Ингибиторы тромбина, основанные на аминокислотной последовательности гирудина

1 Настоящее изобретение относится к производным пептидов, используемых в качестве ингибиторов тромбина и, в частности к производному пептида, основанному на последовательности сегмента гирудина, содержащего с 45 по 65 аминокислоты. Тромбин является важным компонентом сериновой протеазы в каскаде свертывания крови. Помимо инициации свертывания крови путем расщепления фибриногена, тромбин активирует другие факторы гемоагглютинации,включающие факторы V, VIII и XIII, и противосвертывающий фермент белок С. Тромбин также является мощным активатором тромбоцитов,который in vivo ослабляет лизис тромбов, опосредованный тканевым активатором плазминогена. Таким образом, позитивная обратная регуляция тромбина служит для усиления гемостатических процессов, но приводит к образованию опасных для жизни тромбов в ответ на отклонения в кровеносных сосудах и артериях головного мозга. Определяющие различные функции этого фермента, его ингибирование мощными и специфическими компонентами могли бы обеспечить неоценимое дополнение к лечению заболеваний, относящихся к тромбозу. Они включают: заболевания коронарных сосудов, заболевания сосудов головного мозга, закупорку периферических артерий, глубокий венозный тромбоз и эмболию легочных артерий. Наиболее мощным ингибитором тромбина,известным в настоящее время, является гирудин, семейство изо-белков, выделенных из секретов желез пиявок Hirudo Medicinalis. Противосвертывающие свойства гирудина известны в течение длительного времени. Однако до последнего времени это имело небольшое терапевтическое значение, т.к. формулирование этого белка в достаточно эффективную и легко вводимую форму представляется трудным из-за крайне низкой подкожной абсорбции и абсорбции в тонком кишечнике, что делало невозможным обеспечить достаточный уровень белка в кровяном русле. Далее, клиническое использование гирудина, изолированного из экстрактов пиявок,маловероятно из-за его ограниченного количества, затрат и аллергических реакций, которые обычно могут иметь место при введении чужеродных белков, имеющих размер гирудина. В своей публикации, названной "Фармакология селективных ингибиторов тромбина"("Pharmacology of selective thrombin inhibitors",(1988), Nouv.Rev.Fr.HematoL, 30, с. 161-165),Макуорд (Markwardt) представил дополнительные клинические данные о гирудине, основанные на результатах фармакологических исследований, проведенных и для природных, и для синтетических ингибиторов тромбина. Автор делает общие выводы относительно гирудина, упоминая о том, что пептид, который 2 содержит высококислотную С-терминальную часть, является высокоспецифичным к тромбину. Далее он заключает, что Стерминальная часть гирудина, вероятно, способна связываться с анионной областью сайта связывания фермента, в то время как компактная N-терминальная часть, представляется, способна связываться с активной областью сайта фермента. Было обнаружено, что нативный десульфогирудин 45-65 ингибирует свертывание фибриногена и бычьим, и человеческим -тромбином дозозависимым образом. Значение IC50 при 940200 нм для бычьего -тромбина находится в хорошем соответствии с описанным значением формирования сгустка фибрина в плазме для того же фрагмента, и в три раза ниже, чем гирудин 45-65, который представлялся как минимальный кор, необходимый для противосвертывающей активности. Также было продемонстрировано, что те же пептиды последовательно являлись более мощными против человеческого тромбина, чем против бычьего -тромбина. В различных источниках в этой области также продемонстрировано, что активный фрагмент аминокислотной последовательности гирудина является аминокислотной последовательностью, включающей аминокислоты с 45 по 65. С тех пор были сделаны попытки увеличить ингибиторные активности пептида путем замены некоторых из аминокислот, присутствующих в этой последовательности. Крстенанский с соавторами (Krstenansky etal., "Antithombin properties of C-terminus of hirudin using synthetic unsulfated N-acetyl-hirudin",(1987), Febs Letters, Vol. 211, No. I, pages 10-16) описывают синтез С-терминального фрагмента несульфинированного N-ацетил-гирудина 45-65. Авторы ссылаются на предыдущую работу(Chang, J.-V., FEBS Letters, 164, 307 (1983 и упоминают, что этот фрагмент потенциально может содержать два специфических связывающих домена, один, связывающийся с каталитическим сайтом тромбина, и другой, связывающийся с другим сайтом распознавания тромбина. Другие авторы заключают, что это не так. Тем не менее, авторы продемонстрировали, что последовательность гирудина 45-65 способна ингибировать свертывающую активность,как и высвобождение фибринопептида А тромбином. Они также предположили, что та же последовательность гирудина 45-65 не может быть непосредственно вовлечена в связывание с каталитическим сайтом тромбина, так как амидолитические свойства тромбина не проявляются по отношению к синтетическим субстратам. В статье Крстенанского с соавторамиMed. Chem., 30, p. 1688-1691) авторы показывают, что минимальной активной последовательностью в некаталитическом сайте связывания тромбина является гирудин 56-64. Основываясь на этом заключении, авторы сообщают о синтезе нескольких аналогов С-терминального гирудина 56-64 и их способности ингибировать формирование индуцированного тромбином фибринового сгустка для того, чтобы установить природу взаимодействия между гирудином 56-64 и некаталитическим сайтом связывания тромбина. В своем заключении авторы высказывают мысль, что С-терминальная область гирудина может связываться с областью