Способ продуцирования вирусных частиц ad26

СПОСОБ ПРОДУЦИРОВАНИЯ ВИРУСНЫХ ЧАСТИЦ Ad26 Изобретение относится к способу продуцирования по меньшей мере 11012 вирусных частиц (VP)/ мл E1-дефицитного аденовируса серотипа 26 (rAd26), причем отношение абсолютного количества вирусных частиц к инфекционным частицам VP/IU составляет менее 20:1, причем способ включает а) культивирование клеток PER.C6 в суспензии с помощью перфузионной системы;b) инфицирование указанных клеток посредством rAd26 при плотности от 10106 до 16106 жизнеспособных клеток/мл; с) дальнейшее культивирование инфицированных клеток с помощью перфузионной системы для размножения указанного rAd.26 до достижения концентрации по меньшей мере 11012 вирусных частиц VP/мл и d) сбор вирусных частиц указанного rAd26. Изобретение также относится к применению биореактора в указанном способе, где указанный биореактор имеет рабочий объем от 2 до 1000 л и содержит культуральную среду, клетки PER.C6 и вирусные частицы rAd26 в концентрации по меньшей мере 11012 VP/мл. Изобретение относится к области клеточных культур и получения аденовирусов. Более конкретно,оно относится к усовершенствованным способам культивирования клеток млекопитающих, инфицирования этих клеток аденовирусом и продуцирования из них аденовирусных частиц. Предпосылки изобретения Недавние разработки в области ДНК-вакцинации с использованием рекомбинантных вирусных векторов вызвали необходимость в крупномасштабном производстве материала клинической категории. Необходимы способы, позволяющие предоставить менее и наименее развитые общества достаточными количествами рекомбинантных вакцин на основе аденовирусов для борьбы с проблемами туберкулеза и малярии в мире. Оценка когорт рождения демонстрирует, что в менее и наименее развитых обществах в 2010-2015 годах родится более 150000000 человек. Исходя из этой когорты рождения предполагаемая ежегодная потребность в вакцине может достигнуть приблизительно 1,51019 вирусных частиц (VP) в год(http://esa.un.org/unpp/index.asppanel=2). Описано несколько способов продуцирования аденовирусов. В этих способах используются прикрепляющиеся клеточные культуры во вращающихся флаконах, клеточных фабриках (Nunclon от Nunc или CellStack от Corning) или клеточных кубах (Corning). Способы продуцирования на прикрепляющихся клеточных культурах не могут удовлетворить мировую потребность в вакцинах на основе аденовируса. Таким образом, клетки, используемые в способе на прикрепляющихся культурах, адаптированы к суспензионным культурам (например, клеточные линии HEK293 и PER.C6). С использованием суспензионных культур можно масштабировать процессы продуцирования для крупномасштабных биореакторов. Суспензионные клеточные культуры для продуцирования аденовируса обычно достигают масштаба от 3 до 20 л и было описано успешное увеличение масштаба вплоть до 100 л (Kamen et al., 2004) и 250 л (Xieet al., 2003). Описаны эксперименты, которые предусматривают увеличение масштаба вплоть до 10000 л(Xie et al., 2003). Однако, главным недостатком увеличения масштаба до 10000 л является высокое вложение капитала (САРЕХ), которое требуется для моделирования и конструирования биореакторной установки объемом 10000 л. Более того, вложение САРЕХ в конструирование установки объемом 10000 л, согласно условиям BSL 2, должно быть осуществлено в отсутствие даже информации о том, что продуцирование будет успешным (фаза IV и далее). Сообщается, что общие капитальные затраты на биореакторную установку объемом 10000 л составляют от 225000000 до 320000000 (Estape et al., 2006). Таким образом,является желательным получение в меньшем масштабе, например в биореакторах объемом 1000 л или менее. При использовании существующих в настоящее время способов для достижения заданного уровня 1,51019 VP/год необходимо продуцировать более 150 партий в масштабе 1000 л. Таким образом, существует потребность в усовершенствовании систем для продуцирования аденовирусов в целях увеличения выхода аденовирусных частиц, чтобы удовлетворить мировую потребность в аденовирусных вакцинах,предпочтительно без чрезмерных затрат. Одной из проблем, встречаемых при оптимизации продуцирования аденовирусов, является так называемый "эффект клеточной плотности". В случае периодического процесса в нескольких ссылках указывается на существование оптимальной клеточной плотности при инфицировании для продуцирования аденовируса. Оптимум составляет 0,5-1106 клеток/мл (Maranga et al., 2005; Kamen et al., 2004). Для продуцировании аденовируса (Ad5) в биореакторе с механическим перемешиванием для периодического производства было показано, что выход вируса на клетку остается постоянным при уровне приблизительно 0,9106 клеток/мл, но резко падает при уровне приблизительно 1106 клеток/мл (Altaras et al.,2005). При уровне свыше 2106 клеток/мл инфекционные частицы не выявлялись. Переходная точка, связанная с падением удельного продуцирования в зависимости от клеточной плотности при инфицировании, зависит от среды. До настоящего времени ни одна из доступных коммерческих сред не продемонстрировала потенциал в отношении поддержания высоких выходов вирусных частиц при сохранении оптимального удельного продуцирования при клеточной плотности свыше 1106 клеток/мл (Kamen et al.,2004). Причины этого падения в настоящее время неизвестны, однако оно может быть следствием ограниченной доступности питательных веществ для продуцирования вируса или следствием высоких концентраций метаболитов, которые являются ингибиторными для продуцирования вируса. Процессы с подпиткой, такие как добавление глюкозы, глутамина и аминокислот, позволили инфицирование при клеточной плотности вплоть до 2106 клеток/мл. Однако, выход, достигаемый при высокой плотности клеток, был ниже, чем выход, достигаемый при инфицировании при плотности клеток 1106 клеток/мл (Kamen et al., 2004). В перфузионных процессах клетки удерживают в биореакторе полыми волокнами, центробежными фильтрами или акустическими сепараторами, в то время как культуральную среду перфузируют через биореактор. В этих процессах иногда можно достигать плотности клеток 100106 клеток/мл (например,Yallop et al., 2005). Инфицированные клетки перфузионной культуры продемонстрировали преждевременную потерю клеток в ходе перфузии в системе с полыми волокнами. Это может быть связано с их более высокой чув-1 023816 ствительностью к сдвиговым усилиям вследствие вирусной инфекции (Cortin et al., 2004). Наиболее вероятной причиной этого явления были гидродинамические нагрузки, индуцируемые в трубах, полых волокнах или в перистальтическом насосе на более уязвимые инфицированные клетки. Поскольку инфицированные клетки являются более уязвимыми, было предположено, что, если на протяжении фазы инфицирования необходимо поддерживать перфузию, является желательным, в частности, акустический сепаратор (Henry et al., 2004). Однако, инфекции, осуществленные в перфузионном режиме, могли поддерживаться только для плотностей клеток вплоть до 3106 клеток/мл со скоростью перфузии 2 об/сутки. Инфицирование при клеточной плотности 6106 клеток/мл приводило к пятикратному снижению удельной продуктивности(Henry et al., 2004). Несмотря на описанный в других источниках эффект клеточной плотности, в одном сообщении(Yuk et al., 2004) описаны успешные перфузионные культуры на опухолевых клетках человека в качестве платформы для продуцирования онколитических аденовирусных векторов. В этом сообщении описан перфузионный процесс с высокой плотностью клеток с использованием технологии переменного тангенциального потока (ATF). При средней плотности жизнеспособных клеток при инфицировании 9106 клеток HeLaS3/мл наблюдали средний титр вируса приблизительно 41011 VP/мл. Опухолевые клетки, использованные в этом сообщении, не являются предпочтительными в качестве продуцирующих клеток,поскольку использование опухолевых клеток может представлять угрозу безопасности, когда продуцированные аденовирусные частицы подлежат введению человеку. Рекомбинантный аденовирус в этом сообщении был основан на Ad5. Возможности применения таких аденовирусов в качестве вакцин ограничены, поскольку основная часть человеческой популяции имеет предсуществующие нейтрализующие антитела против Ad5, и, таким образом, в качестве вакцин более пригодны рекомбинантные аденовирусы других серотипов (см. например WO 00/70071). Рекомбинантные аденовирусы, особенно преимущественные для применения в качестве вакцин, включают Ad26 (WO 00/70071). Для крупномасштабного продуцирования рекомбинантных аденовирусов, отличных от Ad5, в частности для преимущественного серотипа 26, доступна ограниченная информация, если вообще доступна. Некоторые отличия между крупномасштабным продуцированием Ad35 и Ad5 были описаны ранее, например в РСТ/ЕР 2009/064265. В некоторой степени отличающиеся физические свойства рекомбинантных аденовирусов различных серотипов могут привести к различиям в способах продуцирования. Такие потенциальные отличия могут быть особенно важными при промышленном масштабе, где даже вроде бы небольшие отличия при мелком масштабе могут иметь большие экономические последствия в масштабе,предусматриваемом для продуцирования согласно ежегодной мировой потребности. Например, заявителем было показано, что описанный эффект плотности клеток для Ad5 был отличным для Ad35(PCT/EP2009/064265). Таким образом, rAd35 размножается иным образом в продуцирующих клетках,чем rAd5, в ходе процессов крупномасштабного продуцирования. Очевидно, размножение аденовирусов из различных серотипов очень непредсказуемо. Чтобы удовлетворить мировую потребность в вакцинах на основе рекомбинантного аденовируса серотипа 26 (rAd26), существует необходимость в усовершенствовании систем продуцирования rAd26. Настоящее изобретение относится к усовершенствованным способам промышленного продуцирования rAd26. Сущность изобретения В рамках настоящего изобретения авторы изобретения открыли, что еще один серотип, т.