Последовательности днk, обеспечивающие биосинтез клавама 5s у микроорганизмов streptomyces clavuligerus, штаммы микроорганизма s.clavuligerus, содержащие указанные последовательности днк, и способ повышения выработки клавама 5r, в частности клавулановой кислоты, у микроорганизмов s.clavuligerus

1 Настоящее изобретение касается новых бактериальных генов и способов улучшения выработки клавамов, например клавулановой кислоты. Настоящее изобретение также представляет новые организмы, способные вырабатывать увеличенное количество клавулановой кислоты. Микроорганизмы, в частности Streptomyces sp., вырабатывают ряд антибиотиков, включая клавулановую кислоту и другие клавамы,цефалоспорины, поликетиды, цефамицины, туникамицин, голомицин и пенициллины. Представляет значительный интерес сделать возможным манипулирование абсолютным и относительным количеством этих антибиотиков,вырабатываемых конкретным микроорганизмом: соответственно, было проведено значительное число исследований метаболических и генетических механизмов соответствующих биосинтетических путей [Domain A.L., 1990,"Biosynthesis and regulation of -lactam antibiotics", In "50 years of Penicillin applications, historyand trends"]. Многие из ферментов, которые осуществляют различные этапы метаболических реакций, и гены, кодирующие эти ферменты,известны. Клавамы могут быть произвольно разделены на две группы в зависимости от стереохимических параметров их кольца (клавамы 5S и 5R). Биохимические пути биосинтеза клавамов 5R и 5S полностью пока не установлены, однако, было выяснено, что в обоих случаях она начинается с одних и тех же исходных компонентов (с пока неидентифицированного 3-углеродного соединения [Townsend С.А.Но M.F., 1985, J.Amer. Chem. Soc., 15, 1210-1211] и характеризуются рядом общих промежуточных соединений [Iwata-Reuyl D.Townsend С.А., 1992, J.(2 НМС), 2-(3-аланил)клавам, валклавам и клаваминовую кислоту [GB 1585661; Rohl F. et al.,Arch. Microbiol., 147, 315-320; US 4202819]. Однако примеров клавамов 5R немного, и к настоящему времени наиболее известным является имеющая активность ингибитора лактамазы клавулановая кислота, вырабатываемая в процессе ферментации Streptomyces clavuligerus. Клавулановая кислота в форме клавуната калия находится в комплексе с лактамным амоксициллином в антибиотикеBeecham). С учeтом данного коммерческого интереса исследования путей биосинтеза клавама были сосредоточены на биосинтезе стрептомицетом S.clavuligerus клавулановой кислоты, 003773 2 являющейся клавамом 5R. Ряд ферментов и кодирующих их генов, связанных с биосинтезом клавулановой кислоты, были идентифицированы, и данные о них опубликованы. Примеры таких публикаций включают Hodgson J.E. et al.,1995, Gene, 166, 49-55, Aidoo К.A. et al., 1994,Gene, 147, 41-46; Paradkar A.S. et al., 1995, J.Bacteriol., 177 (5), 1307-1314. Напротив, ничего неизвестно о биосинтезе и генетике клавамов 5S помимо клаваминовой кислоты, являющейся предшественником клавулановой кислоты, образующейся при действии синтазы клаваминовой кислоты в биосинтетическом пути клавулановой кислоты в S.clavuligerus. Эксперименты по клонированию генов позволили установить, что S.clavuligerus имеет две изоформы синтазы клавулановой кислоты - cas1 и cas2 [Marsh E.N. et al., 1992, Biochemistry, 31,12648-12657]: обе они могут вносить свой вклад в выработку клавулановой кислоты в определенных условиях питательной среды [ParadkarA.S. et al., 1995, J. Bacteriol., 177 (5), 1307-1314]. Активность синтазы клавулановой кислоты также была выявлена у других микроорганизмов, вырабатывающих клавулановую кислоту например, у S.jumonjinensis [Vidal С.М., 1987,ES 550549] и у S. katsurahamanus [Kitano К. etS.antibioticos, являющегося продуцентом клавама 5S - валклавама [Baldwin J.E. et al., 1994, Tetrahedron Letts. 35 (17), 2783-2786]. В последней публикации также сообщается о том, чтоS.antibioticos проявляет активность амидиногидролазы проклаваминовой кислоты - т.е. еще одного фермента, для которого известно участие в биосинтезе клавулановой кислоты. Все другие гены,идентифицированные уS.clavuligerus, как участвующие в биосинтезе клавамов, также описываются, как необходимые компоненты биосинтеза клавулановой кислотыK.A. et al., 1994, Gene, 147, 41-46], и при этом ни об одном из них не сообщалось, как о факторе,специфичном для биосинтеза клавамов 5S. Авторы заявки идентифицировали определенные гены, которые являются специфичными для биосинтеза клавамов 5S, примерами которых являются С 2 С и 2 НМС у S.clavuligerus. В соответствии с настоящим изобретением представляется ДНК, включающая один или большее число генов, которые специфичны для биосинтеза клавамов 5S в S.clavuligerus и которые необязательны для биосинтеза клавамов 5R (т.