фибриногена,связывающейся с тромбином, что не является той областью, которая до сих пор предполагается в литературе. В статьях (Dodt et al., "Interaction of sitebasis for the specificity of hirudin", (1988), Biochemistry, 27, pages 6517-6522) авторы сообщают результаты сайт-направленного мутагенеза на гене гирудина. Исследовалось ингибирование тромбина мутированными пептидами гирудина. В этих публикациях авторы исследовали мутации, действовавшие на полный белок, и не ограничивались сегментом гирудина 45-65. Далее, модификации сегмента 45-65 ограничили до единственной модификации, обычно в положении 47, для демонстрации того, что этот остаток не взаимодействует с активным сайтом, хотя эти публикации показывают также мутации в положениях 51,57,58,61 и 62. Сходным образом в статье Додта с соавторами (Dodt et al., "Distinct binding sites of Ala48Hirudin1-47 and Ala48-Hirudin48-65 on -thrombin",(1990), The Journal of Biological Chemistry,Vol.265, No.2, pp. 713-718) описываются эксперименты по проведению сайт-направленного мутагенеза гирудина в положении последовательности 48. В этом случае представляется, что проделанная Додт с соавторами работа была ограничена до замены аланина на пролин в этом положении с целью облегчить необходимый протеолиз, требуемый для их эксперимента. Наконец, Мараганор с соавторами (Maraganore et al., Anticoagulant activity of syntheticsively located within its acidic C-terminal tail",(1990), Febs., Vol.261, No.2, pages 287-290) описывают синтез и противосвертывающие свойства числа пептидов, чьи последовательности основаны на последовательности различных фрагментов природного гирудина. Соединения, имеющие противосвертывающие свойства, являются ценными терапевтическими средствами, которые могут быть использованы in vivo в лечении различных патологических состояний. Среди наиболее важных состояний, при которых может быть использовано противосвертывающее лечение, могут быть упомянуты инфаркт миокарда, эмболия легочных артерий и заболевания сосудов головного мозга, глубокий венозный тромбоз и другие проявления тромботических заболеваний. Доступные в настоящее время антикоагулянты во многих отношениях являются неудовлетворительными. Например, гепарин использовался для ингибирования активности тромбина и, вследствие этого, при лечении таких состояний, как венозный тромбоз и тромбоэмболия. Однако гепарин проявляет множество нежелательных побочных эффектов, что указывает на необходимость в наличии антикоагулянтов,проявляющих более подходящие уровни токсичности. Дизайн низкомолекулярных и специфических ингибиторов тромбина, который использует добавочный локус связывания, отстоящий от,или соединенный с каталитическим центром,сходный с тем, как фибриноген или гирудин связывются с тромбином, представляет собой сложную задачу в белковой химии. Предположительно, такой мультифункциональный ингибитор объединяет два или более разделенных подходящим спейсером элемента распознавания, которые способствуют множественным одновременным взаимодействиям и которые могли бы проявить увеличенную эффективность и специфичность. Введение "чужеродных" химических элементов, воплощенных в структуре с низким молекулярным весом, могло бы придать сопротивление протеолизу и желательную биопригодность. Также, из-за меньшего, чем гирудин, размера, эти соединения, возможно,менее способны вызывать нежелательный иммунный ответ у получивших ими лечение пациентов. Заявка РСТ WO 91/02750 указывает, что определенные ингибиторы тромбина обладаютCSDMs, которые могут разрезаться медленно или не разрезаться вообще. Однако, все, что они раскрыли, это модифицированные связи между аргинином и глицином или пролином, такие как Арг[ф/дюйм 2 СН 2-NH]-Гли; -ГомоАрг-Гли; ГомоАрг-Про; -ГомоАрг-Вал; или Арг-[СОСН 2]-СН 2-(СОNН)-Гли. Не существует указания, что аминокислоты глицин или пролин могут быть полностью удалены и заменены на 5 синтетический линкер, который полностью устойчив к разрезанию тромбина. Составом настоящего изобретения является производное пептида (I) формулы (D)-ФeнПpo-Aрг-(CH2)4(CO)-[NH-(CH2)4CO]2-DFEPIPL,которое имитирует карбоксильную область гирудина, состоящую из остатков 45-65. Буквы(Примечание: в номенклатуре аминокислот,принятой в русскоязычной литературе, не существует однобуквенных обозначений. Вышеуказанные аминокислоты далее обозначены и соответствуют: D - аспарагину (Асп), F - фенилаланину (Фен), Е - глутамину (Глу), Р - пролину(Про), I - изолейцину (Иле), L - лейцину (Лей).) В другом аспекте изобретения обеспечивается фармацевтический состав для лечения тромботических заболеваний, содержащий эффективное количество производного пептида (I)(D)-Фен-Про-Арг-(СН 2)4(СО)-[NН-(СН 2)4 СО]2 Асп-Фен-Глу-Про-Иле-Про-Лей и его фармацевтически приемлемые соли. В другом аспекте изобретения обеспечивается способ лечения или профилактики сосудистых заболеваний, относящихся к тромбозам,состоящий из введения пациенту эффективного количества производного пептида (I) (D)-ФенПро-Арг-(СН 2)4(СО)-[NН-(СН 2)4 СО]2-Асп-ФенГлу-Про-Иле-Про-Лей. В дальнейшем, состав изобретения также может быть использован в композициях и способах для визуальной диагностики in vivo, для хранения экстракорпоральной крови in vitro и покрытия инвазивных приспособлений, и для обработки крови ex vivo. Настоящее изобретение относится к производному пептида, подходящему к использованию в качестве ингибитора тромбина. Было обнаружено, что природный фрагмент гирудина, содержащий остатки 45-65, может одновременно взаимодействовать с двумя независимыми и удаленными сайтами тромбина, одним сайтом, являющимся мнимым анионным экзосайтом, в