Очищенные аминоциклопропан-1-карбоксилат-синтаза и аминоциклопропан-1-карбоксилат-оксидаза растения кофе, кодирующие их нуклеиновые кислоты, способы трансформации клеток растения кофе и трансформированные клетки растения кофе

1 Область техники Данная заявка относится к аминоциклопропан-1-карбоксилат(АЦК)-синтазе и аминоциклопропан-1-карбоксилат(АЦК)-оксидазе растения кофе, кодирующим их нуклеиновым кислотам, способам трансформации клеток растения кофе с целью подавления экспрессии указанных выше ферментов в плодах кофе и трансформированным клеткам растения кофе. Данная заявка относится также к растениям кофе,трансформированным указанными выше нуклеотидными последовательностями, в результате чего растения кофе оказываются не способными синтезировать этилен, необходимый для созревания плодов. Введение экзогенного этилена в растения, трансформированные способом по настоящему изобретению, дает возможность синхронизировать и управлять созреванием плодов растений кофе. Предпосылки изобретения Кофе готовят из обжаренных и перемолотых зерен растений рода Кофе (Coffea), обычно из вида С. arabica. Зерна представляют собой семена растений кофе, которые получают путем обработки плодов, причем хорошо вызревших плодов, что позволяет установить наиболее выгодную цену благодаря их высокому качеству. Раньше кофе высокого качества "для гурманов" собирали вручную. Это было необходимо, так как плоды кофе созревают не одновременно, т.е. на одном дереве одновременно находятся плоды с различной степенью зрелости. Раньше это не являлось серьезной проблемой, т.к. основное количество кофе выращивали в местах, где рабочие руки имелись в большом количестве, а труд ценился дешево. Однако в последние годы нехватка дешевой рабочей силы существенно снизили эффективность производства кофе. Для повышения эффективности производства в некоторых районах мира, например, в такой крупнейшей стране-производителе кофе, как Бразилия, стали пользоваться таким способом сбора урожая, при котором рабочие снимают все плоды подряд, как созревшие, так и незрелые (зеленые). Более того, неодновременное созревание плодов существенно уменьшает эффективность механизированного сбора урожая. Усилие, необходимое для отрыва созревшего (темнокрасного) плода от дерева, аналогично усилию,которое требуется для отрыва зеленого плода. Поэтому машины для сбора плодов не отличают зеленые плоды от темно-красных, в итоге большое количество незрелых плодов собирают вместе со зрелыми. Это сильно уменьшает выход зрелых плодов и эффективность производства. Если бы можно было управлять процессом созревания плодов таким образом, чтобы все плоды созревали одновременно, механизированная уборка урожая стала бы более эффективной, и собранные плоды были бы более высокого каче 004060 2 ства. Это увеличило бы доходность производства кофе. Как и в случае со многими другими плодами (Yang and Hoffman, Ann. Rev. Plant Physiol. 35:155 (1984, продуцируемый растениями этилен играет важную роль на завершающих стадиях созревания плодов кофе. Как только плод достиг определенной стадии развития, его созревание можно стимулировать путем введения экзогенного этилена (Crisosto, С.Н., Р.С. Tausend, M.A. Nagao, LH. Fuchigami and T.H.H.Chen. J. Haw. Рас. Agri. 3:13-17 (1991. Данный факт демонстрирует важность этилена на завершающих стадиях созревания плодов кофе. Этилен синтезируется в процессе двухстадийной реакции из S-аденозилметионина(SAM). Первая стадия заключается в синтезе аминоциклопропан-1-карбоновой кислоты(АЦК) из SAM с помощью АЦК-синтазы. В большинстве растений эта стадия лимитирует скорость реакции. Конечной стадией реакции является превращение АЦК в этилен, катализируемое АЦК-оксидазой (Yang and Hoffman, см. выше). Ингибирование биосинтеза этилена с помощью химических (например, ионами серебра или двуокисью углерода) или биотехнологических средств (Oeller et. al., Science 254:437(1991 замедляет конечные стадии созревания кофе. Это ингибирование является обратимым благодаря введению этилена. Следовательно, стратегия управления созреванием растений кофе заключается в предотвращении синтеза специфических ферментов в процессе биосинтеза этилена. В одной реализации настоящее изобретение относится к генетическому изменению растений кофе с целью ограничения синтеза АЦК-синтазы, в другой - к подавлению синтеза АЦК-оксидазы. В предпочтительных реализациях синтез одного или обоих ферментов подавляют путем трансформации растений кофе последовательностью ДНК, определяющей транскрипцию РНК, которая является антисмысловой по отношению к матричной РНК (мРНК), определяющей экспрессию фермента, синтез которого необходимо подавить. См. Oeller et. al., Science 254:437 (1991), где сообщается об управлении созреванием томатов с использованием аналогичной стратегии. Технологию рекомбинантной ДНК применяли для выделения нескольких генов АЦКсинтазы и АЦК-оксидазы. Однако до настоящего времени гены АЦК-синтазы и АЦК-оксидазы растений кофе не были идентифицированы и секвенированы. Сущность изобретения Настоящее изобретение дает очищенные аминоциклопропан-1-карбоксилат(АЦК)-синтазу и аминоциклопропан-1-карбоксилат(АЦК)оксидазу растения кофе, кодирующие их нуклеотидные последовательности для трансформации клеток растения кофе с целью подавле 3 ния экспрессии указанных выше ферментов,необходимых для синтеза этилена. Растения кофе трансформируют с помощью векторов,содержащих нуклеотидные последовательности АЦК-синтазы и/или АЦК-оксидазы, которые вводят таким образом, что трансформирующие последовательности определяют транскрипцию соответствующих РНК, которые являются антисмысловыми по отношению к мРНК АЦКсинтазы и/или АЦК-оксидазы. Полученная антисмысловая РНК связывается с мРНК, определяющей экспрессию одного или более ферментов в процессе биосинтеза этилена, и таким образом инактивирует ее. Описанные нуклеотидные последовательности также можно применять для предотвращения синтеза АЦК-синтазы или АЦК-оксидазы, используя косупрессию. Итогом любой реализации является то, что