Способ получения высокоинфекционного вируса гриппа, стабильного при низких ph

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ВЫСОКОИНФЕКЦИОННОГО ВИРУСА ГРИППА,СТАБИЛЬНОГО ПРИ НИЗКИХ pH Настоящее изобретение относится к способу получения высокоинфекционного вируса гриппа,стабильного при низком рН, включающего: (а) разведение вирусов в буфере, имеющем рН от 5,2 до 5,9, (b) инфицирование клеток-хозяев по меньшей мере одной инфекционной вирусной частицей, где вирусные частицы добавляются к клеткам и клетки и вирусные частицы инкубируют при рН от 5,2 до 5,9 для обеспечения образования комплекса вирус/клетка, (с) культивирование инфицированных клеток-хозяев для размножения вирусов и (d) сбор вирусов. Изобретение также относится к высокоинфекционному вирусу гриппа, стабильному при низком рН, полученному разработанным способом, и к композиции, предназначенной для вакцинации или терапии вирусного заболевания, содержащей высокоинфекционный вирус гриппа, стабильный при низком рН. Настоящее изобретение обеспечивает способ получения рН-стабильных покрытых оболочкой вирусов, в котором указанные вирусы инкубируют с клетками клеточной культуры в условиях с низким значением рН. Такие вирусы включают новые вирусы гриппа, которые демонстрируют высокую скорость роста в клеточной культуре, повышенную рН- и температурную стабильность и которые обладают специфичностью к человеческому рецептору. Предшествующий уровень техники Вакцинация является наиболее важной санитарно-гигиенической мерой для профилактики заболевания, вызываемого ежегодной эпидемией вирусных инфекций. Эффективное обеспечение вакцинами зависит от возможности быстрого получения больших количеств вакцинного материала (например, вируса). Быстрая разработка вакцин и их избыточная доступность имеют решающее значение в борьбе с множеством заболеваний человека и животных. Задержки при производстве вакцин и их дефицит могут привести к проблемам при устранении вспышек заболевания. Было показано, что выращивание вирусов, особенно вируса гриппа в куриных яйцах с зародышем,приводит к эффективному производству частиц вируса гриппа, которые могут применяться для получения либо инактивированного, либо живого ослабленного вируса гриппа вакцинных штаммов. Тем не менее, в течение последних лет были предприняты интенсивные попытки получения систем производства вирусов в клеточной культуре, потому что способ, основанный на использовании яиц, требует стабильной поставки специфических беспатогенных яиц, которая может быть проблематичной в случае пандемии. Клеточная технология является альтернативным процессом производства, который является независимым от поставщиков яиц и может быть начат сразу после того, как исходный вирус становится доступным. Кроме того, было показано, что вакцина с инактивированным гриппом, приготовленная из вируса, выращенного в клетках млекопитающих, индуцирует больше кросс-реактивных антител в сыворотке и демонстрирует лучшую защиту в сравнении с вакциной из вируса, выращенного в яйцах (Alymova etal., 1998, J. Virol. 72, 4472-7). Более того, в соответствии с предшествующими результатами из-за роста вируса в куриных яйцах с зародышем изменяются рецепторная специфичность и антигенные свойства человеческих изолятов (Mochalova et al., 2003, Virology 313, 473-80, Romanova et al., 2003, Virology 307,90-7). С другой стороны, многократное размножение вирусов в тканевой культуре часто приводит к образованию мутантов по белку НА, которые имеют более высокие значения рН слияния (Lin et al., 1997, Virology 233, 402-10), что коррелирует с уменьшением стабильности при термической денатурации вирусов(Ruigrok et al., 1986). Структура любого белка и его стабильность основаны на нековалентных взаимодействиях, таких как гидрофобные силы, взаимодействия Ван-дер-Ваальса и ионные взаимодействия. Известно, что мутации, возникающие при адаптации вирусов к клеточной культуре, повышают пороговое значение рН при слиянии, что вызывается сниженной белковой стабильностью из-за измененных ионных взаимодействий и солевых мостиков в молекуле НА (Rachakonda et al., 2007, Faseb J. 21, 9951002). Дестабилизирующие мутации, как правило, обнаруживают либо в пределах границ раздела областей НА 1-НА 2 или НА 2-НА 2, либо в N-конце НА 2, что, в свою очередь, может привести к более слабому связыванию с рецепторами клеточной поверхности (Korte et al., 2007, Rachakonda et al., 2007, Faseb J. 21,995-1002, Shental-Bechor et al., 2002, Biochim Biophys Acta 1565, 81-9), что приводит к снижению инфекционности вируса и последующему снижению иммуногенности препаратов живого вируса.Massaab (Massaab H.F., Journal of Immunology, 1969, 102, pp. 728-732) с помощью различных генетических маркеров протестировал биологические и иммунологические характеристики холодоадаптированного вируса гриппа до и после адаптации роста в первичной культуре ткани куриной почки и в яйцах с зародышем. Утверждается, что данные штаммы более чувствительны к низкому значению рН по сравнению с исходными штаммами "дикого типа" и что данные штаммы демонстрируют заметное снижение в инфекционности и гемагглютинации.Fiszman et al. (Journal of Virology, 1974, 13, pp. 801-808) проверяли воздействие низкого значения рН(рН 6,6) на вирус везикулярного стоматита (VSV) и продемонстрировали отсутствие вирусных частиц или нуклеокапсидов. Ackermann W. и Massaab H.F. (Journal of Experimental Medicine FEB 1954, 99, pp. 105-117) раскрыли влияние вирусного ингибитора, -амино-р-метоксифенилметансульфоновой кислоты) на ростовой цикл вируса гриппа. Ввиду трудностей получения из клеточной культуры больших количеств препаратов вакцинных вирусов, обладающих высокой стабильностью и иммуногенностью, что необходимо для преодоления любых проблем, связанных с