Гипоаллергенные варианты основного аллергена из пыльцы betula verrucosa

Есть еще 7 страниц.

Смотреть все страницы или скачать PDF файл.

Формула / Реферат

1. Белок, представляющий собой гипоаллергенный вариант основного аллергена пыльцы Betula verrucosa (Bet v 1) и отличающийся тем, что он:

а) обладает пониженной реактивностью к IgE по сравнению с Bet v 1 дикого типа (SEQ ID NO:1);

б) имеет аминокислотную последовательность, которая:

1) по меньшей мере на 87%, предпочтительно по меньшей мере на 94%, более предпочтительно по меньшей мере на 97% идентична SEQ ID NO:1;

2) при выравнивании последовательности с SEQ ID NO:1 присутствует по меньшей мере одна замена или делеция Lys остатков в положениях, соответствующих аминокислотам 54, 115 и/или 123 в SEQ ID NO:1.

2. Белок по п.1, отличающийся тем, что указанные остатки Lys замещены нейтральными или полярными аминокислотами.

3. Белок по п.2, отличающийся тем, что указанные нейтральные или полярные аминокислоты выбраны из Ala, Thr, Gly, Pro, Leu, Ile, Phe, Ser.

4. Белок по п.3, отличающийся тем, что указанные аминокислоты представляют собой Ala, Ser или Thr.

5. Белок по п.1, выбранный из группы, состоящей из SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5.

6. Иммунологически активный пептидный фрагмент белка по пп.1-5, содержащий от 15 до 35 аминокислот и несущий по меньшей мере одну замену и/или делецию Lys, как определено выше.

7. Фрагмент по п.6, содержащий от 15 до 20 аминокислот.

8. Молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая белок по пп.1-5 или фрагмент по пп.6, 7.

9. Молекула нуклеиновой кислоты по п.8, выбранная из группы, состоящей из SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10.

10. Вектор, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты по пп.8-9.

11. Клетка-хозяин, содержащая вектор по п.10.

12. Фармацевтическая композиция, содержащая эффективное количество белка по пп.1-5 или фрагмента по пп.6, 7 вместе с фармацевтически приемлемыми носителями и эксципиентами.

13. Вакцина, включающая композицию по п.12.

14. Применение белка по пп.1-5 или фрагмента по пп.6, 7 для приготовления лекарственного средства для профилактики или терапевтического лечения аллергических заболеваний.

15. Применение по п.14, где заболевание представляет собой бронхиальную астму, ринит, конъюнктивит или атопический дерматит.