е. Ad26,имеет поведение, отличное от других серотипов Ad5 и Ad35. Действительно, Ad26 имеет тенденцию к демонстрации небольшого эффекта клеточной плотности, но не настолько выраженного, как эффект плотности, наблюдаемый для Ad5. Кроме того, клетки, инфицированные Ad26, имеют тенденцию к дальнейшему росту после инфицирования, в то время как клетки, инфицированные Ad35, демонстрируют сниженный рост после инфицирования. Эти результаты вновь указывают на то, что, возможно, процессы для конкретных серотипов аденовируса необходимо точно отрегулировать для каждого серотипа в целях получения оптимальных результатов. Настоящее изобретение относится к оптимизированной системе для продуцирования rAd26 с точки зрения выхода, качества полученного rAd26 и простоты манипулирования собранным материалом для последующей переработки. Изобретение относится к способу продуцирования по меньшей мере 11012 вирусных частиц(VP)/мл E1-дефицитного аденовируса серотипа 26 (rAd26), причем отношение абсолютного количества вирусных частиц к инфекционным частицам VP/IU составляет менее 20:1, причем способ включает:b) инфицирование указанных клеток посредством rAd26 при плотности от 10106 до 16106 жизнеспособных клеток/мл посредством rAd26;c) дальнейшее культивирование инфицированных клеток с помощью перфузионной системы для размножения указанного rAd26 до достижения концентрации по меньшей мере 11012 вирусных частицd) сбор вирусных частиц указанного rAd26. В определенных вариантах осуществления указанные клетки на стадии b) инфицируют rAd26 при плотности приблизительно от 10106 до 14106 жизнеспособных клеток/мл. В определенных предпочтительных вариантах осуществления указанная перфузионная система на стадии с) представляет собой перфузионную систему переменного тангенциального потока (ATF). В других предпочтительных вариантах осуществления способ дополнительно включает е) очистку вирусных частиц rAd26. В определенных вариантах осуществления указанный рекомбинантный аденовирус лишен по меньшей мере части Е 1 А или Е 1 В области Е 1. В других предпочтительных вариантах осуществления указанная перфузионная система на стадии а) представляет собой перфузионную систему переменного тангенциального потока (ATF). Также аспектом изобретения является способ, в котором стадию а) проводят в биореакторе для предварительного культивирования, и стадии b) и с) проводят в биореакторе для продуцирования. Также изобретение относится к применению биореактора в указанном способе, где указанный биореактор имеет рабочий объем от 2 до 1000 л, и содержит культуральную среду, клетки PER.C6 и вирусные частицы rAd26 в концентрации по меньшей мере 11012 VP/мл. В определенных вариантах осуществления указанный биореактор соединен с перфузионной системой ATF. Краткое описание фигур Фиг. 1 - инфицирование при высокой плотности клеток посредством rAd5 во вращающихся флаконах. Фиг. 2 - инфицирование при высокой плотности клеток во вращающихся флаконах и 2 л биореакторе посредством rAd35.TB-S. Фиг. 3 - инфицирование при высокой плотности клеток во вращающихся флаконах посредствомrAd26. Фиг. 4 - рост клеток после инфицирования посредством rAd26. Фиг. 5 - рост клеток после инфицирования посредством rAd35. Подробное описание изобретения Настоящее изобретение относится к новому способу продуцирования больших количеств рекомбинантного аденовируса rAd26. Этот оптимизированный способ основан на возможности инфицирования культуры при высокой плотности клеток с сохранением высокого выхода вируса на клетку. Посредством этого обеспечивается способ получения раствора с собранным вирусом с высокой концентрацией вируса в одном биореакторе. Типичный выход данных процессов для rAd26 составляет приблизительно 2-31011VP/мл. Действительно, полагают, что с использованием способов по настоящему изобретению можно получать очень большие количества частиц rAd26, например количества по меньшей мере приблизительно 51011 VP/мл, предпочтительно по меньшей мере приблизительно 6, 7, 8 или 91011 VP/мл. Предпочтительно продуцируют по меньшей мере 11012 VP/мл rAd26, более предпочтительно по меньшей мере 1,51012 VP/мл, еще более предпочтительно по меньшей мере 21012 VP/мл, например приблизительно от 11012 до 51012 VP/мл. Как правило, этот способ обеспечивает более чем приблизительно 1 1013 VP/мл rAd26. Выходы, которые могут быть достигнуты с помощью способов в соответствии с настоящим изобретением, вероятно, являются достаточными для получения желаемого в мире количества определенных вакцин на основе rAd26 без потребности в биореакторных установках с рабочими объемами более 1000 л. Изобретение относится к способу продуцирования рекомбинантного аденовируса серотипа 2 6(rAd26), причем способ включает: а) культивирование клеток-продуцентов в суспензии с помощью перфузионной системы; b) инфицирование указанных клеток при плотности по меньшей мере 10106 жизнеспособных клеток/мл посредством rAd26; с) дальнейшее культивирование инфицированных клеток с помощью перфузионной системы для размножения указанного rAd26 и d) сбор указанного rAd26. В определенных вариантах осуществления указанные клетки на стадии b) инфицируют rAd26 при плотности приблизительно между 10106 и 50106 жизнеспособных клеток/мл. В следующих вариантах осуществления указанные клетки на стадии b) инфицируют rAd26 при плотности приблизительно между 10106 и 20106 жизнеспособных клеток/мл. В других преимущественных вариантах осуществления указанные клетки на стадии b) инфицируют rAd26 при плотности приблизительно между 10106 и 16106 жизнеспособных клеток/мл, например при приблизительно 10, 11, 12, 13, 14 или 15106 жизнеспособных клеток/мл. Клетки-продуценты и рекомбинантный аденовирус. Клетка-продуцент (иногда также называемая в данной области и в настоящем описании "упаковывающей клеткой", или "комплементирующей клеткой", или "клеткой-хозяином") в соответствии с настоящим изобретением может представлять собой любую клетку-продуцента, в которой может размножаться желаемый аденовирус. Например, размножение рекомбинантных аденовирусных векторов прово-3 023816 дят в клетках-продуцентах, которые комплементируют дефекты аденовирусов. Такие клетки-продуценты предпочтительно имеют в их геноме по меньшей мере последовательность Е 1 аденовируса, и, тем самым, способны комплементировать рекомбинантные аденовирусы с делецией области El. Кроме того,аденовирус может иметь делецию в области Е 3, которая является необязательной для генома Ad, и, таким образом, такая делеция не должна быть комплементирована. Можно использовать любую комплементирующую Е 1 клетку-продуцент, такую как клетки сетчатки человека, иммортализованные с помощью Е 1, например клетки 911 или PER.C6 (см. патент США 5994128), трансформированные Е 1 амниоциты (см. патент ЕР 1230354), трансформированные Е 1 клетки А 549 (см., например, WO 98/39411, патент США 5891690), GH329:HeLa (Gao et al., 2000, Human Gene Therapy 11: 213-219), 293, и т.п. В определенных вариантах осуществления клетки-продуценты представляют собой, например, клетки HEK293,или клетки PER.C6, или клетки 911, или клетки IT293SF и т.п. Предпочтительно в качестве клетокпродуцентов используют клетки PER.C6 (депонированные 29 февраля 1996 г. под номером депозита ЕСАСС 96022940 в European Collection of Cell Cultures, CAMR, Salisbury, Wiltshire, Великобритания; см. патент США 5994128), или клетки, происходящие из них. В настоящем описании показано, что рекомбинантный аденовирус серотипа 35 (rAd35) обладает прежде неизвестными преимущественными свойствами по сравнению с rAd5 в способах с использованием инфицирования при высокой плотности клеток. Также авторы настоящего изобретения открыли, что другой серотип (rAd26) также ведет себя иначе в сходных процессах по сравнению с упомянутыми выше серотипами, указывая на то, что для различных серотипов необходимо устанавливать оптимальные условия для крупномасштабного продуцирования рекомбинантного аденовируса. Аденовирус по настоящему изобретению представляет собой rAd26. Предпочтительно аденовирусный вектор имеет дефект по меньшей мере одной необходимой функции гена области Е 1, например области Е 1 а и/или области Elb, аденовирусного генома, которая необходима для вирусной репликации. В определенных вариантах осуществления вектор имеет дефицит по меньшей мере одной необходимой функции гена области Е 1 и по меньшей мере части необязательной области Е 3. Аденовирусный вектор может иметь "множественный дефицит", что означает, что аденовирусный вектор является дефицитным по одной или нескольких необходимым функциям генов в каждой из двух или более областей аденовирусного генома. Например, указанные выше Е 1-дефицитные или Е 1-,Е 3-дефицитные аденовирусные векторы могут быть далее дефицитными по меньшей мере по одному необходимому гену области Е 4 и/или по меньшей мере одному необходимому гену области Е 2 (например, области Е 2 А и/или области Е 2 В). Аденовирусные векторы с делецией всей области Е 4 могут индуцировать более низкий иммунный ответ у хозяина. Примеры пригодных аденовирусных векторов включают аденовирусные векторы, которые лишены (а) всей области Е 1 или ее части и всей области Е 2 или ее части, (b) всей области Е 1 или ее части, всей области Е 2 или ее части и всей области Е 3 или ее части, (с) всей области Е 1 или ее части, всей области Е 2 или ее части, всей области Е 3 или ее части и всей области Е 4 или ее части,(d) по меньшей мере части области Е 1 а, по меньшей мере части области Elb, по меньшей мере части области Е 2 а и по меньшей мере части области Е 3, (е) по меньшей мере части области Е 1, по меньшей мере части области Е 3 и по меньшей мере части области Е 4, и (f) всех необходимых аденовирусных продуктов генов (например, аденовирусные ампликоны, содержащие только ITR и сигнал для упаковывания). Как известно специалисту в данной области, в случае делеций необходимых областей из генома аденовируса, функции, кодируемые этими областями, должны быть предоставлены после переноса предпочтительно продуцирующей клеткой, т.е., когда из аденовируса удалены части или целые области El, E2 и/или Е 4, они должны присутствовать в продуцирующей клетке, например встроены в ее геном или в форме так называемого аденовируса-помощника или плазмид-помощников. В следующих вариантах осуществления аденовирус по изобретению лишен по меньшей мере части области Е 1, например кодирующих последовательностей Е 1 А и/или Е 1 В, и, кроме того, содержит гетерологичную нуклеиновую кислоту. Пригодная гетерологичная нуклеиновая кислота хорошо известна специалисту в данной области и, например, может включать открытые рамки считывания трансгенов,например открытые рамки считывания, кодирующие полипептиды, против которых является желательным иммунный ответ, когда вектор rAd используют для вакцинации, например трансгены, пригодные для индукции иммунного ответа против малярии (см. например WO 2004/055187), ВИЧ, туберкулеза(см., например, WO 2006/053871), определенных вирусов и т.