то время как другой - каталитическим сайтом, ответственным за протеолиз. Этот тип связывания имитирует, но является отличным от механизма природной молекулы гирудина,которая, как было показано, взаимодействует с активным центром тромбина через свои три Nтерминальные остатка. Таким образом, очевидно, что остатки 45, 46 и 47 не служат для связывающей функции в природном белке, но, в отсутствие N-терминального кора, пространственно правильно предрасположены для взаимодействия, хотя и слабого. Основываясь на этом наблюдении, мы синтезировали производное пептида, которое несет модификации в обоих ингибиторных компонентах молекулы и которое проявляет антитромбиновую активность выше того уровня,который проявлялся бы каждым из компонентов 6 в отдельности. Далее, химическая модификация вновь сформированной химической связи приводит к образованию более активного соединения, которое имеет преимущество быть протеолитически стабильным к тромбину. Производное пептида полезно в качестве антикоагулянта и как ингибитор аггрегации тромбоцитов, понижая таким образом фактор риска в показаниях при артериальном тромбозе и при других относящихся сюда сердечно-сосудистых заболеваниях. Состав изобретения также может быть использован в лечении метастазов опухоли, как в случае карцином. Термин "остаток", будучи примененным к-аминокислоте, означает радикал, полученный из соответствующей -аминокислоты путем удаления гидроксильной или карбоксильной группы и одного водорода из -аминогруппы. Использованные здесь обозначения для определенных индивидуальных остатков базируются на рекомендациях IUPAC-IUB Комиссии по Биохимической Номенклатуре [Biochemistry, II, 1726-1732, (1972)]. Термин "аминокислота", использованный здесь, включает находящиеся в природе аминокислоты, также как и неприродные аналоги, как те, которые широко используются работающими в области химического синтеза и химии пептидов. Перечень неприродных аминокислот может быть найден в "The Peptides", vol.5, 1983, AcademicPress, Chapter 6, авторы D.C.Roberts, F.Vellaccio. Также, в рамках настоящего изобретения находится способ для лечения или профилактики сосудистых заболеваний, имеющих отношение к тромбозу. Способ содержит введение пациенту эффективного количества состава, состоящего из производного пептида в смеси с фармацевтически приемлемым носителем. Изобретение также относится к способу понижения времени реперфузии или увеличению времени повторной закупорки у пациента,подвергающегося лечению тромболитическим агентом. Способ состоит из введения пациенту эффективного количества состава, содержащего производное пептида в соответствии с изобретением, и тромболитического агента в смеси с фармацевтически приемлемым носителем. В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения производное пептида в соответствии с изобретением может быть использовано в лечении метастазов опухоли. Эффективность производного для лечения метастазов опухоли проявляется путем ингибирования метастатического роста. Это основано на присутствии просвертывающего фермента в определенных раковых клетках. Этот фермент активирует превращения Фактора Х и Фактора Ха в каскаде свертывания, приводя к накоплению фибрина, который, в свою очередь, служит в качестве субстрата для роста опухоли. Ингибируя накопление фибрина через ингибирование 7 тромбина, молекулы настоящего изобретения служат как эффективные агенты против метастатических опухолей. Примеры метастатических опухолей, при лечении которых могут быть использованы ингибиторы тромбина этого изобретения, включают, но не ограничиваются,карциному мозга, карциному печени, карциному легких, остеокарциному и карциному клеток неопластической плазмы. В соответствии с другим аспектом ингибитор тромбина может быть использован в составах и способах для покрытия поверхностей инвазивных приспособлений, снижая риск образования сгустков или активации тромбоцитов у пациентов, получающих такие приспособления. Поверхности, которые могут быть покрыты составами этого изобретения, включают, например, протезы, искусственные клапаны, сосудистые имплантанты, анастамозы и катетеры. Способы и составы для покрытия этих приспособлений известны экспертам в области. Они включают химическую кросс-реакцию или физическую адсорбцию составов, содержащих ингибитор тромбина, на поверхность приспособлений. В соответствии с дальнейшим воплощением настоящего изобретения ингибитор тромбина может быть использован для визуальной диагностики тромбов у пациента. В этом воплощении ингибитор тромбина помечают радиоизотопом. Выбор радиоизотопа основан на числе хорошо известных факторов, например токсичности, биологической полужизни и детектируемости. Предпочтительные изотопы включают, но не ограничиваются, 125I, 123I и 111In. Методики мечения ингибитора тромбина хорошо известны в области. Наиболее предпочтительно, если радиоизотопом является 123I и мечение достигается с использованием реагента 123I-Bolton-Hunter. Помеченный ингибитор тромбина вводится пациенту и предоставляется для связывания с тромбином, содержащимся в сгустке. Затем сгусток исследуют, используя хорошо известные средства определения, такие как камера для определения радиоактивности, соединенная с компьютерной визуальной системой. Эта техника также обеспечивает изображение связанного с тромбоцитами тромбина и мейзотромбина. Иным образом описанный выше ингибитор тромбина или составы на его основе могут быть использованы как антикоагулянты для обработки крови ex vivo или для обработки экстракорпоральной крови (in vitro). Будучи использованным здесь термин "обработка ех vivo" включает