Рекомбинантный модифицированный вирус осповакцины ankara, содержащий ati-промотор вируса коровьей оспы, и способы применения вируса и промотора

009525 Настоящее изобретение относится к рекомбинантному модифицированному вирусу осповакциныAnkara, включающему в своем гене экспрессионную кассету, включающую ATI-промотор вируса коровьей оспы или его производное, и кодирующую последовательность, где экспрессия данной кодирующей последовательности регулируется с помощью указанного промотора. Данный вирус можно использовать в качестве вакцины или в рамках фармацевтической композиции. Характеристика известного уровня техники Рекомбинантные поксвирусы широко используют для экспрессии чужеродных антигенов в инфицированных клетках. Кроме того, рекомбинантные поксвирусы в настоящее время испытывают в качестве весьма многообещающих вакцин, которые вызывают иммунный ответ против чужеродного антигена,экспрессируемого из поксвирусного вектора. Самыми известными являются, с одной стороны, авипоксвирусы, а с другой - вирусы осповакцины. В патенте США 5736368 и в патенте США 6051410 описан рекомбинантный вирус осповакцины, штамм Wyeth, который экспрессирует антигены и белки ВИЧ. В патенте США 5747324 описан рекомбинантный вирус осповакцины, штамм NYCBH, экспрессирующий гены лентивируса. В ЕР 0243029 описан рекомбинантный вирус осповакцины, штамм WesternReserve, экспрессирующий ретровирусные гены человека. Для экспрессии гетерологичных генов в поксвирусах специалистам в данной области техники известны несколько промоторов, такие как промоторы 30K и 40K (см., например, патент США 5747324),сильный синтетический ранний/поздний промотор (см., например, Sutter и соавт., Vaccine (1994) 12,1032-40), промотор Р 7.5 (см., например, Endo и соавт., J. Gen. Virol. (1991) 72, 699-703) и промотор, полученный из гена ATI (белка включения А-типа) вируса коровьей оспы, (Li и соавт., J. Gen. Virol. (1998) 79, 613). Все эти промоторы используют в рекомбинантных вирусах осповакцины для экспрессии гетерологичных генов и, как показано, очень эффективно экспрессируют указанные гены с образованием относительно высокого количества белка, кодируемого данным гетерологичным геном. Для многих способов вакцинации весьма желательно, чтобы определенный антиген, против которого индуцируется иммунный ответ, экспрессировался в больших количествах. Однако это не всегда происходит. Описано, что разные типы цитотоксических Т-клеток (CTL) индуцируются иммунной системой в зависимости от концентрации данного антигена. CTL низкой авидности индуцируются высокими концентрациями антигена, a CTL высокой авидности индуцируются низкими концентрациями антигена. Было показано, что CTL высокой авидности являются гораздо более эффективными для очистки от заражающего вируса в животных тест-системах по сравнению с CTL низкой авидности. Кроме того, было продемонстрировано, что высокие концентрации антигена могут ингибировать или даже уничтожитьCTL высокой авидности. В итоге показано, что иногда желательно использовать скорее низкие концентрации антигена, чтобы индуцировать большее количество CTL высокой авидности и, тем самым, стимулировать эффективный иммунный ответ (Berzofsky и соавт., Immunological Reviews (1999) 170, 151172). Цель изобретения Цель настоящего изобретения заключается в создании вируса осповакцины на основе системы, позволяющей экспрессировать гетерологичные гены, включенные в геном вируса осповакцины в сравнительно низких количествах, после введения животному, в том числе и человеку, которые могут являться предпосылкой для индукции высоких количеств высокоавидных CTL. Подробное описание настоящего изобретения Данная цель достигается с помощью рекомбинантного модифицированного вируса осповакциныAnkara (MVA), включающего в своем геноме экспрессионную кассету, включающую ATI-промотор вируса коровьей оспы или его производное, и кодирующую последовательность, где экспрессия данной кодирующей последовательности регулируется с помощью указанного промотора. Неожиданно оказалось, что ATI-промотор обладает в MVA сравнительно низкой активностью, хотя в других поксвирусных системах указанный промотор является очень активным (например, Li и соавт., J. Gen. Virol. (1998) 79,613). В противоположность этому, в разделе примеров настоящего описания показано, что ATI-промотор в два-четыре раза менее активен в системах, основанных на MVA, чем в системах, основанных на иных штаммах вируса осповакцины, таких как Western Reserve, Elstree или Copenhagen. Таким образом, данный ATI-промотор в MVA является хорошим промотором для экспрессии генов, кодирующих белки,против которых индуцируются CTL высокой авидности. Модифицированный вирус осповакцины Ankara (MVA) родственен вирусу осповакцины, представителю рода Orthopoxvirus в семействе Poxviridae. MVA был создан в результате 516 последовательных пассажей штамма Ankara вируса осповакцины (CVA) в фибробласты куриного эмбриона (см. обзор Mayr А., и соавт., Infection 3, 6-14 [1975]). В результате этих длительных пассажей получали MVA-вирус с делецией в его геномной последовательности около 31 т.п.н., и по этой причине он описан в качестве имеющего высокое ограничение размножения клеткой-хозяином, он может размножаться в клетках птиц(Meyer H. и соавт., J. Gen. Virol. 72, 1031-1038 [1991]). На разных животных моделях показано, что получающийся MVA существенно авирулентен (Mayr А.Danner К. [1978] Dev. Biol. Stand. 