Повышение выхода экспрессии протеина в системах бесклеточного синтеза протеинов путём добавления антипенных присадок

010837 Предпосылки создания изобретения Синтез протеинов является одним из фундаментальных процессов, лежащих в основе развития полипептидных лекарственных препаратов, диагностических средств и катализаторов. С появлением технологии рекомбинантной ДНК (р-ДНК) стало возможным использование каталитических механизмов клетки для получения желаемого протеина. Эта цель может достигаться в клеточной среде либо in vitro с применением экстрактов, получаемых из клеток. На протяжении последнего десятилетия производительность бесклеточных систем возросла на два порядка - от приблизительно 5 до приблизительно 500 мкг/мл/ч. Это достижение превратило синтез протеинов in vitro в практический метод лабораторных исследований и заложило основы технологии высокопроизводительной экспрессии протеинов. Оно также начинает наводить специалистов на мысль о целесообразности применения бесклеточных технологий в качестве альтернативы крупномасштабному производству протеиновых лекарственных средств in vivo. Бесклеточный синтез протеинов обладает некоторыми преимуществами перед обычными способами экспрессии протеинов in vivo. Бесклеточные системы позволяют направить большинство метаболических ресурсов клетки (или даже все такие ресурсы) на продуцирование только одного протеина. Кроме того, отсутствие клеточных оболочек in vitro позволяет более эффективно регулировать среду синтеза. Например, оказывается возможным изменение уровней транспортной РНК (т-РНК) для отражения использования кодонов выражаемых генов. Окислительно-восстановительный потенциал, pH или ионную силу также можно регулировать более гибко, чем in vivo, поскольку рост или жизнеспособность клеток можно не принимать во внимание. Далее, можно легко обеспечить непосредственное извлечение очищенных и надлежащим образом формированных протеиновых продуктов. Трансляция in vitro также получила признание в связи с возможностью встраивания в синтезируемый продукт не встречающихся в природе или меченых изотопами аминокислот, а также получения протеинов, неустойчивых, нерастворимых или цитотоксичных in vivo. Кроме того, бесклеточный синтез протеинов может сыграть определенную роль в коренном изменении технологии производства протеинов и протеомитозного скрининга. Бесклеточный метод позволяет исключить трудоемкие процессы, необходимые для клонирования и трансформирования клеток с целью экспрессии новых генных продуктов, и становится основой технологии в этой области. Несмотря на такие многообещающие особенности бесклеточного синтеза протеинов, его практическому применению и крупномасштабному внедрению препятствуют некоторые недостатки. Главными из них являются кратковременность реакции и низкая производительность по протеинам, что приводит к низким выходам протеина и высоким расходам на реагенты. В пионерской работе Спирина и др. (Spirinet al. (1988) Science 242:1162-1164) вначале было предложено обойти проблему кратковременности реакции путем разработки проточной системы непрерывного действия. Эта работа была воспроизведена и усовершенствована во многих лабораториях, однако во всех этих случаях использовались, главным образом, способы, связанные с непрерывной подачей субстратов в реакционную камеру. При таком подходе увеличивается длительность реакции трансляции и повышается выход протеина по сравнению с системой периодического действия. Однако такой способ является неэффективным с точки зрения расхода дорогостоящих реагентов, позволяет получать, как правило, разбавленные продукты и не обеспечивает значительного повышения производительности. Обычные системы периодического действия обладают несколькими преимуществами перед упомянутыми непрерывными и полунепрерывными схемами, к которым относятся простота увеличения масштабов производства, воспроизводимость, повышенная производительность по протеину, удобство, возможность использования многократных операций для обеспечения высокой производительности экспрессии и более эффективное использование субстрата. В связи с этими преимуществами повышение производительности периодических систем является ключевым моментом с точки зрения промышленного применения бесклеточного синтеза протеинов. Однако проведение реакций в увеличенном масштабе с применением существующих технологий приводит к понижению эффективности. Понижение выхода конкретных протеиновых продуктов особенно значительно в системах, где требуется кислород для окислительного фосфорилирования. Существенным