Текст

Смотреть все

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ЕВРАЗИЙСКОМУ ПАТЕНТУ Дата публикации и выдачи патента ГИПОАЛЛЕРГЕННЫЕ ВАРИАНТЫ ОСНОВНОГО АЛЛЕРГЕНА ИЗ ПЫЛЬЦЫ В изобретении предложены гипоаллергенные варианты основного аллергена Bet v 1 из пыльцы растения Betula verrucosa и их применение для профилактического или терапевтического лечения аллергических заболеваний. 015446 В настоящем изобретении предложены варианты гипоаллергенных последовательностей белка Betv 1, молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие их, фармацевтические композиции, содержащие указанное, и их применение в профилактике и терапии аллергических заболеваний, вызываемых пыльцой растений вида Betula verrucosa. Предшествующий уровень техники Причиной аллергий является нарушение функции иммунной системы, которая реагирует на безвредные белки, содержащиеся в пыльце, клещей, эпителий и некоторые продукты питания путем продуцирования антител lgE-класса. Последние данные указывают на то, что более 10% населения в западных страны страдают от данного заболевания, симптомы которого могут ухудшаться со временем, приводя, например, к астме или к сенсибилизации по отношению к другим аллергенам, затрудняя таким образом выбор подходящей терапии. Специфическая гипосенсибилизирующая иммуннотерапия, в отличие от фармакологической терапии, является только этиологическим лечением аллергических заболеваний, способным положительно изменять иммунологические параметры, на которых основаны эти заболевания. Гипосенсибилизирующая иммуннотерапия состоит во введении возрастающих доз стандартизованных экстрактов (вакцин), полученных из того же вещества, которое вызывает заболевание (1). Таким образом, у пациента постепенно индуцируют вид иммунологической толерантности на указанное вещество с последующим исчезновением аллергических симптомов. Однако риск вызвать серьезные побочные эффекты (2), хотя и значительно сниженный при использовании либо вакцин с медленным высвобождением, либо вакцин, вводимых путями, альтернативными инъекциям, фактически ограничивает применение специфической гипосенсибилизирующей иммунотерапии в лечении аллергических заболеваний. В посление годы наибольшее внимание уделяется разработке эффективных безопасных вакцин. В частности, важной целью является разработка вакцин, состоящих из мутагенизированных рекомбинантных белков, т.е. гипоаллергенных вариантов, способных положительно влиять на естественное развитие заболевания, не вызывая нежелательных побочных эффектов (3). Пыльца растений, таксономически известных как Fagales (береза, ольха, лещина, дуб, граб), является одной из наиболее важных причин аллергического ринита и астмы в областях умеренного пояса. Два основные аллергена березовой пыльцы Bet v 1 (кДНК, депонированная в GenBank acc. No. X15877) и Betv 2 (асс. No. M65179) представляют собой белки с молекулярной массой 17 и 14 кДа соответственно(4,5). Почти 95% пациентов с аллергией на березовую пыльцу продуцируют lgE антитела против Bet v 1 и 60% этих пациентов демонстрируют реактивность к одному Bet v 1 (6).Bet v 1 присутствует в природе в более чем десяти изоформах, демонстрирующих идентичность последовательностей от 84,4 до 99,4% (7). Этот аллерген принадлежит к семейству "белков, связанных с патогенезом", то есть повсеместно присутствующих белков, продуцируемых растениями в ответ на экологический или патологический стресс, предполагаемые функции которых связаны со стероидным транспортом (8, 9). Высокая степень гомологии последовательностей с аллергенами группы 1 в пыльце других растений отряда Fagales объясняет, почему пациенты с IgE, специфичным в отношении Bet v 1,демонстрируют аллергические симптомы во время сезона образования пыльцы у разных растений, принадлежащих к тому же таксономическому отряду (10). Аллергия на березовую пыльцу часто сопровождается побочными реакциями, провоцируемыми потреблением свежих фруктов (например, вишни, яблок, груши) или овощей (например, сельдерея и моркови). Причиной является то, что такие продукты питания содержат белки, характеризующиеся