Способ усиления иммунореактивности

Изобретение касается способа усиления in vitro или ex vivo иммунореактивности клеток иммунной системы, контактировавших с антигеном, который включает снижение или ингибирование функцииCbl-b в данных клетках, при этом иммунореактивность клеток к антигену возрастает.(71)(73) Заявитель и патентовладелец: МЕДИЦИНИШЕ УНИВЕРСИТЕТ ИННСБРУК; АПЕЙРОН БИОЛОДЖИКС АГ (AT) Область техники, к которой относится изобретение Настоящее изобретение имеет отношение к способам модулирования иммунного ответа клеток. Предшествующий уровень техники Активная иммунизация впервые сделала возможной комплексную борьбу против наиболее угрожающих инфекционных болезней, а в некоторых случаях даже их полное искоренение во всем мире, используя недорогой и очень эффективный эндогенный защитный механизм. Поэтому предпринимались и будут предприниматься усилия для развития профилактических и терапевтических методов вакцинации против различных заболеваний. Тем не менее, эффективная иммунизация требует индукции иммунного ответа, что приводит к возникновению защитного иммунитета. Однако при отсутствии иммуногенности антигена, используемого для иммунизации, требуемый эффект не возникает. Были разработаны очень интересные композиции специфических антигенов для профилактики и лечения малярии, ВИЧ, гриппа или раковых заболеваний, если взять только несколько известных примеров. Несмотря на это, такие способы лечения не были успешными, например, из-за отсутствия иммуногенности антигена, используемого для иммунизации. Кроме того, даже широкоприменяемые вакцины вызывают проблемы недостаточной иммуногенности, как то вакцины против гепатита В, которые фактически создают защитный титр иммунного ответа только приблизительно у 80% вакцинированных. Главная причина отсутствия реактивности иммунной системы состоит в том, что эти антигены не распознаются как чужеродные. У млекопитающих главным образом Т-клетки решают, будет ли структура, презентированная антигенпрезентирующими клетками (АПК), распознаваться как эндогенная или чужеродная. Для индукции иммунного ответа необходимы по сути два отдельных сигнала независимо друг от друга. Этот механизм должен предотвращать чрезмерную реакцию иммунной системы. Первая предпосылка заключается в узнавании Т-клеточным рецептором антигена, представленного АПК. Если это не произойдет, то никакая дальнейшая реакция не возникнет. Кроме того, для индукции иммунного ответа совершенно необходимо, чтобы взаимодействие между рецептором CD28 на поверхности Т-клетки и В 7, экспрессированным на АПК,происходило только тогда, когда последний классифицирует антигенную структуру как опасную. При вакцинации антигеном, обладающим лишь минимальной иммуногенностью, не происходит костимуляция посредством взаимодействия В 7 и CD28, что впоследствии приводит не к развитию иммунного ответа, а, наоборот, к развитию толерантности на уровне Т-клеток. Тем не менее, было показано, что необходимость в костимуляции можно обойти путем отключения фермента Е 3-убиквитинлигазы Cbl-b. Этот фермент является решающим элементом переключения при контроле иммунореактивности (Chiang et al.,J. Clin. Invest (2007) doi: 10.1172/JCI29472). Однако и в отсутствие Cbl-b почти лишенные иммуногенности вводимые вещества могут приводить к индукции сильного иммунного ответа. Более того, деффектные по Cbl-b мыши (нокаут по гомозиготному гену) жизнеспособны, а их иммунная система способна эффективно распознавать индуцированные аутологично опухоли и вырабатывать литический иммунный ответ, главным образом, на основе Т-клеток CD8+ (Loeser et al., JEM (2007) doi:10.1084/iem.20061699). Однако полное удаление этого фермента, как было описано, тоже приводит к повышению аутоиммунности после иммунизации суперантигенами. Loeser и др. смогли таким образом показать, что Cbl-b как негативный регулятор отвечает за "иммунореактивность" Т-клеток. Также для Cbl-b была описана технология ниРНК (небольшой интерферирующей РНК, siRNA) для подавления экспрессии конкретного гена, но с меньшей эффективностью. US 2007/0087988 касается способа регулирования HPK1, экспрессия которого может быть увеличена путем усиления экспрессии Cbl-b и наоборот (например, путем ингибирования ниРНК Cbl-b). В US 2007/00543355 описаны пептиды Cbl-b и ассоциированные с Cbl-b белки, в частности POSH, и их применение для лечения связанных с Cbl-b заболеваний.WO 2004/078130 А 2 касается композиций для лечения связанных с POSH заболеваний, как то вирусных заболеваний, рака и неврологических заболеваний. POSH можно получить вместе со множеством связанных с ним белков, включая Cbl-b.US 2006/0292119 A1 касается способов усиления иммунного ответа клеток иммунной системы путем ингибирования отрицательных регуляторов в клетках. Такие отрицательные регуляторы выбирают из числа белков, связанных с молекулярной стабильностью, например, посредством убиквитинирования,дезубиквитинирования и сумоилирования, а также факторов транскрипции, ингибирующих экспрессию ингибиторов NFkB, или супрессоров транскрипции генов-мишеней NFkB. Тем не менее, использование медиаторов Cbl-b для применения в медицинской практике не было описано. Поэтому одной из целей настоящего изобретения является обеспечение способа модулирования иммунореактивности, пригодного для практического применения. Сущность изобретения Таким образом, настоящее изобретение касается способа усиления in vitro или ex vivo иммунореактивности клеток иммунной системы, подвергавшихся контакту с антигеном, который включает подавление или ингибирование функции Cbl-b в этих клетках, тем самым усиливая иммунореактивность клеток к антигену. Ген Cbl-b и его продукты подробно описаны в соответствующих