Диагностический тест cobasorb для определения мальабсорбции кобаламина

009520 Ссылки на все патенты и другие публикации, приведенные в настоящей заявке на патент, полностью включены в данное описание изобретения в качестве ссылки. Область техники, к которой относится изобретение Настоящее изобретение относится к использованию нерадиоактивного кобаламина для диагностики причины недостаточности витамина В 12. Кобаламин можно использовать в свободной форме или связанным с белками, такими как внутренний фактор и гаптокоррин. Кобаламин вводят перорально и затем анализируют пробы крови с целью определения изменения концентрации кобаламина в крови, например кобаламина плазмы, связанного с транскобаламином и/или гаптокоррином. Уровень техники Недостаточность витамина В 12 является обычным заболеванием, встречающимся у 10-15% пожилых людей. Абсорбция кобаламина (витамина В 12) из пищи имеет важное значение для млекопитающих,так как они нуждаются в метил- и 5'-дезоксиаденозилкобаламине в качестве кофактора для двух важных ферментов, метионинсинтазы и метилмалонил-КоА-мутазы. Перенос кобаламина из пищи в кровь опосредован внутренним фактором. Внутренний фактор является кобаламинсвязывающим белком, секретируемым в желудок париетальными клетками слизистой оболочки желудка. Внутренний фактор связывается с кобаламином в кишечнике, и комплекс внутренний фактор-кобаламин затем поглощается эпителиальными клетками в конечной части подвздошной кишки в результате связывания с рецептором кубилином. В эпителиальной клетке кобаламин отделяется от внутреннего фактора и переносится в кровь, где он связывается с транскобаламином и гаптокоррином, присутствующими в плазме. Комплекс транскобаламин-кобаламин и комплекс гаптокоррин-кобаламин определяются, соответственно, как голо-ТС и голо-НС. У многих субъектов причиной недостаточности витамина В 12 является отсутствие или пониженная секреция внутреннего фактора в желудочный сок. Введение указанным субъектам внутреннего фактора и кобаламина вызывает значительное увеличение абсорбции кобаламина. Тест Шиллинга Возможность восстановления всасывания кобаламина в кровь у субъектов с отсутствием секреции внутреннего фактора в результате введения кобаламина вместе с внутренним фактором определяют при помощи обычного теста, так называемого теста Шиллинга, применяемого для диагностики у субъекта недостаточности витамина В 12 (Ward, 2002). Целью данного исследования является определение причины недостаточности витамина В 12 у субъекта, которой может быть пониженная секреция внутреннего фактора или мальабсорбция витамина В 12 в кишечнике. Классический вариант теста Шиллинга включает два этапа. На первом этапе субъект принимает внутрь свободный радиоактивный кобаламин после инъекции высокой дозы немеченого (нерадиоактивного) витамина В 12 для насыщения белков, связывающих витамин В 12. Это гарантирует выведение с мочой всего абсорбированного меченого витамина В 12. Затем мочу собирают в течение последующих 24 ч и определяют количество присутствующего в ней радиоактивного кобаламина. Наличие очень низкой радиоактивности в моче указывает на отсутствие абсорбции кобаламина, которая может быть вызвана недостаточностью внутреннего фактора, в частности отсутствием секреции внутреннего фактора или мальабсорбцией в кишечнике. Для разграничения двух нарушений выполняют вторую часть теста Шиллинга. На данном этапе теста субъект принимает внутрь радиоактивный кобаламин вместе с внутренним фактором. Мочу снова собирают в течение последующих 24 ч и определяют радиоактивность. Значительное увеличение радиоактивности в моче подтверждает диагноз отсутствия внутреннего фактора у данного субъекта, так как абсорбция кобаламина была восстановлена в результате введения кобаламина вместе с внутренним фактором. Отсутствие радиоактивности в моче свидетельствует о том, что у субъекта нарушен процесс абсорбции кобаламина,например имеет место дисфункция кишечника. Тест Шиллинга существует в нескольких модификациях. Одна модификация предполагает введение меченого кобаламина в пище, а не в свободной форме. Подобным образом определяют, связана ли неспособность субъекта абсорбировать витамин В 12 с пониженной способностью высвобождать витамин В 12 из пищи, как это имеет место у субъектов, страдающих недостаточностью поджелудочной железы. Независимо от варианта теста Шиллинга, данный метод характеризуется несколькими серьезными недостатками и ограничениями. Наиболее важной проблемой является использование меченого витамина В 12. Несмотря на ограниченный уровень радиоактивности (0,510-6 Кюри), применение меченого витамина В 12 все в большей степени становится неприемлемым как для самого субъекта, так и для медицинского персонала, имеющего дело с радиоактивным кобаламином и собирающего биологический материал, необходимый для выполнения данного теста. Сбор мочи в течение 24 ч является весьма проблематичным. Данный процесс требует много времени и характеризуется достаточно большой неопределенностью из-за неполного сбора мочи субъектом. Другие варианты теста Шиллинга предполагают сбор стула (тест Дикопак) или подсчет радиоактивности во всем теле. Указанные процедуры являются неприятными и/или требуют больших затрат времени. Приобретение внутреннего фактора, используемого в тестах Шиллинга, связано с определенными трудностями, и в настоящее время отсутствует источник получения внутреннего фактора человека.-1 009520 Выполнение теста абсорбции кобаламина из пищи затруднено отсутствием стандартизации, и, как следствие этого, польза данного теста ограничена. Существующие тесты Шиллинга для определения абсорбции витамина В 12 не дают четкой картины витамина В 12 у субъекта, то есть данные тесты не позволяют определить, нуждается ли субъект, способный к усвоению витамина В 12, в дополнительном витамине В 12. Хенз и др. (Henze et al., 1988) провели исследование, в котором субъектам вводили нерадиоактивный витамин В 12 и определяли уровень витамина В 12 в плазме. Вышеуказанные исследователи не обнаружили существенного различия между субъектами с нормальным результатом теста Шиллинга и субъектами с аномальным результатом данного теста. Исследователи пришли к выводу, что тест Шиллинга не может быть выполнен с использованием нерадиоактивного витамина В 12. Определение голо-ТС Определение голо-ТС считается методом идентификации субъектов с недостаточностью кобаламина. Однако, поскольку голо-ТС выполняет сложную физиологическую функцию, маловероятно, что низкие концентрации голо-ТС действительно являются показателем недостаточности кобаламина (Carmel,2002). Фактически нет убедительных данных, свидетельствующих о том, что фактором, определяющим недостаточность кобаламина или нарушение абсорбции, является низкий уровень голо-ТС (Carmel (2002)Clinical chemistry 48, 407 и ссылки, приведенные в данной публикации). Сущность изобретения Авторы