41:225-34). Кроме того, данный MVA-штамм тестировали в клинических опытах в качестве вакцины для иммунизации против заболевания человека натуральной оспой (Mayr и соавт., Zbl. Bakt. Hyg. I, Abt. Org. В 167, 375-1 009525 390 [1987], Stickl и соавт., Dtsch. med. Wschr. 99, 2386-2392 [1974]). В соответствии с настоящим изобретением можно использовать любой штамм MVA. Примеры вирусных штаммов MVA, используемых в соответствии с настоящим изобретением и депонированных в соответствии с Будапештским Договором, представляют собой штаммы MVA 572 и 575, депонированные в Европейской Коллекции Культур Животных Клеток (ЕСАСС), Salisbury (UK), внесенные в реестр ЕСАСС, соответственно, под номером V94012707 и номером V00120707, a MVA-BN внесен в реестр ЕСАСС под номером V00083008. Наиболее предпочтительным штаммом MVA является MVA-BN или его производное. Признаки штамма MVA-BN, описание биологических испытаний, позволяющих определить, является ли штаммMVA штаммом MVA-BN или его производным, а также описание способов, позволяющих получить штамм MVA-BN или его производное, раскрыты в WO 02/42480. Содержание данной заявки включено в настоящее изобретение путем ссылки. Чтобы размножить MVA, эукариотические клетки заражают данным вирусом. Данные эукариотические клетки являются клетками, которые восприимчивы к заражению соответствующим поксвирусом с последующей репликацией и образованием инфекционного вируса. Для MVA примером данного типа клеток являются фибробласты куриного эмбриона (CEF) и ВНК-клетки (Drexler I., Heller К., Wahren В.,Erfle V. and Sutter G. "Highly attenuated modified vaccinia Ankara replicates in baby hamster kidney cells, a(1998), 79, 347-352). Клетки CEF можно культивировать в условиях, известных специалистам в данной области техники. Предпочтительно клетки CEF культивируют в бессывороточной среде в неподвижных матрасах (колбах) для культивирования или в бутылях, содержимое которых перемешивается при их вращении. Инкубацию предпочтительно осуществляют в течение 48-96 ч при 372 С. Для MVAзаражения предпочтительно используют множественное заражение (MOI) от 0,05 до 1 TCID50, а инкубацию предпочтительно осуществляют в течение 48-72 ч при 372 С. Последовательность промотора гена белка включения А-типа вируса коровьей оспы (ATIпромотор) известна специалистам в данной области техники. В этой связи сошлемся на входной каталожный номер D00319 в Genebank. Предпочтительная последовательность ATI-промотора представлена в виде SEQ ID No: 1 и имеет следующий вид: 5' GTTTT GAATA AAATT TTTTT ATAAT AAAT 3' В соответствии с настоящим изобретением представляется возможным использовать ATI-промотор,который указан в SEQ ID No: 1, или использовать производное данного ATI-промотора, которое может представлять собой субпоследовательность последовательности в соответствии с SEQ ID No: 1. Термин"субпоследовательность последовательности в соответствии с SEQ ID No: 1" относится к более коротким фрагментам последовательности SEQ ID No: 1, которые все еще активны в качестве промотора, в частности, в качестве позднего промотора вируса осповакцины. Типичный фрагмент последовательности SEQID No: 1 обладает длиной по меньшей мере в 10 нуклеотидов, более предпочтительно по меньшей мере в 15 нуклеотидов, еще более предпочтительно по меньшей мере в 20 нуклеотидов, наиболее предпочтительно по меньшей мере в 25 нуклеотидов последовательности SEQ ID No: 1. Данная субпоследовательность предпочтительно может включать 25-29 нуклеотидов из SEQ ID No: 1, т.е. представлять последовательность 5'-ТАААТ-3', локализованную на 3'-конце SEQ ID No: 1. Данная субпоследовательность может также включать 22-29 нуклеотидов SEQ ID No: 1, т.е. представлять последовательность 5'ТААТАААТ-3', локализованную на 3'-конце SEQ ID No: 1. Данный промотор можно встроить выше ("справа") от кодирующей последовательности таким образом, что нуклеотиды 28-29 SEQ ID No: 1 (подчеркнуты в вышеприведенной последовательности) составляют часть стартового кодона трансляции 5' ATG 3'. В качестве альтернативы данный промотор может быть отделен несколькими нуклеотидами от стартового кодона трансляции. Спейсер между 3'концом данного промотора в соответствии с SEQ ID No: 1 и А в стартовом кодоне 5' ATG 3' предпочтительно меньше 100 нуклеотидов, более предпочтительно составляет меньше 50 нуклеотидов и еще более предпочтительно меньше 25 нуклеотидов. Однако данный спейсер может быть и гораздо длиннее до тех пор, пока данный промотор еще способен управлять экспрессией кодирующей последовательности, локализованной "правее" промотора. Производное данного ATI-промотора может также представлять собой последовательность, которая обладает одной или несколькими нуклеотидными заменами, делециями и/или вставками относительно последовательности SEQ ID No: 1, где указанные производные все еще активны в качестве промотора, в частности, в качестве позднего промотора вируса осповакцины. Последовательность, обладающая одной или несколькими нуклеотидными заменами, представляет собой последовательность, в которой один или несколько нуклеотидов последовательности, в соответствии с SEQ ID No: 1, замещены отличными нуклеотидами. Последовательность, обладающая одной или несколькими нуклеотидными вставками, представляет собой последовательность, в которой один или несколько нуклеотидов встроены в одно или в несколько мест последовательности в соответствии с SEQID No: 