Бактериальные упаковывающие штаммы, используемые для генерирования и продуцирования рекомбинантных нуклеокапсидов с двухцепочечной рнк и их применение
Номер патента: 11282
Опубликовано: 27.02.2009
Авторы: Стоун Мишель, Фулкерсон Джон, Хоун Дэвид Майкл, Ониэйб Дэвид, Сэдофф Джералд С.
Формула / Реферат
1. Бактериальный штамм для упаковки, продуцирования и/или доставки генов или РНК, включающий:
a) геномную ДНК, содержащую по меньшей мере одну селектируемую фенотипическую мутацию;
b) последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующие гены, необходимые для продуцирования нуклеокапсида;
c) один или несколько нуклеокапсидов, содержащих белки, обладающие РНК-упаковывающей и РНК-полимеразной активностью; и
d) последовательности dsРНК, содержащиеся в указанном одном или нескольких нуклеокапсидах, где указанные последовательности dsРНК кодируют, по меньшей мере:
i) генный продукт, который комплементирует указанную, по меньшей мере одну селектируемую фенотипическую мутацию, и
ii) представляющую интерес РНК, функционально связанную с последовательностью инициации трансляции в эукариотах.
2. Бактериальный штамм по п.1, где указанные последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующие гены, необходимые для продуцирования нуклеокапсида, присутствуют в указанном одном или нескольких нуклеокапсидах.
3. Бактериальная клетка по п.1, где указанные последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующие гены, необходимые для продуцирования нуклеокапсида, присутствуют в указанной геномной ДНК.
4. Бактериальная клетка по п.1, где указанная бактериальная клетка дополнительно содержит плазмиду и где указанные последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующие гены, необходимые для продуцирования нуклеокапсида, являются частью указанной плазмиды.
5. Штамм по п.1, где указанные последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующие гены, необходимые для продуцирования нуклеокапсида, включают сегмент-L РНК-фага или его функциональный мутант.
6. Бактериальный штамм по п.1, где указанные последовательности dsРНК, содержащиеся в указанном одном или нескольких нуклеокапсидах, включают по меньшей мере часть сегмента-S РНК, или сегмента-М РНК-фага или вируса, или то и другое.
7. Бактериальный штамм по п.6, где указанной частью сегмента-S является последовательность pac сегмента-S.
8. Бактериальный штамм по п.6, где указанной частью сегмента-S является последовательность распознавания РНК-зависимой полимеразы для сегмента-S.
9. Бактериальный штамм по п.6, где указанной частью сегмента-М является последовательность pac сегмента-М.
10. Бактериальный штамм по п.6, где указанной частью сегмента-М является последовательность распознавания РНК-зависимой полимеразы для сегмента-М.
11. Бактериальный штамм по п.1, где указанной селектируемой фенотипической мутацией является ауксотрофная мутация.
12. Бактериальный штамм по п.11, где указанная ауксотрофная мутация выбрана из группы, состоящей из aroA-, aroC-, leuD-, asd- и murI-мутаций.
13. Бактериальный штамм по п.1, где указанной селектируемой фенотипической мутацией является мутация синтеза клеточной стенки.
14. Бактериальный штамм по п.13, где указанная мутация синтеза клеточной стенки выбрана из группы, состоящей из asd- и murI-мутаций.
15. Бактериальный штамм по п.1, где указанной селектируемой фенотипической мутацией является мутация, предупреждающая рост при температуре выше 32шС.
16. Бактериальный штамм по п.15, где указанной селектируемой фенотипической мутацией, предупреждающей рост при температуре выше 32шС, является htrB-мутация.
17. Бактериальный штамм по п.1, где указанные белки, обладающие РНК-упаковывающей и РНК-полимеразной активностью, и указанные последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующие гены, необходимые для продуцирования нуклеокапсида фага или вируса, происходят из фага, выбранного из группы, состоящей из Phi-6, Phi-7, Phi-8, Phi-9, Phi-10, Phi-11, Phi-12 и Phi-13.
18. Бактериальный штамм по п.1, где указанный бактериальный штамм происходит из видов бактерий, выбранных из группы, состоящей из Campylobacter, Neisseria, Haemophilus, Aeromonas, Francisella, Yersinia, Klebsiella, Bordetella, Legionella, Corynebacterium, Chlamydia, Brucella, Pseudomonas, Helicobacter, Citrobacter, Vibrio, Escherichia, Shigella, Salmonella, Listeria и Mycobacterium.
19. Бактериальный штамм по п.1, где указанная представляющая интерес РНК кодирует белок, выбранный из группы, состоящей из вирусного антигена, бактериального антигена, паразитарного антигена, опухолевого антигена, антигена трансплантантов, аутоиммунного антигена, адъюванта и цитокина.
20. Рекомбинантный нуклеокапсид, содержащий двухцепочечную РНК (rdsRN) и включающий:
a) белки, обладающие РНК-упаковывающей и РНК-полимеразной активностью; и
b) последовательности dsРНК, кодирующие, по меньшей мере:
i) генный продукт и
ii) представляющую интерес РНК, функционально связанную с последовательностью инициации трансляции в эукариотах.
21. rdsRN по п.20, дополнительно содержащий последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующие гены, необходимые для продуцирования нуклеокапсида.
22. rdsRN по п.21, где указанные последовательности нуклеиновой кислоты содержат сегмент-L РНК-фага или его функциональный мутант.
23. rdsRN по п.20, где указанные последовательности dsРНК содержат по меньшей мере часть сегмента-S РНК-фага, или сегмента-М РНК-фага, или то и другое.
24. rdsRN по п.23, где указанной частью сегмента-S является последовательность pac сегмента-S, ген 8 или сегмент-S дикого типа.
25. rdsRN по п.23, где указанной частью сегмента-S является последовательность распознавания РНК-зависимой полимеразы для сегмента-S.
26. rdsRN no п.23, где указанной частью сегмента-М является последовательность pac сегмента-М.
27. rdsRN по п.23, где указанной частью сегмента-М является последовательность распознавания РНК-зависимой полимеразы для сегмента-М.
28. rdsRN по п.20, где указанный генный продукт комплементирует селектируемую фенотипическую мутацию в клетке-хозяине.
29. rdsRN по п.28, где указанная фенотипическая мутация выбрана из группы, состоящей из aroA-, aroC- и leuD-мутаций.
30. rdsRN по п.20, где указанный представляющий интерес ген кодирует мутацию синтеза клеточной стенки.
31. rdsRN по п.30, где указанная мутация синтеза клеточной стенки выбрана из группы, состоящей из asd- и murI-мутаций.
32. rdsRN по п.20, где указанный представляющий интерес ген кодирует мутацию, предупреждающую рост при температуре выше 32шС.
33. rdsRN по п.32, где указанным представляющим интерес геном является htrB.
34. rdsRN по п.20, где указанные белки, обладающие РНК-упаковывающей и РНК-полимеразной активностью, происходят из фага, выбранного из группы, состоящей из Phi-6, Phi-8 и Phi-13.
35. rdsRN по п.20, где указанная представляющая интерес РНК кодирует белок, выбранный из группы, состоящей из вирусного антигена, бактериального антигена, паразитарного антигена, опухолевого антигена, антигена трансплантатов, аутоиммунного антигена, адъюванта и цитокина.
36. rdsRN по п.20, где одна или несколько указанных последовательностей dsРНК являются фторированными.
37. Вакцинный препарат, включающий бактериальные клетки, содержащие:
a) геномную ДНК, содержащую по меньшей мере одну селектируемую фенотипическую мутацию;
b) последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующие гены, необходимые для продуцирования нуклеокапсида;
c) один или несколько нуклеокапсидов, содержащих белки, обладающие РНК-упаковывающей и РНК-полимеразной активностью; и
d) последовательности dsРНК, содержащиеся в указанном нуклеокапсиде, где указанные последовательности РНК кодируют, по меньшей мере:
i) генный продукт и
ii) РНК, кодирующую иммуноген, функционально связанный с последовательностью инициации трансляции в эукариотах.
38. Вакцинный препарат по п.37, где одна или несколько указанных последовательностей dsРНК являются фторированными.
39. Вакцинный препарат, включающий рекомбинантные нуклеокапсиды, содержащие двухцепочечную РНК (rdsRN) и включающие:
a) белки, обладающие РНК-упаковывающей и РНК-полимеразной активностью; и
b) последовательности dsРНК, кодирующие, по меньшей мере:
i) генный продукт, который комплементирует по меньшей мхЁх одну селектируемую фенотипическую мутацию;
ii) РНК, кодирующую иммуноген, функционально связанный с последовательностью инициации трансляции в эукариотах; и
(iii) последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующие гены, необходимые для продуцирования нуклеокапсида фага или вируса.
40. Способ создания рекомбинантной бактерии для ее использования в качестве бактериального упаковывающего штамма, где указанный способ включает стадии
введения по меньшей мере одной селектируемой фенотипической мутации в геномную ДНК бактерии;
генетического конструирования указанной бактерии так, чтобы она содержала ДНК, кодирующую функциональные нуклеокапсидные белки фага, содержащего двухцепочечную РНК; и
встраивания в указанную бактерию мРНК-сегментов, кодирующих:
(i) по меньшей мере один ген, кодирующий функциональный продукт, который комплементирует по меньшей мере одну указанную селектируемую фенотипическую мутацию; и
(ii) функциональные нуклеокапсидные белки фага, содержащего двухцепочечную РНК.
41. Способ по п.40, где указанные мРНК-сегменты дополнительно кодируют представляющий интерес ген.
42. Мутантная бактерия, содержащая одну или несколько последовательностей ДНК, экспрессирующих dsRP-прокапсиды, и мутацию, которая позволяет проводить отбор и сохранять rdsRN, экспрессирующие функциональный ген, комплементирующий указанную мутацию.
43. Бактериальный штамм по п.14, где указанной мутацией синтеза клеточной стенки является asd-мутация.
44. Бактериальный штамм по п.17, где указанные белки, обладающие РНК-упаковывающей и РНК-полимеразной активностью, и указанные последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующие гены, необходимые для продуцирования нуклеокапсида фага или вируса, происходят из фага Phi-8 и включают ген 8 фага Phi-8.
45. Бактериальный штамм по п.18, где указанный бактериальный штамм происходит из Shigella.
46. Бактериальный штамм по п.19, где указанным белком является бактериальный антиген.
47. Бактериальная клетка по п.46, где указанным бактериальным антигеном является туберкулезный антиген.
48. rdsRN по п.31, где указанной мутацией синтеза клеточной стенки является asd-мутация.
49. rdsRN по п.34, где указанные белки, обладающие РНК-упаковывающей и РНК-полимеразной активностью, происходят из фага Phi-8 и включают ген 8 фага Phi-8.
50. rdsRN по п.35, где указанным белком является бактериальный антиген.
51. rdsRN по п.50, где указанным бактериальным антигеном является туберкулезный антиген.
52. Бактериальный штамм по п.1, где указанная представляющая интерес РНК кодирует белок, усиливающий апоптоз.
53. Бактериальный штамм по п.52, где указанный белок, усиливающий апоптоз, выбран из группы, состоящей из каспазы-8, рецептора гибели-5, Fas и гибридного белка, включающего цитоплазматические домены Fas/эктодомен CD4.
54. Бактериальный штамм по п.1, где указанная представляющая интерес РНК кодирует белок, индуцирующий толерантность.
55. Бактериальный штамм по п.54, где указанным белком, индуцирующим толерантность, является каспаза 9.
56. Рекомбинантный нуклеокапсид, содержащий двухцепочечную РНК, по п.20, где указанная представляющая интерес РНК кодирует белок, усиливающий апоптоз.
57. Рекомбинантный нуклеокапсид, содержащий двухцепочечную РНК, по п.20, где указанная представляющая интерес РНК кодирует белок, индуцирующий толерантность.
58. Бактериальный штамм по п.1, где указанная dsРНК включает РНК, устойчивую к нуклеазе.
59. Бактериальный штамм по п.58, где указанной РНК, устойчивой к нуклеазе, является фторированная РНК.
60. Рекомбинантный нуклеокапсид, содержащий двухцепочечную РНК, по п.20, где указанная dsРНК включает РНК, устойчивую к нуклеазе.
61. Рекомбинантный нуклеокапсид, содержащий двухцепочечную РНК, по п.60, где указанной РНК, устойчивой к нуклеазе, является фторированная РНК.
62. Бактериальный штамм для упаковки, запуска синтеза и продуцирования rdsRN, включающий:
a) геномную ДНК, содержащую по меньшей мере одну селектируемую фенотипическую мутацию;
b) последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующие гены, необходимые для продуцирования прокапсида; и
c) один или несколько прокапсидов, содержащих белки, обладающие РНК-упаковывающей и РНК-полимеразной активностью.
63. Фторированные последовательности РНК для запуска синтеза rdsRN, кодирующие, по меньшей мере:
i) генный продукт, который комплементирует по меньшей мере одну селектируемую фенотипическую мутацию, и
ii) представляющую интерес РНК, функционально связанную с последовательностью инициации трансляции в эукариотах.
64. Фторированные последовательности РНК, кодирующие, по меньшей мере:
i) генный продукт, который комплементирует по меньшей мере одну селектируемую фенотипическую мутацию,
ii) ген-8 (SEQ ID NO: 7) для стабилизации продуцирования нуклеокапсида; и
iii) представляющую интерес РНК, функционально связанную с последовательностью инициации трансляции в эукариотах.
65. Фторированные последовательности РНК, кодирующие, по меньшей мере:
i) гены, необходимые для продуцирования нуклеокапсида;
ii) генный продукт, который комплементирует по меньшей мере одну селектируемую фенотипическую мутацию, и
iii) представляющую интерес РНК, функционально связанную с последовательностью инициации трансляции в эукариотах.
66. Фторированные последовательности РНК, кодирующие, по меньшей мере:
i) гены, необходимые для продуцирования нуклеокапсида;
ii) генный продукт, который комплементирует указанную, по меньшей мере одну селектируемую фенотипическую мутацию,
iii) ген-8 (SEQ ID NO: 7) для стабилизации продуцирования нуклеокапсида; и
iv) представляющую интерес РНК, функционально связанную с последовательностью инициации трансляции в эукариотах.
67. Среда для электропорации, состоящая из:
(i) бактериального штамма для упаковки, запуска синтеза и продуцирования rdsRN, включающего:
a) геномную ДНК, содержащую по меньшей мере одну селектируемую фенотипическую мутацию;
b) последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующие гены, необходимые для продуцирования прокапсида;
c) один или несколько прокапсидов, содержащих белки, обладающие РНК-упаковывающей и РНК-полимеразной активностью; и
(ii) фторированных последовательностей РНК, кодирующих, по меньшей мере:
а) генный продукт, который комплементирует указанную, по меньшей мере одну селектируемую фенотипическую мутацию, и
b) представляющую интерес РНК, функционально связанную с последовательностью инициации трансляции в эукариотах.
68. Среда для электропорации, состоящая из:
(i) бактериального штамма для упаковки, запуска синтеза и продуцирования rdsRN, включающего:
a) геномную ДНК, содержащую по меньшей мере одну селектируемую фенотипическую мутацию;
b) последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующие гены, необходимые для продуцирования прокапсида;
c) один или несколько прокапсидов, содержащих белки, обладающие РНК-упаковывающей и РНК-полимеразной активностью; и
(ii) фторированных последовательностей РНК, кодирующих, по меньшей мере:
a) генный продукт, который комплементирует указанную, по меньшей мере одну селектируемую фенотипическую мутацию,
b) ген-8 (SEQ ID NO: 7) для стабилизации продуцирования нуклеокапсида; и
c) представляющую интерес РНК, функционально связанную с последовательностью инициации трансляции в эукариотах.
69. Среда для электропорации, состоящая из:
(i) бактериального штамма для упаковки, запуска синтеза и продуцирования rdsRN, включающего:
a) геномную ДНК, содержащую по меньшей мере одну селектируемую фенотипическую мутацию;
b) последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующие гены, необходимые для продуцирования прокапсида;
c) один или несколько прокапсидов, содержащих белки, обладающие РНК-упаковывающей и РНК-полимеразной активностью; и
(ii) фторированных последовательностей РНК, кодирующих, по меньшей мере:
a) геэы, необходимые для продуцирования нуклеокапсида;
b) генный продукт, который комплементирует указанную по меньшей мере одну селектируемую фенотипическую мутацию,
c) ген-8 (SEQ ID NO: 7) для стабилизации продуцирования нуклеокапсида; и
d) представляющую интерес РНК, функционально связанную с последовательностью инициации трансляции в эукариотах.
70. Бактериальный штамм по п.1, где указанной по меньшей мере одной селектируемой фенотипической мутацией является необратимая селектируемая фенотипическая мутация.
71. rdsRN по п.28, где указанной селектируемой фенотипической мутацией является необратимая селектируемая фенотипическая мутация.
72. Вакцинный препарат по п.37, где указанной по меньшей мере одной селектируемой фенотипической мутацией является необратимая селектируемая фенотипическая мутация.
73. Вакцинный препарат по п.39, где указанной по меньшей мере одной селектируемой фенотипической мутацией является необратимая селектируемая фенотипическая мутация.
74. Способ по п.40, где указанной по меньшей мере одной селектируемой фенотипической мутацией является необратимая селектируемая фенотипическая мутация.
75. Бактериальный штамм по п.62, где указанной по меньшей мере одной селектируемой фенотипической мутацией является необратимая селектируемая фенотипическая мутация.
76. Фторированные последовательности РНК по п.63, где указанной по меньшей мере одной селектируемой фенотипической мутацией является необратимая селектируемая фенотипическая мутация.
77. Фторированные последовательности РНК по п.64, где указанной по меньшей мере одной селектируемой фенотипической мутацией является необратимая селектируемая фенотипическая мутация.
78. Фторированные последовательности РНК по п.65, где указанной по меньшей мере одной селектируемой фенотипической мутацией является необратимая селектируемая фенотипическая мутация.
79. Фторированные последовательности РНК по п.66, где указанной по меньшей мере одной селектируемой фенотипической мутацией является необратимая селектируемая фенотипическая мутация.
80. Среда для электропорации по п.67, где указанной по меньшей мере одной селектируемой фенотипической мутацией является необратимая селектируемая фенотипическая мутация.
81. Среда для электропорации по п.68, где указанной по меньшей мере одной селектируемой фенотипической мутацией является необратимая селектируемая фенотипическая мутация.
82. Среда для электропорации по п.69, где указанной по меньшей мере одной селектируемой фенотипической мутацией является необратимая селектируемая фенотипическая мутация.
