Непэгилированные, длительно циркулирующие липосомы

008930 Область техники, к которой относится изобретение Настоящее изобретение относится к непэгилированным, длительно циркулирующим липосомам для парентерального введения, которые могут быть использованы для того, чтобы они содержали и доставляли диагностические или терапевтические агенты, и их получению. Уровень техники изобретения Липосомы обычно состоят из фосфолипидов и/или стеринов и имеют везикулярную структуру, основанную на липидных бислоях, окружающих водные компартменты. Они широко варьируют по физико-химическим свойствам, таким как размер, поверхностный заряд и фосфолипидный состав. Липосомы привлекали повышенное внимание в качестве возможных носителей для диагностических или терапевтических агентов. Например, липосомы применяли для доставки диагностических агентов, таких как контрастные агенты для получения магнитного изображения, такие как хелатGd:диэтилентриаминпентауксусная кислота (Gd-DTPA) (см., например, патент США 6132763), и терапевтических агентов, таких как антрациклиновые агенты, которые, как было показано, проявляют заметную активность против большого разнообразия новообразований (см., например, патент США 4769250). Однако липосомы вызывают агрегацию в крови посредством их взаимного взаимодействия с различными белками плазмы крови и улавливаются ретикулоэндотелиальной системой (RES). Например,клетки Купфера в печени или фиксированные макрофаги в селезенке улавливают липосомы до их достижения предназначенной для них цели. Улавливание посредством RES делало выбранную доставку липосом к целевым тканям или клеткам очень трудной. Кроме улавливания посредством RES липосомы подвергаются электростатическим, гидрофобным взаимодействиям и взаимодействиям посредством сил Ван-дер-Ваальса с белками плазмы. Эти взаимодействия приводят к дестабилизации липосом, приводящей к быстрому выведению везикул из циркуляции, часто до достижения их цели. Кроме того, кроме клеточных и белковых взаимодействий с липосомами трудности возникали при получении липосом, инкапсулирующих некоторые лекарственные средства, вследствие взаимодействия лекарственных средств с фосфолипидами липосом. Например, антрациклины проявляли действие, подобное поверхностно-активному веществу или детергенту, на фосфолипидный бислой везикул, которое вызывает просачивание и нестабильность липосомных везикул. Таким образом, липосомы, нестабильные к среде циркуляции и/или их содержимому, будут терять противоопухолевый агент преждевременно, до достижения места опухоли. В результате такой потери липосомы и вызванной этим появлением токсичности исследователи пытались разработать длительно циркулирующие липосомы, которые способны проникать из сосудов в местах опухоли, являющихся высоко васкулярными по природе. Поскольку наиболее обычно используемые противоопухолевые лекарственные средства не являются токсичными специфически для опухолевых клеток, а являются токсичными для всех тканей, с которыми они контактируют, они вызывают нежелательные побочные эффекты в результате их взаимодействия с нормальными тканями. Например, гидрохлорид доксорубицина является одним из наиболее обычно применяемых цитотоксичных антрациклиновых антибиотиков, используемых при химиотерапии рака,и, как было показано, обладает активностью против большого разнообразия новообразований. Гидрохлорид доксорубицина является эффективным при лечении многих солидных опухолей и лейкозов. Он в частности является эффективным при лечении рака молочной железы, включающем в себя политерапии. Гидрохлорид доксорубицина применяют для протокольной терапии связанной со СПИДом саркомы Капоши. Гидрохлорид доксорубицина обладает также заметной активностью против опухолей яичников,легкого, яичек, простаты, шейки матки, головы и шеи, эстрогенных сарком и саркомы Эвинга. Обычные композиции гидрохлорида доксорубицина доступны в виде высушенного замораживанием продукта или в виде раствора гидрохлорида доксорубицина в воде. Высушенный замораживанием продукт требуется пересоздать водой для инъекции перед введением. Оба этих имеющихся в продаже продукта были связаны с рядом токсичностей при внутривенном введении. Тяжелая миелосупрессия обычно является ограничивающим дозу фактором. Другие типы токсичности включают тошноту и рвоту,алопецию, воспаление слизистой оболочки (в том числе стоматит и эзофагит) и кардиотоксичность, которые могут ограничить применение гидрохлорида доксорубицина. Гидрохлорид доксорубицина является сильнодействующим кожно-нарывным средством, которое может вызывать транссудацию и некроз в месте инъекции или в любом месте, где кожа подвергается воздействию. Воспалительная гиперемия доксорубицина не является необычной и характеризуется образованием эритематозных полосок в месте инъекции. Воспалительная гиперемия доксорубицина обычно спадает приблизительно через полчаса. Механизм действия гидрохлорида доксорубицина точно не известен, но были изучены и описаны многие возможные механизмы. Основной механизм включает в себя способность гидрохлорида доксорубицина интеркалировать ДНК. Целостность ДНК значительно ухудшается и обычно приводит к изменению функций ДНК. Разрывы одинарных и двойных цепей являются также обычными вследствие интеркаляции гидрохлорида доксорубицина с ДНК. Другой механизм гидрохлорида доксорубицина включает в себя его способность генерировать свободные радикалы, которые вызывают повреждение ДНК и клеточной мембраны. Гидрохлорид доксору-1 008930 бицина также ингибирует топоизомеразу II, делая репродукцию ДНК неэффективной. Некоторые из проявляющихся токсических действий гидрохлорида доксорубицина включают сердечную токсичность, анафилактическую реакцию, рвоту, миелосупрессию, микоцит, кожную токсичность, алопецию и токсичность к зрелищу процесса введения (Cancer Investigation, 19(4): 424-436 (2001. Теоретически системы пролонгированной циркуляции (медленное высвобождение), которые эффективно доставляют и высвобождают лекарственное средство в опухолях и вблизи опухолевых клеток, являются более подходящими. Таким образом, желательно иметь стабильные липосомы, которые способны инкапсулировать такие агенты, как гидрохлорид доксорубицина и которые не высвобождают преждевременно свое содержимое в здоровые или нераковые ткани. Несколько подходов, включающих в себя попытку повышения времени циркуляции липосом и, таким образом, обеспечения доставки содержимого липосом к целевой ткани, включают следующие подходы: маскирование липосом от узнавания ретикулоэндотелиальной системой с применением покрытия из остатков сиаловой кислоты (патент США 4501728); придание жесткости липосомным мембранам сфингомиелином или нейтральным фосфолипидом с преимущественно насыщенными ацильными цепями, содержащими 5-20% гликолипида (патент США 4920016); образование липосом с отношением лекарственного средства к липиду, в 3-80 раз превышающим указанное отношение в обычных липосомных препаратах, в трехкомпартментной системе из агента, бислоев и ингибирующего высвобождение буфера, содержащего лимонную кислоту (патент США 6083530); включения холестерина в липосомы(Alberto A. Gabizon, Cancer Investigation, 19(4), 424-436 (2001 и дериватизацию фосфолипида полиэтиленгликолем (пэгилированные липосомы) (патенты США 5013556 и 6132763). К сожалению, указанные выше подходы показали только ограниченный потенциал для продления времени циркуляции липосом in vivo. Например, было показано, что маскировка липосом сиаловой кислотой имеет только ограниченную способность для продления полупериода циркуляции липосом in vivo(патент США 4920016). Для преодоления этих проблем исследователи покрывали поверхность липосом гидрофильным полимером, таким как полиэтиленгликоль (ПЭГ), для предотвращения адсорбции различных белков плазмы крови на поверхности липосом (см., например, патент США 5013556 и патент США 5676971). Эти пэгилированные липосомы были названы стерически стабилизированными липосомами или скрытыми липосомами. Оказалось, что пэгилированные липосомы снижают некоторые токсичные действия, вызванные высвобождением их содержимого, но, к сожалению, появились новые токсичные действия вследствие присутствия полиэтиленгликоля. Например, липосомные препараты,содержащие пэгилированные фосфолипиды, приводили к кожной токсичности, обычно известной как синдром рук-ног, которая приводит к появлению сыпи/язв на коже ладоней рук и подошвах стоп ног(Kenneth В. Gordon, Cancer, Vol. 75(8), 1995, 2169-2173). Другим недостатком пэгилированных липосом является присутствие больших молекул (ПЭГ) на липосомной поверхности, которые могут уменьшать взаимодействие липосом с клетками и препятствовать вхождению липосом в ткань опухоли, в результате чего возможно снижение аккумуляции липосомного лекарственного средства в ткани опухоли (Clinical Cancer Research, (5), 1999, 3645-3652). Таким образом, сохраняется потребность в стабильных, длительно циркулирующих липосомах, которые не вызывают таких вредных эффектов, как синдром рук-ног, а также способах получения таких липосом и композиций на их основе. Настоящее изобретение удовлетворяет такой потребности, а также обеспечивает способы лечения различных состояний введением липосом настоящего изобретения. Таким образом, основной целью настоящего изобретения является разработка композиции липосом с доксорубицином, которая будет иметь длительное время циркуляции и которая не будет вызывать синдрома рук-ног. Другой целью настоящего изобретения является снижение токсичности и других неблагоприятных эффектов, связанных с введением доксорубицина, таких как тошнота, рвота, алопеция. Еще одной целью настоящего изобретения является разработка липосом для поддержания таких композиций противоопухолевых агентов, как доксорубицин. Сущность изобретения Настоящее изобретение обеспечивает способ получения длительно циркулирующих, непэгилированных липосом, предусматривающий формирование липидной пленки выпариванием растворителя из липидного раствора, содержащего один или несколько фосфолипидов, стерин и растворитель; гидратацию липидной пленки водной средой для гидратации с образованием непэгилированных липосом; где количество применяемой водной среды для гидратации находится в диапазоне 10-35 мл на каждый ммоль фосфолипида, присутствующего в липидном растворе. Количество применяемой водной среды для гидратации, предпочтительно, составляет 30 мл на каждый ммоль фосфолипида в липидном растворе. Настоящее изобретение далее обеспечивает способ получения длительно циркулирующих, непэгилированных, сортированных по размеру липосом, предусматривающий растворение одного или нескольких фосфолипидов и стерина в растворителе или смеси растворителей; удаление указанных растворителей до или после гидратации фосфолипидов добавлением водной среды для гидратации с образованием непэгилированных липосом, где количество применяемой водной среды для гидратации находится в диапазоне 10-35 мл на каждый ммоль фосфолипида, присутствующего в липидном растворе; сортирова-2 008930 ние непэгилированных липосом до размеров приблизительно от 0,06 до 0,16 мкм с образованием липосомной композиции и удаление внелипосомной соли среды для гидратации из липосомной композиции с применением буферного раствора сахарозы-гистидина с образованием непэгилированных, сортированных по размеру липосом. Способ получения непэгилированных липосом может дополнительно предусматривать загрузку липосом терапевтическим или диагностическим агентом. Терапевтическим агентом, предпочтительно, является противоопухолевый агент, такой как гидрохлорид доксорубицина, гидрохлорид даунорубицина и гидрохлорид эпирубицина, более предпочтительным является гидрохлорид доксорубицина. Молярное отношение фосфолипида к стерину, предпочтительно, составляет приблизительно от 1:0,1 до 1:2 и, более предпочтительно, приблизительно 1:0,7. Предпочтительная водная среда для гидратации содержит сульфат аммония и сахарозу, а концентрация сульфата аммония в водной среде для гидратации составляет не менее чем 125 ммоль/л. Предпочтительные фосфолипиды имеют температуру фазового перехода, составляющую приблизительно 40-60 С, имеют цепь жирной кислоты минимум из шестнадцати атомов углерода и выбраны из группы, состоящей из дистеароилфосфатидилхолина (DSPC), дипальмитоилфосфатидилхолина (DPPC),гидрогенизированного соевого фосфатидилхолина (HSPC) и производных таких фосфолипидов. Предпочтительным фосфолипидом является дистеароилфосфатидилхолин (DSPC), а предпочтительным стерином является холестерин. Способ может также предусматривать сортирование по размерам непэгилированных липосом. Их предпочтительно сортируют экструзией последовательно через фильтры, имеющие размер пор 0,4-0,05 мкм. Другой вариант осуществления настоящего изобретения обеспечивает липосомы, получаемые описанным здесь способом. Липосомы содержат ингредиенты в пропорциях, описанных в способе их получения, а средний размер