настоящего изобретения установили, что уровни голо-ТС в сыворотке отражают активную абсорбцию витамина В 12. Сделанное открытие позволяет создать наборы для определения абсорбции витамина В 12 с использованием нерадиоактивного кобаламина и разработать усовершенствованные способы их применения. Способ по настоящему изобретению включает пероральное введение нерадиоактивного кобаламина, внутреннего фактора человека и гаптокоррина и определение изменений концентраций голо-ТС и голо-НС в крови. Настоящее изобретение позволяет решить все вышеуказанные проблемы, присущие тесту Шиллинга. Тест по настоящему изобретению предполагает пероральное введение нерадиоактивного кобаламина в свободной форме или в виде комплекса с внутренним фактором человека или гаптокоррином. Пробу крови берут непосредственно перед введением витамина В 12 и через определенные периоды времени после введения витамина В 12. Концентрацию голо-ТС в пробах крови измеряют в качестве показателя поглощения витамина В 12 и/или голо-НС измеряют в качестве показателя запасов витамина В 12. Можно использовать рекомбинантные белки, чтобы исключить риск передачи болезни и загрязнения другими белками, связывающими витамин В 12, что может представлять проблему при использовании нативных белков человека. Настоящее изобретение характеризуется рядом преимуществ по сравнению с существующими методами. В настоящем изобретении используют нерадиоактивный витамин В 12 вместо радиоактивного витамина В 12. Данный способ включает простой анализ крови вместо сбора мочи. Данный способ не требует высокой степени профессионализма. Субъект принимает внутрь таблетки кобаламина вместе с кобаламинсвязывающим белком или без него, после чего у него берут несколько проб крови. При выполнении данного способа можно использовать рекомбинантный внутренний фактор человека и гаптокоррин, полученный, например, из трансгенных растений. Таким образом можно избежать переноса болезней человека и/или загрязнения другими кобаламинсвязывающими белками. Использование гаптокоррина, насыщенного кобаламином, в качестве испытуемой дозы пищевого кобаламина позволяет стандартизировать данную часть теста по настоящему изобретению. Измерение голо-ТС (отражает ранние изменения абсорбции витамина В 12) и голо-НС (отражает запасы витамина В 12) позволяет поставить более точный диагноз субъектам с подозрением на недостаточность витамина В 12. Поскольку тест Шиллинга позволяет контролировать абсорбцию кобаламина путем определения радиоактивности собранной мочи, использование нерадиоактивного кобаламина при выполнении теста по настоящему изобретению требует применения другой системы обнаружения. Концентрация голо-ТС в плазме и насыщенность ТС повышается после абсорбции кобаламина, и концентрация голо-НС в плазме может повышаться по истечении дополнительного периода времени, если в организме субъекта имеются достаточные запасы витамина В 12. Определение концентраций голо-ТС и/или голо-НС в плазме и/или определение насыщенности ТС и/или НС может заменить измерение радиоактивного кобаламина в моче. Тест, раскрытый в данном описании изобретения, включает взятие проб крови до и после предпочтительно неоднократного принятия внутрь рекомендуемой суточной дозы кобаламина с последующим выполнением анализа проб крови с целью определения концентраций голо-ТС и голо-НС. Предпочтительно через несколько дней субъект может принять внутрь аналогичные количества кобаламина, но теперь вместе с внутренним фактором. У субъекта берут новые пробы крови и анализируют изменения концентраций голо-ТС и голо-НС. Объединение результатов, полученных после выполнения двух серий-2 009520 анализов крови, позволяет диагностировать причину недостаточности витамина В 12, которая может заключаться в отсутствии внутреннего фактора или кишечной мальабсорбции. Низкая концентрация голоНС в крови свидетельствует о том, что у субъекта весь витамин В 12 перенесен в клетки организма и не возвращается в кровь или возвращается в небольшом количестве. Пероральное введение гаптокорринсвязанного кобаламина позволяет исследовать способность субъекта переносить кобаламин из пищи во внутренний фактор. Таким образом, настоящее изобретение характеризуется рядом преимуществ по сравнению с традиционным тестом Шиллинга. Способ по данному изобретению не предполагает перорального введения радиоактивного кобаламина. Способ по данному изобретению устраняет риск потери радиоактивной мочи или стула и загрязнения окружающей среды. В способе по данному изобретению используют пробы крови вместо собираемой мочи. Получение проб крови является простым процессом, в то время как сбор мочи может быть весьма затруднительным для многих субъектов, что приводит к потере мочи и неправильному вычислению абсорбции кобаламина, как это имеет место при выполнении теста Шиллинга. Способ по данному изобретению позволяет определить концентрацию голо-ТС и/или насыщенность ТС до и после введения кобаламина, кобаламина вместе с внутренним фактором или кобаламина вместе с гаптокоррином. Поэтому данный тест является стандартизированным анализом, позволяющим определить способность внутреннего фактора восстанавливать абсорбцию витамина В 12 и способность субъекта перерабатывать витамин В 12, связанный с белком, который, как считают, является типичным белком, связывающим витамин В 12 в пище. Способ по данному изобретению включает определение концентраций голо-НС и/или насыщенности НС в пробах крови. Полученные результаты содержат информацию о картине кобаламина в организме субъекта на протяжении длительного периода времени. Тест Шиллинга не дает такой информации. При выполнении данного теста можно использовать большие дозы кобаламина в свободной форме или в комплексе с внутренним фактором по сравнению с дозами, используемыми при выполнении теста Шиллинга. Данный тест позволяет получить информацию о кишечной абсорбции. Описание чертежей общего ТС голо-ТС Фиг. 1. Изменения в сыворотке концентрации витамина В 12 у 31 здорового субъекта после трехкратного приема внутрь 9 мкг витамина В 12. и насыщенности ТС Показано процентное увеличение от исходного значения (0-й день). Приведены среднее значение и стандартная ошибка средней. Наблюдались значительные изменения всех параметров от исходных значений (0-й день) до 1-го дня (р 0,0002 для всех параметров) или 2-го дня (р 0,0005 для всех параметров,за исключением ТС (р=0,002) после введения витамина В 12. На 6-й день только изменение витамина В 12 существенно отличалось от исходного значения (р=0,0024). Фиг. 2. Индивидуальные графики процентного увеличения насыщенности ТС (А) и витамина В 12(В) от исходного значения через определенные периоды времени после перорального введения витамина В 12 у 31 здорового субъекта. Горизонтальные линии показывают минимальное увеличение (21%) насыщенности ТС у участников эксперимента в 1-й день (n=30). Фиг. 3. Абсолютные