трансформированные растения становятся не способными синтезировать этилен, при этом другие аспекты их метаболизма не затрагиваются. Созревание трансформированных растений можно регулировать путем введения экзогенного этилена. При введении этилена в целое растение, его плоды будут созревать одновременно, что сделает механизированный сбор урожая более производительным. Описание рисунков Фиг. 1 представляет полноразмерную последовательность кДНК, определяющую экспрессию АЦК-синтазы в плодах кофе. Фиг. 2 представляет аминокислотную последовательность АЦК-синтазы из плодов кофе,выведенную из последовательности кДНК,представленной на фиг. 1. Фиг. 3 представляет последовательность кДНК, определяющую экспрессию АЦКоксидазы в плодах кофе. Фиг. 4 представляет аминокислотную последовательность АЦК-оксидазы из плодов кофе, выведенную из последовательности кДНК,представленной на фиг. 3. Подробное описание изобретения Для лучшего понимания настоящего изобретения предлагается следующее подробное описание, в котором используются термины: Нуклеотид - Мономерная единица ДНК или РНК, состоящая из углеводного остатка(пентозы), фосфата и азотистого гетероциклического основания. Основание связано с углеводным остатком через гликозидный атом углерода(1'-атом углерода пентозы), и эта комбинация основания и углевода называется нуклеозидом. Основание характеризует нуклеотид. Четыре основания ДНК - это аденин ("А"), гуанин ("G"),цитозин ("С") и тимин ("Т"). Четыре основания РНК - это А, G, С и урацил ("U"). Последовательность ДНК - Линейная цепь нуклеотидов, связанных друг с другом фосфодиэфирными связями между 3'- и 5'-атомами углерода соседних пентоз. 4 Кодон - Последовательность ДНК из трех нуклеотидов (триплет), которая кодирует через РНК аминокислоту, сигнал начала трансляции или сигнал окончания трансляции. Например,триплеты нуклеотидов ТТА, TTG, СТТ, СТС,СТА и CTG кодируют аминокислоту лейцин(Leu), TAG, TAA и TGA кодируют сигналы окончания трансляции, ATG кодирует сигнал начала трансляции и аминокислоту метионин(Met). Полипептид - Линейная последовательность аминокислот, связанных друг с другом пептидными связями между амино- и карбоксильными группами соседних аминокислот. Геном - Суммарная ДНК клетки или вируса. Он включает среди прочего структурный ген, кодирующий полипептиды вещества, а также промотор, сайты начала и окончания транскрипции и трансляции. Ген - Последовательность ДНК, кодирующая через ее матричную РНК (мРНК) последовательность аминокислот, характерную для специфического полипептида. Транскрипция - Процесс получения мРНК из гена или последовательности ДНК. Трансляция - Процесс получения полипептида из мРНК. Экспрессия - Процесс получения полипептида под действием гена или последовательности ДНК. Комбинация транскрипции и трансляции. Плазмида - внехромосомная двухцепочечная последовательность ДНК, включающая интактный "репликон", обеспечивающий репликацию плазмиды в клетке-хозяине. При помещении плазмиды в одноклеточный организм, характеристики этого организма могут быть изменены или трансформированы благодаря ДНК плазмиды. Например, плазмида, несущая ген устойчивости к тетрациклину (TETR), трансформирует клетку, ранее чувствительную к тетрациклину, в клетку, устойчивую к нему. Клетка, трансфомированная плазмидой, называется"трансформантом". Фаги или Бактериофаги - бактериальные вирусы, многие из которых состоят из последовательностей ДНК, заключенных в белковую оболочку ("капсид"). Клонирующий вектор - Плазмида, фаговая ДНК, космида или другая последовательность ДНК, способная реплицироваться в клеткехозяине, характеризующаяся одним или несколькими сайтами узнавания эндонуклеаз, в которых такие последовательности ДНК могут быть разрезаны поддающимся определению образом без потери необходимой биологической функции ДНК, например, репликации, продукции белков оболочки, или без потери промотора или сайтов связывания, и которые содержат маркер, подходящий для идентификации трансформированных клеток, например, ген устойчи 5 вости к тетрациклину или ампициллину. Клонирующий вектор часто называют вектором. Клонирование - Процесс получения популяции организмов или последовательностей ДНК, полученных от одного из таких организмов, или последовательность бесполой репродукции. Рекомбинантная ДНК или гибридная ДНК молекула, состоящая из фрагментов ДНК из различных геномов, которые соединены непрерывно ("конец-к-концу") вне живой клетки и способны поддерживаться в живых клетках. кДНК - Цепь ДНК, комплементарная мРНК, кодирующая специфические полипептиды. Согласно настоящему изобретению стратегия управления биосинтезом этилена в растениях кофе состоит в первую очередь в определении генов, определяющих экспрессию двух ферментов в процессе биосинтеза этилена: АЦК-синтазы и АЦК-оксидазы. Полагают, что трансформация дикорастущих растений кофе конструкциями, содержащими один или оба гена в антисмысловой ориентации по отношению к нормальным генам, будет блокировать синтез соответствующих ферментов. Матричная РНК, транскрибированная с трансформирующей последовательности, будет связываться с мРНК,транскрибированной с нормальной последовательности, инактивируя таким образом нормальный транскрипт и предотвращая синтез фермента. Для выделения последовательностей ДНК,определяющих экспрессию АЦК-синтазы и АЦК-оксидазы в растениях кофе, проводили скрининг библиотеки кДНК, полученной из ткани растений кофе, с помощью синтетических ДНК-зондов, содержащих предполагаемые последовательности нуклеотидов. Эти предполагаемые последовательности были основаны на изучении нуклеотидных последовательностей генов, кодирующих соответствующие ферменты других климактерических растений. В настоящем изобретении для трансформации зародышей растений кофе использовали кДНК, соответствующую гену, кодирующему АЦК-синтазу или АЦК-оксидазу. В качестве трансформирующего вектора использовали плазмиду pBI-121. Последовательности, соответствующие ДНК, определяющей экспрессию АЦК-синтазы и АЦК-оксидазы, вводили в плазмиду