Химерный ген, обеспечивающий экспрессию в растениях циклина d-типа, и способ получения растений с измененными ростовыми свойствами при использовании указанного гена

1 Настоящее изобретение относится к применению циклинов D-типа, а также кодирующих их генов с целью получения растений с измененными фенотипами, в особенности, растений с измененными темпами роста или растений, в состав которых входят части с измененными темпами роста, и/или измененными относительными размерами, или растений с измененным строением. Данное изобретение также относится к растительным клеткам и растениям,экспрессирующим такие ДНК. Предпосылки изобретения Все эукариотические клетки во время своего деления проходят одни и те же последовательные серии событий, и термин клеточный цикл отражает упорядоченную природу и универсальность этих событий. В клеточном цикле эукариот репликация ДНК (S) и деление клетки(М) в норме разделены во времени "переходными" фазами (G1 и G2) в последовательности G1S-G2-M. Такое расположение делает возможным точное контролирование вхождения в принципиально важные процессы репликации ДНК и митоза. Цитологические события, лежащие в основе клеточного цикла, представляют собой упорядоченную последовательность организованных во времени и пространстве молекулярных и клеточных процессов, которые определяют направленность и порядок клеточного цикла. Оказалось, что у всех эукариот прохождение клеточного цикла регулируется главными контролерами, действующими на границах перехода фаз G1-S и G2-M. Для прохождения через эти контрольные точки необходима активация циклинзависимых киназ (СОК), каталитическую активность и субстратную специфичность которых определяют специфические регуляторные субъединицы, известные как циклины, а также взаимодействия с другими белками, которые регулируют степень фосфорилирования комплекса (Atherton-Fessier et al., 1993, Solomon,1993). При почковании и делении дрожжей, G1S и G2-M фазовые переходы контролирует единственная CDK, кодируемая геном cdc2+ уSchizosaccharomyces pombe, и CDC28 у Saccharomyces cerevisiae. Соединение p34cdc2 (p34CDC28 у почкующихся дрожжей) с различными циклиновыми партнерами отличает две контрольные точки (Nasmyth, 1993). Более сложная ситуация имеет место в клетках млекопитающих, где, по крайней мере, шесть родственных, но различных CDK (кодируемых cdc2/cdk1, cdk2, cdk3,cdkain4, cdk5, cdk6), каждая в соединении с одним или несколькими родственными циклиновыми партнерами, играют различные роли (FangHeuvel and Harlow, 1993, Meyerson and Harlow,1994). Циклины В-типа представляют собой основной класс, участвующий в G2-M переходе и ассоциации с p34cdc2 или ее прямыми гомологами (Nurse, 1990). Циклин В представляет со 003425 2 бой один из двух циклинов, первоначально описанных как накапливающиеся в яйцах беспозвоночных в течение интерфазы и быстро разрушающихся в митозе (Evans et al., 1983), он является компонентом фактора, способствующего созреванию у Xenopus (Murray et al., 1989). Следовательно, установлена тождественность гомологов циклина В у многих видов эукариот. Циклин А также имеет широкое распространение у многоклеточных организмов, и точно его роль неясна, хотя максимум его накопления предполагает его функционирование в S фазе (Pienes,1993). Фазовый переход G1-S лучше всего изучен у S. cerevisiae. Генетические исследования определили точку в позднем G1, названнуюSTART. После прохождения START, клетки готовы к вхождению в S фазу и для завершения полного дополнительного цикла деления, результатом которого будет образование двух дочерних клеток, вновь находящихся в G1 фазе.CLN1, CLN2 и CLN3, представляют собой основные лимитирующие компоненты для прохождения через START (Richardson et al., 1989,Wittenberg et al., 1990, Tyers et al., 1993). Транскрипция CLN1 и CLN2 активируется в G1, и накопление их белковых продуктов до критического порогового уровня по механизму положительной обратной связи приводит к активацииand Nasmyth, 1991). Затем G1 циклины деградируют вследствие наличия PEST мотивов в их первичной последовательности, что в результате проявляется в быстром белковом кругообороте. (Rogers et al., 1986, Lew et al., 1991, обзорG1 циклины S. cerevisiae являются, по крайней мере, частично избыточными, так как дрожжевые штаммы, в которых два из трех G1 циклиновых гена удалены, а третий помещен под контроль галактозо-регулируемого промотора, проявляют фенотип с галактозозависимым ростом. Такие штаммы используют для определения клонов кДНК дрозофилы и человека, которые выживают в условиях данного сlnдефицитного фенотипа на глюкозной среде, когда единственный имеющийся дрожжевой генal., 1991; Leopold and O'Farrell, 1991; Lew et al.,1991; Xiong et al., 1991). Этим способом идентифицировали человеческие кДНК, кодирующие три новых класса циклинов: С, D и Е. Хотя эти циклины проявляют только ограниченную гомологию с дрожжевыми CLN белками, они подтвердили важность понимания контролирующих факторов действующих в клетках млекопитающих в течение G1 и в точке рестрикции на границе G1-S фаз (Pardee, 1989; Tsai et al.,1993b). Циклин Е может действовать как лимитирующий скорость компонент на границе G1-S 3 фаз (Ohtsubo and Roberts, 1993; Wimmel et al.,1994), в то время как зависимость содержания циклина D от сывороточных ростовых факторов(Matsushime et al., 1991; Baldin et al., 1993; Sewing et al., 1993) позволяет предположить, что циклины D-типа могут образовывать связь между данными сигналами и кодом клеточного цикла. Важным фактором, участвующим в регуляции протекания клеточного цикла у млекопитающих, является ген восприимчивости к ретинобластоме, кодирующий ретинобластомный белок (Rb). Rb связывает и инактивирует E2F семейство факторов транскрипции, благодаря чему Rb реализует большую часть возможности задерживать клеточное деление в G1 фазе. Известно, что E2F транскрипционные факторы включают ген циклина Е и гены S-фазы, и увеличение содержания циклина Е и/или E2F приводит к началу репликации (Nevins, 1992, Johnson et al., 1993). Способность Rb к инакцивацииE2F зависит от степени его фосфорилирования. Большая часть G1 Rb находится в гипофосфорилированном состоянии, но в поздней G1 фазе осуществляется фосфорилирование Rb циклинзависимыми киназами, в частности, СDК 4 связывается со своей необходимой регуляторной субъединицей, циклином D (Pines, 1995), aG1/S) или циклином А (в S фазе). Такое множественное фосфорилирование Rb побуждает его высвободить E2F, который может затем, в конечном счете, запустить транскрипцию генов Sфазы. Растительные клетки применяли на ранних стадиях клеточного роста и деления, определяя отдельные фазы эукариотического клеточного цикла (Howard and Pelc, 1953), но имеется недостаточное количество материала по молекулярному контролю клеточного цикла в растительных системах. Растительные клетки, которые прекращают делиться in vivo, благодаря впадению в состояние покоя, или in vitro, благодаря недостатку питательных веществ, задерживаются в главных контрольных точках в G1 иHof, 1985), это, в общем, согласуется с действием контролирующих факторов в других эукариотических системах. Хотя зрелые растительные клетки можно обнаружить и с G1 и с G2 ДНК содержанием ДНК или G1, или G2 (EvansG1 контрольная точка более важна в растительных клетках, культивированных в условиях азотного голодания; данные клетки задерживаются исключительно в G1 фазе (Gould et al.,1981). Таким образом, существуют сильные аналогии между главной контрольной точной вG1 для растительного клеточного цикла, START контролем у дрожжей и точкой рестрикции в клетках млекопитающих. 4 Для определения присутствия и локализации активных CDC2-родственных киназ в растительных клетках применяли антитела или гистон H1 киназные тесты (John et al., 1989,1990, 1991; Mineyuki et al., 1991; Chiatante et al.,1993; Colasanti et al., 1993; John et al., 1993), и с помощью гибридизации при пониженной жесткости; или избыточной полимеразной цепной реакции выделили кДНК, кодирующие функциональные гомологи CDC2 киназы, из ряда растительных видов, включая: горох (Feiler andJacobs, 1990), люцерну (Hirt et al., 1991, 1993),Arabidopsis (Ferreira et al., 1991; Hirayama et al.,1991), сою (Miao et al., 1993), Antirrhinum (Fobert et al., 1994) и кукурузу (Colasanti et al.,1991). Ряд последовательностей кДНК, кодирующих растительные митотические циклины с характеристиками А- и В-типа или имеющие смешанные черты, присущие А- и В-типам,также выделили из различных видов, включая морковь (Hata et al., 1991), сою (Hata et al.,1991), Arabidopsis (Hemerly et al., 1992; Day andSoni et al. (1995) выявил новое семейство из трех родственных циклинов из Arabidopsis с помощью комплементации дрожжевого штамма, дефицитного по G1 циклинам. Отдельные члены данного семейства проявляют тканезависимую экспрессию, и консервативны в других видах растений. Они образуют отдельную группу растительных циклинов, и названы циклинами -типа, что свидетельствует об их сходстве с циклинами D-типа млекопитающих. Родственность последовательностейи D циклинов включаетLxCxE. Лейцину в позиции -1 или -2 предшествует аминокислота с кислой боковой цепью (D,Е). Первоначально этот мотив обнаружен в определенных вирусных онкобелках, и он в значительной степени участвует в связывании с ретинобластомным белком. По аналогии с циклиномD млекопитающих, эти растительные гомологи способны проводить ростовые и фитогормональные сигналы в растительный клеточный цикл. В этом отношении показано, что при повторной стимуляции культивированных в суспензии клеток, циклин 3 быстро индуцируется растительным регулятором роста цитокинином,и циклин 2 индуцируется источником углерода. Renaudin et al., (1996) дал определение группам и номенклатуре растительных циклинов, и сейчас 5-циклины называются CycD циклинами.Dahl et al., (1995) обнаружил в люцерне циклин (cycMs4), определенный