безопасностью и снабжением, задача настоящего изобретения заключается во внедрении процессов, которые приводят к получению эффективных и стабильных вирусов. Задача достигается обеспечением воплощений настоящей заявки. Изобретение относится к способу получения рН-стабильных покрытых оболочкой вирусов в тканевых культурах путем применения условий уменьшения рН во время разведения вирусной суспензии и инфицирования клетки-хозяина. Способ изобретения также обеспечивает вирус, стабильность и иммуногенность которого выше по сравнению с вирусными частицами, полученными с помощью способов,применяемых в настоящее время. На чертежах изображено: на фиг. 1 - иммуногенность Wisc.NS1 и Wisc.NS1HA2G75R, которую сравнивали в хорьках после одиночной интраназальной иммунизации с дозой 6,0 log TCID50/животное. На фиг. 2:A) индукция сывороточных антител в мышиной модели;B) воспроизводство вируса тестового заражения в легких и носовых раковинах иммунизированных мышей. На фиг. 3:A) сравнение последовательностей молекулы НА исходного и мутантного вирусов. Замены двух нуклеотидов, (аа) на (tt), сайт-направленным мутагенезом приводит к аминокислотной замене K на I в позиции 58 субъединицы НА 2;B) активность слияния вирусов VN1203 и VN1203 K58I с человеческими эритроцитами;C) Титры антитела IgA в мышиных нозальных смывах после иммунизации вирусами VN1203 иD) титры антитела HAI в мышиной сыворотке после иммунизации вирусами VN1203 и VN1203E) инфекционность вирусов VN1203 и VN1203 K58I в мышах. На фиг. 4 - чувствительность вирусов Vienna/28 и Vienna/28HA2G75R к низкому значению рН. Подробное описание изобретения Изобретение относится к способу получения покрытых оболочкой вирусов, отличающемуся тем,что содержит следующие стадии:a) разведение вирусов в растворе, имеющем рН от 5,2 до 5,9, предпочтительно от 5,4 до 5,8, наиболее предпочтительно около 5,6;b) инфицирование клеток-хозяев по меньшей мере одной инфекционной вирусной частицей; где i) вирусная частица добавляется к указанным клеткам и ii) указанные клетки и указанную вирусную частицу инкубируют при рН от 5,2 до 5,9, предпочтительно при от 5,4 до 5,8, наиболее предпочтительно при около 5,6 для обеспечения образования комплекса вирус/клетка;e) очистка и/или описание вирусов. Вирус, полученный указанным способом, может быть использован для получения вируса в лабораторном масштабе, а также для получения вакцинного вируса в крупном масштабе."Получение в крупном масштабе" означает получение, минимальный объем культивирования которого составляет по меньшей мере 200 л, предпочтительно по меньшей мере 500 л, предпочтительно по меньшей мере около 1000 л. Вакцинные препараты, содержащие покрытые оболочкой вирусы, должны обладать иммуногенностью для обеспечения достаточной вакцинации. В частности, инактивированные пандемические гриппозные вакцины, подобные вакцине против птичьего гриппа, могут быть слабо иммуногенными и требовать высоких доз для вызова защитных антительных ответов в человеке. Эффективные антительные ответы обеспечивают принципиальный иммунитет против вирусной инфекции. Белок гемагглютинина(НА) является основной мишенью защитных антительных ответов, индуцированных вирусной инфекцией вируса гриппа и вакцинацией вакцинами как с инактивированным, так и с живым ослабленным гриппом. Структурная целостность антигенов НА является критичной для вызова защитных антительных ответов. Авторы показали, что способ изобретения обеспечивает вирусы, которые обладают рНстабильностью и повышенной иммуногенностью. Белок НА вирусных частиц, полученный таким образом, предпочтительно демонстрирует повышенную стабильность при низком значении рН. Предпочтительно, если вирусы могут также показать повышенную стабильность при высоких температурах, особенно при температуре вплоть до 60 С. Эти вирусы не теряют значимо активность гемагглютинации НА,даже когда хранятся при повышенных температурах, таких как, например, 60 С, в течение от нескольких минут вплоть до нескольких часов. "Незначимый" означает, что активность гемагглютинации падает ниже, чем в 4 раза по сравнению с исходным вирусом. Даже после воздействия повышенными температурами, указанные вирусы сохраняют стабильность, когда хранятся в течение от нескольких недель вплоть до нескольких месяцев при температуре от 0 до 12 С, предпочтительно при 4 С. Следовательно, вирусы,полученные в соответствии с изобретением, являются весьма выгодными для приготовления вакцин, поскольку указанные вирусы содержат стабильную молекулу НА. Данный способ может быть применен конкретно для вирусов с негативным РНК-геномом - это группа вирусов животных, включающая несколько важных патогенов человека, включая вирусы гриппа,кори, эпидемического паротита, бешенства, респираторно-синцитиальный вирус, вирус Эбола и хантавирусы. Геномы этих РНК-вирусов могут быть мономолекулярными или сегментированными, одноцепочечными с (-) полярностью. На эти вирусы распространяются два основных требования: геномная РНК должна эффективно копироваться в вирусную РНК, форму, которая может быть использована для включения в вирусные частицы потомства; и транскрибироваться в мРНК, которая транслируется в вирусные белки. Эукариотические хозяйские клетки обычно не содержат механизм для репликации РНК-матриц или для механизма трансляции полипептидов с антисмысловой РНК-матрицы. Поэтому вирусы с негативным РНК-геномом кодируют и несут РНК-зависимую РНК-полимеразу для катализа синтеза новой геномной РНК для включения в потомков и для катализа синтеза мРНК для трансляции в вирусные белки. Для передачи вируса геномная вирусная РНК должна быть упакована в вирусные частицы. Процесс, при котором собираются вирусные частицы потомства и осуществляются белок-белковые взаимодействия в течение сборки, является