получаемых таким образом липосом составляет 0,06-0,16 мкм. Настоящее изобретение обеспечивает также композицию длительно циркулирующих, непэгилированных липосом с доксорубицином для парентерального введения, содержащую непэгилированные липосомы с доксорубицином, гидрохлорид гистидина и сахарозу; где указанные непэгилированные липосомы с доксорубицином содержат дистеароилфосфатидилхолин, холестерин, сахарозу помимо гидрохлорида доксорубицина, где указанные липосомы имеют средний размер, составляющий 0,06-0,160 мкм, и где указанные непэгилированные липосомы с доксорубицином имеют время циркуляции в крови, которое по меньшей мере в 25 раз превышает время циркуляции, полученное с адриамицином, при испытании на мышах swiss albino в эквивалентных дозах. Концентрация гидрохлорида доксорубицина, инкапсулированного в липосомы, составляет от 1 до 10 мМ, предпочтительно от 3 до 7 мМ, более предпочтительно 6,9 мМ и наиболее предпочтительно 3,45 мМ. Молярное отношение дистеароилфосфатидилхолина к холестерину составляет от 1:0,6 до 1:0,8,предпочтительно 1:0,7. Молярное отношение гидрохлорида доксорубицина к дистеароилфосфатидилхолину предпочтительно составляет от 1:2 до 1:15, более предпочтительно 1:3,5. Концентрация сахарозы предпочтительно составляет от 0,1 до 0,5 М, более предпочтительно от 0,25 до 0,3 М. Концентрация гидрохлорида гистидина составляет от 1 до 100 мМ, предпочтительно от 8 до 12 мМ и, более предпочтительно приблизительно 10 мМ. Предпочтительный средний размер липосом составляет от 0,08 до 0,12 мкм. В примерной композиции гидрохлорид доксорубицина присутствует при 2 мг/мл, молярное отношение доксорубицина к фосфолипиду составляет приблизительно 1:3,5 и отношение фосфолипида к холестерину составляет приблизительно 1:0,7. В другой примерной композиции гидрохлорид доксорубицина присутствует при 4 мг/мл, молярное отношение доксорубицина к фосфолипиду составляет приблизительно 1:3,5 и отношение фосфолипида к холестерину составляет приблизительно 1:0,7. Время циркуляции (t1/2) композиции в крови, предпочтительно, более чем в 40 раз превышает время циркуляции, полученное с адриамицином, при испытании на мышах swiss albino в эквивалентных дозах. Настоящее изобретение обеспечивает также способы снижения роста опухолей, предусматривающие введение композиций настоящего изобретения. Настоящее изобретение обеспечивает также способ получения композиций длительно циркулирующих, непэгилированных липосом с доксорубицином. Композиции настоящего изобретения являются новыми и до сих пор не описаны. Подробное описание изобретения Настоящее изобретение обеспечивает стабильные, длительно циркулирующие, непэгилированные липосомы, а также способ их получения. Пэгилированные липосомы являются липосомами, покрытыми полиэтиленгликолем (ПЭГ). Поверхность липосомы покрывают несколькими тысячами цепей ПЭГ спо-3 008930 собом, названным пэгилирование. Цепи ПЭГ делают поверхность липосомы волосатой и это предотвращает быструю абсорбцию липосом на поверхности белков крови. Быстрая абсорбция ускоряет быстрое удаление липосом из крови. В противоположность этому, пэгилированные липосомы являются защищенными и удаляются из крови со значительно более медленной скоростью. По сравнению с липосомами, приготовленными без ПЭГ, пэгилированные липосомы являются более стабильными, менее экстенсивно захватываются клетками ретикулоэндотелиальной системы (RES) и имеют пониженную тенденцию выпускать любой капсулированный агент или лекарственное средство при циркуляции. Например, фармакокинетика ПЭГ-липосом, инкапсулирующих доксорубицин, характеризуется длительным полупериодом циркуляции, медленным выведением из плазмы и пониженным объемом распределения по сравнению с доксорубицином непэгилированных липосом или свободным доксорубицином. Длительная циркуляция и способность пэгилированных липосом проникать через сосудистую сеть опухоли приводит к локализации доксорубицина в ткани опухоли с повышением возможности повышенной ответной реакции опухоли вследствие повышенной аккумуляции лекарственного средства, особенно в высоко ангиогенных опухолях. Кроме того, повышенная стабильность пэгилированных липосом по сравнению с обычными липосомами приводит к снижению доступности лекарственного средства в ткани чувствительных органов и, таким образом, к снижению токсичности и других неблагоприятных эффектов, таких как тошнота, рвота и алопеция. Однако указывалось, что серьезный побочный эффект, известный как синдром рук-ног, когда на ладонях рук и подошвах стоп ног наблюдается сыпь или язвы, является результатом клинического применения пэгилированных липосом (Kenneth В. Gordon, Cancer, Vol. 75(8),1995, 2169-2173). Другим недостатком пэгилированных липосом является присутствие больших молекул(ПЭГ) на липосомной поверхности, которые могут снижать взаимодействие липосом с клетками и препятствовать вхождению липосом в опухолевую ткань, тем самым возможно снижая аккумуляцию липосомного лекарственного средства в опухолевой ткани. Способ настоящего изобретения обеспечивает получение стабильных, длительно циркулирующих,низкотоксичных непэгилированных липосом, которые проявляют стабильность пэгилированных липосом с длительным полупериодом циркуляции и пониженной токсичностью, описанных выше. Однако поскольку липосомы настоящего изобретения не требуют применения ПЭГ для достижения указанных выше результатов, они не вызывают синдрома рук-ног. В способе настоящего изобретения гидратация липидов может быть проведена перед выпариванием растворителя или может быть проведена после выпаривания растворителя, который применяют для растворения липидов. Растворители, подходящие для изобретения, являются органическими растворителями, в которых фосфолипиды могут быть растворены. Специалист в данной области может выбрать обычно применяемые и подходящие растворители для изготовления липосом. Примеры подходящих растворителей включают, но не ограничиваются перечисленным, хлороформ, метиленхлорид, этанол, метанол, ацетон. Когда гидратацию липидов проводят после выпаривания растворителя, такие растворители, как хлороформ, метиленхлорид, являются предпочтительными растворителями. Когда гидратацию липидов проводят перед выпариванием растворителя, такие смешиваемые с водой растворители, как этанол, метанол, ацетон, являются предпочтительными растворителями. Когда гидратацию проводят после выпаривания растворителя, способ предусматривает формирование липидной пленки выпариванием растворителя из липидного раствора, содержащего один или несколько фосфолипидов, стерин и растворитель или смесь растворителей. Выпаривание растворителя можно осуществить любым из таких способов выпаривания, как способы, включающие, но не ограничивающиеся перечисленным, выпаривание пропусканием потока инертного газа над раствором, нагреванием, применением вакуума или нагреванием в вакууме. Обычно применяют колбы с роторным испарителем. Когда гидратацию проводят перед выпариванием растворителя, способ предусматривает выпаривание растворителя из водной липосомной суспензии, содержащей растворитель. Выпаривание растворителя можно выполнить любым способом выпаривания, включающим, но не ограничивающимся перечисленным, выпаривание пропусканием потока инертного газа над раствором, нагреванием, применением вакуума или нагреванием в вакууме. Обычно применяют колбы с роторным испарителем. После выпаривания растворителя или смеси растворителей только липосомы остаются в форме водной суспензии. В настоящем изобретения может быть использован любой фосфолипид, подходящий для получения липосом. Подходящие фосфолипиды включают фосфолипиды, которые имеют тенденцию снижать проницаемость липосомной мембраны. Липосомы, содержащие фосфолипиды с длинными цепями жирных кислот, являются более подходящими и их применение приводит к более медленному высвобождению агента, чем у липосом, состоящих из фосфолипидов, имеющих более короткие цепи жирных кислот. Когда длина углеродной цепи жирной кислоты увеличивается, температура фазового перехода также повышается. Липосомы, состоящие из фосфолипидов с более высокой температурой фазового перехода,высвобождают свое содержимое медленнее, чем липосомы, состоящие из фосфолипидов с более низкой температурой фазового перехода. Более высокие температуры фазового перехода способны замедлять высвобождение содержимого из внутренней части липосом в кровоток, поскольку фосфолипидные мем-4 008930 браны являются полупроницаемыми. Другие характеристики фосфолипидов, которые влияют на проницаемость и стабильность мембран, включают в себя степень насыщения и заряд. Липосомы настоящего изобретения, предпочтительно, содержат нейтральные липиды. Предпочтительно, чтобы нейтральные липиды имели температуру фазового перехода от 40 до 65 С, более предпочтительно приблизительно от 50 до 54 С. Предпочтительные фосфолипиды имеют цепь жирной кислоты,содержащую по меньшей мере шестнадцать атомов углерода. Подходящие фосфолипиды настоящего изобретения включают в себя, но не ограничиваются перечисленным, дистеароилфосфатидилхолин (DSPC) или дипальмитоилфосфатидилхолин (DPPC), гидрогенизированный соевый фосфатидилхолин (HSPC) или производные таких фосфолипидов. Фосфатидилхолины являются предпочтительно нейтральными липидами. Предпочтительным фосфолипидом является 1,2-дистеароил-sn-глицерин-3-фосфохолин, который обычно известен как дистеароилфосфатидилхолин(DSPC). DSPC имеет молекулярную массу 790 и молекулярную формулу C44H88NO8P. Стерины вводят в липосомы вместе с фосфолипидами для изменения жесткости и проницаемости липосомных мембран. Примером стерина является холестерин и его производные или аналоги. Холестерин имеет тенденцию повышать жесткость и снижать проницаемость липосомных мембран. Холестерин является амфипатической молекулой и вставляется в фосфолипидную мембрану своими гидроксильными группами, ориентированными по направлению к водной поверхности. Холестерин включают при концентрации, которая обеспечивает оптимальную проницаемость для липосомной мембраны, но также сохраняет жесткость мембраны. Выбор отношения фосфолипида к холестерину определяет скорость растворения содержимого из липосом. Липосомы настоящего изобретения имеют молярное отношение фосфолипидов к стерину, составляющее от 1:01 до 1:2. Предпочтительным диапазоном является диапазон от 1:0,5 до 1:1,5. Предпочтительным молярным отношением фосфолипидов к стерину, когда дистеароилфосфатидилхолин (DSPC) является фосфолипидом, а холестерин является стерином, является отношение от 1:0,6 до 1:0,8. Предпочтительным молярным отношение является приблизительно 1:0,7. Растворитель или смеси растворителей выпаривают в вакууме. В способе, когда гидратацию проводят после удаления растворителей, образованную липидную пленку гидратируют водной средой для гидратации с образованием липосом. Водную среду для гидратации добавляют к пленке с размешиванием или при перемешивании для гидратации липидной пленки и образования липосом. Специалист в данной области может выбрать подходящие водные среды для гидратации. Предпочтительные водные среды для гидратации содержат буферы/соли, чтобы среды были пригодными для создания позднее химического градиента для помощи в загрузке различных агентов в липосомы. Примеры сред для гидратации включают в себя, но не ограничиваются перечисленным, гидроксид аммония, сульфат аммония, карбонат аммония и бикарбонат аммония. Предпочтительная водная среда для гидратации содержит сульфат аммония. Кроме того, водная среда для гидратации содержит изоосмотический агент, например, включающий, но не ограничивающийся перечисленным, сахарозу, хлорид натрия, декстрозу или маннит. Предпочтительно, чтобы изоосмотический агент не реагировал с другими компонентами раствора и самими липосомами. Изоосмотическим агентом предпочтительно является сахароза, так как она является менее всего реакционноспособной. Когда водная среда для гидратации содержит сульфат аммония, предпочтительным изоосмотическим агентом является сахароза. Сахароза помогает в защите и придании жесткости липосомной мембране и сохраняет также изотоничность липосомной композиции. Объем водной среды для гидратации регулируют/снижают по сравнению с количествами среды для гидратации, применяемой при получении обычных липосом и пэгилированных липосом. Посредством снижения объема водной среды для гидратации фосфолипиды могут упаковываться вместе более плотно,что приводит к образованию липосомной мембраны или оболочки с большей толщиной. Более толстая оболочка обеспечивает получение стабильных, длительно циркулирующих, медленно высвобождающих содержимое и обладающих пониженной токсичностью липосом без необходимости ПЭГ. Чем меньше объем применяемой среды для гидратации, тем плотнее будут упаковываться вместе фосфолипиды и тем толще будет оболочка. Термин регулируемый/пониженный означает, что объем применяемой водной среды для гидратации, используемый в настоящем изобретении, меньше, чем ранее известные или приемлемые количества водной среды для гидратации. При применении предпочтительного уменьшенного объема среды для гидратации (т.