е. клавулановой кислоты). Под понятием "ген" по использованию в данном тексте также понимается любой регуляторный сегмент, необходимый для функционирования или экспрессии гена. В предпочтительном варианте ДНК является таковой, как определено на фигуре. Предпочтительно ДНК включает нуклеотидные последовательности, определнные на фигуре такими обозначениями, какorfdwn3. Настоящее изобретение также представляет белки, кодируемые упомянутой ДНК. Настоящее изобретение также представляет векторы, включающие ДНК по настоящему изобретению, и организмы-хозяева, несущие такие векторы. К удивлению авторов заявки, было обнаружено, что, когда, по крайней мере, один из генов по настоящему изобретению оказывается дефектным, то количество вырабатываемой данным организмом клавулановой кислоты увеличивается. Соответственно, настоящее изобретение также представляет способы увеличения количества клавулановой кислоты, вырабатываемой подходящим микроорганизмом. В одном из вариантов изобретения возможно манипулирование идентифицированными генами с целью получения организма, способного вырабатывать увеличенное количество клавама, соответственно клавулановой кислоты. Результаты проделанной работы также позволяют усовершенствовать способ идентификации организмов, характеризующихся высоким уровнем выработки клавулановой кислоты, включающий предварительный скрининг организмов с низким уровнем выработки клавамов 5S или с отсутствием таковой (например, с помощью ВЭЖХ и/или биотеста на клавамы в соответствии с описанным в примерах настоящего изобретения). Соответственно, гены, связанные с синтезом клавамов 5S по настоящему изобретению,могут быть получены с применением стандартных методов клонирования (таких как ПЦР),основываясь на приведeнных здесь нуклеотидных последовательностях. Функция такого гена может быть нарушена, или он может быть элиминирован-делетирован с помощью генетических методик, таких как разрушение гена [Aidoo К.A. et al., 1994, Gene, 147, 41-46], случайный мутагенез, сайт-направленный мутагенез и использование антисмысловой РНК. Ещe в одном варианте настоящего изобретения представляются плазмиды, включающие один или большее число дефектных генов, преимущественно плазмиды рСЕС 060, рСЕС 061,pDES3, pCEC056 и рСЕС 057, описанные ниже. Гены могут быть превращены в дефектные различными путями, например, путем вставки фрагмента ДНК, кодирующего ген резистентности к антибиотику, который полностью уничтожает активность данного гена. С другой стороны, могут быть использованы другие варианты для формирования дефектных генов, включая вставку ДНК, не кодирующую ген резистентности к антибиотику, делегирование части данного гена, делегирование всего этого гена или изменение нуклеотидной последовательности данного гена путем добавления и (или) замещения одного или большего числа нуклеотидов. Дефектные гены по настоящему изобретению могут характеризоваться дефектностью, выра 003773 4 женной в различной степени. Они могут быть дефектными в том смысле, что их активность полностью уничтожена, или же определнная доля их исходной активности может быть сохранена. Соответственно, плазмиды по настоящему изобретению используют для трансформации организма, такого как S.clavuligerus, например,штамма АТСС 27064 (который соответствуетS.clavuligerus NRRL 3585). Подходящие методы трансформации могут быть найдены в относящихся к данной проблеме источниках, включаяA.S.Jensen S.E., 1995, J. Bacteriol., 177 (5),1307-1314. Штаммы вида стрептомицетов S.clavuligerus используются в промышленном масштабе для получения клавулановой кислоты (в виде клавуната калия). При этом Британская и Североамериканская Фармакопеи в отношении клавуната калия (Британская Фармакопея, 1993,приложение 1994, стр. 1362-1363 и Официальные монографии Фармакопеи США, 1995, USP 23 NF18 р. 384-385) особенно тщательно контролируют количества клавам-2-карбоксилата,являющегося токсичным клавамом 5S. Далее в следующем варианте настоящего изобретения представляется организм, способный вырабатывать увеличенное количество клавулановой кислоты, но при этом неспособный вырабатывать С 2 С или способный вырабатывать увеличенное количество клавулановой кислоты и при этом вырабатывающий только очень незначительное количество С 2 