высокой степенью гомологии последовательности и структуры с Bet v 1, которые распознаются специфическими IgE, индуцируемыми основным аллергеном березы (11). Иммуннотерапия аллергеном Bet v 1 может быть эффективна в лечении аллергии на березовую пыльцу, а также поллиноза на другие растения отряда Fagales и аллергии на пищу, содержащую аллергены, которые перекрестно реагируют с Bet v 1 (12). Фактором, коррелирующим с полезными эффектами гипосенсибилизирующей иммуннотерапии,является индукция IgG антител, специфичных к сенсибилизирующему аллергену. Такие (защитные) антитела могут ингибировать связывание IgE с антигеном, конкретно с Bet v 1, изменяя трехмерную конформацию данной молекулы (13, 14). Разработка вакцин, состоящих из рекомбинантных белков, обладающих меньшей аллергенностью и неизмененными иммуногенными свойствами, улучшит терапию аллергических заболеваний. Описание изобретения Было обнаружено, что при замене или удалении одного или более аминокислотных остатков в белковой последовательности аллергена Bet v 1 он становится менее реактивным к IgE антителам. В первом аспекте изобретения предложен гипоаллергенный белок, представляющий собой вариант последовательности аллергена Bet v 1, отличающий тем, что он: 1) демонстрирует пониженную реактивность к IgE по сравнению с Bet v 1 аллергеном дикого типа-1 015446 а) по меньшей мере на 87%, предпочтительно по меньшей мере на 94%, более предпочтительно по меньшей мере на 97% идентична SEQ ID NO:1; б) при выравнивании последовательности с SEQ ID NO:1 присутствует по меньшей мере одна замена или делеция остатков, соответствующих аминокислотам 54, 115 и/или 123 из SEQ ID NO:1, где присутствует остаток Lys. Варианты аллергена Bet v 1, которые в соответствии с изобретением демонстрируют 1, 2 или 3 замены и/или делеции Lys в указанных положениях, упоминаются как одиночный, двойной или тройной варианты замены и/или делеции соответственно. Более предпочтительными являются варианты замены,а не делеции, особенно те, при которых по меньшей мере один остаток Lys в указанных положениях заменен нейтральной или полярная аминокислотой. Более предпочтительно указанная нейтральная или полярная аминокислота выбрана из Ala, Thr, Gly, Pro, Leu, Ile, Ser, Phe, еще более предпочтительно изAla, Thr и Ser. В предпочтительном воплощении гипоаллергенный белок состоит из SEQ ID NO:1, несущей указанную по меньшей мере одну замену или делецию Lys остатка в положениях 54, 115 и 123. Типичные гипоаллергенные белки по изобретению, несущие 1 или 3 замены, идентифицированы вSEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4 и SEQ ID NO:5. Замещенные и/или делеционные варианты аллергена Bet v 1 по изобретению по сравнению с копией дикого типа демонстрировали снижение lgE реактивности по меньшей мере на 25%, предпочтительно по меньшей мере на 50%, более предпочтительно по меньшей мере на 80% на сыворотку пациентов,страдающих аллергией на пыльцу Betula verrucosa.IgE-реактивность белков SEQ ID NO:2-5 из объединенных сывороток пациентов с аллергией тестировали в анализе ELISA (твердофазный иммуносорбентный анализ) (фиг. 1). По сравнению с Bet v 1 аллергеном дикого типа (SEQ ID NO:1), 56% (SEQ ID NO:2), 34% (SEQ ID NO:3), 28% (SEQ ID NO:4) и 80%-ное (SEQ ID NO:5) среднее снижение IgE реактивности наблюдалось, когда такие белки инкубировали с различными разбавлениями (от 1:2 до 1:8) объединенной сыворотки пациентов, страдающих аллергией на пыльцу березы. Эти результаты были подтверждены экспериментами ELISA ингибирования, которые позволяют оценить реактивность гомологичных эпитопов из разных белков. Связывание Bet v 1 дикого типа (SEQID NO:1) с IgE из объединенной сыворотки ингибируется на 100%, когда эту сыворотку предварительно обрабатывают тем же белком, в то время как наблюдаемое ингибирование составляет только 40%, когда сыворотку предварительно инкубируют с идентичными количествами варианта с тройной заменой (SEQID NO:5) (фиг. 2). Эти результаты ясно указывают, что аминокислотные замены по положениям 54, 115 и 123 в SEQ ID NO:1 уменьшают IgE распознавание Bet