как 3 люцерны. Недавно Rb-подобные белки были обнаружены в растениях. Xie et al., (1996); Grafi etal., (1996) описывают выделение и предвари 5 тельную характеристику гомолога Rb из кукурузы.Doerner et al. (1996) описывает эктопическую экспрессию циклина В-типа (cyc1At изArabidopsis) под контролем промотора из cdc2a гена в Arabidopsis. cdc2a трансгенные растения с сильной экспрессией трансгена имели значительно повышенную скорость роста корня. Более того, в трансгенных растениях рост и развитие латеральных корней ускоряли последующей индукцией индолуксусной кислотой по сравнению с контрольными растениями.Hemerly et al., (1995) описывают трансгенный табак и растения Arabidopsis, экспрессирующие дикий тип или доминантные мутации киназы, функционирующей в фазу митоза(CDC2a). Растения, постоянно избыточно продуцирующие CDC2a дикого типа или мутантную форму, для которых было предсказано, что они ускоряют клеточный цикл, не обнаруживали значительного изменения развития. Ожидают, что при экспрессии в Arabidopsis мутантнаяCDC2a задерживает клеточный цикл, отменяя клеточное деление. Получали несколько растений табака, постоянно продуцирующих последнюю мутантную киназу. Такие растения содержали существенно меньше клеток, но больших размеров. В РСТ патентной публикация WO 92/ 09685 описан способ подавления роста растительных клеток, включающий модулирование уровня белков клеточного цикла в растении во время и в условиях, достаточных для подавления клеточного деления. Предпочтительный белок, обнаруженный в примерах, представляет собой p34cdc2 киназу и т.п. функционирующая в фазе. В WО 93/12239 описаны растения с измененной высотой и другими фенотипическими эффектами, в частности с преждевременным цветением и увеличенным количеством цветков,с помощью трансформации растительного генома cdc25 геном из дрожжей, таких как Schizosaccharomyces pombe.WО 97/47647 относится к выделению и характеристике последовательности растительной ДНК, кодирующей ретинобластомный белок, ее применению для подавления роста растительных клеток, растений и/или вирусов растений, а также использование векторов, растений, животных или животных клеток, измененных посредством манипуляций в контролирующем пути, основанном на ретинобластомном белке растений. В патенте США 5514571 описано применение циклина D1 в качестве негативного регулятора пролиферации клеток млекопитающих. Избыточная экспрессия циклина D1 блокирует рост клеток млекопитающих, в то время как блокирование экспрессии циклина D1 ускоряет клеточную пролиферацию. 6 Сущность изобретения Изобретение относится к способу получения растения с измененными ростовыми характеристиками или измененным строением, содержащий химерный ген, содержащий следующие оперативно связанные фрагменты ДНК:a) экспрессируемый растением промоторный участок;b) транскрибируемый участок ДНК, содержащий нуклеотидную последовательность,кодирующую растительный белок, контролирующий клеточное деление, а именно растительный циклин D-типа, способный связывать или фосфорилировать ретинобластомаподобный белок в клетках растения, выбранную из нуклеотидной последовательности EMBL AccessionEMBL Accession No. X83370 от положения 195 до положения 1346, кодирующей белок Arabidopsis thaliana CYCD2, нуклеотидной последовательности EMBL Accession No. X83371 от положения 266 до положения 1396, кодирующей белок Arabidopsis thaliana CYCD3, нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 1 от положения 182 до положения 1243, кодирующей белок Nicotiana tabacum CYCD2;1, нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 2 от положения 181 до положения 1299, кодирующей белок Nicotiana tabacum CYCD3;1, нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 3 от положения 198 до положения 1298, кодирующей белок Nicotiana tabacum CYCD3;2, нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 4 от положения 165 до положения 1109, кодирующей белок Helianthus tuberosus CYCD1;1, нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 5 от положения 48 до положения 1118, кодирующей белок Helianthus tuberosus CYCD3;1, нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 21 от положения 316 до положения 1389, кодирующей белок Zea mays CYCD2, или генетически вырожденных вариантов указанных нуклеотидных последовательностей; и с) 3'-концевую структуру и сигнал полиаденилирования, функционирующий в растительных клетках. Изобретение также относится к химерным генам, содержащим следующие оперативно связанные фрагменты ДНК:a) экспрессируемый растением промоторный участок;b) транскрибируемый участок ДНК, содержащий нуклеотидную последовательность,кодирующую растительный белок, контролирующий клеточное деление, а именно растительный циклин D-типа, способный связывать или фосфорилировать ретинобластомаподобный белок в клетках растения, выбранную из нуклеотидной последовательности EMBL AccessionEMBL Accession No. X83370 от положения 195 до положения 1346, кодирующей белок Arabidopsis thaliana CYCD2, нуклеотидной последовательности EMBL Accession No. X83371 от положения 266 до положения 1396, кодирующей белок Arabidopsis thaliana CYCD3, нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 1 от положения 182 до положения 1243, кодирующей белок Nicotiana tabacum CYCD2;1, нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 2 от положения 181 до положения 1299, кодирующей белок Nicotiana tabacum CYCD3;1, нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 3 от положения 198 до положения 1298, кодирующей белок Nicotiana tabacum CYCD3;2, нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 4 от положения 165 до положения 1109, кодирующей белок Helianthus tuberosus CYCD1;1, нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 5 от положения 48 до положения 1118, кодирующей белок Helianthus tuberosus CYCD3;1, нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 21 от положения 316 до положения 1389, кодирующей белок Zea mays CYCD2, или генетически вырожденных вариантов указанных нуклеотидных последовательностей; и с) 3'-концевую структуру и сигнал полиаденилирования, функционирующий в растительных клетках. Подробное описание изобретения Используемый здесь термин строение растения относится к общей морфологии, которая определяется относительными размерами,расположением и числом некоторых частей растения (например следующих органов, не ограничиваясь ими: листья, соцветия, органы накопления, такие как клубни, корни, стебли, цветки,или части органов, такие как: лепестки, чашелистики, пыльники, рыльце, столбик, черешок и т.п.). Изменение строения растения, таким образом, относится к изменениям общей морфологии в результате изменения, например,числа, размера и расположения органов или частей органов. Понятно, что изменение одного органа или части органа или нескольких органов или частей органов, как было описано, будет выражаться в изменении строения растения. Этого можно достигнуть путем изменения (то есть увеличения или уменьшения) активности клеточного деления в существующей меристеме и/или органном примордии, или путем создания меристем de novo. Используемый здесь термин "ко-супрессия" относится к способу транскрипционной и/или посттранскрипционной супрессии накопления РНК, что выражается в супрессии экспрессии гомологичных эндогенных генов или трансгенов. Супрессия экспрессии эндогенного гена может быть достигнута с помощью введения трансгена, включающего сильный промо 003425 8 тор, оперативно связанный с ДНК участком, в результате чего полученная транскрибируемая РНК представляет собой смысловую РНК,включающую нуклеотидную последовательность, которая составляет, по крайней мере,75%, предпочтительно 80%, в частности, по крайней мере 85%, более узко, по крайней мере,90%, конкретно, по крайней мере, 95% от кодирующей или транскрибируемой последовательности ДНК (смысловой) гена, экспрессия которого подлежит супрессии. Предпочтительно,транскрибируемый ДНК участок не кодирует функциональный белок. В частности, транскрибируемый участок не кодирует белок. Используемый здесь термин "экспрессируемый растением промотор" означает промотор, который способен управлять транскрипцией в растительной клетке. Он включает любые промоторы растительного происхождения, но также и любой промотор нерастительного происхождения, который способен управлять транскрипцией в растительной клетке, то есть определенные промоторы вирусного и бактериального происхождения, такие как промоторыCaMV35S или Т-ДНК гена. Термин экспрессия гена относится к процессу, при котором участок ДНК под контролем регуляторных участков, в частности промотора, транскрибируется в РНК, которая является биологически активной, то есть способна или к взаимодействию с другой нуклеиновой кислотой или с белком, или обладает способностью к трансляции в биологически активный полипептид или белок. Считают, что ген кодирует РНК, если конечный продукт экспрессии этого гена представляет собой биологически активную РНК, такую как, например, антисмысловая РНК или рибозим. Считают, что ген кодирует белок, если конечный продукт экспрессии гена представляет собой биологически активный белок или полипептид. Термин ген означает любой фрагмент ДНК, включающий участок ДНК (транскрибируемый участок ДНК), который транскрибируется в клетке в молекулу РНК (например,мРНК) под контролем подходящих регуляторных участков, например, экспрессируемого растением промотора. Таким образом, ген может включать несколько оперативно соединенных фрагментов ДНК, таких как: промотор, 5'лидерная последовательность, кодирующий участок и 3'-участок, включающий сайт полиаденилирования. Эндогенный растительный ген представляет собой ген, который в природе обнаруживается в видах растений. Химерный ген представляет собой любой ген, который в норме не обнаруживается в видах растений или, альтернативно, любой ген, в котором промотор не соединен