С. Соответственно, вырабатывающий клавулановую кислоту организм нест один или большее число связанных с синтезом клавамов дефектных генов и предпочтительно является штаммS.clavuligerus 56-1A, 56-3 А, 57-2 В, 57-1C, 60-1A,60-2A, 60-3 А, 61-1A, 61-2A, 61-3 А и 61-4A, описанных ниже. Такие организмы пригодны для получения клавулановой кислоты без продуцирования являющегося клавамом 5S клавам-2 карбоксилата или при существенно сниженном продуцировании клавам-2-карбоксилата. Примеры В примерах все методы, за исключением специально оговорнных, соответствуют Sambrook J., Fritsch E.F.Maniatis Т., 1989, Molecular Cloning: a Laboratory Manual, 2d Ed. илиof Streptomyces: a Cloning Manual и Paradkar A.S.Jensen S.E., 1995, J. Bacteriol., 177 (5), 13071314. 1. Секвенирование ДНК хромосомы Streptomyces clavuligerus на участках выше и ниже расположения гена cas1 клаваминатсинтазы. 5 А. Выделение гена cas1. Для выделения фрагментов хромосомной ДНК Streptomyces clavuligerus NRRL 3585, кодирующих изоформу 1 клаваминат-синтазы(cas1), был синтезирован олигонуклеотидный зонд RM01 с учетом параметров нуклеотидов 944 ранее секвенированной последовательности гена cas1 (Marsh E.N., Chang M.D.T.Townsend С.А, 1992, Biochemistry, 31, 12648-12657). Олигонуклеотиды были получены с использованием стандартных методов на ДНК-синтезаторе Applied Biosystems, модель 391. Последовательность зонда RM01, состоящая из 36 нуклеотидов, была синтезирована в антипараллельном направлении по отношению к опубликованнойMarsh et al. (1992, там же) RM01, помечена изотопным способом с 32 Р с использованием стандартных методик концевого мечения олигонуклеотидных ДНК (Sambrook et al., 1989, там же) и использована для скрининга космидной геномной ДНК-клонотеки Streptomyces clavuligerus с помощью Саузерн-блот-гибридизации по методу, описанному StahlAmann (In: Nucleic acidSons, p. 205-248, 1991). Геномная ДНКклонотека S.clavuligerus была получена на космиде pLAFR3 согласно методу, описанному уDoran J.L. et al., 1990, J. Bacteriol., 172 (9), 49094918. Космидные блоты геномной клонотеки S.clavuligerus инкубировали в течение ночи с изотопно меченным зондом RM01 при 60 С в растворе, содержащем 5xSSC, 5x раствора Данхардта и 0,5% натрийдодецилсульфата (1 хSDS: 0,15 М NaCl+0,015 М цитрата натрия; 1 х раствора Данхардта; 0,02% BSA, 0,02% Фиколла и 0,02% PVP). Затем блоты промывали при 68 С в течение 30 мин в растворе 0,5 хSSC+0,1% SDS. Один космидный клон - 10D7 - был выделен,поскольку он жeстко гибридизовал с RM01 и проявлял гибридизационные сигналы в ходе расщепления рестриктазами SacI и EcoRI, что согласуется с сигналами гибридизации, выявляемыми в аналогичных экспериментах по расщеплению полногеномной ДНК S.clavuligerus. В. Секвенирование ДНК, фланкирующей ген сas1 S.clavuligerus. Частичная рестрикционная карта космиды 10D7 была формирована с использованием рестриктазных эндонуклеаз SaсI, NcoI и KpnI. Данные Cayзерн-блот-гибридизации междуRM01 и различными продуктами рестрикции ДНК 10D7 показали, что наиболее вероятно генcas1 локализован в одном из концов субфрагмента ДНК длиной 7 тысяч пар нуклеотидов,вырезаемого рестриктазами SacI-SacI. Этот фрагмент включает открытую рамку считывания гена cas1 и еще примерно 6 тысяч пар нуклеотидов вышерасположенной ДНК. Фрагмент длиной 7 тысяч пар нуклеотидов затем субклонировали из расщеплeнной SacI космиды 10D7 в 6 фагмидный вектор pBluescriptII SK+ (2,96 тысяч пар нуклеотидов; Stratagene), формируя таким образом рекомбинантную плазмиду рСЕС 007. Для облегчения процедуры секвенирования хромосомы на участке выше гена cas1 вырезаемый рестриктазами NcoI-NcoI субфрагмент длиной 3 тысячи пар нуклеотидов из состава субфрагмента SacI-SacI длиной 7 тысяч пар нуклеотидов был субклонирован в плазмидуMessing, 1987, Meth. Enzymol., 153, 3-11) в обоих направлениях с получением в результате рекомбинантных плазмид рСЕС 026 и рСЕС 027. Субфрагмент длиной 3 тысячи пар нуклеотидов включает участок гена cas1, кодирующий Nконцевую часть белка, и еще примерно 2,6 тысяч пар нуклеотидов расположенной выше ДНК. Сгруппированные по месту, перекрывающиеся делеции были индуцированы в плазмидах рСЕС 026 и рСЕС 027 с использованием расщепления экзонуклеазой III и нуклеазой S1 (Sambrook et al., 1989, там же), и последовательность ДНК во фрагменте NcoI-NcoI длиной 3 тысячи пар нуклеотидов была определена по обеим цепям с применением метода дидезокситерминации цепи по Сэйнджеру (Sanger F., Nicklen S.Coulson A.R., 1977, Proc. Natl. Acad. Sci. USA,74, 