схожим среди РНК-вирусов. Образование вирусных частиц обеспечивает эффективный перенос РНК-генома от одной хозяйской клетки к другой в пределах одного хозяина или между различными хозяйскими организмами. Вирусные семейства, содержащие одноцепочную РНК в оболочке с негативным геномом, разделяют на группы, имеющие несегментированные геномы (Paramyxoviridae, Rhabdoviridae, Filoviridae и вирус болезни Борна, Togaviridae) или группы, имеющие сегментированные геномы (Orthomyxoviridae, Bunyaviridae и Arenaviridae). Семейство Orthomyxoviridae включает вирусы гриппа серотипов А, В и С, а также вирусы Тогото, Дхори и вирус инфекционной анемии лососевых. Предпочтительные воплощения включают, но не ограничиваются перечисленным, вирус гриппа,респираторно-синцитиальный вирус (RSV), вирус болезни Ньюкасла (NDV), вирус везикулярного стоматита (VSV) и вирус парагриппа (PIV). Вирионы гриппа состоят из внутреннего рибонуклеопротеинового кора (спирального нуклеокапсида), содержащего одноцепочечный РНК-геном, и внешней липопротеиновой оболочки, покрытой изнутри матриксным белком (M1). Сегментированный геном вируса гриппа А состоит из 8 молекул линейных,одноцепочечных РНК с негативной полярностью, которые кодируют одиннадцать (некоторые штаммы гриппа А десять) полипептидов, включая белки РНК-зависимой РНК-полимеразы (РВ 2, РВ 1 и РА), нуклеопротеин (NP), формирующий нуклеокапсид; матриксные мембранные белки (M1, M2); два поверхностных гликопротеина, выступающих из липидосодержащей оболочки: гемагглютинин (НА) и нейраминидазу (NA); неструктурный белок (NS1) и белок ядерного экспорта (NEP). Большинство штаммов гриппа А кодируют также одиннадцатый белок (PB1-F2), по-видимому, обладающий проапоптотическими свойствами. Транскрипция и репликация генома происходят в ядре, а сборка происходит путем почкования на плазматической мембране. Вирусы могут перемешивать гены во время смешанных инфекций. Вирус гриппа адсорбируется с помощью НА на сиалилолигосахаридах гликопротеинов и гликолипидов клеточной мембраны. При последующем эндоцитозе вириона внутри клеточной эндосомы в молекуле НА происходят конформационные изменения, что облегчает слияние мембран, вызывая утрату вирусом оболочки. Нуклеокапсид мигрирует в ядро, где вирусная мРНК транскрибируется. Вирусная мРНК транскрибируется с помощью уникального механизма, в котором вирусная эндонуклеаза отрезает кэпированные 5'концы от клеточных гетерологичных мРНК, которые затем служат праймерами для транскрипции вирусной транскриптазой вирусных РНК-матриц. Транскрипты терминируются на участках от 15 до 22 оснований от концов их матриц, где олиго-U последовательности действуют как сигналы для добавления поли-А трактов. Из восьми производимых таким образом вирусных РНК-молекул, шесть моноцистронны и транслируются непосредственно в белки НА, NA, NP и белки вирусной полимеразы, РВ 2, РВ 1 и РА. Два других транскрипта подвергаются сплайсингу и каждый дает по две мРНК, транслирующихся с различными рамками считывания для получения M1, М 2, NS1 и NEP. Другими словами, восемь вирусных РНКсегментов кодируют одиннадцать белков: девять структурных и 2 неструктурных белка (NS1 и недавно идентифицированный PB1-F2). Вирусы могут быть выбраны из полученных в природе штаммов, вариантов или мутантов; из подвергнутых мутагенезу вирусов (например, образованных воздействием мутагенов, повторными пассажами и/или пассажами в непермиссивных хозяевах); из реассортантов (в случае сегментированных вирусных геномов); и/или из вирусов, полученных с помощью генной инженерии (например, с помощью методов "обратной генетики"), обладающих требуемым фенотипом. Термин "пассирование" определяется как инокулирование клеток-хозяев определенным количеством вирусных частиц и сбор указанного вируса по прошествии определенного числа дней, как правило,по прошествии 2-3 дней. Вирусы будут иметь примерно от 2 до 4 циклов репликации в день. В данной области хорошо известно, что вирусы дикого типа, применяемые при получении вакцинных штаммов для ежегодной вакцинации против эпидемического гриппа, ежегодно рекомендуются Всемирной организацией здравоохранения (ВОЗ). Эти штаммы могут быть затем применены для получения реассортантных вирусных штаммов, которые, как правило, объединяют гены NA и/или НА вирусов дикого типа с остальными генными сегментами, которые получают из донорного вируса (часто называемого исходный донорный вирус или MDV (master donor virus, который обладает некоторыми требуемыми характеристиками. Например, MDV-штамм может быть холодоадаптированным температурочувствительным, ослабленным и/или может обладать высокой скоростью роста. В соответствии с конкретным воплощением вирусом гриппа является ослабленный вирус гриппа. Конкретно, вирус гриппа содержит делеции или модификации в факторах патогенности, которые ингибируют врожденный иммунный ответ клеток-хозяев. Ослабление для примера может быть получено из холодоадаптированных вирусных штаммов или в результате удаления или модификации в пределах генаNS1 (NS1-вирус), как описано в WO 99/64571 и WO 99/64068, которые включены в данный документ полностью посредством ссылки. Эти вирусы являются репликативно-некомпетентными, поскольку они подвергаются абортивной репликации в дыхательных путях животных. В ином случае вирусы могут содержать делецию или модификацию гена PB1-F2. В соответствии с изобретением вирус может дополнительно содержать модификации в пределах гена НА, которые могут повысить стабильность молекулы НА. Например, Steinhauer et al. (1991, PNAS. 88: 11525-1152) определили мутацию K581 в НА 2 вируса гриппа Rostock (H7N1) как ответственную за уменьшение значения рН при слиянии мембран по сравнению с немутированным вирусом. Это означает,что конформационное изменение