д., все из которых хорошо известны специалисту в данной области. В действительности, природа гетерологичной нуклеиновой кислоты не является критичной для настоящего изобретения, она может представлять собой любую гетерологичную нуклеиновую кислоту и, таким образом, не нуждается в дальнейшем уточнении в настоящем описании. Специалисту в данной области известно о возможности размножения аденовирусных векторов различных серотипов в конкретных клетках-хозяевах с использованием способов, например, таких как описаны в патенте США 6492169 или в WO 03/104467 и ссылках в них. Например, для размножения rAd26 с дефицитом Е 1 можно конструировать конкретные продуцирующие клетки, которые экспрессируют Е 1 В 55 К Ad26, например, на основе существующих продуцирующих клеток, которые экспрессируют Е 1 А и Е 1 В Ad5, таких как клетки PER.C6 или HEK293 (см., например, US 6492169), как известно специалисту в данной области. Альтернативно и предпочтительно, можно использовать существующие (Ad5-) компле-4 023816 ментирующие клеточные линии, например, такие как PER.C6 или HEK293 без модификации клеток для размножения rAd26 с дефицитом Е 1, путем включения кодирующей последовательности E4-orf6 из Ad5 в вектор rAd26, как подробно описано, например, в WO 03/104467, включенной в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме. Таким образом, размножение аденовирусных векторов любого серотипа можно проводить на продуцирующих клетках с использованием средств и способов, хорошо известных специалисту в данной области. Аденовирусные векторы, способы их конструирования и способы их размножения хорошо известны в данной области и описаны, например, в патентах США 5559099, 5837511, 5846782, 5851806, 5994106, 5994128, 5965541, 5981225, 6040174, 6020191 и 6113913, иThomas Shenk, "Adenoviridae and their Replication", M. S. Horwitz, "Adenoviruses", главы 67 и 68 соответственно, Virology, В. N. Fields et al., eds., 3d ed., Raven Press, Ltd., New York (1996) и других ссылках,упомянутых в настоящем описании. Конструирование аденовирусных векторов хорошо понятно в данной области и вовлекает применение стандартных методик молекулярной биологии, таких как методики, описанные, например, в Sambrook et al., Molecular Cloning, a Laboratory Manual, 2d ed., Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor,N.Y. (1989), Watson et al., Recombinant DNA, 2d ed., Scientific American Books (1992), и Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers, NY (1995) и других ссылках, упомянутых в настоящем описании. Клетки-продуценты согласно изобретению культивируют для увеличения количеств клеток и вирусов и/или титров вирусов. Культивирование клетки проводят для обеспечения метаболизма и/или роста,и/или деления, и/или продуцирования представляющего интерес вируса согласно изобретению. Это можно осуществлять способами, по существу, известными в данной области, и они включают, но не ограничивается этим, предоставление питательных веществ для клетки, например, в подходящей культуральной среде. Можно использовать различные культуральные среды, и выбор оптимальной клеточной культуральной среды для клеток и используемых условий является частью повседневных задач специалиста в данной области. Таким образом, пригодные культуральные среды для целей настоящего изобретения хорошо известны специалисту в данной области и их, главным образом, можно получить из коммерческих источников в больших количествах или они могут быть выполненными на заказ в соответствии со стандартными протоколами. Культивирование можно проводить, например, в чашках, вращающихся флаконах или в биореакторах с использованием периодических, периодических с подпиткой, непрерывных систем и т.п. Для достижения крупномасштабного (непрерывного) продуцирования вируса с помощью клеточной культуры в данной области предпочтительно иметь клетки, способные расти в суспензии, и предпочтительно иметь клетки, способные к культивированию в отсутствие происходящей из животного или человека сыворотки или компонентов происходящей из животного или человека сыворотки. Пригодные условия для культивирования клеток известны (см., например, Tissue Culture, Academic Press, Kruse and Paterson, editors (1973), и R.I. Freshney, Culture of animal cells: A manual of basictechnique, fourth edition (Wiley-Liss Inc., 2000, ISBN 0-471-34889-9). Клеточная культуральная система и перфузионная система. Биореакторы широко используют для крупномасштабного продуцирования биологических продуктов из суспензионных культур клеток животных. Согласно изобретению биореакторы, используемые для размножения аденовируса, могут представлять собой, например, смесительные емкости, одноразовые биореакторы, аэролифтные реакторы и т.п. Согласно определенным вариантам осуществления настоящего изобретения биореактор представляет собой смесительную емкость. Согласно определенным вариантам осуществления изобретения биореактор имеет рабочий объем приблизительно между 2 и 2000 л, причем значение этого диапазона включает указанные верхнюю и нижнюю предельные величины, т.е. 2 л является наименьшим рабочим объемом и 2000 л является наибольшим рабочим объемом. Термин "приблизительно" для числовых величин, как используют в настоящем описании, означает эту величину 10%. В определенных предпочтительных вариантах осуществления рабочий объем составляет между 10 и 1000 л, предпочтительно между 20 и 800 л, например между 30 и 600 л, например между 50 и 500 л, например приблизительно 250 л или приблизительно 500 л. Преимущество использования биореакторов с рабочим объемом согласно изобретению состоит в том, что избегают использования биореакторов с очень большим объемом, т.е. биореакторов с рабочим объемом,значительно превышающим 2000 л, предпочтительно 1000 л, и, таким образом, не требуется очень больших вложений капитала и времени для конструирования такого очень большого биореактора. Кроме того, продукт, т.е. rAd, является значительно более концентрированным, когда используют способы по настоящему изобретению, которые экономят время и расходы на сбор и/или дальнейшую переработку rAd из биореакторов. Рабочий объем представляет собой эффективный объем культуры в биореакторе. Смесительные емкости, как правило, имеют отношение высоты к диаметру от 1:1 до 3:1. Культуру обычно смешивают с помощью одного или нескольких смесителей на основе дисков с лезвиями или паттернов гребного винта. Описаны смесительные системы, обеспечивающие меньшие сдвиговые усилия, чем лезвия. Смешение может запускаться либо прямо, либо непрямо с помощью соединенных магнитом приводов. Непрямые приводы снижают риск микробной контаминации посредством изоляции на валах мешалки. Оборудование и управление указанных биореакторов включают (но не ограничиваются ими): управ-5 023816 ление перемешиванием, температурой, растворенным кислородом, рН и бимассой. Перемешивание, рН,температура, концентрация растворенного кислорода клеточной культуральной среды, в принципе, не являются критичными и зависят от типа выбранной клетки. Предпочтительно перемешивание, рН, температуру, концентрацию растворенного кислорода выбирают так, чтобы они были оптимальными для роста клеток. Специалисту в данной области известно, как найти оптимальные перемешивание, рН, температуру, концентрацию растворенного кислорода для культивирования. Как правило, оптимальное перемешивание проводят при 50 и 300 об/мин, например 100-250 об/мин, оптимальное значение рН составляет от 6,7 до 7,7, оптимальная температура составляет от 30 до 39 С, например 34, 35, 36, 37 или 38 С. Большинство крупномасштабных суспензионных культур работают в качестве периодических процессов или периодических процессов с подпиткой, поскольку они наиболее просты для управления и масштабирования. Однако, непрерывные процессы на основе перфузионных принципов становятся более распространенными. В соответствии с настоящим изобретением продуцирующие клетки культивируют в перфузионной системе. Перфузионное культивирование клеток имеет его общепринятое значение в данной области, т.е. оно означает, что в процессе культивирования клетки удерживаются в устройстве для разделения, в котором имеется выход жидкости, имеющей более низкую плотность клеток, чем перед разделением, и в котором имеется приток клеточной культуральной среды. Использование перфузионной культуры является решением задачи выращивания клеток с высокой плотностью (например 10-50106 жизнеспособных клеток/мл). Для увеличения плотности выше 2-4106 жизнеспособных клеток/мл, среду постоянно, или периодически, заменяют свежей подаваемой средой для компенсации дефицита питательных веществ и для удаления токсических продуктов. Перфузия также позволяет лучший контроль условий культивирования (рН, dO2, уровни питательных веществ, и т.д.). Перфузии свежей среды через культуру можно достигать путем удержания клеток в различных устройствах для разделения (например,центробежный фильтр с мелкой сеткой, мембранные фильтры с полыми волокнами или мембранные фильтры в виде плоских пластин, трубки для осаждения). В предпочтительных вариантах осуществления способа по настоящему изобретению устройство для разделения представляет собой фильтрующий модуль, содержащий полые волокна. Под термином "полое волокно" понимают трубчатую мембрану. Внутренний диаметр трубки предпочтительно составляет между 0,3 и 6,0 мм, более предпочтительно между 0,5 и 3,0 мм, наиболее предпочтительно между 0,5 и 2,0 мм. В определенных вариантах осуществления размер сита (размер пор) в мембране выбирают так, чтобы размер пор в сите был близок к диаметру клеток, обеспечивая высокое удержание клеток, в то время как клеточный дебрис может проходить через фильтр. В других вариантах осуществления размер сита является существенно меньшим, чем диаметр клеток. Предпочтительно размер сита составляет приблизительно 0,1-30 мкм, например от 0,1 до 3 мкм, например приблизительно 0,2 мкм. Фильтрующие модули, содержащие полые волокна, коммерчески доступны, например, от GeneralElectric (ранее Amersham). В ходе процесса по настоящему изобретению не наблюдали значительных количеств аденовирусных частиц в выходящей культуральной среде, несмотря на то что вирусные частицы имеют меньшие размеры, чем используемый размер сита. Перфузию используют для поддержания желаемых уровней определенных метаболитов и для удаления и, тем самым, снижения примесей в культуральной среде. Скорость перфузии можно измерять различными путями, например, в значениях объемов на замену/единица времени или в значениях уровней определенных метаболитов, которые должны поддерживаться, в процессе периодов перфузии. Обычно, перфузию не проводят все время в процессе культивирования и, как правило, ее проводят только время от времени в процессе культивирования, как желательно. Например, перфузию обычно не начинают до тех пор, пока определенные компоненты среды, такие как глюкоза, не начинают истощаться и не становится необходимым их заменить. В данной области известно несколько перфузионных систем, и они, в принципе, пригодны для способов по настоящему изобретению. Под термином "перфузионная система" подразумевают комбинацию биореактора, соединенного с устройством для разделения. Устройство для разделения может либо быть включено в биореактор (например, центробежный фильтр с мелкой сеткой), либо оставаться вне биореактора (например полые волокна). В обоих случаях, как объяснено выше, устройство для разделения препятствует вымыванию клеточной массы из реактора и обеспечивает обновление среды. Авторы настоящего изобретения провели предварительные эксперименты с несколькими перфузионными системами, среди которых перфузионная система переменного тангенциального потока (ATF) дала наилучшие результаты. Таким образом, в предпочтительном варианте осуществления изобретения биореакторы работают (соединены) с перфузионной системой ATF (например, ATF System, Refine Technology, Co., East Hanover, NJ). Эта система состоит из диафрагменного насоса, вмонтированного в один конец корпуса с полыми фибрами. Другой конец корпуса соединен с узлом сочленения, который, в свою очередь, соединен с биореактором через доступное отверстие. Диафрагменный насос и контролирующая система служат для создания переменного тангенциального потока через полые волокна. Это означает,что существует один поток в том же направлении (т.