удаление крови пациента по трубкам, экстракорпоральную обработку крови и далее возвращение ее пациенту, как при процедурах диализа,фильтрации крови или при отведении крови во время операции. Будучи использованным здесь термин "экстракорпоральная кровь" относится к продуктам крови, которые хранятся экстракорпорально для возможного введения пациенту, и 8 к крови, собранной у пациента для использования при различных анализах. Такие продукты включают полную кровь, плазму или любую фракцию крови, в которой желательно ингибирование свертывания. Производное пептида настоящего изобретения может быть синтезировано с использованием различных методов, хорошо известных экспертам в области. Например, пептиды могут быть синтезированы твердофазным методом,таким как описано Стьювартом с соавторами(Stewart et al., "Solid phase peptide synthesis",FreemanCo., San Francisco, 1969), на подходящем пептидном синтезаторе. Неаминокислотные области производного пептида требуют химического синтеза перед связыванием этой доли с другими аминокислотами для получения требуемого пептида через подходящий твердофазный синтез. Работающим в области будет удобно, если опытный химик-органик сможет подготовить синтетические области производного пептида. Синтез производного пептида. Производное пептида может быть синтезировано на пептидном синтезаторе AppliedBiosystems 430 А с использованием смолы BOCGlnPAM (Applied Biosystems; 0,64 ммоль/гр) в качестве поддержки твердой фазы. Связывание аминокислот проводят с использованием дициклогексилкарбодиимида/N-гидроксибензолтриазола и снятие защиты проводят 50% трифторуксусной кислотой (TFA) в метиленхлориде в течение 3 мин с последующим дополнительным 20-минутным циклом. Защищенными группами боковых цепей были следующие: Асп (Chx), Арг (Tos). Полностью защищенная пептидная смола может далее быть обработана жидким фторводородом, содержащим анизол и диметилсульфид (10% по объему), при -5 С в течение 60 мин. Избыток фторводорода далее может быть удален под струей азота, и оставшийся осадок проэкстрагирован эфиром и отфильтрован. Смола может далее быть экстрагирована ледяной уксусной кислотой и водой с последующей лиофилизацией. Очистка и анализ производного пептида. Полученный лиофилизированный грубый пептид может быть очищен до гомогенности с использованием широко принятых методов очистки пептидов. Одним из подходящих методов является хроматография на обращенной фазе на колонке Vydac octadecyl silica glass (15 , 1,5 x 30 см, 40 ф/дюйм 2) с использованием линейного градиента системы растворителей: А, 500 мл 500 мл 0,1% TFA/H2 О и Б, 1 л 60% ацетонитрит/Н 2O, содержащий 0,1% TFA. Фракции могут быть анализированы обратнофазной жидкостной хроматографией под высоким давлением на Varian LC с использованием аналитической колонки Vydac С 18 и определены при 215 нм. Фракции, относящиеся к степени чистоты более 9 99%, могут быть объединены и лиофилизированы. Содержание пептида может быть определено анализом аминокислот на аминокислотном анализаторе модели Beckman 6300. Далее пробы высушивают в Water Pico-Tag Work Station. К виале добавляют постоянно кипящую НСl(200), содержащую 1% фенол, и попеременно очищают (сухим азотом), и отводят после трех очисток. Наконец, виалу, содержащую пробу,нагревают до 150 С в течение 1 ч в вакууме. Масс-спектральные анализы могут быть проведены на спектрометре SCIEX API III, оборудованном источником входа ионного распылителя. Таким образом, структура и последовательность синтезированного пептида могут быть подтверждены правильностью аминокислотного состава и масс-спектра для демонстрации совпадения с подсчитанными молекулярными весами. Фармацевтические композиции. Производное пептида настоящего изобретения может быть получено в форме терапевтически приемлемых солей. Так как производное пептида имеет остатки, которые функционируют и в кислой, и/или в щелочной средах, значит далее могут быть образованы соли органических кислот (например, уксусной, трифторуксусной, молочной, янтарной или яблочной) или оснований (например, натриевой, калиевой или кальциевой). Эти соли производных пептидов являются полностью биологически активными. Терапевтически приемлемые соли могут быть переведены из одной соли в другую путем использования подходящей ион-обменной смолы способом, описанным Бойсонассом с соавторами (Boissonas et al., Helv.Chim.Acta. 43, 1849(1960. Производное пептида или его терапевтически приемлемые соли могут быть использованы исключительно или в комбинациях для лечения или профилактики сосудистых заболеваний как следствие тромбозов. Вводится систематично теплокровным животным, например лошадям или собакам, а так же людям, с фармацевтически приемлемыми переносчиками, пропорция и состав которых зависит от растворимости и избранного способа введения. Производное пептида настоящего изобретения вводится либо внутривенно или подкожно, либо путем внутримышечной инъекции в комбинации с фармацевтически приемлемыми переносчиками. Примеры подходящих переносчиков можно найти в стандартных фармацевтических текстах, например "Remington's Pharmaceutical Sciences", 16thedition, Mack Publishing Company, Easton, Penn.,1980. Дозировка производного пептида будет варьировать в зависимости от типа введения и,возможно, от определенной соли. В случае инъекции терапевтически эффективная доза производного пептида находится в дозировке диапазона от, примерно, 0,05 до 10 мг/кг веса тела. В 10 добавление к активному ингредиенту состав,обычно, также содержит подходящие буфера,например фосфатный буфер, для поддержания подходящего значения рН, и хлорид натрия,глюкозу или маннитол