Аллицин

011631 Настоящее изобретение касается аллицина. Аллицин, серосодержащее соединение, имеющее формулу как полагают, является главным действующим соединением, обусловливающим множество известных терапевтических свойств чеснока (Allium sativium). B естественном виде чеснок не содержит аллицин, а содержит предшественник, аллиин [сульфоксид (+)S-аллил-b-цистеина]. Аллиин превращается в аллицин под действием фермента аллиназы или аллиинлиазы, который также содержится в чесноке. Аллиин и аллиназа взаимодействуют, когда дольки чеснока разрезают и измельчают. Следующее уравнение представляет собой схему синтеза: Однако аллиназа быстро и необратимо инактивируется продуктом реакции, аллицином и также инактивируется в кислой среде, например в желудке. Таким образом, на практике выход аллицина из дольки чеснока весьма далек от теоретического максимума. Действительно, выходы обычно составляют 0,3-0,5%. Заявка на изобретение WO 97/39115 описывает непрерывный способ синтеза аллицина путем подготовки колонки, содержащей аллиназу, иммобилизованную на твердом носителе, прохождения раствора аллиина через колонку и сбора раствора аллицина в элюенте. Аллицин также получают в настоящем изобретении в жидкой и высушенной распылением формах,и он продается в капсулах и в форме не расфасованного порошка компанией Allicin International Limitedof Half House, Military Road, Rye, East Sussex, TN31 7NY, United Kingdom, под торговым наименованием Аллимакс. В нашей одновременно рассматриваемой заявке PCT, WO 03/024437, опубликованной 27 марта 2003 г., описываются определенные новые терапевтические свойства аллицина. Настоящее изобретение основано на дальнейших исследованиях терапевтических свойств аллицина. В наиболее широком смысле настоящее изобретение обеспечивает применение аллицина (i) в лечении лейшманиоза; (ii) в качестве дезинфицирующего или биоцидного средства в отношении обитающих в воде организмов; (iii) в качестве антимикробного агента при кормлении животных; (iv) в качестве консерванта в кормах; (v) в качестве водного дезинфицирующего средства или биоцида; (vi) в качестве противопаразитарного средства или антибактериального средства для пчел (apis) или (vii) в получении препарата для воздействия на устойчивый к гликопептидному интермедиату золотистый стафилококк(Staphylococcus aureus). В одном аспекте настоящее изобретение обеспечивает применение аллицина в лечении лейшманиоза. Настоящее изобретение также обеспечивает применение аллицина в получении препарата для лечения лейшманиоза. Предпочтительно, если аллицин присутствует в препарате в концентрации примерно 5000 ч./млн. Во втором аспекте настоящее изобретение обеспечивает применение аллицина в качестве дезинфицирующего или биоцидного воздействия на обитающие в воде организмы. Настоящее изобретение также обеспечивает применение аллицина в получении препарата для дезинфицирующего или биоцидного воздействия на обитающие в воде организмы. Обычно обитающим в воде организмом является рыба. Данный аспект настоящего изобретения особенно применим в рыбном хозяйстве и других водных или морских областях промышленности. В третьем аспекте настоящее изобретение обеспечивает применение аллицина в качестве антимикробного агента при кормлении животных. Когда животные поглощают пищу из водной среды, подходящим является количество аллицина, составляющее примерно 500 ч./млн. В альтернативном воплощении пищей животных являются корма, и аллицин присутствует в количестве, обеспечивающем ежедневное потребление от 1 до 5 мг на животное в день. Соответственно, для крупных животных, таких как коровы или лошади, аллицин присутствует в количестве, обеспечивающем ежедневное потребление от 2,5 до 3 мг на животное в день. Для мелких животных, таких как поросята или козы, аллицин присутствует в рационе в количестве, обеспечивающем ежедневное потребление от 1,5 до 2,4 мг на животное в день. В четвертом аспекте настоящее изобретение обеспечивает применение аллицина в качестве консерванта в кормах. Настоящее изобретение также обеспечивает консервант, содержащий аллицин и по меньшей мере один приемлемый для корма носитель. Предпочтительно, если консервант содержит аллицин в концентрации до 500 ч./млн.-1 011631 В пятом аспекте настоящее изобретение обеспечивает применение аллицина в качестве водного дезинфицирующего средства или биоцида. Настоящее изобретение также обеспечивает композицию для обработки воды, содержащую аллицин, и пищевого наполнителя. В частности, оно обеспечивает определенный водный дезинфектант или биоцид для применения в обработке воды для мытья овощей, сточных вод, ливневых вод или питьевой воды. Предпочтительно композиция для обработки воды содержит аллицин в количестве от 0,5 до 2,0% (мас./об. или мас./мас.), более предпочтительно в количестве от 0,9 до 1,7%. В шестом аспекте настоящее изобретение обеспечивает применение аллицина в качестве противопаразитарного и антибактериального средства для пчел (apis). Настоящее изобретение также обеспечивает противопаразитарное средство для пчел, содержащее аллицин и фармацевтически приемлемый носитель. В частности, этот аспект данного изобретения обеспечивает средство против Varroa mite и бактерийMelissococcus plutonius (ранее называемый Streptococcus plutonius) и Paenibacillus larvae subsp. Larva и грибкового заболевания расплода chalkbrood Ascophera apis. В седьмом аспекте настоящее изобретение также обеспечивает применение аллицина в получении средства для воздействия на устойчивый к гликопептидному интермедиату золотистый стафилококк(Staphylococcus aureus). Соответственно, для орального введения или введения в виде суппозиториев, пессарий или интраназальных препаратов фармацевтически приемлемый носитель представляет собой твердую композицию, с которой связан аллицин или его метаболит. Более конкретно, твердая композиция содержит наполнитель, например лактозу, микрокристаллическую целлюлозу