Получение полиовируса с высокими титрами для получения вакцины

ПОЛУЧЕНИЕ ПОЛИОВИРУСА С ВЫСОКИМИ ТИТРАМИ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ВАКЦИНЫ Изобретение предлагает способ получения полиовируса, включающий в себя следующие стадии: а) предоставление бессывороточной суспензионной культуры клеток, представляющих собой клетки PER.C6; b) заражение упомянутых клеток полиовирусом при плотности клеток в диапазоне между 2106 и 150106 клеток/мл и увеличение количества полиовируса до высоких титров, равных по меньшей мере 109,4 ССID50/мл; и с) сбор урожая полиовируса в период 12-48 ч после заражения. Льюис Джон Альфред (US) Медведев В.Н. (RU) Настоящее изобретение относится к области клеточного культивирования и получения полиовируса. В частности, оно касается улучшенных способов культивирования клеток и получения из них полиовируса для получения вакцин против полиомиелита. Уровень техники настоящего изобретения Полиовирусы являются членами рода Enterovirus семейства Picornaviridae. Полиовирусы представляют собой маленькие вирусы без оболочки с капсидами, окружающими одноцепочечный положительно-полярный РНК геном. Существует три типа полиовирусов: типы 1, 2 и 3. Заражения восприимчивых индивидуумов полиовирусом может приводить к паралитическому полиомиелиту. Полиомиелит высоко контагиозен. Были разработаны две различные вакцины против полиомиелита, инактивированная вакцина против полиовируса (ИПВ) Солка и живая ослабленная оральная вакцина против полиовируса (ОПВ)Sabin. Обе вакцины безопасны и эффективны. Каждая обладает своими индивидуальными достоинствами и недостатками, и обе сыграли важную роль в контроле над полиомиелитом. Для обзора о полиовирусах и вакцинах против полиомиелита см., например, Kew et al., 2005. Оральная вакцина против полиомиелита (ОПВ) является дешевой и удобной и масштабно применялась. Тем не менее, некоторые реципиенты страдают вакцино-ассоциированным паралитическим полиомиелитом (ВАПП) из-за ревертантов в вакцине. Кроме того, в популяциях, которые не были полностью иммунизированы, наблюдали, что ослабленные полиомиелитные штаммы Sabin претерпевали значительные мутационные изменения, чем вызывались вспышки паралитического заболевания, которое клинически и эпидемиологически неотличимо от заболевания природным полиомиелитом дикого типа; упомянутые мутанты называют циркулирующими полиовирусами вакцинного происхождения или цПВВП(см., например, Kew et al., 2005; Wright and Modlin, 2008; Yakovenko et al., 2009). Все более устанавливается консенсус, что инактивированная вакцина против полиовируса (ИПВ) может внести вклад в более быстрое искоренение полиомиелита дикого типа и контроль за возникающим цПВВП, когда она применяется в сочетании с существующими стратегиями применения ОПВ (Wrightand Modlin, 2008; John, 2009). Тем не менее, производство ИПВ является более дорогим (см., например, John, 2009) и может даже оказаться чрезмерно дорогим для малоразвитых и наименее развитых стран, в которых до сих пор существует серьезная необходимость в вакцинах против полиомиелита. Культуральные системы для получения большого объема полиовирусного материала, который может применяться в вакцине, в частности неослабленного полиовируса, вносят значительный вклад в относительно высокие цены. Таким образом, остается необходимость в уровне техники для эффективных культуральных систем для получения полиовируса для применения в вакцинах. Размножение полиовируса в клетках HEK-293 было описано в качестве системы для исследования фенотипов полиовируса с нейрон-специфической репликацией и было описано, что ослабленные формы полиовируса, как, например, полиовирус, содержащий точечные мутации в элементе IRES, как это имеет место в штаммах Sabin, демонстрируют уменьшенное размножение в клетках HEK-293 (Campbell et al.,2005). Е 1-иммортализованные человеческие эмбриональные клетки ретины (HER), в частности клеткиPER.С 6, были описаны в качестве подходящих для размножения различных вирусов, причем особое внимание уделялось вирусу гриппа (Pau et al., 2001; WO 01/38362). Хотя WO 01/38362 описывает рабочие примеры размножения различных штаммов вируса гриппа и вируса Herpes Simplex (HSV) типов 1 и 2, вируса кори и ротавируса в клетках PER.С 6, размножение полиовируса не было подтверждено примером в WO 01/38362. Кроме того, условия для репликации полиовируса в таких клетках не были описаны и не могут легко быть предсказаны на основании репликации неродственных вирусов в данных клетках. Следовательно, до настоящего времени не было известно, окажется ли возможным экономически получать полиовирус в промышленном масштабе с целью получения вакцины в данных клетках. Для крупномасштабного производства инактивированных вакцин против полиомиелита полиовирус, как правило, выращивают в клетках Vero, происходящих от обезьян. Клетки Vero широко применяются для получения вакцины, включая инактивированную, а также живую ослабленную вакцину против полиомиелита, и до сих пор являются наиболее широко признанными регуляторными органами непрерывными клеточными линиями для производства вирусных вакцин, и применение данных клеток для получения вакцины будет возрастать, как ожидается экспертами в данной области (Barrett et al., 2009). Крупномасштабная культура на микроносителях клеток Vero для инактивированной вакцины против полиовируса была описана Montagnon et al., 1982 и 1984. Способ для крупномасштабного получения вакцины против полиомиелита с использованием клеток Vero и полученная вакцина также описаны в патенте США 4525349. Получение высоких титров полиовируса (Sabin тип 1) (почти 2109 TCID50/мл) было описано(Merten et al., 1997) для условий, когда клетки Vero на микроносителях культивировали в содержащей сыворотку среде до фазы получения вируса в бессывороточной среде, но, принимая во внимание недостатки применения сыворотки, авторы указывают, что желателен полностью бессывороточный способ, и в таком оптимизированном полностью бессывороточном способе данные авторы смогли получить титрKreeftenberg et al. (2006), участвовавшие в получении полиовируса для получения вакцины в промышленном масштабе, также отмечают урожаи различных штаммов полиовируса дикого типа и Sabin в клетках Vero, выращенных на микроносителях, каковые урожаи сходны для различных штаммов, причем логарифмические титры лежат в диапазоне между 8,1 и 8,6. Данные авторы также описывают, что количество вируса, необходимого для получения целевой вакцины, значительно выше для ИПВ, чем для ОПВ, что приводит к значительно более высокой стоимости получения на дозу для ИПВ, чем для ОПВ. Бессывороточное получение полиовируса с применением клеток Vero, культивированных на микроносителях, также было описано в (Card et al., 2005) и, хотя уровень урожайности был ниже, чем в статических культурах, было описано, что культуры на микроносителях легче масштабировать. Несмотря на эффективность и промышленную применимость данных клеточных культур Vero с применением