Текст
011282 Область, к которой относится изобретение Настоящее изобретение относится к бактериальным упаковывающим штаммам, используемым в целях генерирования рекомбинантных нуклеокапсидов, содержащих двухцепочечную РНК, (rdsRN), для продуцирования РНК, кодирующей вакцинные антигены, биоактивные белки, иммунорегуляторные белки, антисмысловые РНК и каталитические РНК в эукариотических клетках или тканях. В частности, настоящее изобретение относится к бактериальным упаковывающим штаммам, в которые встраивается и упаковывается рекомбинантная ssРНК с образованием рекомбинантных нуклеокапсидов rdsRN de novo,которые реплицируются в указанных упаковывающих штаммах и, в свою очередь, продуцируют представляющую интерес РНК. Предшествующий уровень техники Вирусный нуклеокапсид, т.е. нуклепротеиновая сердцевина вирусов, обладает многочисленными свойствами, благодаря которым они могут экспрессировать гетерологичные генные последовательности в биологических системах. Из-за отсутствия внешних мембран и адгезинов, которые присутствуют в полных вирусах, нуклеокапсиды представляет собой неинфекционные частицы, состоящие из белков и генетического материала вирусной сердцевины, которая сохраняет способность образовывать капсид и реплицировать последовательности нуклеиновой кислоты. Таким образом, риск инфицирования или распространения инфекции в окружающую среду может быть уменьшен путем элиминации последовательностей, кодирующих мембраны, адгезины, протеазы и другие инфекционные или цитолитические факторы родительского вируса. Кроме того, РНК-нуклеокапсиды позволяют повышать безопасность таких генных экспрессионных систем путем выбора вирусных предшественников, которые, в своем репликативном цикле, не проходят стадию образования ДНК, что снижает риск включения чужеродной нуклеотидной последовательности в геном клетки или организма, в которую или в который они были введены. Природная нестабильность РНК может быть устранена, если при конструировании таких нуклеокапсидных экспрессионных систем использовать вирусы, содержащие двухцепочечную РНК (обозначаемую здесь "dsРНК"). Кроме того, элиминация ненуклеокапсидных последовательностей и типичное сегментирование геномов dsРНК-вирусов делает конструирование искусственных геномных сегментов, заменяющих делетированные последовательности и кодирующих гетерологичную РНК, привлекательным способом экспрессии представляющих интерес генов или доставки представляющей интерес РНК в биологические системы. Таким образом, рекомбинантная нуклеокапсидная экспрессионная система может быть сконструирована так, чтобы она могла содержать последовательности, необходимые для кодирования только дополнительных нуклеокапсидов; представляющие интерес гетерологичные последовательности; и последовательности, необходимые для их размножения и продуцирования в клетке. Фаг, содержащий двухцепочечную РНК, (обозначаемый здесь "dsRP") семейства цистовирусов является прототипом dsРНК-вирусов (Sinclair et al., J Virol. 16:685; 1975); (Mgraw et al., J Virol. 58:142; 1986); (Gottlieb et al., Virology 163:183; 1988); (Mindich et al., J Virol. 62:1180; 1988); (Mindich, Microbiol.Mol. Biol. Rev. 63, 149; 1999). Отличительными признаками цистовирусных dsRP является геном, состоящий из трех сегментов двухцепочечной РНК (далее обозначаемой "dsРНК") (Mcgraw et al., см. выше,1986); (Gottlieb et al., см. выше, 1988); (Mindich et al., см. выше, 1988), называемых сегментом-L, сегментом-М и сегментом-S, и липидсодержащей мембранной оболочки (Sands and Lowlicht, Can. J. Microbiol,22:154; 1976); (Bamford, and Palva, Biochim. Biophys. Acta, 601:245; 1980). Эти геномные сегменты находятся в нуклеокапсидной сердцевине, которая состоит из белков P1, P2, Р 4 и Р 7 и продуцируется генами,кодируемыми сегментом-L dsРНК (например, номер доступа в Genbank AF226851). Синтез плюс-цепи РНК (обозначаемой здесь "мРНК") происходит в нуклеокапсиде и осуществляется под действием РНКзависимой РНК-полимеразы, кодируемой, частично, геном-2 на сегменте-L (Mindich et al., см. выше,1988); (Van Etten et al., J Virol, 12:464; 1973); причем в синтезе мРНК определенную роль также играет ген-7 на сегменте-L (Mindich et al., см. выше, 1999).DsRP Phi-6, представляющий собой архетип этого семейства dsРНК-фагов, обычно инфицируетPseudomonas syringae (Mindich et al., см. выше, 1999), однако, совсем недавно, были выделены dsRP Phi8, Phi-11, Phi-12 и Phi-13, которые могут инфицировать и до определенной степени реплицироваться в штамме JM109 Escherichia coli (Американская коллекция типовых тканевых культур (обозначаемая здесь(обозначаемого далее "S. typhimurium") (Mindich et al., см. выше, 1999); (Mindich et al., J. Bacteriol,181:4505; 1999); (Hoogstraten et al., Virology, 272: 218; 2000); (Qiao et al., Virology 275: 218; 2000). Жизненный цикл архетипа dsRP Phi-6 в бактериях описан в литературе (Mindich, Adv Virus Res,35:137; 1988); (Mindich et al., см. выше, 1999). Phi-6 инфицирует клетки-хозяева посредством связывания с пилями, что позволяет ему контактировать с мембраной клетки-хозяина и, тем самым, приводит к слиянию и введению нуклеокапсида в периплазму. Затем этот нуклеокапсид поступает в цитоплазму,причем такое событие требует эндопептидазной активности белка Р 5 и наличия транспортных свойств белка Р 8. Интересно отметить, что нуклеокапсиды, которые имеют полноразмерный оболочечный белок Р 8, способны спонтанно проникать в бактериальные протопласты, что приводит к аутотрансфекции бактериального штамма, из которого были получены протопласты (Qiao et al., Virology 227:103; 1997);-1 011282 После проникновения в цитоплазму белок Р 8 удаляется, и оставшийся нуклеокапсид, содержащий три сегмента dsРНК и обладающий РНК-зависимой РНК-полимеразной активностью, начинает синтезировать мРНК-копии сегментов L, М и S dsРНК. Белки, продуцируемые сегментом-L, ассоциируются,главным образом, с продуцированием прокапсида; сегмент-M ответственен, главным образом, за синтез белков присоединения, а сегмент-S продуцирует оболочечный белок прокапсида (Р 8), литическую эндопептидазу (Р 5) и белки (Р 9 и Р 12), участвующие в продуцировании липидной оболочки (Johnson andMindich, J Bacteriol, 176: 4124; 1994). Упаковка dsРНК-сегментов происходит последовательно, где сегмент-S распознается и поглощается пустыми прокапсидами; при этом прокапсиды, содержащие сегментS, больше не связываются с этим сегментом, но еще обладают способностью связываться с сегментом-M и поглощать его, а прокапсиды, содержащие сегменты S и M, больше не связываются с этими сегментами, но еще обладают способностью связываться с сегментом-L и поглощать его, что приводит к продуцированию нуклеокапсида. Как только нуклеокапсид будет содержать все три сегмента одноцепочечной РНК (обозначаемой здесь "ssРНК"), начнется синтез минус-цепей РНК, в результате чего будут продуцироваться dsРНК-сегменты. Затем нуклеокапсид будет связываться с белками 5 и 8, и наконец, инкапсулироваться в липидной мембране, что будет приводить к завершению сборки фага. Лизис клеткихозяина, очевидно, происходит посредством накопления разрушающего мембрану белка Р 10, продукта сегмента-М, и такой лизис требует присутствия эндопептидазы Р 5 (Mindich et al., см. выше, 1999). Для сборки и осуществления РНК-полимеразной активности в прокапсидах dsRP не требуется присутствия белков хозяина, поскольку прокапсиды, выделенные из производного штамма JM10 9 Е.coli, в котором экспрессируется кДНК-копия сегмента-L, обладают способностью упаковывать очищенныеssРНК-сегментов вышеуказанной in vitro системой, присоединение рибонуклеотидов приводит к синтезу минус-цепи и к продуцированию зрелых dsРНК-сегментов. Кроме того, после завершения синтезаdsРНК, P8 ассоциируется с нуклеокапсидами, и, как указано выше, полученный продукт приобретает способность проникать в бактериальные протопласты и индуцировать продуктивное заражение (Qiao etal., см. выше, 1997). В предыдущих исследованиях было описано продуцирование рекомбинантного dsRP (обозначаемого здесь "rdsRP") (Mindich, Adv Virus Res 53:341; 1999); (Onodera et al., J Virol 66:190; 1992). ПростойrdsRP был сконструирован путем встраивания аллеля устойчивости к канамицину в сегмент-M dsRP Phi6. RdsRP, содержащий указанный рекомбинантный сегмент, был выделен путем инфицирования штаммаJM109, несущего плазмиду, экспрессирующую рекомбинантный сегмент-М, фагом dsRP Phi-6 дикого типа. Благодаря такому подходу было установлено, что данные клетки-хозяева являются носителями, в которых инфекционный rdsRP непрерывно продуцируется этим штаммом-носителем (Onodera et al., см. выше, 1992); (Mindich, Adv Virus Res 53:341; 1999). Бляшкообразующая способность фага, продуцируемого штаммами-носителями, сохранялась на протяжении трех-пяти пассажей в планшетах, однако, после дополнительных пассажей, растущий фаг больше не образовывал бляшки в штамме-носителе, но при этом еще наблюдалось продуцирование низких уровней инфекционного фага (Onodera et al., см. выше,1992). В некоторых случаях, значительное число штаммов-носителей вообще теряли свою способность продуцировать инфекционный фаг; при этом dsРНК таких бактериальных штаммов обнаруживала делеции в одном или нескольких сегментах (Onodera et al., см. выше, 1992). В одном случае, из одного такого штамма-носителя, не обладающего способностью продуцировать фаг, был выделен мутантный фаг, не содержащий сегмента-S. Ни в одном случае не были сконструированы rdsRN, экспрессия которых обеспечивала бы адаптацию этой системы для ее функционирования в эукариотических клетках или тканях. Таким образом, фаги rdsRP, полученные таким методом, по своей природе являются нестабильными и не могут быть использованы для анализа сборки и репликации фага; причем rdsRP, полученный в предыдущих исследованиях, не был пригоден для применения в биотехнологии и для крупномасштабного производства. Недавно было высказано предположение, что может быть получен rdsRP, который способен экспрессировать мРНК в эукариотических клетках, и что такой rdsRP может быть использован для экспрессии вакцинных антигенов, биологически активных белков, иммурегуляторных белков, антисмысловых РНК и каталитических РНК в эукариотических клетках или тканях (заявка на патент США 20040132678,Hone, которая вводится в настоящее описание посредством ссылки, и которая далее будет упоминаться как 20040132678). В заявке 20040132678 приводится исчерпывающая информация об использовании фага rdsRP, а также описана модель rdsRP и предлагаются методы его получения и использования. Однако,в заявке 20040132678 не дано каких-либо указаний относительно получения rdsRPs de novo или способов продуцирования и выделения стабильных штаммов-носителей, содержащих rdsRPs, способных к репликации. В одном из примеров, приведенных в 20040132678, было высказано предположение, что серииrdsRP могут быть продуцированы путем репликации родительского dsRP в бактериальных трансформантах, несущих плазмиды, которые, в свою очередь, экспрессируют представляющий интерес рекомбинантный сегмент. Однако из этого описания неясно, включает ли такой rdsRP четыре dsРНК-сегмента(т.е. три сегмента дикого типа и рекомбинантный сегмент), либо такой rdsRP включает три dsРНКсегмента, два сегмента дикого типа и рекомбинантный сегмент. В любом случае, остается неясным, ка-2 011282 ким образом rdsRP зависит от размножаемого хелперного фага дикого типа, а также неясно, каким образом rdsRP может быть выделен из dsRP дикого типа. Кроме того, в заявке 20040132678 не описаны конкретные методы стабильного включения рекомбинантных сегментов в dsRP и имеется лишь беглое упоминание о конкретных способах осуществления последующей репликации и стабильного продуцирования rdsRP. Более того, в заявке 20040132678 не описано получение стабильных композиций rdsRP, в которых отсутствуют сегмент-М и сегмент-S дикого типа. И наконец, в заявке 20040132678 также не описано получение упаковывающих штаммов, экспрессирующих сегмент-L и продуцирующих прокапсиды,и поэтому способных генерировать rdsRPs de novo и стабильно продуцировать rdsRPs. Следовательно, в заявке 20040132678 отсутствует нужная информация, необходимая специалисту в данной области для получения упаковывающих штаммов и стабильного продуцирования rdsRP. Кроме того, в заявке 20040132678 не обсуждается ни получение новых композиций rdsRN или упаковывающих штаммов, ни разработка способов создания, стабильного продуцирования и использования фагов rdsRN,которые являются объектом настоящего изобретения. Описание сущности изобретения В соответствии с настоящим изобретением рекомбинантный нуклеокапсид, содержащий двухцепочечную РНК, (rdsRN), включает по меньшей мере один dsРНК-сегмент, кодирующий функциональныеdsРНК-вирусные или бактериофаговые нуклеокапсидные белки, и один или несколько рекомбинантныхdsРНК-сегментов, которые включают по меньшей мере один ген, кодирующий функциональный продукт, комплементирующий селектируемую фенотипическую мутацию в клетке-хозяине (например, бактериальной), такую как ауксотрофная мутация; мутация в механизме синтеза клеточной стенки; или мутация, предупреждающая рост бактерий при температуре выше температуры замерзания. dsRN-сегменты предпочтительно включают РНК, которая кодирует представляющий интерес гетерологичный ген, такой как иммуноген, в сочетании с адъювантами или без адъювантов, и которая используется в настоящем изобретении в целях изготовления вакцин, вырабатывающих иммунный ответ, хотя функция мРНК, продуцируемой такими rdsRN, не ограничивается одной лишь этой функцией. Продуцируемые таким образом РНК могут кодировать адъюванты, иммуномодуляторные белки, терапевтические белки и другие биологически активные белки, либо указанная РНК сама может функционировать как siРНК (siRNA short interferring RNK - короткая интерферирующая РНК) или каталитическая РНК. rdsRN имеют то преимущество, что по сравнению с rdsRP они являются стабильными, легко поддаются обработке, безопасны и т.п. Указанный rdsRN содержится в клетке бактериального упаковывающего клеточного штамма,который включает селектируемую фенотипическую мутацию, что позволяет проводить отбор и сохранять rdsRN в указанном бактериальном упаковывающем штамме. Иллюстративные варианты осуществления настоящего изобретения схематически представлены на фиг. 1-3. На каждой из фиг. 1-3 10 представляет бактериальную клетку; 20 представляет геномную ДНК бактериальной клетки 10; 30 представляет нуклеокапсид (состоящий из белков, обладающих упаковывающей активностью и РНК-полимеразной активностью); a 31 (три волнистые линии в нуклеокапсиде 30) представляет dsРНК, содержащуюся в нуклеокапсиде 30. Аналогичным образом, на каждой из фиг. 1-3 21 представляет селектируемую фенотипическую мутацию в геномной ДНК 20. Как можно видеть на каждой из фиг. 1-3, два элемента, 40 и 41, последовательно связаны с dsРНК 31. 40 представляет последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую генный продукт, который комплементирует селектируемую фенотипическую мутацию 21, а 41 представляет последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую представляющую интерес РНК. Третий элемент, 42, указан на каждой из фиг. 1-3, но его положение варьируется. 42 представляет последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующие гены, необходимые для продуцирования нуклеокапсида (например, гены, кодирующие белки с упаковывающей и РНК-полимеразной активностью). На фиг. 1 проиллюстрирован вариант осуществления изобретения, в котором последовательности нуклеиновой кислоты 42 локализованы в последовательностях dsРНК 31 внутри нуклеокапсида 30. В другом варианте осуществления изобретения, проиллюстрированном на фиг. 2, последовательности нуклеиновой кислоты 42 локализованы в бактериальной геномной ДНК 20. В еще одном варианте осуществления изобретения, проиллюстрированном на фиг. 3, бактериальная клетка 10 также содержит плазмиду (70), и последовательности нуклеиновой кислоты 42 локализованы на плазмиде 70. Целью настоящего изобретения является получение бактериальных упаковывающих штаммов, содержащих последовательности, кодирующие прокапсиды dsRP в указанном штамме, и мутацию, позволяющую проводить отбор и сохранять rdsRN, которые экспрессируют функциональный ген, комплементирующий мутацию в указанном штамме. В одном из своих вариантов настоящее изобретение относится к бактериальному штамму, способному упаковывать, продуцировать и/или осуществлять доставку генов или РНК, где штамм включает: а) геномную ДНК, содержащую по меньшей мере одну селектируемую фекотипическую мутацию; b) один или несколько нуклеокапсидов, содержащих белки, обладающие РНК-упаковывающей и РНК-полимеразной активностью; с) последовательности dsРНК, содержащиеся в указанных одном или нескольких нуклеокапсидах, где указанные последовательности РНК кодируют, по меньшей мере: i) генный продукт, который комплементирует указанную по меньшей мере одну селектируемую фенотипическую мутацию и ii) представляющую интерес РНК, функционально связанную с по-3 011282 следовательностью инициации трансляции в эукариотах; и d) последовательности нуклеиновой кислоты,кодирующие гены, необходимые для продуцирования нуклеокапсида. Другой целью настоящего изобретения является разработка способа генерирования rdsRN, где рекомбинантные РНК-сегменты встраиваются в бактериальные упаковывающие штаммы и упаковываются с образованием рекомбинантного нуклеокапсида, содержащего экспрессионный кластер для трансляции в эукариотах, что приводит к продуцированию rdsRN de novo. Другой целью настоящего изобретения является получение rdsRN, способных стабильно реплицироваться в бактериальном штамме. В одном из вариантов изобретения, рекомбинантный нуклеокапсид,содержащий двухцепочечную РНК (rdsRN), включает: а) белки, обладающие РНК-упаковывающей и РНК-полимеразной активностью, и b) последовательности dsРНК, кодирующие, по меньшей мере: i) генный продукт и ii) представляющую интерес РНК, функционально связанную с последовательностью инициации трансляции в эукариотах. Еще одной целью настоящего изобретения является получение бактериальных штаммов, стабильно продуцирующих rdsRN, которые содержат один или несколько rdsРНК-сегментов, кодирующих аллель позитивного отбора и функциональные экспрессионные кластеры для трансляции в эукариотах. Другой целью настоящего изобретения является получение бактериальных штаммов, стабильно продуцирующих rdsRN, которые содержат экспрессионные кластеры альфа-вирусов, таких как, но не ограничивающихся ими, вирус лесов Семлики (Berglund et al., Vaccine 17:497; 1999) или вирус венесуэльского лошадиного энцефалита (далее обозначаемый "VEE") (Davis et al., J Virol 70:3781; 1996); (Caleyet al., J Virol 71:3031; 1997). Еще одной целью настоящего изобретения является разработка способов введения rdsRN в эукариотические клетки и ткани и использование rdsRN для индуцирования иммунного ответа или вырабатывания биологического эффекта у популяции клеток-мишеней. Другой целью настоящего изобретения является получение живых бактериальных векторов, обладающих rdsRN-упаковывающей способностью. Еще одной целью настоящего изобретения является получение живых бактериальных векторов, обладающих способностью к стабильному сохранению rdsRN. Другой целью настоящего изобретения является получение rdsRN, способных реплицироваться в бактериальном векторном штамме. Другой целью настоящего изобретения является разработка способов доставки rdsRN в клетки и ткани млекопитающих. Другой целью настоящего изобретения является разработка способов применения указанных бактериальных векторов, несущих rdsRN, в целях индуцирования иммунного ответа или получения биологического эффекта в клетках или тканях-мишенях. В предпочтительном варианте осуществления изобретения, селектируемыми фенотипическими мутациями, имеющимися в бактериях-хозяевах согласно изобретению, являются необратимые селектируемые фенотипические мутации. Другой целью настоящего изобретения является получение среды для электропорации, содержащей указанные бактерии и/или указанные dsRN. В еще одном своем варианте осуществления, настоящее изобретение относится к различным фторированным РНК, которые кодируют компоненты dsРНК. Эти и другие цели настоящего изобретения будут очевидны из подробного описания настоящего изобретения. В иллюстративном варианте осуществления изобретения описаны бактериальные упаковывающие штаммы, содержащие последовательности, кодирующие сегмент-L dsRP Phi-8, который экспрессирует прокапсиды в указанном штамме и имеет asd-мутацию, позволяющую проводить отбор и сохранять rdsRN, которые экспрессируют функциональный ген asd в указанном штамме. Кроме того,описан прототип rdsRN, кодирующий вакцинные антигены и репортеры, а также продемонстрирована способность указанного rdsRN экспрессировать кодируемые антигены и репортеры у млекопитающих. Подробное описание графического материала На фиг. 1 схематически представлена бактериальная клетка, содержащая нуклеокапсид, в котором последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующие гены, необходимые для продуцирования нуклеокапсида, локализованы в последовательностях dsРНК внутри нуклеокапсида. На фиг. 2 схематически представлена бактериальная клетка, содержащая нуклеокапсид, в котором последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующие гены, необходимые для продуцирования нуклеокапсида, локализованы в геномной ДНК клетки. На фиг. 3 схематически представлена бактериальная клетка, содержащая нуклеокапсид, в котором последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующие гены, необходимые для продуцирования нуклеокапсида, локализованы на плазмиде. На фиг. 4 показаны экспрессионные кластеры различных рекомбинантных сегментов-S и -M Phi-8(rS, rS2 и rM, соответственно). Как показано ниже в разделе "Примеры", аллелем позитивного отбора является ген asd, а представляющие интерес гены кодируют антигены-кандидаты Mycobacterium tuberculosis и флуоресцентный белок Hc-Red, излучающий в красном диапазоне спектра. rS и rS2 были клонированы в Pstl-сайт рТ 7/Т 3-18. rM был клонирован в виде KpnI/PstI-фрагмента в соответствующие сайтыpcDNA3.1ZEO. Все рекомбинантные сегменты помещали под транскрипционный контроль промотора Т 7. На фиг. 5 показан rS-экспрессирующий кластер, включающий самоамплифицирующийся репликон альфа-вируса (вируса лесов Семлики) (последовательность связывания с nsp1-4 и репликазой). На фиг. 6 схематически представлены получение и функции бактериального упаковывающего штамма. На фиг. 7 проиллюстрированы инвазивные свойства описанных упаковывающих штаммов и родительских штаммов. На фиг. 8 показан иммуноблот-анализ лизатов целых клеток MPC51pLM2653 S. flexneri, который проводили до и после денатурации, где указанные лизаты были зондированы прокапсид-специфической антисывороткой, в целях иллюстрации in vivo сборки прокапсидов. На фиг. 9 представлена фотография MPC51pLM2653 S. flexneri, полученная на электронном микроскопе и иллюстрирующая сборку прокапсидов. На фиг. 10 проиллюстрирована ОТ-ПЦР упакованного MPC51pLM2653 S. flexneri, несущего rdsRN,обозначенный LSMtb4, где указанная ПЦР свидетельствовала о присутствии (-)-цепи и (+)-цепи кДНК,что является показателем синтеза второй цепи. На фиг. 11 представлена