1. Последовательность, обладающая одной или несколькими нуклеотидными делециями, пред-2 009525 ставляет собой последовательность, в которой один или несколько нуклеотидов последовательности, в соответствии с SEQ ID No: 1, делетированы в одном или в нескольких местах. В производных SEQ IDNo: 1 делеции, замены и вставки могут объединяться в одной последовательности. Предпочтительно данное производное обладает по меньшей мере 40% гомологией, более предпочтительно по меньшей мере 60% гомологией, еще более предпочтительно по меньшей мере 80% гомологией, наиболее предпочтительно по меньшей мере 90% гомологией при сравнении с последовательностью SEQ ID No: 1. В соответствии с наиболее предпочтительным вариантом осуществления настоящего изобретения не более 6 нуклеотидов, еще более предпочтительно не более 3 нуклеотидов замещены, делетированы и/или встроены в последовательность SEQ ID No: 1. В частности, предпочтительно сохранение с 25 по 29 нуклеотид SEQ ID No: 1, т.е. сохранение последовательности 5'-ТАААТ-3' в данном промоторе, чтобы достичь максимальной промоторной активности. Предпочтительным также может быть сохранение нуклеотидов с 22 по 29 SEQ ID No: 1, т.е. последовательности 5'-ТААТАААТ-3' в данном промоторе. Совокупность документов предшествующего уровня техники позволяет специалистам в данной области техники предсказать, какие из производных SEQ ID No: 1 все же обладают биологической активностью в качестве промотора вируса осповакцины, в частности, позднего промотора вируса осповакцины. В этой связи следует обратиться к ссылке Chakrarbarti и соавт., Biotechniques (1997) 23, 1094-1097 иDavison and Moss, J. Mol. Biol. (1989) 210, 771-784. Кроме того, специалистам в данной области техники легко проверить, является ли какой-либо фрагмент активным в качестве промотора вируса осповакцины,в частности, позднего промотора. В частности, в плазмидной конструкции производное данной последовательности можно клонировать "левее" от репортерного гена. Указанную конструкцию можно трансфицировать в эукариотическую клетку или клеточную линию, такую как CEF- или ВНК-клетки, которые инфицированы с MVA. Затем определяют экспрессию данного репортерного гена и сравнивают с экспрессией репортерного гена, контролируемого промотором в соответствии с SEQ ID No: 1. Эти экспериментальные данные соответствуют примеру, представленному в настоящем описании. Производное в соответствии с настоящим изобретением представляет собой производное, обладающее в указанной тестсистеме по меньшей мере 10% промоторной активностью, предпочтительно по меньшей мере 30% промоторной активностью, более предпочтительно по меньшей мере 50% промоторной активностью, еще более предпочтительно по меньшей мере 70% промоторной активностью, наиболее предпочтительно 90% промоторной активностью по сравнению с активностью промотора последовательности SEQ ID No: 1. Кроме того, в рамках настоящего изобретения находятся и производные SEQ ID No: 1, обладающие более высокой промоторной активностью, чем SEQ ID No: 1. В более общих чертах настоящее изобретение относится к использованию ATI-промотора вируса коровьей оспы или его производного, как указано выше, для экспрессии кодирующей последовательности в MVA.ATI-промотор можно использовать для экспрессии гена, который уже является частью MVAгенома. Такой ген может представлять собой ген, который является естественной частью вирусного генома, или чужеродный ген, который уже был встроен в MVA-геном. В этих случаях ATI-промотор встраивают "левее" данного гена в MVA-геноме, экспрессия которого контролируется данным ATIпромотором. Данный ATI-промотор можно также использовать для регуляции экспрессии гена, который еще не является частью MVA-генома. В данном случае предпочтительно сконструировать экспрессионную кассету, включающую ATI-промотор и кодирующую последовательность, экспрессия которой регулируется данным ATI-промотором, и встроить указанную экспрессионную кассету в MVA-геном. Предпочтительные сайты встраивания выбирают из (i) естественно встречаемых делеционных сайтов в MVA-геноме в отношении генома штамма Copenhagen вируса осповакцины или (ii) межгенных областей MVA-генома. Термин "межгенная область" относится предпочтительно к тем частям данного вирусного генома, которые локализованы между двумя смежными генами, которые не включают ни кодирующую, ни регуляторную последовательности. Однако данные встраиваемые сайты не ограничиваются этими предпочтительными встраиваемыми сайтами, т.к. то, что экспрессионную кассету можно встроить, где угодно в геноме вируса до тех пор, пока возможно получить рекомбинанты, которые можно амплифицировать и размножить по меньшей мере в одной культуральной клеточной системе, такой как фибробласты куриного эмбриона (CEF-клетки), находится в рамках настоящего изобретения. Таким образом, встраиваемую кассету можно также встроить, например, в несущественные гены или в гены, функция которых может быть дополнена клеточной системой, используемой для размножения MVA. Способы, необходимые для конструирования рекомбинантного MVA, известны специалистам в данной области техники. В качестве примера, экспрессионную кассету, и/или ATI-промотор, или его производное можно встроить в геном MVA с помощью гомологичной рекомбинации. Для этого нуклеиновую кислоту трансфицируют в пермиссивную клеточную линию, такую как клетки CEF или BHK, где данная нуклеиновая кислота включает