для того, чтобы сделать раствор изотоническим. Производное пептида настоящего изобретения может вводиться исключительно или в комбинации с другими фармацевтическими препаратами. Например, производное пептида может вводиться в комбинации с фибринолитиками, такими как тканевой активатор плазминогена, стрептокиназа или урокиназа, для предотвращения повторной закупорки коронарных артерий. Альтернативно, производное пептида можно вводить с гепарином или низкомолекулярным гепарином. Другие соединения, которые могут вводиться с производным пептида, включают тромбоксан и ЕРIIb3 а. Сокращения, использованные в следующих примерах, включают: ВОС - тертбутоксикарбонил; Tos - р-толуенсульфонил;N,О-диметилгидроксиламин гидрохлорид (146 мг, 1,5 ммоль), добавляли реагент ВОР (500 мг,1,1 ммоль) (B.Castro, J.R.Dormoy, G.Elvin,C.Selve, Tetrahedron Letters14, pp. 1219-1222,1975). Реакционную смесь перемешивали в течение 15 ч при 4 С, после чего растворитель выпаривали под высоким вакуумом. Осадок растворяли в 50 мл EtOAc и промывали Н 2 О. Органическую фазу далее экстрагировали 5%NaHCО 3 (3 раза), 1N НСl (3 раза) и высушивали над Na2SО 4. Растворитель фильтровали через селит и концентрировали in vacuo. Добавление небольшого количества гексана к концентрату приводит к накоплению белого твердого тела,соответствующего названному соединению. Масс-спектральный анализ: M/Z=472 (М+Н)+. Пример 2. Синтез 6-ВОС-9-тосилгуанидино-1-нонен-5-он. К раствору продукта из примера 1 (600 мг,1,3 ммоль) в 25 мл THF добавляли 10 эквивалентов реагента Гринарда (Grignard), приготовленного из 4-бромо-1-бутена (примечание по приготовлению: 312 мг магниевых стружек (13 ммоль) в 50 мл безводного эфира обрабатывали 1,75 г 4-бромо-1-бутена капельным образом для поддержания мягкого слива). После полного 11 расхода металла раствор Гринарда переносили шприцем под аргоном в смесь THF. Полную смесь THF охлаждали водным NH4Cl после того, как TCL показывал исчезновение исходных материалов (TCL был приготовлен на Kieselgel 60F 254, Merck, стеклянные подложки). Фазы разделяли и далее органическую фазу промывали 1N НСl и Н 2 О, высушивали (Na2SО 4) и выпаривали под вакуумом. Хроматографией на силикагеле (элюция смесью EtOAc/гексан в соотношении 4:1) получали чистое масло, соответствующее названному соединению. Массспектральный анализ M/Z = 469 (М+Н)+. Пример 3. Синтез 5-ВОС-4-оксо-8-тосилгуанидинооктаноиковой кислоты. Продукт из примера 2 (2,5 г, 5,3 ммоль) растворяли в 50 мл ацетонитрила с последующим добавлением периодата натрия (8 г, 37,5 ммоль), растворенного в 50 мл воды. Полную смесь обрабатывали 100 мг хлорида рутения. После интенсивного перемешивания в течение одного часа при комнатной температуре не было обнаружено исходных компонентов по TLC. Смесь разводили 100 мл H2 О и 100 мл эфира. Разделяли фазы и далее экстрагировали водную фазу эфиром. Собранные органические экстракты промывали H2O, высушивали (Na2SO4) и выпаривали досуха, получая 1,5 г пены, соответствующей названному соединению. M/Z = 485(М+Н)+. Пример 4. Синтез 6-ВОС-5-оксо-9-тосилгуанидинононаноиковой кислоты. Названное соединение этого примера синтезировали способом, аналогичным примерам с 1 по 3. Кратко, продукт из примера 1 подвергали реакции с реагентом Гринарда, приготовленного из магния и 5-бромо-1-пентена. Конечный продукт, изолированный как масло, аналогично примеру 3 последовательно обрабатывали комбинацией периодата натрия и хлорида рутения для получения гомолога названного соединения этого примера. M/Z = 499 (М+Н)+. Пример 5. Синтез 7-ВОС-6-оксо-10-тосилгуанидинодеканоиковой кислоты. Названное соединение этого примера было приготовлено способом, аналогичным примерам с 1 по 4. В этом примере продукт из примера 1 подвергали реакции с реагентом Гринарда, приготовленным из магния и 6-бромо-1-гексена. После отделения продукта путем хроматографии на силикагеле, как описано в примере 2,продукт подвергали реакции с периодатом натрия и хлоридом рутения. Отделение продукта приводило к получению названного соединения в виде масла. M/Z = 513 (М+Н)+. Пример 6. 12 Этил; 4N-t-ВОС-3-оксо-7-тосилгуанидин тиогептаноат (смешанный безводный способ). Формирование смешанного ангидрида: к перемешиваемому раствору 1 г (2,4 ммоль) (L)N-BOC-Apг(Nw)TOS)OH и 0,66 мл (0,48 ммоль) триэтиламина в 15 мл безводного тетрагидрофурана при -20 С добавляли 0,40 мл (0,3 ммоль) изо-бутилхлороформата капельным способом в течение 15 мин. После 1 ч смесь разбавляли 15 мл эфира и фильтровали выпавший осадок. Фильтрат, содержащий смешанный ангидрид, хранили при 0 С. Тем временем, перемешиваемый раствор ди-изо-пропиламина (3,4 мл, 24 ммоль) в 25 мл безводного эфира под аргоном обрабатывали при 0 С одним эквивалентом N-But Li в THF капельным способом в течение 30 мин. После этого реакционную смесь охлаждали до -60 С и обрабатывали 2,5 мл этилтиоацетата. После перемешивания при -60 С в течение 30 мин смесь подвергали реакции с 6 г этерата MgBr2 и перемешивали в течение дополнительных 30 мин. Наконец, эту смесь подвергали реакции со сформированным ранее смешанным ангидридом и продолжали перемешивание в течение 5 ч до момента, когда реакция была закончена с использованием жидкостной хроматографии под высоким давлением. Реакционную смесь обрабатывали капельным способом 6 М NH4Cl и разделяли фазы. Органическую фазу разводили 50 мл EtOAc и экстрагировали 1N НС 1 (3 х), H2O (3 х), высушивали Na2SO4 и выпаривали под высоким вакуумом, получая названное соединение в виде масла M/Z = 515(М+Н)+. Пример 7. Образование связи тиоэфира из примера 6 с эфирами -аминокислот и с незащищенными аминоацилполистиреновыми смолами. Защищенный аргинил статон из примера 6(2 эквивалента) растворяли в СH2 Сl2 и добавляли к смеси эфира -аминокислоты (1 эквивалент) или полистиреновой смолы, содержащей растущую полипептидную цепь. К этой смеси добавляли йодистую медь (2 эквивалента) и триэтиламин (2 эквивалента). Реакцию контролировали жидкостной хроматографией под высоким давлением в случае эфира аминокислоты или подходящим нингидриновым тестом в случае полистирен-связанных пептидов. Пример 8. Приготовление субъединицы синтетического спейсера формулы II: -[NН-СН 2 СН=СН-СН 2-(СО)]3-. Синтез был смоделирован по Сох М.