моментом с точки зрения удовлетворения этой потребности является повышение выхода продукта при проведении реакций в увеличенном масштабе. Литературные источники по затронутым проблемам:-1 010837 Краткое описание сущности изобретения Предлагаются композиции и способы для синтеза биологических молекул in vitro в реакционных смесях, содержащих антипенные присадки. Добавление антипенных присадок к реакционным смесям бесклеточного синтеза обеспечивает повышение удельного выхода протеинов. Согласно одному из вариантов осуществления изобретения реакционной смесью, содержащей антипенную присадку, является реакционная смесь для получения протеинов в увеличенном масштабе, например, при объемах реакционной смеси, превышающих минимум 15 мкл. Реакции можно проводить в различных типах реакторов,известных в отрасли, в том числе в барботажных колоночных реакторах. Краткое описание рисунков На фиг. 1 графически представлен выход протеина в реакционных смесях, содержащих различные антипенные присадки. На фиг. 2 схематически представлен барботажный реактор. На фиг. 3 графически представлен выход протеина GMCSF-scFv в барботажной колонке при суммарном объеме реакционной смеси 1500 мкл в сравнении с объемом смеси 15 мкл. На фиг. 4 графически представлен выход в барботажной колонке при объеме реакционной смеси 2000 мкл в сравнении с тонкопленочным реактором при объеме смеси 200 мкл и реакцией в пробирке Эппендорфа при объеме смеси 15 мкл. При добавлении антипенной присадки во всех этих системах достигаются сравнимые значения удельного выхода. Подробное описание вариантов осуществления изобретения Предлагаются композиции и способы для синтеза биологических молекул in vitro в реакционных смесях, содержащих антипенные присадки, с целью повышения суммарного выхода протеина, выхода растворимого и активного протеинов, синтезируемых в бесклеточных системах. Добавление антипенных присадок обеспечивает повышение выхода при проведении реакций в малом масштабе, однако, особые преимущества достигаются при проведении реакций в увеличенных масштабах, в частности, в реакторах,где обеспечиваются аэробные условия. Термин синтез in vitro в значении, употребляемом в настоящем описании, относится к бесклеточному синтезу биологических макромолекул в реакционных смесях, содержащих биологические экстракты и/или определенные реагенты. Реакционная смесь содержит матрицу для продуцирования макромолекулы, например, ДНК, информационную РНК (и-РНК) и т.п.; мономеры для синтезируемой макромолекулы, например, аминокислоты, нуклеотиды и т.п.; и кофакторы, ферменты и другие реагенты, необходимые для синтеза, например, рибосомы, т-РНК, полимеразы, транскрипционные факторы и т.п. Такие синтетические реакционные смеси хорошо известны в отрасли и описаны в литературе. В способах по настоящему изобретению могут быть применены многочисленные химические реакции для синтеза полипептидов. Такие схемы реакций описаны, например, в патентах США 6337191 от 8 января 2002 г., и 6168931 от 2 января 2001 г., включенных в настоящее описание посредством ссылок. Согласно одному из вариантов осуществления изобретения схема реакции соответствует описанию,приведенному в одновременно рассматриваемой заявке на патент США 10/643683, включенной в настоящее описание посредством ссылки. В этой схеме активируется окислительное фосфорилирование,обеспечивающее повышенные выходы и повышенную эффективность использования источников энергии. Повышенный выход достигается за счет сочетания факторов, в том числе применения биологических экстрактов из бактерий, культивированных на среде, содержащей глюкозу, отсутствия полиэтиленгликоля и оптимизированной концентрации магния. Таким образом, обеспечивается гомеостатическая система, в которой синтез может протекать даже в отсутствии вторичных источников энергии. Специалистам в данной отрасли хорошо известно, что эксплуатационные характеристики биореакторов резко изменяются в зависимости от масштаба. В системах большого объема возникают затруднения, связанные с обеспечением однородности, изменением соотношения поверхности и объема и изменениями в самих реакциях вследствие увеличения временных интервалов. Помимо этих осложнений,реакции синтеза протеинов in vitro, в которых активируется окислительное фосфорилирование, могут требовать повышенного расхода кислорода для достижения оптимальных эксплуатационных показателей, причем при увеличении объема реакционной смеси подача кислорода затрудняется. Неограничительными примерами наиболее распространенных типов реакторов являются