антитело можно деиммунизировать с использованием методов, описанных, например, в публикациях РСТWO 98/52976 и WO 00/34317 (которые включены здесь путем ссылки в их полноте). Мутантные антитела. В другом варианте осуществления настоящего изобретения молекулы нуклеиновой кислоты, векторы и хозяйские клетки можно использовать для создания мутантных антител против CD40. Антитела можно изменить с помощью мутаций по вариабельным доменам тяжелой и/или легкой цепей, например,- 26011449 изменить характеристику связывания антитела. Например, мутацию можно осуществить по одному или нескольким CDR-участкам для увеличения или уменьшения KD данного антитела к CD40, для увеличения или уменьшения Koff или для изменения специфичности связывания антитела. Методы сайтнаправленного мутагенеза хорошо известны в данной области. См., например, Sambrook et al. и Ausubelet al. выше. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения мутации осуществляют по аминокислотному остатку, так, чтобы он был измененным по сравнению с остатком в вариабельном домене антитела против CD40 у клеток зародышевой линии. В другом варианте осуществления настоящего изобретения одну или несколько мутаций осуществляют по аминокислотному остатку, который известным образом изменен по сравнению с остатком из клеток зародышевой линии на CDR-участке или в области рамки считывания вариабельного домена, или в константном домене моноклонального антитела 3.1.1, 3.1.1 Н-А 78 Т, 3.1.1 Н-А 78 Т-V88A-V97A, 3.1.1L-L4M-L83V, 7.1.2, 10.8.3, 15.1.1, 21.4.1,21.2.1, 22.1.1, 22.1.1 Н-С 109 А, 23.5.1, 23.25.1, 23.28.1, 23.28.1H-D16E, 23.28.1L-C92A, 23.29.1, 23.29.1LR174K и 24.2.1. В другом варианте осуществления настоящего изобретения одну или несколько мутаций осуществляют по аминокислотному остатку, который известным образом изменен по сравнению с остатком из клеток зародышевой линии на CDR-участке или в области рамки считывания вариабельного домена аминокислотной последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 4, 12, 20, 28, 36, 44, 52, 60, 68, 76,84, 94, 100, 102, 2, 10, 18, 26, 34, 42, 50, 58, 66, 74, 82, 90, 92, 96, 98, 100 или 102, или последовательности нуклеиновой кислоты, которая представлена в SEQ ID NO: 3, 11, 19, 27, 35, 43, 51, 59, 67, 75, 83, 93, 99,101, 1, 9, 17, 25, 33, 41, 49, 57, 65, 73, 81, 89, 91, 95, 97, 99 и 101. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения область рамки считывания видоизменяют таким образом, чтобы полученный участок (участки) обладал аминокислотной последовательностью соответствующего гена клеток зародышевой линии. Мутацию можно осуществить в области рамки считывания или константного домена для увеличения времени полужизни антитела к CD40. См., например, публикацию РСТWO 00/09560, включенную здесь путем ссылки. Мутацию в области рамки считывания или константного домена можно также осуществить для изменения иммуногенности антитела,для создания сайта ковалентного или нековалентного связывания с другой молекулой или для изменения таких характеристик, как фиксация комплемента, FcR-связывание и ADCC. В соответствии с настоящим изобретением одиночное антитело может обладать мутациями в любом одном или нескольких участках рамки считывания, в константном домене и в вариабельных областях. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения существует от 1 до 18 аминокислотных мутаций в любом из VH- или VL-доменов мутантного антитела к CD40 (в том числе любое число мутаций между ними) по сравнению с антителом против CD40 до мутирования. В любой из вышеуказанных ситуаций данные мутации могут происходить в одном или в нескольких CDR-участках. Далее, любая мутация может быть представлена консервативными аминокислотными заменами. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения существует не более чем 5, 4, 3, 2 или 1 аминокислотных замен в константных доменах. Модифицированные антитела. В другом варианте осуществления настоящего изобретения слитое антитело или иммуноадгезин можно осуществить так, чтобы оно включало антитело к CD40 согласно изобретению, целиком или частично, присоединенное к другому полипептиду. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения только вариабельные домены антитела к CD40 соединены с другим полипептидом. В другом предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения VH-домен антитела к CD40 присоединен к первому полипептиду, a VL-домен антитела к CD40 присоединен ко второму полипептиду, который связан с первым полипептидом таким образом, что домены VH и VL могут взаимодействовать друг с другом с образованием сайта связывания антитела. В другом предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения VH-домен отделен от VL-домена линкером таким образом, что домены VH и VL могут взаимодействовать друг с другом (см. ниже в разделе "Одноцепочечные Антитела"). В последующем VH-линкер присоединяется к представляющему интерес полипептиду. Такое слияние антитела полезно для направленного перехода полипептида в клетку или ткань, экспрессирующиеCD40. Полипептид может представлять собой терапевтический агент, такой как токсин, фактор роста или иной регуляторный белок, или может представлять собой диагностический агент, такой как фермент,который можно легко визуализировать, такой как пероксидаза хрена. Кроме того, можно создать слитые антитела, в которых соединены друг с другом два (или более) одноцепочечных антитела. Это удобно,когда хотят создать бивалентное или поливалентное антитело в одной полипептидной цепи или когда хотят создать антитело с двойной спецификой. Для создания одноцепочечного антитела (scFv) фрагменты VH- и VL-кодирующей ДНК присоединяют путем сшивки к другому фрагменту, кодирующему гибкий линкер, например, кодирующему данную аминокислотную последовательность (Gly4-Ser)3, так, чтобы последовательности VH и VL могли экспрессироваться в виде соответствующего смежного одноцепочечного белка, содержащего объединенные гибким линкером VL- и VH-домены. См., например, Bird et al., Science 242:423-426 (1988); Huston et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883 (1988); McCafferty et al., Nature 348:552-554 (1990). Одноцепочечное антитело может быть одновалентным, если используются только единичные VH и VL, может быть- 27011449 бивалентным, если используются два VH и VL, или поливалентным, если используется более двух VH иVL. Можно создать биспецифические или поливалентные антитела, которые специфически свяжутся сCD40 и с другой молекулой. В других вариантах осуществления настоящего изобретения могут быть получены другие модифицированные антитела с использованием молекул нуклеиновой кислоты, кодирующих антитело к CD40. Например, "Каппа-тельца" (Ill et al., Protein Eng. 10:949-57 (1997, "Минительца" (Martin et al., EMBO J. 13:5303-9 (1994, "Диательца" (Holliger et al., Proc. Natl. Acad. Sex. USA 90:6444-6448 (1993, или "Janusins" (Traunecker et al., EMBO J. 10:3655-3659 (1991) и Traunecker et al., Int. J. Cancer (Suppl.) 7:51-52(1992 можно получить с использованием стандартных методов молекулярной биологии, следуя указаниям соответствующих описаний. Биспецифические антитела или антигенсвязывающие фрагменты можно получить разнообразными способами, в том числе слиянием гибридом или соединением Fab'-фрагментов. См., например, SongsivilaiLachmann, Clin. Exp. Immunol. 79:315-321 (1990), Kostelny et al., J. Immunol. 148:1547-1553 (1992). Кроме того, биспецифические антитела можно образовать в виде "диателец" или "Janusins". В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения биспецифические антитела связывают два разных эпитопа CD40. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения биспецифическое антитело обладает первой тяжелой цепью и первой легкой цепью моноклонального антитела 3.1.1, 3.1.1 НА 78 Т, 3.1.1H-A78T-V88A-V97A, 3.1.1L-L4M-L83V, 7.1.2, 10.8.3, 15.1.1, 21.4.1, 21.2.1, 22.1.1, 22.1.1 НС 109 А, 23.5.1, 23.25.1, 23.28.1, 23.28.1H-D16E, 23.28.1L-C92A, 23.29.1, 23.29.1L-R174K и 24.2.1, и дополнительной тяжелой цепью и легкой цепью антитела. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения дополнительная легкая цепь и тяжелая цепь также представлены цепями одного из вышеуказанных моноклональных антител, но отличаются от указанной первой тяжелой и легкой цепей. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения вышеописанные модифицированные антитела получают с использованием одного или нескольких вариабельных доменов или CDRучастков созданного здесь моноклонального антитела человека к CD40, из аминокислотной последовательности указанного моноклонального антитела или из тяжелой цепи или легкой цепи, кодируемой последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей указанное моноклональное антитело. Антитела преобразованные и меченые. Антитело к CD40 или его антигенсвязывающую часть согласно изобретению можно преобразовать или соединить с другой молекулой (например, другого пептида или белка). Вообще данное антитело или его часть преобразуют так, чтобы связывание CD40 не оказывало отрицательного влияния на преобразование или мечение. В соответствии с этим антитела или части антител согласно изобретению распространяются как на интактные, так и на модифицированные формы описанных здесь антител человека против CD40. Например, антитело или часть антитела согласно изобретению можно функционально соединить (путем химического