Т.,Heston D.W и Horbury J., J. Chem. Soc.Chem.Comm., 1980, 799-800, с большими модификациями. Полный процесс выглядит следующим образом. а) Синтез диметилового эфира транс-гидромукониковой кислоты. 22 г (153 ммоль) трансгидромукониковой кислоты растворяли в 200 мл бензола,содержащего 500 мг р-толуенсульфониковой кислоты и 100 мл метанола. Раствор сливали в течение 6 ч и обрабатывали 100 мл воды. Фазы отделяли и далее экстрагировали органический слой 5% NaHCO3 и Н 2 О. После высушивания(Na2SO4) растворитель выпаривали под вакуумом и остаток возгоняли (83-85 С, 0,5 мм Hg),получая 19 г названного соединения. б) Синтез монометилового эфира транс-гидромукониковой кислоты. 5 г (27,5 ммоль) продукта из шага а) суспендировали в 100 мл раствора 0,1 М КН 2 РO4 с последующим добавлением 20 мг эстеразы свиной печени. рН раствора поддерживали при значении 7 добавлением капельно раствора 1 МNaOH. После добавления 1 М NaOH, соответствующего одномолярному эквиваленту диэфира,раствор обрабатывали древесным углем, перемешивали в течение 5 мин и фильтровали через селит. Фильтрат экстрагировали эфиром и объединенные органические экстракты отбрасывали. Водную фазу закисляли при помощи 3N НСl и снова экстрагировали эфиром. Объединенные эфирные экстракты высушивали (Na2SO4) и выпаривали в вакууме. Остаток возгоняли под пониженным давлением (105-110 С, 0,5 mm Hg),оставляя 4 г масла, соответствующего названному соединению. в) Синтез 4-метоксикарбонил-2-дегидробутил изо-цианата. 1,22 г (7,3 ммоль) моноэфира из шага б) растворяли в 25 мл бензола. 0,76 мл (8,7 ммоль) оксалил хлорида добавляли капельно в течение 15 мин и интенсивно перемешивали раствор в течение 3 ч. Раствор выпаривали под вакуумом. Остаток, растворенный в 10 мл ацетона, добавляли к предварительно охлажденному раствору(0 С) азида натрия, 1 г в 20 мл 50% раствора вода/ацетон. После 30 мин смесь разводили водой (50 мл) и экстрагировали 3 раза порциями бензола по 20 мл. Объединенные органические экстракты высушивали (Na2SO4) и фильтровали. Фильтрат нагревали в масляной бане при 80 С до того, пока более не наблюдалось выделение азота. Растворитель выпаривали под вакуумом и остаток возгоняли под пониженным давлением(80-85 С, 0,5 mm Hg), получая 700 мг названного соединения. г) Синтез 4-N-бутилоксикарбонилпентотриеноиковой кислоты 890 мг терт-бутанола (12,2 ммоль) добавляли к раствору, содержащему продукт из шага в) (1 г, 6,1 ммоль) в 25 мл бензола. Полный раствор сливали в течение 10 ч, после чего его высушивали под вакуумом. Остаток обрабатывали эстеразой свиной печени, как описано на шаге б), и продолжали, как описано, получая 700 мг названного соединения. 14 Продукт из шага г) далее использовали как единицу при приготовлении синтетического спейсера II. Эти единицы собирают вместе для формирования спейсера (II), используя методики, которые хорошо известны работающим в области. Пример 9. Приготовление Р 79 Ас-(D)ФенПро 45-Арг-(СОСН 2)СН 2-(СО)-Глн-Сер 50-ГисАсн-Асп-Гли-Асп 55-Фен-Глу-Глу-Иле-Про 60 Глу-Глу-Тир-Лей-ГлнОН. 1 г терт-бутилоксикарбонил-Глн фенилацетамидометиловой смолы (Applied Biosystems; 0,64 ммоль/г) проводили через 16 циклов синтеза, включающих снятие защиты с nбоковой цепи (50% TFA в СH2Cl2) и образование связи с использованием 2,5 мэкв комплекса защищенная аминокислота/DDC иNгидроксибензотриазола. Группы защиты боковых цепей стандартных аминокислот были следующими: Асп (циклогексил), Глу (бензил), Гис(бензил). Синтетические защищенные аминокислоты из примера 3 соединяли с Глн 49, также используя DCC/N-гидроксибензотриазол. Для оптимальных результатов N-ВОС-(D)-Фен-ПроОН мог быть добавлен к одиночной единице вместо индивидуальных аминокислот. Полностью защищенную пептидную смолу(500 мг) обрабатывали фтороводородом в тефлоновом сосуде, содержащем анизол и диметилсульфид (10% по объему) при -5 С в течение 60 мин. Избыток HF удаляли под струей N2 и оставшуюся массу экстрагировали эфиром, и фильтровали. Смолу экстрагировали трижды ледяной уксусной кислотой и водой с последующей лиофилизацией. Лиофилизированный грубый белок очищали до гомогенности хроматографией на обращенной фазе на стеклянной колонке с octadecyl(15, Vydac) (1,5 х 30 см), 40 ф/дюйм 2, используя линейный градиент системы растворителей, состоящий из (а) 500 мл 0,1% TFA/H2O и(1), Фен (2), Гис (1), Про (2). Полученный пептид демонстрировал псевдо-молекулярный ион, соответствующий 2548.6. Пример 10. Приготовление Р 183. Ас-(D)-Фен-Про-Арг-[(СО)-СН 2]СН 2 СН 2 СН 2-(СО)-[NН-СН 2-СН=СН-СН 2-(СО)]Асп-Фен-Глу-Про-Иле-Про-Лей-ОН. Названное производное пептида синтезировали и очищали в точности, как описано для Р 79 и его гомологов с небольшими модификациями. Например, твердофазный синтез начинали с терт-бутилоксикарбонил-Лей-фенилацета 15 мидометил полистиреновой смолы (Applied Biosystems, 0,64 ммоль/г). Для снятия защиты tBOC группы, следующей за остатком Асп, использовали 50% раствор TFA в СН 2 С 12, содержащий 10% этилметилсульфида. При таком способе выход