резервуары с перемешиванием, барботажные колоночные реакторы и эрлифтные реакторы, работа которых основана на барботаже газа для перемешивания, и др. Для реализации условий реакции получения цитомима(Cytomim) предпочтительным типом реактора может быть барботажный колоночный реактор. К осложнениям, часто встречающимся при проведении ферментации в промышленных условиях,относится вспенивание, которое является нежелательным по различным соображениям, в том числе с точки зрения возможности попадания в ферментатор загрязняющих клеток. Вспенивание в клеточных культурах устраняют путем добавления поверхностно-активных химических соединений, хотя такие антипенные присадки обычно приводят к снижению значений KLa, понижению способности реактора обеспечивать поступление кислорода и других газов, а также могут подавлять рост клеток. Что касается синтеза in vitro, можно ожидать, что гидрофобные компоненты антипенных присадок могут препятствовать синтезу и формированию протеинов, поскольку катализаторы и возникающие продукты не защищены-2 010837 оболочками клеток, как при экспрессии протеинов in vivo, например, при обычных способах рекомбинантной экспрессии. Поэтому результаты, достигнутые по настоящему изобретению, являются неожиданными. Антипенные присадки Реакционные смеси для синтеза протеинов in vitro по настоящему изобретению содержат антипенные присадки. Массовая концентрация таких присадок в смесях составляет по меньшей мере приблизительно 0,00007% и может составлять по меньшей мере приблизительно 0,0001%, но не более приблизительно 0,001%, обычно не более приблизительно 0,007%. Для регулирования скорости подачи антипенной присадки при проведении реакций в непрерывном режиме можно применять различные способы регулирования, в том числе подачу фиксированных аликвотных количеств, регулирование по требованию, пропорциональное, интегральное регулирование и/или регулирование по производной, либо сочетание этих способов. Оптимальные количества добавляемой антипенной присадки зависят от таких переменных параметров, как условия реакции, тип антипенной присадки и т.п. Оптимальные количества добавляемых антипенных присадок и возможные интервалы времени между операциями добавления можно определить эмпирически в процессе пробных синтезов. Термин антипенная присадка в значении, употребляемом в настоящем описании, означает поверхностно-активное химическое соединение, прибавляемое к реакционной смеси с целью упрощения разрушения газовых пузырьков и выделения газа, а также для противодействия вспениванию, которое может возникать вследствие смешения, барботажа или перемешивания. Антипенные присадки могут предотвращать, устранять или ослаблять пенообразование. Антипенные присадки могут дополнительно придавать компонентам смеси вспомогательные положительные поверхностные характеристики, например, способствовать смачиванию, диспергированию, эмульгированию, растворению, текучести и выравниванию, адгезии и глянцу. В качестве антипенных присадок могут быть использованы многочисленные химические соединения, неограничивающими примерами которых являются алкиловые простые эфиры полиоксиалкиленгликолей, сложные эфиры, спирты, силоксаны, силиконы, сульфиты, сульфонаты, жирные кислоты и их производные и т.д. Известны и имеются на рынке разнообразные продукты такого назначения, выпускаемые, например, фирмами Sigma Chemicals, J.T. Baker и др. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения, противопенная присадка не является детергентом. К антипенным присадкам, представляющим интерес, относятся блок-сополимеры, обеспенивающее/антипенное действие которых обеспечивается путем образования нерастворимого мономолекулярного слоя в пене на поверхности раздела воздух/вода. Обеспенивающее действие блок-сополимера зависит как от точки помутнения сополимера, так и от температуры его применения. Для обеспечения эффективного обеспенивания выбирают блок-сополимер, точка помутнения которого лежит ниже установленной температуры применения. Наиболее эффективными обеспечивающими реагентами являются блок-сополимеры с низким содержанием оксида этилена. В качестве обеспенивающих присадок широко применяются поверхностно-активные вещества типа PLURONIC. Поверхностно-активные вещества с обращенной структурой типа PLURONIC R также эффективны в качестве обеспенивающих присадок. К другим антипенным присадкам, представляющим интерес, относятся силоксановые полимеры, смеси дисперсий органических несиликоновых простых эфиров на основе полипропилена, жирные кислоты и сложные эфиры и т.