или фосфат дикальция, предпочтительно целлюлозу; загуститель, например камедь или крахмал; дезинтегрирующий агент, например натрий крахмал гликолят или поперечно-сшитый повидон; разделительный агент, например стеарат магния; эмульсификатор; поверхностно-активное вещество и такие подсластители, ароматизаторы и красители, какие требуются. Наиболее предпочтителен аллицин, связанный посредством распылительной сушки, и твердая композиция, содержащая модифицированный крахмал, например мальтодекстрин, аравийскую камедь, кремнезем и эмульсификатор, например стеарат магния.WO 02/062416 описывает аппарат для диспергирования порошкового материала. Было обнаружено,что данный аппарат предпочтителен в подаче композиции, содержащей аллицин и порошок целлюлозы. В связи с этим в последнем аспекте настоящего изобретения предлагается композиция, содержащая аллицин и порошок целлюлозы. Соответственно, для поверхностного применения фармацевтически приемлемый носитель включает в себя крем или мыло. Носитель может, альтернативно, представлять собой лосьон, мазь, зубную пасту,средство для полоскания рта или средство для волос, например шампунь, гель для укладки или кондиционер. Такие препараты могут содержать комбинацию следующих средств соответственно: поверхностно-активные вещества, ароматизаторы, красители, стабилизаторы, антиоксиданты, эмульсификаторы,загустители, воски, глицериды, жиры, суспендирующие агенты, дефлокулирующие агенты и антиоксиданты, все они могут быть или не быть гипоаллергенными. Соответственно, кремовый носитель содержит белый мягкий парафин, эмульсификатор, например стеарат, применим стеарат магния, глицерин,воду, желтый мягкий парафин и стабилизатор, например цитрат калия. Более применим кремовый носитель, содержащий крем на водной основе, предпочтительно крем на водной основе BP. Применим мыльный носитель, содержащий простой сернокислый эфир кокоамида и кокобетаина. Необязательно, носитель может дополнительно содержать ароматизаторы и красители. Соответственно, для орального, парентерального и поверхностного применения отношение аллицина к носителю является таким, которое обеспечивает концентрацию аллицина между 1 и 2000 ч./млн,предпочтительно между 50 и 1000 ч./млн, более предпочтительно между 250 и 500 ч./млн. Вышеуказанные и другие аспекты настоящего изобретения будут описаны здесь в дополнительных деталях только за счет примера. 1. Применение аллицина в лечении лейшманиоза. Лейшманиоз представляет собой заболевание, распространенное в тропиках и субтропиках, вызываемое простейшими паразитами рода leishmania, и передающееся через укусы москитов. Существует две основные формы болезни: висцеральный лейшманиоз, при котором поражаются клетки различных внутренних органов, и кожный лейшманиоз, который поражает ткани кожи. Последняя форма сама имеет несколько различных форм, в зависимости от региона, в котором она имеет место, и вовлеченных видов простейших. Страны, например Панама, Гондурас, Амазония, Южная Центральная Америка и Азия являются областями, где лейшманиоз наиболее распространен. В Азии, например, он распространен в форме восточной язвы и может быть рассмотрена одна из трех основных мировых проблем. Лейшманиоз является заболеванием кожи и слизистых, приводящим к изъязвлениям, обнаруживаемым на руках и ногах. Инфекция может также распространяться на слизистые носа и рта, вызывая серьезное повреждение тканей. Стандартное лечение обычно проводится с использованием средств, содержащих сурьму, но оно не обладает нужной доступностью или толерантностью.-2 011631 Форма лейшманиоза кожи обусловлена паразитом leishmania tropica mexicana и также известна как язва Шиклеро. Данная болезнь распространена в Панаме, Гондурасе и Амазонии и в основном поражает людей, занимающихся в лесах сбором чикли (камеди). Это состояние принимает форму изъязвления на мочке уха, и хотя язва обычно заживает сама в течение 6 месяцев, это может, однако, служить причиной для сильного дискомфорта. Подтверждающие тесты in vitro в университете East London с использованием аллицина при концентрации 5,0 г на 1 л вызывали гибель простейших паразитов, вызывающих лейшманиоз. Экстраполируя результаты из лабораторных исследований, описанных в PCT/GB2002/004309, авторы полагают, что аллицин в концентрации 5000 ч./млн имеет эффективность в качестве противопротозойного агента. 2. Применение аллицина в качестве дезинфицирующего средства/биоцида в рыбном хозяйстве и других водных или морских областях промышленности. Авторы изобретения показали, что аллицин может быть использован в рыбном хозяйстве и других водных областях промышленности для уничтожения бактерий, паразитов и грибов. Аллицин может быть использован в качестве антимикробного (включая антибактериальный, антивирусный, фунгицидный и противопротозойный) препарата, содержащего аллицин (и его метаболиты, включая ДАДС (диаллилдисульфиды), ДАТС (диаллилтрисульфид), ajoene, аллитридий и винилдитиины). Основываясь на результатах исследований лаборатории на MRSA (30 штаммов), E.coli, E.Faecalis,Candida albicans, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella typhimurium, Streptococcus pyogenes, B.subtilis, Serratia marcecens. и др, полагаем, что данные результаты показывают, что аллицин может быть использован в качестве агента против бактерий и грибов. Основываясь на результатах лабораторных тестов на вшах (Pediculus humanus), описанных вWO 03/024437, полагаем, что аллицин будет уничтожать паразитов, связанных с рыбоводством и другими водными или морскими областями производства. 