е. 30 мл на каждый ммоль фосфолипида) и предпочтительной концентрации холестерина получающаяся в результате липосомная композиция будет иметь твердый фосфолипидный бислой. Это снижение в объеме среды для гидратации можно также оценивать в терминах отношения применяемого объема буфера на моли фосфолипида, присутствующего в липидном растворе. В настоящем изобретении количество применяемой водной среды для гидратации находится в диапазоне 10-35 мл на каждый ммоль фосфолипида, присутствующего в липидном растворе. Предпочтительный объем водной среды для гидратации находится между 20-30 мл на каждый ммоль фосфолипида, присутствующего в липидном растворе. Более предпочтительно, объем водной среды для гидратации составляет 30 мл на каждый ммоль фосфолипида, применяемого в липидном растворе. Липосомы сортируют по размеру подходящим образом. Спеииалист в данной области должен знать известные способы разделения липосом по размеру. Гомогенизация под давлением является одним таким-5 008930 способом. Другой подходящий способ включает в себя экструзию липосом через фильтры с размером пор, подходящим для требуемого размера липосом. Поскольку липосомы настоящего изобретения имеют более плотно упакованную мембрану, имеется тенденция более трудного разделения по размеру, чем у обычных липосом. Поэтому их предпочтительно разделяют по размеру пропусканием через ряд фильтров со все более уменьшающимся размером пор. Например, после гидратации липосомы сначала пропускают через фильтр, имеющий размер пор 0,40 мкм с последующим пропусканием через фильтры с последовательно снижающимся размером пор до приблизительно 0,05 мкм. Получающиеся в результате липосомы имеют диапазон среднего размера пор 0,06-0,2 мкм. Предпочтительный диапазон среднего размера пор составляет от 0,08 до 0,12 мкм. Внелипосомную соль в среде для гидратации удаляют или отмывают от липосом. Диализ с применением среды для диализа является примером способа удаления внелипосомной соли среды для гидратации. Для диализа можно применять любой подходящий буфер. Удаление внелипосомной соли, присутствующей в липосомной композиции, создает химический градиент через липосомную мембрану внутренняя сторона-внешняя сторона, который позднее необходим для загрузки липосом. Другие подходящие способы удаления внелипосомной соли включают ультрафильтрацию или колоночную хроматографию. Липосомы настоящего изобретения обеспечивают для терапевтических или диагностических агентов механизм длительно циркулирующей доставки с медленным высвобождением. Для загрузки липосом требуемым терапевтическим или диагностическим агентом может быть использован любой известный способ. Примеры способов включают в себя добавление такого агента к липидной пленке перед гидратацией липидной пленки, введение агента непосредственно в среду гидратации, при помощи градиента рН или посредством химического градиента. Предпочтительный способ включает в себя загрузку агента с применением химического градиента. Когда липосомы загружают активным способом загрузки, раствор лекарственного средства смешивают с незаполненной липосомной суспензией при температуре, которая выше, чем температура или эквивалентна температуре фазового перехода фосфолипидов. При применении химического градиента количество агента можно легко регулировать и, как только агент загружают внутрь липосом, утечка во внелипосомную среду является минимальной. Кроме того,если среду для гидратации, содержащую буфер/соли, применяют на стадии гидратации, создание такого градиента становится очень легко выполнимым после удаления внелипосомной соли среды для гидратации, как описано выше. Одна такая являющаяся примером среда для гидратации, которую можно применять для создания химического градиента, применимого при загрузке липосом, содержит сульфат аммония. Однако гидратация раствором сульфата аммония, которому придана изотоничность хлоридом натрия (см. патент США 5316771), приводит к получению липосом, которые дают утечку при хранении. Содержание свободного лекарственного средства липосомной композиции повышается при хранении,что, в свою очередь, повышает токсичность. Поэтому имеется потребность в усилении липосомной мембраны. Настоящее изобретение, таким образом, предлагает сопутствующее применение изоосмотического агента, который не реагирует с другими ингредиентами раствора и самими липосомами в среде для гидратации. Изоосмотическим агентом предпочтительно является сахароза. Обнаружено, что применение сахарозы является защитным для липосомных мембран. Сахароза помогает в защите липосомной мембраны и придании ей твердости, а также сохранении изотоничности липосомной композиции. Липосомные мембраны защищали от дегидратации перед сушкой замораживанием посредством применения сахаридов, таких как трегалоза, сахароза, мальтоза (патент США 4880635). Настоящее изобретение, таким образом, предлагает применять сахарозу с сульфатом аммония в качестве среды для гидратации для получения липосом, которые являются более жесткими и не дают утечку агента, инкапсулированного в них, при хранении. При добавлении сахарозы к среде для гидратации сахароза остается на внутренней и внешней поверхности липосомной мембраны, придавая твердость обоим сторонам липосомной мембраны, таким образом снижая утечку лекарственного средства. Предпочтительно, чтобы концентрация сахарозы в среде для гидратации была от 0,1 до 0,5 М. Предпочтительной концентрацией является 0,25-0,3 М. Концентрация сульфата аммония в среде для гидратации оказывает существенное влияние на утечку лекарственного средства из липосом. Раствор сульфата аммония с концентрацией ниже, чем 125 мМ,всегда, когда его применяли для гидратации с целью образования липосом, вызывал утечку лекарственного средства при хранении. Таким образом, в предпочтительном способе получения концентрация сульфата аммония в среде для гидратации является выше, чем 125 мМ, что в свою очередь позволяет получить липосомные композиции с пониженной утечкой при хранении. Таким образом, в предпочтительном способе концентрация раствора сульфата аммония составляет не меньше чем 125 ммоль/л и среда для гидратации содержит сахарозу. Когда проводят диализ, он удаляет внелипосомную соль, т.е. сульфат аммония, но не удаляет внутрилипосомный сульфат аммония, таким образом вызывая образование химического градиента через липосомную мембрану внутренняя сторона-внешняя сторона. Имеется много подходящих буферных растворов, которые можно применять как для загрузки лекарственного средства в липосомы, так и разбавления получающейся в результате липосомной композиции до требуемой концентрации лекарственного средства. Поскольку липосомы в основном содержат-6 008930 фосфолипиды, которые являются стабильными почти при нейтральном значении рН, составляющем приблизительно 6,0-8,0, буферные растворы, применяемые для загрузки и разбавления липосом, должны иметь нейтральное значение рН. Кроме того, идеально буферный раствор должен быть подходящим для парентеральных препаратов. Некоторыми из наиболее обычных буферных растворов, применяемых для парентеральных препаратов, которые являются подходящими в настоящем изобретении для загрузки лекарственного средства в липосомы и для разбавления липосомной композиции, являются буферные растворы глицина, фосфата, цитрата, ацетата и гистидина. Буферный раствор гистидина является предпочтительным, так как он имеет наиболее стабильное значение рН в нейтральном диапазоне. Буферный раствор, предпочтительно, содержит сахарозу и гидрохлорид гистидина в молярном отношении от 29:0,1 до 29:10, более предпочтительно приблизительно 29:1. Применение сахарозы помогает в защите липосомных мембран и придании им твердости, а также в сохранении изотоничности липосомной композиции. После загрузки липосом любой неуловленный в липосомы агент удаляют. Подходящие способы удаления включают, но не ограничиваются перечисленным, гель-фильтрационную хроматографию, диализ, обработку микропористой смолой из сополимера стирола и дивинилбензола (DOWEX) и последующую фильтрацию. Обработка DOWEX является предпочтительным способом вследствие легкости его применения. Когда применяют диализ, его предпочтительно проводят таким же способом, как описано выше при удалении внелипосомных солей среды для гидратации. Как описано выше, благодаря регулированию или снижению количества водной среды для гидратации получающиеся в результате липосомы имеют повышенное содержание фосфолипида на единицу объема. Повышение содержание фосфолипида повышает стабильность липосом, снижает проницаемость и, таким образом, замедляет высвобождение любого уловленного липосомами агента. Подходящие агенты для загрузки в липосомы настоящего изобретения являются растворимыми в воде амфипатическими соединениями с ионизируемыми группами. Амфипатические агенты проявляют как гидрофильные, так и липофильные характеристики и могут быть терапевтическим или диагностическим агентом. Терапевтическими агентами может быть любой требуемый агент, и они включают противоопухолевые агенты. Противоопухолевым агентом является лекарственное средство, которое предотвращает, устраняет или блокирует рост и распространение раковых клеток. Имеется много подходящих противоопухолевых агентов, некоторые из которых включают алтретамин; аспарагиназу; BCG; блеомицин сульфат; бусульфан; карбоплатин; кармустин; хлорамбуцил; цисплатин-цис-платимум; цис-диамминдихлорплатинум; кладрибин; 2-хлордеоксиаденозин; циклофосфамид; цитарабинцитозин арабинозид; дакарбазин имидазолкарбоксамид; дактиномицин; даунорубициндауномицин; даунорубицин гидрохлорид; дексаметазон; доксорубицин; доксорубицин гидрохлорид; эпирубицин; этопозидэпиподофиллотоксин; флоксуридин; фторурацил; флуоксиместерон; флутамид; флударабин; гозерелин; гидроксимочевину; идарубицин HCl; ифосфамид-изофосфамид; интерферон альфа; интерферон альфа 2 а; интерферон альфа 2b; интерферон альфа n3; иринотекан; лейковорин кальций; лейпролид; левамизол; ломустин; мегестрол; мелфалан-Lфенилаланин мустард; L-сарколизин; мелфалан гидрохлорид; мехлоретамин; азотный аналог горчичного газа; метилпреднизолон; метотрексатаметоптерин; митомицинмитомицин-С; митоксантрон; меркаптопурин, паклитаксел; пликамицинмитрамицин; преднизолон; прокарбазин; стрептозоцинстрептозотоцин; тамоксифен; 6-тиогуанин; тиотепатриэтилентиофосфорамид; винбластин; винкристин или винорелбин тартрат. Предпочтительные противоопухолевые агенты данного изобретения включают доксорубицин гидрохлорид, даунорубицин гидрохлорид и эпирубицин гидрохлорид. Настоящее изобретение предлагает также загружать липосомы диагностическими агентами, включающими, но не ограничивающимися перечисленным, контрастные агенты (называемые также парамагнитными агентами) MRI (получение изображения магнитным резонансом), применяемые для помощи в получении ясной картины во время MRI. MRI является специальным видом диагностической процедуры,в которой применяют магниты и компьютеры для создания изображений или картин внутри тела. В отличие от рентгеновских лучей MRI не включает ионизирующее излучение. Примеры диагностических агентов MRI включают гадодиамид; гадопентетат; гадотеридол; гадоверзетамид; хелат Gd:диэтилентриаминпентауксусная кислота (Gd-DTPA) (патент США 6132763). Как только липосомы загружают и неинкапсулированный, терапевтический/диагностический агент удаляют, липосомная композиция может быть асептическим способом отфильтрована для стерилизации,что делает ее подходящей для парентерального введения. В идеальном случае фильтр имеет размер отверстий по меньшей мере 0,2 мкм. Липосомную композицию затем фильтруют в стерильный, освобожденный от пирогенов контейнер большого объема. Затем стерильную композицию помещают в асептических условиях в стерильные, освобожденные от пирогенов контейнеры меньшего размера, такие как стеклянные ампулы. Воздух в головном пространстве контейнера удаляют продуванием инертным газом,таким как азот, и контейнеры герметизируют. Термин подходящий для парентерального введения означает, что композиция является стерильной, изотонической и проверенной в отношении бактериальных эндотоксинов. Настоящее изобретение обеспечивает также стабильные, длительно циркулирующие, непэгилиро-7 008930 ванные липосомы с низкой токсичностью. Липосомы предпочтительно получают описанными здесь способами. Липосомы данного изобретения являются длительно циркулирующими, непэгилированными липосомами, которые имеют полупериод циркуляции в крови по меньшей мере в 25 раз превышающий полупериод циркуляции обычных нелипосомных препаратов (адриамицин), при испытании на мышахswiss albino в эквивалентных дозах. Предпочтительный полупериод циркуляции в крови приблизительно в 40 раз превышает полупериод, полученный с