микроносителей, получение больших количеств полиовируса остается дорогостоящим, и,следовательно, остается необходимость в альтернативных системах получения полиовирусов, которые меньше страдали бы от данного недостатка. Было описано получение полиовируса с применением суспензионных клеток Vero с более низкими титрами вируса (10log CCID50/мл между 6,5 и 7,9), чем наблюдаемые в обычных клетках Vero на микроносителях (van Eikenhorst et al., 2009). Целью настоящего изобретения являются подходящие способы, которые можно было бы применять для крупномасштабного и экономически выгодного получения полиовирусов для применения в вакцинах. Это может помочь в обеспечении доступа к недорогой вакцине против полиомиелита в развивающихся странах на постоянной основе. Сущность изобретения Настоящее изобретение основано на демонстрации очень эффективного размножения полиовируса в клетках PER.C6, причем были получены беспрецедентно высокие титры полиовируса в соответствии со способами, описанными в настоящем описании. Получение таких высоких титров, которое обеспечивает значительное экономическое преимущество над получением полиовируса в клетках Vero, не могло быть предсказано на основании репликации других вирусов в таких клетках, и не могли быть предсказаны условия для осуществимого в промышленном масштабе способа, поскольку данные условия и достигаемые преимущества могут широко варьироваться для различных несходных типов вирусов, которые обладают сильно различающимися свойствами. Таким образом, настоящее изобретение предлагает способ получения полиовируса, включающий в себя следующие стадии: а) предоставление бессывороточной суспензионной культуры клеток, представляющих собой клетки PER.C6, депонированные в ЕСАСС под 96022940; b) заражение упомянутых клеток полиовирусом при плотности клеток между 2106 и 150106 клеток/мл и с) сбор урожая полиовируса в период между 12 и 48 ч после заражения. В определенных вариантах осуществления упомянутое заражение осуществляют при плотности клеток между приблизительно 5106 и 20106 клеток/мл, например между приблизительно 8106 и 15106 клеток/мл, например приблизительно 10106 клеток/мл. В определенных вариантах осуществления упомянутый сбор урожая полиовируса осуществляют в период между приблизительно 18 и 30 ч после заражения, например через приблизительно 24 ч после заражения. Данные условия позволяют получать очень высокие титры (около 1010/мл, что значительно больше чем в 10 раз превосходит титры, обычно получаемые с применением клеток Vero на микроносителях для штаммов полиомиелита дикого типа) полиовируса в относительно коротком способе, который, следовательно, обладает значительными экономическими преимуществами перед способами, применяемыми в настоящее время для получения полиовируса для получения вакцины. Это было продемонстрировано для всех трех типов полиовируса: типа 1 (штамм Brunenders), типа 2 (штамм MEF) и типа 3 (штамм Saukett). В определенных вариантах осуществления, следовательно, упомянутый полиовирус представляет собой дикого типа вирулентный полиовирус, например полиовирус типа 1, полиовирус типа 2 или полиовирус типа 3. В определенных вариантах осуществления упомянутый полиовирус представляет собой полиовирус типа 1 штамма Mahoney или Brunenders, полиовирус типа 2 штамма MEF (или MEF-1) или полиовирус типа 3 штамма Saukett. В других вариантах осуществления упомянутый полиовирус представляет собой ослабленный полиовирус (являющийся менее нейровирулентным), например штаммSabin (который может также быть типа 1, 2 или 3). Настоящее изобретение, кроме того, предлагает способ получения вакцины против полиомиелита,включающий в себя способ получения полиовируса в соответствии с настоящим изобретением, дополнительно включающий в себя очистку, необязательное инактивирование и составление рецептуры собранного полиовируса, для того чтобы получить вакцину против полиомиелита. Для ИПВ осуществляют инактивацию посредством формалина или других средств. Для ОПВ стадии инактивирования не требуется. В настоящем описании также раскрыто предоставление крупной партии полиовируса, пригодной для получения вакцины против полиомиелита, причем упомянутая крупная партия полиовируса может быть получена посредством способа получения полиовируса в соответствии с настоящим изобретением и содержит культуральную среду и титр полиовируса, равный по меньшей мере 109,4 CCID50/мл, например между приблизительно 109,5 и 1011 CCID50/мл, например между приблизительно 109,8 и 1010,8 CCID50/мл. В определенных вариантах осуществления упомянутая крупная партия имеет объем между 1 и 1000 л. В других вариантах осуществления упомянутая крупная партия содержит клетки и/или клеточный дебрис из клеток, используемых в соответствии со способами настоящего изобретения. В определенных вариантах осуществления упомянутая крупная партия присутствует в биореакторе. В других вариантах осуществления крупная партия удалена из биореактора и присутствует в подходящей емкости. Также раскрыты полиовирус и вакцина против полиомиелита, получаемые в соответствии со способами настоящего изобретения. Упомянутый полиовирус и/или упомянутая вакцина не содержат белков обезьяны, предпочтительно не содержат нечеловеческих белков. Они также не будут содержать других остатков нечеловеческих клеток-хозяев. Напротив, полиовирус, который был получен в соответствии с обычными способами, будет содержать остаточный нечеловеческий белок и/или другие нечеловеческие остатки от используемых клеток-хозяев и/или от сыворотки, использованной во время культивирования клеток. Таким образом, полиовирус, полученный в соответствии с рассматриваемым в данный момент изобретением, страдает от меньшего загрязнения нечеловеческими примесями, являющимися результатом способа получения, чем полиовирус, полученный при применении обычных способов. Настоящее изобретение также предлагает способ получения полиовирусного препарата в клеточной культуре с титром, равным по меньшей мере приблизительно 109,4, предпочтительно по меньшей мере 109,8, более предпочтительно по меньшей мере 1010, например между 1010,5 и 1011 CCID50/мл, включающий в себя следующие стадии: а) предоставление бессывороточной суспензионной культуры клеток,представляющих собой клетки PER.C6; b) заражение упомянутых клеток полиовирусом при плотности клеток в диапазоне между 2106 и 150106 клеток/мл и с) сбор урожая полиовируса в период между 12 и 48 ч после заражения, для того чтобы получить полиовирусный препарат, имеющий упомянутую концентрацию. Предпочтительные варианты осуществления являются такими же, как описанные выше для способа получения полиовируса в соответствии с настоящим изобретением. Краткое описание фигур Фиг. 1. Получение полиовируса в адгезивных PER.C6 и Vero клетках. Фиг. 2. Получение полиовируса типа 1 в суспензионных клетках PER.C6 в различных бессывороточных средах, при различных MOI и при различной плотности клеток при заражении. Фиг. 3. Влияние температуры и времени сбора урожая на получение