v 1 аллергена. Кроме того, реактивность SEQ ID NOs:2-5 белков в отношении lgE из объединенной сыворотки, позитивной к пыльце Betula verrucosa, анализировали вестерн-блоттингом. Также в данном случае наблюдалось уменьшение lgE реактивности в анализируемой сыворотке, которое по сравнению с Bet v 1 дикого типа (SEQ ID NO:1) составляло 88% для SEQ ID NO:2, 67% для SEQ ID NO:3, 47% для SEQ ID NO:4 и 100% для SEQ ID NO:5 (фиг. 3). Кроме того, в экспериментах с иммунизацией Balb/c мышей как аллерген Bet v 1 дикого типа, так и гипоаллергенный белок SEQ ID NO:5 доказали способность индуцировать IgG-специфичный иммунный ответ (фиг. 4). В частности, антитела против SEQ ID NO:5 были способны распознавать wt-копию (ww = дикий тип) SEQ ID NO:1 (фиг. 5), что означает, что замена остатка Lys в положениях 54, 115 и/или 123 не обуславливает значительного изменения иммуногенность белка и, в частности, его IgG эпитопов. Наоборот, антитела, присутствующие в сыворотке мышей, иммунизированных некоррелированным антигеном,были не способны распознавать ни Bet v 1 дикого типа, ни SEQ ID NO:5. В дополнительном аспекте изобретения предложен иммунологически активный пептид, соответствующий фрагменту Bet v 1, содержащему от 15 до 35, более предпочтительно от 15 до 20 аминокислотных остатков и несущий по меньшей мере одно из вышеописанных замен и/или делеций. При использовании здесь выражение "иммунологически активный пептид" указывает пептид, который способен вызывать IgE-независимый иммунный ответ. Замещенные и/или делеционные варианты по изобретению могут быть легко получены посредством мутагенеза последовательности кДНК (SEQ ID NO:6) Bet v 1 с использованием способов и методик,известных любому специалисту в данной области техники. Последовательности кДНК, кодирующие одиночные и тройные варианты замены SEQ ID NO:2-5,идентифицированы в SEQ ID NO:7-10 соответственно. В дополнительных аспектах изобретения предложена молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая гипоаллергенный белок Bet v 1, раскрытый здесь, или производный от него пептид, и экспрессирующий вектор, содержащий указанную молекулу нуклеиновой кислоты, функционально связанную с генетическими элементами, контролирующими экспрессию указанного белка или пептида в эукариотических или прокариотических клетках, такими как транскрипционные промоторы, энхансеры, сигнальные и лидерные последовательности или другие последовательности, вовлеченные в регуляцию транскрипции. Примеры векторов включают плазмиды, вирусы и фаги, но также можно использовать любой другой вектор,-2 015446 который обычно используют в генной инженерии. Изобретение также включает прокариотическую или эукариотическую клетку-хозяин, которая трансформирована или трансфицирована вектором, как описано выше. Прокариотические клетки, такие как Escherichia coli или Bacillus subtilis, или эукариотические клетки, такие как Saccharomyces cerevisiae,в общем случае используют для клонирования вектора и экспрессии кДНК. Кроме того, гипоаллергенные варианты по изобретению могут продуцироваться как слитые белки. Благодаря их пониженной IgE-реактивности Bet v 1 варианты в соответствии с настоящим изобретением можно удобно использовать для получения фармацевтических композиций (например, таблеткок и капсул) для профилактического или терапевтического лечения субъектов, страдающих аллергией на пыльцу Betula verrucosa. Дополнительный аспект изобретения, следовательно, относится к фармацевтической композиции,содержащей эффективное количество гипоаллергенного варианта Bet v 1, как предложено здесь, возможно в комбинация с другими аллергенами Betula verrucosa и/или с фармацевтически приемлемыми носителями и эксципиентами. В предпочтительном воплощении изобретения фармацевтическая композиция находится в форме вакцины для применения в профилактике или терапии аллергических заболеваний, включая бронхиальную астму, аллергический ринит, аллергический дерматит и аллергический конъюнктивит. Теория и практика вакцинации известны специалисту в данной области техники (15, 16). Следующие ниже примеры дополнительно