3. Применение аллицина в качестве антимикробного агента в кормах животных. Аллицин может быть использован в качестве антимикробного агента при кормлении животных,обеспечивая рост животных, предотвращая возникновение заболевания у животных и предотвращая передачу заболевания (включая заражение пищи) людям. Антимикробный (включая антибактериальный,антивирусный, противогрибковый и противопротозойный) препарат содержит аллицин (и его метаболиты, включая ДАДС (диаллилдисульфид), ДАТС (диаллилтрисульфид), ajoene, аллитридий и винилдитиины). Животные (например, куры, свиньи, козы и коровы) могут заразиться бактериями и передать их по пищевой цепочке в популяцию людей. Традиционные корма для животных и добавки (включая антибиотики) применяются в предотвращении и лечении заболеваний у животных. Ожидаемое в настоящее время Европейское законодательство предполагает, что применение антибиотиков может быть запрещено или в лучшем случае - снижено. Тесты и дозы. Заявка авторов изобретения WO 03/024437 описывает лабораторные тесты, которые показывают,что аллицин может вызывать гибель E.coli, Listeria, E.Faecalis и других бактерий, связанных с болезнями животных в ряду концентраций до 500 ч./млн. Вводя в систему подачи воды для кур аллицин в концентрации до 500 ч./млн, аллицин может быть использован в качестве антимикробного ингибитора. При введении аллицина в корма для животных, например для свиней и коз, в количестве от 1,5 до 2,4 мг в день он может быть использован в качестве антимикробного ингибитора. При введении аллицина в корма для более крупных животных, например для коров и лошадей, в количестве от 2,5 до 3,0 мг в день он может быть использован в качестве антимикробного ингибитора. Проводили также эксперимент in vivo, где сравнивали два смежных вольера по 10000 цыплят каждый. Каждый вольер снабжался 1000 л воды в день. В течение 7 дней вода для одного вольера содержала 1,5 л раствора аллицина (1000 ч./млн), добавляемого к воде с 1 л раствора аллицина (1000 ч./млн), добавляемого каждый день в течение дополнительных 3 дней. В контрольном вольере не добавляли раствор аллицина. Уже после нескольких дней было зафиксировано улучшение состояния здоровья кур в вольере, где добавляли аллицин. Например, гребешки кур стали краснее и на 2% повышалась продукция яиц. Жизнеспособность кур увеличивалась. В противоположность этому в контрольном вольере наблюдалась инфекция E.coli. После завершения эксперимента исследовали печень нескольких птиц. Печень контрольных кур показала наличие признаков инфекции E.coli, в то время как у птиц принимавших аллицин, этих признаков зафиксировано не было. Птицы, принимавшие аллицин, демонстрировали улучшенный метаболизм и антимикробную защиту. Птицы, принимавшие аллицин, также демонстрировали повышенную толерантность к куриным кровососущим вшам.-3 011631 В тестах in vivo были показаны следующие результаты против 4 обычных куриных бактерий со следующими результатами зон ингибирования при 1000 и 166 ч./млн (разбавление 1:6): 4. Применение аллицина в качестве консерванта в производстве пищи. Аллицин может быть использован в производстве пищи/мяса для предотвращения роста бактерий,которые могут вызывать распространение болезни (включая заражение пищи) среди людей посредством антимикробных (включая антибактериальные, антивирусные, противогрибковые и противопротозойные) препаратов аллицина (и его метаболитов, включая ДАД (диаллилдисульфид), ДАТ (диаллилтрисульфид),ajoene, аллитридий и винилдитиины). Ряд концентраций жидкого аллицина (от 0 до 500 ч./млн) применяли в отношении 10 кг образцов мяса для гамбургеров для определения того, как долго может быть предотвращен бактериальный рост. Данные тесты сравнивали с обычным использованием существующих консервантов (включая нитраты и фосфаты). Для оценки бактериального роста тестовый кусок мяса был разрезан на маленькие кусочки и с использованием стандартных методов анализа был оценен рост E.coli и Salmonella. Результаты. Жидкий аллицин с концентрацией 250 ч./млн предотвращал бактериальный рост до 7 дней. Жидкий аллицин с концентрацией 375 ч./млн предотвращал бактериальный рост до 10 дней. Жидкий аллицин с концентрацией 500 ч./млн предотвращал бактериальный рост до 14 дней. Контрольный образец мяса без консерванта или аллицина демонстрировал усиленный бактериальный рост после нескольких дней. Существующие консерванты, применяемые в соответствии с разрешенной обычной практикой,предотвращали бактериальный рост только до 7 дней. Исследование показало, что аллицин может быть использован в качестве консерванта в производстве пищи/мяса. Стандартные методы анализа демонстрировали предотвращение роста E.coli и Salmonella при концентрациях аллицина 250 ч./млн (эквивалентно 0,0250% (мас./об Дополнительный признак,демонстрирующий консервирующий эффект аллицина, может быть экстраполирован из результатов тестов лабораторных исследований на MRSA (30 штаммов), E.coli, E.Faecalis, F.streptococcus, Candidamarcecens, Listeria monocytogenes, описанных в PCT/GB2002/004309, подтверждающих то, что аллицин может быть использован в качестве консерванта в консервации пищи/мяса. 5. Применение аллицина в качестве дезинфицирующего средства/биоцида в обработке воды для мытья овощей, сточных вод (включая ливневые воды) и питьевой воды. Аллицин может быть использован для дополнения или замены существующих вредных форм дезинфицирующего средства/биоцида, например хлора, гипохлорита натрия, озона и перуксусной кислоты,где все перечисленные выше вещества могут вредно влиять на окружающую среду. УФ-радиация также используется для дезинфекции, но энергозатраты и основные текущие расходы высоки. Авторами проводились лабораторные исследования с применением аллицина в водных суспензиях видов бактерий,обычно используемых в качестве индикаторов эффективности дезинфекции воды и сточных вод. По этой причине идентифицированные штаммы из фекальной колиформы и групп стрептококков, конкретно Escherichia coli (NCTC 8156) и Enterococcus hirae (штамм University of Brighton), применялись во всех экспериментах. Использовали водный раствор аллицина с номинальной концентрацией аллицина, равной 1,8 г/л, т.