5463-5467) с использованием набора реактивов для дезокситерминации Taq dyedeoxyа и автоматического секвенсора Applied Biosystems модели 373 А. Для определения последовательности ДНК хромосомы, непосредственно примыкающей снизу к 3'-концу гена cas1, был субклонирован вырезаемый рестриктазами KpnI-EcoRI фрагмент длиной 4,3 тысяч пар нуклеотидов из космиды 10D7 в вектор pBluescriptII SK+ с образованием плазмиды рСЕС 018. Из состава рСЕС 018 вырезаемый рестриктазами SaсI-SacI субфрагмент длиной 3,7 тысяч пар нуклеотидов был клонирован в плазмиду pSL1180 (3422 тпн:Pharmacia) ; один из SacI-маркируемых концов этого фрагмента перекрывается со стопкодоном TGA гена cas1, другой кодирующий вектор. Оба направления фрагмента длиной 3,7 тысяч пар нуклеотидов были получены при субклонировании и полученные в результате рекомбинантные плазмиды обозначили рСЕС 023 и рСЕС 024. Сгруппированные по месту, перекрывающиеся делеции были индуцированы в обеих плазмидах и была определена последовательность ДНК в обеих цепях фрагмента длиной 3,7 тысяч пар нуклеотидов. Нуклеотидная последовательность хромосомы S.clavuligerus, выявленная в описанных экспериментах, включающая и фланкирующая ген cas1, показана на фигуре. 2. Функциональный анализ открытых рамок считывания, фланкирующих ген cas1. Компьютерный анализ последовательности ДНК, находящейся выше гена cas1, позволяет предположить присутствие двух полных orf(открытых рамок считывания) и одной неполной orf. Все три orf локализованы на противоположной цепи по отношению к кодирующей цепи ДНК гена cas1 и, соответственно, имеют противоположную ориентацию. Первая открытая рамка считывания, обозначенная orfup1,расположена в 579 парах нуклеотидов выше гена cas1 и кодирует полипептид, состоящий из 344 аминокислот. Вторая открытая рамка считывания, обозначенная orfup2, расположена в 437 парах нуклеотидов перед 3'-концом orfup1 и кодирует полипептид, состоящий из 151 аминокислоты. Старт-кодон открытой рамки orfup3 перекрывает трансляционный стоп-кодон открытой рамки orfup2, что подтверждает наличие трансляционной взаимосвязанности этих двухorf. В пределах фрагмента NcoI-NcoI длиной 3 тысячи пар нуклеотидов не локализованы трансляционные стоп-кодоны открытой рамкиorfup3. Аналогичный анализ последовательности ДНК, расположенной ниже гена cas1, позволил предположить присутствие двух полных orf и одной неполной orf. Две из этих orf расположены на противоположной цепи ДНК по отношению к кодирующей последовательности генаcas1 и характеризуются противоположной ориентацией по отношению к cas1. Третья orf расположена на той же цепи, что и ген cas1, т.е. ориентирована в том же направлении после генаcas1. Первая от 3'-конца cas1 открытая рамка,обозначенная orfdwn1, расположена в 373 парах нуклеотидов ниже и кодирует полипептид, состоящий из 328 аминокислот. Вторая открытая рамка считывания orfdwn2 расположена в 55 парах нуклеотидов выше orfdwn1 и кодирует полипептид аа, состоящий из 394 аминокислот. В 315 парах нуклеотидов выше orfdwn2 и на противоположной цепи находится открытая рамка orfdwn3. Поскольку стоп-кодон в пределах фрагмента длиной 3,7 тысяч пар нуклеотидов в составе orfdwn3 не обнаружен, ее часть кодирует неполный полипептид из 219 аминокислот. Разрушение гена в открытых рамках считывания orfup и orfdwn Для оценки вероятной роли открытых рамок считывания, фланкирующих cas1, в биосинтезе клавулановой кислоты и других клавамов,вырабатываемых S.clavuligerus, с помощью методик замещения генов были получены делеционные мутанты или осуществлена инактивация вставками. Метод, использовавшийся для разрушения и замещения генов, был по сути таким же, какой описан у ParadkarJensen (1995, там же).A. orfup1. Фрагмент NcoI-NcoI длиной 1,5 тысяч пар нуклеотидов, несущий ген резистентности к апрамицину (арrr), сконструированный согласно описанному у ParadkarJensen (1995, там же),был обработан фрагментом Клнова с целью 8 получения тупых концов (Sambrook et al., 1989,там же) и затем лигирован в состав рСЕС 026,которую расщепляли рестриктазой BsaBI и так же обрабатывали фрагментом Клнова. Плазмида рСЕС 026 несла сайт узнавания BsaBI, расположенный в пределах orfup1 в 636 парах нуклеотидов от старт-кодона. Лигационную смесь использовали для трансформации компетентных клеток E.coli штамма GM 2163 (получены отNew England Biolabs, USA; Marinus M.G. et al.,1983, Mol. Gen. Genet., 122, 288-289) до достижения резистентности к апрамицину. Из полученных в результате трансформантов