иллюстрируют данное изобретение. Если не указано иное, способы, используемые в примерах, описаны в Sambrook, Fritsch ET Maniatis "Molecular cloning. Alaboratory manual", II ed., vol. 1-2-3, CSH Lab Press 1989. Пример 1. Сайт-специфический мутагенез кДНК, кодирующей аллерген Bet v 1. Сайт-специфический мутагенез кДНК, кодирующей аллерген Bet v 1 (SEQ ID NO: 6), осуществляли посредством кДНК клонирования в прокариотическом векторе (pBluescript, renBank асс. n. Х 52327) с последующей PCR (полимеразная цепная реакция)-амплификацией. Олигонуклеотиды, используемые в качестве праймеров в PCR-реакции (см. таблицу), несли подходящие замены оснований. Для каждого мутагенеза использовали комплементарное олигонуклеотидное связывание с подходящей областью нити ДНК (17). После амплификации неизмененную первоначальную матрицу селективно расщепляли ферментативным гидролизом, катализируемым ферментом рестрикция Dpn. Клетки Escherichia coli затем трансформировали мутагенизированными молекулами. Клоны, полученные из одиночных бактериальных колоний, секвенировали в соответствии с Sanger для обнаружения корректных модификаций оснований и отсутствия неспецифических мутаций в кДНК. В таблице показаны последовательности олигонуклеотидов, используемых в качестве праймеров в сайт-специфическом мутагенезе (мутантные основания выделены жирным) Пример 2. Получение белка Bet v 1 и его вариантов. Дикого типа (SEQ ID N. 6) и мутагенизированные (SEQ ID N. 7-10) кДНК Bet v 1, фланкированные последовательностью, кодирующей шесть гистидинов, клонировали и экспрессировали в Escherichia coli в соответствии со стандартными протоколами (18, 19). Клетки собирали центрифугированием, ресуспендировали в буфере 50 мМ NaH2PO4, 300 мМ NaCl, pH 8, и лизировали обработкой ультразвуком. Рекомбинантные белки разделяли центрифугированием. Осадок, содержащий нерастворимый белковый агрегат, ресуспендировали в 100 мМ NaH2PO4, 10 мМ Трис-HCl, 8 М мочевины (рН 8) (денатурирующий буфер) и перемешивали в течение 60 мин. Солюбилизированные рекомбинантные белки отделяли от нерастворимого дебриса центрифугированием и очищали аффинной хроматографией в денатурирующих условиях, используя колонки агароза, связанные с нитрилотриуксусной кислотой, которая хелатирует ионы никеля, взаимодействующие с шесть-гистидиновым участком, слитым с аллергеном. Осуществляли рефолдинг очищенных белков посредством диализа в течение 16 ч при 4 С в растворе 0,68%. NaCl, 0,275%NaHCO3. Пример 3. Характеристики сыворотки из субъектов с аллергией. Сыворотку собирали от субъектов с сезонной аллергией на пыльцу Betula verrucosa в клиническом анамнезе и RAST 4+ специфической реактивностью к аллергенам В. verrucosa и затем их объединяли. Объединенную сыворотку от пациентов без аллергии использовали в качестве отрицательного контроля. Пример 4. ELISA анализ реактивности вариантов Bet v 1 к lgE из объединенной сыворотки. Одинаковое количество аллергена дикого типа и мутагенизированных вариантов (0,5 мкг) в 50 мМ карбонатном/бикарбонатном буфере, рН 9,6, адсорбировали на лунки полистирольных планшетов для анализа ELISA путем инкубации при 4 С в течение 16 ч. Лунки промывали промывным раствором (60 мМ фосфатный буфер, рН 6,5, содержащий 0,05% Твин-20) и блокировали разбавляющим раствором(25% лошадиная сыворотка, 1 мМ EDTA, 0,05% Твин 20, 0,01% Тиомерсал в 150 мМ фосфатном буфере,рН 7,4). 100 мкл аликвоты серийных разбавлений (в разбавляющем буфере) объединенной сыворотки-3 015446 людей RAST 4+ добавляли к каждому образцу и инкубировали при 25 С в течение 2 ч. После трех промывок добавляли пероксидаза-конъюгированную античеловеческий IgE сыворотку (1:1500 в разбавляющем буфере) и затем инкубировали при 25 С в течение 1,5 ч. После трех промывок осуществляли колориметрическую реакцию путем добавления 100 мкл ТМВ реагента (BioFX Laboratories, Owings Mills,MD) и инкубировали в течение 15 мин при 25 С. Реакцию останавливали путем добавления 100 мкл 1 н.HCl и считывали при 450 нм, используя микропланшетный считывающий спектрофотометр. Пример 5. ELISA анализ ингибирования. Ингибирование Bet v 1 вариантами связывания Bet v 1 дикого типа с IgE из объединенной сыворотки. 