п. Химизм реакций Матрицей при бесклеточном синтезе протеинов может быть либо и-РНК, либо ДНК. Превращение содержащейся в матрице информации в протеин осуществляется путем трансляции стабилизированной и-РНК либо путем комбинированной транскрипции и трансляции. Комбинированная система, как правило, используемая в системах Е. coli, непрерывно генерирует и-РНК из матричной ДНК с помощью распознаваемого промотора. Используется либо эндогенная РНК-полимераза, либо экзогенная фаговая РНКполимераза, как правило, Т 7 или SP6, придаваемая непосредственно к реакционной смеси. В альтернативном варианте и-РНК может непрерывно амплифицироваться путем введения информации в матрицу для QB-репликазы - РНК-полимеразы, зависимой от РНК. Очищенную и-РНК перед добавлением к реакционной смеси, как правило, стабилизируют путем химического модифицирования. С целью содействия стабилизации уровней и-РНК можно удалять из экстрактов нуклеазы. Матрица может кодировать любой конкретный ген, представляющий интерес. Можно добавлять также другие соли, особенно те, которые играют определенную биологическую роль, например соли магния. Калий вводят, как правило, в концентрациях от 50 до 250 мМ и аммоний от 0 до 100 мМ. Значение pH реакционной смеси обычно поддерживают в пределах от 6 до 9. Температура реакционной массы обычно лежит в пределах от 20 до 40 С. Эти диапазоны могут быть расширены. К реакционной смеси можно добавлять метаболические ингибиторы нежелательной ферментационной активности. В альтернативном варианте ферменты или факторы, ответственные за нежелательную активность, можно удалять непосредственно из экстракта. Согласно третьему варианту ген, кодирующий нежелательный фермент, можно инактивировать или стирать из хромосомы.-3 010837 В систему можно вводить также везикулы, либо выделенные из организма-хозяина и очищенные,либо полученные синтетически. Их можно применять для повышения эффективности синтеза и формирования протеина. Показано, что эта технология цитомима активирует процессы, в которых мембранные везикулы, содержащие компоненты дыхательной цепочки, используются для активирования окислительного фосфорилирования. Способы по настоящему изобретению можно использовать для бесклеточной экспрессии с целью активирования других совокупностей мембранных протеинов. К системам синтеза, представляющим интерес, относятся репликация ДНК, которая может включать амплификацию ДНК, транскрипцию РНК с матриц ДНК или РНК, трансляцию РНК в полипептиды и синтез сложных углеводов из простых сахаров. Реакции можно проводить в крупном масштабе, в малом масштабе или в параллельных системах для одновременного проведения нескольких синтезов. Для увеличения продолжительности периода активного синтеза можно вводить дополнительные реагенты. Синтезированный продукт обычно накапливается в реакторе, а затем, после завершения работы системы, его выделяют и очищают обычными методами очистки протеинов. Особый интерес представляет трансляция и-РНК для получения протеинов; эту трансляцию можно сочетать с синтезом и-РНК in vitro из матрицы ДНК. Такие бесклеточные системы содержат все факторы,необходимые для трансляции и-РНК, например, рибосомы, аминокислоты, транспортные РНК, аминоацилсинтетазы, факторы удлинения цепи и факторы инициирования. Известные в отрасли бесклеточные системы включают экстракты Е. coli и другие экстракты, которые можно обработать соответствующими нуклеазами для удаления активной эндогенной и-РНК. Помимо вышеупомянутых компонентов, например, бесклеточного экстракта, генетической матрицы и аминокислот, к реакционной смеси можно добавлять материалы, конкретно необходимые для синтеза протеинов. К таким материалам относятся соли, полимерные соединения, циклический аденозинмонофосфат (сАМР), ингибиторы ферментов разложения протеинов или нуклеиновых кислот, ингибиторы или регуляторы синтеза протеинов, регуляторы окислительно-восстановительных свойств среды, поверхностно-активные вещества, не обладающие денатурирующими свойствами, буферные компоненты,спермин, спермидин и др. К солям относятся предпочтительно калиевые, магниевые, аммонийные и марганцевые соли уксусной или серной кислот, и некоторые из этих солей могут иметь в качестве противоионов аминокислоты. К полимерным соединениям относятся полиэтиленгликоль, декстран, диэтиламиноэтилдекстран, четвертичный аминоэтил- и аминоэтилдекстран и т.