были выделены два клона, включающие плазмиды рСЕС 054 и рСЕС 055; при проведении рестрикционного анализа рСЕС 054 было установлено присутствие арrr-фрагмента, включeнного в той же ориентации, что и orfup1, в то время как в плазмиде рСЕС 055 он имелся в противоположной ориентации. Для внесения рСЕС 054 в клеткиS.clavuligerus плазмидную ДНК расщепляли рестриктазами BamHI и HindIII и лигировали в большое число копий стрептомицетного вектораpIJ486 (6,2 тысяч пар нуклеотидов: Ward et al.,1986, Mol. Gen. Genet., 203, 468-478). Лигационную смесь затем использовали для трансформации компетентных клеток E.Coli GM2163 до достижения резистентности к апрамицину. Из полученных в результате трансформантов был выделен один клон, несущий бифункциональную плазмиду рСЕС 061. Эту плазмиду затем использовали для трансформации S.clavuligerusNRRL 3585. Полученные в результате трансформанты включали в два последовательных круга споруляции на неселективной среде и затем переносили путeм отпечатков на среду, содержащую антибиотик с целью идентификации резистентных к апрамицину и чувствительных к тиострептону трансформантов. В результате этой процедуры были отобраны четыре предполагаемых мутанта (обозначены 61-1 А, 61-2 А,61-3 А и 61-4 А) для проведения дальнейшего анализа. Для подтверждения того, что эти предполагаемые мутанты были разрушены по открытой рамке orfup1, геномная ДНК была выделена из состава двух изолятов 61-1 А и 61-2 А, расщеплена рестриктазой SacI и подвергнута Саузернблоттингу. Полученные в результате гибридные блоты соответствовали имевшим место двойным кроссоверным вариантам и подтвердили,что данные мутанты действительно являются мутантами по разрушающему замещению генаorfup1. Мутанты 61-1 А, 61-2 А, 61-3 А и 61-4 А выращивали в среде Соя-Флоура и культуральные надосадочные фракции тестировали методом ВЭЖХ на выработку клавулановой кислоты и клавамов. Состав среды Соя-Флоура и метод тестирования клавамов с помощью ВЭЖХ были описаны ранее (ParadkarJensen, 1995, там же), 9 за исключением того, что проточный буфер для теста ВЭЖХ включал 0,1 М NаН 2 РO4+6% метанола, рН=3,68 (рН доводили с помощью ледяной уксусной кислоты). Анализ с помощью ВЭЖХ показал, что ни один из тестированных мутантой не вырабатывает выявляемое количество клавам-2-карбоксилата или 2 гидроксиметилклавама. Более того, когда культуральные надосадочные фракции были протестированы по действию на палочку Bacillus sp.Kellett (1983, J. Antibiotics, 36, 208-212), ни один из мутантов не вырабатывал выявляемого количества аланилклавама. С другой стороны, тестирование с помощью ВЭЖХ культуральной надосадочной фракции показало, что мутанты характеризуются более высоким уровнем выработки клавулановой кислоты в сравнении с диким типом (табл. 1). Таблица 1 Титры клавулановой кислоты (КК) у мутантов по orfup1 в тестах с использованием шейкерных колб Штамм Делеция orfup1. Эксперименты по клонированию были предприняты для получения делении гена длиной 654 нуклеотида между сайтами рестрикцииAatII в пределах orfup1. Продукты ПЦР были получены с использованием олигонуклеотидных затравок, приведенных ниже, и описанной выше плазмиды рСЕС 061, взятой в качестве матрицы. Исходная нуклеотидная последовательность была изменена с целью внесения сайта PstI в состав затравки 11 и сайта SphI в состав затравки 14. Пара 1 олигонуклеотидов для получения ПЦР-продукта 1: Затравка 11 5'-CTGACGCTGCAGGAGGAAGTCCCGC 3' Затравка 12 5'-CGGGGCGAGGACGTCGTCCCGATCC 3' Пара 2 олигонуклеотидов для получения ПЦР-продукта 2: Затравка 13 5'-GAGCCCCTGGACGTCGGCGGTGTCC 3' Затравка 14 5'-GACGGTGCATGCTCAGCAGGGAGCG 3' Стандартная полимеразная цепная реакция была проведена с использованием термоциклера РТС-200 (GRI: Felsted, Dunmow, Essex, CM6 3LD, Великобритания). ПЦР-продукт 1 был получен с использованием затравок 11 и 12. Этот продукт имел длину примерно 1 тысячу пар нуклеотидов и включал 10 С-концевую часть orfup1 от второго сайта рестрикции AatII и нижерасположенные сегменты. ПЦР-продукт 2 был получен с использованием затравок 13 и 14. Этот продукт имел длину примерно 1,1 тысяч пар нуклеотидов и включалN-концевую часть orfup1 от первого сайта рестрикции AatII и вышерасположенные сегменты. ПЦР-продукт 2 лигировали в расщеплeнный рестриктазой Srfl вектор pCR-ScriptAmp SK(+) в соответствии с прилагающейся инструкцией производителя (Stratagene Ltd.,Cambridge Science Park, Milton Road, CambridgeCB4 4GF). Лигационную смесь использовали для трансформации суперкомпетентных