е. применяли 0,18% раствор. Исходные суспензии Escherichia coli (NCTC 8156) и Enterococcus hirae (штамм University ofBrighton) культивировали в питательном бульоне 2 из замороженных высушенных штаммов. До каждого эксперимента серийные разбавления суспензий были пронумерованы с помощью метода разведения на чашках Петри в питательном агаре и последующей инкубации при 37 С. Тест Kelsey-Sykes. Первоначальные экспериментальные методики были основаны на способах, установленных в утвержденном UK протоколе (BS 6905: 1987). Методология Kelsey-Sykes была разработана в качестве руководства в отношении концентраций дезинфектантов, которое может быть рекомендовано к применению в "грязных" (сточные воды/нечистоты) условиях. Следовательно, существуют подходящие средства установления эффективности дезинфицирующего средства в отношении сточных вод, содержащих загрязнители, растворенные и в виде частиц, дополнительно к микроорганизмам.-4 011631 Основной тест Kelsey-Sykes применяют для определения концентрации дезинфицирующего средства и времени контактирования, при котором 3 из 5 пробирок не демонстрируют роста тест-организма. Он не предназначен для оценки процента смертности тест-организма в рамках какого-либо набора условий. Следовательно, протокол был адаптирован в соответствии с данными по сточным водам/нечистотам. В условиях измененной методологии образец брали из смеси бактериальная суспензия/биоцид после определенного времени контактирования и высевали на твердую среду так, чтобы можно было подсчитать колонии (см. табл. 1 и 2). Тесты ингибирования на агаре. Этот способ использовали для демонстрации бактерицидного эффекта аллицина и изучения зоны ингибирования, продуцируемой раствором аллицина на сплошной рост тест-организмов на чашках Петри с питательным агаром. Концентрации раствора аллицина 100, 50, 25 и 12,5% (в стерильной дистиллированной воде) добавляли в лунки, образованные в питательном агаре, на котором размножился штаммE.coli, и культивировали в течение 24 ч при 37 С. Все чашки инкубировали в течение дополнительных 24 ч при той же температуре и анализировали зоны ингибирования (см. чашку Петри 1). Результаты. Таблица 1 Процентное снижение колониеобразующих единиц E.coli и Ent.hirae как результат контакта с растворами аллицина в модифицированном тесте Kelsey-Sykes Таблица 2 Число колониеобразующих единиц E.coli и Ent.hirae убитых в результате контакта с растворами аллицина в модифицированном тесте Kelsey-Sykes Исследование продемонстрировало бактерицидный эффект аллицина против бактерий, обычно используемых в качестве индикаторов дезинфекции при обработке воды. Простые тесты на чашках Петри с агаром показали ингибирование E.coli и Ent.hirae уже при концентрациях аллицина 0,225 г/л (эквивалентно 0,0225% (мас./об Дополнительный признак для демонстрации бактерицидного эффекта аллицина на присутствующие в воде бактерии может быть экстраполирован из результатов тестов наших лабораторных исследований на MRSA (30 штаммов), E.coli, E.Faecalis, F.streptococcus, Candida albicans,Pseudomonas aeruginosa, Salmonella typhimurium, Streptococcus pyogenes, B.subtilis, Serratia marcecens,представленных в более ранней заявке на патент PCT/GB2002/004309. 6. Применение аллицина против клещей и бактерий, убивающих пчел. Клещ Varroa является природным паразитом медоносных пчел (включая Apis cerana и Apismellifera). Европейское заболевание гнилец пчел обусловлено бактерией, называемой Melissococcus plutonius (ранее называемой Streptococcus plutonius), которая поражает среднюю кишку 4-5-дневных личинок. Данная бактерия быстро размножается в средней кишке, приводя к смерти. Она поражает личинок-5 011631 только в открытом расплоде. Американское заболевание гнилец пчел обусловлено Paenibacillus larvaesubsp. Larva, которая поражает личинок в запечатанных ячейках расплода пчелиных сот. Существует также не подлежащее заявке грибковое заболевание расплода, называемое chalkbrood Ascophera apis, которое является значительной проблемой для пчеловодов. Результаты тестов лабораторных исследований на MRSA (30 штаммов), E.coli, E.Faecalis, Candidaalbicans, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella typhimurium, Streptococcus pyogenes и др. и другие исследования показывают, что жидкая, кремообразная и порошковая формы аллицина уничтожают клещаVarroa, бактерий европейского и американского гнильца пчел. Эксперимент 1. В этом исследовании изучалась антимикробная активность аллицина (Allisure Liquid) против множества бактериальных и грибковых патогенов, свойственных для пчелиных сообществ общественных и отдельных пчел (Paenibacillus larvae subsp. larvae, Paenibacillus larvae subsp. pulvifaciens,Ascosphaera apis и Ascosphaera aggregata). Минимальные ингибирующие концентрации (МИК) аллицина определяли, используя метод микроразведений жидкой среды в интервале от 1000 до 0,25 ч./млн. Жидкая форма аллицина показала активность против грамположительных бактериальных штаммов (МИК 350 ч./млн) и грибковых штаммов (МИК 250 ч./млн). Антимикробная активность аллицина тестировалась также в тесте диффузии в агар, используя 250 мкг аллицина на диск. Бактериальные штаммы(P.l.pulvifaciens и P.l.larvae) продуцировали зону ингибирования в интервале от 24-26 мм и 45-50 мм соответственно. Грибковые штаммы продуцировали (A.apis) и 35-37 мм (A.aggregata). Антибиотик тилозин класса макролидов (Tylan50, Elanco Inc., IN) применяли в качестве контроля в обоих анализах МИК и в тесте диффузии в агар. Данные этого эксперимента указывают на способность аллицина ингибировать рост патогенов пчел и предотвращать возникновение заболеваний пчел. Авторы изобретения проверили активность аллицина (Allisure Liquid) против некоторых видов энтомопатогенетических бактерий (Paenibacillus larvae subsp. larvae, Paenibacillus larvae subsp.pulvifaciens) и грибов (Ascosphaera apis и Ascosphaera aggregata), используя метод микроразведения жидкой среды, для определения минимальной ингибирующей концентрации (МИК) и тест диффузии в агар(Kirby-Bauer) для определения зоны ингибирования. Бактериальные споры выделяли из образцов пораженных личинок медоносной пчелы. Небольшую аликвоту бактериальных спор, обработанных нагревом,суспендировали в 100 мкл солевого фосфатного буфера - рН 7,2 (PBS) и высевали на полуселективную среду J. Agar, содержащую налидиксовую и пипемидиновую кислоту (Alippi, A.M. (1995) Detection ofPaenibacillus larvae. Applied and Environmental Microbiology, 65 (5): 2243-2245. Чашки Петри инкубировали при 33C в воздушной среде, содержащей 6% СО 2 и при 95% OB (относительной влажности). Первоначальная идентификация видов была основана на морфологической,биологической и культуральной характеристиках. Бактериальную культуру тестировали на наличие каталазной реакции (Leboffe, M.J и Pierce, B.E. (1999), A photographic atlas for the microbiology laboratory.Morton Publishing Company. 