п. К регуляторам окислительных или восстановительных свойств среды относятся дитиотреитол, аскорбиновая кислота, глутатион и/или их оксиды. Может быть использовано также поверхностно-активное вещество, не обладающее денатурирующими свойствами,например Triton Х-100, в концентрации 0-0,5 М. Для повышения эффективности синтеза протеина можно применять спермин и спермидин, а в качестве регулятора экспрессии генов - сАМР. При изменении концентрации конкретного компонента в реакционной среде можно соответствующим образом изменять концентрацию другого компонента. Например, можно одновременно регулировать концентрации нескольких компонентов, например, нуклеотидов и соединений, служащих источниками энергии, в соответствии с изменениями концентраций других компонентов. Уровни концентрации компонентов в реакторе можно также варьировать во времени. Предпочтительно pH реакционной массы поддерживают в пределах от 5 до 10 и температуру в пределах от 20 до 50 С; более предпочтительно поддерживать pH в пределах от 6 до 9 и температуру - от 25 до 40 С. Количество протеина, полученного в результате реакции трансляции, можно измерять различными способами. Один из этих способов основан на возможности выполнения испытания для измерения активности конкретного транслированного протеина. Примерами испытаний для измерения активности протеинов являются испытательная система с люциферазой и система с хлорамфеникальацетилтрансферазой. При этих испытаниях измеряют количество функционально активного протеина,образовавшегося в результате реакции трансляции. При испытаниях активности не измеряется количество протеина с полной длиной цепи, который не является активным вследствие ненадлежащего формирования протеина или отсутствия посттрансляционных модификаций, необходимых для обеспечения активности протеина. Другим способом измерения количества протеина, полученного в результате комбинированных реакций транскрипции и трансляции in vitro, является проведение реакций с применением известного количества радиоактивно меченой аминокислоты, например, 35S-метионина или 14 С-лейцина, с последующим измерением количества меченой аминокислоты, встроенной во вновь транслированный протеин. При таких испытаниях измеряется количество меченых аминокислот во всех протеинах, образовавшихся при реакции трансляции in vitro, в том числе в протеиновых продуктах с усеченными цепями. Меченый протеин можно затем отделить на протеиновом геле и подтвердить методом ауторадиографии, что продукт имеет надлежащую длину цепи и что вторичные протеиновые продукты не образовались.-4 010837 Реакционные объемы и геометрия реакторов Хотя реакционные смеси могут иметь любой объем, способы по настоящему изобретению особенно целесообразно применять при проведении реакций в увеличенных масштабах, когда реакционный объем составляет по меньшей мере приблизительно 15 мкл, обычно по меньшей мере приблизительно 50 мкл,чаще по меньшей мере приблизительно 100 мкл и может достигать 500 мкл, 1000 мкл, 5000 мкл или более. Во многих случаях отдельные реакционные смеси не могут иметь объем более чем приблизительно 10 мл, хотя возможно проведение нескольких параллельных реакций. Однако ожидается также, что настоящее изобретение обеспечит возможность увеличения масштабов проведения реакций в значительно больших объемах, применяемых, например, в промышленных биореакторах, которые могут иметь объем 1, 10, 100, 1000 л и более. Хотя реакционная смесь может содержать липиды, например инвертированные везикулы, она обычно не ограничена поверхностью двойного липидного слоя. Термин малый масштаб в значении, употребляемом в настоящем описании, относится к реакционным смесям, имеющим объем приблизительно 15 мкл или менее. Способы по настоящему изобретению позволяют проводить реакции в увеличенных масштабах, описанных выше, при сохранении значений выхода, практически сопоставимых с выходами в маломасштабных реакциях. Выход можно рассчитать обычным методом, если он выражается одинаково для различных реакций, например, как общее количество синтезированного протеина на 1 мл реакционной смеси; количество растворимого протеина на 1 мл реакционной смеси; количество биологически активного протеина на 1 мл реакционной смеси; и т.п. Выход при проведении реакций в увеличенном масштабе по сравнению с сопоставимой маломасштабной реакцией (т.