клеток кишечной палочки Epicurian E.coli XL1-BlueMRF'Kan (получены от Strategene) до достижения резистентности к ампициллину (в соответствии с рекомендациями производителя). Плазмидную ДНК выделяли из полученных в результате трансформантов, и проведенный рестрикционный анализ ДНК показал, что 7 клонов включают плазмиду, в состав которой был лигирован ПЦР-продукт 2. Одна из этих плазмид была обозначена pDES1. ПЦР-продукт 1 был расщеплен рестриктазами PstI и AatII и полученную в результате ДНК разделяли на фракции с помощью электрофореза в агарозном геле. Фрагмент длиной 1 тысяча пар нуклеотидов вырезали и элюировали из геля с использованием набора реактивовALI 3AW). Затем выделенный фрагмент был лигирован в плазмиду pDES1, обработанную рестриктазами AatII и PstI. Лигационную смесь использовали для трансформации компетентных клеток E.coli XL1-Blue (получены от Stratagene) до достижения резистентности к апрамицину (в соответствии с рекомендациями производителя). Из полученных в результате трансформантов выделяли плазмидную ДНК, и проведенный рестрикционный анализ показал, чти один клон включал плазмиду, в состав которой был лигирован ПЦР-продукт 1. Эту плазмиду обозначилиpDES2. Для внесения плазмиды pDES2 в клеткиS.clavuligerus плазмиду подвергали дальнейшей модификации с целью внесения точки начала репликации, которая бы могла функционировать в клетках стрептомицетов. Для достижения этого плазмидную ДНК pDES2 расщепляли рестриктазами EcoRI и HindIII и лигировали в большое число копий стрептомицетного вектораpIJ486 (6,2 тысяч пар нуклеотидов: Ward et al.,1986, Mol. Gen. Genet., 203, 468-478), также подвергнутого обработке рестриктазами EcoRI и HindIII. Лигационную смесь использовали для трансформации компетентных клеток E.coli штамма JM109 (Stratagene Ltd.) до достижения резистентности к ампицилину. Плазмидную ДНК выделяли из полученных в результате трансформантов, и рестрикционный анализ показал, что 6 клонов несутpDES2, включающую pIJ486. Одна из таких плазмид была обозначена pDES3. ПлазмидуpDES3 использовали для трансформации штамма S.clavuligerus, у которого ген orfup1 уже был разрушен с помощью вставки гена резистентности к апрамицину (см. описание выше). Резистентные к тиострептону трансформанты были отобраны, и эти трансформанты были затем подвергнуты трем циклам споруляции на неселективной среде и скринированы на утрату резистентности к апрамицину. В результате этой процедуры были идентифицированы 45 мутантов, у которых резистенитность к апрамицину была утрачена. Они затем были протестированы с помощью ВЭЖХ, что подтвердило для этих штаммов, как и для вариантов 61-1 А, 61-2 А, 613 А и 61-4 А с разрушенным геном orfup1, неспособность вырабатывать клавам-2-карбоксилат и 2-гидроксиметилклавам при проведении ферментации в условиях, в которых в норме эти формы клавама вырабатываются. В. orfdwn1 и orfdwn2. Мутант по делеции-замещению в orfdwn1 и orfdwn2 был сформирован начиная с расщепления плазмиды рСЕС 018 (7,3 тысяч пар нуклеотидов) рестриктазой NcoI и высвобождения субфрагмента длиной 1 тысячу пар нуклеотидов, включающий большую часть orfdwn1 и часть orfdwn2. Продукты расщепления разделяли на фракции с помощью электрофореза в агарозном геле и фрагмент длиной 6,3 тысяч пар нуклеотидов вырезали и элюировали из геля. Этот фрагмент затем лигировали в вырезанныйNcoI-NcoI фрагмент ДНК, несущий ген арrr, и использовали для трансформации E.coli XLlBlue до достижения резистентности к апрамицину. В результате эксперимента был получен единственный клон, однако, данные рестрикционного анализа полученной в результате рекомбинантной плазмиды показали, что в состав делеционной плазмиды лигированными оказались две копии фрагмента резистентности к апрамицину. Для удаления лишней копии арrrфрагмента плазмиду расщепляли рестриктазойNcoI и самолигировали. Лигационную смесь использовали для трансформации клеток E.coliGM2163 до достижения резистентности к апрамицину. Из этих трансформантов были выделены два клона, которые несли плазмиды рСЕС 052 и рСЕС 053, каждая из которых включала по одной копии aprr-фрагмента; плазмида рСЕС 052 несла арrr-фрагмент в обратной ориентации по отношению к orfdwn1 и orfdwn2, в то время как плазмида рСЕС 053 несла aprrфрагмент, встроенный в той же ориентации, что в orfdwn1 и orfdwn2. Бифункциональный вариант плазмиды рСЕС 052 был сконструирован путeм лигирования расщеплeнной рестриктазой BamHI плазмиды рСЕС 052 со сходным образом обработаннойE.coli GM2163 до достижения