изменения в сыворотке концентрации витамина В 12, общего ТС, голо-ТС и насыщенности ТС у 31 здорового субъектаи 7 больных субъектов ( - c диагнозом болезни Крона,c неясным диагнозом) после трехкратного приема внутрь 9 мкг витамина В 12. На графике приведены результаты теста Шиллинга I (выделение в моче радиоактивного витамина В 12 за 24 ч) для 7 больных субъектов. Выделение в моче 10-40% введенной дозы считается нормальным результатом. Различия параметров, наблюдаемые после введения витамина В 12 (1-й день - 0-й день), представлены в виде графика для соответствующего параметра в сравнении с исходным значением (0-й день). Тонкие вертикальные линии показывают нижнее контрольное значение для каждого параметра. Тонкие горизонтальные линии показывают минимальное увеличение голо-ТС (15 пмоль/л) и насыщенность ТС(0,02) у контрольных больных субъектов после исключения субъектов с ложным диагнозом (n=2). Тонкая горизонтальная линия для общего ТС соответствует 0. Тонкая горизонтальная линия для витамина В 12 соответствует минимальному увеличению, наблюдаемому для голо-ТС (15 пмоль/л). Подробное описание изобретения Способы по настоящему изобретению Первым объектом настоящего изобретения является способ определения причины недостаточности витамина В 12 у субъекта, который включает сравнение концентрации голо-ТС и/или голо-НС в крови или сыворотке после приема внутрь нерадиоактивного кобаламина или его аналогов с концентрацией в пробе крови, полученной до введения кобаламина. Данное изобретение относится также к способу диагностики недостаточности витамина В 12 у субъекта, который включает нижеследующие стадии:ii) введение указанному субъекту дозы нерадиоактивного кобаламина или его аналога вместе со связывающим белком или без связывающего белка;iii) взятие второй пробы крови у указанного субъекта по истечении периода времени, достаточного для всасывания кобаламина или его аналога в кровотоке при наличии указанного всасывания;iv) определение в двух указанных пробах крови одного или нескольких параметров, выбираемых из группы, включающей концентрацию голо-ТС, концентрацию голо-НС, насыщенность ТС и насыщенность НС;v) определение абсорбции кобаламина или его аналога в кровотоке на основании сравнения указанной концентрации и/или насыщенности в двух пробах крови. Кроме того, данное изобретение относится к способу определения абсорбции витамина В 12 у субъекта, который включает нижеследующие стадии:i) взятие двух проб крови у указанного субъекта, причем первую пробу крови получают до приема внутрь указанным субъектом нерадиоактивного кобаламина или его аналога вместе со связывающим белком или без связывающего белка и вторую пробу крови получают после введения нерадиоактивного кобаламина;ii) определение в указанных пробах крови одного или нескольких параметров, выбираемых из группы, включающей концентрацию голо-ТС, концентрацию голо-НС, насыщенность ТС и насыщенность НС;iii) определение абсорбции кобаламина или его аналога в кровотоке на основании сравнения указанной концентрации и/или насыщенности в двух пробах крови. В некоторых вариантах осуществления изобретения данный тест включает определение концентрации голо-ТС и/или насыщенности ТС. В других вариантах осуществления изобретения данный тест включает определение концентрации голо-НС и/или насыщенности НС. В других вариантах осуществления изобретения данный тест включает определение всех четырех параметров, то есть концентрации голо-ТС, концентрации голо-НС, насыщенности ТС и насыщенности НС. В предпочтительном варианте осуществления изобретения определяют активную (то есть опосредуемую внутренним фактором) абсорбцию. Время между введением нерадиоактивного кобаламина или его аналогов и последующим взятием пробы крови должно быть достаточно продолжительным для всасывания (если оно происходит) нерадиоактивного кобаламина или его аналогов в кровотоке. Первую пробу крови, используемую для определения концентрации голо-ТС и/или голо-НС, и/или насыщенности ТС и/или НС до абсорбции введенной дозы кобаламина, берут до приема кобаламина. Однако термин "взятие пробы крови до введения кобаламина" означает также ситуацию, в соответствии с которой первую пробу крови берут одновременно с введением кобаламина или сразу же после введения кобаламина до его абсорбции. Данный способ может быть модифицирован путем введения вместе с кобаламином внутреннего фактора или гаптокоррина. Два или более вариантов указанного теста можно выполнить последовательно в любом порядке. Например, все три варианта данного теста могут быть выполнены при введении субъекту только одного кобаламина в первом тесте, кобаламина и внутреннего фактора во втором тесте,кобаламина и гаптокоррина в третьем тесте. Кобаламин (витамин В 12) представляет собой молекулу, которая содержит корриновое кольцо с четырьмя звеньями пиррола, которые окружают неотъемлемый и центральный атом кобальта и связаны с указанным атомом. Ниже плоскости коррина расположено производное нуклеотида с диметилбензимидазольным основанием, которое также связано с атомом кобальта. И, наконец, атом кобальта связан с шестой молекулой (например, -СН 3, -ОН, -H2O, 5'-дезоксиаденозил, -CN), расположенной выше плоскости коррина. В настоящей заявке авторы изобретения используют термины "кобаламин" и "витамин В 12" для обозначения любой формы витамина, которая в организме человека может быть превращена в активные формы витамина. Кобаламин не синтезируется животными или растениями и продуцируется только некоторыми микроорганизмами, в частности анаэробными бактериями. Термин "кобаламин" в используемом здесь значении означает кобаламин, цианокобаламин, метилкобаламин, гидроксикобаламин или их аналоги, обладающие способностью связываться с внутренним фактором, транскобаламином и/или гаптокоррином. Кобаламин, используемый для перорального введения, представляет собой нерадиоактивную форму. Цель введения кобаламина может быть терапевтической или нетерапевтической. Можно ввести одну,две, три или большее число доз через одинаковые периоды времени, например каждые 6 ч. Повторное введение кобаламина может увеличить концентрацию голо-ТС и, возможно, также голо-НС в крови в случае абсорбции кобаламина. Многократное введение рекомендуемой суточной дозы кобаламина позволяет значительно увеличить концентрацию голо-ТС в крови при хорошем функционировании системы абсорбции. Использование небольших доз кобаламина (менее 0,5 нмоль), как это имеет место при выполнении теста Шиллинга, не вызывает значительного увеличения голо-ТС в крови. Дозу предпочтительно выбирают с таким расчетом, чтобы свести к минимуму пассивную абсорбцию (то есть абсорбцию,не опосредуемую внутренним фактором). Таким образом, общая вводимая доза кобаламина предпочтитель-4 009520 но составляет 0,5-500 нмоль, более предпочтительно 1-250 нмоль, еще предпочтительнее 2-100 нмоль,наиболее предпочтительно 