полиовируса типов 1, 2 и 3 в суспензионных клетках PER.C6 в бессывороточной среде. Фиг. 4. Влияние плотности клеток при заражении, температуры и времени сбора урожая на получение полиовируса типа 1 в суспензионных клетках PER.C6 в бессывороточной среде. Фиг. 5. Эффективное получение полиовируса типов 1, 2 и 3 в бессывороточных суспензионных клетках PER.C6 при высокой плотности клеток. Подробное описание изобретения Клетки, применяемые в способах настоящего изобретения, представляют собой клетки PER.C6, которые являются иммортализованными клетками, также известными в данной области техники как непрерывные клеточные линии, и как таковые обладают потенциалом для бесконечной продолжительности жизни (см., например, Barrett et al., 2009). Клетки PER.C6 для цели настоящего изобретения обозначают клетки, депонированные в ЕСАСС под 96022940 29 февраля 1996 г. Специалисту в данной области техники ясно, что данное определение включает клетки из последующего или предыдущего пассажа или потомка последующего или предыдущего пассажа данных депонированных клеток. Клетки PER.C6 описаны в патенте США 5994128 и в Fallaux et al., 1998. Данные клетки хорошо подходят для получения вируса гриппа, для того чтобы получать клеточные вакцины против гриппа, поскольку они могут быть заражены, и выращивать вирус с высокой эффективностью, как, например, описано в Pau et al., 2001 иWO 01/38362. Клетки PER.C6 способны расти в суспензии в отсутствие сыворотки, как, например, описано в Yallop et al., 2005. В настоящем описании продемонстрировано, что данные клетки также хорошо подходят для получения полиовируса с высокими титрами в бессывороточных суспензионных культурах. Более того, используемые условия являются экономически и регуляторно выгодными. Применение микроносителей не обязательно для рассматриваемого в данный момент изобретения в отличие от широко используемых способов с клетками Vero. Микроносители вносят вклад в высокую стоимость полиовируса, полученного с применением обычных способов, основанных на клетках Vero. Бессывороточная в соответствии с настоящим изобретением означает, что среда, используемая для роста клеток и заражения, не имеет цельной сыворотки в качестве ингредиента. Она может не быть полностью свободной от происходящих от сыворотки продуктов, таких как, например, бычий сывороточный альбумин (БСА), однако в предпочтительных вариантах осуществления такие компоненты также отсутствуют, или их рекомбинантно получают в отсутствие каких-либо компонентов животного происхожде-3 020563 ния. В предпочтительных вариантах осуществления весь способ осуществляют в отсутствие каких-либо компонентов, имеющих непосредственное происхождение от животных, таких как сыворотка или компоненты сыворотки и т.д. В предпочтительном варианте осуществления способ получения вакцины осуществляют в условиях отсутствия животных компонентов. Это означает, что среда, используемая для роста и заражения клеток, лишена каких-либо компонентов животного происхождения. Более того, все вспомогательные вещества, добавленные к среде в способе получения вакцины, также свободны от каких-либо компонентов животного происхождения. Отсутствие животных компонентов в способе изготовления упомянутой вакцины против полиомиелита предлагает способ, который является более управляемым и безопасным. По этой причине клетки PER.C6, которые являются полностью охарактеризованными человеческими клетками и которые разрабатывались в соответствии с GLP/GMP, очень хорошо подходят для применения в производстве вакцины. Можно применять различные культуральные среды,и выбор оптимальной культуральной среды для клеток и используемых условий представляет собой часть рутинных задач для специалиста в данной области техники. Подходящие культуральные среды для цели настоящего изобретения поэтому хорошо известны специалисту в данной области техники и могут обычно быть получены из коммерческих источников в больших количествах или специально изготовлены в соответствии со стандартными протоколами. Культивирование можно осуществлять, например, в планшетах, роллерных флаконах или в биореакторах, используя системы периодического действия, периодического действия с подпиткой, непрерывные и т.п. Для того чтобы достичь крупномасштабного(непрерывного) получения вируса посредством клеточной культуры, в данной области техники предпочтительным является иметь клетки, способные расти в суспензии, и предпочтительным является иметь клетки, пригодные для культивирования в отсутствие сыворотки животного или человеческого происхождения или компонентов сыворотки животного или человеческого происхождения. Подходящие условия для культивирование клетки известны (см., например, Tissue Culture, Academic Press, Kruse and(Wiley-Liss Inc., 2000, ISBN 0-471-34889-9). Бессывороточные культуральные среды, которые могут использоваться в соответствии со способами настоящего изобретения, включают, без ограничения, стандартные среды, которые могут быть заказаны по каталогам продавцов сред, включая CDM4 PERMAb(Thermo Scientific HyClone, каталожные номера SH30871, SH30872). Кроме того, подходящими являются специально заказываемые среды, такие как Permexcis (Lonza). Примерами других бессывороточных сред,которые могут быть подходящими для применения в способах настоящего изобретения, являются АЕМ(Invitrogen, каталожный номер 12582-011), среда EXCELL VPRO (JRH Biosciences, каталожный номер 14561) и CDM4 Retino (HyClone, каталожные номера SH30520, SH30519). В некоторых необязательных и неограничивающих вариантах осуществления возможным является дополнение бессывороточных сред в способах настоящего изобретения липидами, и/или гидролизатами,и/или другими добавками, для того чтобы еще более увеличить урожайность. Термин "приблизительно" или "около" для численных значений, как он используется в настоящем описании, означает величину 10%. Заражение клеток полиовирусом и/или размножение вируса в способах в соответствии с настоящим изобретением соответственно осуществляют, например, при температуре в диапазоне между приблизительно 33 и 38C. В предпочтительных вариантах осуществления упомянутое заражение и/или размножение вируса осуществляют при температуре в диапазоне между приблизительно 34 и 36C, в определенных вариантах осуществления между приблизительно 34,5 и 35,5C, например приблизительно при 35C. Заражение клеток полиовирусом в способах в соответствии с настоящим изобретением может, например, быть соответственно выполнено при множественности заражения (MOI) в диапазоне между 0,001 и 10. В определенных вариантах осуществления упомянутое заражение осуществляют при MOI в диапазоне между приблизительно 1 и 3, например при MOI равной приблизительно 2. Заражение при такой, относительно высокой, MOI (0,1, предпочтительно приблизительно 1 или выше) может дополнительно увеличивать высокую эффективность, высокую урожайность способа. В соответствии с настоящим изобретением клетки заражают полиовирусом, предпочтительно при высокой плотности клеток. В определенных аспектах заражение полиовирусом имеет место, когда плотность клеток составляет между 1106 и 150106 клеток/мл, предпочтительно между 2106 и 150106 клеток/мл. В определенных предпочтительных вариантах осуществления упомянутое заражение осуществляют при плотности клеток в диапазоне между приблизительно 5106 и 20106 клеток/мл, например между приблизительно 8106 и 15106 клеток/мл, например приблизительно при 10106 клеток/мл. Насколько известно, способы настоящего изобретения предлагают наивысшие концентрации клеток, при которых производят вакцины против неаденовирусного вируса. Преимущества данных способов в соответствии с настоящим изобретением заключаются в том, что могут быть получены очень высокие титры полиовируса, т.