присоединения, генетического слияния, нековалентного связывания или иначе) с одним или несколькими другими молекулярными элементами, такими как другое антитело (например, биспецифическое антитело или диательце), детектирующий агент, цитотоксический агент, фармацевтический агент и/или белок или пептид, которые могут опосредовать связь антитела или его части с другой молекулой (такой как коровая область стрептавидина или полигистидиновая метка). Один из типов преобразованного антитела получают путем перекрестного связывания двух или нескольких антител (одного и того же типа или разных типов, например, для создания биспецифических антител). Соответствующие перекрестные линкеры включают в себя линкеры, которые являются гетеробифункциональными, обладающими двумя разными реакционными группами, разделенными подходящим спейсером (например, сложный эфир мета-малеимидобензоил-N-гидроксисукцинимида) или гомобифункциональными (например, дисукцинимидилсуберат). Такие линкеры доступны от Pierce ChemicalCompany, Rockford, Ill. Другой тип преобразованного антитела представляет собой меченое антитело. Пригодные детектирующие агенты, с помощью которых антитело или антигенсвязывающую часть согласно изобретению можно преобразовать, включают в себя флуоресцентные соединения, в том числе флуоресцеин, флуоресцеинизотиоцианат, родамин, 5-диметиламин-1-нафталинсульфонилхлорид, фикоэретрин, лантаноидные фосфаты и т.п. Антитело можно также пометить с помощью ферментов, которые используют для детекции, таких как пероксидаза хрена, -галактозидаза, люцифераза, щелочная фосфатаза, глюкооксидаза и тому подобное. Если антитело метят с помощью детектируемого фермента, то его выявляют при добавлении дополнительных реагентов, чтобы использовать фермент для получения продукта реакции,который можно визуально распознать. Например, если агент представляет собой пероксидазу хрена, то добавление пероксида водорода и диаминобензидина дает цветной продукт реакции, который и детектируется. Антитело можно также метить биотином и детектировать путем непрямого измерения авидинового или стрептавидинового связывания. Антитело можно также метить с помощью эпитопа заранее установленного полипептида, узнаваемого вторичным репортером (например, парными последовательностями лейциновой застежки, сайтами связывания вторичных антител, металлосвязывающими доменами,эпитопными метками). В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения метки присоединяют с помощью "ножек" разной длины, чтобы уменьшить возможное пространственное затруднение.- 28011449 Антитело к CD40 можно также метить аминокислотой с радиоактивной меткой. Радиоактивная метка может использоваться для диагностических и терапевтических целей. Например, радиоактивная метка может использоваться для детекции опухолей, экспрессирующих CD40, методами рентгенодиагностики или иными методами диагностики. Далее, радиоактивная метка может использоваться терапевтически в виде токсина для раковых клеток или опухолей. Примеры меток для полипептидов включают в себя, не ограничиваясь ими, следующие радиоизотопы или радионуклиды - 3H, 14C, 15N, 35S, 90Y, 99Tc,111In, 125I, 131I. Антитело против CD40 можно также преобразовать с помощью химической группы, такой как полиэтиленгликолевая (PEG), метиловая или этиловая группа или с помощью углеводной группы. Данные группы используют для улучшения биологических характеристик антитела, например, для увеличения времени полужизни сыворотки или для повышения тканевого связывания. Фармацевтические композиции и наборы. Настоящее изобретение относится также к композициям, содержащим агонист антитела противCD40 для лечения пациентов, нуждающихся в иммунной стимуляции. Такие композиции используют для лечения, предупреждения, снижения частоты или тяжести инфицированности, включая вирусную и бактериальную инфицированность, для лечения гиперпролиферативного нарушения, включая злокачественное и предраковое состояния, для лечения генетических иммунодефицитных состояний у животных, в том числе и у людей, таких как синдром гиперсекреции IgM и для лечения первичных или комбинированных иммунодефицитных состояний, включая состояния, характеризующиеся нейтропенией. Пациенты, подвергающиеся лечению с помощью терапии агонистом антитела против CD40, включают пациента, нуждающегося в усилении иммунитета, включают, не ограничиваясь ими, людей пожилого возраста и индивидов, у которых иммунитет подавлен, например из-за химиотерапии. Гиперпролиферативные нарушения, которые можно подвергнуть лечению с помощью агониста антитела против CD40 согласно изобретению, могут затрагивать любую ткань или орган и включают в себя, не ограничиваясь