резистентности к 12 апрамицину. В результате этого эксперимента был выделен один клон, который включал бифункциональную плазмиду рСЕС 060. Эта плазмида была использована для трансформацииS.clavuligerus 3585 дикого типа до достижения резистентности к апрамицину и тиострептону. Полученные в результате трансформанты были использованы в двух циклах споруляции в неселективной среде и затем перенесены с помощью отпечатков на среду, содержащую антибиотик, с целью идентификации колоний, резистентных к апрамицину и чувствительных к тиострептону. Три предполагаемых мутанта (60-1 А, 60-2 А и 60-3 А) были выбраны для дальнейшего анализа. Для подтверждения подлинности этих предполагаемых мутантов геномная ДНК была выделена из штаммов 60-1 А и 60-2 А и подвергнута обработке рестриктазами SacI или BstEII с последующим анализом по Саузерну. Полученные в данном эксперименте гибридизационные бэнды соответствовали обоим штаммам, которые претерпели двойной кроссинговер, подтверждая, что эти мутанты являются истинными мутантами по разрушению-замещению генов вorfdwn1/2. Когда эти мутантные штаммы культивировали в среде Соя-Флоура и соответствующие культуральные надосадочные фракции тестировали с помощью ВЭЖХ, ни один из мутантов не вырабатывал выявляемого количества клавам-2 карбоксилата или 2-гидроксимстилклавама. Биотестирование культуральной надосадочной фракции показало, что мутанты также не способны вырабатывать выявляемое количество аланилклавама. Как и в случае с мутантами поorfup1, мутанты по orfdwn1/2 оказались способными вырабатывать более высокое по сравнению с диким типом количество клавулановой кислоты (табл. 2). Таблица 2 Титры клавулановой кислоты (КК) у мутантов по orfdwn1/2 в тестах с использованием шейкерных колб Штаммorfdwn3. Для разрушения гена orfdwn3 плазмиду рСЕС 023 (включающую фрагмент длиной 3,7 тысяч пар нуклеотидов ДНК, расположенной ниже гена cas1, субклонированной в составpSL1180) расщепляли рестриктазой NcoI и затем самолигировали. После трансформации клеток E.coli полученной лигационной смесью был выделен клон, несущий плазмиду рСЕС 031. Эта плазмида сохраняла только маркируемый рестриктазами NcoI-EcoRI фрагмент длиной 1,9 ты 13 сяч пар нуклеотидов, кодирующий частьorfdwn2 и неполную orfdwn3. Анализ последовательности ДНК показал, что плазмида рСЕС 031 имеет уникальный сайт рестрикцииBstEII в 158 парах нуклеотидов от старт-кодонаorfdwn3. Затем плазмиду рСЕС 031 расщепляли рестриктазой BstEII, обрабатывали фрагментом Клнова с целью образования тупых концов и затем лигировали в имеющую тупые концы кассету, несущую фактор резистентности к апрамицину. Лигационную смесь использовали для трансформации клеток E.coli GM2163 до достижения резистентности к апрамицину и резистентности к ампициллину. Были отобраны два трансформанта, включавшие, соответственно,плазмиды pCEC050 и pCEC051. Рестрикционный анализ показал, что кассета резистентности к апрамицину была ориентирована таким же образом, что и orfdwn3, в составе рСЕС 050, и в противоположном направлении в составеpCEC051. Обе эти плазмиды затем подвергали обработке рестриктазой HindIII и легировали аналогично расщепленной PIJ486. Затем лигированную смесь раздельно использовали для трансформации E.coli GM2163 до достижения резистентности к апрамицину и ампициллину. Бифункциональные плазмиды рСЕС 056(pCEC051+pIJ486) были выделены из полученных трансформантов. Обе плазмиды затем использовали для трансформации S.clavuligerusNRRL 3585. По одному трансформанту было отобрано в каждом из экспериментов по трансформации,которые использовали в двух последовательных циклах споруляции на неселективной среде с последующим переносом путeм отпечатков на среду, содержащую антибиотик, с целью идентификации трансформантов, резистентных к апрамицину и чувствительных к тиострептону. В результате этой процедуры были выделены два предполагаемых мутанта в потомстве каждого из первичных трансформантов (56-1 А и 563 А для вектора рСЕС 056 и 57-1 С и 57-2 В для вектора РСЕС 057). Для установления подлинности этих предполагаемых мутантов выделяли геномную ДНК этих штаммов и расщепляли рестриктазами SacI или Асс 65I и подвергали Саузерн-блоттингу. Полученные в этом эксперименте гибридизационные бэнды соответствовали обоим штаммам,прошедшим этап двойного кроссинговера, подтверждая, что эти мутанты являются истинными мутантами по разрушению-замещению генаorfdwn3. Когда эти штаммы культивировали в среде Соя-Флоура и соответствующие надосадочные фракции