в инвертированной ориентации рядом с 35S промотором вируса мозаики цветной капусты. РНК, транскрибированная с таких последовательностей, будет комплементарна мРНК,кодирующей аминокислотную последовательность соответствующего фермента. Целые конструкции амплифицировали в бактериальных клетках. Клетки-хозяева разрушали и амплифицированный вектор присоединяли к коллоидным частицам золота. Частицы золота с присоединенными векторами вводили в ткань растений 6 кофе путем обстрела клеток этими частицами с большой скоростью, как описано в патенте US 5107065. Успешно трансформированные молодые растения идентифицировали по их устойчивости к антибиотикам. Трансформированные растения не продуцировали АЦК-синтазу или АЦК-оксидазу, в зависимости от гена, который использовали для трансфомации растений. Созревание трансформированных растений индуцировали введением экзогенного этилена. Пример 1. Выделение кДНК АЦК-синтазы плодов кофе. Для выделения последовательностей генов АЦК-синтазы, влияющих на процесс созревания растений кофе, готовили библиотеку кДНК из смеси тканей перикарпия и мезокарпия плодов кофе на различных стадиях спелости. Проводили скрининг этой библиотеки с использованием ПЦР-продукта, синтезированного из однонитевой кДНК, полученной из той же мРНК, используемой для конструирования библиотеки и вырожденных олигонуклеотидных праймеров, соответствующих усредненным последовательностям, полученным из генов АЦК-синтазы других организмов. Этот пример, главным образом,включает выделение мРНК, конструирование библиотеки кДНК и последовательные стадии,включающие клонирование подходящей кДНК. а) Выделение мРНК. Общую РНК выделяли из 66 г ткани перикарпия и мезокарпия плодов кофе вида С.arabica L. cv Guatemalan на различных стадиях спелости по методу Леви (Levi et al., Hort Science 27 (12): 1316-1318 (1992. Замороженную ткань перикарпия и мезокарпия измельчали на бытовой кофемолке (Salton model GC-5; SaltonMaxam Housewares Group, Mt. Prospect, IL) в течение 2 мин с небольшим кусочком сухого льда. К измельченной ткани плодов добавляли 200 мкл 200 мМ трис-НСl (трис-гидроксиметиламинометана гидрохлорид) (рН 8,5), 1,5% додецилсульфата натрия (ДСН), 300 мМ LiCl,10 мМ двунатриевой соли этилендиаминтетрауксусной кислоты (Nа 2 ЭДТА), 1,5% дезоксихолата натрия (в:об), 1,5% Nonidet P-40 (SigmaChemical Co.) (об:об), 0,5 мМ тиомочевины, 1 мМ ауринтрикарбоновой кислоты, 10 мМ дитиотреитола (ДТТ), 75 мМ -меркаптоэтанола, 2% поливинилпирролидона (PVP) и 2% поливинилполипирролидона (PVPP) и гомогенизировали в гомогенизаторе для тканей Polytron (Tekmar,Cincinnati, ОН). После 2 мин гомогенизации добавляли 200 мкл хлороформа и гомогенизацию продолжали еще 3 мин. Гомогенат переносили в центрифужные пробирки на 250 мкл(Nalgene) и центрифугировали 15 мин при 2500 х g. Верхнюю водную фазу отбирали и смешивали с 12 мкл 5 М NaCl, разделяли на две равные части, которые помещали в две центрифужные пробирки, и в каждую пробирку прибавляли по 150 мкл этанола. Смесь выдерживали в течение ночи при -20 С. РНК собирали пу 7 тем центрифугирования при 4000 х g в течение 15 мин при 4 С, затем растворяли в 50 мкл буфера ТЕ 1 (50 мМ трис-НСl (рН 8,0), 10 мМNа 2 ЭДТА) и осветляли путем центрифугирования при 12000 х g в течение 10 мин при 4 С. Супернатант переносили в новую центрифужную пробирку и добавляли 3 мкл 5 М NaCl и 30 мкл изопропанола. Содержимое перемешивали и выдерживали в течение ночи при -20 С. РНК собирали путем центрифугирования при 14000 хg в течение 10 мин, затем промывали 20 мкл 70% ледяного этанола и снова центрифугировали, как описано выше. После 10 мин сушки под вакуумом РНК ресуспендировали в 50 мкл буфера ТЕ 1 и добавляли 10 мкл 12 М LiCl. Раствор инкубировали при 4 С в течение 48 ч, РНК собирали путем центрифугирования при 14000 хg в течение 10 мин и ресуспендировали в 30 мкл буфера ТЕ 1. После добавления 15 мкл 5 М ацетата калия РНК инкубировали в течение ночи при 0 С, снова центрифугировали при 14000 х g в течение 10 мин и суспендировали в 50 мкл буфера ТЕ 1. Добавляли 3 мкл 5 М NaCl и 110 мкл 95% этанола и инкубировали в течение ночи при -20 С. РНК центрифугировали при 14000 х g в течение 10 мин, промывали 20 мкл 70% ледяного этанола и центрифугировали, как описано выше, сушили 10 мин под вакуумом и ресуспендировали в 600 мкл буфера ТЕ 1. РНК переносили в микроцентрифужную пробирку,центрифугировали при 14000 об./мин в течение 30 мин при 4 С, после чего 300 мкл суспензии переносили в две новых микроцентрифужных пробирки. Исходную пробирку дополнительно промывали 300 мкл буфера ТЕ 1. В каждую из трех пробирок добавляли 18 мкл 5 М NaCl и 636 мкл 100% этанола. После перемешивания переворачиванием, пробирки выдерживали в течение ночи при -20 С. РНК собирали путем центрифугирования при 14000 об./мин в течение 30 мин и промывали 1 мкл 70% ледяного этанола. После центрифугирования и сушки, как описано выше, РНК ресуспендировали в 400 мкл стерильной воды. В результате получили 1,04 мг общей РНК. Матричную РНК (полиА+-РНК) выделяли с использованием набора PolyATtractR mRNAIsolation System IV (Promega Corporation, Madison, Wl). Два выделения проводили следующим образом. Для каждого выделения 0,48 мг общей РНК растворяли в 800 мкл воды, очищенной от РНКазы. После нагревания в течение 10 мин при 65 С добавляли 3 мкл 50 пкмоль/мл биотинилированного олиго-(dT) и 20,7 мкл 20 х SSC(1 х SSC содержит 150 мМ NaCl и 15 мМ цитрата натрия), смесь медленно охлаждали до комнатной температуры в течение приблизительно 30 мин. Аликвоту парамагнитных частиц со стрептавидином (из PolyATtrackR mRNA Isolation System IV) промывали трижды в 0,5 х SSC и суспендировали в 0,1 мл 0,5 х SSC. Раствор РНК, содержащий биотинилированный oлигo 004060(dT), добавляли к промытым парамагнитным частицам со стрептавидином. После 10 мин инкубации при комнатной температуре парамагнитные частицы, содержащие "захваченные" мРНК, осаждали на стенках пробирки, используя магнит. Супернатант удаляли, частицы промывали 4 раза по 0,3 мл 0,1 