полученная на электронном микроскопе фотография штамма МРС 51 S.flexneri, несущего самореплицирующийся нуклеокапсид LSMtb4. На фиг. 12 представлена полученная на электронном микроскопе фотография бактерии Pseudomonas syringae, несущей бактериофаг Phi-8 дикого типа, реконструированный путем электропорации указанного штамма с использованием РНК, кодирующей сегменты-S, -М и -L дикого типа. На фиг. 13 представлена флуоресцентная фотография клетки HeLa, которая была сделана через 14 ч после ее инвазии штаммом rdsRN-несущим МРС 51 S. flexneri, обозначенным LSMtb4 и зондированным антисывороткой, специфичной для антигена 85 А, и которая иллюстрирует экспрессию антигена 85 А в эукариотической клетке. На фиг. 14 представлена флуоресцентная фотография клетки HeLa, которая была сделана на флуоресцентном микроскопе через 12 ч после инвазии этой клетки rdsRN-несущим штаммом МРС 51 S. flexneri, обозначенным LSMHc-Red, и которая иллюстрирует прямую флуоресценцию белка Hc-Red, транслируемого из LSMHc-Red-продуцирующей мРНК в эукариотической клетке. На фиг. 15 представлена флуоресцентная фотография клетки HeLa, которая была сделана на флуоресцентном микроскопе через 12 ч после ее инвазии штаммом rdsRN-несущим МРС 51 S. flexneri, обозначенным LSMHc-Red и зондированным Hc-Red-специфической антисывороткой, для подтверждения экспрессии белка Hc-Red в эукариотической клетке. Подробное описание предпочтительных вариантов осуществления изобретения 1. Конструирование бактериальных упаковывающих штаммов. Настоящее изобретение относится к бактериальным упаковывающим штаммам, содержащим ДНКпоследовательности, которые кодируют и экспрессируют фаг, содержащий функциональную двухцепочечную РНК/вирусные прокапсидные белки (dsRP), в указанном штамме, что приводит к сборке прокапсидов и упаковке dsРНК с образованием нуклеокапсидов, содержащих двухцепочечную РНК (dsRN) в указанных упаковывающих штаммах. Кроме того, dsРНК может быть генетически сконструирована так,чтобы она содержала последовательности, кодирующие и экспрессирующие представляющий интерес функциональный ген, например, трансген. Таким образом, dsРНК представляет собой рекомбинантнуюdsРНК (rdsРНК), a нуклеокапсиды представляют собой рекомбинантные dsRN (rdsRN). Упаковывающие штаммы также содержат генетическую мутацию, приводящую к селектируемой летальной мутации в данных штаммах. rdsRN генетически конструируют так, чтобы они кодировали и экспрессировали функциональный ген, комплементирующий селектируемый дефицит, вызванный мутацией, что позволяет проводить отбор и сохранять rdsRN в бактериальных упаковывающих штаммах. В rdsRN включены следующие элементы dsРНК-фага: сегмент-L; последовательность pac сегментаS; последовательность распознавания РНК-зависимой РНК-полимеразы сегмента-S; последовательностьpac сегмента-М; и последовательность распознавания РНК-зависимой РНК-полимеразы сегмента-М. Аллели позитивного отбора могут быть генетически сконструированы в фаге следующим образом: аллель позитивного отбора может быть присоединен, например, к сайту связывания с рибосомой гена-8 на сегменте-S или к сайту связывания с рибосомой гена-10 на сегменте-М или к тому и другому. Другие представляющие интерес гены могут быть генетически сконструированы в сегментах S и/или М путем замены областей сегментов S и М, которые не являются необходимыми для продуцирования функциональных dsRN. Альтернативно, сегменты S и М могут быть полностью удалены и заменены представляющими интерес последовательностями. Используемый здесь термин "рекомбинантные сегменты" означает генетически сконструированные сегменты S и/или М, или представляющие интерес последовательности, которые заменяют сегменты S и/или М. Хотя описанная здесь система должна функционировать с использованием любого фага или вируса,содержащего двухцепочечную РНК, однако для функционирования иллюстративной системы rdsRN Phi-5 011282 8, описанной в разделе "Примеры", предпочтительно используются следующие элементы генома(ов) цистовирусов (cystoviridae):(i) сегмент-L и все его гены,(ii) последовательности pac сегментов S и М,(iii) 3'-концевые последовательности связывания с полимеразой в сегментах-S и М,(iv) ген 8 сегмента-S. Например, в Phi-8, все кодирующие последовательности на сегментах-S и М были делетированы, за исключением гена 8, поскольку они не требуются для функционирования системы rdsRN. Кроме того,для экспрессии представляющих интерес генов необходимо или желательно использовать и другие экзогенные последовательности, которые могут быть включены в рекомбинантные сегменты, такие как элементы IRES; последовательность Козака и последовательность Шайна-Дальгарно для инициации трансляции в эукариотах и прокариотах, соответственно; последовательности полиаденилирования; промоторные последовательности; энхансеры, терминаторы транскрипции; лидерные пептидные последовательности; и молекулярные метки для очистки белка, такие как His-метка. В соответствии с настоящим изобретением сегмент-L может быть введен в бактериальный упаковывающий штамм либо путем встраивания в внехромосомный экспрессионный вектор, либо посредством интеграции в бактериальную хромосому, а рекомбинантные сегменты вводят в бактериальный упаковывающий штамм путем электропорации, как подробно описано ниже. Выбор бактериальных штаммов, из которых может быть получен упаковывающий штамм согласно изобретению, не имеет решающего значения для осуществления настоящего изобретения, и такими штаммами могут быть, но не ограничиваются ими, Campylobacter spp, Neisseria spp., Haemophilus spp,Aeromonas spp, Francisella spp, Yersinia spp, Klebsiella spp, Bordetella spp, Legionella spp, Corynebacteriumspp, Citrobacter spp, Chlamydia spp, Brucella spp, Pseudomonas spp, Helicobacter spp или Vibrio spp. Выбор конкретного штамма Campylobacter для использования в настоящем изобретении не имеет решающего значения. Примерами штаммов Campylobacter, которые могут быть использованы в настоящем изобретении, являются, но не ограничиваются ими, С. jejuni (ATCC Nos. 43436, 43437, 43438), С.No. 49349) и С. coli (ATCC Nos. 33559, 43133). Выбор конкретного штамма Yersinia для использования в настоящем изобретении не имеет решающего значения. Примерами штаммов Yersinia, которые могут быть использованы в настоящем изобретении, являются Y. enterocolitica (ATCC No. 9610) или Y. pestis (ATCC No. 19428), Ye03-R2 Y. enterocolitica (al-Hendy et al., Infect. Immun., 60:870; 1992) или aroA Y. enterocolitica (O'Gaora et al., Micro. Path.,9:105; 1990). Выбор конкретного штамма Klebsiella для использования в настоящем изобретении не имеет решающего значения. Примерами штаммов Klebsiella, которые могут быть использованы в настоящем изобретении, являются K. pneumoniae (ATCC No. 13884). Выбор конкретного штамма Bordetella для использования в настоящем изобретении не имеет решающего значения. Примерами штаммов Bordetella, которые могут быть использованы в настоящем изобретении, являются В. pertussis, В. bronchiseptica (ATCC No. 19395). Выбор конкретного штамма Neisseria для использования в настоящем изобретении не имеет решающего значения. Примерами штаммов Neisseria, которые могут быть использованы в настоящем изобретении, являются N. meningitidis (ATCC No. 13077) и N. gonorrhoeae (ATCC No. 19424), aro-мутантMS11 N. gonorrhoeae (Chamberlain et al., Micro. Path., 15:51-63; 1993). Выбор конкретного штамма Aeromonas для использования в настоящем изобретении не имеет решающего значения. Примерами штаммов Aeromonas, которые могут быть использованы в настоящем изобретении, являются A. salminocida (ATCC No. 33658), A. schuberii (ATCC No. 43700), A. hydrophila, A.eucrenophila (ATCC No. 23309). Выбор конкретного штамма Francisella для использования в настоящем изобретении не имеет решающего значения. Примерами штаммов Francisella, которые могут быть использованы в настоящем изобретении, являются F. tularensis (ATCC No. 15482). Выбор конкретного штамма Corynebacterium для использования в настоящем изобретении не имеет решающего значения. Примерами штаммов Corynebacterium, которые могут быть использованы в настоящем изобретении, являются С. pseudotuberculosis (ATCC No. 19410). Выбор конкретного штамма Citrobacter для использования в настоящем изобретении не имеет решающего значения. Примерами штаммов Citrobacter, которые могут быть использованы в настоящем изобретении, являются С. freundii (ATCC No. 8090). Выбор конкретного штамма Chlamydia для использования в настоящем изобретении не имеет решающего значения. Примерами штаммов Chlamydia, которые могут быть использованы в настоящем изобретении, являются С. pneumoniae (ATCC No. VR1310). Выбор конкретного штамма Haemophilus для использования в настоящем изобретении не имеет решающего значения. Примерами штаммов Haemophilus, которые могут быть использованы в настоящем изобретении, являются H. influenzae (Lee et al., J. Biol. Chem. 270:27151; 1995), H. somnus (ATCC No.-6 011282 43625). Выбор конкретного штамма Brucella для использования в настоящем изобретении не имеет решающего значения. Примерами штаммов Brucella, которые могут быть использованы в настоящем изобретении, являются В. abortus (ATCC No. 23448). Выбор конкретного штамма Legionella для использования в настоящем изобретении не имеет решающего значения. Примерами штаммов Legionella, которые могут быть использованы в настоящем изобретении, являются L. pneumophila (ATCC No. 33156), или mip-мутант L. pneumophila (Ott, FEMS Micro. Rev., 14:161; 1994). Выбор конкретного штамма Pseudomonas для использования в настоящем изобретении не имеет решающего значения. Примерами штаммов Pseudomonas, которые могут быть использованы в настоящем изобретении, являются P. aeruginosa (ATCC No. 23267). Выбор конкретного штамма Helicobacter для использования в настоящем изобретении не имеет решающего значения. Примерами штаммов Helicobacter, которые могут быть использованы в настоящем изобретении, являются H. pylori (ATCC No. 43504), H. mustelae (ATCC No. 43772). Выбор конкретного штамма Vibrio для использования в настоящем изобретении не имеет решающего значения. Примерами штаммов Vibrio, которые могут быть использованы в настоящем изобретении, являются Vibrio cholerae (ATCC No. 14035), Vibrio cincinnatiensis (ATCC No. 35912), вирулентный мутант RSI V. cholerae (Taylor et al., J. Infect. Dis., 170:1518-1523; 1994) и ctxA-, ace-, zot-, сер-мутанты V.cholerae (Waldor J. et al., Infect. Dis.,170:278-283; 1994). В предпочтительном варианте осуществления изобретения бактериальным штаммом, от которого происходит упаковывающий штамм согласно изобретению, является бактерия, которая может служить в качестве упаковывающего штамма и вакцинных векторов, такая как Enterobacteriaceae, включая, но не ограничиваясь ими, Escherichia spp, Shigella spp и Salmonella spp. Грамположительные и кислотоустойчивые упаковывающие и векторные штаммы могут быть аналогичным образом сконструированы из Listeriamonocytogenes или Mycobacterium spp. Выбор конкретного штамма Escherichia для использования в настоящем изобретении не имеет решающего значения. Примерами штаммов Escherichia, которые могут быть использованы в настоящем изобретении, являются штаммы DH5, HB 101, HS-4, 4608-58, 1184-68, 53638-С-17, 13-80 и 6-81 Escherichia coli (см., например, Sambrook et al., см. выше; Grant et al., см. выше; Sansonetti et al., Ann. Microbiol. (Inst. Pasteur), 132A:351; 1982), энтеротоксигенная Е.coli (см., например, Evans et al., Infect. Immun.,12:656; 1975), энтеропатогенная E.coli (см., например, Donnenberg et al., J. Infect. Dis., 169:831; 1994), энтероинвазивная Е.coli (см., например, Small et al., Infect Iimun., 55:1674; 1987) и энтерогеморрагическаяE.coli (см., например, McKee and O'Brien, Infect. Immun., 63:2070; 1995). Выбор конкретного штамма Salmonella для использования в настоящем изобретении не имеет решающего значения. Примерами штаммов Salmonella, которые могут быть использованы в настоящем изобретении, являются S. typhi (см., например, АТСС No. 7251), S. typhimurium (см., например, АТССNo. 13311), Salmonella galinarum (АТСС No. 9184), Salmonella enteriditis (см., например, АТСС No. 4931) и Salmonella typhimurium (см., например, АТСС No. 6994), двойной aroC-, aroD-мутант S. typhi (см., например, Hone et al., Vacc, 9:810-816; 1991), aroA-мутант S. typhimurium (см., например, Mastroeni et al.,Micro. Pathol., 13:477-491; 1992). Выбор конкретного штамма Shigella для использования в настоящем изобретении не имеет решающего значения. Примерами штаммов Shigella, которые могут быть использованы в настоящем изобретении, являются Shigella flexneri (см., например, АТСС No. 29903), CVD1203 Shigella flexneri (см., например, Noriega et al., Infect. Immun. 62:5168; 1994), 15D Shigella flexneri (см., например, Sizemore et al., Science 270:299; 1995), Shigella sonnei (см., например, АТСС No. 29930) и Shigella dysenteriae (см., например,АТСС No. 13313). Выбор конкретного штамма Mycobacterium для использования в настоящем изобретении не имеет решающего значения. Примерами штаммов Mycobacterium, которые могут быть использованы в настоящем изобретении, являются штамм CDC1551 М. tuberculosis (см., например, Griffith et al., Am. J. Respir.H37Rv (ATCC25618), ауксотрофный по пантотенату штамм М. tuberculosis (Sambandamurthy, Nat. Med. 2002 8(10):1171; 2002), rpoV- мутантный штамм М. tuberculosis (Collins et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 92(17):8036; 1995), ауксотрофный по лейцину штамм М. tuberculosis (Hondalus et al., Infect. Immun. 68(5):2888; 2000), BCG штамм Дания (АТСС 35733), BCG штамм Япония (АТСС 35737), BCG штамм Чикаго (АТСС 27289), BCG штамм Копенгаген (АТСС 27290), BCG штамм Пастер (АТСС 35734),BCG штамм Glaxo (АТСС 35741), BCG штамм Коннахт (АТСС 35745), BCG штамм Монреаль (АТСС 35746). Выбор конкретного штамма Listeria monocytogenes для использования в настоящем изобретении не имеет решающего значения. Примерами штаммов Listeria monocytogenes, которые могут быть использованы в настоящем изобретении, являются штамм 10403S L. monocytogenes (например, Stevens et al., J.Virol 78:8210-8218; 2004) или мутантные штаммы L. monocytogenes, такие как (i) двойной actA-plcBмутант (Peters et al., FEMS Immunology and Medical Microbiology 35: 243-253; 2003); (Angelakopoulous etal., Infect and Immunity 70: 3592-3601; 2002); (ii) двойной dal-dat-мутант гена аланин-рацемазы и гена Dаминокислота-аминотрансферазы (Thompson et al., Infect and Immunity 66: 3552-3561; 1998). После отбора штамма, который должен служить родительским штаммом для упаковывающего штамма, этот штамм подвергают генетической модификации для встраивания в указанный штамм ДНКпоследовательностей, экспрессирующих прокапсиды dsRP, и для введения мутации, позволяющей проводить отбор и сохранять rdsRN, экспрессирующие функциональный ген, который комплементирует мутацию в указанном штамме. В общих чертах, гены в сегменте-L кодируют белки, необходимые для генерирования полностью функциональных прокапсидов, включая ген-8, кодирующий оболочечный белок. Однако в фаге Phi-8, ген 8 локализован на сегменте S, и хотя для сборки прокапсида Phi-8, продукт гена-8, в основном, не требуется, но тем не менее, этот функциональный продукт гена-8 необходим для эффективной саморепликации нуклеокапсидов Phi-8. Таким образом, если в настоящем изобретении используется фаг Phi-8, то в указанную конструкцию, предпочтительно, включать ген-8 сегмента S. Для другого фага, активность гена 8 кодируется на сегменте-L, и таким образом, способность к экспрессии мРНК сегмента-L является достаточной для продуцирования функциональных нуклеокапсидов. Выбор конкретного dsRP, из которого получают сегмент-L, не играет решающей роли для осуществления настоящего изобретения, и такими сегментами dsRP являются, но не ограничиваются ими, один из сегментов-L, а именно, сегмент-LPhi-6 (номер доступа в Genbank М 17461), сегмент-L Phi-13 (номер доступа в Genbank AF261668) или сегмент-L Phi-8 (номер доступа в Genbank AF226851), и такие сегменты были получены у Dr. L. Mindich на Кафедре микробиологии Научно-исследовательского Института Общественного Здравоохранения,Нью-Йорк. Альтернативно, последовательности кДНК, кодирующие сегмент-L, могут быть синтезированы на ДНК-синтезаторе (Applied Biosystems ABI 3900 High-Throughput DNA Synthesizer) (Foster City, CA 94404 U.S.A.) в соответствии с инструкциями производителей. Для синтеза копий кДНК сегментов-L и рекомбинантных сегментов-S и/или -М получают серии неполных сегментов полноразмерной последовательности с помощью ПЦР, и эти сегменты лигируют с получением полноразмерного сегмента в соответствии с процедурами, хорошо известными специалистам в данной области (Ausubel et al., см. выше,1990). Вкратце, синтетические олигонуклеотиды длиной в 100-200 нуклеотидов (т.е., предпочтительно,олигонуклеотиды, у которых 5'- и 3'-концевые последовательности соответствуют 5'- и 3'-концевым олигонуклеотидам, кодирующим смежную последовательность) получают на автоматическом ДНКсинтезаторе (например, Applied Biosystems ABI 3900 High-Throughput DNA Synthesizer (Foster City, CA 94404 U.S.A Аналогичным способом синтезируют комплементарные олигонуклеотиды, а затем их отжигают с комплементарными партнерами с образованием двухцепочечных олигонуклеотидов. Пары двухцепочечных олигонуклеотидов (т.е. олигонуклеотидов, кодирующих смежные последовательности) соединяют путем лигирования с образованием более крупного фрагмента. Эти более крупные фрагменты очищают с помощью электрофореза в агарозном геле и выделяют с использованием набора для гельочистки (например, системы для гель-экстракции QIAEX II Gel Extraction System, Qiagen, Santa Cruz,CA, Cat. No. 12385). Эту процедуру повторяют до тех пор, пока не будет получена полноразмерная молекула ДНК. После проведения каждого раунда лигирования, фрагменты могут быть амплифицированы с помощью ПЦР для увеличения выхода. Процедуры конструирования синтетического гена de novo хорошо известны специалистам в данной области и описаны в литературе (Andre et al., см. выше, 1998); (Haaset al., см. выше, 1996); либо, альтернативно, синтетические гены могут быть закуплены у коммерческих фирм, например, у фирмы Midland Certified Reagent Co. (Midland, TX). Хотя в настоящем изобретении подробно описано использование немодифицированных последовательностей сегмента-L, однако, для специалиста в данной области очевидно, что в настоящее изобретение могут быть внесены модификации, которые приводят к образованию усеченных или мутантных производных указанных последовательностей, но не предотвращают образование функциональных прокапсидов, и такие модификации не должны, по существу, выходить за рамки объема настоящего изобретения. Выбор какого-либо конкретного промотора, используемого для экспрессии сегмента-L, не имеет важного значения для осуществления настоящего изобретения, и таким промотором может быть любой промотор, функционирующий в нужном штамме, такой как, но не ограничивающийся ими, индуцибельные промоторы, такие как PBAD (номер доступа в Genbank X81838) и PpagC (номер доступа в GenbankM55546), или конститутивные промоторы, такие как Plpp (номер доступа в Genbank V00302) и PompA (номер доступа в Genbank Х 02006). Сегмент-L может быть введен в упаковывающий штамм в экспрессионном векторе, таком как рТ 7/Т 3-18 (Ambion, Austin, ТХ, Cat. No. 7201), либо он может быть интегрирован в хромосому путем аллельного обмена с применением методов, известных специалистам в данной области (например, ПЦР,очистки ДНК, расщепления рестриктирующей эндонуклеазой, электрофореза в агарозном геле и лигирования). Сайт интеграции в хромосоме не имеет решающего значения для осуществления настоящего изобретения, хотя в предпочтительном варианте осуществления изобретения, ДНК, кодирующую кластер,-8 011282 экспрессирующий сегмент-L, подвергают интеграции в хромосому для инактивации гена и для генерирования селектируемого фенотипа в целях отбора в определенных условиях культивирования (например,гена aroA (номер доступа в Genbank X00557), aroC (номер доступа в Genbank AY142231), leD (номер доступа в Genbank L06666), asd (номер доступа в Genbank V00262), murI (номер доступа в GenbankAY520970), kdsA (номер доступа в Genbank AY174101) и htrB (номер доступа в Genbank AF401529). Процедуры хромосомного интегрирования и методы культивирования указанных мутантов хорошо описаны в литературе (Hamilton et al., J. Bacteriol. 171: 4617; 1989); (Blomfield et al., Mol. Microbiol. 5: 1447; 1991). Конкретная мутация, вводимая в упаковывающий штамм, не имеет решающего значения для осуществления настоящего изобретения, и такой мутацией может быть любая мутация, способная генерировать селектируемый фенотип для отбора при определенных условиях культивирования, такая как, но не ограничивающаяся ими, рестриктированные ауксотрофные мутации, например, aroA (номер доступа вGenbank X00557), aroC (номер доступа в Genbank AY142231), leuD (номер доступа в Genbank L06666),или мутации в генах, необходимых для синтеза клеточной стенки, таких как asd (номер доступа в Genbank V00262) или murI (номер доступа в Genbank AY520970), или мутации, предотвращающие рост при температурах выше 32 С, такие как htrB (номер доступа в Genbank AF401529). Мутации могут быть введены в бактерии любым хорошо известным методом генной инженерии. Такими методами являются, но не ограничиваются ими, неспецифический мутагенез, проводимый с использованием химических веществ, таких как N-метил-N'-нитро-N-нитрозогуанидин, акридиновый оранжевый, этидийбромид; или нелетальная обработка ультрафиолетовым излучением (Miller (Ed), 1991,A short course in bacterial genetics, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY). Альтернативно, мутации могут быть введены стандартными методами генной инженерии, такими как Tn10-мутагенез; опосредуемая бактериофагом трансдукция; аллельный обмен, опосредуемый фагом лямбда; или конъюгационный перенос (Miller (Ed), см. выше, 1991); (Hone et al., J. Infect. Dis.156:167; 1987); (Noriega et al., Infect. Immun., 62:5168; 1994); (Hone et al., Vaccine, 9:810; 1991); (Chatfield et al., Vaccine 10:53; 1992);Biol. Chem., 270:27151; 1995); (Garrett et al., J. Biol. Chem., 273:12457; 1998). Указанными мутациями могут быть точковая мутация, мутация с заменой кодонов, или, предпочтительно, необратимая делеционная мутация. Делеционными мутациями могут быть мутация с делецией от одного нуклеотида до всей кодирующей последовательности. Делеционные мутации предпочтительны при проведении крупномасштабных мутаций, поскольку такие мутации делают полученный продукт более стабильным. Мутации могут быть экспрессированы либо конститутивно, либо под контролем индуцибельных промоторов, таких как термочувствительные промоторы генов семейства белков теплового шока или анаэробно индуцируемый промотор nirB (Harborne et al., Mol. Micro., 6:2805; 1992), либо репрессируемые промоторы, такие как uapA (Gorfinkiel et al., J. Biol. Chem., 268:23376; 1993) или gcv (Stauffer et al., J.Bact., 176:6159; 1994). Выбор соответствующего метода зависит от нужного штамма, и такие методы хорошо известны специалистам в данной области. Конкретные условия культивирования бактериальных векторных штаммов, которые включают стабильные rdsRN, не имеют решающего значения для осуществления настоящего изобретения. Так, например, мутанты могут быть культивированы в жидкой среде, такой как среда TS (Difco, Detroit, MI, Cat. No. 244620), питательный бульон (Difco, Detroit, MI, Cat. No. 233000), соевый бульон с трипсином (Difco,Detroit, MI, Cat. No. 211822), в соответствии со стандартными методами культивирования, которые являются подходящими для роста бактериального штамма (Miller, см. выше, 1991). Альтернативно, бактерии могут быть культивированы на твердой среде, такой как питательный агар (Difco, Detroit, MI, Cat.No. 212000), соевый агар с трипсином (Difco, Detroit, MI, Cat. No. 236920) или минимальный агар М 9(Difco, Detroit, MI, Cat. No. 248510). Вакцинные векторные штаммы Mycobacterium культивируют в жидкой среде, такой как среда Миддлбрука 7 Н 9 (Difco, Detroit, MI, Cat. No. 271310) или синтетическая среда Солтон, предпочтительно,при 37 С. Эти штаммы могут храниться в виде стационарной или перемешиваемой культуры. Кроме того, скорость роста Mycobacterium может быть увеличена путем добавления олеиновой кислоты (0,06% об./об.; Research Diagnostics Cat. No. 01257) и детергентов, таких как тилоксапол (0,05% об./об.; ResearchDiagnostics Cat. No. 70400). Чистота культур Mycobacterium может быть оценена путем равномерного посева 100 мкл аликвот культуры Mycobacterium, серийно разведенной (например, 10-кратно разведенной чистой культуры (Neat) - 10-8) в забуференном фосфатом физиологического растворе (далее обозначаемом PBS), на 3,5-дюймовых планшетах, содержащих 25-30 мл твердой среды, такой как среда 7 Н 10 Миддлбрука (BD Microbiology, Cockeyesville, MD, Cat. No. 221174). Оптическая плотность при 600 нм, при которой собирают эти бактерии, не имеет решающего значения и может варьироваться в пределах от 0,1 до 5,0 в зависимости от конкретно используемых штаммов, сред и условий культивирования. 