е. тангенциальный), что и поверхности мембран полых волокон, который течет вперед и назад, и что существует поток в направлении, по существу, пер-6 023816 пендикулярном указанной поверхности фильтра. Тангенциальный поток может быть достигнут согласно способам, известным специалисту в данной области, и как описано, например, в US 6544424. Работа перфузионной системы ATF была описана (Furey, 2002). Системы ATF позволяют культивирование клеток в течение более длительного периода времени и достижение высокой плотности клеток без наличия блокированного фильтра. Действительно, с использованием перфузионной системы ATF можно достигать чрезвычайно высокой плотности клеток свыше 100106 жизнеспособных клеток/мл,например в случае клеток PER.C6 (см. например Yallop et al.). Однако, в более ранних сообщениях клетки PER.C6 в перфузионных системах использовали для совершенно другой цели и не инфицировали аденовирусом. Дополнительное преимущество системы ATF состоит в том, что эта система создает низкое напряжение сдвига. Энергия подается к поверхности жидкости, создавая ламинарный поток с низким сдвигом. Это может быть преимуществом особенно для настоящего изобретения, где клетки инфицированы аденовирусом. В процессе перфузии, после инфекции, с помощью системы ATF не было выявлено снижения клеточной плотности и не наблюдали преждевременной утраты клеток, но скорее наблюдали даже клеточный рост. Поскольку клетки остаются неизмененными, создаются оптимальные условия для размножения вируса. Таким образом, перфузия с помощью системы ATF является преимущественной в фазу предварительного культивирования (стадия в соответствии с настоящим изобретением), поскольку она позволяет достигнуть очень высокой клеточной плотности, и клетки находятся в хорошем состоянии для последующего инфицирования аденовирусом, что, возможно, вносит вклад в высокие достигнутые выходы. Для достижения указанной высокой плотности клеток культуральную среду в определенных вариантах осуществления по меньшей мере частично подвергают перфузии в течение периода времени в процессе клеточного роста продуцирующих клеток (стадия а). В определенных вариантах осуществления перфузию начинают после достижения клеточной плотности от 2106 жизнеспособных клеток/мл до 8106 жизнеспособных клеток/мл. Кроме того, перфузия с помощью системы ATF является преимущественной после стадии инфицирования (стадия с в соответствии с настоящим изобретением), поскольку она позволяет получить очень высокие выходы аденовируса из инфицированных клеток. Таким образом, в предпочтительных вариантах осуществления как на стадии предварительного культивирования, так и на стадии после инфицирования в способах по изобретению используется перфузионная система ATF. Объем культуральной среды, используемый в процессе ATF, может варьировать в соответствии с потребностями клеток, как может легко установить и скорректировать квалифицированный специалист, и, как правило, он варьирует в диапазоне 0,5-5 об./сутки, например между 1 и 3 об./сутки, например приблизительно 2 об./сутки. В определенных преимущественных вариантах осуществления скорость обновления составляет приблизительно между 1 и 2 об./сутки, поскольку авторы изобретения продемонстрировали в настоящем описании, что это обеспечивает очень хорошие результаты с точки зрения выхода и качества полученногоrAd26, и в то же время расход среды в единицу времени и, таким образом, затраты, связанные с ним, тем не менее, являются умеренными. Наконец, перфузионная система ATF является масштабируемой системой. Доступны элементы ATF разного размера. Поскольку для пропускания культуры через мембрану с полыми волокнами используется поток воздуха, можно создать очень высокие скорости тангенциального потока с низким сдвигом,обеспечивающие использование этой технологии от RD до масштаба продуцирования вплоть до 1000 л(Furey, 2002). Возможно, дальнейшая разработка позволит еще больше увеличение масштаба перфузионной системы ATF. В Yuk et al. rAd5 продуцируют с использованием опухолевой клеточной линии и весь процесс проводят в одном биореакторе, что отнимает приблизительно 8-10 суток в биореакторе для продуцирования. В определенных вариантах осуществления настоящего изобретения используют два различных биореактора: один для предварительного культивирования (стадия а; биореактор для предварительного культивирования), и один для инфицирования (стадия b) и культивирования после инфицирования (стадия с; биореактор для продуцирования) клеток. Преимущество использование двух отдельных биореакторов для этих стадий состоит в том, что требуется только приблизительно 1,5-6, как правило, приблизительно 4-5 суток культивирования в биореакторе для продуцирования, и, таким образом, в год можно проводить значительно больше циклов. Добавление большого количества свежей культуральной среды в процессе инфицирования, кроме того, является преимущественным для уменьшения объема культуральной среды,требуемого в ходе перфузии в биореакторе для продуцирования. В альтернативных вариантах осуществления также возможно проводить все стадии а-с по изобретению в одном биореакторе. Инфицирование. В способах по изобретению продуцирующие клетки инфицируют рекомбинантным аденовирусом. Как правило, вирус предоставляют соответствующей продуцирующей клетке в оптимальных условиях,позволяющих захват вируса. Оптимальные условия зависят от типа клетки и от типа выбранного аденовируса. Специалисту в данной области известно, как определить оптимальные условия, а именно для(MOI). Как правило, оптимальное перемешивание проводят при приблизительно между 50 и 300 об/мин,как правило, при приблизительно 100-200, например приблизительно 150, обычно DO составляет 2060%, например 40%, оптимальное значение рН составляет между 6,7 и 7,7, оптимальная температура составляет между 30 и 39 С, например 34-37 С, и оптимальная MOI составляет между 5 и 1000, например приблизительно 50-300. Как правило, аденовирус инфицирует продуцирующие клетки самопроизвольно,и приведение продуцирующих клеток в контакт с частицами rAd является достаточным для инфицирования клеток. Как правило, исходный раствор с исходным аденовирусом добавляют в культуру для инфицирования, а затем аденовирус размножается в продуцирующих клетках. Все это является стандартным действием для специалиста в данной области. В определенном варианте осуществления настоящего изобретения перфузию останавливают перед инфицированием и возобновляют через приблизительно 1-20 ч, например 3-15 ч, например 5 ч после инфицирования. Эта задержка должна позволить вирусным частицам проникнуть в клетки и предотвратить вымывание вирусных частиц из системы. Скорости перфузии после инфицирования определяются по уровню глюкозы, который поддерживается с помощью перфузии. Например, в настоящем изобретении концентрацию глюкозы в среде обычно поддерживают на уровне приблизительно между 2 и 20 ммоль/л,как правило, приблизительно между 5 и 10 ммоль/л. Было возможно преимущественно инфицировать биореактор rAd26 при высокой плотности, т.е. выше 10106 жизнеспособных клеток/мл, при сохранении высокого выхода вируса на клетку. В определенных вариантах осуществления удельная продуктивность сохраняется на уровне приблизительно между 0,5105 и 1,5105 VP/клетка. Более того, в настоящем изобретении жизнеспособность клеточной культуры до инфицирования сохраняется на уровне выше 75%. Это означает, что по меньшей мере 75% всего количества клеток в культуре являются жизнеспособными в момент инифицирования. В определенных вариантах осуществления жизнеспособность клеточной культуры в момент инфицирования составляет по меньшей мере 80%, в следующих вариантах осуществления по меньшей мере 85%. Жизнеспособность можно определять с использованием общепринятых способов, доступных специалисту в данной области, например,исключения трипанового синего, подсчета клеток Casy, и т.п. В определенном варианте осуществления плотность клеток в момент инфицирования составляет приблизительно между 10106 и 50106 жизнеспособных клеток/мл, например приблизительно между 10106 и 20106 жизнеспособных клеток/мл, например приблизительно между 10106 и 15106 жизнеспособных клеток/мл, например приблизительно между 10106 и 14106 жизнеспособных клеток/мл. Эта клеточная плотность обеспечивает высокий выход вируса при ограниченном накоплении клеточного дебриса и ДНК клеток-хозяев, что обеспечивает преимущество этих вариантов осуществления при последующей переработке собранного аденовируса. Таким образом, настоящее изобретение относится к оптимизированному способу продуцирования rAd26, обеспечивающему высокие количества частиц rAd26 высокого качества, и в то же время обеспечивающему собранный материал, который, тем не менее, пригоден для целей последующей переработки. Инфицирование при этих плотностях клеток может обеспечивать еще более высокие концентрации рекомбинантного аденовируса, в частности rAd26, и превосходит выходы для rAd26, описанные до настоящего времени. Как показано впервые в рамках настоящего изобретения, в противоположность инфицированию rAd5 при высокой плотности (свыше 10106 жизнеспособных клеток/мл), инфицированиеrAd26 при плотностях свыше 10106 жизнеспособных клеток/мл, тем не менее, увеличивало объемный выход rAd26 при увеличении клеточных плотностей вплоть до по меньшей мере 16106 жизнеспособных клеток/мл при инфицировании, с использованием продуцирующих клеток в суспензии с перфузионной системой. В предпочтительном варианте осуществления изобретения предусмотрен способ продуцирования по меньшей мере 11012 вирусных частиц rAd26 (VP)/мл. Способы по настоящему изобретению позволяют выделение rAd26 с отношением физических частиц к инфекционным частицам менее 30:1, которое является важным параметром для аденовируса, который подлежит введению человеку. Его можно измерять в качестве отношения вирусная частица(VP)/инфекционная единица (IU), например, с использованием анализа QPA (Wang et al., 2005). Более низкое отношение является преимущественным, поскольку в таком случае меньше вирусных частиц необходимо вводить для инфицирования того же количества клеток. Текущие нормы FDA требуют, чтобы отношение VP/IU составляло менее 30:1, и, таким образом, способы по изобретению, описанные в настоящем описании, пригодны для получения больших количеств rAd26, которые удовлетворяют этому конкретному требованию. Авторы Yuk et al. (2004) описали более низкие абсолютные количества вирусных частиц, чем количества, описанные в настоящем описании, и, кроме того, отношение VP/IU для образцов, описанных Yuk et al. (2004), составляет приблизительно 100 (фиг. 2 А/2 В в Yuk et al., 2004). Напротив, авторы настоящего изобретения описывают более высокие абсолютные выходы и, более того,значительно лучшие отношения VP/IU, составляющие менее 20:1. Таким образом, в определенных предпочтительных вариантах осуществления способы по изобретению обеспечивают партии rAd26, которые имеют отношение VP/IU менее чем 20:1, например от приблизительно 20:1 до приблизительно 5:1. Способы сбора и лизиса клеток. После инфицирования аденовирусом вирус реплицируется внутри клетки и, тем самым, амплифицируется. Аденовирусная инфекция в конечном итоге приводит к лизису инфицированных клеток. Литические характеристики аденовируса, таким образом, позволяют два различных пути продуцирования вируса. Первый путь состоит в сборе вируса до лизиса клеток с использованием внешних факторов для лизиса клеток. Второй путь состоит в сборе супернатанта с вирусом после (практически) полного лизиса клеток продуцированным вирусом (см. например патент США 6485958, в котором описан сбор аденовируса без лизиса клеток-хозяев с помощью внешнего фактора). Для последнего пути требуется более длительное время инкубации для достижения полного лизиса клеток и, таким образом, высоких выходов вируса. Более того, постепенный выход содержимого клеток-хозяев в среду может быть вредоносным для целостности и выхода полученных вирусов. Таким образом, согласно изобретению предпочтительно использовать внешние факторы для активного лизиса клеток для сбора аденовируса. Способы, которые можно использовать для активного лизиса клеток, известны специалисту в данной области, и рассмотрены, например, в WO 98/22588, с. 28-35. Пригодными способами в этом отношении являются, например, замораживание-размораживание, сдвиговое напряжение в твердом состоянии,гипертонический и/или гипотонический лизис, сдвиговое напряжение в жидком состоянии, обработка ультразвуком, экструзия высокого давления, лизис детергентом, комбинации вышесказанных способов и т.