названного пептида был оптимизирован до более, чем 60%, по жидкостной хроматографии под высоким давлением (УФ абсорбция при 215 нм). Р 184 и Р 185 приготавливали сходным с Р 183 образом. Р 184 Ас-(D)-Фен-Про-Арг[(СО)СН 2]СН 2 СН 2 СН 2(СО)-[NН-СН 2-СН=СНСН 2-(СО)]2-Асп-Фен-Глу-Про-Иле-Про-ЛейОН. Аминокислотный анализ показал: Асп(1,88), Про (3,6). Псевдомолекулярный ион: 1647. Производное пептида (I) (D)-Фен-ПроАрг-(СН 2)4(СО)-[NН(СН 2)4 СО]4-Асп-Фен-ГлуПро-Иле-Про-Лей было приготовлено сходным с Р 183, Р 184 и P185 образом, за тем исключением, что вместо [NH-CH2-CH=CH-CH2-(CO)] был использован синтетический остаток аминовалериановой кислоты. Аминокислотный анализ показал: Асп(1,96), Про (2,86). Пример 11. Амидолитический анализ активности тромбина. Катализируемый тромбином гидролиз ТозГли-Про-Арг-рNА оценивали при 405 нм на двулучевом спектрофотометре Varian Сагу 2000, используя концентрации 2,5, 3,5, 5 и 10 М в конечном объеме 1 мл. Гидролитические реакции проводили при 25 С в 0,1 М буфере трис-HCl, рН 7,8, содержащем 0,1 М NaCl и 0,1% ПЭГ 6000. Реакции инициировали добавлением субстрата, растворенного в 0,1 М буфере трисHCl, рН 7,8, к предварительно проинкубированному раствору фермента (0,4 или 0,04 нМ) и различным концентрациям ингибитора, растворенном в том же буфере. В случае конкурентного ингибирования записывали первоначальные скорости, и значения Кi определяли графически весовой регрессией плотов Диксона или, для гиперболического ингибирования, методом Байси (Baici, 1981). Флюорогенные анализы проводили, используя те же условия и инструменты, что и выше, используя способы флюо 000088 16 ресценции и пропорций (ех=383 нм, em =455 нм). Интенсивности флюоресценции подсчитывали по раствору 7-амино-4-метил кумарина известной концентрации. Специфичность производного синтетического пептида настоящего изобретения к человеческому -тромбину также может быть определена путем сравнения его относительных ингибиторных активностей по отношению и к человеческому и бычьему тромбинам, и к трипсину путем сравнения значений Кi, полученных при амидолитическом анализе активности тромбина. Следовательно, ингибиторная активность производного пептида настоящего изобретения по отношению к тромбину может также быть анализирована путем определения времени протромбина (ВП, внешний путь синтеза) или времени активированного частичного тромбопластина (ВАЧТ, внутренний путь синтеза) объединенной рекомпанованной нормальной человеческой плазмы, используя прибор Coag-AMate 2001 (General Diagnostics, Inc., MorrisPlanes, New Jersey) или другой подходящий спектрофотометр. Таким образом, для определения времени протромбина смешивают 50 л рекомпанованной цитрованной нормальной человеческой плазмы (Sigma, St-Louis, МО.) с 50 л раствора тромбопластина при 37 С в кювете объемом 400 л. Далее смесь обрабатывают либо 200 л буфера трис-HCl, рН 7,8, (содержащего 0,1MNaCl, 0,1% ПЭГ 6000), либо различными концентрациями ингибитора в том же буфере. Время образования сгустка оценивали после рекальцинирования со 100 л 25 mM СаСl2. Время образования сгустка в отсутствие ингибитора было между 19-22 с. Ту же процедуру адаптировали для определения времени активированного частичного тромбопластина за исключением того, что рекомпанованную плазму активировали цефалином в течение 3 мин (Sigma, St-Louis, МО). На ингибиторной активности производного пептида по отношению к тромбину отражается его способность ингибировать опосредованное тромбином слипание тромбоцитов, которое определяется по увеличению передачи света,что измеряется на аггрегометре Bio Data PAP-4. Анализ образования сгустка фибриногена. Ингибирование образования сгустка фибриногена измеряли спектрофотометрически при 405 нм на Varian DMS 90 при 37C. В полистиреновой кювете смешивали 300 л 0,1 % фибриногена (Sigma) в 0,1 М трис-HCl, рН 7,8, содержащем 0,1 М NaCl, 0,1% ПЭГ 600 и различные концентрации ингибитора в том же буфере,и инициировали реакцию в общем объеме 1 мл добавлением фермента (человеческого или бычьего -тромбина, 0,4 нМ). Определяли время от смешивания до флексии вследствие формирования сгустка для различных концентраций ингибитора и подсчитывали значения IС 50 анализом log probit. Концентрации ингибиторов в анализе были основаны на содержании пептида. Многие другие анализы могут быть использованы для определения противосвертывающей активности производного пептида настоящего изобретения. Так, ингибиторная активность производного пептида по отношению к тромбину также может быть проанализирована ингибированием времени активированного частичного тромбопластина (ВАЧТ, внутренний путь синтеза или времени протромбина, ВП,внешний путь синтеза). Таким образом, противосвертывающая активность может быть определена анализированием ВАЧТ объединенной нормальной человеческой плазмы с использованием прибора Coag-A-Mate 2001 (General Diagnostics Inc., Morris Planes, New Jersey). Кроме того, производное пептида настоящего изобретения может быть протестировано для ингибирования катализируемого тромбином гидролиза трипептидил Р-нитроанилида на субстрате(Chromozym ТН, Boehringer-Mannheim, Indianapolis, In.) спектрофотометрически при 420 нм на двулучевом спектрофотометре Сагу 219. Реакции могут быть приготовлены путем смешивания раствора тромбина с буфером трис-HCl,рН 7,4, NaCl. Эти анализы, будучи проведенными с использованием производного пептида настоящего изобретения, демонстрируют, что оно действует как бифункциональный ингибитор тромбина. Действительно, было продемонстрировано,что введение двух критических областей пептида, разделенных подходящими