е. по меньшей мере на порядок величины выше, чем с помощью обычных способов с применением Vero из известного уровня техники. В способах в соответствии с настоящим изобретением полиовирус собирают в период между 12 и 48 ч после заражения. В определенных вариантах осуществления упомянутый сбор полиовируса осуществляют в период между приблизительно 18 и 30 ч после заражения, например между приблизительно 20 и 28 ч, между приблизительно 22 и 26 ч после заражения, например через приблизительно 24 ч после заражения. Таким образом, способы в соответствии с настоящим изобретением можно применять, для того чтобы получать высокие титры полиовируса чрезвычайно быстро, что также способствует тому, что способы настоящего изобретения становятся экономически чрезвычайно перспективными по сравнению с более продолжительными способами, которые приняты в уровне техники. С большей частью крупномасштабных суспензионных культур работают с помощью периодического или периодического с подпиткой способов, поскольку они наиболее просты для работы и масштабирования, и такие способы в принципе подходят для способов рассматриваемого в настоящий момент изобретения. Тем не менее, непрерывные способы, основанные на перфузионных принципах, становятся более распространенными. В определенных вариантах осуществления настоящего изобретения клеткипродуценты культивируют в перфузионной системе. С клетками PER.C6 применяли периодический, периодический с подпиткой, перфузионный и перфузионный способы получения, например, для получения рекомбинантных антител. В периодических культурах обычно достигается концентрация жизнеспособных клеток больше чем 12106 клеток/мл. Концентрация жизнеспособных клеток вплоть до 40106 клеток/мл была много раз продемонстрирована при применении периодического действия с подпиткой. В перфузионных способах обычно достигаются пиковые концентрации клеток свыше 150106 клеток/мл (Krai et al., 2009). Перфузионное культивирование клеток обладает своим общепринятым значением в данной области техники, т.е. оно означает, что во время культивирования клетки удерживаются сепарационным устройством, в котором имеет место выходной поток жидкости с более низкой плотностью клеток, чем до сепарации, и в котором имеет место входной поток клеточной культуральной среды. Префузируемую культуру применяют в ответ на заражение растущих клеток при высокой плотности (например,10-50106 жизнеспособных клеток/мл). Для того чтобы увеличить плотности, среду постоянно или периодически заменяют свежим притоком, для того чтобы восполнить нехватку питательных веществ и чтобы удалить токсичные продукты. Перфузия также предоставляет возможность для лучшего управления условиями культивирования (рН, dO2, уровни питательных веществ и т.д.). Перфузия свежей среды через культуру может быть достигнута посредством удерживания клеток с помощью множества сепарационных устройств (например, центробежного фильтра с мелкими отверстиями, мембранных фильтров на полых волокнах или с плоской решеткой, седиментационных трубок). В определенных вариантах осуществления сепарационное устройство представляет собой модуль фильтра, содержащий полые волокна, т.е. трубчатые мембраны. Внутренний диаметр трубки обычно лежит в диапазоне между 0,3 и 6,0 мм, например между 0,5 и 2,0 мм. В определенных вариантах осуществления размер отверстий (размер пор) в мембране выбирают таким, что размер пор в сетке близок к диаметру клеток, обеспечивая высокое удерживание клеток, в то время как клеточный дебрис может проходить через фильтр. В других вариантах осуществления размер отверстий значительно меньше, чем диаметр клеток. Предпочтительно размер отверстий лежит в диапазоне между 0,1-30 мкм, например между 0,1 и 3 мкм, например приблизительно 0,2 мкм. Модули фильтра, содержащие полые волокна, коммерчески доступны от, например, GeneralElectric (в прошлом Amersham). Перфузию применяют, для того чтобы поддерживать требуемые уровни определенных метаболитов и чтобы удалить и посредством этого уменьшить примеси в культуральной среде. Как это обычно имеет место, перфузию не осуществляют все время во время культивирования, а обычно осуществляют только время от времени во время культивирования, по необходимости. Например, перфузию обычно начинают только после того, как определенные компоненты среды, такие как глюкоза, начинают истощаться и требуют замены. Несколько перфузионных систем известны в области техники и в принципе подходят для применения в способах настоящего изобретения. Термин "перфузионная система" означает комбинацию биореактора, соединенного с сепарационным устройством. Сепарационное устройство может быть или встроено в биореактор (например, центробежный фильтр с мелкими отверстиями), или оставаться снаружи биореактора (например, полое волокно). В обоих случаях, как разъяснено выше, сепарационное устройство препятствует вымыванию клеточной массы из реактора и делает возможным восстановление среды. В определенных вариантах осуществления биореакторы работают (соединены) с перфузионной системой изменяемого тангенциального потока (ATF) (например, ATF System, Refine Technology, Co., EastHanover, NJ). Тангенциальный поток может быть получен в соответствии со способами, известными специалисту в данной области техники, и, как описано, например, в патенте США 6544424. Работа перфузионной системы ATF была описана и является масштабируемой (Furey, 2002). Системы ATF предоставляют клеткам возможность подвергаться культивированию в течение более долгого периода времени и достигать высокой плотности клеток в отсутствие модульного фильтра. В самом деле, чрезвычайно высокие плотности клеток свыше 100106 жизнеспособных клеток/мл можно получить с применением пер-5 020563WO 2005/095578). Тем не менее, в упомянутых более ранних сообщениях клетки PER.C6 в перфузионных системах применяли для рекомбинантного получения антител, т.е. с совершенно другой целью, и не заражали полиовирусом. В определенных вариантах осуществления перфузия с применением, например, системы ATF является эффективной во время прекультуры (т.