2. Конструирование сегментов rdsРНК. Как указывалось ранее, заявка 20040132678 США основана на использовании хелперного фага (т.е.dsRP дикого типа) для инициации продуцирования rdsRPs. При этих условиях методы, описанные в заяв-9 011282 ке 20040132678, позволяют продуцировать rdsRP, который содержит либо сегмент-S дикого типа, либо сегмент-М дикого типа. Если учесть, что литические функции dsRP присутствуют в сегментах-S и -М, то неясно, могут ли такие конфигурации оставаться стабильными при крупномасштабном продуцировании. Также остается неясным, каким образом с помощью такой методики можно отделять dsRP дикого типа от rdsRP. Кроме того, в заявке 20040132678 не описаны ни способы получения rdsRN de novo, ни способы продуцирования и выделения стабильных штаммов-носителей, содержащих rdsRP, способных к репликации. В отличие от этого, настоящее изобретение относится к стабильному продуцированию rdsRN. Обычно, допустимое изменение размера вирусного генома составляет примерно 10 процентов, что обеспечивает определенную степень гибкости генома в рекомбинантных вирусных векторах (Domingoand Holland, Annu. Rev. Microbiol. 51:151; 1997). В соответствии с настоящим изобретением, размер сегмента rdsРНК в rdsRN равен сумме сегментов-S, -М и -L плюс/минус приблизительно 10%. Для иллюстрации этого, в качестве примера может быть использован Phi-8. Для генерирования стабильных rdsRN в упаковывающих штаммах, экспрессирующих сегмент-L Phi-8, размер генома Phi-8 должен составлять 14984 п.н., соответственно, а размер рекомбинантного(ых) сегмента(ов) в указанных rdsRN должен составлять приблизительно 79331500 п.н. Как показано ниже, это правило точно не соблюдается, поскольку можно получить rdsRN, происходящие от фага Phi-8, содержащего только сегмент-L и 4,5 т.п.н. сегмента-S rdsРНК (Sun et al., Virology,308:354; 2003). Это позволяет предположить, что rdsRN способны обнаруживать неожиданно высокую степень гибкости генома. В вышеописанном примере, рекомбинантный сегмент-S состоит из последовательностей, происходящих от сегмента-S дикого типа и сегмента-M дикого типа. В этом конкретном примере, описанном в литературе, термин "происходит от" (например, "происходит от сегмента-S дикого типа") относится к последовательностям, присутствующим в этой рекомбинантной конструкции rdsРНК,происходящей от геномной последовательности фага дикого типа и реаранжированной из ее гена дикого типа, либо кодирующей отличительный признак определенного типа. Такие последовательности могут быть амплифицированы из фага дикого типа с помощью ОТ-ПЦР и клонированы, либо они могут быть химически синтезированы на основе известных последовательностей, присутствующих в фаге дикого типа. Могут быть также получены композиции, содержащие геном, размер которого приближается к размеру генома дикого типа. В одном из вариантов такого метода был генерирован рекомбинантный сегмент-S, который имеет размер 79331500 п.н. В другом методе использовали два rdsРНК-сегмента, один из которых содержал последовательность, упаковывающую сегмент-S, и другой содержал последовательность, упаковывающую сегмент-М, где общий размер рекомбинантных сегментов составлял 79331500 п.н. (фиг. 4). В обоих методах по меньшей мере один сегмент содержит аллель позитивного отбора, и один или оба рекомбинантных сегмента содержат эукариотические экспрессионные кластеры. В предпочтительном варианте осуществления изобретения, компоненты сегментов rdsРНК могут быть собраны, например, путем соединения нижеследующих последовательностей кДНК и ДНК (фиг. 4). Сегмент-S rdsРНК. 1. Последовательность pac сегмента-S -8 и ген 8 (Hoogstraten et al., см. выше, 2000). 2. Аллель позитивного отбора, присоединенный к сайту связывания с рибосомой гена 8 сегмента-S дикого типа. Ген 8 кодирует мембранный белок, который может оставаться связанным с нуклеокапсидом, и представляет собой первую открытую рамку считывания сегмента-S дикого типа. 3. Последовательность IRES, содержащая сайты рестриктирующих эндонуклеаз HpaI, EcoRI, SaiI иNotI (RE), локализованных со стороны 3'-конца от последовательности IRES, так, чтобы HpaI-сайт (затупленный по концам RE-сайт) обеспечивал присутствие стартового кодона ATG, функционально связанного с IRES. 4. Бычья последовательность полиаденилирования (полученная из pcDNA3.1 (Invitrogen, Carlsbad,CA, Cat. No. V860-20. 5. Последовательность распознавания РНК-зависимой РНК-полимеразы для сегмента-S -8 (Hoogstraten et al., см. выше, 2000). Сегмент-M rdsРНК. 6. Последовательность pac сегмента-M (Hoogstraten et al., см., выше, 2000). 7. Аллель позитивного отбора, присоединенный к сайту связывания с рибосомой гена 10. Ген 10 представляет собой первую открытую рамку считывания сегмента-М дикого типа и кодирует мембранный белок -8. 8. Последовательность IRES, содержащая сайты рестриктирующих эндонуклеаз HpaI, EcoRI, SaiI иNotI (RE), локализованных со стороны 3'-конца от последовательности IRES, так, чтобы HpaI-сайт (затупленный по концам RE-сайт) обеспечивал присутствие стартового кодона ATG, функционально связанного с IRES. 9. Бычья последовательность полиаденилирования (полученная из pcDNA3.1 (Invitrogen, Carlsbad,CA, Cat. No. V860-20. 10. Последовательность распознавания РНК-зависимой РНК-полимеразы для сегмента-М -8(Hoogstraten et al., см. выше, 2000). Не ограничивая объем изобретения какой-либо конкретной теорией, можно лишь отметить, что, если размер сегмента-S rdsРНК превышает 79001500 п.н., то сегмент-M rdsРНК, вероятно, не будет упаковываться, поскольку сегмент-S rdsРНК, превышающий 79001500 п.н, будет индуцировать изменение конформации в прокапсиде, что, в свою очередь, будет приводить к распознаванию и поглощению сегмента-L и к генерированию rdsRN с геномом, размер которого составляет 10% от генома дикого типа. Последовательности кДНК, кодирующие сегменты rdsРНК, могут быть синтезированы на ДНКсинтезаторе Applied Biosystems ABI 3900 High-Throughput DNA Synthesizer (Foster City, CA) в соответствии с инструкциями производителей. Для синтеза копий кДНК сегментов-L и рекомбинантных сегментов-S и/или -М, получают серии неполных сегментов полноразмерной последовательности с помощью ПЦР, и эти сегменты лигируют с получением полноразмерного сегмента в соответствии с процедурами,хорошо известными специалистам в данной области (Ausubel et al., см. выше, 1990). Вкратце, синтетические олигонуклеотиды длиной в 100-200 нуклеотидов (т.е., предпочтительно, олигонуклеотиды, имеющие 5'- и 3'-концевые последовательности, соответствующие 5'- и 3'-концам олигонуклеотидов, кодирующих смежную последовательность) получают на автоматическом ДНК-синтезаторе (например, Applied Biosystems ABI 3900 High-Throughput DNA Synthesizer (Foster City, CA). Аналогичным способом синтезируют комплементарные олигонуклеотиды, которые затем отжигают с комплементарными партнерами с образованием двухцепочечных олигонуклеотидов. Пары из двухцепочечных олигонуклеотидов(т.е. олигонуклеотидов, кодирующих смежные последовательности) соединяют путем лигирования с образованием более крупного фрагмента. Эти более крупные фрагменты очищают с помощью электрофореза в агарозном геле и выделяют с использованием набора для гель-очистки (например, системы для гель-экстракции QIAEX II Gel Extraction System, Qiagen, Santa Cruz, CA, Cat. No. 12385). Эту процедуру повторяют до тех пор, пока не будет получена полноразмерная молекула ДНК. После проведения каждого раунда лигирования, фрагменты могут быть амплифицированы с помощью ПЦР для увеличения выхода. Процедуры конструирования синтетического гена de novo хорошо известны специалистам в данной области и описаны в литературе (Andre et al., см. выше, 1998); (Haas et al., см. выше, 1996); и альтернативно, синтетические гены могут быть закуплены у коммерческих фирм, например у Midland CertifiedReagent Co. (Midland, TX). Аллели позитивного отбора. Конкретный аллель позитивного отбора, вводимый в сегмент rdsРНК, не имеет решающего значения для осуществления настоящего изобретения, и таким аллелем может быть любой аллель, способный восстанавливать доминантную негативную мутацию в упаковывающем штамме, например, такой как, но не ограничивающийся ими, гены, комплементирующие ауксотрофные мутации, такие как aroA (номер доступа в Genbank X00557), aroC (номер доступа в Genbank AY142231), leuD (номер доступа в GenbankL06666), или гены, комплементирующие мутации в генах, ответственных за синтез клеточной стенки,такие как asd (номер доступа в Genbank V00262), или murI (номер доступа в Genbank AY520970), или гены, комплементирующие мутации в генах, ответственных за деление клеток, такие как ftsZ (номер доступа в Genbank AF221946). Источник последовательностей IRES. Молекулы мРНК, не содержащие 5'-кэп-модификатор, который обычно присоединяют к ядерным мРНК-транскриптам в ядре и для стимуляции распознавания рибосомы, плохо транслируются в эукариотических клетках, если только последовательность IRES не находится выше от представляющего интерес гена. Использование какого-либо конкретного IRES не имеет важного значения для осуществления настоящего изобретения, и он может быть выбран из любых коммерчески доступных векторов, содержащих последовательности IRES, или из любых имеющихся легко доступных последовательностей. Таким образом, последовательности IRES имеют широкое применение и могут быть получены промышленным способом из плазмиды pIRES2-EGFP (Clontech, Palo Alto, CA, Cat. No. 63206) посредством ПЦР с использованием праймеров, специфичных для 5'- и 3'-концов IRES, локализованной в положении нуклеотидов 665-1251 в pIRES2-EGFP. Последовательности в плазмиде pIRES-EGFP могут быть закуплены у производителей (см.www.clontech.com). Аналогичные IRES могут быть также получены из плазмиды pCITE4a (Novagen,Madison, WI, Cat. No. 69913; см. также патент США 4937190) посредством ПЦР с использованием праймеров, специфичных для 5'- и 3'-концов CITE в положениях от нуклеотида 16 до нуклеотида 518 в плазмиде pCITE4a (полноразмерную последовательность pCITE4a можно найти на web-сайте novagen.com/docs/NDIS/69913-000.HTM); из плазмид pCITE4a-c; (патент США 4937190); pSLIRES11(Jang and Wimmer et al., Genes Dev., 4: 1560-1572; 1990), или из дицистронного ретровирусного вектора(номер доступа: D88622); либо в эукариотических клетках, таких как клетки, содержащие IRES фактора роста фибробластов 2 для строгой тканеспецифической регуляции (Creancier et al., см. выше, 2000) или- 11011282 внутренний сайт связывания с рибосомой 3'-нетранслируемой области мРНК для бета-субъединицы митохондриальной Н+-АТР-синтазы (Izquierdo and Cuezva, Biochem. J., 346:849; 2000). Поскольку IP отсутствует на IRES HCV, то в качестве источника IRES может служить плазмида pIRES-G (Hobbs, S.M. CRCCentre for Cancer Therapeutics, Institute of Cancer Research, Block F, 15, Cotswold Road, Belmont, Sutton,Surrey SM2 5NG, UK), последовательность которой является доступной (номер доступа в GenebankY11034). Кроме того, поиск в Интернете с использованием нуклеотидной базы данных NCBI, имеющейся на сайте ncbi.nlm.nih.gov, и с использованием параметра поиска "IRES not patent", дал 140 файлов, содержащих последовательности IRES. И наконец, кДНК IRES может быть синтезирована на ДНКсинтезаторе Applied Biosystems ABI 3900 High-Throughput DNA Synthesizer (Foster City, CA), в соответствии с инструкциями производителя. Для синтеза крупных последовательностей IRES, таких как 502 п.н. IRES в pCITE4a, с помощью ПЦР генерировали серии сегментов, которые затем лигировали с получением полноразмерной последовательности в соответствии с процедурами, хорошо известными специалистам в данной области (Ausubel et al., см. выше, 1990). Менее крупные последовательности IRES, такие как 53 п.н. IRES в вирусе гепатита С (номер доступа в Genebank 1KH6A), могут быть синтезированы за один раунд на ДНК-синтезаторе Applied Biosystems ABI 3900 High-Throughput DNA Synthesizer (FosterCity, CA) в соответствии с инструкциями производителя. Примеры представляющих гетерологичных генов, которые могут быть встроены в rdsRN. В соответствии с настоящим изобретением представляющий интерес ген, вводимый в rdsRN в экспрессионном кластере для трансляции в эукариотах, может кодировать иммуноген, а поэтому rdsRN может действовать как вакцина, вырабатывающая иммунный ответ против этого иммуногена. Таким иммуногеном может быть либо чужеродный иммуноген, происходящий от вирусных, бактериальных и паразитарных патогенов, либо эндогенный иммуноген, такой как, но не ограничивающийся ими, аутоиммунный антиген или опухолевый антиген. Такими иммуногенами могут быть, например, полноразмерный нативный белок, химерные гибриды, состоящие из чужеродного иммуногена и эндогенного белка или миметика, или фрагмент или фрагменты иммуногена, происходящего от вирусных, бактериальных и паразитарных патогенов. Используемый здесь термин "чужеродный иммуноген" означает белок или его фрагмент, которые обычно не экспрессируются в клетках или тканях животного-реципиента, такие как, но не ограничивающиеся ими, вирусные белки, бактериальные белки, паразитарные белки, цитокины, хемокины, иммунорегуляторные агенты или терапевтические средства. Термин "эндогенный иммуноген" означает белок или его часть, которые обычно присутствуют в клетках или тканях животного-реципиента, такие как, но не ограничивающиеся ими, эндогенный клеточный белок, иммунорегуляторный агент или терапевтическое средство. Апоптоз представляет собой запрограммированную клеточную гибель, которая, по характеру и по последствиям ее индуцирования, значительно отличается от некротической клеточной гибели. Апоптоз клеток, содержащих чужеродные антигены, представляет собой известный мощный стимулятор вырабатывания клеточного иммунитета против таких антигенов. Механизм, посредством которого апоптоз антигенсодержащих клеток приводит к вырабатыванию клеточного иммунитета, иногда называют перекрестным примированием (Heath, W.R. et al., Immunol. Rev. 199:9; 2004, Gallucci, S.M. et al., Nature Biotechnology. 5:1249; 1999, Albert, M.L. et al., Nature 392:86; 1988). Существует несколько механизмов индуцирования апоптоза, который приводит к усилению антигенспецифического клеточно-опосредуемого иммунитета. Апоптоз, опосредуемый каспазой 8, приводит к вырабатыванию антигенспецифического клеточного иммунитета (Heath, W.R. et al., Immunol Rev 199:9; 2004). rdsRN-экспрессия каспазы-8 в цитоплазме является эффективным методом индуцирования запрограммированной гибели клеток в присутствии чужеродных антигенов, экспрессируемых rdsRN, что приводит к вырабатыванию высоких уровней антигенспецифического клеточного иммунитета. Рецептор-5 гибели клеток (DR-5), также известный какTRAIL-R2 (рецептор 2 TRAIL) или TNFR-SF-10B (член суперсемейства факторов некроза опухоли 10 В),также индуцирует апоптоз, опосредуемый каспазой 8 (Sheridan, J.P. et al., Science 277:818; 1997). Индуцируемый реовирусом апопотоз опосредуется TRAIL-DR5 и приводит к последующему выведению вируса (Clarke, P.S. et al., J. Virol; 2000). rdsRN-экспрессия DR-5 должна обеспечивать сильное стимулирующее действие, направленное на индуцирование антигенспецифического клеточного иммунитета против rdsRN-экспрессируемых антигенов. Апоптоз антигенэкспрессирующих клеток может быть также индуцирован посредством присоединения Fas, который является сильным стимулятором индуцирования антигенспецифических клеточных иммунных ответов (Chattergoon, M.A. et al., Nat Biotechnology; 18:974,2000). rdsRN, экспрессирующие Fas или гибридный белок, содержащий цитоплазматический доменFas/эктодомен CD4, индуцирует апопотоз и антигенспецифические клеточные иммунные ответы против антигенов, экспрессируемых rdsRN. Усиление клеточного иммунитета посредством rdsRN-опосредуемого апоптоза, как описано выше,не ограничивается только действием антигенов, специфически кодируемых самим rdsRN, и оно может быть также вызвано действием любого антигена, присутствующего в клетке, в которой rdsRN экспресси- 12011282 рует специфические медиаторы апоптоза. Так, например, если rdsRN доставляется в опухолевые клетки,апоптоз которых он индуцирует, то это будет приводить к вырабатыванию клеточного иммунитета против важных опухолевых антигенов с последующим уничтожением опухоли и/или метастазов, либо подавлением или предупреждением развития опухоли и/или возникновения метастазов. В другом варианте настоящего изобретения, если rdsRN, обладающие или не обладающие способностью индуцировать апоптоз и обладающие способностью кодировать и продуцировать чужеродные антигены, против которых будут вырабатываться сильные клеточные иммунные ответы, доставляются вовнутрь опухоли или других клеток, то они будут продуцировать сильные клеточные ответы против этих клеток. Такие клеточные ответы будут приводить к иммуноопосредуемой деструкции опухолевых клеток, а также к перекрестному примированию и индуцированию клеточного иммунного ответа против опухолевых или других важных антигенов с последующим уничтожением опухоли и/или метастазов или подавлением или предупреждением развития опухоли и/или метастазов. Примером такого чужеродного антигена является антиген HLA, отличающийся от HLA клеток-хозяев, против которого вырабатывается сильный гетерологичный клеточный ответ. Рекомбинантные rdsRN, способные индуцировать апоптоз и доставлять специфические опухолевые антигены, будут индуцировать сильные антигенспецифические клеточные ответы против этих опухолевых антигенов, включая подавление, до некоторой степени, толерантности к этим антигенам, что будет приводить к уничтожению опухоли и/или метастазов или к подавлению или предупреждению развития опухоли и/или метастазов, и не требует прямой доставки rdsRN в саму опухоль. Апоптоз, вызываемый разрушением ДНК или действием каспазы 9, индуцирует толерантность к некоторым антигенам (Hugues, S. et al., Immunity 16:169). Индуцирование толерантности играет важную роль в лечении или предупреждении аутоиммунных заболеваний, таких как, но не ограничивающихся ими, диабет, ревматоидный артрит, болезнь Крона, воспалительное заболевание кишечника и рассеянный склероз. Продуцирование нуклеокапсидом rdsRN каспазы 9 или других белков, индуцирующих опосредуемую апоптозом толерантность, в клетках, таких как, но не ограничивающихся ими, панкреатические -клетки, клетки ободочной кишки и нервные клетки, будет приводить к ограниченному апоптозу,который будет индуцировать толерантность к антигенам-мишеням, продуцирующим аутоиммунитет в этих клетках, и тем самым, способствовать лечению или предупреждению аутоиммунных заболеваний. Идентификация специфических антигенов, участвующих в аутоиммунных реакциях, позволяет индуцировать толерантность к этим аутоиммунным антигенам-мишеням посредством rdsRN-продуцирования этих антигенов и каспазы 9 или других молекул, способных индуцировать опосредуемую апоптозом толерантность, которая будет приводить к лечению и/или предупреждению указанных аутоиммунных заболеваний. Поэтому в другом варианте своего осуществления, настоящее изобретение относится к rdsRN, содержащему по меньшей мере один ген, который экспрессирует белок, индуцирующий апопотоз, такой как, но не ограничивающийся ими, SopE Salmonella (номер доступа в Genbank AAD54239, ААВ 51429 или ААС 02071), IpaB Shigella (номер доступа в Genbank AAM89553 или ААМ 89536), каспаза-8 (номер доступа в Genbank AAD24962 или ААН 06737) и т.п. в цитоплазме клеток-хозяев, и такая экспрессии является эффективным методом индуцирования запрограммированной гибели клеток в присутствии антигенов, экспрессиируемых указанным rdsRN, и, тем самым, вырабатывания высокого уровня Т-клеточноопосредуемого иммунитета к антигенами-мишеням. Альтернативно, может быть продуцирован rdsRN,содержащий по меньшей мере один ген, экспрессирующий DR-5, такой как DR-5 человека (номер доступа в Genbank BAA33723), герпесвирус-6 (HHV-6), гомолог человеческий DR-5 (номер доступа в GenbankCAA58423) и т.п., и обладающий сильным адъювантным действием, направленным на индуцирование антигенспецифического клеточного иммунного ответа против антигенов-мишеней. Альтернативно или дополнительно, такой иммуноген может кодироваться синтетическим геном и может быть сконструирован стандартными методами рекомбинантных ДНК (см. выше). Чужеродным иммуногеном может быть любая молекула, которая экспрессиируется любым вирусным, бактериальным или паразитарным патогеном, до или в процессе его инвазии или колонизации организма животного-хозяина или репликации в этом организме. rdsRN может экспрессировать иммуногены или их части, происходящие от вирусных, бактериальных и паразитарных патогенов. Такие патогены могут быть инфекционными для человека, домашних животных или диких животных. Вирусными патогенами, от которых происходят вирусные антигены, являются, но не ограничиваются ими, ортомиксовирусы, такие как вирус гриппа (Taxonomy ID: 59771); ретровирусы, такие как RSV,HTLV-1 (Taxonomy ID: 39015) и HTLV-II (Taxonomy ID: 11909); папиломавирусы, такие как HPV (Taxonomy ID: 337043), герпесвирусы, такие как EBV (Taxonomy ID: 10295); CMV (Taxonomy ID: 10358) или вирус простого герпеса (АТССVR-1487); лентивирусы, такие как ВИЧ-1 (Taxonomy ID: 12721) и ВИЧ 2 (Taxonomy ID: 11709); рабдовирусы, такие как вирус бешенства; пикорновирусы, такие как полиовирус(Taxonomy ID: 12080); поксвирусы, такие как вирус коровьей оспы (Taxonomy ID: 10245); ротавирус(Taxonomy ID: 10912); и парвовирусы, такие как аденоассоциированный вирус 1 (Taxonomy ID: 85106). Примерами вирусных антигенов могут служить антигены группы, включающей, но не ограничивающейся ими, антигены вируса иммунодефицита человека Nef (National Institute of Allergy and InfectiousLett., 66:177; 1999); (Hanke et al., Vaccine, 17:589; 1999; Palker et al., J. Immunol., 142:3612-3619; 1989),химерные производные Env и gp120 ВИЧ-1, такие как, но не ограничивающиеся ими, гибриды белков др 120 и CD4 (Fouts et al., J. Virol. 