адриамицином. Непэгилированные липосомы настоящего изобретения состоят из фосфолипида и холестерина. Приемлемые отношения фосфолипида к холестерину описаны выше и предпочтительно являются молярными отношениями приблизительно от 1:0,1 до 1:2. Предпочтительное молярное отношение фосфолипида к стерину составляет приблизительно 1:0,7. Фосфатидилхолины являются предпочтительными фосфолипидами и особенно предпочтительным является дистеароилфосфатидилхолин (DSPC). Непэгилированные липосомы могут быть загружены диагностическим или терапевтическим агентом. Такие агенты являются известными и обсуждались выше. Непэгилированные липосомы настоящего изобретения предпочтительно загружают с применение обсуждаемого выше химического градиента. Предпочтительные непэгилированные липосомы настоящего изобретения загружают гидрохлоридом доксорубицина и получают с применением описанных выше способов. В одном варианте осуществления при загрузке гидрохлоридом доксорубицина с применением описанной выше процедуры активной загрузки лекарственное средство растворяют в подходящем буферном растворе (как описано выше) перед загрузкой для достижения концентрации, составляющей по меньшей мере 25 мМ. Когда способ активной загрузки включает в себя градиент сульфата аммония, сульфат аммония взаимодействует с гидрохлоридом доксорубицина с образованием сульфата доксорубицина. Сульфат доксорубицина является нерастворимым и остается внутри липосом после загрузки. Как только неуловленное или свободное лекарственное средство удаляют из загруженных липосом, загруженные лекарственным средством липосомы разбавляют с применением водного буферного раствора для достижения требуемой концентрации лекарственного средства. Предпочтительным применяемым буферным раствором является буферный раствор сахарозы-гистидина, как обсуждалось ранее. Примерная композиция непэгилированных липосом с доксорубицином содержит 2 мг/мл гидрохлорида доксорубицина. Другая примерная композиция непэгилированных липосом с доксорубицином содержит 4 мг/мл гидрохлорида доксорубицина. С применением способов настоящего изобретения доксорубицин может быть загружен в непэгилированные липосомы при концентрации, в два раза превышающей концентрацию, требуемую в конечной желаемой композиции. Затем загруженные липосомы могут быть разбавлены подходящим буферным раствором (как описано выше) для достижения требуемой концентрации доксорубицина на мл липосомной композиции. При разбавлении внешняя среда, в которой суспендированы липосомы, разбавляется, тогда как лекарственное средство внутри липосом остается неразбавленным. В предпочтительном варианте осуществления молярное отношение гидрохлорида доксорубицина к фосфолипидам составляет приблизительно от 1:2 до приблизительно 1:15. Предпочтительным молярным отношением является приблизительно 1:3,5. Настоящее изобретение предлагает также композиции непэгилированных липосом с доксорубицином. Композиция содержит непэгилированные липосомы, как описано выше, в подходящих фармацевтически приемлемых носителях, которые являются известными в данной области. Липосомы загружали гидрохлоридом доксорубицина. Композиции являются подходящими для парентерального введения и длительно циркулирующими. В одном варианте осуществления предложены композиции длительно циркулирующих, непэгилированных липосом с доксорубицином для парентерального введения. Липосомная композиция содержит непэгилированные липосомы с доксорубицином в фармацевтически приемлемом носителе. Подходящие фармацевтически приемлемые носители являются известными в данной области. В предпочтительной фармацевтической композиции концентрация гидрохлорида доксорубицина варьирует от 1 до 10 мМ,более предпочтительно составляет приблизительно 6,9 мМ, наиболее предпочтительно приблизительно 3,45 мМ. Молярная концентрация фосфолипидов варьирует от 10 мМ до 15 мМ парентеральной композиции. Более предпочтительное содержание составляет приблизительно 12,15 мМ. Композиция дополнительно содержит дистеароилфосфатидилхолин, холестерин, гидрохлорид гистидина и сахарозу. Липосомы, предпочтительно, имеют средний размер, составляющий 0,06-0,16 мкм. Содержание гидрохлорида доксорубицина предпочтительно составляет 1-10 мМ и, более предпочтительно, содержание гидрохлорида доксорубицина составляет 3,45 мМ. В композиции настоящего изобретения молярное отношение дистеароилфосфатидилхолина к холестерину составляет от 1:0,6 до 1:0,8, предпочтительно 1:0,7. В композиции настоящего изобретения молярное стношение гидрохлорида доксорубицина к дистеароилфосфатидилхолину составляет от 1:2 до 1:10, предпочтительно от 1:2 до 1:8 и более предпочтительно 1:3,5. Содержание сахарозы составляет от 0,1 до 0,5 М, более предпочтительно от 0,25 до 0,3 М. В композициях настоящего изобретения содержание гидрохлорида гистидина составляет от 1 до-8 008930 100 мМ, предпочтительно 8-12 мМ и более предпочтительно 10 мМ. В композициях настоящего изобретения липосомы имеют средний размер 0,8-0,12 мкм. В одном варианте осуществления настоящего изобретения гидрохлорид доксорубицина присутствует при 4 мг/мл и молярное отношение доксорубицина к DSPC составляет 1:3,5 и отношение DSPC к холестерину составляет 1:0,7. Еще в одном варианте осуществления настоящего изобретения гидрохлорид доксорубицина присутствует при 2 мг/мл и молярное отношение доксорубицина к DSPC составляет 1:3,5 и отношение DSPC к холестерину составляет 1:0,7. Липосомы с доксорубицином в композициях предпочтительно имеют полупериод циркуляции (t1/2) в крови, более чем в 40 раз превышающий t1/2 адриамицина, при испытании на мышах swiss albino в эквивалентных дозах. В другом варианте осуществления настоящего изобретения предложен способ снижения роста опухоли введением композиции непэгилированных липосом с доксорубицином. Данный способ включает введение терапевтически эффективного количества композиции непэгилированных липосом с доксорубицином настоящего изобретения. Так как композиция непэгилированных липосом с доксорубицином имеет пролонгированное время циркуляции, имеет пониженную токсичность и не вызывает синдрома рук-ног, она обеспечивает эффективное лечение для уменьшения роста опухоли. Практикующий врач в настоящей области может быть способен использовать представленные здесь данные, а также общее знание дозированных количеств, времени дозирования и пути введения для лечения индивидуума,имеющего опухоль, восприимчивую к лечению гидрохлоридом доксорубицина, непэгилированными липосомами с доксорубицином настоящего изобретения. Композиции настоящего изобретения с концентрациями гидрохлорида доксорубицина 2 и 4 мг/мл являются применимыми для лечения, заключающегося в снижении роста опухоли. Настоящее изобретение обеспечивает также способ получения этих композиций с ингредиентами в таких же пропорциях, как в указанных композициях. Способ предусматривает:(a) растворение дистеароилфосфатидилхолина (DSPC) и холестерина в одном растворителе или в смеси растворителей;(b) удаление указанных растворителей до или после гидратации липидов добавлением водного раствора для гидратации, содержащего сульфат аммония и сахарозу, в количествах в диапазоне от 10 до 35 мл на каждый ммоль DSPC;(c) разделение по размеру липосом в липосомной композиции, полученной в конце стадии b), приблизительно до 0,060 до 0,16 мкм;(d) удаление внелипосомного сульфата аммония из липосомной композиции, которую подвергали разделению липосом по размеру на стадии (с), с применением буферного раствора сахароза-гистидин,содержащего гидрохлорид гистидина и сахарозу;(e) растворение гидрохлорида доксорубицина в указанном буферном растворе сахароза-гистидин с получением раствора гидрохлорида доксорубицина с концентрацией по меньшей мере 25 мМ;(f) смешивание раствора гидрохлорида доксорубицина, полученного на стадии (е), и липосомной композиции, полученной на стадии (d), с получением липосомной композиции, загруженной гидрохлоридом доксорубицина;(g) удаление внелипосомного гидрохлорида доксорубицина из липосомной композиции любым из способов, таким как фильтрование с тангенциальным потоком, колоночная хроматография или обработка смолами, такими как смолы на основе микропористого сополимера стирола и дивинилбензола;(h) пополнение такого объема липосомной композиции, полученной в конце стадии (g), с применение указанного буферного раствора сахароза-буфер, чтобы получить липосомную композицию, имеющую требуемую концентрацию гидрохлорида доксорубицина;(i) фильтрование липосомной композиции в асептических условиях через стерильный 0,2 мк фильтр стерилизующего сорта в стерильный контейнер с получением указанной липосомной композиции доксорубицина. Концентрация сульфата аммония в водной среде для гидратации составляет не меньше чем 125 мМ. Непэгилированные липосомы, содержащие гидрохлорид доксорубицина, настоящего изобретения,проявляли пониженные токсические действия по сравнению с обычными препаратами гидрохлорида доксорубицина (адриамицин) и препаратами пэгилированных липосом с гидрохлоридом доксорубицина(каеликс). В табл. 1 ниже представлены результаты исследования острой токсичности и фармакокинетики на мышах. Непэгилированные липосомы с доксорубицином настоящего изобретения, получаемые по параметрам, указанным в примере II, сравнивали с коммерчески доступным препаратом пэгилированных липосом с доксорубицином, каеликс, и адриамицином. LD50 для непэгилированных липосом с доксорубицином настоящего изобретения выше, чем у адриамицина и каеликса, таким образом, это показывает,что непэгилированные липосомы с доксорубицином настоящего изобретения имеют меньшую токсичность.-9 008930 Таблица 1. Исследования острой токсичности и фармакокинетики на мышах Сокращения: MTD = максимальная толерантная доза; Сmах = максимальная концентрация лекарственного средства, достигаемая в плазме; Тmах = время, требуемое для достижения максимальной концентрации лекарственного средства в плазме; Kel = константа удаления; Т 1/2 = время, требуемое для достижения снижения на 50% концентрации лекарственного средства в плазме; AUS = площадь под кривой зависимости концентрации от времени; Vd = объем распределения; Cl = скорость выведения лекарственного средства. Непэгилированные липосомы с доксорубицином настоящего изобретения применяли для лечения опухоли молочной железы человека MCF-7, имплантированной мышам. Результаты представлены ниже в табл. 2. Различие в массе опухоли и эффективности измеряли Т/С% (испытание/контроль, процент). В этом исследовании (пример VI) наивысшим отношением Т/С с применением каеликс является -78 при 12 мг/кг и -34,7 при 6 мг/кг, тогда как с применением непэгилированных липосом с доксорубицином настоящего изобретения самым высоким отношением является -93,4 при 12 мг/кг и -89,43 при 6 мг/кг. Эти результаты показывают, что, как оказалось, композиции непэгилированных липосом с доксорубицином настоящего изобретения являются более эффективными в снижении массы опухоли, чем в настоящее время продаваемый препарат пэгилированных липосом каеликс. Таблица 2. Влияние на опухоль молочной железы человека MCF-7, имплантированной в "голую" мышь- 10008930 Противоопухолевую активность непэгилированных липосом с доксорубицином настоящего изобретения испытывали на лейкемических клетках мыши L1210. Результаты представлены ниже в табл. 3. Результаты данного испытания (пример VI) показывают, что композиции непэгилированных липосом с доксорубицином настоящего изобретения являются такими же эффективными, как пэгилированные липосомы (каеликс). Таблица 3. Противоопухолевая активность на модели мышиной лейкемии L1210 Т/С%: Процентное отношение испытание/контроль. Указанные выше в табл. 1-3 результаты показывают, что композиция непэгилированных липосом с доксорубицином настоящего изобретения имеет более низкий профиль токсичности и более длительное время циркуляции и имеет доказанную эффективность в виде противоопухолевой активности in vivo в отношении моделей опухолей MCF-7 и L1210.