НА, индуцированное кислым значением рН, происходит в мутированной форме НА при значении рН на 0,7 ниже по сравнению с диким типом. Такой же эффект был показан при введении этой мутации в вирус гриппа Х-31 (Н 3 подтип). Термин "реассортант", когда речь идет о вирусе, указывает на то, что вирус включает генетические и/или полипептидные компоненты, полученные из более чем одного родительского вирусного штамма или источника. Например, реассортант 7:1 включает 7 вирусных геномных сегментов (или генных сегментов), полученных из первого родительского вируса, и одиночный комплементарный вирусный геномный сегмент, например, кодирующий гемагглютинин или нейраминидазу, из второго родительского вируса. Реассортант 6:2 включает 6 геномных сегментов, чаще всего 6 внутренних генов, из первого родительского вируса и два комплементарных сегмента, например с гемагглютинином и нейраминидазой,из другого родительского вируса. Как правило, вакцины вируса гриппа получают из интерпандемических или пандемических штаммов вируса гриппа, например штаммов H1, H3 или В. Было показано, что эти штаммы демонстрируют существенно более высокую иммуногенность, если производятся в соответствии со способом по изобретению. Клетки, которые могут быть применены в способе по изобретению для культивирования вирусов,могут быть любым требуемым типом клеток, которые могут быть культивированы и которые могут быть инфицированы покрытыми оболочкой вирусами, в частности вирусами гриппа. В частности, это могут быть клетки BSC-1, LLC-MK, CV-1, СНО, COS, мышиные клетки, человеческие клетки, клетки HeLa,293, VERO, MDBK, MDCK, CEK (клетки почек куриных эмбрионов) CEF (куриные эмбриональные фибробласты), MDOK, CRFK, RAF, TCMK, LLC-PK, PK15, WI-38, MRC-5, T-FLY, BHK, SP2/0, NSO, PerC6(человеческие клетки сетчатки). Для разведения вирусов может быть применен любой буфер, который может обеспечить диапазон значений рН, в частности от 5,2 до 5,9, в частности от 5,4 до 5,8, и которое является физиологическим для клеток. Например, буфером может быть буфер MES (2-(N-морфолиноэтансульфоновая кислота),цитратный буфер или ацетатный буфер, в частности при использовании буферов на основе PBS. Кроме того, к раствору для разведения могут также быть добавлены компоненты, например соли, такие как хлорид натрия, динатрия гидроксифосфат или калия дигидроксифосфат и т.д. Термин "разведение" означает, что вирусную суспензию разбавляют до содержания вирусных частиц, которое достаточно для продуктивной инфекции клеток. В соответствии со способом по изобретению соответствующие клетки инфицируют по меньшей мере одной вирусной частицей. Количество вирусных частиц, необходимых для достаточной инфекции,может быть легко определено специалистом. Инфекция клеток вирусами может быть конкретно проведена при m.o.i. (множественности заражения) от около 0,0001 до 10, предпочтительно от 0,001 до 0,5. В ходе стадии разведения в растворе для разведения и/или в ходе инфекции и/или культивирования необязательно могут присутствовать антибиотик полиеновый макролид или производное. В частности,антибиотиком является амфотерицин В или его производное. В частности, антибиотик полиеновый макролид может быть добавлен, например, за 30-60 мин до инфекции, более предпочтительно за 30 мин до инфекции. Оптимальная концентрация антибиотика, примененного для инкубации или культивирования вируса, находится в диапазоне от 0,20 до 50 мкг/мл, в частности 0,25 мкг/мл. Температура инкубации вируса для связывания его с клетками, в частности с клеточными рецепторами, может находиться в диапазоне от 20 до 38 С. рН инкубации предпочтительно находится в диапазоне от 5,4 до 5,8. Для определения времени, достаточного для интернализации вируса в клетку, вирус можно контролировать стандартными процедурами, такими как мечение краской или электронная микроскопия. В частности, временной период находится в диапазоне по меньшей мере от 5 до 60 мин, предпочтительно от 20 до 60 мин при комнатной температуре. Может быть добавлена протеаза, которая расщепляет белок-предшественник гемагглютинина, а интернализация вирусов клетками может быть проведена в соответствии с изобретением незадолго до, одновременно и сразу после инфекции клеток вирусами гриппа. Если добавление проводится одновременно с инфекцией, то протеаза может быть добавлена либо напрямую к клеточной культуре, которая долж-4 024262 на быть инфицирована либо, например, может быть добавлена в виде концентрата вместе с вирусным инокулятом. Протеазой предпочтительно является сериновая протеаза, а конкретно предпочтительно является трипсин. Если применяется трипсин, то конечная концентрация, добавляемая в культуральную среду, предпочтительно составляет от 1 до 200 мкг/мл, предпочтительно 5-50 мкг/мл, более предпочтительно 5-30 мкг/мл. После инфекции инфицированную клеточную культуру для репликации вирусов культивируют дополнительно, в частности до обнаружения максимального цитопатического эффекта или максимального количества вирусного антигена. В ином случае сбор может быть проведен в любой временной точке в ходе культивирования. Значение рН для культивирования клеток-хозяев, может быть, например, в диапазоне от 6,5 до 7,5. рН для культивирования зависит от рН-стабильности клеток-хозяев, примененных для культивирования. Значение может быть определено тестированием жизнеспособности клеток-хозяев в условиях с различными значениями рН. В соответствии с изобретением термины культивирование и выращивание имеют одно и то же значение. Для культивирования подходит любая среда, используемая для культивирования клеток. В частности, средой может быть среда "SFM opti-pro", среда с низким содержанием белка для культивирования почечных эпителиальных и подобных клеток, экспрессирующих вирус. Клетки могут культивироваться при температуре от 20 до 40 С, в частности от 30 до 40 С. Вирусы могут пассивироваться в клетках-хозяевах в течение по меньшей мере одного пассажа, но обычно требуется несколько пассажей, например по меньшей мере три пассажа. В соответствии с конкретным воплощением способа сбор и выделение реплицированных вирусов гриппа проводится через 2-10 дней, предпочтительно через 3-7 дней после инфекции. Клетки или клеточные остатки могут быть отделены и собраны из культуральной среды посредством способов, известных специалисту в даннойобласти, например с помощью сепараторов или фильтров. После этого концентрирование вирусов гриппа, присутствующих в среде для культивирования, проводится способами,известными специалисту в данной области, такими как, например, градиентное центрифугирование,фильтрация, преципитация и т.