2000, 74:11427-11436; 2000); усеченные или модифицированные производные env ВИЧ-1, такие как, но не ограничивающиеся ими, gp140 (Stamatos et al. J Virol, 72:9656-9667; 1998) или производные Env и/или gpl40 ВИЧ-1 (Binley et al. J Virol, 76:2606-2616; 2002); (Sanders et al. JVirol, 74:5091-5100; 2000; Binley et al. J Virol, 74:627-643; 2000), поверхностный антиген вируса гепатита В (номер доступа в Genbank AF043578); (Wu et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 86:4726-4730; 1989); ротавирусные антигены, такие как VP4 (номер доступа в Genbank AJ293721); (Mackow et al., Proc. Natl. Acad.Sci., USA, 87:518-522; 1990) и VP7 (номер доступа в Genbank AY003871); (Green et al., J. Virol., 62:18191823; 1988), антигены вируса гриппа, такие как гемаглютинин (номер доступа в Genbank AJ404627);et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 97: 9654-9658; 2000), антигены вируса простого герпеса, такие как тимидинкиназа (номер доступа в Genbank AB047378); (Whitley et al., In: New Generation Vaccines, стр. 825-854). Бактериальными патогенами, от которых происходят бактериальные антигены, являются, но не ограничиваются ими, Mycobacterium spp., Helicobacter pylori, Salmonella spp., Shigella spp., E.coli, Rickettsiaburgdorferi. Примерами протективных антигенов бактериальных патогенов являются соматические антигены энтеротоксигенных бактерий Е.coli, такие как антиген фимбрий CFA/I (Yamamoto et al., Infect. Immun.,50:925-928; 1985) и нетоксическая В-субъединица термолабильного токсина (Klipstein et al., Infect. Immun., 40:888-893; 1983); пертактин Bordetella pertussis (Roberts et al., Vacc, 10:43-48; 1992), аденилатциклаза-гемолизин В. pertussis (Guiso et al., Micro. Path., 11:423-431; 1991), фрагмент С столбнячного токсинаet al., Pediatrics, 108:123-128; 2001); (Wallich et al., Infect Immun, 69:2130-2136; 2001), протективные паракристаллические поверхностные белки Rickettsia prowazekii и Rickettsia typhi (Carl et al., Proc. Natl. Acad.Sci. USA, 87:8237-8241; 1990), листериолизин (также известный как "Llo" и "Hly") и/или супероксиддисмутаза (также известная как "SOD" and "p60") Listeria monocytogenes (Hess, J. et al., Infect. Immun. 65:1286-92; 1997); (Hess, J. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 93:1458-1463; 1996); (Bouwer et al., J. Exp. Med. 175:1467-71; 1992), уреаза Helicobacter pylori (Gomez-Duarte et al., Vaccine 16, 460-71; 1998); (CorthesyTheulaz et al., InfectionImmunity 66, 581-6; 1998), протективный антиген Bacillus anthracis и связывающийся с рецептором домен летального токсина (Price et al., Infect. Immun. 69, 4509-4515; 2001). Паразитарными патогенами, от которых происходят паразитарные антигены, являются, но не ограничиваются ими, Plasmodium spp., такие как Plasmodium falciparum (ATCC30145); Trypanosome spp.,такие как Trypanosoma cruzi (ATCC50797); Giardia spp., такие как Giardia intestinalis (ATCC 30888D);(Taxonomy ID: 38568); Schistosome spp., Brugia spp., Fascida spp., Dirofilaria spp., Wuchereria spp. и Onchocerea spp. Примерами протективных антигенов паразитарных патогенов являются антигены круглого спорозоита Plasmodium spp. (Sadoff et al., Science, 240:336-337; 1988), такие как антиген круглого спорозоита P.bergerii или антиген круглого спорозоита P. falciparum; поверхностный антиген мерозоита Plasmodiumet al., Exp. Parasitol., 75:176-186; 1992), Schistosoma bovis и S. japonicum (Bashir et al., Trop. Geog. Med.,46:255-258; 1994); и KLH Schistosoma bovis и S. japonicum (Bashir et al., см. выше, 1994). Как было упомянуто выше, rdsRN-вакцины могут кодировать эндогенный иммуноген, которым может быть любой клеточный белок, иммунорегуляторный агент или терапевтическое средство, или их части, которые могут экспрессироваться в клетке реципиента, включая, но не ограничиваясь ими, опухолевые иммуногены, иммуногены трансплантатов и аутоиммунные иммуногены или их фрагменты и производные. Таким образом, в соответствии с настоящим изобретением, dsRP может кодировать опухоле- 14011282 вые иммуногены, иммуногены трансплантатов или аутоиммунные иммуногены, или их части или производные. Альтернативно, dsRP может содержать синтетические гены (полученные, как описано выше),кодирующие опухолеспецифические антигены, антигены трансплантантов или аутоиммунные антигены или их части. Примерами опухолеспецифических антигенов являются специфический для предстательной железы антиген (Gattuso et al., Human Pathol., 26:123-126; 1995), TAG-72 и CEA (Guadagni et al., Int. J. Biol. Markers, 9:53-60; 1994), MAGE-1 и тирозиназа (Coulie et al., J. Immunothera., 14:104-109; 1993). Недавно было обнаружено, что у мышей, которые были иммунизованы незлокачественными клетками, экспрессирующими опухолевый антиген, наблюдается вакцинный эффект, а также вырабатывается иммунный ответ,способствующий выведению злокачественных опухолевых клеток, несущих тот же самый антиген(Koeppen et al., Anal. N.Y. Acad. Sci., 690:244-255; 1993). Примером антигенов трансплантатов является молекула CD3 на Т-клетках (Alegre et al., Digest. Dis.Sci., 40:58-64; 1995). Было показано, что обработка антителом против рецептора CD3 способствует быстрому выведению циркулирующих Т-клеток и предотвращению клеточно-опосредуемого отторжения трансплантата (Alegre et al., см. выше, 1995). Примером аутоиммунных антигенов является -цепь IAS (Topham et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA,91:8005-8009; 1994). Было продемонстрировано, что вакцинация мышей пептидом -цепи IAS, состоящим из 18 аминокислот, вызывает у мышей с экспериментальным аутоиммунным энцефаломиелитом вырабатывание иммунитета к указанному заболеванию и подавление такого заболевания (Topham et al.,см. выше, 1994). Кроме того, могут быть сконструированы сегменты rdsРНК, которые кодируют адъювант и могут быть использованы для усиления иммунных ответов на иммуногены у хозяина. Выбор конкретного адъюванта, кодируемого rdsРНК, не имеет важного значения для осуществления настоящего изобретения, и такими адъювантами могут быть субъединица А холерного токсина (т.е. CtxA; номер доступа в GenbankX00171, AF175708, D30053, D30052) или ее части и/или мутантные производные (например, домен А 1 субъединицы A Ctx (т.е. CtxA1; номер доступа в Genbank K02679, происходящие от любого классического штамма Vibrio cholerae (например, штамма V. cholerae 395, АТСС 39541) или штамма El Tor V.cholerae (например, штамма V. cholerae 2125, АТСС 39050). Альтернативно, вместо CtxA может быть использован любой бактериальный токсин, который является членом семейства бактериальных аденозин-дифосфат-рибозилирующих экзотоксинов (Krueger and Barbier, Clin. Microbiol. Rev., 8:34; 1995), например, субъединица А термолабильного токсина (обозначаемая далее EltA) энтеротоксигенной бактерии Escherichia coli (номер доступа в Genbank M35581), субъединица S1 коклюшного токсина (например,ptxS1, номер доступа в Genbank AJ007364, AJ007363, AJ006159, AJ006157 и т.п.); а в качестве другой альтернативы, таким адъювантом может быть один из аденилатциклаза-гемолизинов бактерий Bordetellapertussis (АТСС 8467), Bordetella bronchiseptica (АТСС 7773) или Bordetella parapertussis (АТСС 15237), например, гены суаА В. pertussis (номер доступа в Genbank X14199), В. parapertussis (номер доступа в Genbank AJ24 9835) или В. bronchiseptica (номер доступа в Genbank Z37112). Могут быть также сконструированы цитокинкодирующие сегменты rdsРНК. Выбор какого-либо конкретного цитокина, кодируемого rdsРНК, не имеет решающего значения для осуществления изобретения, и такими цитокинами являются, но не ограничиваются ими, интерлейкин-4 (обозначаемый далееGenbank NM008352 (мышиный IL-12 р 40) или AY008847 (человеческий IL-12 p40, IL-12p70 (номер доступа в Genbank NM008351/NM008352 (мышиный IL-12 p35/40) или AF093065/AY008847 (человеческий IL-12 p35/40, TGF (номер доступа в Genbank NM011577 (мышиный TGF1) или М 60316 (человеческий TGF1, и TNF номер доступа в Genbank X02611 (мышиный TNF) или M2 6331 (человеческий TNF. Кроме того, для регуляции экспрессии белка в тканях-мишенях в сегменты rdsРНК может быть также включена небольшая ингибирующая РНК или антисмысловая РНК. Методы рекомбинантных ДНК и РНК, осуществляемые в целях введения функциональных экспрессионных кластеров для генерирования rdsРНК, способной экспрессировать иммунорегуляторный агент в эукариотических клетках или тканях, описаны выше. Иллюстративные вакцинные конструкции, кодируемые в эукариотических экспрессионных кластерах, т.е. вирусоподобные частицы (обозначаемые здесь "VLP"), могут быть сконструированы для индуцирования вырабатывания протективных иммунных ответов против вирусных патогенов. Было показано,что VLP вируса гриппа подвергаются самосборке после экспрессии в плазмиде генных последовательностей, кодирующих гемаглютинин (НА), нейраминидазу (NA) и матриксные белки (M1 и M2) (Latham etal., J. Virol, 75:6154-6165; 2001). Сконструированные таким образом VLP также могут подвергаться слиянию с мембраной и бадингу, что будет способствовать потенцированию антитело-продуцирующих[Электронная публикация, предшествующая печати]). VLP ВИЧ могут быть аналогичным образом собраны из минимальных последовательностей, кодирующих аминокислоты 146-231 капсидного белка, последовательности миристоилирования из шести аминокислот, последовательности, кодирующей пептид Р 2, домена "лейциновой молнии" GCN4, и предшественника оболочечного белка gp160 (Accola et al., J.Virol, 74:5395-5402; 2000). Было показано, что основной белок L1 HPV способен подвергаться самосборке с образованием VLP в различных клеточных линиях и продуцировать гуморальный и клеточный иммунитет, что делает ген, кодирующий указанный белок, привлекательным иммуногеном (Shi et al., JVirol., 75 (21):10139-10148; 2001). 3. Конструирование сегментов rdsРНК, несущих альфа-вирусные экспрессионные кластеры. Как указывалось выше, rdsRN могут содержать экспрессионный кластер для трансляции у млекопитающих, состоящий из самоамплифицирующегося репликона плазмиды pSFV1 (Invitrogen Inc., Carlsbad,CA) вируса лесов Семлики (обозначаемого здесь "SFV"), функционально присоединенного к представляющему интерес гену. Гены, кодирующие неструктурный белок SFV 1-4 (обозначаемый здесь "nsp1-4") и сайт распознавания репликазы в pSFVl, амплифицировали с помощью ПЦР и встраивали путем лигирования в затупленный по концам HpaI-сайт, локализованный непосредственно ниже последовательности IRES и функционально присоединенный к этой последовательности в rSeg-S с получением rSegSSFV1 (фиг. 5). Сайт рестриктирующей эндонуклеазы SmaI в плазмиде rSeg-SSFV1 может служить в качестве сайта инсерции для любого представляющего интерес чужеродного или эндогенного гена, таких как гены, описанные выше. Следует отметить, что в rdsRN, включающих сегмент-S rdsРНК, содержащий аллель позитивного отбора, nsp1-4 альфа-вируса и ампликон размером примерно 8100 п.н., поглощение сегмента-L не сможет осуществляться, если размер представляющего интерес гена превышает 800 п.н. (т.е., если размер генома более чем на 10% превышает размер генома дикого типа). Следует также отметить, что во всех случаях, rdsRN, включающие сегмент-S rdsРНК, содержащий аллель позитивного отбора, и nsp1-4 альфавируса и ампликон, не требуют присутствия сегмента-M rdsРНК. Такое ограничение емкости может быть устранено путем продуцирования упаковывающих штаммов, экспрессирующих модифицированные производные сегмента-L, не содержащего 5'последовательность рас. Эти последовательности будут экспрессировать белки, необходимые для продуцирования прокапсида, но они не будут упаковываться в нуклеокапсид, в результате чего rdsRN, генерируемый в указанном штамме, будет иметь дополнительную емкость 7000 п.н. Модифицированный сегмент-L в таких конструкциях может быть введен в упаковывающий штамм в экспрессионном векторе, таком как рТ 7/Т 3-18 (Ambion, Austin, TX, Cat. No. 7201), либо он может быть интегрирован в хромосому посредством аллельного обмена методами, известными специалистам в данной области (Hamilton et al., см. выше, 1989); (Blomfield et al., см. выше, 1991). Сайт интеграции в хромосоме на имеет решающего значения для осуществления настоящего изобретения, хотя в предпочтительном варианте осуществления изобретения, ДНК, кодирующую экспрессионный кластер сегмента-L, интегрируют в хромосому для инактивации гена и для генерирования селектируемого фенотипа для отбора в определенных условиях культивирования (например, aroA (номер доступа в Genbank Х 00557), aroCGenbank V00262), murI (номер доступа в Genbank AY520970), kdsA (номер доступа в Genbank AY174101) и htrB (номер доступа в Genbank AF401529). Процедуры интегрирования в хромосому и методы культивирования указанных мутантов хорошо описаны в литературе (Hamilton et al., J. Bacteriol. 171: 4617; 1989); (Blomfield et al., Mol. Microbiol. 5: 1447; 1991). 4. Методы генерирования rdsRN de novo.rdsRN были продуцированы в упаковывающих штаммах путем введения РНК, кодирующей всю генетическую информацию, необходимую для продуцирования rdsРНК после поглощения прокапсидом. Указанная рРНК может быть введена прямым методом, либо она может кодироваться на нереплицирующихся плазмидах, которые могут быть совместно введены в упаковывающий штамм. Гены, кодирующие сегмент-L, а следовательно, и прокапсид, могут присутствовать в упаковывающем штамме на плазмиде, либо они могут интегрироваться в хромосому упаковывающего штамма. В другом варианте,плюс-цепь РНК, кодирующая сегмент-L, может быть введена в упаковывающий штамм в комбинации с плюс-цепью РНК, кодирующей рекомбинантные сегменты-S и -M. После включения в прокапсид рекомбинантных сегментов-S и -M одноцепочечной РНК (далее обозначаемой ssРНК), которые должны иметь достаточный размер и содержать соответствующие упаковывающие последовательности для продуцирования сигнала поглощения сегмента-L мРНК, включается этот сегмент-L, и все упакованные ssРНК превращаются в dsРНК, что приводит к продуцированию rdsRN. На этой стадии, rdsRN способен генерировать рекомбинантные сегменты-S и -М мРНК и сегмент-L мРНК; при этом последний экспрессиирует белки, составляющие указанный прокапсид, который включает рекомбинантный сегмент и сегмент-L мРНК, которая затем превращается в dsРНК, что, тем самым, приводит к продуцированию дополнительных rdsRN (фиг. 6). Синтезированный in vitro рекомбинантный сегмент мРНК вводят в упаковывающие штаммы путем- 16011282 электропорации. РНК, предпочтительно, транскрибируют in vitro из линейных ДНК-матриц посредством фторированных rNTP (Durascribe, Epicentre, Madison, WI) с получением фторированной РНК, которая представляет собой устойчивую к нуклеазе РНК. Фторированные dUTP и dCTP вводят в реакционную смесь при конечной концентрации 5 мМ каждого. Хотя предпочтительными являются fNTP, однако, в настоящем изобретении могут быть использованы любые модифицированные rNTP, которые сообщают устойчивость к нуклеазе, такие как тиол- или аминогексилзамещенные rNTP. Таким образом, специалист в данной области может вместо фторированного NTP использовать любой модифицированный NTP, сообщающий устойчивость к нуклеазе. РНК или, предпочтительно, фторированная РНК кодирует, по меньшей мере, генный продукт, который комплементирует указанную по меньшей мере одну селектируемую фенотипическую мутацию, и представляющую интерес РНК, функционально связанную с последовательностью инициации трансляции в эукариотах. В предпочтительном варианте осуществления изобретения, фторированная РНК кодирует, по меньшей мере, генный продукт, который комплементирует указанную по меньшей мере одну селектируемую фенотипическую мутацию, gene-8 (SEQ ID 7), для стабилизации продуцирования нуклеокапсида; и представляющую интерес РНК, функционально связанную с последовательностью инициации трансляции в эукариотах. Для запуска синтеза rdsRN в указанном упаковывающем штамме получают среду для электропорации, состоящую из:i) электрокомпетентного бактериального штамма при плотности 108-1011 к.о.е./мл для упаковки, запуска синтеза и продуцирования rdsRN, содержащего:a) геномную ДНК, включающую по меньшей мере одну необратимую селектируемую фенотипическую мутацию;b) последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующие гены, необходимые для продуцирования прокапсида; иc) один или несколько прокапсидов, содержащих белки, обладающие РНК-упаковывающей и РНКполимеразной активностью;ii) 1 нг-1 мг, предпочтительно 1-100 мкг, а более предпочтительно 5-40 мкг РНК, кодирующей, по меньшей мере, генный продукт, комплементирующий указанную по меньшей мере одну селектируемую фенотипическую мутацию; и представляющую интерес РНК, функционально связанную с последовательностью инициации трансляции в эукариотах. В предпочтительном варианте осуществления изобретения, в указанном упаковывающем штамме индуцируют синтез rdsRN с использованием среды для электропорации, состоящей из:i) электрокомпетентного бактериального штамма при плотности 108-1011 к.о.е./мл для упаковки, запуска синтеза и продуцирования rdsRN, содержащего:a) геномную ДНК, включающую по меньшей мере одну необратимую селектируемую фенотипическую мутацию;b) последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующие гены, необходимые для продуцирования прокапсида; иc) один или несколько прокапсидов, содержащих белки, обладающие РНК-упаковывающей и РНКполимеразной активностью;ii) 1 нг-1 мг, предпочтительно 1-100 мкг, а более предпочтительно 5-40 мкг РНК, кодирующей, по меньшей мере, генный продукт, комплементирующий указанную по меньшей мере одну селектируемую фенотипическую мутацию, ген-8 (SEQ ID NO: 7) для стабилизации продуцирования нуклеокапсида; и представляющую интерес РНК, функционально связанную с последовательностью инициации трансляции в эукариотах. Альтернативно, в указанном упаковывающем штамме индуцируют синтез rdsRN с использованием среды для электропорации, состоящей из:i) электрокомпетентного бактериального штамма при плотности 108-1011 к.о.е./мл для упаковки, запуска синтеза и продуцирования rdsRN, содержащего: а) геномную ДНК, включающую по меньшей мере одну необратимую селектируемую фенотипическую мутацию;ii) 1 нг-1 мг, предпочтительно 1-100 мкг, а более предпочтительно 5-40 мкг РНК, кодирующей, по меньшей мере, генный продукт, комплементирующий указанную по меньшей мере одну селектируемую фенотипическую мутацию, последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующие гены, необходимые для продуцирования прокапсида; ген-8 (SEQ ID NO: 7) для стабилизации продуцирования нуклеокапсида; и представляющую интерес РНК, функционально связанную с последовательностью инициации трансляции в эукариотах. В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения, в указанном упаковывающем штамме индуцируют синтез rdsRN с использованием среды для электропорации, состоящей из:i) электрокомпетентного бактериального штамма при плотности 108-1011 к.о.е./мл для упаковки, запуска синтеза и продуцирования rdsRN, содержащего:a) геномную ДНК, включающую по меньшей мере одну необратимую селектируемую фенотипиче- 17011282 скую мутацию;b) последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующие гены, необходимые для продуцирования прокапсида; иc) один или несколько прокапсидов, содержащих белки, обладающие РНК-упаковывающей и РНКполимеразной активностью;ii) 1 нг-1 мг, предпочтительно 1-100 мкг, а более предпочтительно 5-40 мкг фторированной РНК,кодирующей, по меньшей мере, генный продукт, комплементирующий указанную по меньшей мере одну селектируемую фенотипическую мутацию; ген-8 (SEQ ID NO: 7) для стабилизации продуцирования нуклеокапсида; и представляющую интерес РНК, функционально связанную с последовательностью инициации трансляции в эукариотах. В еще одном предпочтительном варианте осуществления изобретения, в указанном упаковывающем штамме индуцируют синтез rdsRN с использованием среды для электропорации, состоящей из:i) электрокомпетентного бактериального штамма при плотности 108-1011 к.о.е./мл для упаковки, запуска синтеза и продуцирования rdsRN, содержащего: а) геномную ДНК, включающую по меньшей мере одну необратимую селектируемую фенотипическую мутацию;ii) 1 нг-1 мг, предпочтительно 1-100 мкг, а более предпочтительно 5-40 мкг фторированной РНК,кодирующей, по меньшей мере, генный продукт, комплементирующий указанную по меньшей мере одну селектируемую фенотипическую мутацию; последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующие гены, необходимые для продуцирования прокапсида; ген-8 (SEQ ID NO: 7) для стабилизации продуцирования нуклеокапсида; и представляющую интерес РНК, функционально связанную с последовательностью инициации трансляции в эукариотах. Метод электропорации указанной РНК или, предпочтительно, фторированной РНК в указанный упаковывающий штамм не имеет решающего значения для осуществления настоящего изобретения, и такая электропорация может быть осуществлена в соответствии со стандартными процедурами, хорошо известными специалистам в данной области (Ausubel et al., см. выше, 1990; Sambrook, см. выше). После электропорации среду для электропорации смешивали с восстанавливающей средой, описанной в литературе (Ausubel et al., см. выше, 1990; Sambrook, см. выше), и инкубировали при 37 С в течение 30 мин-4 ч, а предпочтительно в течение 2 ч. Электротрансформанты выделяли на твердой среде в условиях, которые обеспечивали лишь рост штаммов, содержащих и экспрессирующих аллель позитивного отбора в рекомбинантном сегменте (например, на соевом агаре с трипсином (обозначаемом далее TSA), Difco, Detroit, MI). Бактериальные изоляты, содержащие rdsRN, культивировали при температуре в пределях от 25 до 44 С в течение 16-96 ч, однако сначала эти трансформанты предпочтительно культивировать при 28 С в течение 48 ч. Затем колонии, которые росли на селектируемой твердой среде, выделяли и очищали стандартными методами (Ausubel et al., см. выше, 1990); (Sambrook, см. выше). Для подтверждения того, что выбранные изоляты содержали нужный функциональный rdsRN, отдельные изоляты скринировали с помощью ОТ-ПЦР с использованием праймеров, сконструированных для специфической амплификации плюс- и минус- (второй) цепи последовательностей РНК, включая, но не ограничиваясь ими, цепьспецифические упаковывающие последовательности, аллель позитивного отбора, IRES и представляющий интерес ген. Методы получения РНК для анализа хорошо известны специалистам в данной области,и такими методами являются методы, описанные ниже. Отдельные изоляты могут быть культивированы в жидкой среде (например, в соевом бульоне с трипсином (обозначаемом далее TSB), Difco, МО), и полученные культуры могут быть собраны после достижения оптической плотности при 600 нм (OD600),составляющей 0,001-4,0, по сравнению с OD600 стерильного TSB-контроля. Нуклеокапсиды выделяли из таких культур методами, описанными в литературе и хорошо известными специалистам в данной области (Gottlieb et al., J. Bacteriol 172:5774; 1990); (Sun et al., см. выше, 2003). ПЦР-праймеры для проведения такого анализа конструировали с помощью компьютерной программы Clone Manager, версия 4.1 (Scientific and Educational Software Inc., Durham, NC), или компьютерной программы для анализа праймеровOLIGO 4.0 (copyright Wojciech Rychlik). Эта программа позволяет конструировать ПЦР-праймеры, совместимые со специфическими ДНК-фрагментами, подвергаемыми модификации. ОТ-ПЦР проводили в термоячейке Bio Rad iCycler, (Hercules, CA), и время отжига, удлинения и денатурации праймеров в ОТПЦР устанавливали в соответствии со стандартными процедурами (Ausubel et al., см. выше). Затем ОТПЦР-продукты анализировали с помощью электрофореза в агарозном геле в соответствии со стандартными процедурами (Ausubel et al., см. выше, 1990); (Sambrook, см. выше). Позитивный клон определяли как клон, имеющий соответствующую ОТ-ПЦР-картину, которая указывает на то, что сегмент rdsРНК стабильно сохранялся в указанном штамме. ОТ-ПЦР-продукты могут быть затем проанализированы стандартными методами секвенирования ДНК, описанными ниже. После идентификации нужных трансформантов, отдельные штаммы хранили в среде для хранения,которая представляет собой среду TS, содержащую 10-30% (об./об.) глицерин. Бактериальные изоляты собирали с твердой среды с помощью стерильного ватного тампона и суспендировали в среде для хранения при плотности 108-109 к.