х SSC. РНК отделяли от биотинилированных олиго-(dТ) путем суспендирования в 200 мкл воды, очищенной от РНКазы. Дополнительную элюцию осуществляли путем последовательного добавления в каждую из двух пробирок 150 мкл воды. Промывки (550 мкл) объединяли и центрифугировали при 14000 об./мин в течение 30 мин при 4 С в микроцентрифуге. Супернатант разделяли на две микроцентрифужные пробирки и после добавления 1/10 объема 3 М NaCl и 600 мкл этанола, выделяли мРНК путем инкубации в течение ночи при -20 С и последующего центрифугирования,как описано выше. мРНК промывали 1 раз 1 мл ледяного 70% этанола, сушили и ресуспендировали в 20 мкл стерильной воды. Один мкл полученного раствора добавляли к 1 мл воды и проводили спектральный анализ в диапазоне от 230 нм до 330 нм на спектрофотометре ShimadzuUV 160U. Из 1,04 мг общей РНК было получено около 6 мкг мРНК.b) Конструирование библиотеки кДНК. Первая и вторая нити кДНК были синтезированы с использованием набора для синтезаZAP-cDNA (Stratagene, La Jolla, CA). 6 мкг мРНК инкубировали в 20 мкл воды при 65 С в течение 5 мин. Добавляли 2 мкл 100 мМ метилртути и продолжали инкубировать при комнатной температуре 10 мин. Добавляли 4 мкл 700 мМ -меркаптоэтанола и инкубировали еще 5 мин. К денатурированной мРНК добавляли 5 мкл 10 х буфера для синтеза первой нити (из набора), 5 мкл 100 мМ ДТТ, 3 мкл смеси нуклеотидов (по 10 мМ dATP, dGTP, dTTP и 5 метил-dCТР), 2 мкл 1,4 мкг/мкл линкерпраймера 1 мкл блокирующей РНКазы и 5 мкл воды. Смесь инкубировали при комнатной температуре 10 мин для отжига праймера с мРНК, затем добавляли 3 мкл 20 ед./мкл обратной транскриптазы M-MuLV. 5 мкл этой реакционной смеси переносили в пробирку, содержащую 0,5 мкл (0,625 пкмоль) 800 Ки/ммоль [-32P]-dATP. Обе реакции инкубировали при 37 С 1 ч. Реакционную смесь с радиоактивной меткой замораживали при -20 С для дальнейшего анализа в геле. К 45 мкл основной реакционной смеси добавляли 40 мкл буфера для синтеза второй нити, 15 мкл 100 мМ ДТТ, 6 мкл смеси нуклеотидов (по 10 мМ dATP, dGTP, dTTP и 26 мМdCTP), 268,3 мкл воды и 2 мкл (2,5 пкмоль) 800 Ки/ммоль [-32P]-dATP. После перемешивания к реакционной смеси добавляли 4,5 мкл 1 ед./мкл 9 РНКазы Н и 19,2 мкл 5,2 ед./мкл ДНКполимеразы I E. coli и инкубировали при 16 С в течение 2,5 ч. Затем реакционную смесь экстрагировали 400 мкл смеси фенол:хлороформ (1:1). Фазы разделяли центрифугированием в микроцентрифуге в течение 5 мин, водную фазу удаляли и снова экстрагировали хлороформом. Водную фазу получали центрифугированием,как описано выше. Двунитевую кДНК осаждали добавлением 33,3 мкл 3 М ацетата натрия (рН 5,2) и 867 мкп 100% этанола и инкубировали при -20 С в течение ночи. кДНК выделяли центрифугированием при 14000 х g в микроцентрифуге при 4 С в течение 60 мин. кДНК промывали 1 мл 80% этанола и выделяли центрифугированием при 14000 х g в микроцентрифуге при комнатной температуре, сушили под вакуумом и растворяли в 45 мкл воды. 3 мкл ресуспендированной двунитевой кДНК отбирали и хранили при-20 С для дальнейшего анализа с помощью гель-электрофореза. К оставшимся 42 мкл двунитевой кДНК добавляли 5 мкл 10 х буфера Кленова (буфер 3; из набора Stratagene), 2,5 мкл 2,5 мМ смеси нуклеотидов (dCTP, dATP, dGTP, dTTP) и 0,5 мкл 5 ед./мкл фрагмента Кленова ДНК-полимеразы IE. coli. После 30 мин инкубации при 37 С добавляли 50 мкл воды, реакционную смесь экстрагировали равным объемом смеси фенол:хлороформ (1:1) и затем хлороформом, как описано выше. После добавления 7 мкл 3 М ацетата натрия (рН 5,2) и 226 мкл 100% этанола двунитевую кДНК с тупыми концами инкубировали на льду 30 мин и центрифугировали при 14000 х g при 4 С в течение 60 мин в микроцентрифуге. кДНК промывали 300 мкл 70% этанола, центрифугировали и сушили, как описано выше. К высушенной кДНК добавляли 7 мкл 0,4 мкг/мкл EcoRI-линкеров. Структура EcoRIлинкеров следующая: После перемешивания к ресуспендированной кДНК добавляли 1 мкл 10 х лигирующего буфера, 1 мл 10 мМ АТР и 1 мкл 4 Weiss ед./мкл ДНК-лигазы фага Т 4, смесь инкубировали в течение ночи при 8 С. Лигазу инактивировали нагреванием при 70 С в течение 30 мин. 5'концы EcoRI-линкеров, присоединенных к кДНК, фосфорилировали с помощью полинуклеотидкиназы. К реакционной смеси добавляли 1 мкл 10 х буфера 3 из набора для синтезаZAP-cDNA (Stratagene, La Jolla, CA), 2 мкл 10 мМ АТР, 6 мкл воды и 1 мкл 10 ед./мкл полинуклеотидкиназы фага Т 4. Через 30 мин при 37 С реакцию останавливали нагреванием до 70 С в течение 30 мин. ХhоI-"Липкие концы" получали на конце кДНК, соответствующем 3'концу мРНК, путем расщепления XnoI-сайта в линкер-праймере. 28 мкл XnoI-буфера и 3 мкл 10 40 ед./мл рестриктазы XhoI смешивали с кДНК,и смесь инкубировали при 37 С 1,5 ч. кДНК с "липкими концами", образованными рестриктазой EcoRI на 5'-конце, и с "липкими концами", образованными рестриктазойXnoI на 3'-конце (относительно природной мРНК), фракционировали по размеру на вращающейся колонке Sephacryl S-400, как описано ниже. К кДНК добавляли 5 мкл 10 х буфера STENaCl), и кДНК наносили на верхнюю часть 1 мл шприца, содержащего Sephacryl S-400 (Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ). Микроцентрифужную пробирку на 500 мкл помещали в основании шприца, шприц помещали в центрифужную пробирку и центрифугировали 2 мин при 400 хg. Затем добавляли 60 мкл 1 х STE буфера в верхнюю часть шприца, новую микроцентрифужную пробирку помещали в основании шприца и снова центрифугировали, как описано выше. Эту процедуру повторяли, пока не было собрано 6 фракций. Приблизительно 10% каждой фракции анализировали с помощью электрофореза в 1%-ном агарозном геле для определения распределения кДНК по размерам в каждой фракции. Остаток каждой фракции экстрагировали равным объемом смеси фенол:хлороформ, затем хлороформом, как описано выше, и осаждали путем добавления 2 объемов 100% этанола. После инкубации в течение ночи при -20 С выделяли кДНК центрифугированием при 14 000 об./мин при 4 С в течение 60 мин в микроцентрифуге. Каждую фракцию кДНК промывали 200 нл 80% этанола и сушили,как описано выше. Затем фракцию 1 кДНК ресуспендировали в 3 мкл стерильной воды, а фракцию 2 кДНК ресуспендировали в 10,5 мкл стерильной воды. Отбирали по 0,5 мкл каждой из двух фракций для определения количества ДНК с помощью бромистого этидия. Фракции 1 и 2, содержащие самые большие молекулы кДНК, объединяли. 