254 p.). Бактериальные колонии характеризовали по форме, краям и цвету. Грамположительно окрашенные мазки (Gram-stain Reagents Kit, EMD Chemicals Inc., NJ) подвергали морфологической идентификации покоящихся клеток и спор. ПЦР идентификацию ДНК осуществляли для дополнения идентификации бактериальных видов. Бактериальные клетки из культуральных чашек Петри добавляли непосредственно к 30 мкл смеси для ПЦР. Используемые в ПЦР праймеры имели в своей основе последовательность 16S РНК для селективной амплификации фрагмента 973 п.о. уникального для P.larvae (Govan et al., 1999). Продукты ПЦР детектировали с помощью электрофореза в 0,8% агарозном геле в буфере TAE и окрашивали этидийбромидом. Эталонные штаммы бактерий были использованы в качестве контроля в ПЦР реакциях и поступали от National Center for Agricultural Research, Peoria, IL. P.l.larvae (NRRL B-3560, B-2605) и P.l.pulvifaciens(NRRL B-3688, B-3685, B-3689, NRS-1687, P. alvei B383). Споры грибов (Ascosphaera apis) собирали из куколок черных медоносных пчел и (Ascosphaera aggregata) из пораженных пчел-листорезов. Образцы пчел растирали в тканевом гомогенизаторе в PBS,фильтровали через грубую мембрану и центрифугировали 5 мин при 12500 об/мин. Концентрированные споры затем ресуспендировали в PBS и хранили при 4C. Аликвоты спор грибов (100 мкл приблизительно 108-109 спор/мл) высевали на агарную среду дрожжи-глюкоза-фосфат (YGPS), содержащую дрожжевой экстракт 1%,KH2PO4 1,35%,растворимый крахмал 1,0%,агар 0,2%,глюкозу 1,0%,стрептомицина сульфат 30,0 мкг/мл,ампициллин 50,0 мкг/мл (Anderson, D.L.; Gibbs, A.J.; Gibson, N.L. (1998). Identification and phylogenyrural industries research and development corporation. New South Wales Agriculture, AU, Publication 01/150,13 p.) и инкубировали при 33 С, 6% CO2 и 95% OB. Колонии грибов анализировали приготовлением микроскопических препаратов воздушного мицелия и цист грибковых спор. Идентификация видов грибов была также подтверждена ПЦР анализом. Экстрагирование ДНК из грибкового мицелия и спор и условия ПЦР были такими, как описано Андерсоном и др. Значения минимальной ингибирующей концентрации (МИК) были определены для аллицина(Allisure Liquid) с использованием метода микроразведения жидкой среды (Norrell, S.A. andMessley, K.E. (1997), microbiology Laboratory Manual. Principles and applications. Prentice-Hall, Inc. 302 p.) в интервале концентраций от 1000 до 0,25 ч./млн. Положительные контроли содержали антибиотик тилозин (Tylan50, Elanco Animal Health Inc., IN), а отрицательные контроли не содержали антибиотиков. Бактериальные (P.l.larvae, P.l.pulviphaciens) или грибковые (A.apis, A.aggregata) споры (100 мкл приблизительно 108-109 спор/мл) добавляли к 2,5 мл бактериальной или грибковой жидкой среды, содержащей серийные разведения аллицина. Культуры инкубировали в шейкере при 35 С и 215 об/мин. Оптические плотности культур (OD 600) фиксировали после 24 и 48 ч инокуляции, в зависимости от скорости роста видов микробов. Значения МИК определяли как наименьшую концентрацию антибиотика, приводящую к отсутствию микробного роста в культуральной пробирке, и это значение определяли три раза. Значения минимальной бактерицидной концентрации (МБК) определяли для аллицина высеванием 100 мкл бактериальных культур после анализа МИК. Чашки Петри инкубировали в течение 24 и 48 ч при 33 С и 6% СО 2 для наблюдения бактериального роста. Тест дисковой диффузии (Kirby-Bauer)/зоны ингибирования. Аллицин (Allisure Liquid) тестировали против бактериальных и грибковых патогенов, используя стандартный метод дисковой диффузии (per NorrellMessley). Аликвоты бактериальных или грибковых спор (100 мкл приблизительно 108-109 спор/мл) высевали на агарную среду Mueller-Hinton, глубиной 4,0 мм. Бумажные диски диаметром 6 мм, содержащие 250 мкг аллицина или 5 мкг тилозина (положительный контроль), помещали в центр каждой чашки Петри. Чашки Петри инкубировали при 33C и 6% СО 2 и зону ингибирования замеряли после 24, 48 или 76 ч инокуляции в зависимости от видов микробов. Все эксперименты повторяли по меньшей мере трижды. Результаты. Грамположительные бактериальные штаммы (P.l.pulvifaciens и P.l.larvae) имели значение МИК,равное 350 ч./млн, и грибковые штаммы (A.apis и A.aggregata) имели значение МИК 250 ч./млн. Аллицин показал только бактериостатическую активность (не бактерицидную) против P.l.larvae и P.l.pulvifaciens в интервале от 1000 до 25 ч./млн. Антибиотик тилозин (Tylan50, Elanco Inc., IN) использовали в качестве контроля и он имел очень высокую антибактериальную активность, значение МИК менее чем 0,25 ч./млн. В тестах диффузии в агар, аллицин продуцировал зоны ингибирования в интервале 24-26 мм дляP.l.pulvifaciens и 45-50 мм для P.l.larvae. При тестировании грибковых патогенов аллицин продуцировал зоны ингибирования в интервале 31-35 мм против A.apis и 35-38 мм против A.aggregata. B контролях с тилозином P.l.pulvifaciens продуцировал зону ингибирования в 14-16 мм. Рост P.l.larvae полностью ингибировался тилозином. Как ожидалось, тилозин не ингибировал рост ни одного из