- 11008930 Для того, чтобы специалист в данной области мог более полно понять данное изобретение, представлены нижеследующие примеры, которые описывают получение, характеристику и химиотерапевтическое применение in vivo липосомных препаратов данного изобретения на модели животного. Эти примеры представлены только для цели иллюстрации и никоим образом не предназначены для ограничения настоящего изобретения. Примеры Гидрохлорид доксорубицина, применяемый в этих примерах, был парентерального сорта, соответствующего спецификациям фармакопеи США. Фосфолипиды, применяемые в этих примерах, были парентерального сорта. Холестерин, применяемый в этих примерах, соответствовал спецификациям фармакопеи США. Вода, применяемая в этих примерах, была парентерального сорта, соответствующая спецификациям воды для инъекции. Все другие добавки, используемые в этих примерах, были добавками парентерального сорта. Весь процесс проводили на площади с регулируемой средой. Каеликс (препарат пэгилированных липосом с доксорубицином), приготовленный Ben Venue Laboratories, США, и адриамицин (обычный нелипосомный препарат доксорубицина), приготовленный Pharmacia and Upjohn, США, применяли при изучении животных для сравнительной оценки препарата непэгилированных липосом с доксорубицином настоящего изобретения. Адриамицин, который называется в настоящем описании также обычной нелипосомной композицией доксорубицина, является высушенным при замораживании стерильным порошком для инъекции, причем каждая ампула содержит 10 мг гидрохлорида доксорубицина, 50 мг лактозы, 1 мг метилгидроксибензоата. Перед применением высушенный при замораживании порошок пересоздают с 5 мл воды для инъекции, представленной с упаковкой. Для гематологического испытания применяли счетчик клеток (Sysmex Automated Hematology Analyser-KX-21). Пример 1. Способ получения липосомной композиции, содержащей гидрохлорид доксорубицина. Формирование липидной пленки. DSPC (1,565 г) и холестерин (0,521 г) растворяли один за другим в хлороформе (40 мл) в колбе с роторным испарителем. Их смешивали до образования прозрачного раствора. Колбу соединяли с роторным испарителем, и температуру водяной бани устанавливали до 60 С. Растворитель выпаривали в вакууме с образованием тонкой пленки липидов на стенках колбы. После выключения вакуума колбу вращали в течение приблизительно 5 мин при пропускании азота в колбу для высушивания любого остаточного растворителя. Гидратация. Липидную пленку в колбе затем гидратировали 60 мл водной среды для гидратации,содержащей сульфат аммония. Среда для гидратации состояла из 10,0 г сахарозы, 2,04 г сульфата аммония и 100 мл воды. Колбу, содержащую липидную пленку и среду для гидратации, вращали в течение 30 мин на водяной бане, поддерживаемой при 65-68 С, с образованием липосом. Снижение размера липосом экструзией. Полученную выше липосомную суспензию разделяли по размеру экструзией последовательно через фильтры, имеющие размер пор от 0,4 мкм до 0,05 мкм. Создание градиента сульфата аммония. Суспензию разделенных по размеру липосом диализовали против буферного раствора сахароза-гистидин для удаления внелипосомного сульфата аммония, тем самым создавая химический градиент. Для диализа применяли систему фильтрации с тангенциальным потоком, снабженную кассетой 300 KD. Отсутствие сульфата аммония определяли с применением агентаNesseler. Буферный раствор сахароза-гистидин, применяемый для диализа и загрузки лекарственного средства (описано ниже), имеет следующий состав: 170,0 г сахарозы, 3,40 г гистидина HCl, 1,7 л воды и гидроксид натрия в количестве, достаточном для установления рН 6,0-6,5. Загрузка лекарственного средства. В круглодонной колбе получали 15 мг/мл раствора доксорубицина HCl в буферном растворе сахароза-гистидин (описан выше) для загрузки липосомного препарата и получения загруженных лекарственным средством липосом, имеющих концентрацию 4 мг/мл гидрохлорида доксорубицина. Разделенные по размеру и отдиализованные липосомы, полученные выше, медленно добавляли в круглодонную колбу и смешивали в течение 1 ч при 65 С. Загруженные лекарственным средством липосомы смешивали с DOWEX в течение 30 мин для удаления неуловленного лекарственного средства. Загруженные лекарственным средством липосомы разбавляли до концентрации 2 мг/мл с применением буферного раствора сахароза-гистидин и затем асептическим способом фильтровали с применением стерильного 0,22 мкм мембранного фильтра. Отфильтрованную композицию липосом с доксорубицином затем разливали в асептических условиях в стерильные, апирогенные стеклянные пузырьки и герметизировали под атмосферой азота с применением покрытых тефлоном резиновых пробок. Пример II. Сравнение LD50 композиции пэгилированных липосом с доксорубицином, нелипосомной композиции доксорубицина и композиции непэгилированных липосом с доксорубицином настоящего изобретения. Была получена следующая композиция липосом с доксорубицином, причем каждый мл композиции содержал:- 12008930 Гидрохлорид доксорубицина 2,01 мг Сахароза 95 мг Гидрохлорид гистидина 2 мг Композицию получали такой же процедурой, как в примере 1. Гидрохлорид доксорубицина (216 мг) растворяли в 14 мл буферного раствора сахароза-гистидин, добавляли к 40 мл сортированных по размеру липосом и перемешивали в течение 1 ч. Полученную в результате дисперсию липосом, загруженных лекарственным средством, затем пропускали через колонку DOWEX для удаления не уловленного лекарственного средства. Продукт, полученный после пропускания через колонку DOWEX, имел следующие характеристики: Анализ продукта: Общее содержание доксорубицина HCl 3,98 мг/мл Содержание уловленного доксорубицина HCl 3,94 мг/мл Указанный выше продукт после разбавления гистидиновым буфером до концентрации 2 мг/мл анализировали по следующим параметрам: внешний вид - окрашенная в красный цвет полупрозрачная жидкость; рН 6,1; размер частиц - средний размер частиц 0,093 мкм; содержание DSPC - 9,55 мг/мл; содержание холестерина - 3,15 мг/мл; содержание доксорубицина HCl - 2,01 мг/мл; содержание сахарозы - 9,35 мас./об.%; содержание гистидина HCl - положительное; бактериальные эндотоксины - меньше, чем 2,2 ЭЕ/мг гидрохлорида доксорубицина; стерильность - стерильный. Данную композицию подвергали исследованию на острую токсичность на мышах. Сравнение LD50 композиции пэгилированных липосом с доксорубицином (каеликс), обычной нелипосомной композиции доксорубицина (адриамицин) и композиции непэгилированных липосом с доксорубицином настоящего изобретения. Используемые животные - мыши любого пола Swiss albino; диапазон веса животных - 20-22 г; число групп - 3; число животных в группе - 10. Животных делили на 3 группы и каждая группа содержала десять животных. Группа 1 получала композицию примера II, группа 2 получала каеликс, группа 3 получала адриамицин. Все животные получали инъекцию через внутривенный путь. Растворы лекарственных средств подходящим образом разбавляли раствором декстрозы 5% (мас./об.) перед введением животным. Животных затем обследовали в течение периода 14 дней. Их обследовали на любую клиническую токсичность и смертность. Величины LD50 разных исследованных препаратов доксорубицина представлены в табл. 1. Обнаружено, что доза LD50 была 16,13 мг/кг, тогда как доза LD50 для имеющегося в продаже обычного препарата (адриамицина) была 10,29 мг/кг. LD50 для имеющегося в продаже препарата пэгилированных липосом каеликс была 13,5 мг/кг. Эти результаты показывают, что непэгилированные липосомы настоящего изобретения имеют пониженную токсичность по сравнению с другими препаратами доксорубицина и препаратами пэгилированных липосом с доксорубицином. Пример III. Сравнение субострой токсичности композиции непэгилированных липосом с доксорубицином настоящего изобретения с композицией пэгилированных липосом с доксорубицином (каеликс) и обычной нелипосомной композицией доксорубицина (адриамицин). Используемые животные - мыши любого пола swiss albino; число групп - 11; число животных в группе - 8; диапазон веса животных - 19-23 г; путь введения - внутривенный. Животных делили на 11 групп, причем каждая группа содержала восемь животных. Группа 1 получала инъекцию 5% декстрозы, группа 2 получала "пустые" липосомы (перед загрузкой лекарственного средства) настоящего изобретения, группа 3, группа 4 и группа 5 получали композицию примера II в различных дозах, группа 6, группа 7 и группа 8 получали каеликс в различных дозах, группа 9, группа 10 и группа 11 получали адриамицин в различных дозах. Дозы представлены в табл. 4.- 13008930 Таблица 4. Дозы препаратов доксорубицина для изучения токсичности повторных доз для мышей Все группы получали инъекции через день в течение четырнадцати дней внутривенным путем. Препараты подходящим образом разбавляли 5% декстрозой для инъекции перед введением животным. Животных обследовали в течение периода изучения 14 дней по следующим параметрам:СмертностьКлинические признаки и симптомыВес телаПотребление кормаМассы органов Результаты Смертность: процент смертности на протяжении периода четырнадцати дней регистрировали для всех препаратов. Таблица 5. Процент смертности для различных доз препаратов доксорубицина Клинические симптомы. В течение курса исследования линьку кожи хвоста и алопецию наблюдали у всех групп, обработанных доксорубицином. Линьку кожи хвоста наблюдали у животных после пяти инъекций. Зависимую от дозы алопецию наблюдали у всех обработанных доксорубицином животных. В табл. 6 детализируются случаи алопеции в течение курса изучения.- 14008930 Таблица 6. Случаи алопеции у мышей, обработанных различными препаратами доксорубицина+ Одно из 8 животных проявляло алопецию.Два из 8 животных проявляли алопецию.Три из 8 животных проявляли алопецию.Четыре из 8 животных проявляли алопецию. Вес тела. Вес тела животных регистрировали в день 1, день 4, день 7 и день 14. При дозе 2 мг/кг и 3 мг/кг снижение веса тела наблюдали во всех группах, обработанных лекарственным средством. Потеря веса значительно отличалась от контроля. Вес тела животных, получающих "пустые" липосомы, был сравним с весом группы декстрозы. Потребление корма. В течение периода от 4 до 14 дней животные, обработанные доксорубицином,проявляли в общем снижение потребления корма. Массы органов. Органы выживших животных собирали и взвешивали. Было обнаружено, что средние массы органов всех животных были сравнимы для всех групп, обработанных лекарственным средством. Пример IV. Оценка фармакокинетики композиции непэгилированных липосом с доксорубицином настоящего изобретения, композиции пэгилированных липосом с доксорубицином (каеликс) и обычной нелипосомной композиции доксорубицина (адриамицин) на мышах. Используемые животные - мыши любого пола swiss albino; число групп - 3; число животных в группе - 48; вес тела животных - 25-30 г; доза для фармакокинетического изучения - 10 мг/кг; временные точки - 5 мин, 30 мин, 1 ч, 2 ч, 5 ч, 10 ч, 15 ч, 20 ч; число мышей на временную точку - 6 мышей; путь введения - внутривенный. Образцы крови после сбора центрифугировали при 4000 оборотов в минуту в течение 20 мин и плазму отделяли и хранили в замороженном состоянии при -20 С до проведения анализа. Замороженную плазму размораживали и применяли для анализа. Ацетонитрил в количестве 1 мл добавляли к 100 мкл плазмы, перемешивали с завихрением в течение 10 мин, центрифугировали при 3250 оборотов в минуту в течение 10 мин. Супернатант отбирали и к нему добавляли 0,5 мл насыщенного раствора ZnSO4. Получающийся в результате раствор перемешивали с завихрением в течение 5 мин и затем центрифугировали в течение 10 мин при скорости 3250 оборотов в минуту. Верхний органический слой затем отбирали и сушили в атмосфере азота без кислорода при 60 С. Полученный остаток затем пересоздавали 200 мкл растворителя А, содержащего ZnSO4. 100 мкл этого раствора затем вводили в колонку ВЭЖХ. Инструмент - жидкостной хроматограф LC-10ATVP Shimadzu; колонка - С 8 Thermoquest hypersil MOS (250 х 4,6 мм, 5 мк); температура колонки - температура окружающей среды;- 15008930 подвижная фаза - растворитель А - подкисленная вода (рН 2,5, значение рН установлено 60% перхлорной кислотой) и тетрагидрофуран (80:1, об./об.); растворитель В - ацетонитрил; растворитель А - растворитель В (40:60); скорость потока - 1 мл/мин; детектор - флуоресцентный детектор (RF - 10 AXL Shimadzu; возбуждение 460 нм и эмиссия 550 нм); время опыта - 15 мин. Статистический анализ Для сравнения трех препаратов применяли t-тест Стьюдента. Результаты суммированы в табл. 1. Пример V. Сравнение подострой токсичности композиции непэгилированных липосом с доксорубицином настоящего изобретения с обычной нелипосомной композицией доксорубицина (адриамицин) на собаках. Используемые животные - собаки; число групп - 3; число животных в группе - 3; диапазон веса животных - 10-20 кг; доза и введение - 1 мг/кг внутривенной инфузией на протяжении 20 мин. Введение один раз в неделю (т.