е. в случаях, когда реакционные смеси содержат те же самые компоненты и отличаются только объемом) обычно составляет по меньшей мере приблизительно 90%, чаще по меньшей мере приблизительно 95% и может достигать по меньшей мере приблизительно 99%. В некоторых случаях отмечено реальное повышение выхода при проведении реакции в реакционной смеси по настоящему изобретению в увеличенном масштабе. Система может работать в аэробных и анаэробных условиях, предпочтение отдается аэробным условиям. Для предотвращения высыхания реакционной смеси в свободном объеме реактора можно обеспечивать повышенную влажность, обычно по меньшей мере приблизительно 80% значения насыщения при рабочей температуре, чаще по меньшей мере приблизительно 90% значения насыщения при рабочей температуре. В лабораторных условиях обычно достаточно герметизировать реакционную камеру, создавая над реакционной массой замкнутый газовый объем. Свободный объем реакционной камеры можно заполнять кислородом либо вводить кислород в реакционную смесь. Кислород можно подавать в свободный объем реакционной камеры непрерывно или (при увеличенной длительности реакции) периодически заполнять кислородом упомянутый объем в процессе экспрессии протеина. Помимо кислорода, в клеточный экстракт, предварительно индуцированный для обеспечения соответствующей последовательности дыхательных реакций, можно вводить другие электроноакцепторные соединения, например нитраты. Условия проведения реакции с аэрированием можно обеспечить в барботажной колонке. В барботажной колонке в заполненный жидкостью контейнер вдувается воздух. Путем вдувания газа в жидкую фазу, например в колонке, можно диспергировать газ, получая газовые пузырьки. Газ, например кислород или кислородсодержащую газовую смесь, можно диспергировать с образованием пузырьков с помощью распределительных пластин, покрывающих всю площадь сечения колонки, а также с применением эрлифтных реакторов, где воздух заключен в канале, образованном циркуляционной или отсасывающей трубой, придающей реактору в целом вид некоторого циркуляционного контура. В отрасли известны разнообразные конфигурации колонок, различающиеся по размерам, расположению перегородок, наличию свободного объема и т.д. См., например, монографию Барботажные колоночные реакторы (BubbleColumn Reactors, W.-D. Deckwer, ISBN 0471918113); публикации Олдшу (Oldshue, 1983, Biotechnol. Adv. 1(1): 17-30), Поулсена и Иверсена (Poulsen and Iversen, 1999, Biotechnol. Bioeng. 64(4):452-458 и 1998,Biotechnol. Bioeng. 58(6):633-41), включенные в настоящее описание посредством ссылок. Следует иметь в виду, что настоящее изобретение не ограничено описанными конкретными методами, методиками, линиями клеток, видами или родами живых организмов, конструкциями и реагентами, поскольку они, естественно, могут варьироваться. Следует также иметь в виду, что терминология,употребляемая в настоящем описании, применима только для описания конкретных вариантов осуществления изобретения и не ограничивает объем притязаний настоящего изобретения, который определяется только формулой изобретения. Если не оговорено иное, все технические и научные термины имеют в настоящем описании их обычные значения, понятные специалисту в отрасли, к которой относится изобретение. Хотя при реализации или испытаниях данного изобретения могут быть применены любые способы, устройства и материалы, аналогичные или эквивалентные описанным, в данном документе описаны предпочтительные способы, устройства и материалы. Все упомянутые в данном документе публикации включены в его объем посредством ссылок для целей описания и раскрытия информации, например, описанных в таких публикациях линий клеток, конструкций и методов, которые могут быть использованы в связи с настоящим изобретением. В публикациях, рассмотренных выше и далее по тексту, предусматривается лишь раскрытие информации на мо-5 010837 мент, предшествующий дате подачи заявки на данный патент. Никакая информация в данном описании не может рассматриваться как допущение, что изобретатели не имеют права датировать такое раскрытие более ранним числом в силу предшествующего изобретения. Нижеприведенные примеры составлены так, чтобы предложить среднему специалисту в данной отрасли полное раскрытие и описание путей осуществления и использования настоящего изобретения и не должны рассматриваться как ограничивающие объем изобретения. Были предприняты усилия по обеспечению точности указываемых численных значений (например, количеств, температуры, концентраций и т.д.), однако, следует учитывать некоторые экспериментальные погрешности и отклонения. Если не оговорено иное, части означают массовые части; молекулярные массы означают средние молекулярные массы; температура указывается в градусах стоградусной шкалы; и давление равно атмосферному или близко к нему. Экспериментальная часть Пример 1. Испытывали добавление антипенных присадок к системе для бесклеточного синтеза протеина. Пять различных антипенных присадок добавляли к бесклеточной системе PANOx (Ким и Сварц - Kim andSwartz, 2001, Biotechnol. Bioeng. 