п. Авторами было успешно показано, что разведение покрытых оболочкой вирусов и инфицированных клеток в условиях с низким значением рН дает покрытые оболочкой вирусы, которые демонстрируют стабильность при низком значении рН и повышенную иммуногенность. Эти вирусы также демонстрируют стабильность при повышенных температурах и/или высокие скорости роста в клеточной культуре и/или специфичность к человеческим рецепторам. К всеобщему удивлению Scholtissek (1985, ArchivesVirol., 85, 1-11) продемонстрировал, что инфекционность вирусов гриппа при низких значениях рН необратимо теряется. Также утверждалось, что корреляция между рН и тепловой стабильностью отсутствует. В качестве дополнительно воплощения изобретением также обеспечивается вирус гриппа, который является полезным в качестве посевного вируса или вируса, полезного для целей вакцинации. Указанный вирус гриппа сохраняет детектируемую активность гемагглютинации при повышенной температуре, сохраняет стабильную в диапазоне значений рН 5,4-5,8 инфекционность, имеет высокую скорость роста в клеточной культуре и обладает специфичностью к человеческому рецептору."Посевной вирус" определяется как вирус, применяемый при инокуляции клеточной культуры. Детектируемая активность гемагглютинации в соответствии с воплощением изобретения определяется как не более чем четырехкратное снижение активности гемагглютинации по сравнению с использованным исходным вирусом. Источником вируса может быть, например, вирус, выделенный напрямую из носового мазка. В соответствии с дополнительным воплощением вирус может быть предоставлен так, чтобы он являлся полезным в качестве вакцинного вируса. Указанные частицы вируса являются стабильными при низком значении рН и демонстрируют иммуногенность, которая является похожей или более высокой по сравнению с вирусом, полученным известными процедурами из клеточных культур, например из клетокVero, MDCK и MDBK. В частности, вирус демонстрирует повышенный рост в клеточной культуре по сравнению с вирусом, который не подвергался воздействию способа по настоящему изобретению. Кроме того, вирус является термостабильным и обладает специфичностью к человеческим рецепторам. Термостабильность по настоящему изобретению означает, что активность гемагглютинации не уменьшается в значительной степени при температуре вплоть до 60 С в течение периода времени вплоть до 15 мин. рН-стабильность определяется как стабильность вируса при рН 5,6, предпочтительно от 5,4 до 5,8, предпочтительно от 5,2 до 5,9. Высокая скорость роста означает скорость роста вплоть до 6 logTCID50/мл, предпочтительно выше 7 log TCID50/мл. Указанный вирус может быть получен способом, описанным в настоящей заявке. Вирусы особенно полезны в вакцинных и терапевтических составах. Вирус гриппа, содержащийся в этом составе, может быть либо ослабленным, либо инактивированным вирусом. Инактивация может быть осуществлена любым способом известным в данной области, таким как обработка формалином или другими агентами,-5 024262 применяемыми для изготовления вакцин с убитыми вирусами, или обработка неионными детергентами или экспонирование УФ-излучению. Вирус гриппа, содержащийся в препаратах, может быть введен любым путем, например подкожно, интраназально или внутримышечно. В ином случае, препараты содержащие вирус гриппа, могут дополнительно содержать фармацевтически приемлемые носители или адъюванты, известные тем, что они усиливают иммуногенность введенного препарата. Предпочтительно, если препараты вводятся через слизистую, конкретно интраназальным путем, поскольку эти вирусы являются высокоиммуногенными в результате выше перечисленных характеристик,т.е. рН-стабильности, температурной стабильности, высокой скорости роста и специфичности к человеческим рецепторам. Вирус гриппа с этими характеристиками никогда не был описан или указан ранее. Более полное понимание вышеописанному даст ссылка на следующие примеры. Такие примеры являются, однако, лишь образцом способов применения одного или более воплощений настоящего изобретения и не должны толковаться как ограничение сферы применения изобретения. Примеры Пример 1. Два штамма гриппа, несущих поверхностные гликопротеины из эпидемического штаммаA/Wisconsin/67/05 (H3N2), и все другие гены из штамма вакцины ВОЗ IVR-116 (реассортант A/New Caledonia/20/99 и A/Puerto Rico/8/34) в комбинации с геном NS, потерявшим открытую рамку считыванияNS1 (NS1), были сконструированы посредством обратной генетики. Полученные вирусы отличались по одной аминокислотной замене в последовательности молекулы НА, из-за различных условий пассирования в клетках Vero. Первый вирус, названный Wise.NS1, всегда пассировали на клетках Vero с предварительной обработкой вирусного инокулюма буфером с низким значением рН, а именно вирус растворяли до соответствующего значения moi в буфере для инфекции MES (0,1 М MES, 150 mM NaCl, 0,9 мМCaCl2, 0,5 мМ MgCl; pH 5,6) дополненном 