работах (UniGene Id. Hs.3144 и доступа NM008279 и NP009112. Антитела к Cbl-b, ниРНК и антисмысловые ингибиторы доступны коммерчески. В US 2007/0054355 раскрыты некоторые ниРНК, пригодные для снижения или ингибирования экспрессии Cbl-b и тем самым функции Cbl-b, например, состоящие из смеси нуклеотидов РНК/ДНК и длиной примерно в 20 оснований. Чтобы противодействовать риску гиперреакции иммунной системы, которая может привести, к примеру, к индукции аутоиммунной реактивности, ингибирование/нокаут функций Cbl-b в Т-клетках может осуществляться только в строго определенный период времени. Поэтому при адьювантной терапевтической вакцинации необходимо контролируемое подавление Cbl-b только в течение ограниченного периода времени, чтобы поддержать развитие иммунного ответа, специфичного к данному иммунизационному антигену, но предотвратить аутоиммунную болезнь, быстро восстанавливая "нормальное" иммунологическое состояние. Поэтому в соответствии с настоящим изобретением только определенная выборка выделенных клеток иммунной системы подвергается обработке in vitro или ex vivo, а затем возвращается пациенту. Таким образом, данный подход к эффективному подавлению Cbl-b in vitro или exvivo является необходимым условием усиления иммунореактивности. Функция Cbl-b предпочтительно снижается или ингибируется путем снижения или ингибирования экспрессии Cbl-b. Термины "снижение" или "ингибирование" относятся к снижению функции (и/или экспрессии) Cbl-b по сравнению с неизмененной естественной функцией вплоть до полного е ингибирования. Функция (и/или экспрессия) предпочтительно снижается по меньшей мере на 30, 40, 50, 60, 70, 80,90 или 95%. В предпочтительных воплощениях функция Cbl-b предпочтительно снижается или ингибируется кратковременно. Иными словами, функция снижается только временно, как указано выше, а впоследствии может восстановиться, например, при израсходовании или деградации таких ингибиторов, как ниРНК Cbl-b, либо посредством неогенеза или клетками с неповрежденным Cbl-b (in vivo). Кратковременное снижение Cbl-b в иммунных клетках может осуществляться и многократно, например, до достижения терапевтического эффекта. Экспрессия Cbl-b предпочтительно подавляется или ингибируется с помощью антисмысловой РНК или ниРНК Cbl-b. С этой целью применяются короткие последовательности ДНК и/или РНК, комплементарные части последовательности мРНК мишени (Cbl-b), так что они при этом гибридизируются с ними и инактивируют их. Длина этих последовательностей предпочтительно составляет по меньшей мере 15, 18, 20, 22, 25, 28, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 140, 160, 180 или 200 оснований вплоть до полной длины последовательности мишени, предпочтительно вплоть до 2502, 2000, 1500, 1000, 500 или 300 оснований. Предпочтительно используют последовательности SEQ ID 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 и/или 8. Функцию Cbl-b также можно понизить или ингибировать с помощью множества других известных компонентов, как то с помощью антагонистов и ингибиторов Cbl-b, в частности аптамеров или интрамеров. Любые антагонисты или ингибиторы, которые подавляют действие и/или функцию Cbl-b, могут использоваться в соответствии с изобретением для усиления иммунореактивности клеток. Антагонисты или ингибиторы предпочтительно используются для получения фармацевтического средства для усиления по изобретению иммунореактивности клеток иммунной системы in vitro, ex vivo или даже in vivo. Это позволяет лечить заболевания с угнетенной или неэффективной иммунной системой, в частности рак, а также усиливать иммунный ответ на (вакцинационные) антигены, которые могут контактировать с клетками иммунной системы in vivo или ex vivo. Настоящее изобретение также касается способа снижения иммунореактивности клеток иммунной системы, который включает понижение или ингибирование функции с-Cbl в этих клетках с тем, чтобы понизить иммунореактивность их к антигену предпочтительно путем кратковременного снижения или ингибирования, в частности с помощью антисмысловой РНК или ниРНК c-Cbl. Для усиления иммунореактивности вовсе не нужно одновременно подавлять c-Cbl вместе с Cbl-b. Как показано в примерах, подавление c-Cbl вместо этого вызывает отмену эффектов, достигнутых ингибированием Cbl-b. Следовательно, Cbl-b и c-Cbl обладают противоположными функциями. c-Cbl также выполняет ранее неизвестную функцию тонкой регуляции реактивности Т-клеток, при этом его подавление приводит к повышению иммунотолерантности. Поэтому снижение или ингибирование функции c-Cbl подходит для иммуносупрессии и поэтому делает возможным его применение, к примеру, при воспалении или аллергии. Поскольку величина и направленность снижения зависят от степени подавления или ингибирования Cblb и/или c-Cbl (аналогично Cbl-b, как описано в данном тексте), функции обоих факторов могут понижаться в комбинации. Для усиления иммунореактивности снижение Cbl-b должно превосходить снижение c-Cbl и наоборот. Антисмысловая или ниРНК c-Cbl может иметь такие же линии последовательностей, как и описанные выше для Cbl-b. Предпочтительно используются последовательности SEQ ID 9,10, 11, 12, 13, 14, 15 и/или 16. В специальных воплощениях предпочтительно применяются клетки, которые захватили антиген и предпочтительно презентируют фрагмент антигена или, что еще лучше, распознают фрагмент антигена в контексте HLA, и при этом активировались. В предпочтительных воплощениях клетки для применения по изобретению представляют собой антигенпрезентирующие клетки, мононуклеары периферической крови (PBMCs), Т-лимфоциты, В-2 018966CD8+, Т-лимфоциты CD4+, в частности Th1, Th2, Th17, регуляторные Т-клетки (Tregs) или цитотоксические