грибковых штаммов и продуцировал зону ингибирования в 0,0 мм. Эксперимент 2. Введение. В Великобритании присутствуют два серьезных бактериальных заболевания медоносных пчел. Европейский гнилец пчел (ЕГП) обусловлен бактерией Melissococcus plutonius, хотя другие бактерии,включая Paenibacillus alvei и Brevibacillus laterosporus, также могут служить индикаторами данного заболевания. Американский гнилец пчел (АГП) обусловлен Paenibacillus larvae subsp. larvae, который обычно обнаруживают в монокультуре в инфицированных личинках. Во многих случаях ЕГП можно лечить используя антибиотик окситетрациклин, но колонии с АГП всегда разрушаются из-за высокоинфекционного характера данного заболевания. Однако применение антибиотиков не желательно и целью NBU является снижение их использования в пчеловодстве. Единственным путем для осуществления этого является поиск других потенциальных способов воздействия. Целью данного исследования была оценка влияния нового продукта, называемого аллицин, препарата экстракта чеснока, на бактерии, вызывающие заболевание медоносных пчел. Результаты могут показать, является ли продукт подходящим для применения в лечении гнильца пчел в поле. Жидкий аллицин (исходная концентрация = 1000 ч./млн) получали от Allicin International Ltd. и хранили замороженным. Тестируемыми бактериями были Paenibacillus larvae subsp. larvae, Melissococcus plutonius, Brevibacillus laterosporus и Paenibacillus alvei. Все штаммы были свежевыделенными из пораженного материала,-7 011631 присланного в диагностическую лабораторию NBU. Культуральная среда и условия инкубации.P.larvae subsp. larvae, В.laterosporus и P.alvei росли на агаре с экстрактом мозга и сердца с тиамином(BHIT) и жидкой питательной среде (SOP NBU/014) в анаэробных условиях и M.plutonius выращивали на агаре SYPG и жидкой питательной среде (SOP NBU/015) в анаэробных условиях. Все эксперименты проводились при 34C. Концентрации исследуемого жидкого аллицина составляли 500, 250, 100, 50, 25 и 10 ч./млн. Концентрация жидкой питательной среды составляла вплоть до двукратного количества от обычной концентрации, таким образом, когда добавляли аллицинсодержащий компонент, среда была надлежащей крепости для бактериального роста. Раствор аллицина разбавляли в стерильной деионизованной воде для получения желаемой концентрации при добавлении к автоклавированной жидкой питательной среде. К контролям добавляли аликвоту стерильной деионизованной воды, и конечный объем для каждой тест-культуры составлял 5 мл. Были включены дополнительные контроли, которые представляли собой среду с добавлением соответствующего объема аллицина, но не заселенную бактериями. Это должно было показать, присутствуют ли здесь какие-либо бактерии в объекте испытаний, которые могли бы повлиять на видимые результаты. Были включены аэробные и анаэробные контроли. Выделение бактериальных штаммов. Бактерии выделяли из пораженных образцов и пересевали на чашки с агаром до достижения чистоты культуры, при инокуляции культуры в бульон. Культуры M.plutonius выделяли анаэробно, затем пересаживали и инкубировали аэробно и анаэробно для подтверждения того, что исследуемый штамм представляет собой данную бактерию. Сходный микроб, Enterococcus faecalis, иногда может быть выделен из ЕГП-пораженных образцов и его морфологически трудно отличить от M.plutonius. Однако первая бактерия растет аэробно, в то время как M.plutonius не способен к репликации. Таким образом, если штамм может расти аэробно, то он не является M.plutonius. Данный механизм контроля использовали во время проведения экспериментальных процедур для того, чтобы убедиться, что тестируется правильный организм. Посев тест-культур. Каждая бактерия была свежевыращена в тест-пробирке, содержащей 5 мл жидкой питательной среды. Полную петлю (5 мкл) этой бактериальной суспензии брали из культуры и засевали в каждую тестпробирку в соответствии с SOP NBU/131. Этот же источник инокулята для каждого штамма использовали для всех разведений аллицина, и все эксперименты были проведены трижды. Подтверждение результатов. Там, где наблюдался рост в присутствии аллицина, один репликат из каждой концентрации для каждой бактерии пересаживали на соответствующий агар для идентификации бактерий, которые росли в жидкой питательной среде для подтверждения результатов (SOP NBU/131). Как только был подтвержден рост на этой чашке Петри, культуру оценивали в отношении морфологии колонии и окраски по Граму (в соответствии с SOP NBU/111) в качестве дополнительного подтверждающего теста. Это подходящий способ, так как каждая тестируемая бактерия имеет определенную микро- и макроскопическую морфологию. Исследование бактериостатического и бактерицидного эффектов. Там, где не было роста в репликате (повторе), в конце одной недели культуру пересаживали для получения отдельных колоний на соответствующий агар. Следовало определить, имел ли объект испытаний бактерицидную, когда гибнут все бактериальные клетки, или бактериостатическую активность, когда данные клетки не способны к делению в присутствии вещества, но растут после его удаления. Был осуществлен также дополнительный тест, где 0,5 мл жидкой питательной среды переносили в 4,5 мл свежей жидкой питательной среды (приводя к разбавлению 1:10). При этом некоторое количество аллицина присутствовало в жидкой питательной среде, но в слишком низкой концентрации, чтобы воздействовать на рост. Там, где наблюдался рост в отсутствие аллицина, жидкую питательную среду оценивали микроскопически и пересаживали для получения отдельных колоний для подтверждения идентичности бактерии. Табл. 1 содержит результаты исследований ингибирования роста.