в природе с частью или целым транскрибируемого участка ДНК или, по крайней мере, с другими регуляторными участками гена. 9 Данное изобретение основано на неожиданной находке, что химерные гены, включающие ДНК, кодирующую растительный циклинD-типа, могут быть стабильно интегрированы в геном растительных клеток под контролем экспрессируемого растением промотора без оказания вредного влияния, и более того, что повышенная экспрессия в растительных клетках такого циклина D-типа, приводит к специфическим изменениям скорости роста и строения полученных трансформированных растений. Таким образом, изобретение относится к модулированию уровня экспрессии или активности циклинов D-типа, предпочтительно устойчивым образом, в клетках растения с целью изменения строения или скорости роста, или и того, и другого у трансформированного растения, а также у его потомства. Удобно, когда содержание или функциональная активность белков, контролирующих клеточное деление, а именно циклинов D-типа, контролируют генетически с помощью изменения экспрессии генов, кодирующих эти белки, контролирующие клеточное деление. Увеличение содержания или функциональной активности белка, контролирующего клеточное деление, такого как циклинD-типа, может быть достигнуто генетически,например, путем манипулирования с числом копий кодирующего гена(ов), путем изменения промоторного участка кодирующих генов, или путем манипулирования с генами, прямо или опосредованно регулирующими уровень экспрессии белка, контролирующего клеточное деление. Иначе, содержание белка, контролирующего клеточное деление, может быть увеличено путем стабилизирования мРНК, кодирующей белок, контролирующий клеточное деление, или путем стабилизирования белка, контролирующего клеточное деление, например,путем удаления деструктирующих мотивов или,так называемых, PEST последовательностей. Функциональный уровень или активность белка, контролирующего клеточное деление,такого как циклин D-типа, могут быть увеличены с помощью уменьшения уровня антагониста или ингибитора белка, контролирующего клеточное деление, с помощью следующих способов, но не ограничиваясь ими: предоставление клетке белка, например, неактивного белка,контролирующего клеточное деление, но похожего на тот белок, чей функциональный уровень желают увеличить, или, предоставляя часть такого белка, контролирующего клеточное деление, которая еще обладает способностью к связыванию ингибитора или другого регуляторного белка, или еще обладает способностью к связыванию циклин-зависимых киназ. Также функциональный уровень или активность белка, контролирующего клеточное деление, могут быть увеличены с помощью изменения или мутации белка, контролирующего клеточное деление, с целью уменьшения или отмены способности 10 связываться с антагонистом или ингибитором активности белка, имеющего отношение к клеточному делению. Понижение функциональной активности белка, контролирующего клеточное деление,такого как циклин D-типа, можно достигнуть,например, с помощью уменьшения пула мРНК,кодирующих белок, контролирующий клеточное деление, что возможно при трансляции, с помощью таких методов, как (но не ограничивается ими): антисмысловая РНК, действие рибозима или ко-супрессия. Иначе, функциональный уровень белка, контролирующего клеточное деление, можно понизить с помощью увеличения уровня антагониста или ингибитора белка,вызывающего клеточное деление. В целях данного изобретения белок, контролирующий клеточное деление представляет собой полипептид или белок, который необходим для регуляции прохождения эукариотической клетки через клеточный цикл, предпочтительно растительной клетки, или белок, который способен воздействовать на вхождение клеток в клеточный цикл или воздействовать на прохождение клетки через клеточный цикл путем прямого взаимодействия с белком, который необходим для регуляции прохождения через клеточный цикл, или взаимодействия с полипептидом или белком, который может выполнять эквивалентную функцию, но не является при этом необходимым для регуляции клеточного цикла. Белки, подходящие для контролирования клеточного деления, представляют собой белки,способные самостоятельно или в комбинации с другими белками фосфорилироватьRbподобный белок, предпочтительно, способные фосфорилировать Rb-подобный белок в растительных клетках в G1-S переходной фазе, или способные связываться с карманным доменомRb-подобных белков, предпочтительно белки,содержащие LxCxE связывающий мотив, включенный в аминокислотную последовательность,или родственный ему мотив, такой как LxSxE или FxCxE (связывающие мотивы приведены в однобуквенном аминокислотном коде, где х представляет собой любую аминокислоту). Особенно предпочтительны циклины, которые включают LxCxE связывающий мотив (и/или родственный мотив) в N-концевой половине белка, предпочтительно, в пределах первых 50 аминокислотных остатков, в особенности, в пределах первых 30 аминокислотных остатков,такие как, циклины D-типа, в особенности растительные циклины D-типа, особенно циклин из группы Arabidopsis thaliana CYCD1, ArabidopsisCYCD2;1, Nicotiana tabacum CYCD3;2, Helianthus tuberosus CYCD1;1, Zea mays CYCD2, Helianthus tuberosus CYCD3;1 или циклин, с суще 11 ственно похожими аминокислотными последовательностями. Указанные растительные циклины D-типа полностью охарактеризованы с помощью аминокислотной последовательности, закодированной в последовательности ДНК в EMBL Accession N Х 83369 с нуклеотидного положения 104 до нуклеотидного положения 1108 для Arabidopsis thaliana CYCD1, EMBL Accession NX83370 с нуклеотидного положения 195 до нуклеотидного положения 1346 для Arabidopsisthaliana CYCD2, EMBL Accession N X83371 с нуклеотидного положения 266 до нуклеотидного положения 1396 для Arabidopsis thalianaID N 1 с нуклеотидного положения 182 до нуклеотидного положения 1243 для Nicotiana tabacum CYCD2;1, нуклеотидной последовательности SEQ ID N 2 с нуклеотидным положением 181 до нуклеотидного положения 1299 дляNicotiana tabacum CYCD3;1, нуклеотидной последовательности SEQ ID N 3 с нуклеотидным положением 198 до нуклеотидного положения 1298 для Nicotiana tabacum CYCD3;2, нуклеотидной последовательности SEQ ID N 4 с нуклеотидным положением 165 до нуклеотидного положения 1109 для Helianthus tuberosusSEQ ID N 5 с нуклеотидным положением 48 до нуклеотидного положения 1118 для Helianthustuberosus CYCD3;1, нуклеотидной последовательности SEQ ID N 21 с нуклеотидным положением 316 до нуклеотидного положения 1389 для Zea mays CYCD2. Вследствие увеличения, соответственно уменьшения, содержания или функциональной активности, или активности таких белков, контролирующих клеточное деление, таких как циклины D-типа, ускоряется, соответственно замедляется, переход от G1 к S фазе в растительных клетках, или увеличивается, соответственно уменьшается, процентное соотношение активно делящихся клеток, в результате взаимодействия этих белков с Rb-подобными белками,что влияет на способность Rb-подобного белка к инактивации определенных факторов транскрипции. Далее, экспрессия таких белков, контролирующих клеточное деление, взаимодействующих с Rb-подобными белками, дает возможность клеткам эффективно инициировать процессы деления, тогда как напротив, ожидается, что (избыточная) экспрессия С 2/митотических циклинов (таких как циклины В-типа или продукт cdc25 гена) приводит к быстрому прохождению через С 2/митотические фазы уже начатых клеточных циклов. В целях данного изобретения Rbподобные белки определяют как белки из группы: человеческий Rb-1 белок (Lee et al.,1987; AccessionР 06400), человеческий р 107A49370), RBF дрозофилы (Du et al., 1996; Accessionдля ДНК кодирующего гена Х 96975),мышиный Rb (Bernards et al., 1989; Accessionmays (Xie et al., 1996; Graft et al., 1996; каталожный номер для ДНК кодирующих генов: Х 98923; GenBank U52099), а также некоторые другие белки, которые одновременно обладают,по крайней мере, 25-30% сходством аминокислотной последовательности (идентичностью),по крайней мере, с тремя членами указанной выше группы, и включают консервативный остаток цистеина, в положении 706 человеческогоRb-1, или в эквивалентной позиции других Rbподобных белков (см., например, Xie et al.,1996).Rb-подобные белки являются членами небольшого семейства, известного как карманные белки. Данный термин произошел от названия консервативного домена, состоящего из двух частей, так называемого карманного домена, который представляет собой сайт связывания для нескольких белков, контролирующих рост, таких как семейство факторов транскрипции E2F, циклинов D-типа и вирусных онкобелков. А и В субдомены карманного домена являются более консервативными по сравнению с остальным белком (приблизительно 50-64% для А и В субдоменов) и отделены неконсервативным спэйсером (промежутком). Карманные домены локализованы между аминокислотами в положениях 451 и 766 для человеческого Rb,321 и 811 для человеческого р 107, 438 и 962 для человеческого р 130, 445 и 758 для Rb мыши,441 и 758 для Rb цыпленка, 440 и 767 для Xenopus Rb, 11 и 382 для com ZmRb, 89 и 540 дляRb1 кукурузы. В целях изобретения связывание с Rbподобным белком или связывание с карманным доменом Rb-подобного белка может быть проанализировано с помощью методик in vitro или одного из методов in vivo, или их комбинацией. В методе in vitro, анализируют связывание между интересующим белком, меченым 35Sметионином, и комплексом из белка глутатионS-трансферазы (GST) и карманным доменом Rbподобного белка, такого как человеческий Rb. Сшивание с GST дает возможность упростить очистку и фиксацию пришитого белка на глутатион-сефарозные шарики. Взаимодействие между анализируемым белком и Rb-подобным белком сравнивают со связыванием того же самого белка и сшивкой GST белка с Rbподобным белком с мутацией в консервативном цистенине в позиции, эквивалентной цистеину 706 в человеческом Rb C706F. Такой