е. до заражения полиовирусом), поскольку она делает возможным получение очень высокой плотности клеток, и клетки находятся в хорошем состоянии для последующего заражения полиовирусом. Для того чтобы достичь упомянутой высокой плотности клеток,культуральную среду в определенных вариантах осуществления, по меньшей мере частично, префузируют во время отрезка времени во время роста клеток. В определенных вариантах осуществления перфузию начинают, как только достигается плотность клеток между приблизительно 2106 и 8106 жизнеспособных клеток/мл. В способах настоящего изобретения клетки заражают полиовирусом. Как правило, вирус подвергают воздействию соответствующей клетки-продуцента в оптимальных условиях, позволяющих поглощение вируса. Специалисту в данной области техники известно, как найти оптимальные дополнительные условия, т.е. для перемешивания, рН, растворенного кислорода (dO2 или DO). Обычно перемешивание оптимально между приблизительно 50 и 300 об/мин, как правило приблизительно 100-200, например приблизительно 150, обычный DO составляет 5-60%, оптимальный рН составляет между 6,7 и 7,7. Как правило, полиовирус заражает клетки настоящего изобретения спонтанно, и осуществление контакта клеток с полиовирусными частицами является существенным для заражения клеток. Как правило, полиовирусный посевной материал добавляют к культуре, для того чтобы инициировать заражение, и затем полиовирус размножается в клетках. Оказалось, что существует выгодная возможность заражать клеточную культуру в соответствии с настоящим изобретением полиовирусом при высокой плотности клеток, т.е. приблизительно 10106 клеток/мл, и были получены очень высокие титры (выше чем 1010 CCID50/мл) полиовируса. В определенных вариантах осуществления жизнеспособность клеточной культуры до заражения остается выше чем 75%, что означает, что по меньшей мере 75% от полного количества клеток в культуре жизнеспособно на момент заражения. В определенных вариантах осуществления жизнеспособность клеточной культуры при заражении составляет по меньшей мере 80%, в дополнительных вариантах осуществления по меньшей мере 85%. Жизнеспособность можно измерять с помощью обычных способов, доступных специалисту в данной области техники, например исключения трипанового синего, подсчета клеток с помощью Casy и т.п. В определенном варианте осуществления плотность клеток при заражении лежит в диапазоне между приблизительно 10106 и 50106 жизнеспособных клеток/мл, например между приблизительно 10106 и 20106 жизнеспособных клеток/мл, например между приблизительно 10106 и 15106 жизнеспособных клеток/мл. Данные плотности клеток создают возможность для высокой урожайности вируса с ограниченным накоплением клеточного дебриса и ДНК клеток-хозяев, что предоставляет преимущество данных вариантов осуществления в дальнейшей переработке урожая полиовируса. Таким образом, настоящее изобретение предлагает оптимизированный способ получения полиовируса, дающий высокие титры полиовируса, в то же время предоставляя собранный материал, который еще удобен для цели дальнейшей переработки. В других вариантах осуществления плотность клеток при заражении лежит в диапазоне между приблизительно 15106 и 150106 клеток/мл, например между приблизительно 15106 и 80106 клеток/мл,например между приблизительно 20106 и 50106 клеток/мл. При заражениях при данных плотностях клеток можно получать даже более высокие концентрации вируса. В определенных вариантах осуществления настоящего изобретения предлагается способ получения крупной партии полиовируса при титре, равном по меньшей мере 1010 CCID50/мл. Титр выражается в CCID50, что представляет собой 50% заразительной дозы клеточной культуры. Иногда его также называют TCID50 (50% заразительной дозы тканевой культуры), но, поскольку он определяется клеточной культурой, в настоящем описании применяется термин CCID50. Вирус приводят в контакт с клетками, для того чтобы дать возможность вирусу заразить упомянутые клетки и размножиться. Например, вирусную посевную партию добавляют к клеточной культуре и позволяют ей абсорбироваться на клетках, например, в течение приблизительно 30 мин при легком перемешивании (например, приблизительно 30 об/мин), после которого можно добавить дополнительную культуральную среду, и корректируют рН при необходимости, можно скорректировать скорость перемешивания, и культивирование продолжают. После стадии заражения имеет место увеличение количества вирусных частиц. Конечно, данную стадию также предпочтительно осуществляют в клетках PER.C6,которые культивируют в суспензии в отсутствие сыворотки, и более предпочтительно в условиях полного отсутствия компонентов, непосредственно происходящих от животных. Данная стадия может соответственно осуществляться в биореакторах, например, с размером в диапазоне между 1 и 20000 л, например между 10 и 2000 л, например между 50 и 1000 л, каковой размер можно легко скорректировать исходя из потребности в вакцине. В определенных вариантах осуществления биореактор представляет собой одноразовый биореактор (SUB). После размножения полиовируса в клетках вирус или его компоненты собирают на клеточной культуре. Это может быть осуществлено обычными способами, которые как таковые известны специалисту в данной области техники. Вирус, полученный и выделенный в клеточную культуральную среду, можно отделить от клеточной биомассы посредством обычных способов, таких как центрифугирование или ультрафильтрация, и собрать в супернатант. В таком случае центрифугирование или фильтрация являются стадиями сбора. Можно применять обычные способы для сбора вируса, например, описанные в патенте США 4525349. Кратко говоря, жидкую суспензию среды, содержащей вирус, как правило, отбирают,фильтруют и концентрируют посредством, например, ультрафильтрации. Например, в конце культивирования проводят сбор урожая посредством сбора культуральной среды, содержащей вирусную суспензию. Урожай можно отфильтровать, например используя 0,22 мкм фильтр, и необязательно сохранить при 4C. Отфильтрованный урожай можно необязательно подвергнуть ультрафильтрации, для того чтобы сконцентрировать вирусную суспензию, и затем полиовирус можно очистить, например используя гельфильтрацию и/или ионообменную хроматографию, например следуя методике, описанной в патенте США 4525349 или в Van Wezel et al., 1978. Полученную в результате вирусную суспензию можно необязательно разбавить, и для получения ИПВ полиовирус в ней инактивируют, для чего можно применять обычные способы. Способы для сбора и очистки полиовируса или вирусных компонентов и получения из них вакцин применяются в области техники уже в течение десятилетий и, следовательно, хорошо известны и подробно описаны, например, в Van Wezel et al., 1978; Montagnon et al., 1984; WO 2007/007344; патенте США 4525349, все включены в настоящее описание посредством ссылки. Вакцины против полиомиелита основаны на живом вирусе или инактивированном вирусе. Они содержат полиовирусный D-антиген, который является важным протективным антигеном. Урожаи вируса можно измерять посредством стандартных методик титрования вируса, в то время как определение концентрации