о.е./мл, и полученные суспензии затем хранили при -80 С.- 18011282 Партии очищенных rdsRN выделяли из указанных штаммов-носителей методами, хорошо известными специалистам в данной области и очень подробно описанными в литературе (Mindich et al., J Virol 66, 2605-10; 1992); (Mindich et al., Virology 212:213-217; 1995); (Mindich et al., J Bacteriol 181:4505-4538; 1999); (Qiao et al., Virology 275:218-224; 2000); (Qiao et al., Virology 227:103-110; 1997); (Olkkonen et al.,Proc Natl Acad Sci USA 87:9173-9177; 1990); (Onodera et al., J Virol 66, 190-196; 1992). 5. Использование rdsRN для индуцирования биологического эффекта in vivo. Выбор какого-либо конкретного метода, применяемого для получения новых rdsRPэкспрессирующих систем, описанных в настоящем изобретении, не имеет решающего значения для его осуществления, и такой метод может быть выбран из методов, проводимых с использованием физиологического буфера (Feigner et al., патент США 5589466 (1996); фосфата алюминия или гидроксифосфата алюминия (например, Ulmer et al., Vaccine, 18:18; 2000), монофосфорил-липида А (также обозначаемого MPL или MPLA; Schneerson et al., J. Immunol., 147: 2136-2140; 1991); (например, Sasaki et al., Inf. Immunol., 65: 3520-3528; 1997); (Lodmell et al., Vaccine, 18:1059-1066; 2000); сапонина QS-21 (например,Sasaki et al., J. Virol., 72:4931; 1998); дексаметазона (например, Malone et al., J. Biol. Chem. 269:29903; 1994); ДНК-последовательности CpG (Davis et al., J. Immunol., 15:870; 1998); или антагониста липополисахарида (ЛПС) (Hone et al., см. выше, 1997).rdsRN может быть введен непосредственно в эукариотические клетки, ткани животных или человеческие ткани путем внутривенной, внутримышечной, внутрикожной, внутрибрюшинной, интраназальной и пероральной инокуляции. Выбор какого-либо конкретного метода введения описанных здесь rdsRNконструкций в клетку- или ткань-мишень не имеет решающего значения для осуществления настоящего изобретения, и такие методы могут быть выбраны из ранее описанных методов вакцинации (Wolff et al.,Biotechniques 11:474-85; 1991); (Johnston and Tang, Methods Cell Biol 43:353-365; 1994); (Yang and Sun,Nat Med 1:481-483; 1995); (Qiu et al., Gene Ther. 3:262-8; 1996); (Larsen et al., J. Virol. 72:1704-8; 1998);al., Proc Natl Acad Sci USA 96:4512-4517; 1999). Конкретными биологическими эффектами, входящими в объем настоящего изобретения, являются,но не ограничиваются ими, протективные или модулирующие иммунные ответы, терапевтические ответы и ингибирование экспрессии (например, siРНК) или стимуляция экспрессии (например, экспрессии цитокина) белков хозяина. Сначала rdsRN вводят в дозе 102-109 нуклеокапсидных частиц, и такое введение проводят соответствующим способом, таким как пероральное введение, интраназальное введение,подкожное введение, внутримышечное введение или введение посредством инвазивных бактериальных векторов (Sizemore et al., Science. 1995 Oct 13; 270 (5234):299-302). Число доз варьируется в зависимости от эффективности отдельных rdsRN, и могут быть введены одна, две или три дозы с интервалами в 2-4 недели. Каждая оценка уровня экспрессии включает использование rdsRN, не содержащего нужного гена, в качестве негативного контроля, и использование вакцинного ДНК-вектора, кодирующего нужный ген, в качестве позитивного контроля. Методы измерения биологических эффектов экспрессии гена, содержащегося в rdsRN, в биологических системах, хорошо известны специалистам в данной области. Так, например, для определения уровней сывороточных IgG- и IgA-ответов на gp120, сыворотку собирали до вакцинации и через 10, 20, 30,40, 50, 60, 70 и 80 дней после вакцинации. Примерно 400-500 мкл крови брали из хвостовой вены каждой мыши и собирали в отдельные пробирки, а затем кровь инкубировали в течение 4 ч на льду для ее свертывания. После центрифугирования в микроцентрифуге в течение 5 мин, сыворотку переносили в свежие пробирки и хранили при -80 С. Уровни IgG- и IgA-ответов на антигены в слизистой, экспрессируемые нужными генами, определяли с использованием фекальных гранул и вагинальных промывок, которые собирали до вакцинации и через определенные интервалы времени после вакцинации (Srinivasan et al.,Biol. Reprod. 53: 462; 1995); (Staats et al., J. Immunol. 157: 462; 1996). Для количественной оценки IgG- иIgA-ответов на gpl20 в пробах сыворотки и в образцах слизистой проводили стандартные ELISA (Abacioglu et al., AIDS Res. Hum. Retrovir. 10: 371; 1994); (Pincus et al., AIDS Res. Hum. Retrovir. 12: 1041; 1996). В каждый ELISA-анализ в качестве антигена негативного контроля может быть включен овальбумин. Кроме того, каждый ELISA-анализ может включать сыворотку, используемую в качестве позитивного контроля, фекальные гранулы или образец вагинальной промывки, если это необходимо. Образцы для позитивного контроля брали у животных, интраназально вакцинированных 10 мкг антигена, экспрессируемого нужным геном, вместе с 10 мкг холерного токсина, как описано в литературе (Yamamoto et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. 94: 52 67; 1997). Титр в конечной точке вычисляли как обратную величину последнего серийного разведения, которое продуцирует увеличение оптической плотности при 490 нм до значения, превышающего среднее значение, полученное для ряда лунок негативного контроля, плюс три величины стандартной ошибки. Для оценки клеточного иммунитета клеточные суспензии обогащенных CD4+- и CD8+-Т-клеток лимфоидной ткани использовали для измерения антигенспецифических Т-клеточных ответов с помощью- 19011282 цитокин-специфического анализа ELISPOT (Wu et al., AIDS Res. Hum. Retrovir. 13:1187; 1997). Этот анализ позволяет определять число антигенспецифических Т-клеток, которые секретируют IL-2, IL-4, IL-5,IL-6, IL-10 и IFN-. Все анализы ELISPOT проводили с использованием коммерчески доступных mAb для захвата и детекции (RD Systems and Pharmingen), как описано в литературе (Wu et al., Infect. Immun. 63:4933; 1995) и как применялось ранее (Xu-Amano et al., J. Exp. Med. 178:1309; 1993); (Okahashi et al.,Infect. Immun. 64: 1516; 1996). В каждом анализе, в качестве контроля использовали митоген (Con А) и овальбумин. 6. Использование бактериальных векторов, несущих rdsRN, для индуцирования иммунного ответа или для продуцирования биологического эффекта в клетках- или тканях-мишенях. Доставка rdsRN в эукариотические клетки-, ткани- или организмы-мишени и экспрессия кодируемых последовательностей в этих клетках, тканях или организмах могут быть осуществлены путем инокуляции нуклеокапсидами rdsRN, присутствующими в непатогенном или в аттенюированном бактериальном вакцинном векторе. Представляющими интерес биологическими ответами являются, но не ограничиваются ими, протективные или модулирующие иммунные ответы, терапевтические ответы и ингибирование экспрессии (например, siРНК) или индуцирование экспрессии (например, экспрессии цитокинов) белков хозяина. Выбор бактериальных штаммов, из которых может быть получен бактериальный вакцинный вектор согласно изобретению, не имеет решающего значения для осуществления настоящего изобретения, и такими штаммами являются, но не ограничиваются ими, Campylobacter spp, Neisseria spp., Haemophilusspp, Aeromonas spp, Francisella spp, Yersinia spp, Klebsiella spp, Bordetella spp, Legionella spp, Corynebacterium spp, Citrobacter spp, Chlamydia spp, Brucella spp, Pseudomonas spp, Helicobacter spp или Vibrio spp. Выбор конкретного штамма Campylobacter для использования в настоящем изобретении не имеет решающего значения. Примерами штаммов Campylobacter, которые могут быть использованы в настоящем изобретении, являются, но не ограничиваются ими, С. jejuni (ATCC Nos. 43436, 43437, 43438), С.No. 49349) и С. coli (ATCC Nos. 33559, 43133). Выбор конкретного штамма Yersinia для использования в настоящем изобретении не имеет решающего значения. Примерами штаммов Yersinia, которые могут быть использованы в настоящем изобретении, являются Y. enterocolitica (ATCC No. 9610) или Y. pestis (ATCC No. 19428), Ye03-R2 Y. enterocolitica (al-Hendy et al., Infect. Immun., 60:870; 1992) или aroA Y. enterocolitica (O'Gaora et al., Micro. Path.,9:105; 1990). Выбор конкретного штамма Klebsiella для использования в настоящем изобретении не имеет решающего значения. Примерами штаммов Klebsiella, которые могут быть использованы в настоящем изобретении, являются K. pneumoniae (ATCC No. 13884). Выбор конкретного штамма Bordetella для использования в настоящем изобретении не имеет решающего значения. Примерами штаммов Bordetella, которые могут быть использованы в настоящем изобретении, являются В. pertussis и В. bronchiseptica (ATCC No. 19395). Выбор конкретного штамма Neisseria для использования в настоящем изобретении не имеет решающего значения. Примерами штаммов Neisseria, которые могут быть использованы в настоящем изобретении, являются N. meningitidis (ATCC No. 13077) и N. gonorrhoeae (ATCC No. 19424), aro-мутантMS11 N. gonorrhoeae (Chamberlain et al., Micro. Path., 15:51-63; 1993). Выбор конкретного штамма Aeromonas для использования в настоящем изобретении не имеет решающего значения. Примерами штаммов Aeromonas, которые могут быть использованы в настоящем изобретении, являются A. salminocida (ATCC No. 33658), A. schuberii (ATCC No. 43700), A. hydrophila, A.eucrenophila (ATCC No. 23309). Выбор конкретного штамма Francisella для использования в настоящем изобретении не имеет решающего значения. Примерами штаммов Francisella, которые могут быть использованы в настоящем изобретении, являются F. tularensis (ATCC No. 15482). Выбор конкретного штамма Corynebacterium для использования в настоящем изобретении не имеет решающего значения. Примерами штаммов Corynebacterium, которые могут быть использованы в настоящем изобретении, являются С. pseudotuberculosis (ATCC No. 19410). Выбор конкретного штамма Citrobacter для использования в настоящем изобретении не имеет решающего значения. Примерами штаммов Citrobacter, которые могут быть использованы в настоящем изобретении, являются С. freundii (ATCC No. 8090). Выбор конкретного штамма Chlamydia для использования в настоящем изобретении не имеет решающего значения. Примерами штаммов Chlamydia, которые могут быть использованы в настоящем изобретении, являются С. pneumoniae (ATCC No. VR1310). Выбор конкретного штамма Haemophilus для использования в настоящем изобретении не имеет решающего значения. Примерами штаммов Haemophilus, которые могут быть использованы в настоящем изобретении, являются H. influenzae (Lee et al., см. выше) и H. somnus (ATCC No. 43625). Выбор конкретного штамма Brucella для использования в настоящем изобретении не имеет решающего значения. Примерами штаммов Brucella, которые могут быть использованы в настоящем изо- 20011282 бретении, являются В. abortus (ATCC No. 23448). Выбор конкретного штамма Legionella для использования в настоящем изобретении не имеет решающего значения. Примерами штаммов Legionella, которые могут быть использованы в настоящем изобретении, являются L. pneumophila (ATCC No. 33156) или mip-мутант L. pneumophila (Ott, FEMS Micro. Rev., 14:161; 1994). Выбор конкретного штамма Pseudomonas для использования в настоящем изобретении не имеет решающего значения. Примерами штаммов Pseudomonas, которые могут быть использованы в настоящем изобретении, являются P. aeruginosa (ATCC No. 23267). Выбор конкретного штамма Helicobacter для использования в настоящем изобретении не имеет решающего значения. Примерами штаммов Helicobacter, которые могут быть использованы в настоящем изобретении, являются H. pylori (ATCC No. 43504), Н. mustelae (ATCC No. 43772). Выбор конкретного штамма Vibrio для использования в настоящем изобретении не имеет решающего значения. Примерами штаммов Vibrio, которые могут быть использованы в настоящем изобретении, являются Vibrio cholerae (ATCC No. 14035), Vibrio cincinnatiensis (ATCC No. 35912), вирулентный мутант RSI V. cholerae (Taylor et al., J. Infect. Dis., 170:1518-1523; 1994) и ctxA-, ace-, zot-, сер-мутанты V.cholerae (Waldor et al., Infect. Dis.,170:278-283; 1994). В предпочтительном варианте осуществления изобретения, бактериальными штаммами, от которых происходит бактериальный вакцинный вектор согласно изобретению, являются аттенюированные производные описанных ранее бактерий, которые могут служить в качестве вакцинных векторов, такие какEnterobacteriaceae, включая, но не ограничиваясь ими, Escherichia spp, Shigella spp и Salmonella spp. Грамположительные и кислотоустойчивые упаковывающие и векторные штаммы могут быть аналогичным образом сконструированы из Listeria monocytogenes или Mycobacterium spp. Выбор конкретного штамма Escherichia для использования в настоящем изобретении не имеет решающего значения. Примерами штаммов Escherichia, которые могут быть использованы в настоящем изобретении, являются штаммы DH5, HB 101, HS-4, 4608-58, 1184-68, 53638-С-17, 13-80 и 6-81 Escherichia coli (Sambrook et al., см. выше; 2001) (Sansonetti et al., Ann. Microbiol. (Inst. Pasteur), 132A:351; 1982), энтеротоксигенная E.coli (Evans et al., Infect. Immun., 12:656; 1975), энтеропатогенная E.coli (Donnenberg et al., J. Infect. Dis., 169:831; 1994) и энтерогеморрагическая Е.coli (McKee and O'Brien, Infect.Immun., 63:2070; 1995). Выбор конкретного штамма Salmonella для использования в настоящем изобретении не имеет решающего значения. Примерами штаммов Salmonella, которые могут быть использованы в настоящем изобретении, являются S. typhi (ATCC No. 7251), S. typhimurium (АТСС No. 13311), Salmonella galinarumtyphimurium (Mastroeni et al., Micro. Pathol., 13:477-491; 1992). Выбор конкретного штамма Shigella для использования в настоящем изобретении не имеет решающего значения. Примерами штаммов Shigella, которые могут быть использованы в настоящем изобретении, являются Shigella flexneri (ATCC No. 29903), CVD1203 Shigella flexneri (Noriega et al., Infect. Immun. 62:5168; 1994), 15D Shigella flexneri (Vecino et al., J. Immunol. Lett. 82:197; 2002), Shigella sonnei (ATCCNo. 29930) и Shigella dysenteriae (ATCC No. 13313). Выбор конкретного штамма Mycobacterium для использования в настоящем изобретении не имеет решающего значения. Примерами штаммов Mycobacterium, которые могут быть использованы в настоящем изобретении, являются штамм CDC1551 М. tuberculosis (Griffith et al., Am. J. Respir. Crit. Care Med.Aug; 152(2):808; 1995), штамм Бейджинга М. Tuberculosis (Soolingen et al., 1995), штамм H37Rv (ATCC25618), ауксотрофный по пантотенату штамм М. Tuberculosis (Sambandamurthy, Nat. Med. 2002 8(10):1171; 2002), rpoV-мутантный штамм М. tuberculosis (Collins et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 92(17):8036; 1995), ауксотрофный по лейцину штамм М. tuberculosis (Hondalus et al., Infect. Immun. 68(5):2888; 2000), BCG штамм Дания (ATCC35733), BCG штамм Япония (ATCC35737), BCG штамм Чикаго (АТСС 27289), BCG штамм Копенгаген (АТСС 27290), BCG штамм Пастер (АТСС 35734),BCG штамм Glaxo (АТСС 35741), BCG штамм Коннахт (АТСС 35745), BCG штамм Монреаль (АТСС 35746). Выбор конкретного штамма Listeria monocytogenes для использования в настоящем изобретении не имеет решающего значения. Примерами штаммов Listeria monocytogenes, которые могут быть использованы в настоящем изобретении, являются штамм 10403S L. monocytogenes (например, Stevens et al., J.Virol 78:8210-8218; 2004) или мутантные штаммы L. monocytogenes, такие как (i) двойной actA-plcBмутант (Peters et al., FEMS Immunology and Medical Microbiology 35: 243-253; 2003); (Angelakopoulous etal., Infect and Immunity 70: 3592-3601; 2002); (ii) двойной dal-dat-мутант гена аланин-рацемазы и гена (Dаминокислота)-аминотрансферазы (Thompson et al., Infect and Immunity 66: 3552-3561; 1998). Методы аттенюирования E.coli, Salmonella, Mycobacteria, Shigella и Listeria не имеют решающего значения для осуществления в данной области настоящего изобретения и хорошо известны специалистам в данной области (Evans et al., см. выше, 1975); (Noriega et al., см. выше, 1994); (Hone et al., см. выше, 1991).- 21011282 После отбора непатогенных или аттенюированных бактериальных штаммов, содержащих вакцинный вектор, каждый штамм модифицировали так, чтобы он служил в качестве rdsRN-упаковывающего штамма. Такая процедура может быть осуществлена в соответствии со стратегиями, которые подробно описаны выше и которые позволяют вводить последовательности сегмента-L, экспрессирующие dsRPпрокапсиды в каждом штамме, и вводить мутацию для отбора и сохранения нуклеокапсидов rdsRN, экспрессирующих функциональный ген, комплементирующий дефицит, создаваемый такой мутацией в указанном штамме. Для генерирования штаммов, упаковывающих и стабильно поддерживающих нужный rdsRN, синтезированный in vitro рекомбинантный сегмент РНК вводили в упаковывающие штаммы путем электропорации и трансформанты выделяли на твердой среде в условиях, которые обеспечивали рост лишь тех штаммов, которые содержат и экспрессируют аллель позитивного отбора в рекомбинантном сегменте(например, на соевом агаре с трипсином, который обеспечивает рост только asd- и murI-мутантов, если ген дикого типа комплементирует такой геномный дефект, Difco, Detroit, MI, Cat. No. 244520). Все методы продуцирования rdsРНК-сегментов, методы синтеза in vitro мРНК и методы электропорации описаны выше. Для подтверждения того, что данные изоляты содержат представляющий интерес rdsRN, отдельные изоляты культивировали в жидкой среде (например, TS, Difco, Detroit, MI, Cat. No. 244620) и из указанных культур выделяли нуклеокапсиды методами, описанными в литературе и хорошо известными специалистам в данной области (Gottlieb et al., см. выше, 1990); (Sun et al., см. выше, 2003). dsРНК выделяли из нуклеокапсидов с использованием коммерчески доступных наборов для экстракции РНК и скринировали с помощью ОТ-ПЦР с использованием праймеров, амплифицирующих определенные фрагменты в рекомбинантных сегментах, включая, но не ограничиваясь ими, ПЦР-праймеры, амплифицирующие аллель позитивного отбора, IRES и представляющий интерес ген, как подробно обсуждается выше. Позитивный клон определяли как клон, который обнаруживает соответствующий ОТ-ПЦР-профиль, указывающий на то, что сегмент rdsРНК стабильно сохраняется в указанном штамме. ОТ-ПЦР-продукты могут быть также оценены в соответствии со стандартными процедурами секвенирования ДНК, описанными ниже. Конкретные условия культивирования штаммов, содержащих бактериальный вакцинный вектор и включающих стабильные rdsRN, не имеют решающего значения для осуществления настоящего изобретения. В иллюстративных целях, указанные мутанты могут быть культивированы в жидкой среде, такой как среда LB (Difco, Detroit, MI, Cat. No. 244620), питательный бульон (Difco, Detroit, MI, Cat. No. 233000) или соевый бульон с трипсином (Difco, Detroit, MI, Cat. No. 211822), в соответствии со стандартными условиями культивирования, которые являются подходящими для роста бактериальных штаммов(Miller, см. выше, 1991). В качестве альтернативы, бактерии могут быть культивированы на твердой среде, такой как питательный агар (Difco, Detroit, MI, Cat. No. 212000), соевый агар с трипсином (Difco, Detroit, MI, Cat. No. 236920) или минимальный агар М 9 (Difco, Detroit, MI, Cat. No. 248510). Штаммы Mycobacterium, содержащие вакцинные векторы, культивировали в жидкой среде, такой как среда Миддлбрука 7 Н 9 (Difco, Detroit, MI, Cat. No. 271310) или синтетическая среда Солтон, предпочтительно при 37 С. Эти штаммы могут храниться в виде стационарной или перемешиваемой культуры. Кроме того, скорость роста Mycobacterium может быть увеличена путем добавления олеиновой кислоты (0,06% об./об.; Research Diagnostics Cat. No. 01257) и детергентов, таких как тилоксапол (0,05% об./об.; Research Diagnostics Cat. No.70400). Чистота культур Mycobacterium может быть оценена путем равномерного посева 100 мкл аликвот культуры Mycobacterium, серийно разведенной (например, 10 кратно разведенной чистой культуры (Neat) - 10-8) в забуференном фосфатом физиологическом растворе(далее обозначаемом PBS), на 3,5-дюймовых планшетах, содержащих 25-30 мл твердой среды, такой как среда 7 Н 10 Миддлбрука (BD Microbiology, Cockeyesville, MD, Cat. No. 221174). Количество бактериального вакцинного вектора, вводимого с rdsRN согласно изобретению, может варьироваться в зависимости от вида индивидуума, а также от заболевания или состояния, подвергаемого лечению. Обычно, используемые дозы составляют примерно 103-1011 жизнеспособных микроорганизмов, а предпочтительно, примерно 103-109 жизнеспособных микроорганизмов. Бактериальный вектор, содержащий rdsRN, обычно вводят в комбинации с фармацевтически приемлемым носителем или разбавителем. Выбор какого-либо конкретного фармацевтически приемлемого носителя или разбавителя не имеет решающего значения для осуществления настоящего изобретения. Примерами разбавителей являются забуференный фосфатом физиологический раствор, буфер для забуферивания против действия кислоты желудочного сока, образующегося в желудке, такой как цитратный буфер (pH 7,0), содержащий сахарозу; отдельно взятый бикарбонатный буфер (pH 7,0) (Levine et al., J.Clin. Invest., 79: 888-902; 1987); (Black et al., J. Infect. Dis., 155:1260-1265; 1987) или бикарбонатный буфер (pH 7,0), содержащий аскорбиновую кислоту, лактозу и, необязательно, аспартам (Levine et al., Lancet, II: 467-470; 1988). Примерами носителей являются белки, например, содержащиеся в сепарированном молоке, сахара, например, сахароза или поливинилпирролидон. Обычно эти носители используются в концентрации, составляющей примерно 0,1-90% (мас./об.), а предпочтительно в пределах 1-10%(мас./об.). Биологическую активность векторных штаммов оценивали у соответствующего животного-модели(например, у мышей BATS/cJ, кроликов, морских свинок или макак-резусов). Сначала rdsRN-векторые штаммы вводили в дозах 102-109 к.