тестировали с помощью ВЭЖХ, мутанты характеризовались выработкой резко сниженного количества клавам-2-карбоксилата или 2-гидроксиметилклавама. Виотестирование этих культуральных надосадочных фракций 14 показало, что мутанты также не способны вырабатывать выявляемое количество аланилклавама. Как и в случае с мутантами по orfup1 иorfdwn1/2, мутанты по orfdwn3 оказываются способными вырабатывать большее по сравнению со штаммами дикого типа количество клавулановой кислоты (табл. 3). Таблица 3 Титры клавулановой кислоты (КК) у мутантов по orfdwn3 в тестах с использованием шейкерных колб Штамм Заявка представляет следующие нуклеотидные последовательности:SEQ ID NO 1: последовательность ДНК на фигуреSEQ ID NO 8: последовательность олигонуклеотидной затравки 11SEQ ID NO 9: последовательность олигонуклеотидной затравки 12SEQ ID NO 10: последовательность олигонуклеотидной затравки 13SEQ ID NO 11: последовательность олигонуклеотидной затравки 14 ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Молекула ДНК, включающая ген cas1 и фланкирующие его участки, специфичные для биосинтеза клавама 5S у микроорганизмовStreptomyces clavuligerus и не являющиеся необходимыми для биосинтеза клавама 5R, имеющая нуклеотидную последовательность SEQ IDNO:1, приведенную на фигуре, или молекула ДНК, которая гибридизуется в жестких условиях с указанной молекулой ДНК. 2. Молекула ДНК, представляющая собой открытую рамку считывания, которая специфична для биосинтеза клавама 5S у S. clavuligerus и не является необходимой для биосинтеза клавама 5R, выбранная из группы, состоящей из а) orfup1, имеющей нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 4; б) orfup2, имеющей нуклеотидную последовательность SEQ ID NО:3; в) orfup3, имеющей нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 2; 15 г) orfdwn1, имеющей нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 5; д) orfdwn2, имеющей нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 6; е) orfdwn3, имеющая нуклеотидную последовательность SEQ ID NO:7. 3. Вектор, включающий молекулу ДНК по п.1 или 2. 4. Плазмида, включающая один или более генов, специфичных для биосинтеза клавама 5S,из которых один или более генов были разрушены или сделаны дефектными иным образом,при том, что гены имеют открытую рамку считывания, выбранную из группы, состоящей из а) orfup1, имеющей нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 4; б) orfup2, имеющей нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 3; в) orfup3, имеющей нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 2; г) orfdwn1, имеющей нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 5; д) orfdwn2, имеющей нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 6; е) orfdwn3, имеющей нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 7. 5. Плазмида по п.4, являющаяся рСЕС 060,рСЕС 061, рСЕС 055, рСЕС 057 или pDES3. 6. Штамм микроорганизма S.clavuligerus,включающий плазмиду по п.4. 7. Штамм микроорганизма S. clavuligerus,включающий один или более генов, специфичных для биосинтеза клавама 5S, из которых один или более генов были разрушены или сделаны дефектными иным образом, при том, что гены имеют открытую рамку считывания, выбранную из группы, состоящей из 16 а) orfup1, имеющей нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 4; б) orfup2, имеющей нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 3; в) orfup3, имеющей нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 2; г) orfdwn1, имеющей нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 5; д) orfdwn2, имеющей нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 6;e) orfdwn3, имеющей нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 7; при том, что указанные разрушенные или дефектные гены были встроены в штамм S. clavuligerus, путем замены генов с использованием плазмиды по п.4. 8. Способ повышения выработки клавама 5R у микроорганизмов S.clavuligerus, включающий следующие стадии: а) разрушение или придание дефектности иным образом ДНК по п.1 или 2; б) введение разрушенной или дефектной ДНК по (а) в микроорганизмы S. clavuligerus,способные вырабатывать клавам 5R; и в) ферментация микроорганизмовS.clavuligerus по (b) в условиях, подходящих для выработки клавама 5R. 9. Способ по п.8, отличающийся тем, что указанная ДНК соответствует открытым рамкам считывания orfup3, orfup2, orfup1, orfdwn1,orfdwn2 или orfdwn3. 10. Способ по п.8 или 9, отличающийся тем, что указанным клавамом 5R является клавулановая кислота.