12,5 мл объединенных фракций содержали около 100 нг кДНК. Эту фракцию уменьшали до 2,5 мкл в Speed-Vac и хранили на льду. Фракцию 3 кДНК ресуспендировали в 10,5 мкл стерильной воды и хранили при -20 С для дальнейшего использования. 100 нг кДНК из фракций 1 и 2 лигировали в 1 мкг Uni-Zap (Stratagene, La Jolla, CA), вектор лямбдаZАР, который был расщеплен рестриктазами EcoRI и ХhоI. Фракции 1 и 2 кДНК(2,5 мкл) добавляли к 0,5 мкл 10 х лигирующего буфера, 0,5 мкл 10 мМ АТР, 1 мкл 1 мкг/мкл вектора Uni-Zap XR и 0,5 мкл 4 Weiss ед./мкл ДНК-лигазы фага Т 4. Реакционную смесь инкубировали при 8 С в течение 44 ч. Затем аликвоту 1 мкл реакционной смеси прибавляли к одной аликвоте экстракта "Freeze-Thaw" из набора(Stratagene, La Jolla, CA). Добавляли 15 мкл озвученного экстракта и осторожно перемешивали. Упаковку проводили при комнатной темпе 11 ратуре. Через 2 ч к каждой реакционной смеси прибавляли по 500 мкл буфера SM и 20 мкл хлороформа, дебрис удаляли коротким центрифугированием в микроцентрифуге. Упакованные фаги переносили в новую микроцентрифужную пробирку. Прибавляли 10 мкл хлороформа и хранили при 4 С до использования. Титр этой первичной библиотеки показал присутствие 0,7 х 106 рекомбинантных колоний. с) Амплификация первичной библиотеки. 600 мкл клеток Е. coli XL1-Blue MRF'(Stratagene, La Jolla, CA), выращенных до плотности OD600=0,5, и 32,5 мкл исходного раствора первичной библиотеки добавляли в каждую из 16 пробирок. После инкубации при 37 С в течение 15 мин в каждую пробирку прибавляли по 6 мл фракции агара, разогретой до 48 С (5 г/лNaCl, 2 г/л MgSO47H2O, 5 г/л дрожжевого экстракта, 10 г/л NZ амина (рН 7,5) и 0,7% агарозы), содержимое высевали на чашки размером 100 х 15 мм со средой NZY (5 г/л NaCl, 2 г/лNZ амина (рН 7,5), 15 г/л агара фирмы Difco). Чашки инкубировали в течение ночи при 37 С,затем в каждую чашку наслаивали по 10 мл буфера SM и инкубировали при 4 С еще 8 ч при осторожном перемешивании. Затем стерильной пипеткой отбирали SM буфер и хранили в стерильной центрифужной пробирке на 250 мл. Каждую чашку промывали 10 мл свежего SM буфера, который затем собирали и объединяли с ранее отобранным SM буфером. К раствору фага добавляли хлороформ до конечной концентрации 5%, и полученную смесь инкубировали при комнатной температуре в течение 15 мин и затем центрифугировали 10 мин при 2000 х g для удаления клеточного дебриса. Супернатант переносили в стерильную полипропиленовую пробирку и добавляли хлороформ до конечной концентрации 0,3%. Амплифицированную библиотеку хранили при 4 С.d) Высев амплифицированной библиотеки для скрининга определенных генов. Титр аплифицированной библиотеки определяли, как описано выше. Приблизительно 50000 рекомбинантных колоний прибавляли к 600 мкл клеток Е. coli XL1-Blue MRF', выращенных, как описано выше. После 15 мин инкубации при 37 С добавляли 6,5 мл фракции агара, разогретой до 48 С, и высевали на чашки размером 100 х 15 мм со средой NZY. Получали 4 чашки, содержащие суммарно 200000 рекомбинантных колоний, которые инкубировали в течение ночи при 37 С. Затем чашки охлаждали 4 ч при 4 С и использовали для приготовления образцов колоний, как описано ниже.e) Идентификация и конструирование олигонуклеотидов, гомологичных генам АЦКсинтазы растений кофе. В предыдущих исследованиях, описанных в заявке на патент US 08/485107, которые приводятся здесь в качестве ссылки, авторы данно 004060 12 го изобретения идентифицировали нуклеотидные последовательности, общие для АЦКсинтаз ряда растений, которые упоминаются здесь как усредненные последовательности. На основании этих исследований авторы разработали набор из трех (3) полностью вырожденных праймеров для ПЦР-амплификации участков первой нити кДНК растений кофе, соответствующей этим усредненным последовательностям. Последовательности этих праймеров следующие:f) Реакция с обратной транскриптазой для получения первой нити кДНК растений кофе. Реакцию с обратной транскриптазой для получения первой нити кДНК проводили в объеме 20 мкл, используя набор GeneAmp RNAPCR Core Kit (Perkin Elmer, Foster City, CA). Сначала 0,9 мкг мРНК плодов кофе в 3 мкл воды смешивали с 1 мкл 50 мкМ произвольного гексамера и 6 мкл стерильной воды в микроцентрифужной пробирке и инкубировали 5 мин при 65 С. Затем смесь оставляли на 2 мин при комнатной температуре и отделяли водный слой с помощью короткого центрифугирования. К этой смеси добавляли 2 мкл ПЦР-буфера II (из указанного набора), 4 мкл 25 мМ МgСl2, 2 мкл 10 мМ смеси нуклеотидов dNTP, 1 мкл RNAsin (20 ед./мкл) и 1 мкл (50 ед./мкл) обратной транскриптазы. Реакцию инкубировали при 42 С в течение 1 ч, после чего обратную транскриптазу инактивировали нагреванием на водяной бане при 95 С в течение 5 мин.g) Полимеразная цепная реакция для амплификации гена АЦК-синтазы растений кофе. Полимеразную цепную реакцию (ПЦР)(Saiki et. al., 1988) проводили с использованием набора GeneAmp Kit (см. выше) в объеме 50 мкл, содержащем 10 мкл смеси первых нитей кДНК, 4 мкл ПЦР-буфера II, 1 мкл 25 мМMgCl2, 2,5 мкл 20 мкМ праймера АС 5167 (SEQ.ID. NO. 3), 2,5 мкл 20 мкМ праймера АС 5885(SEQ. ID. NO. 5), 29,5 мкл стерильной воды и 0,5 мкл Taq ДНК-полимеразы (5 ед./мкл). Условия для ПЦР были следующие: 35 циклов при 94 С - 1 мин, 44 С -1 мин, 72 С - 2 мин. Продукт ПЦР анализировали с помощью электрофореза в агарозном геле из 1,5% агарозы SeaPlaque (FMC BioProducts, Rockland, ME), в качестве маркеров размеров использовали ДНК фага фХ 174, расщепленную рестриктазой HaeIII(Promega Corporation, Madison, WI). Был получен единственный ПЦР-продукт, имеющий около 650 пар оснований.h) Амплификация ПЦР-продукта с помощью различных праймеров. Участок