метод описан, например, Dowdy et al., (1993) и Ewen et al.,(1993). В варианте данного метода Rb-подобный белок можно экспрессировать в клетках насекомых, инфицированных бакуловирусом (Dowdyet al., 1993). В другом варианте и Rb-подобный белок и Rb-связывающий белок можно коэкспрессировать в клетках насекомых, и их ассоциацию детектируют путем гель-фильрации или ко-иммунопреципитации (O'Reilly et al.,1992). Метод in vivo, который можно использовать для определения связывания белка с карманным доменом Rb-подобных белков, представляет собой дрожжевую двухгибридную систему (Fields and Strong, 1989). Анализ основан на способности восстанавливать функциональную активность GAL4 из двух отдельныхGАL4-сшитых белков, содержащих ДНК связывающий домен (GAL4BD) и активационный домен (GAL4AD), пришитые к карманному доменуGAL4-индуцибельные HIS3 и LacZ маркеры,или в штамм Y190 (Harper et al., 1993). Белки,связывающие карманный домен Rb-подобного белка, позволят расти в условиях отсутствия гистидина. Пример двухгибридного метода, демонстрирующий взаимодействие белка с Rbподобным белком описан Durfee et al., 1993. Предпочтительно включать подходящие контрольные эксперименты, например, раздельное введение экспрессирующих плазмид в тот же дрожжевой штамм, или введение экспрессирующих плазмид, кодирующих сшитые белки,содержащие ДНК-связывающий домен (GALABD) и активационный домен (GALAAD), сшитые с мутированным карманным доменом Rbподобного белка, предпочтительно мутированным в С 706 или в эквивалентных позициях, и белок, который будут анализировать, соответственно. Альтернативный способ определения связывания белка с карманным доменом Rbподобных белков in vitro включает временную экспрессию обоих белков в растительных клетках, предпочтительно в протопластах табака, и иммунопреципитацию, с использованием антител, направленных против одного из двух белков для измерения ко-преципитации другого белка. В целях изобретения фосфорилированиеRb-подобного белка можно проанализировать с помощью методов in vitro, основанных на использовании гамма 32P меченного аденозинтрифосфата для контроля способности белка(или комбинации белков, таких как циклины и циклин-зависимые киназы) переносить меченую фосфатную группу на белок-мишень, что хорошо известно в данной области. В целях изобретения циклин можно определить как регуляторный белок, включающий 14 белковый домен из приблизительно 100 аминокислот, известный как циклиновый бокс. Циклиновый бокс представляет собой сайт связывания циклин-зависимых киназ, позволяющий циклину оказывать свое регуляторное действие на киназную активность CDK. Циклиновый бокс можно идентифицировать путем сравнения аминокислотных последовательностей белка с известными циклиновыми боксами, например, аминокислотной последовательности между положениями 81-186 CYCD1 из Arabidopsis thaliana, между положениями 96201 CYCD2 из Arabidopsis thaliana, между позициями 86-191 CYCD3 из Arabidopsis thaliana,циклиновые боксы описаны Renaudin et al.,(1994; 1996), Soni et al., (1995) and Hemerly et al.,(1992). Аминокислотную последовательность отождествляют с циклиновым боксом на основании сравнения последовательности, которая должна содержать, по крайней мере, пять консервативных остатка, необходимых для активности циклина R(97),D(126),L(144), К(155),Е(185)(отмеченные позиции получены из последовательности CYCD2 из Arabidopsis thaliana) в эквивалентных позициях (см., например, Soni etal., (1995) and Renaudin et al., (1996). Циклины D-типа (циклин D или CycD) представляют собой циклины, которые характеризуются наличием дополнительных характеристических последовательностей, таких какLxCxE мотив или родственные мотивы для связывания Rb-подобных белков, которые обнаруживаются в N-концевой части белка, предпочтительно находятся между N-концом и циклиновым боксом, в частности в пределах первых 50 аминокислот, конкретно в пределах 30 первых аминокислот от инициирующего метионинового остатка. Предпочтительно, лейцину связывающего мотива в позиции -1 или -2 предшествует аминокислота с кислой боковой цепью(D, Е). Можно обнаружить и другие связывающие мотивы, такие как LxSxE или FxCxE. Действительно, Phelps et al., (1992) определил, что мутация связывающего мотива LxCxE в LxSxE у человеческого папилломавируса Е 7 не влияет на способность белка связывать Rb-подобные белки. На основании гомологии последовательности определены три группы D-циклинов:CYCD3;2 и Helianthus tuberosus CYCD3;1). Номенклатура и консенсусные последовательности для различных типов и групп растительных циклинов, включая циклины D-типа,описаны Renaudin et al., (1996), и могут использоваться для классификации новых циклинов на основании их аминокислотной последовательности. 15 В целях изобретения, белки, контролирующие клеточное деление, можно доставлять в клетки или прямым способом, например, путем электропорации протопластов в присутствии белков, контролирующих клеточное деление,или непрямым способом, путем трансформации растительных клеток экспрессируемым в растении химерным геном, кодирующим интересующий белок, временно или постоянно встраивая его в геном протопластов. В одном аспекте изобретения с целью получения растения с измененной скоростью роста или измененным строением, увеличивают содержание или функциональную активность белка, контролирующего клеточное деление, способного к фосфорилированию Rb-подобного белка, или связыванию карманного домена Rbподобных белков, таких как циклин D-типа,путем интегрирования в геном клеток растения химерного гена, включающего следующие оперативно связанные фрагменты ДНК:A) экспрессируемый в растении промоторный участок, в частности CaMV35S промоторный участок,B) транскрибируемый участок ДНК, кодирующий белок, экспрессия которого увеличивает содержание или функциональная активность циклина D-типа; и необязательно,C) 3'-концевая структура или сигнал полиаденилирования, функционирующий в растительных клетках. В предпочтительном осуществлении изобретения, уровень экспрессии циклина D увеличивают путем введения в геном растительной клетки химерного гена, включающего транскрибируемый участок ДНК, кодирующий циклин D, под контролем экспрессирующегося в растении промотора. Транскрибируемый участок ДНК включает нуклеотидную последовательность, выбранную из нуклеотидной последовательности EMBL AccessionХ 83369 с нуклеотидным положением 104 до нуклеотидного положения 1108, EMBL AccessionХ 83370 с нуклеотидного положения 195 до нуклеотидного положения 1346, EMBL AccessionХ 83371 с нуклеотидного положения 266 до нуклеотидного положения 1396, нуклеотидной последовательности SEQ ID1 с нуклеотидного положения 182 до нуклеотидного положения 1243, нуклеотидной последовательности SEQ ID2 с нуклеотидного положения 181 до нуклеотидного положения 1299, нуклеотидной последовательности SEQ ID3 с нуклеотидного положения 198 до нуклеотидного положения 1298, нуклеотидной последовательности SEQ IDN 4 с нуклеотидного положения 165 до нуклеотидного положения 1109, нуклеотидной последовательности SEQ ID5 с нуклеотидного положения 48 до нуклеотидного положения 1118 и нуклеотидной последовательности SEQID21 с нуклеотидного положения 316 до нуклеотидного положения 1389 для Zea mays. 16 В особенно предпочтительном осуществлении уровень экспрессии циклина CYCD2 типа изменяют (напр., увеличивают) путем введения в геном растительной клетки химерного cycD2 гена, включающего транскрибируемый участок ДНК, кодирующий циклин CYCD2 типа, под контролем экспрессируемого в растении промотора, предпочтительно конститутивного промотора, в частности CaMV35S промотора, такого как химерный cycD2 ген плазмиды pCEC1, с целью изменить морфологию, строение и ростовые характеристики трансгенного растения, в частности увеличить вегетативный рост трансгенного растения, конкретно, изменить скорость роста трансгенного растения. В целях изобретения увеличение или уменьшение измеряемых фенотипических особенностей считают как разность между средним значением измерений, относящихся к описанию этой особенности у различных растений одной трансгенной линии растений, и средним значением измерений этой особенности у дикого типа растений, деленную на среднее значение измерений этой особенности у дикого типа растений, выраженную в процентах, причем трансгенное и контрольное (дикий тип) растения растут в одних и тех же условиях поступления питательных веществ, света, влажности,температуры и т.