Т-клетки (CTL), клетки NK или NKT. Подобным же образом можно использовать лимфоцитыCD3/CD19-минус в целом, из которых особенно предпочтительную группу составляют NK-клетки. Антиген предпочтительно уже захвачен клетками, и они его презентируют, предпочтительно фрагмент антигена. Для терапии особенно предпочтительна комбинация PBMCs и Т-клеток, чтобы индуцировать особенно сильную антиген-специфичную реакцию. В других воплощениях, в частности для общего усиления иммунореактивности (например, при лечении иммунной недостаточности), достаточно одних лишь различных Т-клеток для достижения широкого эффекта. Усиление иммунореактивности в соответствии с изобретением предпочтительно опосредуется этими клетками, в частности клетками CD8 илиCD4, а также клетками NK и/или NKT. Для трансфекции клеток, в частности Т-клеток или NK-клеток, ингибитором Cbl-b типа ниРНК Cblb или конструкцией с нокаутом по Cbl-b предпочтительно применяется злектропорация. Для этой цели,т.е. для ингибирования Cbl-b, можно применять любые среды, пригодные для трансфекции. Одним из примеров такой среды является Optimem (Gibco, 31985-047). Кроме того, для усиления иммунного ответа клеток их также можно обрабатывать, т.е. стимулировать иммуностимулирующими веществами, например иммуностимулирующим цитокином или лигандом других иммуностимулирующих рецепторов (типа TLRs, т.е. Toll-подобных рецепторов) либо антителами к поверхностным молекулам, предпочтительно CD3 и/или CD28. Ингибирование Cbl-b также может применяться как составная часть вакцинации, реализуемой дендритными клетками, предпочтительно противораковой вакцинации. В качестве альтернативы и/или в дополнение клетки, ингибирующие in vitro совместное культивирование Cbl-b-ингибированных клеток и дендритных клеток, полученных от пациента и предпочтительно насыщенных антигенами (клеток) опухоли, поскольку в целях изобретения также можно использовать совместное культивирование."Вакцинация" в настоящем изобретении не должна пониматься в абсолютном смысле - т.е. как введение иммуногена, ведущее к абсолютной защите иммунной системой, а скорее как иммунологическое введение для усиления защиты иммунной системой и/или активации иммунной системы, в частности клеток иммунной системы, против антигена вакцины. В одном предпочтительном аспекте настоящее изобретение касается применения ингибиторов или антагонистов Cbl-b для изготовления фармацевтической композиции для усиления иммунореактивности к антигену у пациента и/или усиления иммунореактивности в чистом виде, которое включает выделение клеток иммунной системы пациента, усиление иммунореактивности in vitro или ex vivo с помощью ингибиторов или антагонистов Cbl-b и реимплантацию клеток пациенту, при этом иммунореактивность возрастает путем снижения или ингибирования функции Cbl-b в клетках. Реализацию усиления иммунореактивности, предпочтительно на ограниченный срок, параллельно с вакцинацией, введением антигена можно индуцировать путем снижения экспрессии Cbl-b в небольшой части циркулирующих Т-клеток. Можно получить PBMCs (мононуклеары периферической крови) из цельной крови и/или клеток крови из костного мозга и из самой опухолевой ткани (TILs) пациента, в идеале иммунизированного несколькими днями раньше, например пятью днями, и обработать их in vitro или ex vivo препаратом Cbl-b-специфичной ниРНК. Этот способ выполняется очень быстро. В идеальном случае такой препарат клеток можно снова ввести пациенту всего лишь через несколько минут после выделения. При желании перед реимплантацией клетки можно размножить или подрастить по методикам стимуляции ex-vivo, пригодным для соответствующих клеток. При циркуляции в организме реципиента активированные in vitro Т-клетки, составляющие лишь несколько процентов от популяции Т-клеток пациента, сталкиваются с антигенпрезентирующими клетками в лимфатических узлах, где эти антигенпрезентирующие клетки захватили антигены вследствие произошедшей иммунизации и мигрировали туда. Поскольку обработанные in vitro Т-клетки не нуждаются в сигнале костимуляции, они пролиферируют сразу же после распознавания иммунизационного антигена и секретируют цитокины, которые систематически вносят свой вклад в индукцию иммунного ответа и на клеточном, и на гуморальном уровне. С этим препаратом даже слабоиммуногенные антигены вызывают продолжительный иммунитет. Более того, этим способом можно вызвать отторжение аутологичных опухолей у больных раком. При этом антагонист Cbl-b усиливает иммунореактивность, если он применяется при исключительной и/или сопутствующей химиотерапии/радиотерапии в сочетании с пассивной иммунизацией, как то специфичными к опухолевым антигенам антителами. Этот способ поэтому применяется для лечения врожденной или приобретенной иммунной недостаточности, в частности СПИДа, множественной миеломы, хронического лимфолейкоза, медикаментозной иммуносупрессии или рака, необязательно с подбором специфичных для заболевания антигенов. Особенно предпочтительно лечение рака, включающего солидные опухоли. Для повышения вероятности успешного лечения, лечение рака предпочтительно проводится в комбинации с другой противоопухолевой терапией, в частности химиотерапией, радиотерапией, введением терапевтического биопрепарата или вакцинацией с помощью дендритных клеток (опухолевой вакцина-3 018966 цией). Ингибирование Cbl-b может применяться как часть вакцинации с помощью дендритных клеток,предпочтительно противоопухолевой вакцинации. В качестве альтернативы и/или в дополнение также возможно совместное культивирование in vitro Cbl-b-ингибированных клеток с дендритными клетками,полученными от пациента, предпочтительно насыщенными антигенами (клеток) опухоли, а также