экспрессионную кассету, и/или ATI-промотор, или его производное, фланкированные нуклеотидными участками, которые гомологичны области MVA-генома, в который должны быть встроены экспрессионная кассета, и/или ATI-промотор, или его производное. Данные клет-3 009525 ки инфицируют с помощью MVA, и в этих инфицированных клетках осуществляется гомологичная рекомбинация между нуклеиновой кислотой и вирусным геномом. Альтернативно также возможно сначала заразить клетки с помощью MVA и затем трансфицировать нуклеиновую кислоту в инфицированные клетки. Опять-таки, в клетках происходит рекомбинация. Затем с помощью способов, уже известных в данной области техники, отбирают рекомбинантный MVA. Конструирование рекомбинантного MVA не ограничивается данным конкретным способом. Вместо него с этой целью можно использовать любой подходящий способ, известный специалистам в данной области техники.ATI-промотор в MVA можно использовать для контроля экспрессии любой кодирующей последовательности. Эта кодирующая последовательность может предпочтительно кодировать, по меньшей мере, антигенный эпитоп или антиген. В этом случае рекомбинантный MVA можно использовать для экспрессии указанного антигена после инфицирования клеток в организме, например, млекопитающего, в том числе и человека. Презентация указанного антигена/эпитопа может вызвать иммунный ответ в данном организме, что может привести к вакцинации этого организма против агента, из которого данный антиген/эпитоп произошел. В частности, эпитоп/антиген может являться частью большей аминокислотной последовательности, такой как полиэпитоп, пептид или белок. Примерами таких полиэпитопов, пептидов или белков могут быть полиэпитопы, пептиды или белки, произошедшие из (i) вирусов, таких как ВИЧ, HTLV, герпесвирус, вирус лихорадки Денге, вирус полиомиелита, вирус кори, вирус паротита, вирус краснухи, вирусы гепатита и так далее, (ii) бактерий, (iii) грибов. Альтернативно кодирующая последовательность может кодировать терапевтическое соединение,такое как интерлейкины, интерфероны, рибозимы или ферменты. Рекомбинантный MVA можно вводить в организм животного или человека в соответствии с опытом специалиста в данной области техники. Так, рекомбинантный MVA в соответствии с настоящим изобретением может оказаться полезным в качестве лекарственного средства (т.е. фармацевтической композиции) или вакцины. Фармацевтическая композиция или вакцина может, как правило, включать, помимо данного рекомбинантного MVA, один или несколько фармацевтически приемлемых и/или апробированных носителей,добавок, антибиотиков, консервантов, адъювантов, разбавителей и/или стабилизаторов. Такие вспомогательные вещества могут представлять собой воду, физиологический раствор, глицерин, этанол, смачивающие или эмульгирующие агенты, вещества, обеспечивающие pH буфера, или им подобные. Подходящие носители представляют собой, как правило, большие, медленно метаболизируемые молекулы,такие как белки, полисахариды, полимолочные кислоты, полигликолевые кислоты, полимерные аминокислоты, аминокислотные сополимеры, липидные агрегаты или им подобные. Для получения фармацевтических композиций или вакцин рекомбинантный MVA преобразуют в физиологически приемлемую форму. Это можно осуществить на основе опыта получения поксвирусных вакцин, используемых для вакцинации против натуральной оспы (как описано у Stickl H. и соавт., [1974]Dtsch. med. Wschr. 99, 2386-2392). Например, выделенный очисткой вирус хранят при -80 С с титром 5108 TCID50/мл, рецептированного в около 10 мМ Tris, 140 мМ NaCl рН 7,4. Для получения вакцинных доз, например, 101109 частиц рекомбинантного вируса в соответствии с настоящим изобретением лиофилизируют в фосфатно-солевом буфере (PBS) в присутствии 2% пептона и 1% альбумина человека в ампуле, предпочтительно в стеклянной ампуле. Или же вакцинные дозы можно получить путем постепенной лиофилизации данного вируса в композиции. Данная композиция может содержать дополнительные добавки, такие как манит, декстран, сахар, глицин, лактозу или поливинилпирролидон, либо иные добавки, такие как антиоксиданты или инертный газ, стабилизаторы или рекомбинантные белки (например, альбумин сыворотки человека), пригодные для введения in vivo. Типичная вируссодержащая композиция, пригодная для лиофилизации, включает 10 мМ Tris-буфера, 140 мМ NaCl, 18,9 г/л декстрана (м.в. 36000-40000), 45 г/л сахарозы, 0,108 г/л моногидрата монокалиевой соли L-глутаминовой кислоты, pH 7,4. Затем стеклянную ампулу запаивают и ее можно хранить в диапазоне между 4 С и комнатной температурой в течение нескольких месяцев. Однако в отсутствие необходимости использовать данную ампулу, ее хранят при температуре ниже -20 С. Для вакцинации или для лечения лиофилизат или лиофилизованный продукт можно растворить в 0,1-0,5 мл водного раствора, предпочтительно в воде, физиологическом растворе или в Tris-буфере, и ввести либо системно, либо местно, а именно парентерально, внутримышечно или иным путем введения,известным специалисту широкого профиля. Определенный режим введения, определенная доза и определенная частота введения могут быть оптимизированы специалистом в данной области техники известным способом. Таким образом, в соответствии с близким вариантом осуществления настоящее изобретение относится к способу воздействия, предпочтительно индукции иммунологического ответа в живом организме животного, в том числе и