0,25 мкг/мл амфотерицина В. Клетки Vero отмывали буфером для инфекции, вирусный инокулюм наносили на клетки и инкубировали в течение 30 мин. Затем инокулят удаляли и клетки инкубировали в бессывороточной среде "Opti-pro", дополненной 0,25 мкг/мл амфотерицина В и 5 мкг/мл трипсина. Этот метод привел к сохранению исходной вирусной последовательности НА, обнаруженной в клиническом мазке. Второй вирус размножали стандартным путем в нейтральных условиях, и он приобрел одну замену в субъединице НА 2, а именно G75R (табл. 1). В табл. 1 представлено сравнение последовательностей молекулы НА в сравнении с вирусом присутствующим в мазке. Сравнивали нуклеотидные последовательности НА двух вирусов, культивированных в различных условиях. Вирус Wisc.ANS не приобрел каких-либо мутаций в молекуле НА, тогда как одна мутация,G75R, расположенная в субъединице НА 2, была обнаружена в вирусе Wisc.NSHA2G75R. Таблица 1 Далее оба вируса сравнивали по их стабильности в отношении низкого значения рН следующим способом. Вирус разводили в буфере для инфекции с MES, который имеет диапазон рН 5,6-7,5 для того чтобы получить определенное значение moi и наносили на клетки Vero с последующей инкубацией в течение 30 мин, для того чтобы позволить вирусу инфицировать клетки. Далее инокулят удаляли, клетки инкубировали при 37 С в течение 4-9 ч (в зависимости от штамма), затем фиксировали и белок вируса гриппа NP детектировали иммунофлуоресценцией. Этот тест показал, что вирус Wisc.NS1, по всей видимости, является стабильным при рН 5,6, инфицируя клетки с такой же эффективностью, как и в нейтральных условиях, в то время как мутантный вирус Wise. NS1HA2G75R полностью потерял способность инфицировать клетки при рН 5,6, инфицируя клетки только при рН 5,8 с такой же эффективностью, что и в нейтральных условиях (результаты не представлены). Иммуногенность вирусов Wise.NS1 и Wise.NS1HA2G75R сравнивали в хорьках после одиночной интраназальной иммунизации с дозой 6,0 log TCID50/животное. Полученные результаты показали,что вирус с интактной последовательностью НА, Wise.NS1, индуцирует значимо более высокие антительные титры, измеренные тестом HAI (GMT 202.9), чем вирус Wise.NS1HA2G75R (GMT 27.9)(фиг. 1). Пример 2. С помощью обратной генетики были сконструированы два вируса H1N1, несущих поверхностные гликопротеины из эпидемического штамма A/Brisbane/59/07 (H1N1), а все остальные гены из штамма вакцины ВОЗ IVR-116 в сочетании с геном NS, который потерял открытую рамку считывания NS1(NS1). Полученные вирусы отличались по одной аминокислотной замене в последовательности моле-6 024262 кулы НА из-за различных условий пассирования в клетках Vero. Первый вирус, названныйBrisbaneNS1, пассировали в условиях с низкими значениями рН в присутствии амфотерицина В. Эта процедура приводит к сохранению последовательности НА, которая, по-видимому, является похожей на последовательность вируса выделенного в клетках MDCK из клинического образца (пассаж 1). Второй вирус, названный BrisbaneNS1HA2N16I, пассировали стандартными способами, и он приобрел одну замену в субъединице НА 2, N16I (табл. 2). В табл. 2 представлено сравнение последовательностей молекул НА 2 в сравнении с исходным изолятом. Таблица 2 Сравнивали нуклеотидные последовательности НА двух вирусов, культивированных в различных условиях. Вирус BrisbaneNS не приобрел каких-либо мутаций в молекуле НА, тогда как одна мутацияN16I, расположенная в субъединице НА 2 была обнаружена в вирусе BrisbaneNSHA2N16I. Сравнение вирусной стабильности к низким значениям рН показало, что вирус BrisbaneNS1, повидимому, является стабильным. В иммунофлюоресцентом анализе при рН таком низком как 5,6 наблюдали такое же количество окрашенных клеток Vero, как и при рН 7,5. Мутантный вирус BrisbaneNS1HA2N16I был менее стабильным при инфицировании клеток при рН 5,8 и не инфицировал при рН 5,6. На клетках, инфицированных вирусом, в сочетании с буфером с рН 5,6 не был виден иммунный флюоресцентный сигнал (результаты не представлены). Иммуногенность обоих вирусов сравнивали после одиночной интраназальной иммунизации мышей с дозой вируса 5,6 log TCID50/животное. Полученные результаты показали, что вирус BrisbaneNS1 был более иммуногенным, чем BrisbaneNS1HA2N16I, индуцируя более высокие уровни сывороточных антител (измерено с помощью теста HAI), и лучшую защиту животных, на что указывает сниженная репликация тестируемого вируса в легких и носовых раковинах мышей (фиг. 2 А, В). На фиг. 2 В конкретно раскрыто воспроизводство тестируемого вируса в легких и носовых раковинах иммунизированных мышей. Пример 3. Культивирование штаммов вируса гриппа В в клетках Vero в стандартных условиях также приводит к появлению дестабилизирующих мутаций, либо на границе области НА 1-НА 2, либо на границе области НА 2-НА 2 в молекуле НА, связанных с пониженной стабильностью и, в свою очередь, со сниженной иммуногенностью мутированного вируса в животных моделях (данные не указаны). Пример 4. Ранее было обнаружено, что высокопатогенные птичьи вирусы H5N1, циркулирующие последнее десятилетие, не выдерживают обработку носовыми промывочными жидкостями для человека, которые имеют рН 5,6. Они также не выдержали обработку кислым буфером с таким же рН 5,6 во время инокуляции клеток Vero. Было обнаружено, что причина нестабильности заключается в высоком значении рН,при котором молекула НА изменяет конформацию в целях осуществления слияния с клеточной мембраной, которое для вируса H5N1 имеет значение 5,6, в то время как для вирусов человека оно находится в диапазоне 5,2-5,4.Steinhauer et al., продемонстрировали, что одиночная замена в НА 2, а именно K58I в вирусе H7N7 может значительно снизить значение рН слияния на 0,7 единицы. Введение этой мутации в вирус H3N2 