5-50 нмоль. В особенно предпочтительном варианте осуществления изобретения вводят три дозы кобаламина, каждая из которых составляет 5-15 нмоль. Пробы крови, взятые через несколько часов, например на следующее утро после введения кобаламина, демонстрируют максимальное изменение концентрации голо-ТС в крови при абсорбции кобаламина из кишечника и переносе в ТС в крови. В одном предпочтительном варианте осуществления изобретения концентрацию голо-ТС, голо-НС, общего ТС и/или общего НС в крови измеряют менее чем через 48 ч, более предпочтительно через 8-16 ч после введения последней дозы кобаламина. Если необходимо выполнить два или более вариантов данного теста при обследовании одного субъекта (например, при введении только кобаламина, введении кобаламина с гаптокоррином и/или введении кобаламина с внутренним фактором), при выполнении второго теста исходную концентрацию голо-ТС, голо-НС, общего ТС и/или общего НС в крови измеряют более чем через 48 ч, предпочтительно через 5-10 дней после последнего введения кобаламина. Кобаламинсвязывающими белками являются белки, способные связывать кобаламин или его аналоги. Кобаламинсвязывающие белки, используемые в данном изобретении, представляют собой транскобаламин, внутренний фактор, гаптокоррин или функциональные эквиваленты любого из указанных белков. Термин "функциональные эквиваленты" в используемом здесь значении означает белки, сохраняющие способность связывать кобаламин. Функциональные эквиваленты могут быть, например, функционально эквивалентными фрагментами или функционально эквивалентными вариантами кобаламинсвязывающих белков. Предпочтительные фрагменты кобаламинсвязывающего белка составляют по крайней мере 50%,по крайней мере 75%, по крайней мере 90% от общей длины соответствующего белка. Предпочтительные варианты имеют последовательность, которая по крайней мере на 50%, по крайней мере на 75%, по крайней мере на 90% идентична соответствующему белку. Процентную идентичность двух аминокислотных последовательностей определяют путем совмещения последовательностей для достижения оптимального сравнения (например, в обе последовательности могут быть введены пробелы для лучшего совмещения) и сравнения аминокислотных остатков в соответствующих положениях. Термин "максимальное совмещение" означает такое совмещение двух последовательностей, при котором достигается наибольшая процентная идентичность. Процентную идентичность определяют по числу сравниваемых идентичных аминокислотных остатков (то есть % идентичность = число идентичных положений/общее число положений 100). Кобаламинсвязывающие белки, используемые для введения и анализа концентраций голо-ТС и голо-НС в плазме, могут быть нативными, например полученными у человека, свиньи, или рекомбинантными кобаламинсвязывающими белками, продуцированными, например, в дрожжах, растениях, растительных клетках, клетках насекомых, клетках млекопитающих. Кобаламинсвязывающие белки предпочтительно являются рекомбинантными белками человека, продуцированными дрожжами или трансгенными растениями, так как это устраняет риск переноса патогенов млекопитающих из источников получения внутреннего фактора и гапртокоррина, содержащих другие вещества, присущие млекопитающим. Кобаламин, внутренний фактор и гаптокоррин адаптируют для перорального введения. Они могут быть получены в дискретной форме, такой как капсулы или таблетки; а также в виде порошков или гранул; растворов или суспензий в водных или неводных жидкостях; съедобной пены или крема; жидких эмульсий масла в воде или жидких эмульсий воды в масле. Способы, рассмотренные в данном описании изобретения, могут быть выполнены с использованием проб крови любых субъектов, включая здоровых субъектов, субъектов с подозрением на недостаточность витамина В 12, которым не был поставлен окончательный диагноз, или субъектов, которые, как известно, страдают недостаточностью витамина В 12. В одном варианте осуществления изобретения субъект не болен СПИДом. Концентрации голо-ТС и голо-НС в крови можно определить несколькими разными способами. Ниже дано описание нескольких таких способов, но можно использовать любые приемлемые способы. Приемлемые способы, например, описаны в заявках на патент СШАUS20010051346 и US20030148541. Концентрацию общего транскобаламина (апо- и голо-ТС) и общего гаптокоррина в пробе крови можно определить, например, методом ELISA с использованием, соответственно, антител против транскобаламина и гаптокоррина. Фракцию транскобаламина и гаптокоррина в апо-форме (не насыщенной кобаламином) можно отделить благодаря сродству к гранулам или твердому материалу, покрытому кобаламином. Затем количество связанного ТС и НС можно определить методом ELISA с использованием антител против транскобаламина и гаптокоррина. Концентрацию голо-ТС и голо-НС можно вычислить,вычитая концентрацию апо-формы из концентрации апо- и голо-формы. Насыщенность ТС и НС можно вычислить, соответственно, в виде отношения голо-ТС/общий ТС и голо-НС/общий НС. Концентрацию голо-формы транскобаламина или гаптокоррина в пробах крови альтернативно можно определить, например, методом ELISA с использованием моноклональных антител, узнающих только голо-форму и не узнающих апо-форму или свободный кобаламин. Концентрацию голо-формы транскобаламина и гаптокоррина альтернативно можно определить методом, описанным в публикации Nexo et al. (2002). Данный метод включает удаление апо-ТС и апо-НС-5 009520 из пробы крови при помощи магнитных шариков, покрытых кобаламином, которые связывают апо-форму кобаламинсвязывающих белков. Указанные шарики удаляют, при этом супернатант содержит голоТС и голо-НС вместе с другими белками, не способными связывать кобаламин, и не содержит апо-форму ТС и НС. Концентрацию голо-ТС и голо-НС определяют методом ELISA с использованием антител против ТС и НС, как это описано для ТС в публикации Nexo et al. (2000). Концентрацию голо-ТС в крови можно также определить при помощи анализа связывания радиоактивного изотопа, такого как метод RIA для определения голо-ТС компании Axis Shield (Норвегия), описанный в публикации Uleland et al. (2002). Увеличение концентрации голо-ТС и/или насыщенности ТС в крови после введения кобаламина показывает, что испытуемый субъект секретирует внутренний фактор, способный связывать введенный кобаламин. Полученный результат также показывает, что комплекс кобаламин-внутренний фактор способен связываться с кишечным рецептором и таким образом переносить кобаламин к транскобаламину в крови. Альтернативно, при отсутствии или незначительном увеличении концентрации голо-ТС и/или насыщенности ТС полученный результат показывает, что у субъекта отсутствует секреция внутреннего фактора или является недостаточной для эффективного переноса кобаламина к кишечному рецептору,либо ограничена возможность кишечной абсорбции, например, из-за проблем с кишечными рецепторами. Многократное