74:309-316), причем было обнаружено повышение выхода общей, растворимой и активной хлорамфеникол-ацетилтрансферазы (CAT) E. coli (фиг. 1). На фиг. 2 представлена схема барботажного реактора. На фиг. 3 и фиг. 4 сопоставлены выходы протеиновой конструкцииGMCSF-VL-VH млекопитающих и CAT в барботажном реакторе увеличенного масштаба по сравнению с выходами в реакторе малого масштаба (пробирке Эппендорфа). Антипенные присадки перечислены в табл. 1, а компоненты реакционных смесей - в табл. 2 и 3. Для системы цитомима компоненты, перечисленные в табл. 2, смешивали в указанных концентрациях (Джуэтт и Сварц - Jewett and Swartz, совместно рассматриваемая заявка 10/643683). Для системыPANOx смешивали компоненты, перечисленные в табл. 3, в указанных концентрациях, как описано в работе Сварца и Кима Регенерация аденозинтрифосфата из гликолевых промежуточных продуктов для бесклеточного синтеза протеина (Biotechnology and Bioengineering, Vol. 74, 4, 20 августа 2001 г.) Для экспрессии протеина CAT ДНК, использованная в качестве матрицы в системе, представляла собой кольцевую плазмиду pK7-CAT, включающую промотор Т 7, за которым следует ген, кодирующий протеин Е. coli - хлорамфеникол-ацетилтрансферазу. За структурным геном следует терминатор Т 7. Для экспрессии протеина GMCSF-scFv ДНК, использованная в качестве матрицы в системе, представляла собой кольцевую плазмиду pK7-GMCSF-VL-VH, включающую промотор Т 7, за которым следует ген, кодирующий протеин GMCSF (Ми-Хуа Тао - Mi-Hua Tao, 1993) и конденсированный с геном,кодирующим фрагмент scFv антитела мышиной лимфомы 38 С 13 (Хаким - Hakim, 1996) через связующее звено из 5 аминокислот (глицин 4-серин). За структурным геном следует терминатор Т 7. Экстракт клеток S30 приготовляли из E.coli K12 (штамм А 19) по методике Пратта (Pratt, 1994). После гомогенизации к лизату клеток не добавляли DL-дитиотреитол. РНК-полимеразу Т 7 приготовляли из культуры Е. coli штамма BL21 (pAR1219) по методике Даванлоо и др. (Davanloo et al., 1984). Для экспрессии GMCSF-VL-VH экспрессионную систему модифицировали с целью усовершенствования формирования протеина и образования дисульфидных связей, используя нижеуказанные добавки. Бесклеточный экстракт перед добавлением к реакционной смеси обрабатывали 0,85 мМ йодацетамидом (IAM) в течение 30 мин при комнатной температуре. Добавляли DsbC Е. coli в концентрации 50 мкг/мл. К реакционной смеси добавляли окисленный и восстановленный глутатион в концентрациях соответственно 4 и 1 мМ.DsbC E. coli получали с помощью сверхэкспрессивного штамма BL21(DE3) (pETDsbC) и очищали на колонке IMAC с кобальтом. Для восстановления активного центра DsbC отобранные фракции подвергали диализу против буфера S30 (Пратт, 1984), содержащего 5 мМ DTT. Антипенные присадки приобретали у указанных в таблице поставщиков и добавляли в указанных количествах. В некоторых случаях антипенные присадки разбавляли водой таким образом, чтобы вводить 1 мкл смеси присадки с водой в каждую порцию бесклеточной реакционной смеси объемом 15 мкл. Для проведения испытаний в пробирках Эппендорфа соответствующий объем смеси переносили с помощью пипетки на дно пробирки Эппендорфа. Пробирку инкубировали при 37 С в течение соответствующего времени (3 ч для PANOx, 6 ч для системы цитомима). Таблица 1-6 010837 Таблица 2 Реагенты для бесклеточного синтеза протеина цитомима и их концентрации Таблица 3 Реагенты для бесклеточного синтеза протеина PANOx и их концентрации Барботажный колоночный реактор состоял из колонки внутренним диаметром 1 см и высотой 5 см. Бесклеточные реакционные смеси (табл. 1 и табл. 2) загружали в колонку (фиг. 2) с помощью пипетки. Газ из резервуара сжатого газа барботировали через узкое сопло (диаметром менее 1 мм) у дна колонки. Для системы цитомима (как описано в совместно рассматриваемой заявке 10/643683 Джуэтта и Сварца) использовали чистый кислород, и реакцию проводили в течение максимум 4 ч при 37 С. Для реакции PANOx применяли аргон, и длительность реакции составляла 3 ч при 37 С. Размер газовых пузырьков соответствовал диаметру приблизительно 0,5 см, а скорость барботажа соответствовала прибли-7 010837 зительно прохождению 1 пузырька в секунду. Без добавления антипенной присадки реакционная смесь бесклеточного синтеза протеина сразу же вспенивалась и поднималась над верхним краем колоночного реактора. Протеин не образовывался. При добавлении антипенной присадки (Sigma 204, отношение объемов присадки и реакционной смеси 1/1000-1/10000) реакция синтеза протеина проходила с минимальным вспениванием в течение 3,5-4 ч, обеспечивая выходы протеинов, сравнимые с выходами в пробирках Эппендорфа при реакционных объемах 15 мкл (см. фиг. 3 и 4). Количество синтезированного протеина оценивали по радиоактивности осажденных ТСА продуктов, измеряемой жидкостным сцинтилляционным счетчиком (LS3801, Beckman Coulter, Inc.) После центрифугирования проб при 4 С и 15000g в течение 15 мин отбирали надосадочные жидкости и использовали их для определения выходов растворимых протеинов путем осаждения ТСА и подсчета сцинтилляций. Подробное описание методик дано в работе Кима и др. (Kim et al., 1996 b). Представлены результаты как для CAT, так и для конденсированного протеина GMCSF-scFv. Все реакции проводили в периодическом режиме, без добавления реагентов после начала реакции. Эти данные свидетельствуют, что добавление антипенных присадок при проведении реакций в различных масштабах, при различных геометрических параметрах реакторов и для получения различных протеинов обеспечивает улучшение процесса синтеза протеинов in vitro. В частности, антипенные присадки обеспечивают повышение выхода протеинов при проведении реакций в увеличенных масштабах с применением барботажных колонок. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Способ in vitro транскрипции и-РНК и/или трансляции полипептидов, включающий проведение синтеза упомянутых и-РНК и/или полипептидов в бесклеточной реакционной смеси, содержащей антипенную присадку. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что массовая концентрация антипенной присадки составляет по меньшей мере приблизительно 0,00007%, но не более чем приблизительно 0,007%. 3. Способ по п.2, отличающийся тем, что антипенная присадка представляет собой блок-сополимер,обеспечивающий обеспенивающее/антипенное действие путем образования нерастворимого мономолекулярного слоя в пене на поверхности раздела воздух/вода. 4. Способ по п.1, отличающийся тем, что упомянутая реакционная смесь имеет объем, превышающий приблизительно 15 мкл. 5. Способ по п.1, отличающийся тем, что упомянутая реакционная смесь имеет объем, превышающий приблизительно 100 мкл. 6. Способ по п.5, отличающийся тем, что выход по упомянутой реакции составляет по меньшей мере приблизительно 90% выхода по сравнимой реакции в малом масштабе. 7. Способ синтеза биологических макромолекул, включающий проведение синтеза биологических макромолекул в бесклеточной реакционной смеси, содержащей экстракт бактериальных клеток; матрицу для транскрипции и-РНК и/или трансляции полипептида; мономеры для синтеза упомянутых и-РНК и/или полипептидов и кофакторы, ферменты и другие реагенты, необходимые для упомянутых транскрипции и/или трансляции; а также антипенную присадку, массовая концентрация которой составляет по меньшей мере приблизительно 0,00007%, но не более чем приблизительно 0,007%. 8. Реакционная смесь для бесклеточного синтеза биологических макромолекул, отличающаяся тем,что бесклеточная реакционная смесь для синтеза биологических молекул содержит антипенную присадку. 9. Реакционная смесь по п.8, отличающаяся тем, что массовая концентрация антипенной присадки составляет по меньшей мере приблизительно 0,00007%, но не более чем приблизительно 0,007%. 10. Реакционная смесь по п.9, отличающаяся тем, что антипенная присадка представляет собой блок-сополимер, обеспечивающий обеспенивающее/антипенное действие путем образования нерастворимого мономолекулярного слоя в пене на поверхности раздела воздух/вода. 11. Реакционная смесь по п.8, отличающаяся тем, что упомянутая реакционная смесь имеет объем,превышающий приблизительно 15 мкл. 12. Реакционная смесь по п.8, отличающаяся тем, что упомянутая реакционная смесь имеет объем,превышающий приблизительно 100 мкл. 13. Реакционная смесь по п.12, отличающаяся тем, что упомянутая реакция дает выход, составляющий по меньшей мере приблизительно 90% выхода по сравнимой реакции в малом масштабе. 14. Реакционная смесь для бесклеточного синтеза биологических макромолекул, содержащая экстракт бактериальных клеток; матрицу для транскрипции упомянутой и-РНК и/или трансляции упомянутого полипептида; мономеры для синтеза упомянутых и-РНК и/или полипептидов и кофакторы, ферменты и другие реагенты, необходимые для упомянутых транскрипции и/или трансляции; а также антипенную присадку, массовая концентрация которой составляет по меньшей мере приблизительно 0,00007%,но не более чем приблизительно 0,007%.