о.е. соответствующим способом (например, Е.coli, Salmonella и Shigella могут быть введены внутрижелудочно или интраназально, а rBCG-векторы вводят подкожно). Число доз может варьироваться в зависимости от эффективности отдельного векторного штамма и валентности представляющего интерес кодируемого рекомбинантного продукта. Методы измерения уровней иммунных и других биологических ответов на продукты, кодируемыеrdsRN, хорошо известны специалистам в данной области. Для определения уровней сывороточных IgG- иIgA-ответов на gp120 сыворотку собирали до вакцинации и через 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70 и 80 дней после вакцинации. Примерно 400-500 мкл крови брали из хвостовой вены каждой мыши и собирали в отдельные пробирки, а затем кровь инкубировали в течение 4 ч на льду для ее свертывания. После центрифугирования в микроцентрифуге в течение 5 мин, сыворотку переносили в свежие пробирки и хранили при 80 С. Уровни IgG- и IgA-ответов на антигены в слизистой, экспрессируемые нужными генами, определяли с использованием фекальных гранул и вагинальных промывок, которые собирали до вакцинации и через определенные интервалы времени после вакцинации (Srinivasan et al., Biol. Reprod. 53: 462; 1995);(Staats et al., J. Immunol. 157: 462; 1996). Для количественной оценки IgG- и IgA-ответов на gp120 в пробах сыворотки и в образцах слизистой проводили стандартные ELISA (Abacioglu et al., AIDS Res. Hum.Retrovir. 10: 371; 1994); (Pincus et al., AIDS Res. Hum. Retrovir. 12: 1041; 1996). В каждый ELISA-анализ, в качестве антигена негативного контроля может быть включен овальбумин. Кроме того, каждый ELISAанализ может включать сыворотку, используемую в качестве позитивного контроля, фекальные гранулы или образец вагинальной промывки, если это необходимо. Образцы позитивного контроля брали у животных, интраназально вакцинированных 10 мкг антигена, экспрессируемого нужным геном, вместе с 10 мкг холерного токсина, как описано в литературе (Yamamoto et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 94: 5267; 1997). Титры в конечной точке вычисляли как обратную величину последнего серийного разведения, которое продуцировало увеличение оптической плотности при 490 нм до значения, превышающего среднее значение, полученное для ряда лунок негативного контроля, плюс три величины стандартной ошибки. Клеточный иммунитет может быть измерен путем окрашивания внутриклеточных цитокинов (также называемого цитометрией внутриклеточных цитокинов) или с помощью ELISPOT (Letsch A. et al.,Methods 31:143-49; 2003). Оба эти метода позволяют количественно оценивать антигенспецифические иммунные ответы, хотя для фенотипической характеризации антигенспецифических CD4+- и CD8+-Тклеток может быть также одновременно использована импульсная система ICS. С помощью таких анализов можно определять число антигенспецифических Т-клеток, секретирующих IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL10 и IFN- (Wu et al., AIDS Res. Hum. Retrovir. 13:1187; 1997). Анализы ELISPOT проводили с использованием коммерчески доступных mAb для захвата и детекции (RD Systems and Pharmingen), как описано в литературе (Wu et al., Infect. Immun. 63:4933; 1995) и как применялось ранее (Xu-Amano et al., J. Exp.Med. 178:1309; 1993); (Okahashi et al., Infect. Immun. 64: 1516; 1996). В каждом анализе использовали митоген (Con А) и овальбумин в качестве контроля. 7. Методы рекомбинантных ДНК. Методы рекомбинантных ДНК, применяемые для конструирования упаковывающих штаммов, бактериальных векторов и rdsRN, включают, но не ограничиваются ими, ПЦР, гидролиз рестриктирующей эндонуклеазой (обозначаемой далее "RE"), лигирование ДНК, электрофорез в агарозном геле, очистка ДНК и дидезокси-секвенирование, описанные в литературе (Miller, A Short Course in Bacterial Genetics,Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; 1992); (Bothwell et al., см. выше); (Ausubel etal., см. выше), опосредуемую бактериофагом трансдукцию (de Boer, см. выше); (Miller, см. выше, 1992) и(Ausubel et al., см. выше) или химические методы (Bothwell et al., см. выше); (Ausubel et al., см. выше);al., см, выше); (Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor, NY; 1992) и методы физической трансформации (Johnston et al., см. выше); (Bothwellet al., см. выше). Гены могут быть введены в фаг (de Boer et al., Cell, 56:641-649; 1989), в плазмидные векторы (Curtiss et al., см. выше), или они могут быть сплайсированы в хромосому нужного штамма (Hone etal., см. выше). Генные последовательности могут быть синтезированы на ДНК-синтезаторе Applied BiosystemsABI 3900 High-Throughput DNA Synthesizer (Foster City, CA 94404 U.S.A.) в соответствии с инструкциями производителей. Для синтеза крупных последовательностей, т.е. составляющих более чем 200 п.н., с помощью ПЦР генерировали серии сегментов полноразмерной последовательности и эти сегменты лигировали с получением полноразмерной последовательности в соответствии с процедурами,хорошо известными специалистам в данной области. Однако, менее крупные последовательности, т.е. составляющие менее чем 200 п.н., могут быть синтезированы за один раунд на ДНК-синтезаторе AppliedBiosystems ABI 3900 High-Throughput DNA Synthesizer (Foster City, CA) в соответствии с инструкциями производителя. Рекомбинантные плазмиды вводили в бактериальные штаммы путем электропорации с использованием импульсного устройства BioRad Gene-Pulser при 200 Ом, 25 мкФ и 2,5 кВ (BioRad Laboratories,- 23011282Hercules, CA) [38]. Секвенирование нуклеотидов для подтверждения последовательностей кДНК осуществляли стандартными методами автоматического секвенирования (на автоматическом секвенаторе Applied Biosystems, model 373A). ДНК-праймеры для секвенирования ДНК и для проведения полимеразной цепной реакции (далее обозначаемой "ПЦР") синтезировали на ДНК-синтезаторе Applied BiosystemsABI 3900 High-Throughput DNA Synthesizer (Foster City, CA 94404). Нижеследующие примеры приводятся лишь в целях иллюстрации настоящего изобретения и не должны рассматриваться как ограничение его осуществления. Примеры Пример 1. Методы рекомбинантных ДНК. Рестриктирующие эндонуклеазы (обозначаемые здесь "RE"); (New England Biolabs, Beverly, MA),ДНК-лигазу Т 4 (New England Biolabs, Beverly, MA) и полимеразу Taq (Life Technologies, Gaithersburg,MD) использовали в соответствии с инструкциями производителей; плазмидную ДНК получали с использованием наборов для лабораторной (набор Qiagen MiniprepR, Santa Clarita, CA) или крупномасштабной (набор Qiagen MidiprepR, Santa Clarita, CA) очистки плазмидной ДНК в соответствии с инструкциями производителей (Qiagen, Santa Clarita, CA); деионизованную воду с биологической чистотой, не содержащую нуклеазы, Трис-HCl (pH 7,5), EDTA pH 8,0; 1M MgCl2, 100% (об./об.) этанол, сверхчистую агарозу и буфер для электрофореза на агарозном геле закупали у Life Technologies, Gaithersburg, MD. Реакции RE-гидролиза, ПЦР, ДНК-лигирования и электрофорез на агарозном геле проводили в соответствии с хорошо известными процедурами (Sambrook et al., см. выше, 1989); (Ausubel et al., см. выше,1990). Нуклеотидное секвенирование для подтверждения последовательности ДНК каждой рекомбинантной плазмиды, описанной в нижеследующих примерах, осуществляли стандартными методами секвенирования ДНК на автоматическом секвенаторе Applied Biosystems, модель 373 А). ПЦР-праймеры закупали у фирмы Integrated DNA Technologies (Coralville, IA) или в биополимерной лаборатории Мэрилендского Университета (Baltimore, MD) и синтезировали на синтезаторе ДНК AppliedBiosystems (модель 373 А). ПЦР-праймеры использовали при концентрации 200 мкМ и температуру отжига для проведения ПЦР-реакций определяли с помощью компьютерной программы Clone Manager,версия 4.1 (Scientific and Educational Software Inc., Durham, NC) или компьютерной программы для анализа праймеров OLIGO 4.0. ПЦР проводили в термоячейке Bio Rad iCycler, (Hercules, CA). ПЦРпраймеры для амплификации конструировали с помощью компьютерной программы Clone Manager,version 4.1 (Scientific and Educational Software Inc., Durham, NC) или компьютерной программы для анализа праймеров OLIGO 4.0. Указанная программа позволяет конструировать ПЦР-праймеры и идентифицировать RE-сайты, которые являются совместимыми со специфическими ДНК-фрагментами, подвергаемыми модификации. ПЦР проводили в термоячейке Bio Rad iCycler, (Hercules, CA) и время отжига,удлинения и денатурации праймеров в ПЦР устанавливали в соответствии со стандартными процедурами (Ausubel et al., см. выше). Затем RE-гидролизаты и ПЦР-продукты анализировали с помощью электрофореза в агарозном геле в соответствии со стандартными процедурами (Ausubel et al., см. выше,1990); (Sambrook, см. выше). Позитивный клон определяли как клон, имеющий соответствующий REпрофиль и/или ПЦР-профиль. Плазмиды, идентифицированные с помощью такой процедуры, могут быть также проанализированы стандартными методами секвенирования ДНК, описанными ниже. Штаммы Тор 10 и DH5 Escherichia coli закупали у Invitrogen (Carlsbad, CA), а штамм SCS110 закупали у Stratagene (La Jolla, CA). Эти штаммы служили в качестве хозяев рекомбинантных плазмид, описанных ниже в примерах. Рекомбинантные плазмиды вводили в Е.coli путем электропорации с помощью импульсного устройства Gene-Pulser (BioRad Laboratories, Hercules, CA) при 200 Ом, 25 мкФ и 1,8 кВ или путем химической трансформации, описанной в литературе (Ausubel et al., см. выше). Бактериальные штаммы культивировали на соевом агаре с трипсином (Difco, Detroit, MI) или в соевом бульоне с трипсином (Difco, Detroit, MI), если это не оговорено особо, при соответствующей температуре. В среды, если это необходимо, добавляли 100 мкг/мл ампициллина, 50 мкг/мл канамицина и/или 20 мкг/мл хлорамфеникола (Sigma, St. Louis, МО). Бактериальные штаммы, суспендированные в соевом бульоне с трипсином (Difco), содержащем 30% (об./об.) глицерина (Sigma, St Louis, МО) при плотности примерно 109 колониеобразующих единиц (далее обозначаемых "к.о.е.") на мл, хранили при -80 С. Список реагентов.KpnI (New England Biolabs, Beverly, MA, Cat. Nos. R0142S), PstI (New England Biolabs, Beverly, MA,Cat. No. R0140S), соевый бульон с трипсином (Difco, Detroit, MI, Cat. No. 211822), соевый агар с трипсином (Difco, Detroit, MI, Cat. No. 236920), набор для очистки плазмидной ДНК Miniprep (Qiagen, Valencia, CA, Cat. No. 27106), глицерин (Sigma, St. Louis, MO, Cat. No. G5516), HpaI (New England Biolabs,Beverly, MA, Cat. No. R0105S), телячья кишечная щелочная фосфатаза (New England Biolabs, Beverly,MA, Cat. No. M0290S), ДНК-полимераза VentR (New England Biolabs, Cat. No. M0254S), набор для ПЦРочистки QIAquick (Qiagen, Cat. No. 28106, Valencia, CA), диаминопимелиновая кислота (Sigma-Aldrich,St. Louis, MO, Cat. No. D1377), BglII (New England Biolabs, Beverly, MA, Cat No. R0144S), IPTG (Invitrogen, Carlsbad, CA, Cat. No. 15529-019), реагент для лизиса клеточнной культуры (Promega, Madison, WI,Cat. No. E1531), лизоцим (Sigma, St. Louis, MO, Cat. No. L6876), фосфат калия (Sigma, St. Louis, MO, Cat.No. P5379), хлорид магния (Sigma, St. Louis, MO, Cat. No. M1028) DraIII (New England Biolabs, Beverly,MA, Cat. No. R0510S), PsiI (New England Biolabs, Beverly, MA, Cat. No. V0279S), протеиназа К (Ambion,Austin, TX, Cat. No. 2542-2548), набор для транскрипции Durascribe T7 (Epicentre, Madison, WI), набор для транскрипции Durascribe SP6 (Epicentre, Madison, WI), набор для транскрипции MEGAscript T7(Ambion, Austin, TX, Cat. No. 1334), набор для транскрипции MEGAscript SP6 (Ambion, Austin, TX, CatBrightStar Millennium (Ambion, Austin, TX, Cat. No. 7170), найлоновая мембрана BrightStar (Ambion, Austin, TX, Cat. No. 10102), набор для биодетекции BrightStar (Ambion, Austin, TX, Cat. No. 1930), трис-HClбуфер (Quality Biological, Gaithersburg, MD, Cat. No. 351-007-100), хлорид магния (Sigma-Aldrich, St.SUPERase (Ambion, Austin, TX, cat. No 2694), биотин-14-СТР (Invitrogen, Carlsbad, CA, Cat. No. 19519016), рибонуклеаза RNase ONE (Promega, Madison, WI, Cat. No. M4261). Пример 2. Конструирование сегментов rdsРНК, которые комплементируют asd-мутацию и экспрессируют флуоресцентные репортеры, антигены Mycobacterium tuberculosis и антигены LCMV. Целью данного исследования является разработка рекомбинантных сегментов, которые могут быть введены в прототип rdsRN, полученного на основе генома dsРНК Phi-8 (Mindich et al., J. Bacteriol, 181: 4505; 1999); (Mindich, Microbiol. Mol. Biol. Rev, 63: 149; 1999); (Hoogstraten et al., Virology, 272: 218; 2000); (Sun et al., Virology, 308: 354; 2003). Как обсуждалось выше, геном Phi-8 состоит из трех сегментов: S, М и L. Был сконструирован прототип rdsRN, в котором РНК-зависимая РНК-полимераза, кодируемая сегментом-L дикого типа (обозначаемым здесь "wtL"), экспрессировала гены-пассажиры, клонированные в рекомбинантные сегменты-М и -S (обозначаемые здесь "rM" и "rS", соответственно). Оба rM и rS содержат ген (полуальдегид аспарагиновой кислоты)-дегидрогеназы дикого типа (обозначаемый здесь asd, GenBankV00262), связанный с бактериальным сайтом связывания с рибосомой гена 10 и гена 8, соответственно (см. фиг. 4), и представляющий интерес ген (т.е. кодирующий флуоресцентный белок HcRed и микобактериальный антиген TBS), функционально связанный с IRES вируса гепатита С. Примечательно, что структурные гены фага на сегментах-M и -S не были первоначально введены в rM или rS, несмотря на то, что аллель asd rS был заменен геном 8 сегмента-S дикого типа в более позднем варианте осуществления настоящего изобретения для стабилизации rdsRN. Аллель asd и IRESHcRed иMtb-антиген-кодирующие последовательности были фланкированы 5'- и 3'-нетранслируемыми последовательностями, кодирующими pac, и последовательностями инициации синтеза минус-цепи РНК, соответственно. Другими словами, репортерные гены на rM фланкированы 5'-последовательностью pac сегмента-M и 3'-концевой последовательностью сегмента-М. Аналогичным образом, rS состоит из репортерных генов, фланкированных 5'-последовательностью pac сегмента-S и 3'-концевой последовательностью генов сегмента-S (фиг. 5). Следует отметить, что такая конфигурация позволяет продуцировать лишь rdsRN, но не фаговые и не rdsRP-частицы. Конструирование рекомбинантных сегментов осуществляли методами с использованием синтетической ДНК и стандартными методами рекомбинантных ДНК, такими как ПЦР, ОТ-ПЦР, сайтнаправленный мутагенез, гидролиз рестриктирующими ферментами, гель-электрофорез, лигирование,дидезокси-секвенирование и бактериальная трансформация, описанные в примере 1. Рекомбинантный сегмент-S (rS) был синтезирован фирмой Midland Certified Reagent Co., (Midland,TX). 5'- и 3'-последовательности были получены из копии кДНК сегмента-S Phi-8 (любезно предоставленной Dr. Leonard Mindich, номер доступа в Genbank AF226853) и имели модификации, описанные ниже. Сегмент rS (SEQ ID NO: 1) в 5'3'-ориентации состоит из указанных ниже гибридных компонентов(i) Последовательность pac сегмента S и сайт связывания с рибосомой (обозначаемый далее "RBS") гена 8, представляющие собой первые 187 нуклеотидов сегмента-S (номер доступа в Genbank AF226853),необходимые для поглощения прокапсидом (Hcogstraten et al., см. выше; 2000). RBS необходим для инициации трансляции в прокариотических клетках.(ii) Ген asd, функционально присоединенный к вышеуказанному RBS для позитивного отбора вasd-штамме Х 6212 Е.coli. Последовательность asd была получена из нуклеотидов 240-1343, номер доступа в Genbank V00262.(iii) Внутренний сайт связывания с рибосомой вируса гепатита С для инициации трансляции в эукариотических клетках. Указанная последовательность охватывает нуклеотид 36-341, номер доступа в(iv) Сайт множественного клонирования (MCS) для инсерции гена-пассажира.(v) 3'-нетранслируемая область полиаденилирования мРНК rS вируса лесов Семлики; нуклеотиды 1-261, номер доступа в Genbank V01398.- 25011282 доступа в Genbank AF226853), необходимые для обеспечения стабильности РНК и для связывания с полимеразой Phi-8 перед инициацией синтеза минус-цепи РНК. Синтетический ДНК-фрагмент, состоящий из вышеуказанных компонентов (SEQ ID NO: 1), присоединяли к PstI-гидролизованной ДНК рТ 7/Т 3-18 (Cat. No. 7201, Ambion, Austin, TX) с использованием ДНК-лигазы Т 4, как описано в примере 1. После лигирования, ДНК встраивали в штамм DH5-E Е.coli(Invitrogen, Carlsbad, CA, Cat. No. 11319-019) путем электропорации (пример 1) и трансформанты выделяли путем культивирования на среде TSA с добавлением ампициллина (100 мкг/мл) при 37 С в течение 16-24 ч. Продукты, полученные в результате успешного лигирования, идентифицировали путем выделения суперспирализованной ДНК из 2 мл культур, которые инокулировали уколочным введением полученных одиночных колоний с помощью стерильной зубочистки и помещения этой зубочистки в стерильную среду TSB с добавлением ампициллина (100 мкг/мл); а затем эти культуры инкубировали при перемешивании (200 об/мин) при 37 С в течение 16-24 ч. После центрифугирования жидкий супернатант отбрасывали, и бактериальный осадок ресуспендировали в 100 мкл раствора Р 1, поставляемого в наборе для очистки плазмидной ДНК Miniprep (Qiagen, Valencia, CA, Cat. No. 27106). Затем плазмидную ДНК экстрагировали и очищали в соответствии с инструкциями производителя (см. руководство Qiagen, Valencia, CA, Cat. no. 27106). Очищенную плазмидную ДНК расщепляли рестриктирующей эндонуклеазойPstI (New England Biclabs, Beverly, MA, Cat no. R0140S) в соответствии с инструкциями производителя и с использованием буферов, поставляемых производителем, а затем инкубировали при 37 С в течение 1 ч. Полученные ДНК-фрагменты фракционировали с помощью электрофореза в агарозном геле, как описано выше (см. пример 1), и плазмиды, обнаруживающие соответствующую картину, дополнительно охарактеризовывали путем секвенирования дидезокси-методом (пример 1). Эта процедура позволяла идентифицировать четыре независимых изолята, которые содержали плазмиду рТ 7/Т 3-18, несущую ДНК, кодирующую rS. Плазмиды в этих изолятах были обозначены AF1 и четыре изолята, содержащих эту плазмиду, высевали штрихом на среду TSA с добавлением ампициллина (100 мкг/мл) и инкубировали при 37 С в течение 16-24 ч. Затем бактерии собирали с помощью стерильного ватного тампона (Puritan, Guilford,ME, Cat. No. 25-8061WC) и суспендировали в среде TSB, содержащей 30% (об./об.) глицерина (Sigma, St.Louis, МО, Cat. No. G5516) при плотности примерно 109 к.о.е./мл, а затем хранили в 1 мл-аликвотах при 80 С. Второй rS (rS2) конструировали путем ПЦР-амплификации 1-1294 п.н. последовательности сегмента-S Phi-8 дикого типа (номер доступа в Genbank AF226853), связанной посредством BglII-сайта с последовательностью IRES вируса гепатита С и к расположенной ниже последовательности rS (1301-2020 п.н.), как описано выше (rS2, SEQ ID NO: 3). Эту конструкцию лигировали в PstI-сайт рТ 7 Т 3-18 и трансформировали в Top10 E.coli. Трансформанты анализировали, как описано выше, и шесть "подходящих" изолятов обозначали pAF1S2. Рекомбинантный сегмент-М (rM, SEQ ID NO: 2) был аналогичен rS, за исключением того, что 5'-рас и 3'-концевые последовательности были получены из сегмента-M дикого типа, из нуклеотидов 1-262 и 4677-4741, соответственно, номер доступа в Genbank AF226852. Таким образом, подобно rS, rM состоит из экзогенных последовательностей, фланкированных 5'-pac и 3'-концевой последовательностью Phi-8No. V860-20, Carlsbad, CA). Рекомбинантные плазмиды, содержащие соответствующие вставки, идентифицировали в соответствии с процедурой, применяемой для получения rS, и новую плазмиду обозначалиpAF19. Для конструирования эукариотического экспрессионного кластера, pAF1 расщепляли ферментамиHpaI и NotI (New England Biolabs, Beverly, MA, Cat. No. R0105S). Это RE-расщепление приводило к введению сайта направленного клонирования в MCS, в результате чего, после лигирования, ген Hc-Red и упаковка микобактериального антигена были локализованы непосредственно ниже IRES HCV и были функционально связаны с этой IRES. После расщепления концы линеаризованной плазмиды дефосфорилировали кишечной щелочной фосфатазой теленка (New England Biolabs, Beverly, MA, Cat. No. M0290S) для предотвращения рециркуляризации. Затем дефосфорилированную плазмиму очищали с помощью электрофореза в 0,8% агарозном геле с последующей гель-экстракцией. Гибридную последовательность размером 2,0 т.п.н., содержащую микобактериальный антиген(TBS), подвергали ПЦР-амплификации из плазмиды pAdApt35.Bsu.ТВ. S (Crucell) с использованием ДНК-полимеразы Accuprime (Invitrogen, Carlsbad, CA) и праймеров, включающих сайты рестриктирующих эндонуклеаз (RE) HpaI и NotI. Размер амплифицированной последовательности подтверждали путем электрофореза в агарозном геле и эту последовательность очищали с использованием набора для ПЦРочистки QIAquick в соответствии с инструкциями производителя (Qiagen, Cat. No. 28106, Valencia, CA). Фрагмент, кодирующий TBS, лигировали с дефосфорилированной pAF1 с использованием ДНКлигазы Т 4 (New England Biolabs, Cat. No. M0202S) и полученную плазмиду обозначали pSTB2. Антигенсодержащую гибридную последовательность TBS и HC-Red-кодирующую последовательность аналогичным образом встраивали в HpaI-сайт в rM, присутствующем на pAF19 (фиг. 4) в соответ- 26011282 ствии с техникой рекомбинантных ДНК, как описано выше. Полученные плазмиды обозначали рМТВ 7 иpMHc-Red. Плазмиды pSTB2 и pLM2775 (кодирующие сегмент-S дикого типа) линеаризовали рестриктирующими ферментами SphI и PsiI и полученные линеаризованные фрагменты очищали путем электрофореза в агарозном геле и экстракции. Плазмиды pMTB7 и pMHc-Red линеаризовали аналогичным образом путем расщепления ферментами SphI и PsiI. Линеаризованные последовательности ДНК от каждого из четырех RE-расщеплений использовали в качестве матриц в реакциях транскрипции Durascribe T7 (Epicentre, Madison, WI) in vitro в соответствии с инструкциями производителя и получали фторированные РНКтранскрипты сегмента wtS, сегмента rS, кодирующего антигены TBS, сегмента rM, кодирующего антигены TBS, и сегмента rM, кодирующего Hc-Red. Аналогичным образом конструировали третью серию сегментов rdsРНК для экспрессии антигенов гликопротеинов GP-1 и GP-2 вируса лимфоцитарного хориоменингита (обозначаемого здесь "LCMV"). 1511 п.н.