-8 011631 Таблица 1 Ингибирование бактериального роста различными концентрациями аллицина Наблюдается слабый рост, позже при меньшей концентрации. Все бактерии росли нормально в отсутствие испытываемого объекта, и также рост был нормален при наименьших тестируемых концентрациях. Однако бактерия P.larvae subsp. larvae не могла хорошо расти при концентрации аллицина 25 ч./млн, и рост абсолютно прекращался при более высоких концентрациях. Три других вида бактерий были способны расти при концентрации до 100 ч./млн включительно,тем не менее во всех трех случаях рост был замедлен и не был столь выражен, как при высоких концентрациях. Не было видимого роста какого-либо бактериального штамма при 250 или 500 ч./млн. Все три репликата для каждой концентрации и бактерии давали такие же результаты, и идентичность бактерии также успешно подтверждали в каждом случае. Исследование бактериостатического и бактерицидного эффектов. Результаты исследования жизнеспособности культур после воздействия аллицина представлены в табл. 2. Таблица 2 Исследование роста на агаре культур, которые не росли в присутствии аллицина Три вида, способные слабо расти при 100 ч./млн, также пересаживали для исследования жизнеспособности, и все росли хорошо, без признаков того, что их рост был подвергнут риску воздействием испытываемого объекта. Однако в каждом случае, где не наблюдался рост в жидкой культуре, не наблюдался рост после того, как культуру пересевали на агар без добавления аллицина. Все культуры были очень хорошо перемешаны до пересаживания, но существовала возможность того, что перенос такого маленького инокулята снижает вероятность захвата жизнеспособных клеток, так как наблюдалось довольно малое количество бактерий в жидких культурах без роста. Невероятным является то, что, если бы присутствовали жизнеспособные клетки в инокуляте, они бы не росли. Результаты дополнительных тестов, где 10% инокулята переносили в свежую среду, представлены в табл. 3.-9 011631 Таблица 3 Исследование роста в жидкой питательной среде культур, которые не росли в присутствии аллицинаND - не определено. Рост присутствует только для одного повтора. Что касается P.alvei и В.laterosporus, аллицин не убивал все бактерии в культурах, так как наблюдался рост после пересева в свежую среду. Однако другой эффект был виден на P.larvae subsp. larvae, так как наблюдался рост только в одном пересеве после сходного переноса. Когда этот штамм пересаживали для подтверждения его идентичности, он был красного цвета, тем не менее, колонии выглядели сходно с теми, что обычно были видимы по другим признакам, например по цвету и морфологии колонии. Этот штамм при оценке под микроскопом также напоминал P.larvae subsp. larvae. Возможно, следовательно,бактерия мутировала, и это не было типичным результатом особенно потому, что не было роста в других повторах. Все три бактерии образуют споры, фазу жизненного цикла некоторых видов бактерий, которая позволяет им противостоять стрессам окружающей среды, например недостатку воды и питательных веществ. Многие споры высокоустойчивы к экстремальному воздействию тепла, УФ-радиации и химических дезинфектантов. Культуры P.alvei и В.laterosporus обычно демонстрируют большое количество спор для живущих клеток, но в культурах P.larvae subsp. larvae это значение значительно ниже. Действительно, спорообразование этой бактерии может быть трудно достижимым in vitro. Это может помочь в дальнейшей интерпретации этих результатов, так как две бактерии, способные к хорошему росту, наиболее вероятно присутствуют в виде большого количества спор в инокуляте. Эти бактерии не могут развиваться в присутствии аллицина (который воздействует только на живые клетки), но когда этот стрессовый фактор устраняют, а именно - их пересевают в свежую жидкую среду без аллицина, споры могут развиваться и их рост виден. Возможно, что присутствовало намного меньше спор засеянных в тесткультуру P.larvae subsp. larvae, таким образом, эта бактерия не была способна пережить воздействие испытываемого объекта.M.plutonius не образует спор, таким образом, любое препятствие росту в этом эксперименте наиболее вероятно благодаря какому-либо бактерицидному действию аллицина на эту бактерию. Однако в отсутствие аллицина был зафиксирован рост после воздействия, демонстрируя скорее бактериостатический, чем бактерицидный эффект. Дальнейшая работа была предпринята для подтверждения действия аллицина на эти бактерии,включая тесты, которые могут подтвердить, было ли воздействие спорицидным или только влияющим на рост клеток. Другая работа могла подтвердить, демонстрирует ли соединение бактериостатический или бактерицидный эффекты, хотя в случае P.larvae subsp. larvae оказывается наблюдался бактерицидный эффект. 7. Эффективность аллицина против устойчивого к гликопептидному интермедиату StaphylococcusStaphylococcus aureus является наиболее обычной причиной, приобретаемой в общественных местах и больницах инфекции в мире. В 1980-х гг. во многих больницах появился метициллинустойчивыйS.aureus (MRSA). Ванкомицин был единственным антимикробным агентом, эффективным против некоторых MRSA. В 1996 г. в Японии было заявлено о первом штамме S.aureus со сниженной чувствительностью к ванкомицину (S.aureus, устойчивый к гликопептидному интермедиату [GISA]). К 1997 г. было заявлено в Соединенных Штатах о первых штаммах GISA и в 2003 г. пациент в Великобритании умер от инфицирования штаммом GISA. Штаммы GISA, следовательно, могли обусловить значительную заболеваемость и смертность. Аллицин в жидкой форме был протестирован против штамма GISA, выделенного из трупного материала, полученного из Великобритании. В стандартном тесте диффузии в агар штамм продуцировал зону размером 37 мм при 500 ч./млн (чашка 2) и 30 мм при 300 ч./млн. Штамм GISA был, таким образом, аб- 10011631 солютно чувствительным к аллицину в рекомендуемых нами дозах для поверхностного применения. Доставка аллицина и аппарат WO 02/062416. Препараты аллицина и целлюлозу готовили с и без дополнительных фармацевтически приемлемых носителей. Препарат поступал к нужным областям с помощью прибора сухого распыленияWO 02/062416. WO 02/062416 описывает применение