п., предпочтительно в стандартных условиях. Предпочтительный уровень увеличения или уменьшения является статистически значимым, предпочтительно с доверительным интервалом 0,05, еще предпочтительнее с доверительным интервалом 0,01, подсчитанный, например, путем анализа вариаций(напр., как описано в Statistical Methods by Snedecor and Cochran). Увеличение вегетативного роста трансгенного растения предпочтительно проверять путем измерения увеличения сухого веса в течение ростового периода. Среднее увеличение сухого веса определяют как разницу средних значений сухого веса трансгенных растений и растений дикого типа, умноженную на 100 и деленную на среднее значение сухого веса растений дикого типа. Обычно в результате введения химерных генов cycD2 настоящего изобретения, увеличение сухого веса, особенно в раннем периоде роста, колеблется от, по крайней мере, примерно 39 до примерно 350%, в особенности, от примерно 68 до примерно 150%. Очевидно, что увеличение сухого веса вследствие введения химерных генов данного изобретения, может изменяться в зависимости от видов растений или от использованных химерных генов, и в рамки изобретения включено любое значительное увеличение сухого веса трансгенных растений, в частности, увеличение сухого веса, по крайней мере, примерно в 1,44,5 раза по сравнению с сухим весом нетрансформированных контрольных растений, в частности, по крайней мере, в 1,8-2,7 раз по сравне 17 нию с нетрансформированными контрольными растениями. В любом случае, средний сухой вес трансгенных растений статистически значимо отличается от среднего сухого веса нетрансформированных растений. Также можно определить увеличение вегетативного роста трансгенного растения путем сравнения числа листьев, наблюдаемых на трансгенных растениях, и на контрольных растениях дикого типа в любую данную точку времени. Ожидают, что разница в количестве листьев трансгенных растений в середине периода роста, будет, по крайней мере, примерно в 1,1-3 раза, в частности, по крайней мере, в 1,5-2 раза по сравнению с числом листьев у нетрансформированных растений. Увеличение вегетативного роста трансгенного растения также можно проверить путем измерения высоты стебля (измеряют от уровня земли до вершины ростовой точки) в течение периода роста. Среднее увеличение высоты стебля определяют как разницу средней высоты стебля трансгенных растений и растений дикого типа, умноженную на 100 и деленную на среднюю высоту растений дикого типа. Обычно, в результате введения химерных генов cycD2 настоящего изобретения, увеличение высоты стебля колеблется от, по крайней мере, примерно 65% в раннем периоде роста, по крайней мере, примерно 20-30% в середине периода роста,до, по крайней мере, примерно 10% в период цветения, но может быть и очень высока - примерно 120-190% в раннем периоде роста, примерно от 40-50 до 75% в середине периода роста, и примерно 15-20% в конце стадии цветения. Очевидно, что увеличение высоты стебля в результате введения химерных генов данного изобретения, может изменяться в зависимости от видов растений или от используемых химерных генов, и любое значимое увеличение высоты стебля у трансгенных растений входит в рамки изобретения, в частности, высота стебля,превышающая, по крайней мере, в 1,1-3 раза высоту стебля нетрансформированных контрольных растений, в частности, превышающая по крайней мере в 1,5-2 раза высоту стебля нетрансформированных контрольных растений. Разница высоты стебля между трансгенными и контрольными растениями уменьшается в процессе роста, так как темп роста замедляется во время цветения. Таким образом, конечная высота трансгенного растения может быть такой же, как и конечная высота нетрансгенного растения. Трансгенные растения с включенными химерными генами cycD2 данного изобретения,имеют ускоренный темп роста по сравнению с нетрансформированными растениями, что выражается в уменьшении времени, необходимого для достижения данного сухого веса или высоты стебля. Используемый здесь термин темп роста относится к увеличению в размере рас 003425 18 тения или части растения за одни сутки, в частности, увеличение высоты стебля за одни сутки,и его можно подсчитать как разницу между размером растения или части растения в начале и в конце периода, включающего определенное количество дней, в частности 6-8 дней, деленную на количество дней. Предпочтительно выражать увеличение темпа роста в соответствии с общим определением увеличения измеряемого фенотипа, но также его можно выражать как отношение между темпом роста трансгенных растений и темпом роста нетрансформированных контрольных растений в течение одного и того же периода времени, в одних и тех же условиях. Как упоминалось ранее, увеличение скорости роста в результате введения химерных генов данного изобретения, может изменяться в зависимости от видов растений или от используемых химерных генов, и любое значимое увеличение темпа роста у трансгенных растений входит в рамки изобретения, в частности, увеличение темпа роста колеблется от примерно 4 до примерно 85%, более конкретно от примерно 20 до примерно 60%, особенно, от примерно 30 до примерно 50%. Увеличение вегетативного роста трансгенного растения также можно оценить путем измерения длины или размера самого большого листа в различные точки времени в течение периода роста, пока листья еще развиваются. Измеряемый фенотип представляет собой измерение ускоренного созревания трансгенных растений. Среднее увеличение длины самого большого листа вследствие введения химерных генов настоящего изобретения (определяют как разницу между средней длиной самого большого листа трансгенных растений и растений дикого типа, умноженную на 100 и деленную на среднюю длину самого большого листа растений дикого типа), колеблется от примерно 7-31% (в среднем, примерно 17%) в раннем периоде роста до примерно 3-14% (в среднем, примерно 7%) в середине ростового периода. Опять же, такие увеличения размера самого большого листа, в результате введения химерных генов данного изобретения, могут изменяться в зависимости от видов растений или от используемого химерного гена, и любое значимое увеличение роста или размера листа у трансгенных растений входит в рамки данного изобретения. В другом осуществлении данного изобретения в растения также могут быть введены химерные гены cycD2, с целью увеличения развития корней параллельно с увеличением вегетативной части над поверхностью земли (стебель,листья, цветы), и это увеличение может колебаться в пределах примерно 40-70%, но, опять же, это увеличение может изменяться в зависимости от видов растений и от используемого химерного гена, и любое значимое увеличение, 19 в частности статистически значимое увеличение корневого развития, входит в рамки настоящего изобретения. В другом осуществлении изобретения в растения также может быть введен химерный ген, контролирующий клеточное деление, в частности, химерные гены cycD2, с целью увеличения размера, а также числа цветков, в особенности числа плодоносящих цветков, и числа плодоносящих семяпочек в каждом цветке. Очевидно, что в результате увеличения числа плодоносных цветков, и числа плодоносящих семяпочек в каждом цветке (что в целом приводит к увеличенному количеству семян на одно растение), можно получить увеличение урожая семян на одно растение. Понятно, что увеличение числа цветков и семяпочек на цветок, а также увеличение урожая семян может изменяться в зависимости от видов растения, трансформированного химерными генами данного изобретения, контролирующими клеточное деление, и от используемых химерных генов. Обычно, увеличение размеров цветков в результате введения химерного гена, включая cycD2, кодирующий участок ДНК под контролем промотораCaMV35S, колеблется в пределах, по крайней мере, примерно 4-30%, в частности в пределах примерно 10-20%. Обычно увеличение числа цветков, колеблется от, по крайней мере, примерно 20% до, по крайней мере, примерно 50%,в частности от, по крайней мере, примерно 24% до, по крайней мере, примерно 45%, а увеличение числа семян на одно растение (выраженное на основании веса) попадает в пределы от, по крайней мере, примерно 5% до, по крайней мере, примерно 55%, в частности от, по крайней мере, примерно 10% до, по крайней мере, примерно 30%, и конкретно примерно 25%. В еще одном осуществлении изобретения в растения или их семена также можно ввести химерные гены cycD2, с целью увеличения прорастания. Обнаружено, что трансгенные семена,включающие химерные гены cycD2 изобретения, могут прорастать быстрее по сравнению с контролями дикого типа на, по крайней мере,примерно 8-16 ч. Более того, в растения также можно ввести упомянутые химерные гены с целью уменьшения среднего числа дней, необходимых до достижения развития цветорасположения, таким образом, эффективно уменьшая время, необходимое для начала цветения. Трансгенные растения, с включенными химерными генами cycD2 изобретения, таким образом, достигают зрелости, в частности стадии цветения, раньше, но имеют нормальные размеры цветущего растения. Фактическое уменьшение времени, необходимого до достижения стадии цветения, может зависеть от видов растений и от используемых химерных генов. Обычно трансгенные растения,несущие химерный ген, включающий cycD2 кодирующий участок ДНК под контролем про 003425 20 мотора CaMV35S, показывают уменьшение времени, необходимого до начала цветения, по крайней мере, от примерно 3 до примерно 1112%, в частности, по крайней мере, от примерно 4 до примерно 7%. В другом осуществлении изобретения,увеличивают функциональную активность циклина D-типа, получая растение с измененным темпом роста или строения путем введения в геном клеток растения химерного гена, включающего следующие оперативно связанные фрагменты ДНК:CaMV35S,B) транскрибируемый участок ДНК, кодирующий белок, который при экспрессии увеличивает функциональную активность белка, контролирующего клеточное деление, предпочтительно, кодирующий мутантный белок, контролирующий клеточное деление, или часть мутантного белка, контролирующего клеточное деление, более предпочтительно, кодирующий мутантный циклин D-типа или часть циклина Dтипа, в частности, кодирующий циклин D-типа с мутацией в циклиновом боксе (конкретно замена аминокислоты 185 или аминокислоты 155 циклина 02-типа, в особенности Е 185 А или К 155 А) , или циклин D-типа, у которого удалены PEST последовательности, в частности, который делегирован по С-концу для удаленияPEST последовательностей, или циклин D-типа,у которого изменен или делегирован LxCxE связывающий мотив, в частности, у которого делегирован С-остаток из LxCxE связывающего мотива; и необязательноC) образование 3'-концевая структура и сигнал полиаденилирования, функционирующий в растительных клетках. Никоим образом не ограничивая изобретение в отношении механизма действия, полагают, что мутантные белки, контролирующие клеточное деление, оказывают свое действие путем изолирования ингибиторов или антагонистов нормальных белков, контролирующих клеточное деление. Особенно предпочтительная комбинация олигонуклеотидов для ПЦР амплификации растительных циклинов D2 типа представляет собой олигонуклеотид, выбранный из группы олигонуклеотидов, имеющих ДНК последовательности: SEQ ID N 12 или SEQ ID N 13 и олигонуклеотид, выбранный из группы олигонуклеотидов, имеющих ДНК последовательности: SEQID N 14 или SEQ ID N 15. Особенно предпочтительная комбинация олигонуклеотидов для ПЦР амплификации растительных циклинов D3 типа представляет собой олигонуклеотид, выбранный из группы олигонуклеотидов, имеющих ДНК последовательности: SEQ ID N 16 или SEQ ID N 17 или SEQ ID N 18 и олигонуклеотид, выбранный из группы олигонуклеотидов, имеющихID N 20. Амплифицированный фрагмент ДНК затем используют для отбора кДНК или геномной библиотеки (в строгих условиях) с целью получения клонов полной длины. Иначе, дополнительные гены, кодирующие циклины, выделенные из растений, могут быть получены с помощью таких способов, как, но не ограничиваются ими: функциональное дополнение условных G1-S циклин-дефицитных дрожжевых штаммов, как описано Soni et al.