-фрагмент подвергали ПЦР-амплификации из плазмиды pCMV-GP, кодирующей предшественник полипротеина GP, локализованный на большой хромосоме генома LCMV. Эту последовательность амплифицировали с использованием ДНК-полимеразы Accuprime (Invitrogen, Carlsbad, CA) и праймеров,включающих рестрикционные HpaI- и WotI-сайты. Размер амплифицированной последовательности подтверждали путем электрофореза в агарозном геле, и эту последовательность очищали с использованием набора для ПЦР-очистки QIAquick в соответствии с инструкциями производителя (Qiagen, Cat. No. 28106, Valencia, CA). Плазмиды pAF1S2 и pAF19 линеаризовали рестриктирующими эндонуклеазамиHpaI и NotI (New England Biolabs, Beverly, MA, Cat. No. R0105S) и дефосфорилировали кишечной щелочной фосфатазой теленка (New England Biolabs, Beverly, MA, Cat. No. M0290S). GP-кодирующую последовательность аналогичным образом расщепляли ферментами HpaI и NotI и лигировали в линеаризованные плазмиды pAFlS2 и AF19, в результате чего получали плазмиды pSGP1 и pMGP2. Таким образом,эти плазмиды кодировали ген-предшественник полипротеина GP, фунционально связанный с IRES HCVpSGP1 и pMGP2 расщепляли RE KpnI и PsiI, соответственно, и использовали в качестве матриц для транскрипции in vitro. Фторированные РНК-транскрипты генерировали из каждой плазмиды с использованием Durascribe T7 (Epicentre, Madison, WI), поставляемого в наборе для in vitro транскрипции в соответствии с инструкциями производителя. Полученные таким образом транскрипты кодировали последовательности антигенов GP-1 и GP-2 в rS2 и rM. Пример 3. Конструирование упаковывающего штамма-прототипа и штамма для доставки. Целью настоящего исследования является создание бактериального упаковывающего штаммапрототипа. Штамм 15D Shigella flexneri имеет в своей хромосоме необратимую делеционную мутацию по встраиванию маркера asd, которая приводит к нарушению продуцирования (полуальдегид аспарагиновой кислоты)-дегидрогеназы дикого типа (обозначаемого далее "ASD"), а следовательно, и к неспособности этого штамма синтезировать диаминопимелиновую кислоту, являющуюся компонентом клеточной стенки (обозначаемую здесь "DAP") (Sizemore et al., Vaccine. 1997 Jun; 15 (8):804-7). Для роста в отсутствии генетической комплементации требуется добавление культуральной среды, содержащей 50 мкг/мл DAP (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, Cat. No. D1377). Хотя бактерия Shigella была выбрана лишь в целях иллюстрации, однако, ее инвазивные свойства и природный тропизм по отношению к иммунным клеткам слизистых делает ее идеальным вектором для доставки. Поскольку asd-мутация должна комплементироваться rdsRN-кодируемым аллелем asd, то необходимо также создать вторую хромосомную мутацию для аттенюирования этого штамма, так, чтобы она вызывала его лизис после ее внедрения в клетку млекопитающих и высвобождения rdsRN. Области размером приблизительно 1 т.п.н., расположенные выше и ниже гена murl (кодирующего глутаматрацемазу), амплифицировали с помощью ПЦР, а затем присоединяли путем лигирования MheI-сайтов,кодируемых ПЦР-праймером, и лигировали в pCVD442 (ref X) в кодируемые праймером SstI- и XbaIсайты. Полученную плазмиду переносили путем конъюгирования в бактерию 15D S. flexneri. Коинтегрированные последовательности идентифицировали путем анализа на устойчивость к антибиотикам и чувствительность к сахарозе, а также путем ПЦР-анализа, и разделяли хорошо известными методами для продуцирования asd-, murI-штамма МРС 51. Мутация murI сообщает клетке неспособность синтезировать пептидогликановый компонент D-глутамат и требует добавления 50 мкг/мл D-глутамата в минимальную культуральную среду М 9 для осуществления нормального роста. Кроме того, анализ на инвазию клетокHeLa выявил, что данный штамм является инвазивным, но имеет непродолжительное время жизни внутри клетки (фиг. 7). Для того чтобы определить, могут ли такие требования ауксотрофии комплементироваться in trans посредством экспрессии гена asd, присутствующего в rdsRN, штамм МРС 51 S. flexneri трансформировали плазмидой pLM2 653, которая экспрессирует мРНК wtL под контролем промотора SP6 и продуцирует белки Phi-8, необходимые и достаточные для сборки прокапсида (Sun et al., Virology, 308: 354; 2003). Плазмиду pLM2653 вводили путем электропорации и отбирали путем добавления 100 мкг/мл ампициллина. Сборку прокапсида в MPC51pLM2653 оценивали путем дифференциальной фильтрации нативных и- 27011282 ДСН-денатурированных клеточных лизатов, которые анализировали путем иммуноблоттинга с использованием антисыворотки, специфичной к прокапсидным белкам (фиг. 8). Вкратце, поскольку ожидаемая молекулярная масса (MW) каждого прокапсида составляла 15 МДа, то было показано, что прокапсидные белки (87 кДа и 34 Да) не проходили через мембрану с отсечкой молекулярной массы 100 кДа, если только этот лизат не был обработан 10% ДСН, что указывало на сборку белка (фиг. 8). Кроме того, на микрофотографиях тонких срезов MPC51pLM2653, сделанных на трансмиссионном электронном микроскопе, ясно наблюдалось большое число прокапсидных частиц в концентрации приблизительно 60 нМ(фиг. 9). Пример 4. Введение ssРНК, кодирующей сегменты rdsРНК, в упаковывающий штамм-протитип и индуцирование функциональной саморепликации rdsRN в указанном штамме. Целью исследований, описанных в этом примере, является разработка способа продуцирования и сохранения rdsRN в бактериальном упаковывающем штамме. Выбранная стратегия включает трансформацию упаковывающего штамма S. flexneri MPC51pLM2653 (пример 3) in vitro синтезированнойMPC51pLM2653, ssРНК(+) упаковывалась в прокапсид и синтез минус-цепи завершался, в результате чего образовывались rdsRN (фиг. 6). Затем rdsRN синтезировал мРНК, включающую мРНК wtL, rM и rS(т.е. ssРНК(+), которая пассивно секретировалась из rdsRN в цитоплазму штамма-носителя (фиг. 6. Эти транскрипты продуцировали большее количество прокапсидов посредством экспрессии сегментов wtL,rM и rS, которые несут функциональный ген asd, комплементирующий asd-мутацию в МРС 51, что позволяет игнорировать требование присутствия DAP, необходимого для роста. Сегменты wtL, rM и rS мРНК также упаковывались в прокапсиды, что приводило к образованию дополнительных rdsRN. Электрокомпетентные клетки MPC51pLM2 653 получали стандартными методами (Ausubel et al.,см. выше). Вкратце, одиночные клоны культивировали при 37 С в среде М 9, в которую были добавлены ампициллин (100 мкг/мл), канамицин (50 мкг/мл) и 50 мкг/мл DAP (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, Cat. No.D1377). Пятьдесят миллилитров культур культивировали при OD6000,1 и клетки собирали во время экспоненциального роста при OD600 0,3 и 0,6. Клетки один раз промывали охлажденным на льду 5 мМEDTA, 10% глицерином (об./об.), а затем три раза промывали охлажденным на льду 10% (об./об.) глицерином, причем после каждой промывки проводили центрифугирование при 4000g. После конечной промывки и центрифугирования, клетки ресуспендировали в 10% (об./об.) глицерине, распределяли на 200 мкл-аликвоты и хранили при -80 С.Gene-Pulser при 200 Ом, 25 мкФ и 1,8 кВ (BioRad, Hercules, CA). Клетки восстанавливали в течение 2 ч при 28 С на среде SOC (cat 15544-034, Invitrogen, Carlsbad, CA), в которую было добавлено 50 мкг/млDAP и в которой отсутствовали антибиотики. Затем клетки высевали на агар М 9 с соответствующими антибиотиками, в который было добавлено 50 мкг/мл D-глутамата и 0,1 мкг/мл DAP, концентрация которого была ниже минимальной концентрации DAP, необходимой для поддержания роста МРС 51 pLM2 653. Клетки оставляли для роста при 25-27 С, а затем их переносили в среду М 9 с Ap/Kn/D-глатаматом и добавляли DAP до 0,01 мкг/мл или удаляли. Клетки культивировали при 22 С-25 С, в результате чего образовывались колонии, которые были устойчивыми к ампициллину, что было обусловлено присутствием pLM2653, и были DAP-независимыми, что было обусловлено экспрессией генов asd на rS и rM. Для повышения способности к росту, MPC51pLM2653 подвергали электропорации с использованием in vitro транскрибированной ssРНК из pMTB7 и плазмиды pLM2775, кодирующей сегмент-S дикого типа, в качестве источника гена 8. Эту процедуру и последующие стадии культивирования проводили,как описано выше, в результате чего получали DAP-независимый rdsRN-содержащий штамм МРС 51,обозначенный LSMtb4 (фиг. 10). Аналогичным образом, MPC51pLM2653 подвергали электропорации с использованием in vitro транскрибированной ssРНК из плазмиды pLM2775, кодирующей сегмент-S дикого типа, в качестве источника гена 8 и из pMHc-Red, кодирующей белок Hc-Red, функционально связанный с IRES сегментаrM. Эту процедуру и последующие стадии культивирования проводили, как описано выше, в результате чего получали DAP-независимый rdsRN-содержащий штамм MPC51, обозначенный LSMHc-Red. В третьем примере, ssРНК, in vitro транскрибированную из конструкции rS2 pSGP1 (включающей ген 8), кодирующей GP-антиген LCMV, использовали для устранения необходимости присутствия последовательности гена-8 из wtS. Клетки MPC51pLM2653 S.flexneri подвергали электропорации с использованием in vitro транскрибированной РНК из pSGP1 и pMGP2, как описано выше в примерах. Последующие стадии культивирования проводили, как описано выше, в результате чего получали DAPнезависимый rdsRN-содержащий штамм MPC51, обозначенный LSgpMgp. Присутствие rdsRN подтверждали с помощью иммуноблоттинга лизатов целых клеток, проводимого с использованием нуклеокапсид-специфической антисыворотки, и с помощью ОТ-ПЦР, проводимой с использованием праймеров,специфичных к (+)- и (-)-цепям rS2 и rM.- 28011282 Интересно отметить, что электропорация MPC51, осуществляемая с использованием in vitro транскрибированной ssРНК с любой комбинацией rS и rM, не приводила к образованию трансформантов, если только не присутствовал wtL ssРНК или плазмида, кодирующая wtL, либо если нужный штамм не был ранее трансформирован плазмидой, кодирующей wtL. Кроме того, обработка in vitro транскрибированной ssРНК РНКазой А до электропорации MPC51pLM2653 не приводила к получению трансформантов. В качестве дополнительного примера, демонстрирующего эффективность и продуктивность электропорации РНК как средства создания rdsRN, проводили электропорацию in vitro транскриптов всех трех сегментов дикого типа в Pseudomonas syringae (в природном хозяине Phi-8) методами, аналогичными методам, описанным выше. Это приводило к восстановлению литического бактериофага Phi-8 дикого типа, на что указывало образование бляшек на бактериальных газонах, полученных в результате электропорации и визуализации на трансмиссионном электронном микроскопе фаговых частиц дикого типа в клетках P. syringae, полученных в результате электропорации (фиг. 12). Очевидно, что независимость от DAP является следствием амплификации генов asd+ на РНК rS и/или rM, кодируемых соответствующим rdsRN. Действительно, ОТ-ПЦР-анализ полноразмерной РНК,происходящей от штаммов, несущих вышеописанные rdsRN, который проводили с использованием праймеров, специфичных к амплификации минус- или плюс-цепи РНК, указывал на восстановление кДНК сегментов rS и rM. При этом следует напомнить, что синтез минус-цепи в данном фаге происходит только после поглощения всех трех геномных сегментов. Во время этой процедуры, MPC51 S. flexneri,несущий rdsRN LSMtb4 и LSMHc-Red, сохранял DAP-независимость в течение 3 месяцев в непрерывной культуре. И наконец, указанные конструкции продолжали продуцировать капсидные белки, детектируемые с помощью иммуноблоттинга, и подвергались сборке нуклеокапсиды, наблюдаемые с помощью трансмиссионного электронного микроскопа (фиг. 11). Следовательно, в целом, эти результаты продемонстрировали, что комплементация asd-делеции вMPC51pLM2653 является результатом поглощения РНК и упаковывающего и самореплицирующего действия rdsNC в упаковывающем штамме. Эти результаты также продемонстрировали, что с помощью описанных процедур могут быть получены rdsRN, которые сохраняются в полученных штаммах. Пример 5. Экспрессия rdsRN-кодируемых последовательностей в клетках млекопитающих. Объем настоящего изобретения не ограничивается доставкой rdsRN в ткань или организм млекопитающего с использованием бактериального упаковывающего штамма, и в целях иллюстрации было принято решение использовать аттенюированную инвазивную бактерию МРС 51 Shigella flexneri (примеры 3 и 4), поскольку, в природе, она является инвазивной для многих клеточных линий тканевых культур и для животных-моделей. Этот штамм конструировали, как описано в примере 3, для индуцирования лизиса бактериальных клеток после их инвазии в эукариотические клетки и высвобождения rdsRN из эндоцитарной везикулы и для высвобождения rdsRN в цитоплазму эукариотической клетки. В качестве первого свидетельства был выбран штамм МРС 51, содержащий rdsRN LSMtb4. Эта конструкция rdsRN кодирует упаковку антигена М. tuberculosis, обозначенного TBS. Точный состав этой упаковки не имеет существенного значения для осуществления настоящего изобретения, однако, в целях иллюстрации был выбран компонент антигенной упаковки, который представляет собой последовательность, кодирующую белковый антиген 85 А. Как описано в примере 2, антигенную упаковку лигировали с последовательностью IRES HCV и помещали под трансляционный контроль этой последовательности. Отсутствие экспрессии конструкции TBS в бактериальном штамме, несущем указанный rdsRN(MPC51+LSMtb4), подтверждали с помощью иммуноблот-анализа лизатов целых клеток, зондированных на присутствие антигена 85 А с использованием поликлональной антисыворотки (Abcam, Cambridge,UK). Клетки HeLa (Invitrogen, Carlsbad, CA) культивировали в среде DMEM + 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS) (Invitrogen, Carlsbad, CA) + 1% раствора антибиотика/противогрибкового средства (Invitrogen, Carlsbad, CA) по меньшей мере до 60%-ной конфлюэнтности на покровных стеклах в 6 луночных планшетах для культивирования тканей при 37 С, 5% CO2. Одновременно с этим,MPC51+LSMtb4 S.flexneri культивировали при встряхивании в 50 мл среды M9 при 28 С до OD600, составляющей по меньшей мере 0,6. За 24 ч до проведения анализов на инзазию, среды удаляли из лунок с клетками HeLa и заменяли средой DMEM + 10% FBS. За 2 ч до инвазии, среду клеток HeLa заменяли средой DMEM и бактериальные культуры разводили и оставляли для стационарного роста при 37 С. Затем концентрацию O2 в инкубаторе для культивирования тканей снижали до 1% добавлением N2 и PBSпромытую суспензию MPC51+LSMtb4 в DMEM добавляли в культуры HeLa при множественности заражения (MOI) 100 и инкубировали в течение 1 ч. Одновременно с этим, бактериальные суспензии S. flexneri 15D (asd) и MPC51pLM2653, полученные аналогичным образом, добавляли в лунки с клеткамиHeLa, как описано выше. После инвазивного инкубирования в течение 1 ч клетки HeLa два раза промывали PBS, культуральную среду (DMEM+FBS) заменяли и в течение 1 ч добавляли 150 мкг/мл сульфата гентамицина (Sigma,St. Louis, МО) для уничтожения всех остальных бактериальных клеток, которые не проникали в клеткиHeLa, а поэтому они не были защищены клетками HeLa. Гентамицин представляет собой широко применяемый антибиотик, обычно используемый в указанной концентрации, но он не проходит через мембра- 29011282 ны эукариотических клеток. Через 1 ч культуральную среду заменяли свежей средой DMEM+FBS и клетки тканевой культуры инкубировали при 37 С, 5% СО 2, в течение 14 ч. Затем покровные стекла с клетками HeLa вынимали, фиксировали 2% параформальдегидом в PBS(pH 7,4) после чего клетки делали проницаемыми с использованием 0,1% тритона Х-100 в PBS (pH 7,4),блокировали в течение 2 ч 3% BSA, 5% нормальной козьей сывороткой, 0,05% азидом натрия в PBS (pH 7,4), и зондировали антисывороткой, специфичной к антигену 85 А (IgY) (Abeam, Cambridge, MA) при разведении 1:100 в 1% BSA, 3% NGS, 0,05% азида натрия в PBS (pH 7,4). Затем клетки подвергали контрзондированию с использованием ФИТЦ-конъюгированных кроличьих антител против IgY (Abeam,Cambridge, MA) при разведении 1:100 в 1% BSA, 3% NGS, 0,05% азиде натрия в PBS (pH 7,4) и анализировали под флуоресцентным микроскопом. Контрольная группа клеток HeLa, которая не была обработана бактериями, 15D S. flexneri, или MPC51pLM2653, не обнаруживала флуоресценции, указывающей на экспрессию антигена 85 А. Клетки HeLa, обработанные инвазивным MPC51+LSMtb4, обнаруживали интенсивную флуоресценцию, что указывало на экспрессию в клетках антигена 85 А, являющегося частью гибридного белка, содержащего антиген TBS (фиг. 13). И снова, важно отметить, что экспрессия антигена 85 А не детектировалась в упаковывающем штамме/штамме-носителе Shigella, и после 14-часового инкубирования не было выделено живых бактерий Shigella. Это ясно свидетельствует о трансляцииrdsRN-продуцируемого рекомбинантного сегмента мРНК у млекопитающих. Способом, аналогичным описанному выше, инвазию клеток HeLa проводили с использованиемMPC51+LSMHc-Red, который имеет последовательность непосредственно флуоресцирующего гена HcRed, присутствующего на сегментах rM. Через 12 ч после инвазии покровные стекла с клетками HeLa фиксировали и наблюдали под флуоресцентным микроскопом. Контрольные группы, обработанные S.flexneri 15D и MPC51pLM2653, не обнаруживали Hc-Red-флуоресценции, тогда как MPC51+LSMHcRed-обработанные клетки HeLa обнаруживали прямую флуоресценцию (фиг. 14). Для дополнительного подтверждения того, что эта флуоресценция не обусловлена экспрессией Hc-Red, клетки HeLa фиксировали и зондировали Hc-Red-специфическим антителом и контрзондировали конъюгированным "вторым" антителом. И в этом случае, флуоресценцию обнаруживали только клетки, обработанныеMPC51+LSMHc-Red (фиг. 15). Кроме того, экспрессия He-Red не могла быть детектирована с помощью иммуноблот-анализа или микроскопического анализа на прямую флуоресценцию одногоMPC51+LSMHc-Red. Эти комбинированные результаты, полученные путем непосредственного наблюдения флуоресценции и иммунодетекции белков, свидетельствуют о том, что rdsRN-кодируемая РНК была транслирована с образованием белка в клетках млекопитающих. И наконец, поскольку за этот период времени, живой штамм Shigella либо вообще не был выделен, либо было выделено лишь небольшое его количество, и поскольку "оголенная" РНК имела ограниченное время полужизни, а в кодируемые белки могли транслироваться только (+)-цепь или мРНК, то очевидно, что источником транслируемой информационной РНК является мРНК, продуцируемая нуклеокапсидом rdsRN после лизиса упаковывающего штамма/штамма для доставки, присутствующего в клетках HeLa. Пример 6. Иллюстративные последовательности рекомбинантного сегмента-S и рекомбинантного сегмента-S2. Как показано на фиг. 4, ниже представлены иллюстративные последовательности, которые были использованы в настоящем изобретении для конструирования рекомбинантного сегмента-S (rS).
МПК / Метки
МПК: C07H 21/02, C12N 1/20
Метки: бактериальные, двухцепочечной, штаммы, применение, рекомбинантных, нуклеокапсидов, используемые, рнк, упаковывающие, генерирования, продуцирования
Код ссылки
<a href="https://eas.patents.su/30-11282-bakterialnye-upakovyvayushhie-shtammy-ispolzuemye-dlya-generirovaniya-i-producirovaniya-rekombinantnyh-nukleokapsidov-s-dvuhcepochechnojj-rnk-i-ih-primenenie.html" rel="bookmark" title="База патентов Евразийского Союза">Бактериальные упаковывающие штаммы, используемые для генерирования и продуцирования рекомбинантных нуклеокапсидов с двухцепочечной рнк и их применение</a>
Улучшенные штаммы e.coli для продуцирования плазмидной днк
Номер патента: 10864
Опубликовано: 30.12.2008
Авторы: Ходжсон Клейг П., Уилльямс Джеймс А.
МПК: C12P 19/34
Метки: e.coli, продуцирования, штаммы, плазмидной, улучшенные, днк
Формула / Реферат:
1. Способ продуцирования ковалентно замкнутой суперспиральной плазмидной ДНК, включающий стадии: А) введения гена, кодирующего одну или более чем одну безопасную для плазмиды нуклеазу в геном Е.coli; и Б) направления продуцирования указанных нуклеаз с введенных генетических последовательностей таким образом, что ферменты направляются в периплазматическое пространство с помощью сигнального пептида или эквивалентным образом; В) выращивания клеток...
Штаммы бактерий pseudomonas syringae, используемые для получения псевдомицинов
Номер патента: 6119
Опубликовано: 25.08.2005
Авторы: Миллар Пенелопа Джейн Беверли, Томас Деннис Нельсон, Гетман Брайан Джеральд, Истридж Джек Ричард, Строубел Джуниор Роберт Джозеф Дж., Кэнтвелл Кэтлин Элис, Хилтон Мэттью Дэйл, Кокшотт Эндрю Ричард
МПК: C07K 7/06, C12P 17/14, C12N 1/20...
Метки: штаммы, бактерий, псевдомицинов, получения, pseudomonas, используемые, syringae
Формула / Реферат:
1. Штамм бактерий Pseudomonas syringae 25-B1 (ATCC PTA-1622), продуцирующий один или более псевдомицинов в количестве, превышающем приблизительно 10 мкг/мл. 2. Штамм бактерий Pseudomonas syringae 67H1 (ATCC PTA-1621), продуцирующий один или более псевдомицинов в количестве, превышающем приблизительно 10 мкг/мл. 3. Штамм бактерий Pseudomonas syringae 7H9-1 (ATCC PTA-1623), продуцирующий один или более псевдомицинов в количестве, превышающем...
Способ получения псевдомицина и используемые для этого штаммы pseudomonas syringae
Номер патента: 10054
Опубликовано: 30.06.2008
Авторы: Истридж Джек Ричард, Кэнтвелл Кэтлин Элис, Строубел Джуниор Роберт Джозеф Дж., Томас Деннис Нельсон, Гетман Брайан Джеральд, Миллар Пенелопа Джейн Беверли, Хилтон Мэттью Дэйл, Кокшотт Эндрю Ричард
МПК: C12P 17/14, C07K 7/06, C12N 1/20...
Метки: pseudomonas, syringae, псевдомицина, получения, способ, штаммы, этого, используемые
Формула / Реферат:
1. Способ получения псевдомицина, включающий культивирование биологически чистой культуры Pseudomonas syringae в питательной среде, включающей метил миристат и/или аминокислоту глицин, при pH от около 4 до около 6,5 до получения псевдомицина в концентрации по меньшей мере около 10 мкг/мл и извлечение псевдомицина из культуральной среды. 2. Способ по п.1, где указанная питательная среда дополнительно включает глутаминовую кислоту, гистидин или их...
Поливалентныe штаммы бактериофага, способы их получения и использования и содержащее указанные штаммы лекарственное средство
Номер патента: 7472
Опубликовано: 27.10.2006
Авторы: Сыпер Данута, Лусяк-Шелаховска Марзанна, Боратыньски Януш, Гурски Анджей, Мульчик Мариан, Вебер-Дабровска Беата
МПК: A61K 35/76, A61K 35/74, A61P 31/04...
Метки: использования, бактериофага, поливалентные, получения, штаммы, средство, способы, содержащее, указанные, лекарственное
Формула / Реферат:
1. Способ получения поливалентного штамма бактериофага, отличающийся тем, что: a) выделяют достаточное количество (n) бактериальных патогенных штаммов определенного вида, случайно появляющихся в данном регионе, причем указанные бактериальные штаммы, возможно, являются лекарственно-устойчивыми; b) выделяют достаточное количество штаммов бактериофага, специфичных по меньшей мере для одного из бактериальных штаммов, указанных в а); c) определяют...
Штаммы молочно-кислых бактерий и их применение
Номер патента: 6428
Опубликовано: 29.12.2005
Авторы: Цинк Ральф, Руссо Виржини, Перес Пабло, Кавадини Кристоф, Вон Дер Вейд Тьерри, Беньяку Жалиль, Шиффрин Эдуардо, Реньеро Роберто, Роша Флоранс
МПК: A61K 35/74, A23K 1/00, C12N 1/20...
Метки: молочно-кислых, применение, бактерий, штаммы
Формула / Реферат:
1. Выделенный штамм молочно-кислых бактерий Lactobacillus reuteri NCC 2581 (CNCM 1-2448), обладающий высокой пробиотической активностью в организме домашнего животного, способный выживать в желудочно-кишечном тракте домашнего животного и колонизировать его. 2. Выделенный штамм молочно-кислых бактерий Lactobacillus reuteri NCC 2592 (CNCM 1-2450), обладающий высокой пробиотической активностью в организме домашнего животного, способный выживать в...
Предыдущий патент: Макролиды
Следующий патент: Гидрохлорид дигидрат (s)-(-)-1-(4-фторизохинолин-5-ил)сульфонил-2-метил-1.4-гомопиперазина
Случайный патент: Торговая информационно-аналитическая система