аппарата для доставки целлюлозы в назальный тракт для лечения аллергии на пыльцу. Этот аппарат позволяет пациенту индивидуально нанести распылением комбинацию порошка аллицина и целлюлозы на нужные области (включая назальный тракт). Для тестирования этого нового метода доставки аллицина к нужным областям компания заявителяWO 02/062416, Nasaleze Ltd., предоставила смеси порошка аллицина с порошком целлюлозы, которые были исследованы на предмет антистафилококковой активности. Была установлена биологическая активность аллицина против бактерий. В исследованиях, имеющихся в нашей ранней патентной заявке авторов WO 03/024437, уже показали, что природные виды метициллинустойчивого Staphylococcus aureus (MRSA) особенно чувствительны к аллицину. Используя чувствительный штамм MRSA, авторы изобретения разработали новый способ, с помощью которого можно определить, обладают ли разные партии аллицина биологической активностью. Существует некоторое количество тестов для определения антимикробной активности выбранных агентов. Тесты диффузии определяют чувствительность штаммов измерением зон ингибирования вокруг измеренного количества антимикробного агента. Величина зоны ингибирования не более чем на 6 мм меньше, чем величина известного контрольного штамма, показывает, что тест-бактерия чувствительна к антимикробному агенту. Размеры зон в 12 мм или менее обычно показывают резистентность к антибиотикам. Существует также промежуточная антибиотик-резистентная группа с чувствительностью, находящейся между этими уровнями и с размерами зон более 12 мм. Материалы и методы. Бактерии: использовали клинический штамм MRSA UEL301. Были приготовлены ночные культуры в изосенситестовом бульоне. Среда: применялся изосенситестовый агар (Oxoid Ltd.). Порошки: обеспечены Allicin International (целлюлозный порошок от Nasaleze Ltd. + аллициновый порошок). Способ. Жидкая питательная среда, содержащая 105 КОЕ/мл была приготовлена на пептонной воде. 0,2 мл распыляли на каждую изосенситестовую чашку Петри. Чашки Петри высушивали на воздухе и 6 мм лунку вырезали в центре чашки. Объем 100 или 150 мкг каждого порошка добавляли в каждую лунку. Чашки Петри инкубировали в течение ночи при 37 С. Присутствие зон ингибирования вокруг лунки свидетельствует об имеющейся биологической активности. Отсутствие зоны вокруг 6 мм лунки (как в случае отрицательного контроля) говорит об отсутствии биологической активности. Применялись следующие соотношения порошка аллицина и целлюлозы: порошок аллицина:порошок целлюлозы = 2:1, 4:1, 6:1 и 8:1. Тесты были также проведены с использованием одного порошка аллицина, только порошка целлюлозы и одного порошка аравийской камеди. Установленная концентрация аллицина в порошке аллицина составляла 250 ч./млн.- 11011631 Результаты. Сравнительные размеры зон в мм (0 представляет размер лунки 6 мм) приведены в табл. 4. Таблица 4 Сама по себе аравийская камедь демонстрировала минимальную антибактериальную активность,выражаемую в размере зоны от 2 до 3 мм. Целлюлозный порошок сам не проявлял бактериальной активности. Следовательно, указанные выше тесты демонстрируют антимикробную активность ряда порошковых смесей аллицин/целлюлоза (поставляемых аппаратом WO 02/004309 или сходными устройствами для доставки порошковых материалов) против MRSA и других бактерий с множественной лекарственной резистентностью, включая MDRTB (туберкулез с множественной лекарственной устойчивостью), VRSA(Staphylococcus aureus устойчивый к ванкомицину), MRSE (Staphylococcus epidermidis устойчивый к метициллину), PRSP (Streptococcus pneumoneae устойчивый к пенициллину), VRE (enterococci устойчивый к ванкомицину) и VISA (Staphylococcus aureus устойчивый к промежуточному ванкомицину). ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Применение аллицина в качестве водного дезинфицирующего средства или биоцида. 2. Применение аллицина по п.1 в качестве водного дезинфицирующего средства или биоцида, содержащего аллицин в количестве 0,0225% (мас./об.) и более, предпочтительно 0,18% (мас./об.). 3. Применение аллицина по п.1 в качестве водного дезинфицирующего средства или биоцида, содержащего аллицин в количестве от 0,5 до 2,0% (мас./об. или мас./мас.). 4. Применение аллицина по п.1 в качестве водного дезинфицирующего средства или биоцида, содержащего аллицин в количестве от 0,9 до 1,7% (мас./об. или мас./мас.). 5. Применение по пп.1, 2 для биоцидного воздействия на обитающие в воде организмы. 6. Применение аллицина в получении препарата для дезинфекции или биоцидного воздействия на обитающие в воде организмы. 7. Применение аллицина по п.6 в получении препарата для дезинфекции или биоцидного воздействия на обитающие в воде организмы, содержащего аллицин в количестве от 0,0225% (мас./об.) и более,предпочтительно 0,18% (мас./об.). 8. Применение аллицина по п.6 в получении препарата для дезинфекции или биоцидного воздействия на обитающие в воде организмы, содержащего аллицин в количестве от 0,5 до 2,0% (мас./об. или мас./мас.). 9. Применение по п.6 в получении препарата для дезинфекции или биоцидного воздействия на обитающие в воде организмы, содержащего аллицин в количестве от 0,9 до 1,7% (мас./об. или мас./мас.). 10. Композиция для обработки воды, содержащая аллицин в количестве от 0,0225% (мас./об.) и более, предпочтительно 0,18% (мас./об.). 11. Композиция по п.10 для обработки воды, содержащая аллицин в количестве от 0,5 до 2,0%(мас./об. или мас./мас.) и пищевой носитель. 12. Композиция для обработки воды по п.10, содержащая аллицин в количестве от 0,9 до 1,7%- 12011631 Зоны ингибирования Escherichia coli вокруг лунок с раствором аллицина в чашке Петри с питательным агаром (чашка Петри 1). Против часовой стрелки, начиная с верхнего правого, 100, 50, 12,5 и 25%,разбавления первоначального раствора аллицина (1,8% (мас./об. Фиг. 1 Зона ингибирования, продуцируемая 500 ч./млн аллицина против штамма GISA (чашка Петри 2)