оказывает такое же воздействие. Это изменение было введено сайт-направленным мутагенезом в белок НА вируса A/VN1203/04NSI (H5N1) (реассортант, унаследовавший гены НА, NA и М из A/VN/1203/04, а оставшиеся гены из вакцинного штамма IVR-116 в сочетании с геном NS1), который назвали освобожденный вирусVN1203 НА K58I (фиг. 3 А). В фиг. 3 А показано сравнение последовательностей молекулы НА исходного и мутантного вирусов. Белок НА обоих вирусов модифицировали трипсинзависимым способом. рН слияния мутированного вируса VN1203 НА K58I изменилось на 0,3 единицы в эксперименте гемолиза человеческих эритроцитов (данные не показаны). Более того, вирус VN 1203 НА K58I продемонстрировал сниженную потерю инфекционности при рН 5,6. В иммунофлюоресцентном анализе было отмечено почти одинаковое количество окрашенных клеток после инфекции, проведенной вирусом VN 1203 НА K58I при рН 5,6 и 7,5, в то время как при проведении инфекции вирусом VN 1203 при рН 5,6 были видны не окрашенные клетки (данные не показаны). Сравнивали способность вирусов индуцировать иммунный ответ после интраназальной иммунизации мышей. Через четыре недели после иммунизации получали сыворотку и носовые смывы и измеряли антитела HAI и IgA. Как показано на фиг. 3 В, вирус VN1203 НА K58I индуцировал в 4 раза более высокие титры антител IgA, чем вирус VN1203 с исходной последовательностью НА. На фиг. 3 В показаны титры IgA-антител в мышиных назальных смывах после иммунизации вирусами VN1203 и VN1203 K58I. На фиг. 3 С показаны титры HAI-антител в мышиной сыворотке после иммунизации вирусамиVN1203 и VN1203 K58I. Для того чтобы доказать, что повышенная стабильность НА при низких значениях рН приводит к повышению инфекционности вируса в млекопитающих, были сконструированы два аналогичных реассортанта VN1203R и VN1203R НА K58I, содержащих компетентный ген NS. Присутствие компетентного гена NS было необходимо для эффективного вирусного роста в дыхательных путях иммунокомпетентных организмов. Сравнивали вирусный рост обоих вирусов в верхних дыхательных путях после интраназальной инокуляции каждым из этих вирусов, взятом в различных дозах. Было обнаружено, что вирусVN1203R НА K58I с мутированным НА был в 100 раз более инфекционным при росте в верхних дыхательных путях мышей со значении MID50 (инфекционная доза в мышах - доза, инфицирующая 50% мышей) 2,5 log по сравнению с 4,5 log MID50 немодифицированного вируса VN1203R (фиг. 3 Е). В фиг. 3 Е показано воспроизведение вирусов в верхних дыхательных путях мышей после интраназальной инфекции различными дозами. Пример 5. Термостабильность. Размножение вирусов с кислотной инокуляцией сохраняет также вирусную стабильность к термоинактивации. Термостабильность проверяли титрованием титра гемагглютинации вируса после инкубации вируса при повышенных температурах в течение 15 мин. Было обнаружено, что вирусы, которые культивировали с инокуляцией при низком значении рН (BrisbaneNS1 H1N1, WisconsinNS1 H3N2,BrisbaneNS1 H3N2), сохраняли активность гемагтлютинации даже после воздействия 60 С. Вирусы,культивируемые в стандартных условиях и получившие дестабилизирующие мутации в белке НА (NewCaledoniaNS1HA2113, WisconsinNS1HA2182257581 H3N2), были не способны выдержать обработку при 60 С и полностью теряли активность гемагглютинации через 15 мин (табл. 1). Что касается птичьих вирусов гриппа, то было обнаружено, что штаммы содержащие НА только с одной модификацией полиосновного сайта расщепления (трипсинзависимым способом) не выдерживали даже обработки при 55 С (HongKong156NS1 H5N1, VN1203(6:2) (H5N1), VN1203 H5N1) полностью теряя способность агглютинировать эритроциты после 15 мин обработки. Пороговое значение для этих вирусов составило 50 С. Введение мутации K58I в субъединицу НА 2 эктодомена НА повышает вирусную стабильность до 55 С. Таблица 3 Вирусы гриппа человека BrisbaneNS1 H1N1, WisconsinNS1 H3N2, BrisbaneNS1 H3N2, New Caledonia NS1HA2113, Wisconsin NS1HA12182257581 H3N2 получали в виде реассортантов 6:2,несущих поверхностные антигены НА и NA из соответствующих эпидемических вирусов и все другие гены из штамма IVR-116. Штамм IVR-116 рекомендован ВОЗ для производства инактивированной вакцины содержащей поверхностные гликопротеины из вируса A/New Caledonia/20/99 (H1N1). Ген NS всех вирусов потерял открытую рамку считывания NS1. Птичьи вирусы получили в виде реассортантов 5:3 (VN 1203 H5N1 и VN 1203/04 НА K58I H5N1) или 6:2 (VN1203(6:2) H5N1), наследующих гены НА, NA и М (в случае 5:3) птичьих вирусовA/Vietnam/1203/04 или A/Hong Kong/156/97, а все остальные гены из штамма IVR-116. Сайт расщепления НА высокопатогенных птичьих штаммов заменяли сайтом из низкопатогенных птичьих вирусов. Все птичьи вирусы в этом исследовании содержали ген NS потерявший открытую рамку считывания NS1. Пример 6. С помощью обратной генетики были сконструированы два реассортанта гриппа, несущих поверхностные гликопротеины из эпидемического штамма A/Vienna/28/06 (H3N2), а все остальные гены из штамма вакцины ВОЗ IVR-116 в сочетании с геном NS, который потерял открытую рамку считыванияNS1 (NS1). Полученные вирусы отличались по одной аминокислотной замене в последовательности субъединицы НА 2 молекулы НА, из-за различных условий пассирования в клетках Vero. Первый вирус,который называется Vienna/28, культивировали в присутствии среды, имеющей рН 6,5, а второй вирус(Vienna/28HA2G75R) культивировали в стандартных условиях. Вирус Vienna/28HA2G75R отличался от Vienna/28 по последовательности НА в субъединице НА 2 в позиции G75R, которая отсутствует в исходном вирусе дикого типа. Эта замена привела к сниженной инфекционности вирусаVienna/28HA2G75R при низком значении рН в сравнении с вирусом Vienna/28, что измерено с помощью предварительной инкубации вирусов в