введение рекомендуемой суточной дозы кобаламина насыщает систему абсорбции и поэтому служит показателем абсорбционной способности. Абсорбированный кобаламин сначала появляется в крови в виде комплекса с ТС и затем переносится к НС. Поэтому концентрация голо-НС увеличивается в крови позже, чем концентрация голо-ТС. Если испытуемый субъект страдает недостаточностью витамина В 12 в течение длительного периода времени,запасы кобаламина в организме будут низкими или будут полностью отсутствовать. Абсорбция нескольких наномолей кобаламина вызовет временное увеличение голо-ТС до переноса кобаламина в клетки ткани. В данной ситуации не произойдет значительного увеличения концентрации голо-НС в крови. Внутренний фактор или гаптокоррин и кобаламин можно вводить вместе, отдельно или последовательно. Для облегчения сравнения результатов, полученных в первом варианте данного способа (например, введение только кобаламина), с результатами второго и/или третьего варианта данного способа(введение кобаламина и внутреннего фактора и/или гаптокоррина) желательно, чтобы используемая доза кобаламина была одинаковой во всех тестах. Если перорально введенный кобаламин не всасывается кишечником, причиной недостаточности витамина В 12 может быть отсутствие секреции внутреннего фактора или недостаточность внутреннего фактора другого типа. Поэтому субъекту перорально вводят кобаламин и внутренний фактор. Увеличение концентрации голо-ТС и голо-НС в крови после введения кобаламина и внутреннего фактора свидетельствует о том, что субъект страдает недостаточной секрецией внутреннего фактора или другим видом недостаточности внутреннего фактора. Небольшое или большое увеличение концентрации голо-ТС отражает, соответственно, незначительную и значительную способность всасывания в кишечнике комплекса кобаламин-внутренний фактор. Увеличение голо-ТС без увеличения голо-НС показывает, что субъект страдает недостаточностью витамина В 12 в течение длительного периода времени, вследствие чего в организме имеются небольшие запасы или полностью отсутствуют запасы голо-НС. Данный способ может быть адаптирован для определения того, является ли причиной недостаточности витамина В 12 отсутствие переноса кобаламина из гаптокоррина (в виде заменителя пищи кобаламином, связанным с белком) к внутреннему фактору в кишечнике. Если субъект способен абсорбировать кобаламин после его введения и все же страдает недостаточностью витамина В 12, причиной недостаточности, скорее всего, является не отсутствие внутреннего фактора или кишечных рецепторов, а, по-видимому, неспособность переноса кобаламина из кобаламинсвязывающих белков в пище к внутреннему фактору. Отсутствие увеличения концентрации голо-ТС в крови после многократного введения рекомендуемой суточной дозы кобаламина, связанного с гаптокоррином(или другим связывающим белком, который может служить в качестве заменителя кобаламинсвязывающих белков в пище), показывает, что данный субъект не способен высвобождать витамин В 12 из пищи,что характерно для субъектов, страдающих дисфункцией поджелудочной железы. Наборы по данному изобретению Другим объектом настоящего изобретения являются наборы, используемые для диагностики недостаточности витамина В 12. Таким образом, данное изобретение относится к набору компонентов, предназначенному для диагностики недостаточности витамина В 12, который включает:i) вещества, пригодные для определения концентрации голо-ТС и/или голо-НС в пробе крови;ii) инструкции для пользователя, включающие описание возможного применения указанного набора при выполнении любого из способов, представленных в данном описании изобретения. Кроме того, настоящее изобретение относится к набору компонентов, предназначенному для диагностики недостаточности витамина В 12, который включает нерадиоактивный кобаламин, антитела к транскобаламину и/или антитела к гаптокоррину. Указанные наборы могут включать одну или несколько емкостей, содержащих, например, кобаламин, внутренний фактор, гаптокоррин, антитела к транскобаламину, антитела к гаптокоррину, кобала-6 009520 мин, связанный с гранулами или твердым носителем, буферы и колонки. Антитела могут быть также моноклональными антителами, которые узнают только голо-ТС и не узнают апо-ТС или кобаламин. В набор может также входить меченая форма кобаламинсвязывающего белка. Указанные компоненты могут находиться в наборе в виде отдельных компонентов или готовых смесей. Реагенты могут быть высушены сублимацией, лиофилизованы или представлять собой готовый раствор. Такие наборы могут также включать другие емкости или устройства, предназначенные для использования набора. Примеры Было выполнено исследование с целью определения взаимосвязи между абсорбцией витамина В 12 и изменениями концентрации голо-ТС и/или насыщенности ТС. Вещества и способы В исследовании участвовал 31 здоровый субъект, привлеченный к участию в октябре 2002 г. Ни один из указанных субъектов не страдал известными заболеваниями, обусловленными недостаточностью витамина В 12. Из исследования были исключены субъекты с хроническим системным заболеванием,субъекты, проходящие курс любого консервативного лечения, включая прием внутрь таблеток витаминов на прошедшей неделе, и субъекты, не давшие письменного согласия на участие в эксперименте. Возраст здоровых субъектов составлял от 25 до 57 (в среднем, 40) лет. В исследовании участвовали 9 мужчин и 22 женщины. Авторы изобретения далее ввели в состав участников эксперимента 7 больных субъектов (возраст 22-39 лет, 5 мужчин и 2 женщины), которые были направлены на амбулаторное лечение в терапевтическое отделение в 2003 г. по подозрению в мальабсорбции витамина В 12. У 3 из 7 больных субъектов ранее была диагностирована болезнь Крона. Диагноз у остальных 4 больных субъектов был неясен. У всех субъектов было получено письменное согласие на участие в исследовании, и протокол исследования был одобрен Комитетом по этике научных исследований округа г.