п. В одном варианте осуществления изобретения клетки подвергают лизису с использованием по меньшей мере одного детергента. Использование детергента для лизиса имеет преимущество в том, что оно представляет собой простой способ, который легко масштабируется. Детергенты, которые можно использовать, и способ их использования, главным образом, известны специалисту в данной области. Несколько примеров, например, рассмотрены в WO 98/22588, с. 29-33. Детергенты, как используют в рамках изобретения, могут включать анионные, катионные, цвиттерионные и неионные детергенты. Специалисту в данной области очевидно, что концентрация детергента может варьировать, например, в диапазоне приблизительно 0,1-5% мас./мас. В одном варианте осуществления используемым детергентом является Triton Х-100. Для удаления контаминирующих нуклеиновых кислот, т.е., главным образом, нуклеиновых кислот продуцирующих клеток можно использовать нуклеазу. Иллюстративные нуклеазы, пригодные для применения в настоящем изобретении, включают Benzonase, Pulmozyme или любую другую ДНКазу и/или РНКазу, обычно используемую в данной области. В предпочтительных вариантах осуществления нуклеаза представляет собой Benzonase, которая быстро гидролизует нуклеиновые кислоты путем гидролиза внутренних фосфодиэфирных связей между конкретными нуклеотидами, тем самым снижая вязкость клеточного лизата. Benzonase можно коммерчески приобретать от Merck KGaA (код W214950). Концентрация, в которой используют нуклеазу, предпочтительно находится в диапазоне 1-100 единиц/мл. Способы сбора аденовируса из культур продуцирующих клеток подробно описаны в WO 2005/080556. В соответствии с настоящим изобретением время сбора составляет приблизительно между 24 и 120 ч после инфицирования, например приблизительно между 48 и 96 ч после инфицирования, например 72 ч после инфицирования. Способы очистки. В определенных вариантах осуществления собранный аденовирус далее очищают. Очистку аденовируса можно проводить на нескольких стадиях, включающих процеживание, ультрафильтрацию, диафильтрацию или разделение с помощью хроматографии, как описано, например, вWO 05/080556, включенной в настоящее описание в качестве ссылки. Процеживание проводят с помощью стадии фильтрации, удаляющей клеточный дебрис и другие примеси из клеточного лизата. Ультрафильтрацию используют для концентрации раствора вируса. Диафильтрация или замена буфер с использованием ультрафильтров является способом удаления и замены солей, сахаров и т.п. Специалисту в данной области известно, как найти оптимальные условия для каждой стадии очистки. Также в WO 98/22588, включенной в настоящее описание в качестве ссылки, описаны способы продуцирования и очистки аденовирусных векторов. Способы включают выращивание клеток-хозяев, инфицирование клеток-хозяев аденовирусом, сбор и лизис клеток-хозяев, концентрирование неочищенного лизата, замену буфера неочищенного лизата, обработку лизата нуклеазой и дальнейшую очистку вируса с использованием хроматографии. Очистку, например, можно проводить центрифугированием в градиенте плотности, как описано,например, в WO 98/22588, с. 59-61. Однако, предпочтительно в очистке используется по меньшей мере одна стадия хроматографии, например, как описано в WO 98/22588, с. 61-70. Для дальнейшей очистки аденовирусов описано множество способов, где в способ включены стадии хроматографии. Специалисту в данной области известны эти способы, и он может варьировать точный способ использования стадий хроматографии для оптимизации способа. Например, можно очищать аденовирусы с помощью стадий анионообменной хроматографии, см. например WO 05/080556. Для очистки аденовируса предпочтительно использовать по меньшей мере одну стадию анионообменной хроматографии. После стадии анионообменной хроматографии вирус может быть достаточно чистым. Однако, в определенных вариантах осуществления далее проводят стадию эксклюзионной хроматографии для увеличения надежности способа. Эта стадия может быть до или после стадии анионообменной хроматографии. Очевидно, со стадией анионообменной хроматографии также можно пригодным образом комбинировать другие стадии очистки. Использование анионообменной хроматографии для очистки аденовируса подробно описано, и, таким образом, этот аспект находится в пределах досягаемости специалиста в данной области. Для очистки используют и пригодны множество различных хроматографических матриц, и специалист в данной области может легко найти оптимальный анионообменный материал для очистки вируса, например, руководствуясь перечисленными документами уровня техники. В патенте США 5837520 (также см. Huyghe et al., 1995, Human Gene Therapy 6: 1403-1416) описан способ очистки аденовируса, где лизат клетки-хозяина обрабатывают нуклеазой с последующей анионообменной хроматографией и аффинной хроматографией с ионами металлов. В патенте США 6485958 описано применение сильной анионообменной хроматографии для очистки рекомбинантного аденовируса. Анионообменную хроматографию для очистки аденовирусных частиц используют на колонках с псевдоожиженным слоем, см. WO 00/50573. Кроме того, анионообменная хроматография с восходящим движением жидкости и определенные хроматографические смолы для анионообменной хроматографии для очистки аденовирусных частиц описаны в патенте США 6586226. В дополнение к анионообменным колонкам, пригодны продукты анионообменной мембранной хроматографии, такие как продукты, производимые Pall (например, серии Mustang) и Sartorius (например серии Sartobind). Для применения этих фильтров и их преимуществ для очистки аденовируса см.,например, WO 03/078592 и WO 2005/080556. В патенте США 6537793 описана очистка аденовирусных частиц из клеток-хозяев с использованием ионообменной хроматографии, в частности описана предпочтительность хроматографической подложки типов Q Sepharose XL для этой цели. В одном варианте осуществления настоящего изобретения аденовирус далее очищают с использованием колонки Q Sepharose XL. В способе очистки может быть пригодным образом использована стадия эксклюзионной хроматографии. В международной заявке WO 97/08298 описана очистка аденовирусов с использованием определенных хроматографических матриц для предупреждения повреждения вирусов, включая анионообменную и эксклюзионную стадии. В патенте США 6261823 описан способ очистки аденовируса, где препарат аденовируса подвергают анионообменной хроматографии, а затем эксклюзионной хроматографии. На эксклюзионной стадии достигают группового отделения вирусных частиц от примесей с низкой молекулярной массой. Также можно использовать гидроксиапатитный носитель для очистки аденовируса, см. WO 02/44348. Также можно использовать стадию обращенно-фазовой адсорбции, как описано, например, в WO 03/097797, с. 26. В международной заявке WO 97/08298 описана очистка аденовирусов с использованием определенных хроматографических матриц для предупреждения повреждения вирусов, включая анионообменную и эксклюзионную стадии. Определенные способы ультрафильтрации также в высокой степени пригодны для очистки аденовируса, как описано в WO 2006/108707. Такие стадии можно проводить в дополнение к определенным стадиям хроматографической очистки или вместо них. Следующие преимущественные способы очистки аденовирусов из культур с высокой плотностью клеток описаны заявителем в заявках ЕР 09173090.3 и ЕР 09173119.0, поданных 15 октября 2009 г., обе из которых включены в настоящее описание в качестве ссылок в полном объеме. Получение фармацевтического препарата. В определенных вариантах осуществления очищенный аденовирус включают в состав фармацевтической композиции. Это можно осуществлять различными способами и с использованием различных буферов, все из них согласно общепринятым способам, хорошо известным специалисту в данной области. Как правило, это охватывает включение аденовирусных частиц в фармацевтически приемлемую композицию, содержащую аденовирус и по меньшей мере один фармацевтически приемлемый эксципиент. Такую композицию можно получать в условиях, известных специалисту в данной области, и в определенных вариантах осуществления она пригодна для введения человеку. Например, аденовирус можно подвергать замене буфера в ходе группового разделения на буфер,который также используется для мирового стандарта для аденовируса (Hoganson et al., Development of astable adenoviral vector formulation, Bioprocessing March 2002, p. 43-48): 20 мМ Tris pH 8, 25 мМ NaCl,2,5% глицерин, и в итоге хранить в нем. Очевидно, можно использовать множество других буферов, и несколько примеров подходящих составов для хранения и фармацевтического введения очищенных (адено)вирусных препаратов могут быть найдены, например, в патенте Европы 0853660 и в международных патентных заявках WO 99/41416,WO 99/12568, WO 00/29024, WO 01/66137, WO 03/049763. В определенных вариантах осуществления аденовирусные векторы используют в качестве вакцин,и они, как правило, содержатся в фармацевтически приемлемых носителях или эксципиентах и/или разбавителях. Фармацевтически приемлемые носители или эксципиенты и разбавители хорошо известны в данной области и их широко используют в широком диапазоне терапевтических продуктов. Предпочтительно используют носители, которые хорошо работают в вакцинах. Более предпочтительно вакцины, кроме того, содержат адъювант. Адъюванты известны в данной области для дальнейшего увеличения иммунного ответа на применяемую антигенную детерминанту, и фармацевтические композиции, содержащие аденовирус и адъювант на основе фосфата алюминия, описаны, например, в WO 2007/110409. Для введения человеку могут использоваться фармацевтические композиции по изобретению, содержащие rAd и фармацевтически приемлемый носитель или эксципиент. В данном контексте термин"фармацевтически приемлемый" означает, что носитель или эксципиент в используемых дозировках и концентрациях не вызовет каких-либо нежелательных или вредоносных эффектов у индивидуумов, которым их вводят. Такие фармацевтически приемлемые носители и эксципиенты хорошо известны в данной области (см. Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th edition, A. R. Gennaro, Ed., Mack PublishingCompany [1990]; Pharmaceutical Formulation Development of Peptides and Proteins, S. Frokjaer and L. Hovgaard, Eds., TaylorFrancis [2000]; и Handbook of Pharmaceutical Excipients, 3rd edition, A. Kibbe, Ed.,Pharmaceutical Press [2000]). Очищенный rAd предпочтительно изготавливают и вводят в качестве стерильного раствора, хотя в объем этого изобретения входит использование лиофилизированных препаратов. Стерильные растворы получают стерильной фильтрацией или с помощью других способов, по существу, известных в данной области. Затем растворы лиофилизируют и помещают в контейнеры с фармацевтическими дозами. рН раствора, как правило, находится в диапазоне между рН 3,0 и 9,5, например между рН 5,0 и 7,5. rAd, как правило, находится в растворе, имеющем пригодный фармацевтически приемлемый буфер, и раствор rAd также может содержать соль. Необязательно может присутствовать стабилизатор, такой как альбумин. В определенных вариантах осуществления добавляют детергент. В определенных вариантах осуществления rAd может быть изготовлен в виде инъецируемого препарата. Эти составы содержат эффективные количества rAd, представляют собой стерильные жидкие растворы, жидкие суспензии или лиофилизированные версии и необязательно содержат стабилизаторы или эксципиенты. Настоящее изобретение относится к способам продуцирования аденовирусных векторов, в частности rAd26, с очень высокими выходами, и, насколько известно авторам настоящего изобретения, полученные и описанные в настоящем описании выходы ранее не были описаны. В способах по изобретению используют биореакторы и биореактор с очень высоким количеством аденовирусных частиц на объем является непосредственным (промежуточным) продуктом по изобретению. Культуральная среда может представлять собой любую культуральную среду, пригодную для размножения клеток и инфицирования аденовирусом, как описано выше. Аспекты объема биореактора,продуцирующих клеток и количества частиц rAd26 и отношения VP/IU являются такими, как описано выше для способов по изобретению. В предпочтительных вариантах осуществления биореактор соединен с перфузионной системой ATF. В другом аспекте изобретение относится к способу продуцирования по меньшей мере 11012 вирусных частиц rAd26 (VP)/мл, причем способ включает: а) культивирование продуцирующих клеток в суспензии с помощью перфузионной системы; b) инфицирование указанных клеток при плотности от 10106 жизнеспособных клеток/мл до 15106 жизнеспособных клеток/мл посредством rAd26; с) дальнейшее культивирование инфицированных клеток с помощью перфузионной системы для размножения указанного rAd26, где концентрация вирусных частиц rAd26 достигает по меньшей мере 11012 VP/мл; иd) сбор указанного rAd26. До настоящего изобретения было неизвестно, являются ли такие высокие выходы rAd26 вообще осуществимыми, не говоря о том, как достигнуть таких высоких выходов. Настоящее изобретение показывает, что такие выходы возможны в соответствии со способами, описанными в настоящем описании. Предпочтительно отношение физических частиц к инфекционным частицам в собранном rAd26 составляет менее 30:1. Другие преимущественные варианты осуществления являются такими, как описано для способов в соответствии с изобретением, описанных выше. Кроме того, изобретение поясняется в следующих примерах. Примеры не ограничивают изобретение никоим образом. Они служат только для пояснения изобретения. Примеры Пример 1. Инфицирование при высокой плотности клеток вектором Ad5. Из рабочего банка клеток PER.C6 клетки размораживали и размножали в бессывороточной культуральной среде в инкубаторе с увлажнением при 37 С и 10% СО 2. Субкультивирование проводили каждые от 3 до 4 суток, пока не достигали достаточной клеточной плотности для инокуляции 2-л биореактора при объеме 1,5 л и плотности клеток от 0,2 до 0,5106 жизнеспособных клеток/мл. Клетки размножали в биореакторе при 37 С, DO 40%, и рН 7,3. Процесс перфузии ATF начинали при клеточной плотности 4,7106 всех клеток/мл. ATF была от Refine Technology, Co., East Hanover, NJ. Через 89 ч клеточная плотность достигала 12,4106 всех клеток/мл. В этот момент часть клеток собирали и клетки центрифугировали в течение 5 мин при 300g. Клеточный осадок ресуспендировали до следующих концентраций в свежей бессывороточной среде: 1,3106 жизнеспособных клеток/мл, 30 мл/вращающийся флакон, два 250-мл вращающихся флакона 10106 жизнеспособных клеток/мл, 30 мл/вращающийся флакон, два 250-мл вращающихся флакона 20106 жизнеспособных клеток/мл, 30 мл/вращающийся флакон, два 250-мл вращающихся флакона 30106 жизнеспособных клеток/мл, 30 мл/вращающийся флакон, два 250-мл вращающихся флакона Вращающиеся флаконы инфицировали Ad5.CS (вектор rAd5; Shott et al., 2008) при MOI 90VP/клетка и инкубировали при 36 С, 10% СО 2 и 100 об./мин. На 1 и 2 сутки после инфицирования проводили обновление среды для вращающихся флаконов, инкубированных при 10, 20 и 30106 жизнеспособных клеток/мл. Это обновление среды проводили с помощью стадии центрифугирования в течение 5 мин при 300g и ресуспендирования клеточного осадка в 30 мл свежей среды на вращающийся флакон. На 3 сутки после инфицирования вращающиеся флаконы собирали и отбирали образцы для анализа АЕХ-ВЭЖХ. Лизис собранных клеток проводили путем смешения образца объемом 1 мл из каждого вращающегося флакона с 100 мкл 10% Triton X-100 и инкубации при 37 С в течение 30 мин. После инкубации образцы смешивали с 2,42 Benzonase/MgCl2 с последующей стадией инкубации в течение 30 мин при 37 С. Наконец к образцам добавляли 100 мкл 50% сахарозы. После стадии центрифугирования в течение 5 минут при 2500g образцы хранили при температуре ниже -65 С до проведения анализа АЕХВЭЖХ для определения количества продуцированных вирусных частиц (VP/мл). Результаты представлены на фиг. 1. Объемный выход инфицирования при клеточной плотности 10106 жизнеспособных клеток/мл был в 10 раз выше, чем при 1106 жизнеспособных клеток/мл. Это было в некоторой степени неожиданным,учитывая эффект клеточной плотности, описанный в более ранних сообщениях при значительно более низких плотностях (т.е. при приблизительно 0,5-3106 клеток/мл, например Maranga et al., 2005; Kamen etal., 2004; Altaras et al., 2005). Однако при плотности более 10106 клеток/мл наблюдали эффект клеточной плотности и объемный выход снижался. Таким образом, в случае рекомбинантного Ad5 в перфузионной системе наблюдают эффект клеточной плотности. Пример 2. Инфицирование rAd35 при низкой плотности клеток (1-1,6106 жизнеспособных клеток/мл). В примере 1 использовали rAd5. Однако, известны и были описаны для различных целей различные серотипы аденовирусов. Эти серотипы могут иметь различные свойства, и, таким образом, способы, пригодные для одного серотипа, не всегда обязательно пригодны для другого серотипа. Это может иметь особое значение в процессах промышленного масштаба, где вроде бы небольшие отличия иметь могут иметь большое экономическое значение. Одним из особенно преимущественных серотипов для применения, например в вакцинах, является Ad35, и в следующих примерах авторы настоящего изобретения протестировали возможность улучшения выходов rAd35 для получения больших его количеств. В этом примере продемонстрировано инфицирование вектором rAd35 при низкой плотности клеток по сравнению со следующими примерами, где клетки инфицируют при более высокой плотности клеток. Из рабочего банка клеток PER.C6 клетки размораживали и размножали в бессывороточной культуральной среде в инкубаторе с увлажнением при 37 С и 10% СО 2. Субкультивирование проводили каждые от 3 до 4 суток, пока не достигали достаточной клеточной плотности для инокуляции 10-л биореактора при объеме 5 л и плотности клеток от 0,2 до 0,35106 жизнеспособных клеток/мл. Клетки размножали в биореакторе при 37 С, DO 40%, и рН 7,3. Через четверо суток после инокуляции (когда плотность клеток достигала от 2 до 3,5106 жизнеспособных клеток/мл) клеточную суспензию разбавляли 5 л свежей среды, а затем инфицировали rAd35.TB-S (вектор rAd35; Radosevic et al., 2007) при MOI 70VP/клетка. Размножение вируса проводили при 36 С, рН 7,3 и DO 40%. Через трое суток после инфицирования проводили взятие образцов для подсчета клеток и определения продуцирования вируса. Для высвобождения вируса 1 мл образца из каждого биореактора смешивали со 100 мкл 10% Triton X-100 и инкубировали при 37 С в течение 30 мин. После инкубации образцы смешивали с 2,42 мклBenzonase/MgCl2 с последующей стадией инкубации в течение 30 мин при 37 С. Наконец, к образцам добавляли 100 мкл, 50% сахарозы. После стадии центрифугирования в течение 5 мин при 2500g образцы хранили при температуре ниже -65 С до анализа посредством АЕХ-ВЭЖХ. Проводили всего десять циклов в биореакторе и проводили анализ согласно описанному выше способу, и эти циклы дали согласую- 12023816 щиеся результаты (не представлено). Средний выход вирусных частиц составлял 2,31011 VP/мл. Для ежегодной потребности, составляющей приблизительно 1,51019 VP, при таком выходе потребуется приблизительно 65000 л. Это потребовало бы больших установок и, таким образом, больших предварительных капиталовложений в ходе разработки вакцины. Пример 3. Исследование выполнимости процесса инфицирования rAd35 при высокой клеточной плотности (10106 жизнеспособных клеток/мл). Из рабочего банка клеток PER.C6 клетки размораживали и размножали в бессывороточной культуральной среде в инкубаторе с увлажнением при 37 С и 10% CO2. Субкультивирование проводили каждые от 3 до 4 суток, пока не достигали достаточной клеточной плотности для инокуляции 2 л биореактора при объеме 1,5 л и плотности клеток от 0,2 до 0,5106 жизнеспособных клеток/мл. Клетки размножали в биореакторе при 37 С, DO 40% и рН 7,3. Перфузию среды начинали при клеточной плотности 6,8106 всех клеток/мл с использованием системы ATF. Через 70 ч клеточная плотность достигала 36,8106 всех клеток/мл. В этот момент проводили следующее инфицирование. Инфицирование во вращающихся флаконах при клеточной плотности: 1,3106 жизнеспособных клеток/мл, 30 мл/вращающийся флакон, два 250-мл вращающихся флакона 10106 жизнеспособных клеток/мл, 30 мл/вращающийся флакон, два 250-мл вращающихся флакона 20106 жизнеспособных клеток/мл, 30 мл/вращающийся флакон, два 250-мл вращающихся флакона 30106 жизнеспособных клеток/мл, 30 мл/вращающийся флакон, два 250-мл вращающихся флакона Инфицирование в масштабе биореактора 2 л при 8,7 всех клеток/мл (жизнеспособность 84%) - через 1 ч после инфицирования биореактора образец отбирали из биореактора и переносили в два вращающихся флакона объемом 250 мл, по 30 мл/вращающийся флакон. Для процесса инфицирования в 250-мл вращающихся флаконах клеточную суспензию из биореактора объемом 2 собирали, и эту суспензию центрифугировали в течение 5 мин при 300g. Клеточный осадок ресуспендировали до упомянутых выше концентраций в свежей бессывороточной среде. Вращающиеся флаконы инфицировали Ad35.TB-S при MOI 70 VP/клетка и инкубировали при 36 С, 10% СО 2 и 100 об./мин. На 1 и 2 сутки после инфицирования проводили обновление среды для вращающихся флаконов, инфицированных при 10, 20 и 30106 жизнеспособных клеток/мл. Это обновление среды проводили с помощью стадии центрифугирования в течение 5 мин при 300g и ресуспендирования клеточного осадка в 30 мл свежей среды на вращающийся флакон. На 3 сутки после инфицирования вращающиеся флаконы собирали и проводили взятие образцов для анализа АЕХ-ВЭЖХ. Лизис собранных клеток проводили путем смешения образца объемом 1 мл из каждого вращающегося флакона с 100 мкл 10% TritonX-100 и инкубации при 37 С в течение 30 мин. После инкубации образцы смешивали с 2,42 Benzonase/MgCl2 с последующей стадией инкубации в течение 30 мин при 37 С. Наконец к образцам добавляли 100 мкл 50% сахарозы. После стадии центрифугирования в течение 5 мин при 2500g образцы