человека, включающему введение вируса, композиции или вакцины в соответствии с настоящим изобретением в подвергаемого лечению животного или человека. Обычно, вакцинная доза включает по меньшей мере 102, предпочтительно по меньшей мере 104, более предпочтительно по меньшей мере 106, еще более предпочтительно 108 TCID50 (инфицирующая доза тканевой культуры) дан-4 009525 ного вируса. Особое преимущество рекомбинантного MVA в соответствии с настоящим изобретением, в частности, рекомбинантного MVA-BN и его производных, состоит в том, что данный вирус можно использовать для основной и повторной иммунизации. Таким образом, настоящее изобретение относится, кроме того, к способу, в котором вирус, композиция или вакцина вводятся животному, в том числе и человеку,нуждающемуся в них, в терапевтически эффективных количествах для первой иммунизации ("первичная иммунизация") и для второй иммунизации ("повторная иммунизация"). Кроме того, настоящее изобретение относится к способу встраивания кодирующей последовательности в клетки-мишени, включающему инфицирование клеток-мишеней вирусом в соответствии с настоящим изобретением. Эти клетки-мишени могут быть представлены клетками, такими как клетки CEF и BHK, в которых вирус способен реплицироваться, либо клетками, такими как все типы клеток человека, которые могут быть инфицированы MVA, но в которых данный вирус не может реплицироваться. Кроме того, настоящее изобретение относится к способу получения пептида, белка и/или вируса,включающему инфицирование клетки-хозяина рекомбинантным вирусом в соответствии с настоящим изобретением с последующим культивированием инфицированной клетки-хозяина в подходящих условиях, и с последующим извлечением и/или обогащением пептида и/или белка, а также вирусов, продуцируемых указанной клеткой-хозяином. Если это подразумевает получение, т.е. амплификацию вируса в соответствии с настоящим изобретением, то клетка должна представлять собой клетку, такую как клеткиCEF и BHK, в которой вирус способен реплицироваться. Если это подразумевает получение пептида/белка, кодируемого вирусом, предпочтительно белка/пептида, кодируемого кодирующей последовательностью, экспрессия которого контролируется с помощью ATI-промотора или его производного, то клетка может представлять собой любую клетку, которая может быть инифицирована рекомбинантным вирусом, и которая делает возможным экспрессию белков/пептидов, кодируемых MVA. Кроме того, настоящее изобретение относится к клеткам, инфицированным вирусом в соответствии с настоящим изобретением. Краткое описание фигур Фиг. 1 - результаты реакции ПЦР, которая обнаруживает присутствие РНК, экспрессируемой с ATIпромотора рекомбинантного MVA после заражения им CEF-клеток (см. пример 2); фиг. 2 - результаты Вестерн-блота белков, выделенных из клеток, инфицированных различными рекомбинантными MVA; фиг. 2 А - невосстанавливающие условия, непрогретые белки; фиг. 2 В - восстанавливающие условия, непрогретые белки; фиг. 2 С - невосстанавливающие условия, прогретые белки. Дорожки 1, 3, 4 представляют собой, соответственно, клеточные лизаты клеток, инфицированныхMVA-ATI-NS1, MVA-GFP, а также неинфицированных клеток. Дорожки 5, 7, 8 представляют собой, соответственно, супернатанты клеток, инфицированных MVA-ATI-NS1, MVA-GFP, a также супернатанты контрольных клеток. Дорожки 2 и 6 оставались пустыми. Примеры Нижеследующие примеры дополнительно иллюстрируют настоящее изобретение. Специалистам в данной области техники должно быть очевидно, что представленные примеры никоим образом не интерпретируются так, что применимость технологии, разработанной в настоящем изобретении, ограничена данными примерами. Пример 1. Активность ATI-промотора вируса коровьей оспы в разных штаммах вируса осповакцины. Цель данного примера проанализировать силу ATI-промотора вируса коровьей оспы в разных штаммах вируса осповакцины. Введение.ATI-промотор вируса коровьей оспы сливали с GUS (-глюкуронидаза Е. coli), репортерным геном для анализа экспрессии. Клетки BHK (почки детеныша хомяка) инфицировали с помощью разных штаммов вируса осповакцины и трансфицировали с помощью плазмиды, содержащей ATI-промотор, слитый с данным GUS-геном. Анализируемые штаммы вируса осповакцины включали CVA, Copenhagen, Elstree,IHD, Western reserve и MVA-BN. Когда данный промотор функционирует, то должен экспрессироватьсяGUS, что можно количественно оценить с помощью ферментативной реакции. Материалы и оборудование. Клетки BHK (ЕСАСС No.84100501) Все вирусы осповакцины использовали с титром 7,5107 TCID50 на мл Плазмида pBNX73 (pBluescript+ATI-промотор+GUS) Набор для трансфекции Effectene (Qiagen) Среда DMEM для культуры клеток (Gibco BRL)FCS (Gibco BRL) Буфер для лизиса клеток (PBS+0,1% Тритона+1 мМ ингибитора протеазы)-5 009525 1 мМ субстрат для GUS (паранитрофенил-бета-(D)-глюкуронид; Sigma, Cat. No. N1627) 2,5 М стоп-раствор (2-амино-2-метил-1,3-пропандиол; Sigma, Cat. No. А 9754) Посев клеток. В лунки 6-луночного планшета высевали 5105 клеток BHK для осуществления реакции трансфекции и выдерживали их в DMEM/10% FCS в течение ночи при 37 С и 5% CO2. Инфицирование/трансфекция. Клетки инфицировали разными штаммами вируса осповакцины (MOI 0,1) в 0,5 мл DMEM/10% FCS на лунку и инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре со встряхиванием. Трансфекцию осуществляли как описано в протоколе производителей. В буфере ЕВ (общий объем 100 