1 мкг аликвоты аллергена дикого типа в 50 мМ карбонатном/бикарбонатном буфере, рН 9,6, адсорбировали на лунки полистирольных планшетов для ELISA анализа путем инкубации при 4 С в течение 16 ч. Лунки промывали раствором для промывки (60 мМ фосфатный буфер, рН 6,5, содержащий 0,05% Твин-20) и блокировали разбавляющим буфером (25% лошадиная сыворотка, 1 мМ EDTA, 0,05% Твин 20, 0,01% Тиомерсал в 150 мМ фосфатном буфере, рН 7,4). 100 мкл аликвоты RAST 4+ объединенной сыворотки людей, разбавленные 1:3 в буфере для разбавления, предварительно инкубировали при 25 С в течение 2 ч с серийными разбавлениями аллергена дикого типа и мутагенизированного варианта. Полученный раствор помещали в лунки и инкубировали при 4 С в течение 16 ч. После трех промывок 0,06 М фосфатным буфером, рН 6,5, Твин-20 0,05%, добавляли пероксидаза-конъюгированную античеловеческий IgE сыворотку с разбавлением 1:1500 (в буфере для разбавления), с последующей инкубацией при 25 С в течение 1,5 ч. После трех промывок осуществляли колориметрическую реакцию путем добавления 100 мкл ТМВ реагента (BioFX Laboratories, Owings Mills, MD) и инкубирования при 25 С в течение 15 мин. Реакцию останавливали путем добавления 100 мкл 1 н. HCl с последующим спектрофотометрическим считыванием при 450 нм. Процент ингибирования рассчитывали следующим образом: 100[(А-В)/А], где А представляет собой поглощение при 450 нм в отсутствие ингибитора, в то время как В представляет собой поглощение в присутствии ингибитора. Пример 6. Вестерн-блоттинг анализ реактивности Bet v 1 вариантов в отношении lgE из объединенной сыворотки. Равные количества аллергена дикого типа и мутагенизированных форм (1,5 мкг) анализировали электрофорезом на полиакриламидном геле с последующим электроблоттингом на нитроцеллюлозной мембране, как описано Towbin (20). Мембрану сначала инкубировали в течение одного часа в TBST (TBS, 0,05% Твин-20), содержащем 5% обезжиренного сухого молока (насыщающий буфер), и затем инкубировали в течение ночи с объединенной сывороткой из субъектов с аллергией к Betula verrucosa, демонстрирующим 4+ реактивность,разбавляли 1:3 в TBST 2% обезжиренном сухом молоке. После часовой инкубации мембрану промывали три раза TBST. Мембран-связанные антитела контактировали с пероксидаза-конъюгированной античеловеческий IgE сывороткой и после несколько промывок детектировали с помощью хемилюминисцентной системой детекции, используя люминол в качестве субстрата пероксидазы (ECL, Amersham). Пример 7. Протокол иммунизация Balb/c мышей. Две группы по 5 самок Balb/c мышей (Charles River) подкожно иммунизировали 200 мкл эмульсии,содержащей 100 мкл полного адъюванта Фрейнда и 20 мкг антигена (SEQ ID NO:1 и SEQ ID NO:5) в 100 мкл физиологического раствора. Проводили три дополнительных бустерных иммунизации с 1 недельными интервалами, заменяя полный адъювант неполным. В качестве контроля пяти мышам вводили некоррелированный антиген. Через семь суток после последней иммунизации из хвоста отбирали образец крови и использовали в ELISA для контроля за антительным ответом против каждого иммуногенного агента. У мышей, иммунизированных SEQ ID NO:5, также анализировали способность распознавать белок дикого типа. Пример 8. ELISA анализ lgG-специфического ответа у иммунизированных мышей. Одинаковые количества Bet v 1 дикого типа и варианта SEQ ID NO:5 (0,25 мкг) в 50 мМ карбонатном/бикарбонатном буфере, рН 9,6, адсорбировали на лунки полистирольных планшетов для ELISA анализа путем инкубации в течение 16 ч при 4 С. Лунки промывали промывным раствором (60 мМ фосфатный буфер, рН 6,5, содержащий 0,05% Твин-20) и блокировали разбавляющим раствором (25% лошадиная сыворотка, 1 мМ EDTA, 0,05% Твин 20, 0,01% Тиомерсал в 150 мМ фосфатном буфере, рН 7,4). 