хранили при температуре ниже -65 С до проведения анализа АЕХ-ВЭЖХ. Оставшиеся клетки в биореакторе объемом 2 л разбавляли свежей бессывороточной средой до концентрации клеток 8,7106 всех клеток/мл (жизнеспособность 84%). Биореактор инфицировали Ad35.TB-S при MOI 70 VP/клетка и инкубировали при 36 С, рН 7,3 и DO 40%. Систему ATF запускали через 15 ч после инфицирования при скорости обновления среды 1 объем биореактора в сутки. На 1, 2, 3 и 4 сутки после инфицирования из биореактора проводили взятие образцов для подсчета клеток (цитометр CASY) и определения выхода вируса с помощью АЕХ-ВЭЖХ. Приготовление образцов проводили, как описано выше. Образцы хранили при температуре ниже -65 С до проведения анализа АЕХ-ВЭЖХ. Приблизительно через 1 ч после инфицирования биореактора из 2 л биореактора отбирали образец объемом по меньшей мере 60 мл и начинали два процесса инфицирования (в 250-мл вращающихся флаконах) в объеме 30 мл на вращающийся флакон. На 1 и 2 сутки после инфицирования проводили обновление среды для имитации перфузионной системы. Это обновление среды проводили посредством стадии центрифугирования в течение 5 мин при 300g и ресуспендирования клеточного осадка в 30 мл свежей среды на вращающийся флакон. На 3 сутки после инфицирования проводили сбор из вращающихся флаконов и взятие образцов для анализа АЕХ-ВЭЖХ. Приготовление образцов проводили, как описано выше. Образцы хранили при температуре ниже -65 С до проведения анализа АЕХ-ВЭЖХ. Результаты представлены на фиг. 2. Результаты демонстрируют, что является возможным инфицирование от 1,3106 жизнеспособных клеток/мл до 30106 жизнеспособных клеток/мл. В противоположность результатам для rAd5 общие выходы rAd35 возрастали при увеличении плотности клеток при инфицировании даже образцов с более 10106 жизнеспособных клеток/мл. При 30106 жизнеспособных клеток/мл достигали объемного выхода 1,41012 VP/мл. Результаты отчетливо указывают на то, что является возможным инфицирование Ad35.TB-S при высоких плотностях клеток, т.е. 10106 жизнеспособных клеток/мл или более. Даже при 30106 жизнеспособных клеток/мл, инфекции дали высокие объемные выходы. Следует отметить, что наблюдают снижение продуктивности на единицу от 120000 VP/клетка при 1,3106 клеток до 47000 VP/клетка при 30106 жизнеспособных клеток/мл. Вращающиеся флаконы,- 13023816 культивирование в которых начинали с суспензии клеток, которые были инфицированы в биореакторе,демонстрируют выход при сборе 8,01011 VP/мл и удельную продуктивность 92000 VP/клетка. Результаты в биореакторе объемом 2 л являются несколько более низкими: был получен выход при сборе 51011VP/мл, что соответствует продуктивности на единицу, составляющей 57000 VP/клетка. Пример 4. Эксперименты в биореакторе по инфицированию при высокой клеточной плотности вектором rAd35. 1) Из рабочего банка клеток PER.C6 клетки размораживали и размножали в бессывороточной культуральной среде в инкубаторе с увлажнением при 37 С и 10% СО 2. Субкультивирование проводили каждые от 3 до 4 суток, пока не достигали достаточной клеточной плотности для инокуляции 2 л биореактора при плотности клеток от 0,59106 жизнеспособных клеток/мл. Клетки размножали в биореакторе при 37 С, DO 40% и рН 7,3. Когда достигали плотности клеток приблизительно 2,9106 всех клеток/мл(на 4 сутки после инокуляции) запускали систему ATF. После перфузии в течение 118 ч достигали клеточной плотности 29106 всех клеток/мл. В этот момент времени часть клеточной суспензии собирали и остальные клетки разбавляли свежей среде в биореакторе объемом 2 до клеточной плотности 16,4106 всех клеток/мл (жизнеспособность 82%, следовательно 13,4106 жизнеспособных клеток/мл). Затем биореактор объемом 2 л инфицировали Ad35.TB-S при MOI 70 VP/клетка и инкубировали при 36 С, рН 7,3 иDO 40%. Систему ATF запускали через 15 ч после инфицирования при средней скорости обновления 2 объема емкости в сутки. На 1, 2 и 3 сутки после инфицирования проводили взятие образцов из 2 л биореактора для подсчета клеток и определения выхода вируса с помощью АЕХ-ВЭЖХ. Для высвобождения вируса образец объемом 1 мл смешивали с 100 мкл 10% Triton X-100 и инкубировали при 37 С в течение 30 мин. После инкубации образец смешивали с 2,42 Benzonase/MgCl2 с последующей стадией инкубации в течение 30 мин при 37 С. Наконец, к образцам добавляли 100 мкл 50% сахарозы. После стадии центрифугирования в течение 5 мин при 2500g образцы хранили при температуре ниже -65 С до анализа способом АЕХ-ВЭЖХ. Результаты представлены в табл. 2. Результаты продемонстрировали, что инфицирование при клеточной плотности более 10106 жизнеспособных клеток/мл осуществимы в биореакторах, соединенных с перфузионной системой, и что возможно увеличить объемный выход практически в 10 раз по сравнению с периодическим процессом(пример 2). Не наблюдали преждевременной утраты клеток в инфицированной культуре, что указывает на то, что процесс ATF является пригодной системой для культивирования инфицированных клеток. Таблица 2 Результаты для примера 4 (1) Требованием FDA для партий rAd является отношение VP/IU 30. Анализ QPA (анализ эффективности на основе Q-ПЦР; Wang et al., 2005) продемонстрировал, что все образцы удовлетворяют этому требованию. Напротив, образцы, описанные в Yuk et al. (2004), имеют отношение VP/IU приблизительно 100 (фиг. 2 А-2 В в ней). Отношение физических частиц к инфекционным частицам является значимым параметром для аденовирусов и более низкое отношение является предпочтительным для партий rAd. Партии, полученные согласно этому примеру, соответственно имеют такое низкое отношение, составляющее менее 10:1. Для ежегодной потребности приблизительно 1,51019 VP и с выходом приблизительно 21012 VP/мл необходимо переработать менее 7500 л собранной культуры. Эти объемы можно обрабатывать на установках объемом 1000 л или менее, и, таким образом, это снизило бы предварительные затраты на разработку вакцины. 2) Дополнительные эксперименты в биореакторе объемом 2 л. Из рабочего банка клеток PER.C6 клетки размораживали и размножали в бессывороточной культуральной среде в инкубаторе с увлажнением при 37 С и 10% СО 2. Субкультивирование проводили каждые от 3 до 4 суток, пока не достигали достаточной клеточной плотности для инокуляции 2 л биореактора при плотности клеток 0,44106 жизнеспособных клеток/мл. Клетки размножали в биореакторе при 37 С, DO 40% и рН 7,3. Систему ATF запускали через 4 суток после инокуляции при плотности клеток приблизительно 2,72106 всех клеток/мл. После перфузии в течение 144 ч достигали плотности клеток 30,5106 всех клеток/мл. В этот момент часть клеточной суспензии собирали и остальные клетки разбавляли свежей средой в биореакторе объемом 2 л до клеточной плотности 16,2106 всех клеток/мл (жизнеспособность 81%, следовательно, 13,1106 жизнеспособных клеток/мл). Затем биореактор объемом 2 л инфицировали Ad.35.TB-S при MOI 70 VP/клетка и инкубировали при 36 С, рН 7,3 и DO 40%. СистемуATF запускали через 5 ч после инфицирования при скорости обновления среды 2 объема емкости в су- 14023816 тки. На 2, 3 и 4 сутки после инфицирования проводили взятие образца из 2 л биореактора для подсчета клеток и продуцирования вируса с помощью АЕХ-ВЭЖХ. Для высвобождения вируса 1 мл образца смешивали с 100 мкл 10% Triton X-100 и инкубировали при 37 С в течение 30 мин. После инкубации образец смешивали с 2,42 мкл Benzonase/MgCl2 с последующей стадией инкубации в течение 30 мин при 37 С. Наконец, к образцам добавляли 100 мкл 50% сахарозы. После стадии центрифугирования в течение 5 мин при 2500g образцы хранили при температуре ниже -65 С до анализа посредством АЕХ-ВЭЖХ. Результаты представлены в табл. 3. Таблица 3 Результаты для примера 4 (2) Результаты вновь продемонстрировали, что инфекции при плотности клеток более 10106 жизнеспособных клеток/мл являются выполнимыми в биореакторах, соединенных с перфузионной системой, и что возможно увеличить объемный выход практически в 10 раз по сравнению с периодическим процессом (пример 2). Более того, этот пример демонстрирует, что скорость перфузии после инфицирования может быть ограничена до двух 2 объемов емкости в сутки без снижения выхода вируса. Для ежегодной потребности приблизительно 1,51019 VP и с выходом приблизительно 21012 VP/мл необходимо переработать менее 7500 л собранной культуры. Эти объемы можно обрабатывать на установках объемом 1000 л или менее, и, таким образом, это снизило бы предварительные затраты на разработку вакцины. 3) Дальнейшие эксперименты в биореакторе SOL. Из рабочего банка клеток PER.C6 клетки размораживали и размножали в бессывороточной культуральной среде в инкубаторе с увлажнением при 37 С и 10% СО 2. Субкультивирование проводили каждые от 3 до 4 суток, пока не достигали достаточной клеточной плотности для инокуляции 10 л биореактора при плотности клеток 0,52106 жизнеспособных клеток/мл. Клетки размножали в 10-л биореакторе при 37 С, DO 40% и рН 7,3. Систему ATF запускали, когда достигали плотности клеток приблизительно 5,3106 всех клеток/мл (4 суток после инокуляции). После перфузии в течение 169 ч достигали плотности клеток 77106 всех клеток/мл. В этот момент суспензию клеток объемом 1 л разбавляли свежей средой в биореакторе объемом 50 л до клеточной плотности 15,5106 всех клеток/мл (жизнеспособность 81%,следовательно, 12,6106 жизнеспособных клеток/мл). Затем биореактор объемом 50 л инфицировалиAd35.TB-S при MOI 70 VP/клетка и инкубировали при 36 С, рН 7,3 и DO 40%. Систему ATF запускали через 5 ч после инфицирования при скорости обновления среды 2 объема емкости в сутки. На 2 и 3 сутки после инфицирования из 50-л биореактора проводили взятие образца для подсчета клеток и определения выхода вируса с помощью АЕХ-ВЭЖХ. Для высвобождения вируса 1 мл образца смешивали с 100 мкл 10% Triton Х-100 и инкубировали при 37 С в течение 30 мин. После инкубации образец смешивали с 2,42 мкл Benzonase/MgCl2 с последующей стадией инкубации в течение 30 мин при 37 С. Наконец, к образцам добавляли 100 мкл 50% сахарозы. После стадии центрифугирования в течение 5 мин при 2500g образцы хранили при температуре ниже -65 С до анализа посредством АЕХ-ВЭЖХ. Результаты представлены в табл. 4. Таблица 4 Результаты для примера 4 (3) Результаты продемонстрировали, что инфицирование при плотности клеток более 10106 жизнеспособных клеток/мл было осуществимо в биореакторах объемом 50 л, соединенных с перфузионной системой, и что было возможным в масштабе 50 л увеличить объемный выход практически в 10 раз по сравнению с периодическим процессом (пример 2). В данном случае было показано, что разработанный способ можно увеличивать в масштабе. С помощью данного процесса можно продуцировать собираемые объемы, которые должны быть переработаны в год для удовлетворения ежегодной потребности в вирусе. Для ежегодной потребности приблизительно 1,51019 VP и с выходом приблизительно 21012 VP/мл необходимо переработать менее 7500 л собранной культуры. Эти объемы можно обрабатывать на установках объемом 1000 л или менее, и, таким образом, это снизило бы предварительные затраты на разработку вакцины. Пример 5. Инфицирование rAd26 при низкой плотности клеток (1-1,6106 жизнеспособных клеток/мл). В этом примере продемонстрировано инфицирование вектором rAd26, содержащим трансген CS малярии (rAd26.CS), при низкой