Орхус (2002.0224). Протокол исследования Абсорбцию витамина В 12 оценивали, анализируя пробы крови, полученные до и после перорального введения витамина В 12, на наличие в сыворотке витамина В 12, общего ТС и голо-ТС. У здоровых субъектов брали пробы крови в 8:00 в день, предшествующий введению витамина В 12(-1), и в 0-й, 1-й, 2-й и 6-й день. После взятия пробы крови в 0-й день испытуемым субъектам трижды перорально вводили 9 мкг дозу витамина В 12 (Natur Drogeriet A/S, Hoerning, Denmark) с 6-часовыми интервалами между приемами доз (в 8:00, 14:00 и 20:00 ч, с возможностью отклонения от установленного периода времени, равного 45 мин). Один здоровый субъект не явился для сдачи крови на 6-й день. Абсорбцию витамина В 12 у 7 субъектов определяли при помощи теста Шиллинга I и вышеуказанным способом, за исключением того, что пробы крови получали только в 0-й и 1-й день. Тест Шиллинга I выполняли после альтернативного способа, предложенного авторами изобретения. Испытуемые субъекты принимали таблетки витамина В 12 с водой или апельсиновым соком. За 3060 мин до взятия пробы крови субъекты получали легкий завтрак, не содержащий молочных продуктов,причем в другое время субъектам было разрешено есть обычную пищу. Пробы крови центрифугировали в течение 60 мин и хранили при -80 С до последующей обработки. Тест Шиллинга I Тест Шиллинга I выполняли в соответствии с известным описанием (Chanarin, 1979). Субъекту натощак перорально вводят 1 мкг дозу витамина В 12, меченную радиоактивным кобальтом (Со-57). Через 2 ч после перорального введения дозы субъекту внутримышечно инъецируют 1000 мкг немеченого витамина В 12. После этого начинают 24-часовой сбор мочи. Затем определяют процентное значение введенной дозы, выделенной в моче в течение 24 ч. Выделение в моче 10-40% введенной дозы считается нормальным. Биохимический анализ Концентрацию витамина В 12 в сыворотке определяли коммерческим методом (Bayer corporation,NY) в устройстве Centaur (аналитическая погрешность 10%). Концентрацию общего ТС и голо-ТС в сыворотке измеряли ранее описанным методом ELISA (Nexo et al., 2000, 2002), который был модифицирован с возможностью применения автоматического анализатора ELISA (ВЕР-2000, Dade Behring, Germany). Была произведена нижеследующая модификация; все инкубации выполняли при 37 С. Аналитическая погрешность была равна 7% для общего ТС (среднее значение=934 пмоль/л, n=91) и 8% для голо-ТС(среднее значение=38 пмоль/л, n=41). Контрольные проверки концентрации общего ТС выполняли в течение 12 месяцев и голо-ТС в течение 6 месяцев. Контрольный интервал был установлен в результате анализа 161 пробы, полученной у здоровых доноров крови (в возрасте от 21 года до 65 лет). Контрольный интервал был равен 700-1400 пмоль/л для общего ТС, 50 пмоль/л для голо-ТС и 0,05 для насыщенности ТС. Гематологические параметры анализировали в счетчике Coulter (Beckman Coulter CA). Креатинин в плазме измеряли методом Джаффе и в автоматическом анализаторе integra 700 Roche Cobas(аналитическая погрешность 3%). Статистический анализ Изменчивость результатов у одного субъекта высчитывали методом оценки изменчивости ANOVA на основании измерений анализируемых веществ из двух проб крови, полученных до выполнения теста(-1-й день и 0-й день). Изменения (увеличение или уменьшение) параметров в зависимости от времени анализировали,сравнивая изменения, полученные у одних и тех же субъектов, с исходным значением (0-й день), причем теоретическое среднее значение для 0-го дня было принято равным "0". Так как полученные данные не представляли нормального распределения, использовали непараметрическое тестирование (метод совмещенных пар Вилкоксона). Р-значения 5% считались статистически значимыми. Данные анализировали с использованием программного обеспечения SPSS10.0 (SPSS Inc.) и GraphPad (Prism2). Результаты У 31 здорового субъекта были нормальные уровни эритроцитов, гемоглобина, среднеклеточного объема и креатинина, суммированные в табл. 1. Таблица 1 Среднее значение, диапазон и индивидуальная изменчивость витамина В 12,концентрация голо-ТС, общего ТС и насыщенность ТС у 31 здорового субъектаа Лабораторные параметры определяли, используя пробы крови, полученные в 1-й день. Интервалы контрольных значений для голо-ТС, общего ТС и насыщенности ТС были определены на основе анализов 161 пробы крови, полученной у здоровых доноров крови.c Индивидуальную изменчивость высчитывали на основании значений, полученных в 1-й и 0-й дни в пробах крови 31 здорового субъекта до введения витамина В 12. Индивидуальная изменчивость составляла менее 13% для всех параметров (табл. 1) при вычислении на основании данных, полученных для проб крови, взятых до введения витамина В 12 (1-й день и 0-й день). После трехкратного перорального введения 9 мкг витамина В 12 все исследуемые параметры изменились так, как показано на фиг. 1. Изменения относительно исходного значения (0-й день) были особенно значимыми в 1-й день (р 0,0002 для всех параметров) и во 2-й день (р 0,0005 для голо-ТС, насыщенности ТС и витамина В 12, р=0,02 для общего ТС). Максимальное процентное и абсолютное увеличение (среднее значение (диапазон голо-ТС было равно 39 (0-+108)%, 34 (0-149) пмоль/л и насыщенности ТС было равно 52 (-2-+128)%, 0,04 (0-0,23) в виде соотношения (n=31). Максимальное увеличение, равное 15% или более для голо-ТС и насыщенности ТС, наблюдалось в 1-й день у 29 субъектов и во 2-й день у 1 субъекта. Только у 1 здорового субъекта не наблюдалось увеличения голо-ТС и насыщенности ТС.-8 009520 Процентное и абсолютное увеличение витамина В 12 в сыворотке было менее выраженным (14(-8-+51)%, 36 (-27-290) пмоль/л). У 4 здоровых субъектов не наблюдалось увеличения данного показателя, и у 14 здоровых субъектов увеличение составило менее 15%. Небольшие, но значимые изменения наблюдались для общего ТС. Максимальное процентное и абсолютное уменьшение составило 5 (-16-+9)% и 46 (-180-+77) пмоль/л. У 23 из 31 здорового субъекта наблюдалось снижение концентрации общего ТС в 1-й день. После 1-го дня наивысшие уровни (среднее значение (диапазон были получены для голо-ТС (118(176-856) пмоль/л) (табл. 2). После 6 дней уровни голо-ТС, общего ТС и насыщенности ТС существенно не отличались от исходного значения, в то время как уровень витамина В 12 в сыворотке оставался значительно выше исходного значения (р=0,0086). Таблица 2 Абсолютные значения (среднее значение (диапазон, полученные для насыщенности ТС, голо-ТС и витамина В 12 до (0-й день) перорального введения витамина В 12 и в определенные периоды времени после перорального введения витамина В 12 у 31 здорового субъекта Вычисленное значение насыщенности ТС становится несколько лучшим показателем абсорбции витамина В 12 благодаря наблюдаемому уменьшению общего ТС наряду с увеличением концентрации голо-ТС после введения витамина В 12. У всех здоровых субъектов, за исключением 1 человека, наблюдалось увеличение насыщенности ТС на 21% или больше. Однако только у 7 здоровых субъектов наблюдалось такое же или большее увеличение концентрации витамина В 12 в сыворотке (фиг. 2). У 4 из 7 больных субъектов с подозрением на пониженную абсорбцию витамина В 12 были получены значения концентрации голо-ТС и витамина В 12 в сыворотке ниже контрольного интервала (фиг. 3), хотя их гематологические параметры были нормальными (данные не приведены). У 3 из 4 вышеуказанных больных субъектов ранее была диагностирована болезнь Крона. После введения витамина В 12 у 3 субъектов, страдающих болезнью Крона, наблюдалось пренебрежимое увеличение голо-ТС (3, 7, 14 пмоль/л) и насыщенности ТС (0,004, 0,01, 0,01) (фиг. 3). У всех 7 больных субъектов, за исключением 1 человека, количественные результаты теста ШиллингаI (процентное значение витамина В 12, выделенного в моче) лишь приблизительно были сравнимы