(1995) and Dahl et al. (1995) или использование дрожжевой двухгибридной системы (Fields andSong, 1989), с целью выделения последовательностей ДНК, кодирующих циклины, связывающие карманный домен Rb-подобных белков, как описано выше. Кроме того, известно, что некоторые растения содержат более одного гена, кодирующего циклин D-типа одной подгруппы (напр., табак содержит, по крайней мере, 2 гена из подгруппы CycD3) и очевидно, что и эти варианты могут быть использованы в области изобретения. Более того, для получения того же эффекта можно использовать циклины D-типа, которые имеют аминокислотную последовательность, в существенной мере похожую на те, что раскрыты в данном изобретении, например мутантные циклины D-типа. Выражение аминокислотные последовательности, в существенной степени сходные, означает, что при выравнивании обоих рассматриваемых последовательностей, процент идентичности последовательности (то есть число позиций с идентичными аминокислотными остатками, деленное на число остатков в более короткой из двух аминокислотных последовательностей) выше 80%, предпочтительно,выше 90%. Выстраивание в ряд двух аминокислотных последовательностей выполняют по алгоритму Wilbur and Lipmann (Wilbur and Lipmann, 1983), используя окно-размеры 20 аминокислот, с длиной слова в 2 аминокислоты и промежутком в 4. Компьютерный анализ и интерпретацию данных о последовательности,включая выстраивание в ряд последовательности, как описано выше, удобно проводить, используя программы Intelligenetics Suite (Intelligenetics Inc., CA). Понятно, что для конструирования химерных генов данного изобретения, контролирующих клеточное деление, можно использовать любую последовательность ДНК, кодирующую белок, контролирующий клеточное деление, в частности циклин D-типа, и особенно, последовательности ДНК, которые частично или полностью синтезированы человеком. Понятно также, что для получения сходных эффектов можно использовать и другие промоторы, экспрессируемые растением, в частности конститутивные промоторы, например,промоторы опиновой синтазы Ti или Ri плазмид 22 из Agrobacterium, в частности, промотор нопалин-синтазы. Более того, как известно специалистам в данной области, существуют различные формы CaMV35S промотора, и при использовании таких альтернативных CaMV35S промоторов, а также тех, что описаны Hull andHowell, Virology, 86, р. 482 (1978), осуществление изобретения можно достигнуть в равной мере. Следующим предметом изобретения является предоставление растений с измененной морфологией или строением, ограничений для специфических органов или тканей, с помощью использования ткане-специфичных или органоспецифичных промоторов для контроля экспрессии ДНК, кодирующей циклин D-типа. Такие ткане-специфичные или органоспецифичные промоторы хорошо известны в данной области и включают, не ограничиваясь ими, следующие: семя-специфичные промоторыCycD3a гена, Doonan et al., 1998) и т.п. В другом осуществлении данного изобретения, экспрессию химерного гена, кодирующего белок, контролирующий клеточное деление,при желании можно проконтролировать с помощью соответствующего химического индуктора, путем операбельного связывания участка ДНК, кодирующего белок, контролирующий клеточное деление, и промотора, экспрессию которого индуцируют химическим соединением, например, промотора гена, раскрытого вEuropean Patent publication "EP" 0332104 или промотор гена, раскрытый в WO 90/08826. В другом осуществлении изобретения,экспрессию химерного гена, кодирующего белок, контролирующий клеточное деление, такой как циклин D-типа, можно проконтролировать с помощью сайт-специфических рекомбиназ и соответствующих им цис-действующих последовательностей, например, путем вставки между промотором, экспрессируемым растением, и транскрибируемым участком, кодирующим белок, контролирующий клеточное деление, неродственной нуклеотидной последовательности(предпочтительно с сигналами окончания транскрипции и/или трансляции), фланкированной цис-действующими последовательностями,узнаваемыми сайт-специфической рекомбина 23 зой (напр., 1 ох или FRT сайты); предоставляя растительные клетки, включающие этот химерный ген с сайт-специфической рекомбиназой(напр., Cre FLP) так, что при рекомбинации вставленная неродственная нуклеотидная последовательность элиминируется, таким образом, придавая химерному гену, контролирующему клеточное деление, возможность экспрессироваться. Считают, что морфологические изменения растений, полученные вследствие увеличения экспрессии циклинов D-типа, благодаря введению химерного гена, включающего участок ДНК, кодирующий циклин D-типа, под контролем экспрессируемого растением промотора,можно усилить путем удаления, переделки или инактивации PEST последовательностей. PEST последовательности представляют собой аминокислотные последовательности, богатые пролином, глютаматом или аспартатом, серином или треонином, локализованные между позитивно заряженными фланкирующими остатками, они участвуют в быстром обороте белка,включающего такие последовательности. (Tyerset al., 1992; Cross, 1988; Wittenberg and Reed,1988; Salama et al., 1994). Удаление таких PEST последовательностей в дрожжевых циклинах стабилизирует циклины in vivo (Pines, 1995).PEST участки можно определить с помощью компьютерного анализа, используя такие программы, как PESTFIND (Rogers et al., 1986;Rechsteiner, 1990). Мутация ДНК, кодирующей белок, контролирующий клеточное деление, с изменением PEST последовательностей с помощью таких способов, как описаны, например,Sambrook et al. (1989), является источником в пределах данной области. В дальнейшем ожидают, что количественные эффекты фенотипических изменений можно модулировать, (то есть усиливать или репрессировать) с помощью экспрессии химерных генов, кодирующих эндогенный CycD, в качестве альтернативы применению гетерологичных генов из других растений, кодирующих похожие белки. Предпочтительно использование гетерологичных генов, в частности гетерологичных генов, кодирующих похожие белки с идентичностью аминокислотной последовательности с эндогенным белком, контролирующим клеточное деление менее чем на 65%,предпочтительно менее чем на 75%, наиболее предпочтительно менее чем на 65%. В другом аспекте данного изобретения морфологию растений можно изменить с помощью уменьшения экспрессии циклина D-типа. Этого можно достигнуть, используя, например,антисмысловую-РНК, рибозим или методики ко-супрессии. Наконец, в растительные клетки вводят, в частности стабильно интегрируют в геном растительных клеток, химерный ген,включающий транскрибируемый участок ДНК,который транскрибируется в РНК, продукция 24 которой в свою очередь уменьшает, ингибирует или предотвращает экспрессию циклина D-типа,в растительных клетках. В возможном осуществлении данного аспекта, транскрибируемый участок ДНК химерного гена кодирует антисмысловую РНК, которая комплементарна, по крайней мере, части смысловой мРНК, кодирующей циклин D-типа. Таким образом, антисмысловая РНК включает участок, который комплементарен части смысловой мРНК, предпочтительно на протяжении,по крайней мере, в 50 оснований по длине, в частности, по крайней мере, 100-1000 оснований по длине. Антисмысловая РНК может быть комплементарна любой части последовательности мРНК: она может быть комплементарна последовательности, близкой к 5' концу или кэппинг-сайту, или части или целому лидерного участка, комплементарна интронному или экзонному участку (или участку, соединяющему экзон и интрон), комплементарна смысловой пре-мРНК, или участку, между некодирующим и кодирующим участками, части или целому кодирующего участка, включая 3' конец кодирующего участка, и/или целому или части 3' или хвостового участка. Сходство последовательности между антисмысловой РНК и комплементарной ей смысловой РНК, кодирующей белок,контролирующий клеточное деление, должно быть в пределах, по крайней мере, от, примерно 75 до 100%. В другом осуществлении этого аспекта,транскрибируемый участок ДНК химерного гена кодирует специфический РНК фермент или, так называемый, рибозим (см. напримерWO 98/05852), способный высокоспецифично расщеплять смысловую мРНК, кодирующую циклин D-типа. Еще в одном осуществлении уровень функционального циклина D-типа, можно уменьшить с помощью экспрессии химерного гена, включающего участок ДНК, кодирующий белок или полипептид, который при экспрессии уменьшает уровень циклина D-типа, или ингибирует циклин D-типа, с целью подавить его функцию в растительных клетках. Предпочтительно, чтобы химерный ген кодировал антитело, которое связывает циклин D-типа. Уменьшение содержания или функциональная активность циклина D-типа, в клетках трансгенного растения, с включенными химерными генами этого осуществления изобретения,приводит к изменению строения, особенно к уменьшению высоты стебля, уменьшению темпа роста или к задержке цветения у трансгенных растений по сравнению с нетрансформированными растениями, растущими в одних и тех же условиях. Полученный эффект может изменяться в зависимости от видов растений или от используемых химерных генов, и любой эффект строения и/или темпа роста, в частности уменьшения высоты стебля или темпа роста, или уве 25 личение времени, необходимого для развития цветорасположения, входит в рамки данного изобретения. Уменьшение темпа роста в результате уменьшения уровня циклина D-типа, в частности циклина CYCD2 типа, колеблется примерно от 30 до 60%, в частности примерно от 35 до 50%. Уменьшение высоты стебля в результате уменьшения уровня циклина D-типа, в частности циклина CYCD2 типа, колеблется примерно от 10 до 60%, в частности примерно от 30 до 50%, конкретно около 40%. Увеличение времени цветения в результате уменьшения уровня циклина D-типа, в частности циклина D2 типа, колеблется примерно от 10 до 40%, в частности примерно от 15 до 38%. Химерный ген, контролирующий клеточное деление, кроме всего прочего, может включать регуляторную или другие последовательности, такие как лидерные последовательности(напр., cab22L лидер из Petunia или лидер омега из TMV (Gallie et al., 1987), сигналы 3' транскрипционной терминации и полиаденилирования (напр., ген синтазы октопина (De Greve etMunroe et al., 1990; Ballas et al., 1989; Joshi et al.,1987), согласованные последовательности инициирования трансляции у растений (Joshi, 1987),интроны (Luehrsen and Walbot, 1991) и т.