геля с ПЦР-продуктом, имеющим 650 пар оснований, вырезали и помещали в микроцентрифужную пробирку на 1,5 мл. После добавления 200 мкл стерильной воды этот фрагмент нагревали при 90 С 5 мин, охлаждали до комнатной температуры и центрифугировали 5 мин при 14000 об./мин в микроцентрифуге. Супернатант, содержащий амплифицированную ДНК, отбирали и помещали в новую стерильную микроцентрифужную пробирку на 1,5 мл. Реакцию ПЦР проводили в объеме 25 мкл с использованием 0,4 мкл ранее амплифицированной ДНК в качестве матрицы, 2,5 мкл 10 х буфера ПЦР (10 мМ трис-HCl, рН 9,0, 0,1% тритон Х-100), 2 мкл 25 мМ MgCl2, 5 мкл 1 мМ dNTPs,1 мкл 20 мкМ праймера ACS289 (SEQ. ID. NO. 5), 1 мкл 20 мкМ праймера ACS885 (табл. 2),12,8 мкл воды и 0,3 мкл Taq ДНК-полимеразы (5 ед./мкл) (Promega Corporation, Madison, WI). Условия для ПЦР были следующие: 35 циклов при 94 С - 1 мин, 45 С - 1 мин, 72 С - 2 мин. 5 мкл этой реакционной смеси анализировали в 1,5% агарозном геле, как описано выше. Был получен единственный продукт, имеющий приблизительно 603 п.о. К оставшемуся количеству реакционной смеси добавляли 80 мкл стерильной воды, 10 мкл 3 М ацетата натрия (рН 5,2) и 220 мкл 100% этанола. После инкубации в течение ночи при 20 С выделяли ДНК путем центрифугирования при 4 С в течение 30 мин при 14000 об./мин. ДНК промывали 400 мкл 75% ледяного этанола и ресуспендировали в 25 мкл стерильной воды. Путем анализа на пластинах с бромистым этидием опредилили, что концентрация ДНК составляет 10 нг/мкл.i) Введение метки в ДНК АЦК-синтазы плодов кофе. С использованием ДНК АЦК-синтазы, полученной с помощью ПЦР, и набора Prime-agene Kit (Promega Corporation, Madison, WI) синтезировали произвольно примированный зонд. 2,5 мкл ДНК (25 нг) добавляли к 27,5 мкл стерильной воды и денатурировали кипячением в течение 5 мин. Затем добавляли 10 мкл 5 х буфера для мечения, 2 мкл немеченных dNTPP] dАТР (3000 Ки/ммоль) (Dupont-NEN) до получения конечного объема 50 мкл. После 1 ч инкубации при комнатной температуре реакцию прекращали добавлением 2 мкл 0,5 М Nа 2 ЭДТА и кипятили 2 мин.j) Скрининг амплифицированной библиотеки с помощью зонда, специфичного к АЦКсинтазе. Приготавливали четыре чашки 150 х 15 мм со средой NZY, каждая из которых содержала 50000 рекомбинантных клонов. Четыре нейло 004060Separations, Incorporated, Westborough, MA) увлажняли, помещая их на хроматографическую бумагу, насыщенную 5 х SSC приблизительно на 10 с. Затем мембраны помещали на чашки с рекомбинантными колониями на 5 мин, вынимали и инкубировали их 2 мин на хроматографической бумаге, насыщенной раствором, содержащим 0,5 М NaOH и 1,5 М NaCl, помещая вверх сторону, содержащую фаги. Затем мембраны нейтрализовали, помещая их на 5 мин на хроматографическую бумагу, насыщенную 0,5 М трис-НСl (рН 8,0) и 1,5 М NaCl. После короткой обработки (20 с) на хроматографической бумаге, насыщенной 2 х SSC буфером, содержащим 0,2 М трис-НСl (рН 7,5), фильтры сушили. После 1 ч сушки на воздухе ДНК пришивали к мембранам путем обработки ультрафиолетовым облучением 12000 мкДж с длиной волны 260 нм с помощью установки UV Stratalinker 1800 (Stratagene, La Jolla, CA). Четыре мембраны предварительно гибридизовали при 65 С в течение 2 ч в 100 мл 6 хNaH2PO4H2O, 2,2 г/л Na2 ЭДTA, [рН 7,4]), 5 х растворе Дэнхардта (1 г/л фиколла, 1 г/л поливинилпирролидона, 1 г/л БСА (фракция V,0,5% ДСН и 100 мкг/мл денатурированной ДНК спермы сельди в термостате для гибридизацииHybrid Mark II (National Labnet Company, Woodbridge, NJ) в пробирках HB-OV-BL. Гибридизацию проводили при 65 С в течение 12 ч в 10 мл 6 х SSPE буфера, содержащего 0,5% ДСН, 100 мкг/мл денатурированной ДНК спермы сельди и 52 мкл произвольно примированного зонда, описанного выше. После окончания гибридизации раствор для гибридизации удаляли, а мембраны быстро промывали 100 мл 2 х SSC буфера, содержащего 0,5% ДСН,при 65 С. Затем мембраны еще 30 мин промывали тем же количеством свежего буфера при 65 С. После этого мембраны промывали еще 2 раза по 30 мин при 65 С 100 мл 0,2 х SSC буфера, содержащего 0,5% ДСН, упаковывали в целлофановый пакет и экспонировали 24 ч при-70 С с предварительно облученной рентгеновской пленкой Fuji RXGCU. Было получено 10 положительных клонов. Участки на исходных чашках, соответствующие идентифицированным колониям, удаляли и помещали в 1 мл буфера SM, содержащего 20 мкл хлороформа. Из полученных десяти клонов пять снова высевали на чашки с низкой плотностью и подвергали повторному скринингу, как описано выше, для получения индивидуальных колоний.k) Характеристика кДНК-клонов АЦКсинтазы плодов кофе. Размеры предполагаемых кДНК-клонов АЦК-синтазы растений кофе определяли с помощью ПЦР с использованием праймеров, гомологичных участкам Т 3 и Т 7 промоторов, присутствующих в клонирующем векторе и примы 15 кающих к сайту вставки кДНК. Последовательности этих праймеров следующие: Условия для проведения ПЦР были аналогичны описанным выше, за исключением того,что температурный цикл продолжался 1 мин при 95 С, 1 мин при 50 С и 2 мин при 72 С. Анализ в агарозном геле проводили, как описано выше. Три самых больших клона были получены в виде фагмид путем эксцизии in vivo. 200 мкл исходного раствора фага из индивидуальной колонии смешивали с 200 мкл клеток Е. соliOD600=1,0. К этой смеси прибавляли 1 мкл фагахелпера ExAssist (Stratagene La Jolla, CA)(1 х 106 pfu/мкл), и пробирки инкубировали при 37 С 15 мин. Затем добавляли 3 мл стерильной среды LB и инкубировали еще 3 ч при 37 С при перемешивании. После нагревания в течение 20 мин при 70 С и центрифугирования при 1000 хg в течение 15 мин, 1 мл супернатанта, содержащего вырезанную фагмиду pBluescript, упакованную в виде нитевидных фаговых частиц,переносили в стерильную микроцентрифужную пробирку на 1,5 мл и хранили при 4 С. Фагмиды выделяли добавлением 25 мкл этого исходного раствора к 200 мкл клеток Е. соli Solar (Stratagene La Jolla, CA), выращенных до плотностиOD600=1. После инкубации при 37 С в течение 15 мин 200 мкл клеточной суспензии высевали на