D-антигена также осуществляют посредством обычных методик, хорошо известных специалисту в данной области техники, например иммуноферментного анализа D-антигена. Иммуногенность можно, например, определить посредством in vivo испытаний на животных. Эффективность можно определить, используя иммуноферментный анализ D-антигена и посредством анализа нейтрализации полиовируса в культуре клеток на сыворотках от предварительно иммунизированных крыс. Как правило, каждый из полиовирусных штаммов культивируют в отдельном способе, и если, например, получают тривалентную вакцину, содержащую три типа полиовируса, (инактивированные в случае ИПВ) вирусы смешивают и составляют для получения индивидуальных доз. В определенных вариантах осуществления, например, конечная доза вакцины (например, 0,5 мл) может, например, содержать 40 единиц D-антигена (DU) полиовируса типа 1, 8 DU полиовируса типа 2 и 32 DU полиовируса типа 3, что определяется сравнением с эталонными препаратами. Инактивацию полиовируса можно осуществлять в соответствии со способами, известными в уровне техники, например с помощью формалина или с помощью -пропиолактона (BPL) (см., например, Jianget al., 1986). В определенных вариантах осуществления инактивацию осуществляют с помощью формалина, например, посредством следующего способа: очищенную вирусную суспензию фильтруют через 0,22 мкм мембрану, нагревая до 37C при равномерном перемешивании с помощью магнитной мешалки в течение 24 ч, после чего добавляют раствор формалина до концентрации, равной 1 на 4000. Поддерживая температуру вирусной суспензии, равную 37C, продолжают перемешивание с помощью магнитной мешалки в течение первых четырех дней. На шестой день вирусную суспензию фильтруют через 0,22 микронную мембрану и продолжают инактивацию суспензии при 37C вплоть до двенадцатого дня. Инактивированную вирусную суспензию гомогенизируют и могут сохранять, например, при 4C. После данной стадии могут быть получены концентрированные и/или окончательные партии для применения,например, посредством смешивания требуемых препаратов. В определенных вариантах осуществления очищенный полиовирус или вирусный компонент составляют в фармацевтическую композицию. Это может быть осуществлено в соответствии с множеством способов и с применением множества буферов в полном соответствии с обычными способами, хорошо известными специалисту в данной области техники. Как правило, сюда входит введение полиовирусных частиц в фармацевтически приемлемую композицию, содержащую полиовирус и по меньшей мере фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество. Такая композиция может быть получена в условиях, известных специалисту в данной области техники, и в определенных вариантах осуществления подходит для введения людям. В определенных вариантах осуществления композиция может содержать буферизованную культуральную среду, которая может необязательно представлять собой среду M-199,которую применяют в качестве буфера для композиции для определенных зарегистрированных стандартных инактивированных вакцин против полиовируса. Кроме того, можно использовать фосфатный буферный солевой раствор, и конечные дозированные композиции могут содержать, например, 0,5% 2-феноксиэтанола и не более 0,02% формальдегида на дозу в качестве противомикробных консервантов. Фармацевтически приемлемые носители или вспомогательные вещества и разбавители хорошо известны в данной области техники и широко применяются в широком диапазоне терапевтических продуктов. Предпочтительно применяют носители, которые хорошо работают в вакцинах. В определенных вариантах осуществления вакцины дополнительно содержат адъювант, например квасцы. В данной области техники известно, что адъюванты дополнительно увеличивают иммунный ответ на применяемую антигенную детерминанту. Для введения людям настоящее изобретение может применять фармацевтические композиции, содержащие полиовирус и фармацевтически приемлемый носитель или вспомогательное вещество. В настоящем контексте термин "фармацевтически приемлемый" означает, что носитель или вспомогательное вещество в применяемых дозах и концентрациях не окажет какого-либо нежелательного или вредного воздействия на субъектов, которым их вводят. Такие фармацевтически приемлемые носители и вспомогательные вещества хорошо известны в данной области техники [см. Remington's Pharmaceuticalof Pharmaceutical Excipients, 3rd edition, A. Kibbe, Ed., Pharmaceutical Press (2000)]. Очищенный инактивированный полиовирус или его иммуногенные части предпочтительно составляют и вводят в виде стерильного раствора. Стерильные растворы получают посредством стерильной фильтрации или посредством других способов, известных per se в данной области техники. Затем растворы лиофилизируют или разливают в контейнеры для фармацевтических препаратов. рН раствора, как правило, составляет от 3,0 до 9,5, например от 5,0 до 7,5. Полиовирус или его иммуногенные части, как правило, помещены в раствор с подходящим фармацевтически приемлемым буфером, и раствор полиовируса может также содержать соль. Необязательно может присутствовать стабилизирующее средство, такое как альбумин. В определенных вариантах осуществления добавляют детергент. В определенных вариантах осуществления вакцина может быть составлена в инъекционный препарат. Данные композиции содержат эффективные количества полиовируса или его иммуногенные части, представляют собой или стерильные жидкие растворы, жидкие суспензии или лиофилизированные варианты и необязательно содержат стабилизаторы или вспомогательные вещества. Вакцина против полиомиелита может быть моновалентной, содержащей один тип полиовируса (тип 1, 2 или 3), или бивалентной (содержащей два типа полиовируса, например типы 1 и 2, 1 и 3 или 2 и 3),или тривалентной (содержащей три типа полиовируса, т.е. типы 1, 2 и 3). Существует возможность получать ИПВ из полиовирусов дикого типа. Иначе ИПВ можно получать из невирулентного живого полиовируса, например из штаммов Sabin, что дополнительно снизило бы риск повторного занесения полиовируса дикого типа с производства ИПВ (см., например,WO 2007/007344 и Doi et al., 2001). Настоящее изобретение подходит для получения полиовируса дикого типа (типов 1, 2 и 3, например штамма Mahoney типа 1, штамма MEF типа 2 или штамма Saukett типа 3),а также невирулентных типов полиовируса (например, штаммов Sabin). Настоящее изобретение можно,таким образом, применять, для того чтобы получать полиовирус для ИПВ, а также для ОПВ. Способы в соответствии с настоящим изобретением, применяемые для того чтобы получать ИПВ, могут послужить снижению цены до такой степени, что ИПВ может стать доступна для малоразвитых и наименее развитых стран. Хотя, как правило, ОПВ дешевле, чем ИПВ, когда ее получают в соответствии с обычными способами, высокоэффективные способы настоящего изобретения могут еще уменьшить цену нерасфасованного материала для ОПВ и, следовательно, уменьшить также ее цену. Введение вакцины против полиомиелита может осуществляться, например, внутримышечно, внутрикожно или орально в соответствии со способами, известными в данной области техники. Вакцину против полиовируса, получаемую в соответствии с настоящим изобретением, можно применять в качестве отдельной вакцины, но в других вариантах осуществления можно обычным способом объединять с другими вакцинами, например в форме комбинированной вакцины против дифтерии, коклюша, столбняка и полиомиелита, и можно необязательно включать дополнительные вакцинные компоненты, например против гепатита В и/или гемофильной инфекции, и т.