этим, злокачественные опухоли головного мозга, легких, сквамозных клеток, мочевого пузыря, желудка, поджелудочной железы, молочной железы, головы, шеи, печени, почки, яичника,предстательной железы, прямой кишки, пищевода, гинекологические, носоглотки, или злокачественные опухоли щитовидной железы, меланомы, лимфомы, лейкозные или множественные миеломы. В частности, агонисты антител человека против CD40 согласно изобретению пригодны для лечения карцином молочной железы, предстательной железы, ободочной кишки и легкого. Лечение может включать в себя введение одного или нескольких агонистов моноклональных антител против CD40 согласно изобретению или их антигенсвязывающих фрагментов, отдельно или вместе с фармацевтически приемлемым носителем. Используемый здесь "фармацевтически приемлемый носитель" означает любой или все растворители, диспергирующие среды, сенсибилизаторы, антибактериальные и противогрибковые агенты, изотонические и задерживающие адсорбцию агенты и им подобные,которые физиологически совместимы. Некоторые примеры фармацевтически приемлемых носителей представляют собой воду, физиологический раствор, фосфатно-солевой буферный раствор, декстрозу,глицерин, этанол и им подобные, а также их сочетания. Во многих случаях в данную композицию предпочтительно включать изотонические растворы, например, сахара, полиспирты, такие как маннит, сорбит, либо хлорид натрия. Дополнительные примеры фармацевтически совместимых веществ представляют собой увлажняющие агенты, или минорные количества вспомогательных веществ, таких как увлажняющие или эмульгирующие агенты, консерванты или буферы, которые повышают срок годности при хранении или эффективность данного антитела. Агонисты антител против CD40 согласно изобретению и композицию, включающие их, можно вводить в сочетании с одним или несколькими другими терапевтическими, диагностическими или профилактическими агентами. Дополнительные терапевтические агенты включают в себя другие антибластомные, противораковые, антиангиогенные или химиотерапевтические агенты. Такие дополнительные агенты могут быть включены в одну композицию или могут быть введены раздельно. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения один или несколько агонистов антител против CD40 согласно изобретению могут использоваться в качестве вакцины или в качестве адъювантов к вакцине. Композиции согласно изобретению могут быть разнообразными по форме, например, жидкими, полужидкими и твердыми дозированными формами, такими как жидкие растворы (например, инъецируемые и инфузионные растворы), дисперсии или суспензии, таблетки, пилюли, порошки, липосомы или свечи. Предпочтительная форма зависит от предполагаемого режима введения и терапевтического применения. Типичные предпочтительные композиции представлены в форме инъецируемых или инфузионных растворов, таких как композиции, аналогичные композициям для пассивной иммунизации человека. Предпочтительным режимом введения является парентеральный (например, внутривенный, подкожный, внутрибрюшинный, внутримышечный). В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения данное антитело вводят путем внутривенного вливания или внутривенной инъекции. В другом предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения данное антитело вводят путем внутримышечной или подкожной инъекции. Как правило, терапевтические композиции должны быть стерильными и стабильными в условиях- 29011449 изготовления и хранения. Данную композицию можно создать в виде раствора, микроэмульсии, дисперсии, липосомы или иной упорядоченной структуры, пригодной для высококонцентрированного лекарственного средства. Стерильные инъецируемые растворы можно получить путем включения антител кCD40 в требуемом количестве в соответствующий растворитель с одним или, при необходимости, с сочетанием вышеперечисленных ингредиентов с последующей стерилизацией фильтрованием. В основном, дисперсии готовят путем включения данного активного соединения в стерильный наполнитель, который содержит щелочную дисперсионную среду и требуемые другие ингредиенты из вышеперечисленных ингредиентов. Что касается стерильных порошков для приготовления стерильных инъекционных растворов, предпочтительные способы их получения представлены вакуумной сушкой и замораживанием-оттаиванием, что дает не только активный порошкообразный ингредиент, но и любой необходимый дополнительный ингредиент из его ранее стерилизованного фильтрованием раствора. Надлежащую текучесть раствора можно сохранить, например, путем нанесения слоя, такого как лецитин, путем поддержания размера частиц, что касается дисперсии, и путем использования поверхностно-активных соединений. Поглощение инъецированных композиций можно пролонгировать путем включения в данную композицию агента, задерживающего поглощение, например, солей моностеарата и желатины. Антитела настоящего изобретения можно вводить разнообразными способами, известными в данной области, хотя для многих терапевтических применений предпочтительным путем/способом введения является подкожное, внутримышечное или внутривенное вливание. Квалифицированным младшим специалистам следует иметь в виду, что путь и/или способ введения варьирует в зависимости от желаемых результатов. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения, композиции антител активного соединения можно приготовить с носителем, который защищает данное антитело от быстрого высвобождения, таким носителем, который контролирует высвобождение композиции, в том числе, имплантаты,чрескожные пэтчи, и микроинкапсулируемые системы доставки. Можно использовать рассасывающиеся,биосовместимые полимеры, такие как этиленвинилацетат, полиангидриды, полигликолевую кислоту,коллаген, эфиры жирных ортокислот и многоатомных спиртов, и полимолочную кислоту. Многие способы получения таких композиций запатентованы и, как правило, известны специалистам в данной области. См., например, Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems (Продолжительное и контролируемое высвобождение систем доставки лекарственных средств) (J.R.Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc.,New York, 1978). В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения антитело против CD40 согласно изобретению можно вводить перорально, например, вместе с инертным разбавителем или усвояемым пищевым носителем. Данное соединение (и, при необходимости, другие ингредиенты) можно также заключить в капсулу из твердой или мягкой желатиновой оболочки, запрессовать в таблетки, или включить непосредственно в диету пациента. Для перорального терапевтического введения антитело к CD40 можно включить вместе с наполнителями и использовать в форме проглатываемых таблеток, защечных таблеток, пастилок, капсул, эликсиров, суспензий, сиропов, облаток и тому подобное. Для введения соединения настоящего изобретения непарентеральным путем введения может возникнуть потребность покрыть данное соединение или ввести данное соединение совместно с веществом, защищающим его от инактивации. В данные композиции можно также включить дополнительные активные соединения. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения антитело к CD40 настоящего изобретения составляют совместно и/или вводят совместно с одним или несколькими дополнительными терапевтическими агентами. Данные агенты включают, без ограничения, антитела, которые связывают другие мишени (например, антитела, такие как антитела к CTL4, которые связывают один или несколько ростовых факторов или цитокинов с их рецепторами на клеточной поверхности), антибластомные средства, противоопухолевые агенты, химиотерапевтические агенты, пептидные аналоги, которые активируют CD40, растворимый CD40L, один или несколько химических агентов, которые активируют CD40, и/или иные агенты,известные в данной области, которые усиливают иммунный ответ против клеток злокачественной опухоли, например, IFN-1, IL-2, IL-8, IL-12, IL-15, IL-18, IL-23, IFN- и GM-CSF. При таком комбинированном лечении могут понадобиться более низкие дозы антитела к CD40, а также совместно вводимых агентов, с тем, чтобы исключить возможные токсикозы или осложнения, связанные с той или иной монотерапией. Агонисты антитела против CD40 согласно изобретению и композиции, включающие их, также можно вводить в сочетаниис другими лечебными режимами, в частности, в сочетании с радиационным лечением. Композиции согласно изобретению могут включать в себя "терапевтически эффективное количество" или "профилактически эффективное количество" антитела или его антигенсвязывающей части согласно изобретению. "Терапевтически эффективное количество" относится к эффективному количеству для достижения требуемого терапевтического результата в необходимых дозах и в течение необходимых интервалов времени. Терапевтически эффективное количество данного антитела или части антитела может изменяться в соответствии с такими факторами, как состояние больного, возраст, пол и масса тела

МПК / Метки

МПК: A61K 39/395, C12N 15/00, C12N 15/11, C12N 15/63, C12N 5/10, C07K 16/28, C12N 15/12, A61P 37/04, A61P 35/00

Метки: антитело, способы, моноклональное, применения, человека

Код ссылки

<a href="https://eas.patents.su/30-11449-monoklonalnoe-antitelo-cheloveka-k-cd40-i-sposoby-ego-primeneniya.html" rel="bookmark" title="База патентов Евразийского Союза">Моноклональное антитело человека к cd40 и способы его применения</a>