п., операбельно связанные с нуклеотидной последовательностью химерного гена, контролирующего клеточное деление, такого как ген циклина Dтипа. Предпочтительно, чтобы рекомбинантная ДНК, включающая химерный ген, контролирующий клеточное деление, сопровождалась маркером химерного гена. Химерный маркерный ген может включать маркерную ДНК, которая операбельно связана с 5' концом экспрессируемого растением промотора, предпочтительно конститутивного промотора, такого какCaMV35S, или светоиндуцируемого промотора,такого как промотор гена, кодирующий малую субъединицу Rubisco; и операбельно связана с 3' концом подходящего транскрипционного 3' формирования у растений и сигналами полиаденилирования. Ожидают, что выбор маркерной ДНК не является критичным, и можно использовать любые подходящие маркерные ДНК. Например, маркерная ДНК может кодировать белок, который придает трансформированной клетке растения отличительный цвет, например,А 1 ген (Meuer et al., 1987), может придавать трансформированной растительной клетке гербицидную устойчивость, так bar ген, кодирует устойчивость к фосфинотрицину (ЕР 0 242 246),или может придавать трансформированным клеткам устойчивость к антибиотикам, как 26 аас(6') ген, кодирующий устойчивость к гентамицину (WO 94/01560). Хотя очевидно, что изобретение можно применять по существу ко всем видам и разновидностям растений, изобретение особенно подходит для изменения строения и увеличения темпа роста растений, имеющих коммерческое значение. Ожидают, что усиление вегетативного роста в большей степени проявится в растениях,которые не подвергали обширному разведению и селекции для ускорения вегетативного роста. Изобретение будет особенно уместно для растений, которые выращивают в оранжереях (теплицах), в особенности для уменьшения времени,необходимого тепличному растению до достижения требуемой стадии развития, например (но не ограничивается ими): цветение, образование плодов или образование семян. Кроме того,изобретение будет уместно для усиления темпа роста деревьев, особенно деревьев с мягкой древесиной, таких как сосна, тополь, эвкалипт и т.п. Другое важное приложение изобретения включает расширение эффективной территории,в пределах которой можно культивировать растения в результате уменьшения времени, необходимого для достижения экономически важной стадии развития. Особенно предпочтительными растениями для применения настоящего изобретения являются: кукуруза, маслянно-семенная капуста, льняное семя, пшеница, злаковые травы, люцерна, бобовые растения, Brassica овощ,помидоры, латук, рис, ячмень, картофель, табак,сахарная свекла, подсолнечник, декоративные растения, такие как гвоздика, хризантема, розы,тюльпаны и т.п. Рекомбинантную ДНК, включающую химерный ген, контролирующий клеточное деление, можно стабильно включить в ядерный геном клетки или растения. Генный перенос можно осуществить с помощью вектора, который представляет собой безвредную Ti-плазмиду, с включенным химерным геном изобретения, переносимую с помощью Agrobacterium. Эту трансформацию можно осуществить, с помощью способов, описанных, например, в ЕР 0 116 718. Иначе, для трансформации растительной клетки можно использовать любой тип вектора,и способы его применения, например: прямой генный перенос (как описано, например, в ЕР 0 233 247), трансформация с помощью опыления(как описано, например, в ЕР 0 270 356, WO 85/01856 и US 4 684 611), вирус-опосредованная трансформация растительной РНК (как описано,например, в ЕР 0 067 553 и US 4 407 956), липосома-опосредованная трансформация (как описано, например, в US 4 536 475) и т.п. Также подходят другие методы, например,бомбардировка микроснарядами, как описано 27 ферментативно расщепленную плотную эмбриогенную ткань, способную к образованию плотных эмбриогенных наплывов, или поврежденные и/или расщепленные незрелые эмбрионы, как описано в WO 92/09696. Полученную трансформированную растительную клетку затем используют для регенерации трансформированного растения традиционным способом. Полученное трансформированное растение можно использовать в традиционной схеме размножения для получения более трансформированных растений с теми же характеристиками,или для введения химерного гена, контролирующего клеточное деление изобретения в другие разновидности того же вида или родственные виды растения. Семена, полученные от трансформированных растений, содержат химерный ген изобретения, контролирующий клеточное деление, в качестве стабильного геномного включения. Нижеследующие не ограничивающие примеры описывают конструирование химерных генов, контролирующих клеточное деление, и использование таких генов с целью модификации строения и темпа роста растений. В примерах, все методики рекомбинантных ДНК проводят в соответствии со стандартными протоколами, как описано Sambrook et al., (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition,Gold Spring Harbor Laboratory Press, NY и в Volumes 1 и 2, Ausubel et al., (1994) Current Protocols in Molecular Biology, Current Protocols, USA,кроме особо оговоренных случаев. Стандартные материалы и способы для молекулярной работы с растениями описаны в Plant Molecular BiologyBlackwell Scientific Publications, UK. На всем протяжении описания и примеров даны ссылки на следующие последовательности:B-9000 Gent Belgium 11 марта 1997 года и им присвоены следующие номера хранения: МС 1061(pCEC1): BCCM/LMBP3657B-9000 Gent Belgium 19 марта 1998 года под номером хранения:EMBL Accession N X83370 с нуклеотидной позиции 194 до нуклеотидной позиции 1332) обрабатывают полимеразой Клнова, образуя тупые концы из выступающих, и присоединяют кCabbB-Jl изолята (Harpster et al., 1988) и 3'ocs участком (MacDonald et al., 1991). Затем, химерный ген вставляют между Т-ДНК границей ТДНК вектора, включающего также выбранный химерный маркерный ген. С этого конца химерный cycD2 ген отрезают от рСЕС 1, используя Notl, и связывают сNotI линеаризированной pART27 (Gleave, 1992),получая pCECS. pART27 включает выбранный химерный маркерный ген, состоящий из следующих операбельно связанных фрагментов: промотор гена нопалин-синтазы, пео кодирующий участок и 3' конец гена нопалин-синтазыpCECl, используя соответствующий рестрикционный фермент (например, Notl) и вводят в полилинкер между Т-ДНК граничными последо 29 вательностями Т-ДНК вектора pGSVS вместе с выбранным химерным маркерным геном (pSSUbar-3'ocs; De Almeida et al., 1989), получаяpGSV5 получают из плазмиды pGSC1700(Cornelissen and Vandewiele, 1989) , но она отличается от последней тем, что не содержит гена бета-лактамазы, и тем, что ее Т-ДНК характеризуется последовательностью SEQ ID No 6. Пример 2. Опосредованная Agrobacterium трансформация растений табака Т-ДНК векторами из примера 1. Т-ДНК вектор рСЕС 5 вводят Agrobacterium tumefaciens LBA4404 (Klapwijk et al., 1980) с помощью электропорации, как описано Walkerpeach and Velten (1995), и отбирают трансформантов, используя соответственно спектиномицин и тетрациклин. Т-ДНК вектор pCECSb вводят в A. Tumefaciens C58ClRifR с помощью трехродительского скрещивания (Ditta et al., 1980). Полученные штаммы Agrobacterium используют для трансформации Nicotiana tabacumvar Xanthi, применяя способ листовой disc трансформации, как описано An et al., 1985. Одиннадцать растений табака трансформировали рСЕС 5 (обозначают С 8 линии с 1 по 3 и с 5 по 12). Растения, трансформированные рСЕС 5 ТДНК, анализируют на копированное число вставленных трансгенов с помощью Southern гибридизации, используя BamHI, расщепленную ДНК, полученную из этих растений, и меченный 0,7 т.п.н. NcoI-EcoRI фрагмент из J22 кДНК(включающий часть cycD2 кодирующего участка; Soni et al., 1995). Все линии С 8-2, С 8-3, С 8-5,С 8-8, С 8-1, С 8-9, С 8-10, С 8-11, С 8-12 имеют одну копию трансгена, линия С 8-7 имеет две копии, линия С 8-6 имеет три копии, и линия С 81 имеет четыре копии трансгена. ТО (первичные трансформанты) являются самовоспроизводящимися, и позволяют собрать семена (Т 1 семена). Растения, выращенные изT1 семян, обозначили С 8-Т 1-Х, где Х означает номер линии исходного трансформанта. Семена от Т 1 растений относятся к Т 2 семени; растения,выращенные из таких семян называют С 8-Т 2-Х,где Х вновь является номером исходного трансформанта. Когда поколение не упоминают, значит растения проращены из Т 1 семени.Northern анализ подтвердил транскрипцию трансгенов, по крайней мере, у линий С 8-1, С 83, С 8-7, 3 К 9, 4 К 9 и 8 К 9. Пример 3. Фенотипический анализ трансформированных растений табака. 