клеточной плотности по сравнению с последними примерами, где клетки инфицированы при более высокой плотности клеток. Из рабочего банка клеток PER.C6 клетки размораживали и размножали в бессывороточной культуральной среде в инкубаторе с увлажнением при 37 С и 10% СО 2. Субкультивирование проводили каждые от 3 до 4 суток, пока не достигали достаточной клеточной плотности для инокуляции 10 л биореактора при объеме 5 л и плотности клеток от 0,25 до 0,35106 жизнеспособных клеток/мл. Клетки размножали в биореакторе при 37 С, DO 40% и рН 7,3. Через трое суток после инокуляции (когда плотность клеток достигала от 1 до 2,1106 жизнеспособных клеток/мл) клеточную суспензию разбавляли 5 л свежей среды, а затем инфицировали вектором rAd26.CS при MOI 70 VP/клетка. Размножение вируса проводили при 36 С, рН 7,3 и DO 40%. Через трое суток после инфицирования проводили взятие образцов для подсчета клеток и определения продуцирования вируса. Для высвобождения вируса 1 мл образца из каждого биореактора смешивали со 100 мкл 10% Triton X-100 и инкубировали при 37 С в течение 30 мин. После инкубации образцы смешивали с 2,42 мкл Benzonase/MgCl2 с последующей стадией инкубации в течение 30 мин при 37 С. Наконец, к образцам добавляли 100 мкл, 50% сахарозы. После стадии центрифугирования в течение 5 мин при 2500g образцы хранили при температуре ниже -65 С до анализа посредством АЕХ-ВЭЖХ. Проводили всего 5 циклов в биореакторе и проводили анализ согласно описанному выше способу, и эти циклы дали согласующиеся результаты (не представлено). Средний выход вирусных частиц составлял 7,61011 VP/мл. Для ежегодной потребности приблизительно 1,51019 VP при таком выходе ежегодно необходимо было бы перерабатывать приблизительно 197000 л. Это потребовало бы больших установок и, таким образом, большого предварительного инвестирования в ходе разработки вакцины. Пример 6. Осуществимость инфицирования при высокой клеточной плотности вектором rAd26. Осуществимость инфицирования Ad35 при высокой клеточной плотности ранее оценивали, и было показано, что продуцирование Ad35 можно увеличивать в масштабе. Поскольку существуют существенные отличия между серотипами аденовирусов, в рамках настоящего изобретения было протестировано,является ли осуществимым продуцирование Ad26 путем инфицирования культур с высокой клеточной плотностью. Из рабочего банка клеток PER.C6 клетки размораживали и размножали в бессывороточной культуральной среде в инкубаторе с увлажнением при 37 С и 10% СО 2. Субкультивирование проводили каждые от 3 до 4 суток, пока не достигали достаточной клеточной плотности для инокуляции 2 л биореактора при объеме 1,5 л и плотности клеток 0,5106 жизнеспособных клеток/мл. Клетки размножали в биореакторе при 37 С, DO 40% и рН 7,3. Процесс перфузии ATF начинали при клеточной плотности 3,6106 всех клеток/мл. Через 120 ч клеточная плотность достигала 21,6106 всех клеток/мл. В этот момент часть клеток собирали. Клетки центрифугировали в течение 5 мин при 300g и клеточный осадок ресуспендировали до следующих концентраций в свежей бессывороточной среде: 1,3106 жизнеспособных клеток/мл, 30 мл/вращающийся флакон, два 250-мл вращающихся флакона 10106 жизнеспособных клеток/мл, 30 мл/вращающийся флакон, два 250-мл вращающихся флакона 20106 жизнеспособных клеток/мл, 30 мл/вращающийся флакон, два 250-мл вращающихся флакона 30106 жизнеспособных клеток/мл, 30 мл/вращающийся флакон, два 250-мл вращающихся флакона Вращающиеся флаконы инфицировали rAd26.CS при MOI 70 VP/клетка и инкубировали при 36 С,10% СО 2 и 100 об./мин. На 1 и 2 сутки после инфицирования проводили обновление среды для вращающихся флаконов, инкубированных при 10, 20 и 30106 жизнеспособных клеток/мл. Это обновление среды проводили с помощью стадии центрифугирования в течение 5 мин при 300g и ресуспендирования клеточного осадка в 30 мл свежей среды на вращающийся флакон. На 3 сутки после инфицирования вращающиеся флаконы собирали и отбирали образцы для анализа АЕХ-ВЭЖХ. Лизис собранных клеток проводили путем смешения образца объемом 1 мл из каждого вращающегося флакона с 100 мкл 10%Triton Х-100 и инкубации при 37 С в течение 30 мин. После инкубации образцы смешивали с 2,42 Benzonase/MgCl2 с последующей стадией инкубации в течение 30 мин при 37 С. Наконец к образцам добавляли 100 мкл 50% сахарозы. После стадии центрифугирования в течение 5 мин при 2500g образцы хранили при температуре ниже -65 С до проведения анализа АЕХ-ВЭЖХ. Результаты представлены на фиг. 3 и демонстрируют, что инфицирование с помощью Ad26 при клеточной плотности вплоть до 30106 жизнеспособных клеток/мл является осуществимым. Объемные выходы rAd26 были более высокими, чем выходы, достигнутые в случае, например, Ad5. В противоположность результатам для rAd35, эффект клеточной плотности наблюдали при плотности клеток выше 10106 жизнеспособных клеток/мл. Действительно, выход rAd26 возрастал при увеличении клеточных плотностей при инфицировании свыше 10106 жизнеспособных клеток/мл и выходы- 16023816 снижались в диапазоне 20106-30106 жизнеспособных клеток/мл. Исходя из наблюдаемого эффекта клеточной плотности для Ad26 может быть определена оптимальная клеточная плотность при инфицировании. Указанное оптимальное значение находится в диапазоне 10-16106 жизнеспособных клеток/мл. Объемные выходы rAd26, полученные путем инфицирования клеток, были существенно более высокими по сравнению с объемными выходами, полученными путем инфицирования клеток при низкой плотности клеток (например, в периодическом процессе). Действительно, выход, полученный при низкой плотности клеток согласно примеру 5, был равен 7,61010 VP/мл,в то время как при более высокой клеточной плотности при инфицировании выходы достигали вплоть до 1-21012 VP/мл (см. пример 7). Инфицирование в указанном диапазоне позволяет наличие высоко продуктивного процесса, который можно использовать при продуцировании в крупном масштабе. Пример 7. Инфицирование при высокой клеточной плотности вектором rAd26 в биореакторе. Из рабочего банка клеток PER.C6 клетки размораживали и размножали в бессывороточной культуральной среде в инкубаторе с увлажнением при 37 С и 10% СО 2. Субкультивирование проводили каждые от 3 до 4 суток, пока не достигали достаточной клеточной плотности для инокуляции 2 л биореактора при плотности клеток 0,6106 жизнеспособных клеток/мл. Клетки размножали в биореакторе при 37 С, DO 40% и рН 7,3. Систему ATF запускали через 2 суток после инокуляции при плотности клеток приблизительно 2106 всех клеток/мл. После перфузии в течение 7 суток достигали плотности клеток 19,1106 всех клеток/мл. В этот момент часть клеточной суспензии собирали и остальные клетки разбавляли свежей средой в биореакторе объемом 2 л до клеточной плотности 16,5106 всех клеток/мл (жизнеспособность 80%, следовательно, 13,1106 жизнеспособных клеток/мл). Затем биореактор объемом 2 л инфицировали rAd26.CS при MOI 70 VP/клетка и инкубировали при 36 С, рН 7,3 и DO 40%. СистемуATF начинали через 5 ч после инфицирования при скорости обновления среды 2 объема емкости в сутки. На 3, 4, 5 и 6 сутки после инфицирования проводили взятие образца из 2 л биореактора для подсчета клеток и продуцирования вируса с помощью АЕХ-ВЭЖХ и QPA. Для высвобождения вируса 1 мл образца смешивали с 100 мкл 10% Triton Х-100 и инкубировали при 37 С в течение 30 мин. После инкубации образец смешивали с 2,42 мкл Benzonase/MgCl2 с последующей стадией инкубации в течение 30 мин при 37 С. Наконец, к образцам добавляли 100 мкл 50% сахарозы. После стадии центрифугирования в течение 5 мин при 2500g образцы хранили при температуре ниже -65 С до анализа посредством АЕХ-ВЭЖХ иQPA. Результаты представлены в табл. 5. Таблица 5 Результаты для примера 7 Эти результаты впервые продемонстрировали, что инфицирование rAd26 при клеточной плотности свыше от 10106 до 16106 жизнеспособных клеток/мл являются осуществимыми в биореакторах, соединенных с перфузионной системой и что возможно увеличить объемных выход более чем в 20 раз по сравнению с периодическим процессом (как показано в примере 5). Для ежегодной потребности приблизительно 1,51019 VP и с выходом приблизительно 21012 VP/мл необходимо переработать менее 7500 л собранной культуры. Эти объемы можно обрабатывать на установках объемом 1000 л или менее, и, таким образом, это снизило бы предварительные затраты на разработку вакцины. При сравнении роста клеток после инфицирования было выявлено, что после инфицирования посредством Ad26 клетки имеют тендецию к дальнейшему росту, хотя после инфицирования Ad35 клетки прекращали расти. Действительно, было показано (фиг. 4), что клетки, которые были инфицированыAd26 при плотности 12106 VP/мл, росли далее до максимума 22106 VP/мл через 3 суток. После инфицирования Ad35, клетки, которые были инфицированы при плотности 12106 VP/мл, росли далее до максимума через 2 суток и через 3 суток их плотность снижалась до 14106 VP/мл (фиг. 5). Таким образом,Ad26 размножается иначе, чем Ad35. Вместе с эффектом клеточной плотности, описанным выше, это демонстрирует, что существуют явные отличия между размножением рекомбинантных аденовирусов различных серотипов (Ad5, Ad35 и Ad26) в клетках, которые влияют на способы получения фармацевтических материалов из этих серотипов в промышленных масштабах. СсылкиProduction Platform for Oncolytic Adenoviral Vectors. Biotechnol. Bioengin. 86: 637-641 (2004). ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Способ продуцирования по меньшей мере 11012 вирусных частиц (VP)/мл E1-дефицитного аденовируса серотипа 26 (rAd26), причем отношение абсолютного количества вирусных частиц к инфекционным частицам VP/IU составляет менее 20:1, причем способ включает:b) инфицирование указанных клеток посредством rAd26 при плотности от 10106 до 16106 жизнеспособных клеток/мл;c) дальнейшее культивирование инфицированных клеток с помощью перфузионной системы для размножения указанного rAd26 до достижения концентрации по меньшей мере 11012 вирусных частицd) сбор вирусных частиц указанного rAd26. 2. Способ по п.1, где указанные клетки на стадии b) инфицируют посредством rAd26 при плотности приблизительно от 10106 до 14106 жизнеспособных клеток/мл. 3. Способ согласно любому из предшествующих пунктов, где указанная перфузионная система на стадии с) представляет собой перфузионную систему переменного тангенциального потока (ATF). 4. Способ по любому из предшествующих пунктов, дополнительно включающий стадию е) очистки вирусных частиц rAd26. 5. Способ по любому из предшествующих пунктов, где указанный рекомбинантный аденовирус лишен, по меньшей мере, части Е 1 А или Е 1 В области Е 1. 6. Способ по любому из предшествующих пунктов, где указанная перфузионная система на стадии а) представляет собой перфузионную систему переменного тангенциального потока (ATF). 7. Способ по любому из предшествующих пунктов, где стадию а) проводят в биореакторе для предварительного культивирования, и стадии b) и с) проводят в биореакторе для продуцирования. 8. Применение биореактора в способе по любому из пп.1-7, где указанный биореактор имеет рабочий объем от 2 до 1000 л и содержит культуральную среду, клетки PER.C6 и вирусные частицы rAd26 в концентрации по меньшей мере 11012 VP/мл. 9. Применение по п.8, где указанный биореактор соединен с перфузионной системой ATF.