чашки размером 100 х 15 мм со средой NZY,содержащей 50 мкг/мл ампициллина. Чашки инкубировали в течение ночи при 37 С. Индивидуальные колонии переносили в 10 мл средыLB, содержащей 50 мкг/мл ампициллина, и выращивали в течение ночи в инкубаторе при 37 С при встряхивании. Клетки концентрировали в стерильной микроцентрифужной пробирке на 1,5 мл путем повторного центрифугирования,фагмидную ДНК очищали с использованием мининабора QIAGEN для очистки плазмид. Бактериальные осадки промывали водой и ресуспендировали в 0,3 мл буфера Р 1. Далее, добавляли 0,3 мл щелочного буфера Р 2 для лизиса,осторожно перемешивали и инкубировали при комнатной температуре менее 5 мин. Затем добавляли 0,3 мл охлажденного буфера Р 3, перемешивали переворачиванием пробирок 6 раз,экстракты инкубировали на льду 10 мин и центрифугировали 15 мин при 14000 об./мин в микроцентрифуге. Супернатанты переносили на колонки QIAGEN-tip 20, предварительно уравновешенные 1 мл буфера QDT. Экстракты пропускали через колонки самотеком. После прекращения протока, колонки промывали 4 раза 1 мл буфера QC. ДНК элюировали, промывая колонки QIAGEN-tip 20 0,8 мл буфера QF, элюат собирали в микроцентрифужные пробирки на 1,5 мл. ДНК осаждали добавлением 0,7 объемов(560 мкл) изопропанола. Пробирки немедленно центрифугировали при 14000 об./мин в течение 30 мин и супернатант осторожно удаляли. Осадки, содержащие ДНК, промывали 1 мл 70% ледяного этанола, центрифугировали, как описано выше, и сушили на воздухе 5 мин. ДНК ресуспендировали в 50 мкл стерильной воды. Концентрация ДНК после одного выделения плазмиды, по данным флюорометрического анализа, составляла 0,1 мкг/мкл. Секвенирование ДНК проводили путем смешивания 8 мкл фагмидной ДНК (0,8 мкг) с 4 мкл Т 3 либо Т 7 праймеров (0,8 пкмоль/мкл). Автоматическое секвенирование ДНК этих образцов проводили в Биотехнологическом центре Гавайского университета. Было получено приблизительно 350 п.о. последовательности как от 5'-, так и от 3'-конца кДНК. Новые секвенирующие праймеры были синтезированы на основе последовательностей, примыкающих к концу предыдущих последовательностей, и использовались таким же образом для завершения последовательности обеих нитей кДНК. Полноразмерная последовательность кДНК АЦКсинтазы, экспрессирующейся в плодах кофе,представлена на фиг. 1. Выведенная аминокислотная последовательность АЦК-синтазы, экспрессирующейся в плодах кофе, представлена на фиг. 2. Последовательность клонированной кДНК АЦК-синтазы плодов кофе и выведенную последовательность белка сравнивали с генами других АЦК-синтаз, имеющимися в Genbank. Выделенная из плодов кофе кДНК показала от 68,3 до 58,1% идентичности другим АЦКсинтазам из Genbank. А последовательность белка, выведенная на основе этой кДНК, показала от 67,9 до 50,5% идентичности другим АЦК-синтазам. Однако эта кДНК представляет собой уникальную последовательность, так как не существует других последовательностей,имеющих более 1500 п.о., которые показали бы идентичность более 68,3%. Пример 2. Выделение АЦК-оксидазы плодов кофе. а) Синтез олигонуклеотидных праймеров,специфичных к АЦК-оксидазе. Выделение общей РНК, мРНК из плодов кофе и синтез специфической кДНК проводили,как описано выше. С помощью программы Pileup (GeneticsComputer Group, Madison, WI) производили выравнивание 12 последовательностей АЦКоксидазы, полученных из Genbank. Было обнаружено, что участок длиной приблизительно 1000 п.о. от стартового кодона для трансляции является консервативным, и был синтезирован вырожденный олигонуклеотидный праймер соответствующий этому участку. Инозин(I) помещали в позиции, демонстрирующие отсутствие консервативности последовательности, 17 поскольку любой из нуклеотидов А, Т, G или С мог занимать данную позицию. Позиции, проявляющие двоякую неопределенность, готовили со смешанными остатками (T/G или A/G). Также получали второй праймер, гомологичный участку кДНК АЦК-оксидазы, экспрессирующейся в плодах папайи, которую предварительно клонировали в лаборатории авторов данного изобретения, и расположенному на расстоянии приблизительно 372 п.о. от стартового кодона для трансляции: Эти два праймера использовали в ПЦР для амплификации АЦК-оксидазы, экспрессирующейся в плодах кофе. Реакционная смесь для ПЦР содержала 0,2 мкл (10 нг) фракции 3 кДНК(описанной в примере 1), 5 мкл 10 х буфера ПЦР, 3 мкл 25 мМ MgCl2, по 1 мкл каждого из четырех 10 мМ dNTP, 1 мкл 20 мкМ раствора каждого праймера, 0,3 мкл Taq ДНКполимеразы (Promega Corporation, Madison, WI) и 38,5 мкл воды. Условия ПЦР: 35 циклов по 1 мин при 94 С, 1 мин при 50 С, 1 мин при 72 С. Инкубацию в течение 5 мин при 72 С проводили после последнего цикла. Аликвоту 20 мкл продукта реакции анализировали в 1,5% агарозном геле, как описано выше, и обнаружили, что продукт содержит около 800 пар оснований. Участок с ДНК вырезали из геля и смешивали с 200 мкл стерильной воды в микроцентрифужной пробирке на 1,5 мл. После кипячения в течение 5 мин, 2 мкл смеси использовали в качестве матрицы в 50 мкл реакционной смеси для ПЦР, как описано выше, с применением тех же праймеров. Гель-электрофорез, проведенный,как описано выше, с использованием 20 мкл реакционной смеси ПЦР, показал присутствие единственного продукта длиной 800 п.