применение совместного культивирования в целях изобретения. Усиление иммунореактивности in vitro или ex vivo может осуществляться в терапевтическом способе, как описано выше, при этом клетки подвергаются воздействию антигена по выбору до или после извлечения клеток. При терапевтическом применении также важна хронологическая последовательность презентирования иммунизационных антигенов, их захвата антигенпрезентирующими клетками, а также миграции этих клеток в региональные лимфатические узлы, где захваченные вещества презентируются активированным Т-клеткам. Поэтому пациенту предпочтительно делают прививку антигеном, предпочтительно еще до выделения клеток, особенно предпочтительно по меньшей мере за 1, 2, 3, 4 или 5 дней и/или не более чем за20, 16, 12, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 или 1 неделю до выделения клеток. С другой стороны, также возможна последующая вакцинация или обработка клеток антигеном in vitro или ex vivo. Кроме того, также возможно применение антигенпрезентирующих клеток, которые предпочтительно происходят от самого пациента и могут контактировать с соответствующим антигеном, а затем способствуют повышению специфической иммунореактивности либо совместно, либо до или после введения Cbl-b-ингибированных иммунных клеток, предпочтительно Т-клеток. Клетки предпочтительно специфичны к определенному антигену или же клетки, содержащие определенный антиген, отбираются по специфичности или по присутствию антигена, при этом иммунореактивность выбранных клеток возрастает. Посредством отбора определенного антигена и/или клеток, обладающих иммуностимулирующей специфичностью к нему, иммунный ответ может быть прицельно направлен на определенную мишень у пациента. Такой мишенью, в частности, могла бы быть опухоль(посредством отбора по меньшей мере одного или нескольких антигенов) или патоген. Вполне возможно, что параллельно с разделением клеток в те же самые стерильные одноразовые пробирки будет вноситься соответствующая ниРНК в смеси для трансфекции. Поэтому в другом аспекте настоящее изобретение касается предпочтительно стерильного контейнера типа одноразовых пробирок,содержащих ингибитор Cbl-b, в частности для усиления иммунореактивности клеток иммунной системы к антигену. Также настоящим изобретением предусмотрен набор, включающий контейнер, в частности одноразовые пробирки для хранения клеток иммунной системы, а также ингибитора Cbl-b типа ниРНК, в частности для усиления иммунореактивности клеток иммунной системы к антигену способом по изобретению. Контейнер и/или набор также может содержать иммуностимулирующие вещества, предпочтительно цитокины или лиганды других рецепторов (например, TLRs) либо антитела к поверхностным молекулам,предпочтительно CD3 и/или CD28, чтобы дополнительно усилить стимуляцию. Также набор или контейнер может содержать стабилизирующие компоненты, среды или буфера (для стабилизации клеток), растворы для трансфекции или нуклеофекции, предпочтительно такие клеточные среды, как RPMI или Optimem. Настоящее изобретение иллюстрируется следующими фигурами и примерами, но не ограничивается ими. Краткое описание фигур На фиг. 1 представлена упрощенная схема активации Т-клеток при совместной стимуляции (а) или,в случае подавления экспрессии Cbl-b, только при стимуляции Т-клеточных рецепторов (с), которое обычно не приводит к активации (b). На фиг. 2 представлен анализ экспрессии Cbl-b методом вестерн-блоттинга. Клетки CD8+ выделяли из PBMCs, трансфецированных ниРНК Cbl-b, содержали в культуре и сравнивали с контрольной группой без стимуляции, после стимуляции анти-CD3 или после стимуляции анти-CD3 и анти-CD28. В качестве контроля на процедуру нагрузки использовали Fyn. На фиг. 3 представлена секреция IFN- клетками CD8+ человека через два дня после обработки ниРНК. Измеряли концентрацию IFN- в супернатанте Т-клеток CD8+ без стимуляции (среда) (слева) и после CD3-специфичной стимуляции (в центре) или после совместной CD3- и CD28-специфичной стимуляции (справа). Сравнивали двухдневные популяции клеток, трансфецированных неспецифичной ниРНК (1-й столбец), Cbl-b-специфичной ниРНК (2-й столбец), c-Cbl-специфичной ниРНК (3-й столбец) и Cbl-b-специфичной + c-Cbl-специфичной ниРНК (4-й столбец). На фиг. 4 представлена секреция IL-2 клетками CD8+ человека через двадцать дней после обработки ниРНК. Измеряли концентрацию IL-2 в супернатанте Т-клеток CD8+ без стимуляции (среда) (слева) и после CD3-специфичной стимуляции (в центре) или после совместной CD3- и CD28-специфичной стимуляции (справа). Сравнивали двухдневные популяции клеток, трансфецированных неспецифичной ниРНК (1-й столбец), Cbl-b-специфичной ниРНК (2-й столбец), c-Cbl-специфичной ниРНК (3-й столбец) и Cbl-b-специфичной + c-Cbl-специфичной ниРНК (4-й столбец). На фиг. 5 представлена хронологическая последовательность способа подавления экспрессии Cbl-bin vitro для усиления иммунореактивности. На фиг. 6 представлен захват ниРНК Т-клетками человека, выделенными из PBMCs (А), и захват ниРНК клетками PBMCs, истощенными по клеткам CD8 (В). На фиг. 7 представлена экспрессия мРНК Cbl-b после обработки иРНК (А) и количество вырабатываемого белка Cbl-b после обработки иРНК на вестерн-блоте (В). На фиг. 8 представлена продукция IFN-, TNF-, IL-2 после ингибирования Cbl-b. На фиг. 9 представлена продукция IFN- во времени после ингибирования Cbl-b в виде графика от времени. На фиг. 10 представлено усиление реактивности Т-клеток при измерении по экспрессии маркеров:CD107a + CD69 (A), CD107a, CD3, CD40L, ICAM (В). На фиг. 11 А представлен рост опухолей у мышей после терапии с подавлением Cbl-b в терапевтических клетках CD8 или без него. Фиг. 11 В - смертность у