д. Таким образом, полиовирус подходит для применения в расширенной программе вакцинации (EPI) и может сочетаться с вакцинами в данной программе. Аналогично обычным вакцинам против полиовируса, вакцину в соответствии с настоящим изобретением можно вводить в виде отдельной дозы или предпочтительно в схеме прайм-буст,в которой несколько доз вакцины вводят с соответствующими временными интервалами, например две инъекции с временным интервалом 1-2 месяца, за чем следует повторная доза через 6-12 месяцев; или,например, начальная оральная доза, за которой следует вторая доза приблизительно через 8 недель и третья доза через 8-12 месяцев после второй дозы; или, например, для маленьких детей первая оральная доза в возрасте 6-12 недель, за чем следует вторая доза приблизительно через 8 недель после первой дозы и третья доза в возрасте приблизительно 6-18 месяцев; или, например, только одна доза для предварительно вакцинированных людей при повышенном риске; и т.д. Оптимальная схема применения может быть определена в соответствии со стандартной медицинской практикой и, как правило, будет следовать тем же схемам, что и для доступных вакцин против полиовируса. Настоящее изобретение далее разъясняется в последующих примерах. Примеры не ограничивают настоящее изобретение каким бы то ни было образом. Они всего лишь служат для большей ясности настоящего изобретения. Примеры Пример 1. Эффективное получение полиовируса на адгезивных клетках PER.С 6. Для того чтобы исследовать размножение полиовируса на адгезивных клетках PER.C6 и создать запасы вирусного материала, получили полиовирус типа 1 (Brunenders), типа 2 (MEF-1) и типа 3 (Sauckett) от SBL (Швеция). Титры данных материалов, каждый из которых получен на клетках Vero, составили приблизительно 106 CCID50/мл. Клетки PER.C6 (Fallaux et al., 1998) вырастили в культуральной среде(DMEM с 10% FBS и 10 мМ MgCl2). В три флакона Т 175 посеяли по 30106 клеток PER. С 6/флакон в 25 мл культуральной среды для каждого типа полиовируса и заразили на следующий день с множественностью заражения (MOI), равной 0,1 (0,1 CCID50/клетку), при 37C и 10% СО 2 во влажной камере. Через три дня клетки и среду собрали и получили неочищенные лизаты с помощью двух циклов замораживания/размораживания. После центрифугирования для удаления клеточного дебриса супернатанты разделили на аликвоты и сохранили при -80C. Параллельно в один флакон Т 175 посеяли 6,25106 клеток Vero в 25 мл культуральной среды для клеток Vero (среда Optipro SFM, дополненная 4 мМ L-глутамина) для каждого штамма полиовируса и заразили с той же самой MOI. Культуры Vero также собрали через 3 дня,заморозили/разморозили дважды и разделили на аликвоты для хранения. Получение полиовируса затем определили количественно посредством анализа CCID50 с применением клеток Vero. Для этого 1,25104 клеток Vero посеяли в каждую лунку 96-луночного планшета в 100 мкл среды и инкубировали при 37C и 5% СО 2. На следующий день серию из 15 пятикратных разбавлений образцов полиовируса приготовили в культуральной среде для клеток Vero и 100 мкл разбавлений с номерами с 5 по 15 добавили в ряды с 1 по 11 в 96-луночный планшет восьмикратно. Ряд 12 служил в качестве неинфицированного контрольного ряда. Через семь дней лунки проанализировали на наличие цитопатогенного эффекта (СРЕ) и вычислили титры, используя метод Спирмена-Кербера: Конечный титр (log10) = X0 - d/2 +d/nXi,где Х 0 представляет собой значение log10 наивысшего разбавления, при котором все посевы еще остаются положительными;d представляет собой значение log10 использованного коэффициента разбавления;n представляет собой количество повторов при каждом разбавлении иXi представляет собой сумму всех лунок, которые остались положительными, включая разбавление Х 0. Результаты эксперимента по титрованию изображены на фиг. 1 и показывают, что на адгезивных клетках PER.C6 титры были 5 раз выше, чем на клетках Vero для полиовируса типа 1 и 10 раз выше в случае типов 2 и 3. Ожидается, что различия в получении вирусных частиц на клетку будут меньше, поскольку было посеяно больше клеток PER.C6. Как для PER.C6, так и для Vero слияние клеточного монослоя было определено равным 80%. Из данных экспериментов авторы заключили, что получение полиовируса на адгезивных монослоях клеток PER.C6 оказалось, по меньшей мере, не хуже, чем на клетках Vero. Пример 2. Эффективное получение полиовируса в клетках PER.C6 в суспензии. Для того чтобы исследовать размножение полиовируса на клетках PER.C6 в суспензии, осуществили эксперименты малого масштаба, для того чтобы испытать различные культуральные среды, множественность заражений (MOI) и время сбора урожая (ТОН). Для этого клетки PER.C6 культивировали в трех различных средах: АЕМ (Invitrogen), BMIVg (коммерчески доступна как Permexcis от Lonza) иCDM4PERMAb (Hyclone). В день заражения клетки, культивированные в одном типе среды, подсчитывали и пересевали в том же самом типе среды при различных плотностях клеток (1,5, 2,5, 3,5 или 5 млн клеток/мл) и заражали с различными MOI (0,01, 0,05 или 0,1 CCID50/клетку) при 37C во влажной камере на качающейся платформе. Платформа (IKA KS 260) имела орбитальный диаметр 10 мм и применялась при 100 об/мин для 125 или 250 мл встряхиваемых флаконов, содержавших 15-20 мл среды. Для среды АЕМ клетки посеяли при 1,5 или 2,5 млн клеток/мл, поскольку АЕМ не поддерживает более высокие плотности клеток. Таким способом было получено несколько культур, которые были собраны через 2, 3 или 4 дня после заражения. Все образцы заморозили/разморозили дважды и оставили при -20C или ниже до дополнительного анализа. Фиг. 2 изображает результаты титрования данных образцов для образцов дня 2 и дня 4 (данные дня 3 не показаны). Клетки PER.C6, выращенные и зараженные во всех трех средах, оказались способны к получению высоких титров полиовируса типа 1, хотя титры на среде BMIVg были несколько ниже по сравнению со средами PERMAb и АЕМ. Кроме того, более долгая инкубация не привела к более высоким титрам. Напротив, титры урожая дня 2 оказались в большинстве случаев более высокими по сравнению с урожаями дней 3 и 4. Стойкого эффекта от изменения MOI в данном эксперименте увидеть было нельзя. Что важно, применение более высоких плотностей клеток при заражении действительно привело к более высоким волюметрическим титрам, что показывает, что способ с суспензионной культурой с применением высоких плотностей