3.1. Растения табака, с включеннымCaMV35S-AthCycD2 химерным геном. Семена от первичных трансформантов (ТО растений) поверхностно стерилизуют в 10% хлорной извести в течение 15 мин и основательно промывают стерильной водой. Поверхностно-стерилизованные семена проращивают наGM среде, содержащей канамицин в конечной концентрации 100 мкг/мл. Семена на плашках помещают на 5 дней в 4 С (яровизация) и затем переносят в ростовую камеру при 23 С. Все временные точки относят ко дню помещения в ростовую камеру. Через 18 дней после помещения в ростовую камеру (то есть после 23 дней в целом), канамицин-резистентные саженцы перемещают в семянной лоток, содержащий землю, и выращивают при фотопериоде в 18 ч в ростовой комнате. Еще через 10 дней эти растения переносят в 3-дюймовые растительные горшочки, и еще через дополнительные 15 дней переносят в 8-дюймовые растительные горошки, где они остаются все остальное время эксперимента, 3-й 8-дюймовые растительные горшочки инкубируют в теплице, поддерживая при дополнительном освещении, достигая 18 часового фотопериода. В пределах теплицы растения размещают случайным образом. Измерения начинают через два дня, (то есть через 45 дней или через 27 дней в земле; обозначают неделя 1), и повторяют каждую неделю в течение семи недель, как предписано. Для каждой линии анализируют следующее количество растений: 22 растения для линии С 8-1,7 растений для линии С 8-7, 5 растений для линии С 8-8, 6 растений для линии С 8-9, 4 растения для линии С 8-10, 6 растений для линии С 8-11, 5 растений для линии С 8-12, 34 растения для нетрансформированного контроля (дикий тип). Анализируют следующие параметры: высоту растения от поверхности земли до самой высокой точки (то есть до растущей верхушки; результаты в табл. 1 как средняя высотастандартное отклонение в см); длину самого большого листа в определенное время (результаты в табл. 2 как средняя длинастандартное отклонение в см), время (результаты в табл. 3 как среднее времястандартное отклонение в днях), при котором меристема цветорасположения видна невооруженным глазом (цветорасположение в 0,25 см и 1 см); высота, на которой видна меристема цветорасположения (результаты в табл. 3 как средняя длинастандартное отклонение в см); длина лепестковой трубки цветков; ширина шейки лепестковой трубки(результаты в табл. 3 как средняя длина и ширинастандартное отклонение в мм); общее число семенных коробочек на растение; средний семенной выход (на основании веса) на растение. Трансгенные растения показывают повышенный темп роста, проявляющийся со стадии посадки, приводящий к увеличению средней высоты стебля (табл. 1). Во временную точку неделя 3, все популяции трансгенных линий значимо больше, чем нетрансформированные контроли (t-тест; при доверительном интервале 95%), а линии С 8-1, С 8-2, С 8-3, С 8-5, С 8-11 значимо больше, чем нетрансформированные контроли, при доверительном интервале 99%. Уве 31 личенный темп роста также выражается в среднем больших листьях в определенные моменты времени, которые соответствуют периоду, во время которого еще продолжается развитие листа(табл. 2) а также больших цветках, у которых лепестковая трубка в среднем длиннее у трансгенных растений, по сравнению с лепестковой трубкой цветков нетрансформированных растений. Также у трансгенных растений увеличено число цветков, а также число плодоносящих цветков, что проявляется в большем числе семенных коробочек, и большем семенном выходе на растение (результаты в табл. 4 А). Более того,количество семян на коробочку больше у трансгенных растений, чем у растений контрольного дикого типа. Отклонение от нормы семенного выхода в линии С 8-Т 1-6 возникло благодаря высокому проценту ампутации цветков. Таким образом, можно сделать заключение, что постоянная экспрессия AthCycD2 кодирующей ДНК приводит к увеличению как числа семенных коробочек, так и общего выхода семян на одно растение. В конце сравнивают корневое развитие саженцев дикого типа и трансгенных саженцевGM средой без селекции, яровизуют, и затем помещают в вертикальном положении в ростовую комнату. Длину корня измеряют через 9 и 13 дней после яровизации и регистрируют наличие боковых корней. Используют семена линии С 8-Т 1-7 и С 8-Т 2-2 (гомозиготы). Линия С 8-Т 1-7 имеет две вставки, которые расщепляются приблизительно 15:1 на канамициновых плашках. Из этой линии проращивают 35 саженцев, и оказалось, что три из них, показывали тот же темп роста, что и наблюдаемый в саженцах дикого типа. Результаты от этих саженцев регистрировали отдельно, через девять дней после яровизации. Для определения значимости разницы средних значений применяют t-тест, и уровень значимости отмечен в таблице. Ns означает отсутствие значимой разницы между образцами. Таким образом, оказалось, что увеличение вегетативного роста в апикальных частях сбалансировано равнозначным увеличением корневого развития. Таблица 1 Среднее значение высоты (в см) трансформированных растений табака с включенным CaMV35S-AtcycD2 Неделя 1 Неделя 2 Неделя 3 Неделя 4 Неделя 5 Неделя 6 Неделя 7 Таблица 2. Среднее значение длины листа(в см) самого большого листа трансформированных растений табака с включенным Таблица 3 А. Цветковое развитие (средняя высота для цветорасположения в 0,25 см или 1 см (в см), среднее время, необходимое для достижения цветорасположения в 0,25 см или 1 см Среднее время до цветорасположения в 0,25 см, дни 67,354,580 65,422,573 68,773,436 70,252,712 68,002,828 70,953,034 72,603,286 73,173,251 Среднее время до цветорасположения в 1 см, дни 74,754,541 72,003,546 74,323,414 76,632,387 73,332,944 77,152,852 77,602,793 79,502,429 Средняя высота при цветорасположении в 1 см, см 105,521,670 110,621,439 106,514,134 122,46,737 117,05,550 133,414,497 116,15,482 129,2510,324 33 С 8-Т 1-10 С 8-Т 1-11 С 8-Т 1-12 Среднее значение Дикий тип Таблица 3 В. Цветковое развитие (среднее значение величины цветка, то есть длины и ширины (мм) ) табака, трансформированногоCaMV35SАthCycD2. Измеряют длину и ширину 5 цветков от каждого растения, и подсчитывают среднее значение ширины и длины цветка для каждой трансгенной линии. Значения для каждой независимой трансгенной линии сравнивают с таковым дикого типа, используя t-тест. Таблица показывает уровень вероятности, при котором результаты являются статистически значимыми по сравнению с диким типом, ns означает отсутствие значимой разницы. Среднее значение длины цветка, мм 47,222,261 44,191,848 41,301,720 47,302,822 50,781,990 48,042,604 42,901,252 45,121,906 44,601,627 42,401,891 42,570,978 С 8-Т 1-1 С 8-Т 1-2 С 8-Т 1-3 С 8-Т 1-5 С 8-Т 1-6 С 8-Т 1-7 С 8-Т 1-8 С 8-Т 1-9 С 8-Т 1-10 С 8-Т 1-11 С 8-Т 1-12 Среднее 45,0932,877 значение Дикий тип 41,221,005 Среднее значение ширины цветка, мм 33,451,668 31,141,486 31,041,360 33,301,945 34,251,467 33,191,391 30,132,270 30,561,333 30,932,002 29,102,998 28,551,190 Таблица 4 А. Среднее количество семенных коробочек на растение, средний вес семян, содержащихся в шести коробочках (г), средний семенной выход на растение (г) у табака, трансформированного CaMV35SAthCycD2 Среднее Средний вес Средний количество семенного семенной семенных содержимого на 1 растекоробочек 6 коробочек, к ние, г 105,1514,96 1,0850,174 19,015 127,297,82 0,8240,137 17,481 110,4616,30 1,1060,179 20,361 97,8610,81 1,1050,178 18,023 78,6012,97 1,0780,150 14,123 118,1715,64 1,1310,253 22,275 123,754,78 1,1230,165 23,162 110,8320,91 1,0900,218 20,134 104,2010,99 1,1220,311 19,485 138,208,35 1,1160,222 25,705 106,2012,62 1,1340,056 20,072 106,7316,47 0,9380,118 16,685 Таблица 4 В. Сравнение корневого развития саженцев дикого типа и трансгенных саженцев. Число% Средняя рас- боковых длина тений корней корня, мм 9 дней после яровизацииWT 23 36 15,326 С 8-Т 1-7 25 100 26,520 3 33 14,000 С 8-Т 2-2 28 100 26,911 13 дней после яровизации Дикий 16 100 28,188 тип С 8-Т 1-7 13 100 53,846 С 8-Т 2-2 15 100 51,267 Пример 4. Выделение CycD-гомологичных генов из других растений. кДНК библиотеку, полученную от экспоненциально растущих BY-2 клеток табака конструируют в Lambda Zap Express векторе(Stratagene). Приблизительно 7,5 х 105 библиотечных клонов высевают на чашки, и делают реплика-блоты с каждой чашки, используя Hybond N+ найлоновые мембраны (Amersham Int),которые затем фиксируют с помощью обжига при 80 С в течение 2 ч. Мембраны гибридизуют с cycD2 гетерологичными зондами, меченнымиCycD2 зонд состоит из 1298 п.о. NcoI-SacI фрагмента cycD2 из A. thaliana (имеющего нуклеотидную последовательность EMBL AccessionN X83370 с нуклеотидной позиции 194 до нуклеотидной позиции 1332). CycD3 гибридизации проводят при 55 С, и мембраны дважды промывают в в 2 хSSC/0, 1%. Литература/запись="правая граница последовательности из Т-ДНК PGSV5/запись = "левая граница последовательности из Т-ДНК pGSV5" ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Химерный ген, содержащий следующие оперативно связанные фрагменты ДНК:a) экспрессируемый растением промоторный участок;b) транскрибируемый участок ДНК, содержащий нуклеотидную последовательность,кодирующую растительный белок, контролирующий клеточное деление, а именно растительный циклин D-типа, способный связывать или фосфорилировать ретинобластомаподобный белок в клетках растения, выбранную из нуклеотидной последовательности EMBL Accession 48 белок Zea mays CYCD2, или генетически вырожденных вариантов указанных нуклеотидных последовательностей; иc) 3'-концевую структуру и сигнал полиаденилирования, функционирующий в растительных клетках. 2. Способ получения растения с измененными ростовыми характеристиками или измененным строением, причем указанный способ предусматривает изменение концентрации или функциональной активности растительного белка, контролирующего клеточное деление, а именно циклина D-типа, способного связывать или фосфорилировать ретинобластомаподобный белок в клетках растения, путем обеспечения экспрессии химерного гена, охарактеризованного в п.1, в указанных клетках растения.