мышей с опухолями EG7ova после терапии. Примеры Пример 1. Последовательности. Для ингибирования Cbl-b использовали следующие последовательности ниРНК, одни или в комбинации. Для ингибирования с-Cbl использовали следующие последовательности ниРНК, одни или в комбинации. Пример 2. Кратковременное снижение экспрессии Cbl-b. В данном примере будет показано, что на иммунореактивность Т-клеток можно повлиять ex vivo. Цельную кровь брали у доноров, используя пробирки СРТ (Vacutainer), и отделяли клетки РВМС центрифугированием. На следующей стадии из этого препарата концентрировали клетки CD8+. Одну партию клеток трансфецировали Cbl-b-специфичной ниРНК с помощью аппарата для трансфекции клеток Amaxa (см. детальный протокол в примере 3), а затем культивировали. Аналогичную партию клеток трансфецировали неспецифической ниРНК по идентичной методике, а затем культивировали в качестве контроля. Поскольку предполагается возможное перекрывание функций Cbl-b и с-Cbl, две другие партии клеток обрабатывали c-Cbl-специфичной ниРНК и комбинацией из c-Cbl-специфичной + Cbl-bспецифичной ниРНК. Все партии клеток культивировали в течение двух дней. То, что трансфекция ведет к искомому подавлению экспрессии Cbl-b, демонстрировали при последующем анализе методом вестерн-блоттинга. Чтобы индуцировать экспрессию Cbl-b, культуры клеток стимулировали CD3, а другую партию клеток - CD3-специфичными и CD28-специфичными антителами. Во всех экспериментах экспрессия Cbl-b в трансфецированных препаратах подавлялась до менее 5% от интенсивности при контрольной трансфекции, как видно из фиг. 2. Поскольку стабильность ниРНК и, следовательно, эффективное подавление экспрессии имеет ограниченную продолжительность и не передается другим клеткам,то отобранные образцы представляют кратковременное подавление экспрессии Cbl-b, которое напрямую связано с присутствием ниРНК Cbl-b. Пример 3. Методика трансфекции. Нуклеофекция Т-клеток человека с помощью ниРНК. Нуклеофекция осуществляется при совместной работе с другим лаборантом. Один человек пипеткой вносит олигонуклеотиды ниРНК, а другой переносит образцы в культуральную среду. Это значительно ускоряет процедуру. 1. Приготовить клеточную среду RPMI (+pen/strep., +L-glut, +10% FCS). 2. Внести пипеткой культуральную среду по меньшей мере в две пробирки/конструкции Falcon на 50 мл (одна для сбора нуклеофецированных клеток и одна для среды промывки клеток), по 1 мл образца для нуклеофекции в каждую пробирку. Довести пробирки до 37 С. 3. Пометить микропробирки (Eppendorf) для каждого образца нуклеофекции. 4. Центрифугировать подлежащие нуклеофекции клетки (410g) в течение 7 мин и удалить супернатант. Добавить среду Optimem (Gibco, 31985-047) так, чтобы плотность клеток составила 40106 клеток/мл. 5. Внести по 100 мкл (= 4106 клеток) в каждую микропробирку. 6. Добавить 1,5-2,5 мкМ олигонуклеотидов ниРНК в микропробирки, содержащие клетки, точно перед нуклеофекцией. Перемешать с помощью пипетки и перенести раствор в кювету (избегая образования воздушных пузырьков). Постучать кюветой по столу для удаления пузырьков. 7. Закрыть крышкой и поставить кювету в устройство для трансфекции Amaxa (электропоратор).(Программа U-14, а не V-24, так как это лучший вариант при использовании раствора Optimem Nucleofector). Нажать кнопку X и убрать кювету после сигнала ОК. (Нажать кнопку X снова перед следующей электропорацией). 8. Немедленно добавить 500 мкл RPMI (37 С) в кювету для трасфекции и осторожно перемешать с помощью пипетки Пастера. Перенести клетки в пробирку для сбора Falcon. Промыть кювету один раз 500 мкл подогретой среды RPMI и перенести оставшиеся клетки в пробирку для сбора Falcon. 9. Повторить операции 5-7 для каждого образца. 10. Поставить пробирки Falcon в инкубатор до завершения нуклеофекции всех проб. 11. Внести по 4 мл суспензии клеток в лунки 6-луночного планшета (=2 образца) и поставить планшеты в инкубатор. 12. На следующий день собрать клетки, посчитать их и запустить культивирование через 24 ч после проведения нуклеофекции, как описано выше. Взять порцию клеток для выделения РНК с целью проверки того, что ген-мишень подвергался понижающей регуляции в момент активации. Пробы белка берутся на основе динамики экспрессии белка. Пример 4. Эффективность нуклеофекции.CD8+ выделяли из периферической крови человека, как описано выше. Отрицательный отбор осуществляли с помощью гранул. Результаты (сравнение с Amaxa): чистота популяции: 97% CD8+ (FACS) Эксперимент со средой Optimem: Таким образом, методами белковой химии обнаружено явное снижение экспрессии Cbl-b. Пример 5. Кратковременное усиление реактивности Т-клеток - измерение IFN-. Таким образом, было показано, что экспрессия Cbl-b в клетках CD8+ человека может быть подавлена с эффективностью не менее 95%. В качестве другого результата теперь будет показано, что реактивность популяции Т-клеток также может быть усилена. Чтобы удостовериться, что искомый эффект специфичен исключительно к Cbl-b и не может быть обойден в случае подавления экспрессии Cbl-b с помощью с-Cbl, в другом препарате также подавляли с-Cbl, а в третьем подавляли с-Cbl и Cbl-b. Все эти культуры клеток CD8+ культивировали 2 дня и стимулировали с помощью CD3, а также CD3 и CD28, и сравнивали с нестимулированными клетками. В норме Т-клеткам для пролиферации необходима указанная совместная стимуляция CD3 и CD28, которую легко определить по секреции воспалительных цитокинов в супернатантах культур. Для выявления этой активации Т-клеток измеряли титры IFN- в супернатантах. На фиг. 3 представлен график влияния подавления экспрессии путем обработки ниРНК на реактивность Т-клеток. Через два дня после трансфекции все культуры клеток