мкл) разбавляли 2 мкг плазмиды. После добавления 3,2 мкл раствора энхансера полученный раствор перемешивали и инкубировали в течение 5 мин при комнатной температуре. Затем добавляли 10 мкл реактива Effectene,суспензию перемешивали и инкубировали в течение 10 мин при комнатной температуре. Суспензию вируса отделяли от клеток и приливали 1,6 мл DMEM/10% FCS. Добавляли 0,6 мл DMEM/10% FCS к полученной Effectene-смеси ДНК, которую затем капали на клетки, содержащиеся во вращающейся культуральной планшете. Затем клетки инкубировали в течение 48 ч. Сбор клеток. Среду отделяли от клеток и приливали к ним 0,5 мл лизирующего буфера. После 15-минутного встряхивания при КТ, клетки соскабливали в данный лизирующий буфер, переносили в 1,5 миллилитровую реакционную пробирку и энергично встряхивали. Лизированные клетки центрифугировали в течение 1 мин при 500 об./мин и 4 С, полученный прозрачный супернатант переносили в чистый флакон и хранили при -20 С до использования. Определение GUS-активности. 10 мкл клеточного экстракта (= белку от 2104 клеток) приливали к 1 мл предварительно нагретому раствору субстрата (37 С) и инкубировали при 37 С до появления желтой окраски. Затем образцы помещали непосредственно на лед и приливали 0,4 мл стоп-раствора. Определяли экстинкцию при 415 нм и приравнивали к GUS-активности, экстинкция которой находится между 0,05 и 2,0 линейного диапазона. Данный раствор субстрата использовали в качестве эталона, а клеточный экстракт неинфицированных клеток использовали в качестве негативного контроля. Результаты. Количественный анализ GUS-активности, экспрессируемой конструкцией ATI-промотор/GUS-ген вBHK-клетках, инфицированных разными штаммами вируса осповакцины, дал следующие результаты:ATI-промотора вируса коровьей оспы. Целью данного примера является демонстрация того, что ATI-промотор способен регулировать и экспрессировать гены при его встраивании в геном MVA. Введение.ATI-промотор вируса коровьей оспы сливали с неструктурным (NS) геном 1 вируса лихорадки Денге. Эту экспрессионную кассету встраивали в рекомбинантный вектор, включающий последовательности, гомологичные последовательностям генома MVA. В получающейся рекомбинантной плазмиде экспрессионная кассета фланкирована последовательностями, гомологичными последовательностям геномаMVA, в который должна встраиваться экспрессионная кассета. Клетки CEF инфицировали MVA-BN и трансфицировали с помощью рекомбинантного вектора, включающего ATI-промотор-NS1 экспрессионную кассету. В данных клетках между геномом MVA и рекомбинантной плазмидой происходила гомологичная рекомбинация, дающая рекомбинантный MVA-геном. После нескольких циклов выделения очисткой анализировали, действительно ли NS1-белок рекомбинантного MVA экспрессируется под контролем ATI-промотора. В параллельных экспериментах экспрессионную кассету, включающую последовательность, кодирующую ВИЧ-политоп под контролем данного ATI-промотора, встраивали в геном MVA и вновь проверяли, действительно ли ATI-промотор активен в MVA и экспрессирует ВИЧ-политоп. Материалы и оборудование: эмбриональные CEF-клетки,-6 009525 клетки почек детеныша хомячка (BHK; депозит 85011433 в Европейской Коллекции Клеточных Культур Животных),MVA-BN с титром 108 TCID50/мл,плазмида pBN74 и pBN84:pBN74 включает последовательность, кодирующую ВИЧ-политоп под контролем ATI-промотора, a pBN84 включает кодирующую последовательность NS1-белка вируса лихорадки Денге под контролем данного ATI-промотора. Помимо данной экспрессионной кассеты, включающей, соответственно, кодирующую последовательность вируса лихорадки Денге и ВИЧ-политопкодирующую последовательность, обе плазмиды включают в качестве маркерных генов ген устойчивости к G418 и ген, кодирующий зеленый флуоресцентный белок. Эти маркерные гены, а также экспрессионные кассеты, соответственно, для NS1 вируса лихорадки Денге и ВИЧ-политопа, фланкированы последовательностями MVA, которые гомологичны области генома MVA, в которую должны быть встроены гетерологичные гены.Effectene-набор для трансфекции (Qiagen) Клеточная культуральная среда VP-SFM (Gibco BRL)RNeasy-набор для извлечения РНК (Qiagen) ДНКаза, без РНКазы (Roche) Обратная транскриптаза MMLV (Promega)Taq-DNA-полимераза (Roche) РНКазный ингибитор RNAsin (Promega) Следующие олигонуклеотиды получены от MWG, Германия: праймер oBN465 ggtctgatttccatcccgtac(21 нуклеотид), используемый для реакции с обратной транскриптазой; праймер oBN463gaactgaagtgtggcagt (18 нуклеотидов), используемый для ПЦР; праймер oBN464 cggtggtaatgtgcaagatc (20 нуклеотидов), используемый для ПЦР. Методы. Интеграция в геном MVA с помощью гомологичной рекомбинации. Описанные выше плазмиды pBN74 или pBN84 использовали для интеграции, соответственно, ВИЧполитоп-кодирующей последовательности и кассеты для экспрессии NS1 вируса лихорадки Денге, в геном MVA путем гомологичной рекомбинации между MVA-последовательностями, фланкирующими экспрессионные кассеты в pBN74 или pBN84, с одной стороны, и гомологичными последовательностями-мишенями в рамках генома MVA, с другой стороны. Это осуществляется путем трансфекции линеаризованной плазмиды pBN74 или pBN84 в фибробластные клетки куриного эмбриона (CEF), ранее инфицированные MVA при низкой множественности заражения. В частности, CEF-клетки высевали в 6 луночные планшеты и поддерживали в VP-SFM в течение ночи при 37 С и 5% CO2. Затем эти клетки инфицировали MVA-BN (MOI 1,0) в 