е. после 7 дней), введение всего 4 доз. Фармакологическая оценка:Клинические симптомы токсичностиВес телаГемодинамические параметрыГематологияБиохимические параметры Таблица 7. Клинические симптомы токсичности Вес тела: группы, обработанные адриамицином, проявляли снижение веса тела, тогда как контрольные группы и группы, обработанные композицией примера II, не проявляли изменение веса тела. Изученные гематологические параметры:RBCОбщий WBC и дифференциальный WBCГемоглобинГематокритное числоСредний корпускулярный объемТромбоциты Все указанные выше параметры были в пределах нормального диапазона у всех групп. Биохимические параметры - повышение уровней креатининфосфокиназы и лактатдегидрогеназы обнаружили у групп, обработанных адриамицином, тогда как в контрольной группе и группах композиции примера II не наблюдали значительного изменения. Испытание функции печени (LFT) - повышение уровней аспартатаминотрансферазы, аланинаминотрансферазы и общего уровня билирубина наблюдали в группах, обработанных адриамицином, тогда как в контрольной группе и группах композиции примера II не наблюдали значительных изменений. Испытание функции почек (KFT) - повышение содержания азота мочевины в крови (BUN) и креатинина наблюдали в группах, обработанных адриамицином, тогда как в контрольной группе повышения не наблюдали. У группы животных, обработанных композицией примера II, обнаружили повышение уровней как BUN, так и креатинина, которое, однако, было значительно ниже, чем у групп, обработанных адриамицином. Пример VI. Оценка противоопухолевой активности композиции непэгилированных липосом с доксорубицином настоящего изобретения и композиции пэгилированных липосом с доксорубицином(каеликс) в отношении мышиного лейкоза L1210 и опухоли молочной железы человека MCF-7, имплантированной "голым" мышам. Приготовление дозы. Оба указанных выше препарата доксорубицина разбавляли до 1 мг/мл стерильным обычным солевым раствором (0,9%). Подходящие объемы раствора лекарственного средства вводили различным испытуемым группам на основе веса тела таким образом, чтобы животные получали лекарственное средство, как указано в табл. 9 и 10. В обеих моделях применяли самок "голых" мышей NCr (nu/nu) возраста шести недель. Животных поселяли в поликарбонатные микроизоляторные клетки, как описано в инструкции для ухода за лабораторными животными и их использовавнию (ILAR publication, 1996, National AcademyPress). Комнаты хорошо вентилировали (более чем 10 замен воздуха в час) с 50% свежего воздуха. Поддерживали фотопериод 12 ч света/12 ч темноты. Температуру в комнате поддерживали между 18-26 С. Изучаемых животных акклиматизировали в течение по меньшей мере 3 ч перед инокуляцией опухоли. Общее описание: оба липосомных препарата, перечисленных выше, испытывали на моделях мышиного лейкоза L1210 и опухоли молочной железы человека MCF-7 в двух концентрациях каждого из препаратов и сразнивали с контрольной группой, получающей солевой раствор. Модель L1210. Опухолевые клетки: линию клеток мышиного лейкоза L1210 получали от АТСС и размножали с- 17008930 применением стандартных способов размножения клеток in vitro. Клетки выращивали в культуральной среде с подходящими добавками и 10% фетальной бычьей сывороткой (FBS). Культуры затем выращивали в 35 склянках Т-225 до 80-90% конфлюэнтности. Клетки собирали центрифугированием и осажденные клетки снова суспендировали в RPMI без сыворотки до 106 жизнеспособных клеток/мл. Животным вводили инъекцией 0,1 мл суспензии клеток с применением иглы 25G. Группы и дозы. Каждая группа состояла из 5 животных. Мышей внутрибрюшинно инокулировали 106 опухолевыми клетками/мышь. Оба липосомных препарата вводили внутривенно на 1,5 и 9 день в дозах, показанных в табл. 9. Животных обследовали в течение 30 дней после обработки и регистрировали смертность Таблица 9 Животных обследовали ежедневно и взвешивали два раза каждую неделю и вес регистрировали. Любую смертность во время курса исследования регистрировали. Противоопухолевую активность обоих липосомных препаратов оценивали сравнением среднего времени выживания в каждой обработанной группе со средним временем выживания контролей, которые получали солевой раствор. Результаты выражали в терминах Т/С, которые вычисляли следующим образом: Т/С 125% считали значительной активностью. Результаты противоопухолевой активности в отношении модели мышиной лейкемии L1210 представлены в табл. 3. Смертность наблюдали в течение от 15 до 26 дней после первой инъекции (день 1). Среднее время выживания контрольной группы, которая получала солевой раствор, было 16,5 дней. Повышение времени выживания наблюдали в обеих группах, обработанных лекарственным средством. Обе обработанные лекарственным средством группы проявили одинаковое различие в среднем времени выживания (Т/С%),что указывает на то, что композиция примера II является такой же эффективной, как каеликс, в отношении модели опухоли L1210. Модель MCF-7. Опухолевые клетки: линию клеток опухоли молочной железы человека MCF-7 получали от АТСС и размножали с применением стандартных способов размножения клеток in vitro. Клетки выращивали в культуральной среде с подходящими добавками и 10% FBS. Культуру затем выращивали в 35 склянках Т-225 до 80-90% конфлюэнтности. Клетки собирали центрифугированием и осажденные клетки трипсинизировали и снова суспендировали в RPMI без сыворотки до 107 жизнеспособных клеток/мл. Животным вводили инъекции 0,1 мл суспензии клеток с применением иглы 25G. Группы и дозы. Каждая группа состояла из 5 животных. Мышам имплантировали шарики эстрогена за 5 дней до инокуляции. Их инокулировали подкожно 107 опухолевыми клетками/мышь. Опухолям давали возможность расти до тех пор, пока они не достигали размера 30-100 мм 3. После достижения подходящего размера опухоли (5-ый день после инокуляции) мышам внутривенно вводили дозу испытуемого препарата в день 1, 5 и 9, как показано в табл. 10. Размер опухоли измеряли с применением циркуля дважды в неделю вплоть до 30 дней после начала обработки. Животных обследовали ежедневно и взвешивали дважды каждую неделю и вес регистрировали. Длину и ширину опухолей индивидуальных мышей измеряли дважды в неделю с использованием циркулей, и приблизительную массу опухоли (мг) из размеров опухоли (мм х мм) вычисляли с применением формулы для объема вытянутого эллипсоида: где L представляет собой большее двух измерений. Противоопухолевую активность обоих липосомных препаратов оценивали сравнением изменения массы опухоли для обработанной группы с изменением массы контролей, которые получали солевой раствор. Изменение массы опухоли вычисляли вычитанием средней массы опухоли группы на день 5 после инокуляции опухолевых клеток из средней массы опухоли группы на последний день оценки (день 30 после обработки).Масса = Массаконечная- Массаначальная Отношение Т/С для всех испытуемых групп вычисляли следующим образом: Т/С% =Масса испытания/Массаначальная испытания х 100. Величина Т/С 20% считается необходимой для демонстрации умеренной активности. Величина Т/С 10% считается значительной активностью. Противоопухолевая активность в отношении модели опухоли молочной железы человека MCF-7 представлена в табл. 2. Таблица 11. Ранняя гибель в различных группах животных Опухоли в контрольной группе продолжали расти на всем протяжении исследования, достигая максимума 116,4 мг на 26-ой день, тогда как опухоли у обработанных мышей значительно регрессировали на протяжении курса исследования. Опухоли исчезали полностью в группе, получающей 12 мг/кг композиции примера II, что указывает на то, что композиция примера II является эффективной в отношении опухолей молочной железа человека MCF-7. Несколько ранних смертей имели место в различных группах, как показано в табл. 11. Представляется, однако, что причина смерти не коррелирует с опухолями. Смертей не было в контрольной группе с солевым раствором, которая имела самые большие опухоли. Некоторых из умерших животных вскрывали, и было обнаружено, что все из них имели уплотненные аномальные мочевые пузыри. После оконча- 19008930 нии исследования многие их эвтанизированных мышей подобным образом имели уплотненные мочевые пузыри. Гистопатологическое обследование одного из уплотненных мочевых пузырей не обнаружило доказательства появления метастаза опухоли. Преждевременная смерть эстрогенизированных "голых" мышей с имплантированной опухолью обусловлена случаем мочеполового заболевания. Пример VII. Определение максимальной толерантной дозы (MTD) и анализ терапевтической эффективности липосом с доксорубицином настоящего изобретения на "голых" бестимусных мышах с опухолью яичников человека А 121. Определение максимальной толерантной дозы и анализ терапевтической эффективности липосом с доксорубицином настоящего изобретения для "голых" бестимусных мышей с опухолью яичников человека А 121 проводили в сравнении с обычным нелипосомным препаратом (адриамицин) и препаратом пэгилированных липосом (каеликс)."Голым" бестимусным мышам Ncr-nu/nu [4 мыши/группу (10 в контрольной группе)] имплантировали подкожно опухоль яичников человека А 121 посредством троакарного имплантата. Всего 46 животных применяли в этом эксперименте. Эквивалентные дозы адриамицина, каеликса и композиции примера II оценивали при внутривенном введении. Лекарственные средства вводили мышам внутривенно через хвостовую вену на день 5 и 12 после имплантации опухоли. Все группы обработки демонстрировали хорошую противоопухолевую эффективность. Перечень доз представлен ниже. Контрольные мыши: контрольные мыши не получали лечения. Адриамицин 12 мг/кг (6 мг/кг х 2 инъекции) 24 мг/кг (12 мг/кг х 2 инъекции) 36 мг/кг (18 мг/кг х 2 инъекции) КАЕЛИКС 12 мг/кг (6 мг/кг х 2 инъекции) 24 мг/кг (12 мг/кг х 2 инъекции) 36 мг/кг (18 мг/кг х 2 инъекции) Композиция примера II 12 мг/кг (6 мг/кг х 2 инъекции) 24 мг/кг (12 мг/кг х 2 инъекции) 36 мг/кг (18 мг/кг х 2 инъекции) Все мыши, получающие самую высокую дозу 36 мг/кг свободного лекарственного средства (18 мг/кг х 2 адриамицина), и 3 из 4 мышей, которые получали промежуточную по количеству дозу 24 мг/кг,погибали в результате токсичности лекарственного средства. Максимальной толератной дозой (MTD) адриамицина, следовательно, является доза меньше чем 24 мг/кг. Мыши проявляли толерантность как к каеликсу, так и композиции примера II. Оба препарата хорошо переносились при 36 мг/кг. Однако оказалось, что каеликс вызывает большую токсичность, чем композиция примера II, и вызывает большую потерю веса у мышей, получающих высокую дозу (36 мг/кг). Данное изучение показывает, что композиция примера II лучше переносится, чем коммерчески доступный препарат пэгилированных липосом (каеликс) и обычный нелипосомный препарат (адриамицин). Пример VIII. Анализ эффективности композиции липосом с доксорубицином настоящего изобретения для "голых" бестимусных мышей, которым имплантировали ксенотрансплантанты резистентной ко многим лекарственным средствам, Pgp-положительной опухоли DLD1 толстой кишки человека. Композицию примера II вместе с каеликсом и адриамицином подвергали исследованию на эффективность на "голых" бестимусных мышах, которым имплантировали подкожно резистентную к лекарственным средствам, (Рgр+) опухоль DLD-1 толстой кишки человека. Животным, "голым" бестимусным мышам, 4 мыши/группу (10 в контрольной группе), подкожно имплантировали опухоль толстой кишки DLD-1 человека посредством троакарного имплантата. Контроль: без обработки Адриамицин 12 мг/кг (6 мг/кг х 2 инъекции) 24 мг/кг (12 мг/кг х 2 инъекции) Каеликс 24 мг/кг (12 мг/кг х 2 инъекции) 36 мг/кг (18 мг/кг х 2 инъекции) 48 мг/кг (24 мг/кг х 2 инъекции) Композиция примера II 24 мг/кг (12 мг/кг х 2 инъекции) 36 мг/кг (18 мг/кг х 2 инъекции) 48 мг/кг (24 мг/кг х 2 инъекции) Для эксперимента всего применяли 42 животных. Результаты:- 20008930 Дозы адриамицина были снижены до 12 и 24 мг/кг в этом исследовании на основании токсичности,наблюдаемой в примере VII после введения 36 мг/кг свободного лекарственного средства. В противоположность этому, дозы каеликса и композиции примера II повышали до 48 мг/кг, чтобы сравнить их эффективность и токсичность со свободным лекарственным средством при их соответствующих MTD. Все агенты вводили "голым" бестимусным мышам внутривенно через хвостовую вену на день 5 и 12 после подкожной имплантации ксенотрансплантата резистентной к лекарственным средствам, Pgpположительной опухоли толстой кишки человека. Все группы обработки демонстрировали противоопухолевую эффективность. Однако мыши, получающие любой из липосомных препаратов, демонстрировали значительно более высокую противоопухолевую активность. При эквивалентных дозах свободного лекарственного средства (24 мг/кг) среднюю задержку роста опухоли, составляющую 10 дней, наблюдали для свободного лекарственного средства, тогда как все мыши, которым вводили липосомные препараты, имели опухоли, которые были меньше чем 600 нм 3 на день 40. Токсичность не была очевидной при дозах 36 мг/кг ни для каеликса, ни для композиции примера II. При более высоких дозах (48 мг/кг) обоих препаратов липосом с лекарственным средством (24 мг/кг х 2, каеликса или композиции примера II) мыши демонстрировали 15% потерю веса и 1 из 4 животных каждой из этих групп рано погибало (день 17, 19) в результате токсичности лекарственного средства. Следовательно, MTD обоих липосомных препаратов была одинаковой и, оказалось, что она меньше чем 48 мг/кг. В противоположность адриамицину, два липосомных препарата [каеликс (пэгилированные липосомы с доксорубицином) и композиция примера II (непэгилированные липосомы с доксорубицином)] проявляли значительную противоопухолевую эффективность в отношении подкожно имплантированныхPgp-положительных, резистентных ко многим лекарственным средствам опухолей DLD-1 толстой кишки человека при