кислых буферах (в течение 30 мин) с последующим титрованием инфекционного титра (фиг. 4). Пример 7. Вирус A/Brisbane/10/2007 (выделен из яиц, получен в NIBSC, UK) пассировали пять раз параллельно на клетках MDCK и Vero. После 5 пассажей оба полученных в результате варианта сравнивали с исходным вирусом по инфекционности при различных значениях рН в иммунофлюоресцентном анализе. Полученные данные ясно показывают, что исходный вирус A/Brisbane/10/2007 инфицирует клетки с одной и той же эффективностью при рН 5,6 и при нейтральной значении рН 7,5. После 5 пассажей на соответствующих клеточных линиях оба вируса потеряли способность инфицировать клетки при рН 5,6. Положительное окрашивание клеток наблюдали только при рН 5,8, но при применении буфера с рН 5,6 были видны окрашенные клетки (результаты не показаны). Секвенирование генов НА показало, что оба вирусных варианта приобрели одну и ту же мутацию в позиции 160 D-E в молекуле НА. Пример 8. Вирус A/Solomon lsland/3/06 (выделен из яиц, получен в NIBSC, UK) адаптировали к клеткам Vero посредством последовательных пассажей, проведенных двумя различными путями: в стандартных (нейтральных) условиях или в кислых условиях (инфекция при рН 5,6). Полученный в результате вирус, пассированный при нейтральном значении рН, улучшил способность к росту на клетках Vero с 4,7 logTCID50/мл на 6,7 log TCID50/мл, но потерял способность инфицировать клетки при рН 5,6 в иммунофлюоресцентном анализе. После инфекции клеток вирусом, объединенным с буфером рН 5,6 не наблюдали окрашенных клеток, в то время как при инфекции в нейтральных условиях монослой был полностью окрашен. Вирус A/Solomon lsland/3/06 адаптированный к росту в клетках Vero с помощью инфекции в кислых условиях достигал титра 7,6 log TCID50/мл и в то же время сохранил инфекционность в условиях с низким значением рН. В иммунофлюоресцентном анализе было отмечено похожее распределение окрашенных клеток после инфекции при рН 5,6 и 7,5. Пример 9. Вирус A/California/7/09 нового субтипа H1N1 (из яиц, полученный у выделен из яиц, получен вCDC) адаптировали к клеткам Vero несколькими последовательными пассажами, проведенными в кислых условиях (инфекция клеток при рН 5,6). Полученный вирус получил название A/California/7/09-acid. Исходный и адаптированный вирусы использовали для производства в малом масштабе (10 л) в биореакторе с последующей очисткой. Выход вируса A/California/7/09-acid, измеренный по титру гемагглютинации (НА) был выше, чем у вируса A/California/7/09 после каждой стадии производства в 2-8 раз. Результаты представлены в табл. 4. Таблица 4 Выход вирусов A/California/7/09 и A/California/7/09-acid Оба вируса собирали, очищали в соответствии со стандартной процедурой, применяемой для очистки инактивированных вакцин, и сравнивали. Полученные результаты показали, что вирусA/California/7/09-acid был лучше, чем A/California/7/09 по всем измеряемым параметрам (табл. 5). Таблица 5 Сравнение очищенных препаратов вирусов A/California/7/09 и A/California/7/09-acid ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Способ получения высокоинфекционного вируса гриппа, стабильного при низком рН, включающий стадии:a) разведения вирусов в буфере, имеющем рН от 5,2 до 5,9;b) инфицирования клеток-хозяев по меньшей мере одной инфекционной вирусной частицей; где:i) вирусная частица добавляется к указанным клеткам иii) указанные клетки и указанную вирусную частицу инкубируют при рН от 5,2 до 5,9 для обеспечения образования комплекса вирус/клетка;d) сбора вирусов. 2. Способ по п.1, где разведение вирусов, инкубацию клеток-хозяев и вирусных частиц проводят в буфере, имеющем рН от 5,4 до 5,8. 3. Способ по п.1, где разведение вирусов, инкубацию клеток-хозяев и вирусных частиц проводят в буфере, имеющем рН около 5,6. 4. Способ по любому из предшествующих пунктов, дополнительно включающий добавление на стадии разведения, инфицирования и/или культивирования антибиотика полиенового макролида или его производного, предпочтительно амфотерицина В. 5. Способ по любому из предшествующих пунктов, где клетки являются клетками тканевой культуры, выбранными из группы, состоящей из клеток BSC-1, LLC-MK, CV-1, СНО, COS, мышиных клеток,человеческих клеток, клеток HeLa, HEK-293, VERO, MDBK, MDCK, MDOK, CRFK, RAF, TCMK, LLCPK, PK15, WI-38, MRC-5, T-FLY, BHK, SP2/0, NS0, PerC6. 6. Способ по любому из предшествующих пунктов, где вирус является вирусом гриппа А или В. 7. Способ по любому из предшествующих пунктов, где вирус гриппа является ослабленным вирусом гриппа. 8. Способ по любому из предшествующих пунктов, где вирус гриппа содержит делецию или модификацию в гене NS1. 9. Способ по любому из предшествующих пунктов, где вирусы разводят в буфере, который выбирают из группы, состоящей из буфера MES, цитратного буфера и ацетатного буфера. 10. Способ по любому из предшествующих пунктов, где культивирование клеток проводят в среде для культивирования "SFM opti-pro". 11. Способ по любому из предшествующих пунктов, где вирусы пассируют в клетках-хозяевах по меньшей мере один раз. 12. Способ по любому из предшествующих пунктов, дополнительно включающий очистку вируса. 13. Вирус гриппа, полученный способом по любому из пп.1-12, имеющий инфекционность в диапазоне рН от 5,5 до 5,8, стабильность при хранении в течение от 15 мин вплоть до нескольких недель при температуре вплоть до 60 С, активность гемагглютинации, сниженную более чем в четыре раза по сравнению с вирусом-источником, стабильность при хранении в течение нескольких недель при температурах от 0 до 12 С и скорость роста выше 7 log TCID50/мл. 14. Композиция, предназначенная для вакцинации или терапии вирусного заболевания, содержащая вирус гриппа по п.13 и фармацевтически приемлемый носитель или адъювант.