0,5 мл VP-SFM на лунку и инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре на встряхивающей мешалке. Трансфекцию данных клеток осуществляли либо с помощью pBN74, либо с помощью pBN84, как описано в протоколе их производителя. Через 48 ч после инфицирования или когда данное инфицирование приводило к слиянию, готовили вирусный экстракт и хранили при -20 С, готовый для селекции и очистки клона требуемого рекомбинантного MVA (rMVA). Селекция и очистка клона рекомбинантного MVA (rMVA). Удаление нерекомбинантного MVA (пустой вирусный вектор) и амплификация rMVA осуществляется путем инфицирования слитых фибробластных клеток куриного эимбриона (CEF) при низком MOI в присутствии G418 (количество G418 оптимизируют, чтобы определить наивысшую дозу, которая не убивает CEF-клетки). Любой вирус, который не содержит интегрированный ген NPT II, не реплицируется в присутствии G418, добавляемого в поддерживающую клеточную среду. G418 ингибирует репликацию ДНК, но поскольку эти CEF-клетки должны находиться в стационарном нереплицирующемся состоянии,они не подвергаются воздействию G418. CEF-клетки, инфицированные rMVA, можно визуализировать под флуоресцентным микроскопом, благодаря усиленной экспрессии зеленого флуоресцентного белка. Вирусные экстракты из стадии гомологичной рекомбинации последовательно разбавляют и используют для заражения свежих CEF-клеток в присутствии G418. Полученные инфицированные клетки покрывают слоем геля из легкоплавкой агарозы. Через 2 дня после инфицирования под флуоресцентным микроскопом в планшетах просматривают отдельные очаги зеленых инфицированных клеток. Данные клетки маркированы и агарозные блоки, содержащие очаги инфицированных клеток, отбирают и помещают в 1,5 миллилитровые микроцентрифужные пробирки, содержащие стерильную поддерживающую клеточную среду. Вирус высвобождается из отобранного агарозного блока в результате трехкратного замораживания-оттаивания микроцентрифужной пробирки при -20 С. Полученный рекомбинантный MVA с встроенной кассетой экспрессии NS1 вируса лихорадки Денге, описанной в настоящем изобретении, назвали MVA-ATI-NS1. Детекция РНК, экспрессируемой под контролем ATI-промотора в рекомбинантном MVA. Для детекции РНК, экспрессируемой под контролем промотора ATI в клетках, инфицированных рекомбинантным MVA, экстрагирование РНК осуществляли, как описано в протоколе производителей(RNeasy Mini Protocol для выделения тотальной РНК из клеток животных). Реакцию обработки ДНКазой осуществляли путем добавления 3 мкл ДНКазы, свободной от РНКазы (= 30 Ед.; Roche), 3 мкл 10 буфер-7 009525 А (обычно используемый для рестрикции, Roche) к 5 мкг РНК в объеме, доведенном водой до 30 мкл. Полученную смесь инкубировали в течение 90 мин при 37 С. РНК выделяли очисткой с использованиемRneasy-колонок, в соответствии с протоколом производителя. Для обратной транскрипции 2 мкг РНК смешивали с 1 мкг праймера OBN465 для обратной транскрипции и общий объем доводили до 10 мкл добавлением воды. Инкубацию проводили в течение 5 мин при 70 С и данную пробирку ставили на лед. Затем приливали 5 мкл 5 буфера, 5 мкл смеси dNTP (10 мкМ), 0,5 мкл Rnasin, 2 мкл М-MLV RT (200 Ед.) и 2,5 мкл Н 2 О и данную смесь инкубировали в течение 60 мин при 42 С. Для осуществления ПЦР-амплификации 5 мкл RT-реакции смешивали с 36 мкл Н 2 О, 5 мкл 10 буфера, 1 мкл смеси dNTP, 2 мкл каждого праймера oBN463 и oBN464 (10 мкМ) и 1 мкл Taq-полимеразы. ДНК амплифицировали в 25 циклах (1 мин удлинение, температура отжига 55 С) и анализировали с помощью гель-электрофореза. Детекция экспрессируемого NS1-белка вируса лихорадки Денге в клетках, инфицированных MVAATI-NS1. В 25 см 2 матрас, содержащий около 80% слившегося монослоя BHK-клеток, инокулировали 100 мкл вирусного штамма MVA-ATI-NS1, разбавленного до 1107 в МЕМ с 1% FCS, и качали при комнатной температуре в течение 30 мин. В каждый матрас приливали 5 мл МЕМ с 3% FCS и инкубировали при 30 С в CO2-инкубаторе. Инкубированные матрасы убирали через 48 ч. Из каждого матраса удаляли супернатант и центрифугировали его при 260g в течение 10 мин при 4 С. Данные супернатанты хранили в аликвотах при -80 С. Полученный осадок дважды промывали 5 мл 1PBS и затем ресуспендировали в 1 мл гипотонического буфера для гомогенизации с 1%ТХ 100. Клеточные лизаты собирали и центрифугировали в течение 5 мин при 16000g, а полученные супернатанты хранили в микроцентрифужных пробирках при -80 С. Матрасы, инокулированные контрольными вирусами, и незараженные матрасы обрабатывали таким же образом, как описано выше. Клеточно/вирусный лизат и его супернатант обрабатывали либо невосстанавливающим, либо восстанавливающим буфером для образцов в условиях нагревания или без нагрева. Белки разделяли в 10%SDS-ПААГ и переносили на нитроцеллюлозные мембраны. Полученные блоты зондировали в течение ночи объединенной сывороткой от выздоравливающих пациентов (PPCS), т.е. сывороткой от пациентов,которые страдали от заражения вирусом лихорадки Денге, в разведении 1:500. После трехкратной отмывки с помощью 1XPBS данные блоты инкубировали с конъюгированными с пероксидазой хрена(HRP) антителами против IgG человека (DAKO) в течение 2 ч при комнатной температуре. Затем блоты промывали, как описано выше, перед проявлением с использованием 4-хлор-1-нафтола. Результаты представлены на фиг. 2. Результаты. Показано, что при регуляции ATI-промотором вируса коровьей оспы экспрессируется NS1-ген, а также ВИЧ-политоп (фиг. 1). Соответствующая мРНК четко детектировалась. В частности, ожидаемый сигнал 926 п.