с изменением концентрации голо-ТС в сыворотке после введения витамина В 12 (фиг. 3). У 1 из 3 больных субъектов, страдающих болезнью Крона, был получен аномальный результат теста Шиллинга I (2%). У 2 других больных субъектов результат теста Шилинга I находился в нормальном диапазоне (10-40%), но их показатели располагались в нижней части контрольного интервала (соответственно, 10, 15%). Заключение Результаты данного исследования показывают, что уровни голо-ТС в сыворотке и насыщенности ТС отражают активную абсорбцию витамина В 12. Через 1 день после трехкратного перорального введения 9 мкг дозы витамина В 12 уровень голо-ТС и насыщенности ТС увеличивался, в среднем, примерно на 50%, в то время как аналогичное увеличение составило только 14% для концентрации витамина В 12 в сыворотке здоровых субъектов. Полученные результаты позволяют предположить, что измерение голоТС и/или насыщенности ТС после перорального введения дозы витамина В 12 является более информа-9 009520 тивным, чем измерение витамина В 12 в сыворотке в случае оценки активной абсорбции витамина В 12. До сих пор мало внимания уделялось дозе витамина В 12, вводимой субъекту для исследования активного поглощения витамина В 12 путем анализа проб крови. В большинстве ранее выполненных исследований использовали относительно большую однократную перорально вводимую дозу витамина В 12(1000 мкг) (Henze et al., 1988; Moridani et al., 2002). Важное значение в данном случае имеет то, что при использовании такой большой дозы витамина В 12 не опосредуемая внутренним фактором (IF) абсорбция только 1% витамина В 12 повышает концентрацию в плазме, что искажает результаты измерения. Данное увеличение не отражает активную IF-опосредуемую абсорбцию и поэтому имеет ограниченное значение для диагностики активной абсорбции витамина В 12. В выполненном исследовании введение витамина В 12 удовлетворяет двум критериям. Во-первых,авторы изобретения свели к минимуму пассивную абсорбцию, составляющую примерно 1% вводимой дозы (Chanarin, 1979). Во-вторых, авторы изобретения накопили как можно больше активно абсорбируемого витамина В 12 для получения оптимального сигнала. Для удовлетворения двум вышеуказанным требованиям авторы изобретения выбрали высокую физиологическую дозу (9 мкг) и вводили указанную дозу 3 раза с 6-часовыми интервалами. Хорошо известно, что после приема внутрь дозы витамина В 12 наступает рефрактерная фаза, длящаяся примерно 3 ч, когда происходит меньшая абсорбция витамина В 12 по сравнению с последующим поглощением витамина В 12 (Chanarin, 1979). Следующая доза витамина В 12 абсорбируется нормально при введении примерно через 4-6 ч после первой дозы (Chanarin,1979). Ранее было показано, что наибольшее количество IF-связанного витамина В 12 было получено при введении 10 мкг дозы витамина В 12. СсылкиCarmel. R. (2002) Measuring and interpreting holo-transcobalamin (holo-transcobalamin II) Clin. Chem.; 48: 407-409. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Способ определения абсорбции витамина В 12 у субъекта, который включает нижеследующие стадии:i) взятие двух проб крови у указанного субъекта, причем первую пробу получают до приема внутрь указанным субъектом нерадиоактивного кобаламина или его аналога вместе со связывающим белком или без связывающего белка и вторую пробу получают после указанного приема;ii) определение в полученных пробах крови одного или нескольких параметров, выбираемых из группы, включающей концентрацию голо-ТС, концентрацию голо-НС, насыщенность ТС и насыщенность НС;iii) определение абсорбции кобаламина или его аналога в кровотоке на основании сравнения указанной концентрации и/или насыщенности в двух полученных пробах крови. 2. Способ по п.1, в котором указанный нерадиоактивный кобаламин или его аналог вводят без связывающего белка. 3. Способ по п.1, в котором указанный нерадиоактивный кобаламин или его аналог вводят вместе с внутренним фактором, его аналогом, фрагментом или вариантом. 4. Способ по п.3, в котором указанный внутренний фактор, его аналог, фрагмент или вариант является рекомбинантным. 5. Способ по п.3, в котором указанный внутренний фактор, его аналог, фрагмент или вариант получен из рекомбинантного растения. 6. Способ по п.1, в котором указанный нерадиоактивный кобаламин или его аналог вводят вместе с гаптокоррином, его аналогом, фрагментом или вариантом или другим связывающим белком, который может служить заменителем кобаламинсвязывающих белков в пище. 7. Способ по п.6, в котором указанный гаптокоррин, его аналог, фрагмент или вариант либо другой связывающий белок является рекомбинантным.- 10009520 8. Способ по п.6, в котором указанный гаптокоррин, его аналог, фрагмент или вариант либо другой связывающий белок получен из рекомбинантного растения. 9. Способ по п.2, который дополнительно включает предшествующее или последующее выполнение способа по п.3 или по п.6. 10. Способ по любому из пп.1-9, в котором вводят две или большее число доз кобаламина вместе со связывающим белком или без связывающего белка. 11. Способ по п.10, в котором кобаламин вводят 3 раза с интервалами времени, равными 6 ч. 12. Способ по любому из пп.1-11, в котором общая введенная доза кобаламина составляет от 0,5 до 500 нмоль, предпочтительно от 1 до 250 нмоль, более предпочтительно от 2 до 100 нмоль, наиболее предпочтительно от 5 до 50 нмоль. 13. Способ по п.11, в котором каждая из трех введенных доз составляет от 5 до 15 нмоль. 14. Способ по любому из пп.1-13, в котором один или несколько параметров, выбираемых из группы, включающей концентрацию голо-ТС, концентрацию голо-НС, насыщенность ТС и насыщенность НС, измеряют менее чем через 48 ч после последнего введения кобаламина. 15. Способ по п.14, в котором один или несколько параметров, выбираемых из группы, включающей концентрацию голо-ТС, концентрацию голо-НС, насыщенность ТС и насыщенность НС, измеряют через 8-16 ч после последнего введения кобаламина. 16. Способ по любому из пп.9-15, в котором один или несколько параметров, выбираемых из группы, включающей концентрацию голо-ТС, концентрацию голо-НС, насыщенность ТС и насыщенность НС, первоначально измеряют для выполнения последующего способа более чем через 48 ч после последнего введения кобаламина в предшествующем способе. 17. Способ по п.16, в котором один или несколько параметров, выбираемых из группы, включающей концентрацию голо-ТС, концентрацию голо-НС, насыщенность ТС и насыщенность НС, первоначально измеряют для выполнения последующего способа через 5-10 дней после последнего введения кобаламина в предшествующем способе. 18. Способ по любому из пп.9-17, в котором кобаламин вместе со связывающим белком или без связывающего белка вводят в одинаковом количестве, в виде одинакового числа доз, с одинаковым промежутком времени между дозами в каждом способе. 