клеток выгоден для урожая инфекционного полиовируса. В следующем эксперименте время сбора и температуру во время заражения сравнили для всех трех полиовирусных штаммов. Для этого клетки PER.C6 посеяли в среде АЕМ при 2,5106 клеток/мл с объемами 15 мл во встряхиваемых флаконах и заразили с MOI равной 0,1 при 37 и при 35C каждым полиовирусным штаммом. Клетки и среду собрали через 2, 3 и 4 дня после заражения и обработали, как описано выше. Анализ получения вируса в различных условиях был проведен посредством определения значений CCID50, как описано выше, и показал увеличение урожая при 35C по сравнению с 37C для всех трех типов полиовируса (фиг. 3). Кроме того, было подтверждено и распространено на полиовирус типа 2 и 3, что в большинстве случаев наиболее высокие титры были измерены, когда урожай собирали в день 2. Пример 3. Повышение урожая полиовируса на суспензионных клетках PER.C6 при более высокой плотности клеток. Для того чтобы исследовать, влечет ли дальнейшее увеличение плотности клеток увеличение титра вируса, получение при 2,5106 клеток/мл сравнили с 10106 клеток/мл. Для этого клетки PER.C6 в средеPERMAb посеяли в объеме 15 мл во встряхиваемых флаконах с указанными плотностями клеток и заразили 2 CCID50/клетку полиовируса типа 1 в трех повторностях. Через 24 и 48 ч клетки и среду собрали и получили очищенные лизаты посредством замораживания/размораживания и центрифугирования, как описано выше. В дополнение к ранее проверенным температурам 35 и 37C эксперимент также провели при 33C. Анализ титров с помощью анализа CCID50 (фиг. 4) подтвердил, что урожай возрастал, когда клетки заражали при плотности, равной 10106 клеток/мл, по сравнению с 2,5106 клеток/мл. Наилучшие титры были получены при 35C независимо от плотности клеток или дня сбора урожая. Кроме того, и это указывает на эффективное размножение полиовируса на клетках PER.C6, было показано, что урожаи можно также собирать через 24 ч, поскольку урожаи в 24- и 48-часовых образцах были вполне сопоставимы. В следующем эксперименте данные условия исследовали также для других типов полиовируса. Клетки PER.C6 посеяли в среду PERMAb при 10106 клеток/мл и заразили 2 CCID50/клетку при 35C во встряхиваемых флаконах в трех повторностях различными полиовирусными материалами. Урожаи собрали через 24 и 48 ч и клетки и среду переработали до очищенных лизатов, как описано выше. Анализ титрования CCID50 показал, что применение высоких плотностей клеток также приводило к высоким урожаям вируса для типов 2 и 3 (фиг. 5). Это ясно показывает, что высокая плотность культур клеток PER.C6 в суспензии предоставляет отличную платформу для получения полиовируса дикого типа. Поскольку клеточная плотность клетокPER.C6 и размер/объемы культуры можно увеличить посредством применения биореакторных систем,волновых мешков или других типов масштабируемых систем для культивирования, получение полиовируса может быть значительно улучшено по сравнению с применяемой в настоящее время системой на микроносителях с клеточными культурами Vero. Полученный полиовирус собирают и очищают в соответствии со способами, известными в данной области техники и применяемыми для полиовируса, размножающегося на клетках Vero, инактивируют формалином в соответствии с известными способами, и затем проверяют иммуногенность с применением стандартного анализа иммуногенности на крысах в соответствии со способами, хорошо известными в данной области техники (например, Bevilacqua et al., 1996). Ожидается, что полиовирус, полученный таким способом, обладает иммуногенностью, сопоставимой с полиовирусом, полученным с помощью обычных способов с применением клеток Vero. Пример 4. Получение полиовируса в клетках PER.C6 в биореакторе. Клетки из рабочего банка клеток PER.C6 размораживают и размножают в бессывороточной культуральной среде во влажной камере при 37C и 10% СО 2. Пассирование осуществляют каждые 3-4 дня до тех пор, пока не достигается достаточная плотность клеток, для того чтобы засеять двухлитровый биореактор с плотностью клеток, равной 0,2-0,4106 клеток/мл. Клетки размножаются в двухлитровом биореакторе при 37C, DO 40% и рН 7,3. Когда достигается плотность клеток, равная приблизительно 2106 клеток/мл (4 день после заражения), начинает работать система ATF, для того чтобы позволить культивирование клеток в течение более долгого периода времени и для того чтобы достичь высоких плотностей клеток. Приблизительно через 11-12 дней достигается плотность клеток в двухлитровом биореакторе более чем 50106 клеток/мл. В этот момент клеточную суспензию переносят в десятилитровый биореактор. Клеточную суспензию из двухлитрового биореактора разбавляют 1:5 бессывороточной культуральной средой. Плотность клеток в десятилитровом биореакторе лежит в диапазоне между 10 и 15106 клеток/мл. Затем десятилитровый биореактор заражают полиовирусным посевным материалом сMOI 2 CCID50/клетку. Получение полиовируса осуществляют при 35C, рН 7,3 и DO 40%. Из десятилитрового биореактора в определенные моменты времени берутся образцы для подсчета клеток и получения полиовируса, и сбор урожая полиовируса осуществляют соответственно между 12 и 48 ч после заражения.a) получение бессывороточной суспензионной культуры клеток, представляющих собой клеткиb) заражение указанных клеток полиовирусом при плотности клеток между 2106 и 150106 клеток/мл и увеличение количества полиовируса до высоких титров, равных по меньшей мере 109,4 CCID50/мл; иc) сбор урожая полиовируса в период между 12 и 48 ч после заражения. 2. Способ по п.1, в котором указанное заражение и/или размножение вируса осуществляют при температуре между 34 и 36C. 3. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором указанное заражение осуществляют при плотности клеток между 5106 и 20106 клеток/мл. 4. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором указанное заражение осуществляют при плотности клеток приблизительно 10106 клеток/мл. 5. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором указанное заражение осуществляют при множественности заражения (MOI) между 1 и 3 CCID50/клетку, например приблизительно 2. 6. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором указанный сбор урожая полиовируса осуществляют в период между 18 и 30 ч после заражения, например через приблизительно 24 ч после заражения. 7. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором указанный полиовирус представляет собой полиовирус типа 1, полиовирус типа 2 или полиовирус типа 3. 8. Способ по п.7, в котором указанный полиовирус представляет собой полиовирус типа 1 штаммаMahoney, полиовирус типа 2 штамма MEF или полиовирус типа 3 штамма Saukett. 9. Способ по п.7, в котором указанный полиовирус представляет собой ослабленный полиовирус,такой как штамм Sabin. 10. Способ получения вакцины против полиомиелита, включающий в себя способ по любому из предшествующих пунктов с последующей очисткой и инактивированием собранного полиовируса, для того чтобы получить вакцину против полиомиелита.