CD8+ трансфецировали Cblb- и/или с-Cbl-специфичными ниРНК, стимулировали, как описано, и сравнивали с контрольной группой, которую трансфецировали неспецифической ниРНК. Нестимулированные клетки практически не проявляли экспрессии IFN-. После стимуляции только одним CD3 все культуры проявляли повышенную реактивность, так что в супернатантах определялось по меньшей мере 500 пг/мл IFN-. Сигналы у клеток, трансфецированных с-Cbl-специфичной и неспецифичной ниРНК, были очень близкими (низкими). И только клетки, трансфецированные Cbl-b-специфичными ниРНК, проявляли гораздо большую реактивность, которая сочеталась с титром IFN- примерно в 3 нг/мл. Однако реактивность клеток, совместно трансфецированных Cbl-b- и с-Cbl-специфичными ниРНК, была ниже, чем после обработки Cblb-специфичными ниРНК, достигая лишь 1,2 нг/мл. Во всех случаях совместная CD3- и CD28 специфичная стимуляция давала, как и ожидалось, существенно большие сигналы, чем только одна CD3 специфичная стимуляция. Контрольный препарат, обработанный неспецифической ниРНК, проявлял титр IFN- на уровне 1,2 нг/мл, тогда как культура, обработанная Cbl-b-специфичной ниРНК, проявляла концентрацию IFN- 3,8 нг/мл. Примечательно, что культура с совместным специфическим подавлениемCbl-b и с-Cbl проявляла титр в 1,7 нг/мл, что было значительно ниже, чем титры в группе с подавлениемCbl-b. Также неожиданно оказалось, что популяция клеток, обработанная Cbl-b-специфичной ниРНК,имела значительно меньшую реактивность, а в супернатанте определялось лишь 500 пг/мл IFN-. Эта концентрация значительно ниже, чем в контрольной группе с неспецифической обработкой и совместной стимуляцией, и сравнима с уровнем контрольной группы, стимулированной только одним анти-CD3. Таким образом, в отличие от мышиной системы избыточность Cbl-b и с-Cbl в Т-клетках CD8+ человека была исключена экспериментально, и для усиления иммунореактивности целесообразным является терапевтический подход через Cbl-b (и его вышележащие регуляторы), но не через комбинации Cbl-b/c-Cbl. Однако ингибирование с-Cbl способствует иммунносупрессии при других показаниях, как то при лечении воспаления или аллергии. Такой сопутствующий терапевтический подход либо в виде монотерапии, либо в сочетании с вакцинацией также способен распознавать диссеминированные раковые клетки на периферии и в конце концов противодействовать им путем выработки иммунного ответа. К тому же при его применении сразу же после диагностики рака предотвращается распространение первичной опухоли. Пример 6. Кратковременное усиление реактивности Т-клеток - измерение IL-2. Очень близкий результат был получен при измерении концентрации IL-2 в тех же супернатантах,как видно из фиг. 4. Без стимуляции не было никакого измеримого ответа, тогда как анти-CD3 специфическая обработка давала хорошо измеримые сигналы во всех группах. Так, в группе с подавлением Cbl-b определялось 200 пг/мл. Концентрация IL-2 в популяции клеток с совместным подавлениемCbl-b и с-Cbl опять же была значительно ниже и составляла 100 пг/мл. Совместная анти-CD3- и антиCD28-специфичная стимуляция давала еще более высокие сигналы. Концентрации IL-2 в 800 пг/мл определялись во всех группах независимо от обработки ниРНК. Контрольная группа проявляла титры,очень близкие к титрам групп с подавлением Cbl-b в 1,3 и 1,4 нг/мл. Интересно, что концентрации IL-2 после специфического подавления с-Cbl были значительно ниже и достигали лишь 800 пг/мл независимо от того, использовали при этом только один с-Cbl или же с-Cbl вместе с Cbl-b. Пример 7. Кратковременное усиление иммунореактивности. В результате обработки in vitro или ex vivo эффективно возрастает реактивность Т-клеток, так что через стимуляцию одних лишь Т-клеточных рецепторов можно индуцировать пролиферацию Т-клеток. Это является необходимой предпосылкой терапевтического подхода, описанного в настоящем изобретении. Такое подавление имеет кратковременный характер вследствие применения технологии РНКинтерференции. Такое применение этих модифицированных клеток служит для усиления иммуногенности вакцин и усиления реактивности иммунной системы в целом. Через 5 дней после базовой иммунизации у пациентов брали цельную кровь в пробирки СРТ. Примерно через 20 мин выделяли PBMCs центрифугированием. Выделенные клетки трансфецировали Cbl-b-специфичными ниРНК и реимплантировали пациенту сразу же после этого. На 10-й день снова брали цельную кровь и отделяли сыворотку. Измеряли титры провоспалительных цитокинов в сыворотке крови и сравнивали с контрольной группой. Характер индуцированного иммунного ответа также анализировали в отношении клеточной направленности Th1 контролируемого иммунного ответа (повышение титров IFN-, IL-2 и IL-12) или гуморальной направленности Th2-ориентированного иммунного ответа (повышение титров IL-4, IL-5 и IL-10). При необходимости с интервалом в 14 дней проводится повторная иммунизация (бустер) вместе с терапией клетками РВМС или без не (фиг. 5). Пример 8. Нуклеофекция Т-клеток CD4 и В-клеток CD19. Клетки РВМС выделяли, как описано выше, и трансфецировали при тех же условиях, что и в примере 3 (U14). Для трансфекции использовали олигонуклеотид siGLO красный в концентрации 2 мкМ, а специфический захват определяли методом FACS; дифференциальное определение клеток CD4 и CD8 осуществляли при одновременном двойном окрашивании с помощью CD8-FITC и CD3-APC (фиг. 6 А). Клетки РВМС получали, как описано выше, и из них выделяли клетки CD8. Затем оставшиеся клетки CDS-минус тоже трансфецировали siGLO красным, как описано выше (но при концентрации олигонуклеотида в 3,3 мкМ). Специфический захват определяли методом с помощью FACS при одновременном двойном окрашивании