спейсерами,обеспечивало мощные ингибиторы тромбина. Результаты показаны в таблице. Соединение(I) 100 1,3 3,1 1 0,7 доза гепарина, необходимая для вызывания удвоения раскрытого состояния, равна 200 U/кг;- значения не определены; значения являются средними из 3-5 наблюдений; время раскрытия в контрольной группе крыс (обработанных соляным раствором) равно 191 мин (n=11);- концентрация соединения, необходимая для увеличения в два раза времени тромбина в буфере, содержащем фибриноген;- концентрация соединения, необходимая для ингибирования времени образования сгустка в человеческой плазме на 50%. Очевидно, что введение двух сайтов связывания, разделенных подходящим линкером, в единственную молекулу существенно увеличивает сродство соединений к тромбину. В действительности, комбинирование отдельных IC50 доз двух независимых областей приводит к точному удвоению времени образования сгустка, в то время как большую активность получают,если две области соединены линкером. Следовательно, получается, что двойное кооперативное связывание бифункциональных ингибиторов настоящего изобретения имеет место, когда они находятся в контакте с тромбином. Линкер служит как подходящий спейсер для образования связи вспомогательного сайта (область (ii и каталитического сайта (область (i, как и аполярный связывающий сайт, примыкающий к каталитическому сайту. Модель тромбоза, индуцированного повреждением с хлоридом железа. Виды: крысы, мужской пол, SpragueDawley, вес 375-450 г. Анализы модели артериального повреждения, индуцированного FeCl3, проводили в соответствии с Куртц с соавторами (Kurz, KD.,Main, R.W., Sandusky, G.E., Thrombosis research,60; 269-280, 1990) и Шумахер с соавторами(Schumacher, W.A. et al., J.Pharmacology and Experimental Therapeutics, 267; 1237-1242,1993). Мужские особи, Sprague-Dawley (375-450 г) получали анестезию с использованием Urethane (1500 мг/кг IP). Животных укладывали на подогревающийся коврик с поддержанием температуры при 37C. Сонную артерию достигали через срединный затылочный надрез. Использовали осторожное тупое вскрытие для достижения и изолирования сосуда из оболочки сонной артерии. Используя хирургические щипцы, приподнимали артерию для обеспечения зоны видимости, чтобы ввести под нее две небольшие полиэтиленовые трубки (РЕ-205). Температурный зонд (Physitemp МТ 23/3) помещают между РЕ-205 и артерией. Температура сосуда контролируется в течение 60 мин после приложения FeCl3. Изменения температуры сосуда учитываются на термистере (Cole-Palmer Model 08533-41). Повреждение индуцируют путем приложения небольшого диска (3 мм в диаметре) фильтровальной бумаги WhatmanТМ No.1,предварительно смоченной в 35% раствореFeCl3, на сонную артерию выше температурного зонда. Область эксперимента закрыта алюминиевой фольгой для защиты FeCl3 от деградации светом. Время между приложением хлорида железа и временем, в которое температура сосуда резко падает ( 2,4 С), зачитывается как время закупорки сосуда (ВЗС). Перед началом эксперимента забирают одну пробу крови (1 мл) в пробирку с буферным раствором 0,105 М цитрата (из глазной пазухи) и полностью обескровливают животное. Все пробы хранят на льду и центрифугируют как можно быстрее при 2000 rpm в течение 10 мин при 4 С. Плазму анализируют в дублях по времени активированного частичного тромбопластина на гемостатическом анализаторе (STAGO ST4). В группе из четырех животных две артерии сохранили при -80 С для дальнейших анализов. Другие просматривали под световым микроскопом при 40 х (Leica) для подсчета сгустков (полные, частичные, нет сгустков). Анализ аггрегации тромбоцитов. Человеческие тромбоциты были отделены из донорской крови, и приготовлены дважды промытые суспензии в соответствии со способом, описанным Пакманом с соавторами (Packman et а 1). Кровь крыс собирали в ACD (6:1,о/о) сердечной пункцией. Суспензии промытых тромбоцитов готовили, как описано Эрдлай с соатворами (Ardlie et al., Br. J. Haematol. 1970,19:7, Proc. Soc. Exp. Bio. Med. 1971, 136:1021). Конечной средой для суспензии был модифицированный раствор Tyrode (NaCl 138 mM, KCl 2,9 mM, HEPES 20 mM, NaH2PO4 0,42 mM,CaCl2 1M, MgCl2 2 mM, 0,1% глюкоза, 0,35% альбумин, апираза (lul/мл) рН 7,4). Подсчеты тромбоцитов были приведены к 5000,000/ul. Для обеспечения измерения продолжительности высвобождения содержимого плотных гранул тромбоциты метили 14 С-серотонином в первом растворе для промывки (luCi/10 мл промывающей жидкости) и определяли высвобождение 20 14 С-серотонина. Для предотвращения обратного связывания высвобожденного серотонина добавляли импрамин (в конечной концентрации 5 uM). Для анализа использовали аггрегометр тромбоцитов (4-канальный BioData РАР 4, Hatboro, PA, USA). Процент аггрегации определяли спустя 3 мин после добавления стимулирующего агента (человеческого, в конечной концентрации 0,1 U/мл). Ингибиторы преинкубировали перед добавлением стимулирующего агента в течение 1 мин при 37C. Значениями IС 50 являлись концентрации, необходимые для ингибирования аггрегации тромбоцитов или секреции до 50% контроля. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Производное пептида (I):(D)-Фен-Про-Арг-(СН 2)4(СО)-[NН(СН 2)4 СО]2 Асп-Фен-Глу-Про-Иле-Про-Лей и его фармацевтически приемлемые соли. 2. Состав для лечения тромботических заболеваний, содержащий эффективное количество производного пептида (I)(D)-Фен-Про-Арг-(СН 2)4(СО)-[NН(СН 2)4 СО]2 Асп-Фен-Глу-Про-Иле-Про-Лей и его фармацевтически приемлемые соли. 3. Способ лечения или профилактики сосудистых заболеваний, относящихся к тромбозу,который состоит из введения пациенту эффективного количества состава по п.2.