н. четко детектировался после RT-ПЦР РНК-образца (фиг. 1, дорожка 2). Сигнал не детектировался при использовании образца только для ПЦР (фиг. 1, дорожка 3). По этой причине можно исключить ложный позитивный сигнал, вызванный загрязнением ДНК. На фиг. 1, дорожка 4, представлен результат ПЦР для плазмидного положительного контроля. Как ожидалось, размер ПЦР-продукта оказался идентичным размеру ПЦР-продукта после RT-ПЦР образца РНК. На фиг. 1, дорожка 5, представлен результат RT-ПЦР-реакции для отрицательного контроля (воды). На фиг. 1, дорожки 1 и 6, представлен маркер молекулярных масс (100 п.н.Ladder). Результаты Вестерн-блотов свидетельствуют, что NS1 экспрессируется в клетках, инфицированныхMVA-ATI-NS1. NS1 экспрессировался в правильной конформации и в виде димера в условиях без нагрева, как показано на дорожке 1 фиг. 2 А и 2 В. При нагревании данного образца можно видеть NS1 мономер, как показано на фиг. 2 С. Полученные результаты свидетельствуют также о том, что NS1, экспрессируемый в клетках, инфицированных MVA-ATI-NS1, является антигенным и распознается объединенной сывороткой выздоравливающих пациентов. В заключение, результаты данных экспериментов свидетельствуют, что NS1 экспрессируется в правильной конформации в BHK-клетках, инфицированных MVA-ATI-NS1. И димер, и мономер являются антигенными и распознаются с помощью объединенной сыворотки выздоравливающих пациентов. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Рекомбинантный модифицированный вирус осповакцины Ankara (MVA), содержащий в своем геноме экспрессионную кассету, содержащую ATI-промотор вируса коровьей оспы или его производное,и кодирующую последовательность, где экспрессия кодирующей последовательности находится под контролем указанного промотора. 2. Рекомбинантный MVA по п.1, в котором ATI-промотор имеет последовательность SEQ ID NO:1. 3. Рекомбинантный MVA по п.1, в котором производное ATI-промотора выбрано из:(ii) последовательностей с одной или несколькими нуклеотидными заменами, делециями и/или инсерциями в SEQ ID NO:1 или ее фрагменте,где указанные фрагменты и последовательности соответственно сохраняют активность промотора вMVA. 4. Рекомбинантный MVA по любому из пп.1-3, представляющий собой штамм MVA-BN ECACCV00083008, или производный от указанного штамм, или штамм MVA 575 ECACC V00120707. 5. Рекомбинантный MVA по любому из пп.1-4, в котором экспрессионная кассета встроена в природный сайт с делецией генома MVA по сравнению с геномом штамма Copenhagen вируса осповакцины или в межгенную область генома MVA. 6. Рекомбинантный MVA по любому из пп.1-5, где последовательность кодирует по меньшей мере один антиген, антигенный эпитоп и/или терапевтическое соединение, такое как интерлейкин, интерферон, рибозим или фермент. 7. Фармацевтическая композиция, в частности вакцина, содержащая рекомбинантный MVA по любому из пп.1-6. 8. Применение рекомбинантного MVA по любому из пп.1-6 для получения вакцины или лекарственного средства против агента, из которого получен антиген или антигенный эпитоп. 9. Применение по п.8, где терапевтически эффективные количества вакцины или лекарственного средства вводят при первой иммунизации (первичная вакцинация) и при второй иммунизации (ревакцинация). 10. Способ введения кодирующей последовательности в клетки-мишени, который предусматривает инфицирование клеток-мишеней вирусом по любому из пп.1-6. 11. Способ получения пептида и белка, где пептид/белок кодируется вирусом, и/или амплификации вируса, который предусматривает:-9 009525 а) инфицирование клетки-хозяина вирусом по любому из пп.1-6,б) культивирование инфицированной клетки-хозяина в подходящих условиях и с) выделение и/или обогащение пептида, белка и/или вируса, продуцируемого или амплифицируемого указанной клеткой-хозяином. 12. Способ индукции иммунного ответа в организме животного, в том числе в организме человека,предусматривающий введение вируса по любому из пп.1-6 или композиции, в частности вакцины, по п.7 указанному животному, в том числе человеку. 13. Способ по п.12, предусматривающий введение по меньшей мере 102 TCID50 вируса. 14. Способ по любому из пп.12 или 13, согласно которому вирус, композицию, в частности вакцину, вводят в терапевтически эффективных количествах при первой иммунизации (первичная вакцинация) и при второй иммунизации (ревакцинация). 15. Эукариотическая клетка, содержащая вирус по пп.1-6. 16. Применение ATI-промотора вируса коровьей оспы или его производного для экспрессии кодирующих последовательностей в MVA, где производное ATI-промотора выбрано из:(ii) последовательностей с одной или несколькими нуклеотидными заменами, делециями и/или инсерциями в SEQ ID NO:1 или ее фрагменте,где указанные фрагменты и последовательности соответственно сохраняют активность промотора вMVA. 17. Применение ATI-промотора вируса коровьей оспы или его производного для экспрессии кодирующих последовательностей в MVA, где ATI-промотор имеет последовательность SEQ ID NO:1. 18. Способ получения рекомбинантного MVA по любому из пп.1-6, предусматривающий встраивание экспрессионной кассеты в геном MVA, где экспрессионная кассета содержит промотор ATI или его производное и кодирующую последовательность и где экспрессия кодирующей последовательности находится под контролем указанного промотора.