19. Способ по п.1 или по любому из пп.3-18, в котором молярное количество кобаламина, вводимого вместе со связывающим белком, меньше, равно или больше молярного количества вводимого связывающего белка. 20. Способ по любому из пп.9-19, в котором один или несколько параметров, выбираемых из группы, включающей концентрацию голо-ТС, концентрацию голо-НС, насыщенность ТС и насыщенность НС, измеряют в крови в одно и то же время после введения кобаламина вместе со связывающим белком или без связывающего белка в каждом способе. 21. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором концентрацию голо-ТС и/или голоНС измеряют при помощи иммуносорбентного анализа. 22. Способ по п.21, в котором иммуносорбентный анализ представляет собой метод ELISA или RIA. 23. Способ по п.21 или 22, в котором концентрацию голо-ТС и/или голо-НС определяют, вычитая концентрацию апо-ТС и/или апо-НС из общей концентрации ТС и/или НС. 24. Способ по любому из пп.21-23, в котором апо-ТС и/или апо-НС удаляют, пропуская пробу крови через комплекс кобаламина на твердом носителе. 25. Способ по п.23 или 24, в котором концентрацию апо-ТС и/или апо-НС определяют, используя моноклональные антитела, специфичные к апо-ТС или апо-НС. 26. Способ по п.21 или 22, в котором концентрацию голо-ТС и/или голо-НС определяют, используя моноклональные антитела, специфичные к голо-ТС или голо-НС. 27. Способ по любому из пп.1-20, в котором концентрацию голо-ТС или голо-НС определяют, измеряя количество витамина В 12, присоединенного к голо-ТС или голо-НС. 28. Способ по п.27, в котором указанное определение включает нижеследующие стадии: выделение апо- и голо-формы ТС или НС из пробы крови в результате связывания с антителами против ТС или НС; высвобождение кобаламина из фракции голо-ТС или голо-НС и удаление или разрушение ТС или НС; определение количества кобаламина, выделенного при помощи конкурентно-связывающего анализа. 29. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором конечная стадия включает определение того, является ли значение одного или нескольких параметров, выбираемых из группы, включающей концентрацию голо-ТС, концентрацию голо-НС, насыщенность ТС и насыщенность НС, во второй пробе выше, чем в первой пробе. 30. Способ определения возможной недостаточности витамина В 12 у субъекта, который включает стадии любых способов по любому из предшествующих пунктов и дополнительно стадию выявления недостаточности витамина В 12 и/или причины такой недостаточности у указанного субъекта на основании сравнения указанной концентрации и/или насыщенности в полученных пробах крови. 31. Способ определения причины недостаточности витамина В 12 у субъекта, включающий стадии- 11009520 любых способов по пп.1-29 и дополнительно стадию выявления причины указанной недостаточности на основании сравнения указанной концентрации и/или насыщенности в полученных пробах крови. 32. Способ определения причины недостаточности витамина В 12, которая может быть вызвана недостаточностью внутреннего фактора, в частности отсутствием секреции внутреннего фактора, или мальабсорбцией кобаламина, связанного с внутренним фактором, в кишечнике, причем указанный способ включает выполнение способа по п.3 и дополнительно стадию оценки возникновения недостаточности витамина В 12 вследствие отсутствия секреции внутреннего фактора или мальабсорбции кобаламина,связанного с внутренним фактором, в кишечнике на основании сравнения указанной концентрации и/или насыщенности в полученных пробах крови. 33. Способ определения причины недостаточности витамина В 12, которая может быть вызвана недостаточным переносом кобаламина из пищи во внутренний фактор, причем указанный способ включает выполнение способа по п.6 и дополнительно стадию оценки возникновения недостаточности витамина В 12 вследствие недостаточного переноса кобаламина из пищи во внутренний фактор на основании сравнения указанной концентрации и/или насыщенности в полученных пробах крови. 34. Способ диагностики недостаточности витамина В 12 у субъекта, включающий нижеследующие стадии:ii) введение указанному субъекту дозы нерадиоактивного кобаламина или его аналога вместе со связывающим белком или без связывающего белка;iii) взятие второй пробы крови у указанного субъекта по истечении периода времени, достаточного для всасывания кобаламина или его аналога в кровотоке при наличии указанного всасывания;iv) определение в полученных пробах крови одного или нескольких параметров, выбираемых из группы, включающей концентрацию голо-ТС, концентрацию голо-НС, насыщенность ТС и насыщенность НС;v) определение абсорбции кобаламина или его аналога в кровотоке на основании сравнения указанной концентрации и/или насыщенности в двух полученных пробах крови. 35. Набор компонентов, предназначенный для диагностики недостаточности витамина В 12, который включает:i) по меньшей мере 1 единицу нерадиоактивного кобаламина, где указанная по меньшей мере одна единица включает общую дозу кобаламина 0,5-500 нмоль; иii) рекомбинантный внутренний фактор и/илиiii) гаптокоррин,где указанные нерадиоактивный кобаламин, рекомбинантный внутренний фактор и/или гаптокоррин адаптированы для перорального введения, иii) инструкции для пользователя, включающие описание возможного применения данного набора при выполнении любого из способов по пп.1-34. 36. Набор компонентов по п.35, в котором рекомбинантный внутренний фактор является рекомбинантным внутренним фактором человека. 37. Набор компонентов по п.35 или 36, в котором общая доза в указанной по меньшей мере 1 единице нерадиоактивного кобаламина является одинаковой для всех единиц, используемых в тесте, основывающемся на приеме внутрь только кобаламина,приеме внутрь кобаламина и внутреннего фактора и/или приеме внутрь кобаламина и гаптокоррина. 38. Набор компонентов по любому из пп.35-37, в котором количество единиц нерадиоактивного кобаламина равно по меньшей мере 3, и количество единиц нерадиоактивного кобаламина и внутреннего фактора равно по меньшей мере 3, и/или количество единиц нерадиоактивного кобаламина и гаптокоррина равно по меньшей мере 3. 39. Набор компонентов по любому из пп.35-38, в котором указанный внутренний фактор и/или указанный гаптокоррин включены по меньшей мере в 1 единицу нерадиоактивного кобаламина. 40. Набор компонентов по любому из пп.35-38, дополнительно включающий вещества, предназначенные для определения концентраций голо-ТС и/или голо-НС в пробе крови. 41. Набор компонентов по любому из пп.35-40, в котором вещества, предназначенные для определения концентраций голо-ТС и/или голо-НС, включают антитела к транскобаламину и/или антитела к гаптокоррину. 42. Набор компонентов по любому из пп.35-41, который дополнительно включает кобаламин, связанный с твердым носителем и/или буферами, пластиками и субстратами, необходимыми для определения концентрации голо-ТС и/или голо-НС. 43. Набор компонентов по пп.35-42, который дополнительно включает меченый кобаламин.