исследовании на "голых" бестимусных мышах. При эквивалентных дозах 24 мг/кг оба липосомных препарата проявляли повышенную эффективность по сравнению со свободным лекарственным средством. Кроме того, оба липосомных препарата проявляли более низкую токсичность по сравнению со свободным лекарственным средством, что позволяет вводить больше лекарственного средства. Оказалось, что MTD для адриамицина составляет приблизительно половину MTD для липосомных препаратов. Дозы 36 мг/кг липосомного лекарственного средства хорошо переносились. Примеры IX-XIII. Составы и способы примеров IX-XIII приводятся в табл. 12. Таблица 12 Процедура: процедуру примера I применяли для примеров X, XI и XII. В примере IX применяли процедуру примера I, за исключением уменьшения размера липосом, что достигали экструзией через мембраны от 0,4 до 0,2 мк, чтобы получить средний размер липосом в диапазоне от 0,15 до 0,25 мкм. В примере XIII применяли процедуру примера II, за исключением объема гидратации, который удваивали. Результаты токсикологического испытания приводятся в табл. 13. Таблица 13 Пример XIV. Композиция липосом с доксорубицином без сахарозы. Формирование липидной пленки: дистеароилфосфатидилхолин (1,565 г) и холестерин (0,521 г) растворяли друг за другом в хлороформе (40 мл) в колбе с роторным испарителем. Их перемешивали до об- 22008930 разования прозрачного раствора. Колбу соединяли с роторным испарителем, и температуру водяной бани устанавливали до 60 С. Растворитель выпаривали в вакууме с образованием тонкой пленки липидов на стенках колбы. После отключения вакуума колбу вращали в течение приблизительно 5 мин при пропускании азота в колбу для удаления какого-либо остаточного растворителя. Гидратация: липидную пленку гидратировали 60 мл водной среды для гидратации. Водной средой для гидратации был 2,04% (мас./об.) раствор сульфата аммония в воде. Колбу, содержащую липидную пленку и среду для гидратации, вращали в течение 30 мин на водяной бане при 65-68 С с образованием"пустых" липосом. Снижение размера "пустых" липосом экструзией: полученную выше липосомную композицию разделяли по размеру экструдированием последовательно через фильтры, имеющие размер пор от 0,4 до 0,05 мкм. Диализ: суспензию разделенных по размеру липосом диализовали против 0,2% (мас./об.) раствора гидрохлорида гистидина с рН 6,5. Для диализа использовали систему фильтрования с тангенциальным потоком. Диализ продолжали до удаления внелипосомного сульфата аммония. Отсутствие сульфата аммония в нелипосомной среде подтверждали с применением реагента Nesseler. Загрузка лекарственного средства: в круглодонной колбе раствор доксорубицина HCl 15 мг/мл получали растворением 216 мг гидрохлорида доксорубицина в 14 мл раствора гидрохлорида гистидина(описан выше). Отмеренный объем (40 мл) разделенных по размеру и отдиализованных липосом, полученных выше, добавляли медленно в круглодонную колбу и перемешивали в течение одного часа при 65 С. Загруженные лекарственным средством липосомы обрабатывали DOWEX для удаления незахваченного лекарственного средства. Образцы композиции, полученные до и после обработки DOWEX, анализировали на содержание гидрохлорида доксорубицина высокоэффективной жидкостной хроматографией (ВЭЖХ). Получены следующие результаты. Загруженные гидрохлоридом доксорубицина липосомы после удаления свободного лекарственного средства разбавляли до концентрации гидрохлорида доксорубицина, составляющей 2 мг/мл, с применением раствора гидрохлорида гистидина и сахарозы (как описано выше). Полученную таким образом липосомную композицию затем асептическим способом фильтровали с применением стерильного 0,22 мкм мембранного фильтра в стерильный, лишенный пирогенов контейнер и анализировали по следующим параметрам: внешний вид - полупрозрачная жидкость красного цвета; рН 6,3; размер частиц - средний размер частиц 0,097 мкм; содержание доксорубицина HCl - 2,05 мг/мл бактериальные эндотоксины - меньше чем 3,2 ЭЕ/мг гидрохлорида доксорубицина стерильность - стерильный. Проводили изучение стабильности композиции, полученной в данном примере, наблюдения приведены в табл. 14. Пример XV. Способ получения композиции липосом с доксорубицином с помощью 120 мМ раствора сульфата аммония. Формирование липидной пленки: дистеароилфосфатидилхолин (1,565 г) и холестерин (0,521 г) растворяли друг за другом в хлороформе (40 мл) в колбе с роторным испарителем. Их перемешивали до образования прозрачного раствора. Колбу соединяли с роторным испарителем, и температуру водяной бани устанавливали до 60 С. Растворитель выпаривали при пониженном давлении с образованием тонкой пленки липидов на стенках колбы. После отключения вакуума колбу вращали в течение приблизительно 5 мин при пропускании азота в колбу для удаления какого-либо остаточного растворителя. Гидратация: липидную пленку гидратировали 60 мл водной среды для гидратации. Водная среда для гидратации состоит из 10% (мас./об.) сахарозы, 1,58% (мас./об.) сульфата аммония в воде. Колбу,содержащую липидную пленку и среду для гидратации, вращали в течение 30 мин на водяной бане при 65-68 С с образованием "пустых" липосом. Снижение размера "пустых" липосом экструзией: полученную выше липосомную суспензию разделяли по размеру экструдированием последовательно через фильтры, имеющие размер пор от 0,4 мкм до 0,05 мкм. Диализ: суспензию разделенных по размеру липосом диализовали против буферного раствора сахароза-гистидин. Для диализа применяли систему фильтрования с тангенциальным потоком. Диализ продолжали до удаления внелипосомного сульфата аммония. Отсутствие сульфата аммония в нелипосомной- 23008930 среде подтверждали с применением реагента Nesseler. Раствор гидрохлорида гистидина, применяемый при диализе и при загрузке лекарственного средства (ниже), был следующим: 170,0 г сахарозы, 3,40 г гистидина HCl, 1,7 л воды и гидроксида натрия в количестве, достаточном для установления рН 6,0-6,5. Загрузка лекарственного средства: в круглодонной колбе раствор доксорубицина HCl 15 мг/мл получали растворением 216 мг гидрохлорида доксорубицина в 14 мл раствора гидрохлорида гистидина(описан выше). Отмеренный объем (40 мл) разделенных по размеру и отдиализованных липосом, полученных выше, добавляли медленно в круглодонную колбу и перемешивали в течение одного часа при 65 С. Загруженные лекарственным средством липосомы обрабатывали DOWEX для удаления неуловленного лекарственного средства. Образцы композиции, полученные до и после обработки DOWEX, анализировали на содержание гидрохлорида доксорубицина высокоэффективной жидкостной хроматографией (ВЭЖХ). Получены следующие результаты. Загруженные гидрохлоридом доксорубицина липосомы после удаления свободного лекарственного средства разбавляли до концентрации гидрохлорида доксорубицина 2 мг/мл с применением раствора гидрохлорида гистидина и сахарозы (как описано выше). Полученную таким образом липосомную композицию затем асептическим способом фильтровали с применением стерильного 0,22 мкм мембранного фильтра в стерильный, лишенный пирогенов контейнер и анализировали по следующим параметрам: внешний вид - полупрозрачная жидкость красного цвета; рН 6,35; размер частиц - средний размер частиц 0,09 мкм; содержание доксорубицина HCl - 2,03 мг/мл; бактериальные эндотоксины - меньше чем 2,2 ЭЕ/мг гидрохлорида доксорубицина; стерильность - стерильный. Проводили изучение стабильности композиции, полученной в данном примере, наблюдения приведены в табл. 14. Пример XVI. Композицию примера XIV, примера XV вместе с композицией настоящего изобретения (пример II) подвергали изучению на кратковременную стабильность при форсированной температуре (25 С). Результаты содержания доксорубицина приведены в табл. 14. Таблица 14 Данный пример показывает, что присутствие сахарозы является существенным для снижения утечки инкапсулированного доксорубицина и важной является концентрация сульфата аммония в среде для гидратации. Концентрация 120 мМ приводит к утечке инкапсулированного доксорубицина и поэтому является неудовлетворительной. Однако в композиции примера II, содержащей сахарозу и сульфат ам- 24008930 мония при концентрации 155 мМ, утечка инкапсулированного доксорубицина во время исследования не происходила. Пример XVII. Получение композиции липосом с доксорубицином способом удаления растворителя после гидратации. Дистеароилфосфатидилхолин (1,565 г) и холестерин (0,521 г) растворяли друг за другом в этаноле(20 мл) и медленно перекачивали под давлением в водную среду для гидратации, которую непрерывно перемешивали. Водная среда для гидратации состояла из 10% (мас./об.), 2,04% (мас./об.) сульфата аммония в воде. Этот липидный раствор, содержащий растворитель этанол, переносили в колбу с роторным испарителем. Колбу соединяли с роторным испарителем и температуру водяной бани устанавливали до 60 С. Этанол удаляли в вакууме. Снижение размера "пустых" липосом экструзией: полученную выше липосомную суспензию разделяли по размеру экструзией последовательно через фильтры, имеющие размер пор от 0,4 мкм до 0,05 мкм. Диализ: суспензию разделенных по размеру липосом диализовали против гистидинового буфера. Для диализа применяли систему фильтрования с тангенциальным потоком. Диализ продолжали до удаления внелипосомного сульфата аммония. Отсутствие сульфата аммония в нелипосомной среде подтверждали с применением реагента Nesseler. Раствор гидрохлорида гистидина, применяемый при диализе и при загрузке лекарственного средства (ниже), был следующим: 170,0 г сахарозы, 3,40 г гистидинаHCl, 1,7 л воды и гидроксида натрия в количестве, достаточном для установления рН 6,0-6,5. Загрузка лекарственного средства: в круглодонной колбе раствор доксорубицина HCl 15 мг/мл получали растворением 216 мг гидрохлорида доксорубицина в 14 мл раствора гидрохлорида гистидина(описан выше). Отмеренный объем (40 мл) разделенных по размеру и отдиализованных липосом, полученных выше, добавляли медленно в круглодонную колбу и перемешивали в течение одного часа при 65 С. Загруженные лекарственным средством липосомы обрабатывали DOWEX для удаления неуловленного лекарственного средства. Липосомы, загруженные гидрохлоридом доксорубицина, после удаления свободного лекарственного средства разбавляли до концентрации гидрохлорида доксорубицина, составляющей 2 мг/мл, с применением раствора гидрохлорида гистидина и сахарозы (описан выше). Полученную таким образом липосомную композицию затем асептическим способом фильтровали с применением стерильного 0,22 мкм мембранного фильтра в стерильный, лишенный пирогенов контейнер. Итоговые результаты проведенного исследования токсичности и эффективности были следующими. Пример II. Непэгилированные, длительно циркулирующие липосомы, содержащие гидрохлорид доксорубицина, настоящего изобретения показали пониженные токсические действия по сравнению с нелипосомными препаратами гидрохлорида доксорубицина (адриамицин) и препаратами пэгилированных липосом с гидрохлоридом доксорубицина (каеликс). LD50 для непэгилированных липосом с доксорубицином настоящего изобретения выше, чем для каеликса и адриамицина, это показывает, что непэгилированные липосомы с доксорубицином настоящего изобретения имеют более низкую токсичность. Пример III. При изучении подострой токсичности похожую картину токсичности наблюдали как в случае каеликса, так и в случае композиции примера II, тогда как адриамицин проявлял токсичность. Пример IV. При фармакокинетическом исследовании композиция примера II и каеликс проявляли сравнимый полупериод существования в плазме. Видимый объем распределения был приблизительно равен общему объему крови, что указывает на низкое поглощение липосом нормальными тканями, и был сходным с объемом для каеликса. Адриамицин проявил более высокую скорость выведения и больший объем распределения, что указывает на поглощение свободного доксорубицина в нормальных тканях. Пример V. При исследовании токсичности на собаках было показано, что композиция примера II лучше переносится, чем адриамицин. Пример VI. На моделях мышиного лейкоза L1210 и опухоли молочной железы человека MCF-7 было показано, что композиция примера II является эффективной. Пример VII. На мышах с имплантированной опухолью было обнаружено, что максимальная толерантная доза композиции примера II является значительно более высокой, чем у адриамицина. Пример VIII. Было обнаружено, что композиция примера II является более эффективной для "голых" бестимусных мышей, которым имплантировали ксенотрансплантанты устойчивой ко многим лекарственным средствам, Pgp-положительной опухоли DLD1 толстой кишки человека. Указанные выше примеры явно доказывают, что композиции настоящего изобретения являются весьма применимыми для снижения роста опухоли. Такое применение включает в себя парентеральное введение терапевтически эффективного количества непэгилированных липосом с гидрохлоридом доксорубицина настоящего изобретения. Непэгилированные липосомы с гидрохлоридом доксорубицина имеют пролонгированное время циркуляции, проявляют пониженную токсичность и не вызывают синдрома рук-ног и поэтому они являются применимыми для снижения роста опухолей.