CD3-FITC и CD19-АРС (фиг. 6 В). Интересно, что в этом эксперименте также наблюдалось то, что эффективный захват используемого олигонуклеотида происходит и во фракции лимфоцитов CD3/CD19-минус, которая в основном содержит NK-клетки. Таким образом, данный пример свидетельствует, что другие иммунные клетки также могут быть трансфецированы с высокой эффективностью при тех же условиях трансфекции, что и клетки CD8. Пример 9. Кратковременное снижение экспрессии Cbl-b в клетках CD4 человека на уровне мРНК и белка. Клетки CD4 выделяли из PBMCs путем истощения клеток CD8 и культивировали со стимуляцией РНА/анти-CD3/28. Через 2 недели эти клетки CD4 трансфецировали Cbl-b-специфичной ниРНК по методике трансфекции фирмы Amaxa (см. примеры 3 и 8). Идентичную порцию клеток трансфецировали неспецифической ниРНК по такой же методике в качестве контрольной группы. После трансфекции клетки культивировали с IL-2 (5 нг/мл) еще один день и стимулировали анти-CD3/28 на следующий день. Экспресия мРНК Cbl-b в трансфецированном препарате снижалась приблизительно на 85% по сравнению с контрольной трансфекцией в клетках CD4, стимулированных в течение 24 ч (фиг. 7 А). Резкое снижение мРНК Cbl-b коррелировало со сравнительно сильным сокращением количества белка Cblb, обнаруженным на вестерн-блоте (фиг. 7 В). Пример 10. Усиление реактивности Т-клеток CD4-измерение цитокинов с противоопухолевой активностью. Одной из основных задач клеток CD4 в опосредованном Т-клетками иммунном ответе является выработка воспалительных цитокинов. В частности, в литературе упоминаются цитокины IL-2, IFN- иTNF-. Поэтому определяли экспрессию этих трех цитокинов методом ELISA. Через 24 ч после стимуляции анти-CD3/28 содержание этих трех цитокинов в Т-клетках CD4 человека при подавлении Cbl-b значительно возрастало (фиг. 8). Пример 11. Кратковременное течение усиления реактивности Т-клеток CD4 через повышение продукции цитокинов с противоопухолевой активностью. Для достижения эффективной противоопухолевой активности Т-клеток при подавлении Cbl-b также важно, чтобы в течение определенного времени после стимуляции Т-клеток поддерживалась повышенная продукция цитокинов. Однако такой период времени также должен быть ограниченным, чтобы минимизировать риск возникновения постоянного нежелательного аутоиммунитета по отношению к нераковым тканям пациента. Поэтому также анализировали продукцию IFN- методом FACS по внутриклеточному окрашиванию в различные моменты времени. Из диаграммы на фиг. 9 четко видно, что заметное повышение IFNсохранялось по меньшей мере в течение 48 ч, но через шесть дней после стимуляции оно вернулось к уровню, сравнимому с уровнем в контроле. Пример 12. Усиление реактивности Т-клеток CD4 - повышение экспрессии поверхностных молекул с функциональными свойствами и/или функцией маркеров стимуляции. Определение продукции соответствующих цитокинов в качестве маркеров функционально успешного подавления Cbl-b в Т-клетках человека технически более сложно и поэтому вряд ли может быть выполнено точно в срок. Поэтому также определяли экспрессию функционально важных поверхностных маркеров методом FACS.CD107 а описан в литературе как поверхностный маркер секреторной активности цитотоксических Т-лимфоцитов, поэтому его определяли при подавлении Cbl-b в Т-клетках CD8 через 24 ч после стимуляции анти-CD3/28. При этом Т-клетки, трансфецированные ниРНК Cbl-b, проявляли сильное повышение секреторной активности (фиг. 10 А). Поскольку в Т-клетках молекула CD107 а участвует в везикулярном транспорте, е тоже можно использовать в качестве основного маркера секреторной активности Т-клеток CD4. Из фиг. 10 В видно, что экспрессия CD107 а в трансфецированных ниРНК Cbl-b клетках также была значительной при сравнении с экспрессией в контрольных клетках, во всем остальном обработанных таким же образом.CD40L и ICAM - две другие поверхностные молекулы, которые могут индуцироваться при стимуляции Т-клеток. Эти две молекулы имеют функциональное значение, в частности, CD40L - для взаимодействия с антигенпрезентирующими клетками и для стимуляции/пролиферации В-клеток, a ICAM - для взаимодействия с антигенпрезентирующими клетками и миграции из сосудистой системы в (злокачественную) ткань. Из фиг. 10 В видно, что экспрессия этих двух поверхностных молекул существенно возрастает в трансфецированных ниРНК Cbl-b Т-клетках CD4 человека. Один из механизмов, описанный в настоящем изобретении как отвечающий за повышение реактивности Т-клеток, заключается в менее выраженном подавлении рецепторов CD3 на поверхности клеток. Из фиг. 10 В видно, что количество рецепторов CD3, все еще находящихся на поверхности клетки, также значительно повышается в трансфецированных ниРНК Cbl-b Т-клетках CD4 человека. Интересно, что экспрессия на поверхности клеток CD9 - традиционного маркера активации Тклеток тоже существенно повышалась, тогда как экспрессия CD25 оставалась без изменений. Это может иметь определенное функциональное значение, так как, хотя CD25 и описан как маркер стимуляции, его функция особенно связана с присутствием и выживанием так называемых Т-регуляторных клеток. В целом из фиг. 10 следует, что при трансфекции ниРНК Cbl-b на поверхности клеток в достаточно больших количествах обнаруживаются дополнительные функционально важные молекулы или молекулы, служащие поверхностными маркерами. Пример 13. Совместная пересадка Cbl-b-дефицитных Т-клеток и дендритных клеток является эффективной терапевтической процедурой на модели опухолей in vivo. У мышей дикого типа вызывали опухоли подкожной инъекцией 0,1 млн. клеток EG7ova. Затем на 5-й и 6-й день делали инъекции Т-клеток CD8 и дендритных клеток и непрерывно отслеживали эффект этой адоптивной терапии по измерениям роста опухоли. Из фиг. 11 А видно, что рост опухоли подавляется намного сильнее и на более длительный период времени при пересадке Cbl-b-дефицитных Т-клеток, чем Т-клеток дикого типа. Из фиг. 11 В также видно, что обработка Cbl-b-дефицитными Т-клетками обеспечивает долгосрочную выживаемость у значительной части обработанных мышей вплоть до конца 80-дневного периода наблюдения. В противоположность этому, обработка Т-клетками дикого типа приводила только к небольшому увеличению продолжительности жизни по сравнению с контрольной группой. Таким образом,из фиг. 11 В видно, что обработка Cbl-b-дефицитными или ингибированными Т-клетками имеет существенное преимущество по сравнению с обработкой нормальными Т-клетками. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Способ усиления иммунореактивности у пациента, включающий выделение по меньшей мере одной клетки иммунной системы пациента; обработку этой клетки in vitro или ex vivo по меньшей мере одним ингибитором или антагонистомCbl-b для увеличения иммунореактивности клетки и возвращение клетки в организм пациента; причем ингибитор или антагонист Cbl-b выбирают из группы, состоящей из последовательности ДНК с короткой цепью, комплементарной части Cbl-b мРНК последовательности, и последовательности РНК с короткой цепью, комплементарной части Cbl-b мРНК последовательности; указанная клетка, при необходимости, контактирует с антигеном, а иммунореактивность к антигену у пациента увеличивается путем снижения или ингибирования функции Cbl-b клетки. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что функция Cbl-b снижается или ингибируется путем снижения или ингибирования экспрессии Cbl-b. 3. Способ по п.1 или 2, отличающийся тем, что снижение или ингибирование функции Cbl-b является кратковременным. 4. Способ по любому из пп.1-3, отличающийся тем, что экспрессия Cbl-b снижается или ингибируется с помощью антисмысловой РНК или ниРНК Cbl-b. 5. Способ по любому из пп.1-4, отличающийся тем, что экспрессия Cbl-b снижается или ингибируется с помощью антагонистов, ингибиторов, аптамеров или интрамеров Cbl-b. 6. Способ по любому из пп.1-5, отличающийся тем, что клетки уже захватили антиген и предпочтительно презентируют фрагмент антигена или, что еще лучше, распознают фрагмент антигена в контекстеHLA и при этом активировались. 7. Способ по любому из пп.1-6, отличающийся тем, что клетки включают антигенпрезентирующие клетки, мононуклеары периферической крови (PBMCs), T-лимфоциты, В-лимфоциты, моноциты, макрофаги, NK-клетки, NKT-клетки и/или дендритные клетки, в частности Т-лимфоциты, предпочтительно Тлимфоциты CD8+ или CD4+. 8. Способ по любому из пп.1-7, отличающийся тем, что клетки обрабатываются иммуностимулирующим веществом, предпочтительно иммуностимулирующим цитокином, или лигандом других иммуностимулирующих рецепторов, или антителом к поверхностным молекулам, предпочтительно CD3 и/илиCD28. 9. Применение ингибиторов или антагонистов Cbl-b, выбранных из группы, состоящей из последовательности ДНК с короткой цепью, комплементарной части Cbl-b мРНК последовательности, и последовательности РНК с короткой цепью, комплементарной части Cbl-b мРНК последовательности, для изготовления фармацевтической композиции для усиления иммунореактивности к антигену у пациента путем выделения клеток иммунной системы пациента, повышения иммунореактивности клеток in vitro или ex vivo с помощью ингибиторов или антагонистов Cbl-b и реимплантации клеток пациенту, причем иммунореактивность повышается путем снижения или ингибирования функции Cbl-b этих клеток. 10. Применение по п.9 для лечения врожденной или приобретенной иммунной недостаточности, в частности СПИД, множественной миеломы, хронического лимфолейкоза, медикаментозной иммуносупрессии или рака. 11. Применение по п.10, отличающееся тем, что рак образует солидные опухоли. 12. Применение по п.10 или 11 для лечения рака в комбинации с другой противоопухолевой терапией, предпочтительно химиотерапией, радиотерапией, введением биопрепарата или вакцинацией с помощью дендритных клеток, в частности опухолевой вакцинацией. 13. Применение по любому из пп.9-12, отличающееся тем, что пациент подвергался вакцинации антигеном предпочтительно до выделения клеток, особенно предпочтительно не менее чем за 2 дня и/или не более чем за 8 недель до выделения клеток. 14. Применение по любому из пп.9-13, отличающееся тем, что клетки подвергаются контакту с антигеном in vitro или ex vivo. 15. Применение по любому из пп.9-14, отличающееся тем, что повышение иммунореактивности клеток in vitro или ex vivo определяется по пп.1-8. 16. Применение по любому из пп.9-15, отличающееся тем, что клетки специфичны к определенному антигену либо клетки, содержащие определенный антиген, отбираются по специфичности к антигену или по присутствию антигена, при этом иммунореактивность выбранных клеток возрастает. 17. Применение по п.16, отличающееся тем, что антиген является опухолевым антигеном. 18. Применение по любому из пп.9-17, отличающееся тем, что перед реимплантацией клетки размножают. 19. Контейнер, предпочтительно одноразовые пробирки, содержащие ингибитор Cbl-b, используемый в способе для усиления иммунореактивности клеток иммунной системы к антигену по любому из пп.1-8 или в применении по любому из пп.9-18. 20. Набор для выполнения способа по пп.1-8 или применение по пп.9-18, включающий контейнер по п.19. 21. Контейнер по п.19 или набор по п.20, дополнительно включающий иммуностимулирующее вещество, предпочтительно иммуностимулирующий цитокин, или лиганд других иммуностимулирующих рецепторов, или антитело к поверхностным молекулам, предпочтительно CD3 и/или CD28.