о. К оставшимся 30 мкл реакционной смеси ПЦР добавляли 20 мкл хлороформа и 100 мкл воды. Содержимое перемешивали и центрифугировали 2 мин при 14000 об./мин в микроцентрифуге. Верхний водный слой, содержащий ДНК, переносили в чистую микроцентрифужную пробирку. Часть этой ДНК радиоактивно метили с помощью произвольно примированного синтеза,как описано выше.b) Скрининг амплифицированной библиотеки с помощью произвольно примированного зонда. Амплифицированную кДНК плодов кофе,описанную в примере 1, использовали для приготовления четырех чашек размером 150 х 10 мм со средой NZY, как описано выше. Прегибридизацию, гибридизацию и выделение клонов проводили, как описано выше, за исключением того, что в качестве зонда использовали последовательность АЦК-оксидазы, полученную в результате ПЦР. 18 Размеры кДНК-клонов АЦК-оксидазы,экспрессирующейся в плодах кофе, определяли с помощью ПЦР с использованием праймеров,гомологичных Т 3 и Т 7 промоторам, как описано в примере 1. Была получена последовательность самого большего кДНК-клона АЦК-оксидазы плодов кофе, как описано в примере 1. Ее сравнивали с генами других АЦК-оксидаз, имеющимися вGenbank. Последовательность АЦК-оксидазы плодов кофе представлена на фиг. 3. Выведенная аминокислотная последовательность этого белка представлена на фиг. 4. Было определено,что указанная кДНК кодирует АЦК-оксидазу,поскольку она была идентична на 50,4-82,5% нуклеотидным последовательностям других АЦК-синтаз из Genbank. Выведенная последовательность белка также показала идентичность от 32,5 до 86,5% другим АЦК-оксидазам изGenbank. Описанные примеры служат только для иллюстрации, и их не следует рассматривать в качестве примеров, ограничивающих объем охраны изобретения, который обозначен в формуле изобретения, приведенной далее. Список последовательностейCoffea arabica с выведенной аминокислотной последовательностью SEQ. ID NO.10, приведенной на фиг. 1. 2. Выделенная последовательность кДНК,определяющая экспрессию АЦК-синтазы по п.1,имеющая нуклеотидную последовательностьSEQ. ID NО.11, приведенную на фиг. 2, а также варианты указанной кДНК, полученные на основе вырожденности генетического кода. 3. Очищенная аминоциклопропан-1 карбоксилат(АЦК)-оксидаза из растения кофеCoffea arabica с выведенной аминокислотной последовательностью SEQ. ID NO.12, приведенной на фиг. 3. 4. Выделенная последовательность кДНК,определяющая экспрессию АЦК-оксидазы по п.3, имеющая нуклеотидную последовательность SEQ. ID NO.13, приведенную на фиг. 4, а также варианты указанной кДНК, полученные на основе вырожденности генетического кода. 5. Трансформирующий вектор, включающий промотор, обеспечивающий процесс транскрипции в клетках растения кофе, связанный с последовательностью кДНК по п.2. 6. Трансформирующий вектор по п.5, где последовательность кДНК связана с промотором транскрипции в смысловой ориентации. 7. Трансформирующий вектор по п.5, где последовательность кДНК связана с промотором транскрипции в антисмысловой ориентации. 27 8. Трансформирующий вектор, включающий промотор, обеспечивающий процесс транскрипции в клетках растения кофе, связанный с последовательностью кДНК по п.4. 9. Трансформирующий вектор по п.8, где последовательность кДНК связана с промотором транскрипции в смысловой ориентации. 10. Трансформирующий вектор по п.8, где последовательность кДНК связана с промотором транскрипции в антисмысловой ориентации. 11. Трансформированная клетка растения кофе, полученная путем введения в нее трансформирующего вектора по любому из пп.5-7. 12. Трансформированная клетка растения кофе по п.11, где вектор представляет собой вектор по п.6. 13. Трансформированная клетка растения кофе по п.11, где вектор представляет собой вектор по п.7. 14. Трансформированная клетка растения кофе, полученная путем введения в нее трансформирующего вектора по любому из пп.8-10. 15. Трансформированная клетка растения кофе по п.11, где вектор представляет собой вектор по п.9. 16. Трансформированная клетка растения кофе по п.11, где вектор представляет собой вектор по п.10. 17. Клетка растения кофе, трансформированная последовательностью кДНК по п.2 и последовательностью кДНК по п.4 путем введения трансформирующего вектора по п.5 и трансформирующего вектора по п.8 в клетку растения кофе. 18. Трансформированная клетка растения кофе по п.17, где по меньшей мере одна из последовательностей кДНК связана с промотором транскрипции в антисмысловой ориентации. 19. Способ трансформации клетки растения кофе последовательностью кДНК по п.2,включающий получение трансформирующего вектора по п.7, где последовательность кДНК связана с промотором транскрипции в антисмысловой ориентации; и введение полученного трансформирующего вектора в клетку растения кофе. 20. Способ трансформации клетки растения кофе последовательностью кДНК по п.4,включающий получение трансформирующего вектора по п.10, где последовательность кДНК связана с промотором транскрипции в антисмысловой ориентации; и введение полученного трансформирующего вектора в клетку растения кофе. 21. Способ трансформации клетки растения кофе последовательностью кДНК по п.2 и последовательностью кДНК по п.4, включающий получение первого трансформирующего вектора, охарактеризованного в п.5, получение второго трансформирующего вектора, охарактеризованного в п.8, причем по крайней мере 28 одна из вышеуказанных кДНК связана со своим промотором транскрипции в антисмысловой ориентации; и введение каждого из трансформирующих векторов в клетку растения кофе. 22. Способ трансформации клетки растения кофе последовательностью кДНК по п.2,включающий получение трансформирующего вектора, охарактеризованного в п.6, и введение полученного трансформирующего вектора в клетку растения кофе. 23. Способ трансформации клетки растения кофе последовательностью кДНК по п.4,включающий получение трансформирующего вектора, охарактеризованного в п.9, и введение полученного трансформирующего вектора в клетку растения кофе. 24. Способ трансформации клетки растения кофе последовательностью кДНК по п.2 и последовательностью кДНК по п.4, включающий получение первого трансформирующего вектора, охарактеризованного в п.5, получение второго трансформирующего вектора, охарактеризованного в п.8, причем по крайней мере одна из вышеуказанных кДНК связана со своим промотором транскрипции в смысловой ориентации; и введение каждого из трансформирующих векторов в клетку растения кофе. Выведенная аминокислотная последовательность АЦК-синтазы из растения Coffea arabica Примечание: Кодирующий участок этой последовательности представлен группами оснований в виде кодонов. Фиг. 2 Выведенная аминокислотная последовательность АЦК-оксидазы из растения Coffea arabica Примечание: Кодирующий участок этой последовательности представлен группами оснований в виде кодонов. Фиг. 4