- 25008930 ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Способ получения длительно циркулирующих, непэгилированных липосом, предусматривающий растворение одного или большего числа фосфолипидов или одного или большего числа стеролов в растворителе или смеси растворителей и удаление указанного растворителя (растворителей), причем до или после удаления растворителя (растворителей) получающиеся в результате липиды гидрируются жидкой средой гидратации в количестве от 10 до 35 мл на каждый ммоль фосфолипидов, присутствующих в липидном растворе, с образованием непэгилированных липосом, характеризующийся тем, что жидкая среда гидратации содержит сульфат аммония и сахарозу. 2. Способ по п.1, где количество применяемой водной среды для гидратации составляет 30 мл на каждый ммоль фосфолипида в липидном растворе. 3. Способ по п.1, где концентрация сульфата аммония в водной среде для гидратации составляет не менее 125 ммоль. 4. Способ получения непэгилированных липосом по п.1, дополнительно предусматривающий загрузку липосом терапевтическим или диагностическим агентом. 5. Способ по п.4, где терапевтическим агентом является противоопухолевый агент. 6. Способ по п.5, где противоопухолевый агент выбирают из группы, состоящей из гидрохлорида доксорубицина, гидрохлорида даунорубицина и гидрохлорида эпирубицина. 7. Способ по п.6, где противоопухолевым агентом является гидрохлорид доксорубицина. 8. Способ по п.1, где молярное отношение фосфолипида к стерину составляет приблизительно от 1:0,1 до 1:2. 9. Способ по п. 8, где молярное отношение фосфолипида к стерину составляет приблизительно 1:0,7. 10. Способ по п.1, где фосфолипид имеет температуру фазового перехода от 40 до 60 С. 11. Способ по п.10, где фосфолипид имеет минимум шестнадцать атомов углерода в цепи жирной кислоты. 12. Способ по пп.10-11, где фосфолипид выбирают из группы, состоящей из дистеароилфосфатидилхолина (DSPC), дипальмитоилфосфатидилхолина (DPPC), гидрогенизированного соевого фосфатидилхолина (HSPC) и производных таких фосфолипидов. 13. Способ по пп.1-12, где фосфолипидом является дистеароилфосфатидилхолин (DSPC) и где стерином является холестерин. 14. Способ по п.1, где непэгилированные липосомы последовательно экструдируют через ряд фильтров, имеющих размер пор от 0,4 до 0,05 мкм, для разделения их по размеру. 15. Липосомы, полученные способом по п.1. 16. Липосомы по п.15, где фосфолипид включает дистеароилфосфатидилхолин (DSPC) и где стерин включает холестерин. 17. Липосома по п.15, где непэгилированная липосома дополнительно содержит терапевтический или диагностический агент. 18. Липосома по п.17, где указанный терапевтический агент включает противоопухолевый агент. 19. Липосома по п.18, где противоопухолевый агент выбирают из группы, состоящей из гидрохлорида доксорубицина, гидрохлорида даунорубицина и гидрохлорида эпирубицина. 20. Липосома по п.19, где противоопухолевым агентом является гидрохлорид доксорубицина. 21. Липосома по п.15, где средний размер липосомы составляет от 0,06 до 0,16 мкм в диаметре. 22. Композиция длительно циркулирующих, непэгилированных липосом с доксорубицином для парентерального введения, содержащая непэгилированные липосомы с гидрохлоридом доксорубицина,гидрохлорид гистидина и сахарозу; где указанные непэгилированные липосомы с доксорубицином содержат дистеароилфосфатидилхолин, холестерин, сахарозу; где указанные липосомы имеют средний размер, составляющий 0,06-0,16 мкм; и где указанные непэгилированные липосомы с доксорубицином имеют время циркуляции в крови,по меньшей мере в 25 раз превышающее время циркуляции адриамицина, при испытании на мышахswiss albino в эквивалентных дозах. 23. Композиция по п.22, где концентрация доксорубицина, инкапсулированного в липосомы, составляет от 1 до 10 мМ, выраженная как концентрация гидрохлорида доксорубицина. 24. Композиция по п.23, где концентрация гидрохлорида дсксорубицина составляет от 3 до 7 мМ. 25. Композиция по п.24, где концентрация гидрохлорида доксорубицина составляет приблизительно 3,45 мМ. 26. Композиция по п.24, где концентрация гидрохлорида доксорубицина составляет приблизительно 6,9 мМ. 27. Композиция по п.22, где молярное отношение дистеароилфосфатидилхолина к холестерину составляет от 1:0,6 до 1:0,8. 28. Композиция по п.27, где молярное отношение дистеароилфосфатидилхолина к холестерину со- 26008930 ставляет приблизительно 1:0,7. 29. Композиция по п.22, где молярное отношение гидрохлорида доксорубицина к дистеароилфосфатидилхолину составляет от 1:2 до 1:15. 30. Композиция по п.29, где молярное отношение гидрохлорида доксорубицина к дистеароилфосфатидилхолину составляет приблизительно 1:3,5. 31. Композиция по п.22, где концентрация сахарозы составляет от 0,1 до 0,5 М. 32. Композиция по п.31, где концентрация сахарозы составляет приблизительно 0,29 М. 33. Композиция по п.22, где концентрация гидрохлорида гистидина составляет от 1 до 100 мМ. 34. Композиция по п.33, где концентрация гидрохлорида гистидина составляет от 8 до 12 мМ. 35. Композиция по п.34, где концентрация гидрохлорида гистидина составляет приблизительно 10 мМ. 36. Композиция по п.22, где средний размер липосом составляет от 0,08 до 0,12 мкм. 37. Композиция по п.22, где гидрохлорид доксорубицина присутствует в количестве 2 мг/мл и где молярное отношение доксорубицина к DSPC составляет 1:3,5 и где молярное отношение DSPC к холестерину составляет 1:0,7. 38. Композиция по п.22, где гидрохлорид доксорубицина присутствует в количестве 4 мг/мл и где молярное отношение доксорубицина к DSPC составляет 1:3,5; и где отношение DSPC к холестерину составляет 1:0,7. 39. Композиция по п.22, где время циркуляции (t1/2) указанной композиции в крови по меньшей мере в 40 раз превышает время циркуляции, полученное с адриамицином, при испытании на мышах swissalbino в эквивалентных дозах. 40. Способ уменьшения роста опухоли, предусматривающий введение композиции по п.22. 41. Способ уменьшения роста опухоли, предусматривающий введение композиции по п.37 или 38. 42. Способ получения композиции длительно циркулирующих, непэгилированных липосом с доксорубицином для парентерального введения, предусматривающий:(а) растворение липидов, включающих дистеароилфосфатидилхолин (DSPC) и холестерин, в одном растворителе или в смеси растворителей;(b) удаление указанных растворителей до или после гидратации липидов добавлением водной среды для гидратации с образованием липосом в липосомной композиции, где указанная водная среда для гидратации содержит сульфат аммония и сахарозу, и где водную среду для гидратации добавляют в количествах в диапазоне от 10 до 35 мл на каждый ммоль DSPC;(c) разделение по размеру липосом в липосомной композиции, полученной в конце стадии (b), приблизительно до 0,060-0,16 мкм;(d) удаление внелипосомного сульфата аммония из липосомной композиции, которую подвергали разделению по размеру на стадии (с), с применением буферного раствора сахароза-гистидин, содержащего гидрохлорид гистидина и сахарозу;(e) растворение гидрохлорида доксорубицина в указанном буферном растворе сахароза-гистидин с получением раствора с концентрацией гидрохлорида доксорубицина по меньшей мере 25 мМ;(f) смешивание раствора гидрохлорида доксорубицина, полученного на стадии (е), и липосомной композиции, полученной в конце стадии (d), с получением композиции липосом, загруженных гидрохлоридом доксорубицина;(g) удаление внелипосомного гидрохлорида доксорубицина из липосомной композиции способом,выбранным из группы, состоящей из фильтрации с тангенциальным потоком, колоночной хроматографии и обработки смолами;(h) пополнение объема липосомной композиции, полученной в конце стадии (g), указанным буферным раствором сахароза-гистидин для получения липосомной композиции с требуемой концентрацией гидрохлорида доксорубицина;(i) фильтрование в асептических условиях липосомной композиции через стерильный фильтр 0,2 мкм стерилизующего сорта в стерильный контейнер для получения указанной композиции липосом с доксорубицином. 43. Способ получения композиции длительно циркулирующих, непэгилированных липосом с доксорубицином для парентерального введения по п.42, дополнительно предусматривающий заполнение композицией липосом с гидрохлоридом доксорубицина стерильных, освобожденных от пирогенов контейнеров и герметизацию контейнера под атмосферой инертного газа. 44. Способ получения композиции длительно циркулирующих, непэгилированных липосом с доксорубицином для парентерального введения по п.42, где концентрация сульфата аммония в водной среде для гидратации не меньше чем 125 мМ на литр. 45. Способ получения композиции длительно циркулирующих, непэгилированных липосом с доксорубицином для парентерального введения по п.42, где молярное отношение сахарозы к гидрохлориду гистидина в буферном растворе сахароза-гистидин, применяемом на стадии (d), находится между 29:0,1 и 29:10. 46. Способ получения композиции длительно циркулирующих, непэгилированных липосом с док- 27008930 сорубицином для парентерального введения по п.45, где молярное отношение сахарозы к гидрохлориду гистидина в буферном растворе сахароза-гистидин составляет 29:1. 47. Способ получения композиции длительно циркулирующих, непэгилированных липосом с доксорубицином для парентерального введения по п.42, где концентрация гидрохлорида доксорубицина составляет от 1 до 10 мМ. 48. Способ получения композиции длительно циркулирующих, непэгилированных липосом с доксорубицином для парентерального введения по п.47, где концентрация гидрохлорида доксорубицина составляет приблизительно 3,45 мМ. 49. Способ получения композиции длительно циркулирующих, непэгилированных липосом с доксорубицином для парентерального введения по п.42, где молярное отношение дистеароилфосфатидилхолин:холестерин составляет от 1:0,6 до 1:0,8. 50. Способ получения композиции длительно циркулирующих, непэгилированных липосом с доксорубицином для парентерального введения по п.49, где молярное отношение дистеароилфосфатидилхолин:холестерин составляет приблизительно 1:0,7. 51. Способ получения композиции длительно циркулирующих, непэгилированных липосом с доксорубицином для парентерального введения по п.42, где молярное отношение гидрохлорид доксорубицина:дистеароилфосфатидилхолин составляет от 1:2 до 1:15. 52. Способ получения композиции длительно циркулирующих, непэгилированных липосом с доксорубицином для парентерального введения по п.51, где молярное отношение гидрохлорид доксорубицина:дистеароилфосфатидилхолин составляет приблизительно 1:3,5. 53. Способ получения композиции длительно циркулирующих, непэгилированных липосом с доксорубицином для парентерального введения по п.42, где концентрация сахарозы составляет от 0,1 до 0,5 М. 54. Способ получения композиции длительно циркулирующих, непэгилированных липосом с доксорубицином для парентерального введения по п.53, где концентрация сахарозы составляет от 0,25 до 0,3 М. 55. Способ получения композиции длительно циркулирующих, непэгилированных липосом с доксорубицином для парентерального введения по п.54, где концентрация гидрохлорида гистидина составляет от 1 до 100 мМ. 56. Способ получения композиции длительно циркулирующих, непэгилированных липосом с доксорубицином для парентерального введения по п.54, где концентрация гидрохлорида гистидина составляет от 8 до 12 мМ. 57. Способ получения композиции длительно циркулирующих, непэгилированных липосом с доксорубицином для парентерального введения по п.55, где концентрация гидрохлорида гистидина составляет приблизительно 10 мМ. 58. Способ получения композиции длительно циркулирующих, непэгилированных липосом с доксорубицином для парентерального введения по п.42, где полупериод циркуляции (t1/2) в крови указанной композиции по меньшей мере в 25 раз превышает полупериод циркуляции, полученный с адриамицином,при испытании на мышах swiss albino в эквивалентных дозах. 59. Способ получения длительно циркулирующих, непэгилированных, разделенных по размеру липосом, предусматривающий растворение одного или нескольких фосфолипидов и стерина в растворителе или смеси растворителей; удаление указанных растворителей до или после гидратации фосфолипидов добавлением водной среды для гидратации с образованием непэгилированных липосом; где количество применяемой водной среды для гидратации находится в диапазоне 10-35 мл на каждый ммоль фосфолипида, присутствующего в липидном растворе; разделение по размеру непэгилированных липосом до приблизительно 0,06-0,1 мкм с получением липосомной композиции; удаление внелипосомной соли среды для гидратации из липосомной композиции с применением буферного раствора сахароза-гистидин с образованием непэгилированных, разделенных по размеру липосом.