100 мкл аликвоты серийных разбавлений (в буфере для разбавления) сыворотки от каждой мыши помещали в лунки и инкубировали в течение 2 ч при 25 С. После трех промывок пероксидаза-конъюгированную анти-мышиный IgG сыворотку разбавляли 1:2000 в буфере для разбавления и добавляли к лункам, затем инкубировали в течение 1,5 ч при 25 С. После трех промывок осуществляли колориметрическую реакцию путем добавления 100 мкл ТМВ реагента (BioFX Laboratories, Owings Mills, MD) и инкубировали в течение 15 мин при 25 С. Реакцию останавливали 100 мкл 1 н. HCl с последующим спектрофотометрическим считыванием при 450 нм. На фиг. 4 и 5 показана средняя реактивность, полученная при анализе сыворотки от 5 мышей для каждой группы. Краткое описание графических матеиалов Фиг. 1 - ELISA анализ lgE реактивности к Bet v l аллергену и к Bet v 1 гипоаллергенным вариантам;-4 015446 фиг. 2 - ингибирование IgE связывания с Bet v 1 аллергеном; фиг. 3 - вестерн-блоттинг анализ lgE реактивности к Bet v 1 аллергену и его вариантам; фиг. 4 - мышиный IgG ответ на соответствующие иммуногенные белки; фиг. 5: IgG ответ у мышей, иммунизированных SEQ ID NO:5. Библиография 1) Malling H.J. (1998) "Immunotherapy as an effective tool in allergy treatment". Allergy, 53: 461. 2) Toubi E., Kessel A., Blant A., Golan T.D., (1999) "Follow-up after systemic adverse reactions of immunotherapy". Allergy, 54(6): 617-620. 3) Akdis C.A., Blaser K., (2000) "Regulation of specific immune response by chemical and structuralgels to nitrocellulose sheets: Procedure and some applications". Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76: 4350-4354. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Белок, представляющий собой гипоаллергенный вариант основного аллергена пыльцы Betula verrucosa (Bet v 1) и отличающийся тем, что он: а) обладает пониженной реактивностью к IgE по сравнению с Bet v 1 дикого типа (SEQ ID NO:1); б) имеет аминокислотную последовательность, которая:-5 015446 1) по меньшей мере на 87%, предпочтительно по меньшей мере на 94%, более предпочтительно по меньшей мере на 97% идентична SEQ ID NO:1; 2) при выравнивании последовательности с SEQ ID NO:1 присутствует по меньшей мере одна замена или делеция Lys остатков в положениях, соответствующих аминокислотам 54, 115 и/или 123 в SEQ IDNO:1. 2. Белок по п.1, отличающийся тем, что указанные остатки Lys замещены нейтральными или полярными аминокислотами. 3. Белок по п.2, отличающийся тем, что указанные нейтральные или полярные аминокислоты выбраны из Ala, Thr, Gly, Pro, Leu, Ile, Phe, Ser. 4. Белок по п.3, отличающийся тем, что указанные аминокислоты представляют собой Ala, Ser илиThr. 5. Белок по п.1, выбранный из группы, состоящей из SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4,SEQ ID NO:5. 6. Иммунологически активный пептидный фрагмент белка по пп.1-5, содержащий от 15 до 35 аминокислот и несущий по меньшей мере одну замену и/или делецию Lys, как определено выше. 7. Фрагмент по п.6, содержащий от 15 до 20 аминокислот. 8. Молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая белок по пп.1-5 или фрагмент по пп.6, 7. 9. Молекула нуклеиновой кислоты по п.8, выбранная из группы, состоящей из SEQ ID NO:7, SEQID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10. 10. Вектор, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты по пп.8-9. 11. Клетка-хозяин, содержащая вектор по п.10. 12. Фармацевтическая композиция, содержащая эффективное количество белка по пп.1-5 или фрагмента по пп.6, 7 вместе с фармацевтически приемлемыми носителями и эксципиентами. 13. Вакцина, включающая композицию по п.12. 14. Применение белка по пп.1-5 или фрагмента по пп.6, 7 для приготовления лекарственного средства для профилактики или терапевтического лечения аллергических заболеваний. 15. Применение по п.14, где заболевание представляет собой бронхиальную астму, ринит, конъюнктивит или атопический дерматит.

МПК / Метки

МПК: C12N 15/00, C07K 14/415, A61K 39/36

Метки: основного, варианты, betula, пыльцы, гипоаллергенные, аллергена, verrucosa

Код ссылки

<a href="https://eas.patents.su/15-15446-gipoallergennye-varianty-osnovnogo-allergena-iz-pylcy-betula-verrucosa.html" rel="bookmark" title="База патентов Евразийского Союза">Гипоаллергенные варианты основного аллергена из пыльцы betula verrucosa</a>

Похожие патенты