Композиция для предотвращения или замедления развития рака предстательной железы

КОМПОЗИЦИЯ ДЛЯ ПРЕДОТВРАЩЕНИЯ ИЛИ ЗАМЕДЛЕНИЯ РАЗВИТИЯ РАКА ПРЕДСТАТЕЛЬНОЙ ЖЕЛЕЗЫ Описана композиция, содержащая в качестве активных ингредиентов экстракт зеленого чая и экстракт граната, для предотвращения или замедления развития рака предстательной железы.(71)(73) Заявитель и патентовладелец: СИГМА-ТАУ ИНДУСТРИЕ ФАРМАСЬЮТИКЕ РИУНИТЕ С.П.А. Настоящее изобретение относится к композиции для предотвращения или замедления развития рака предстательной железы. В частности, настоящее изобретение относится к композиции, содержащей в качестве активных ингредиентов экстракт зеленого чая и экстракт граната (pomegranate), подходящей для предотвращения или замедления развития рака предстательной железы. Рак предстательной железы представляет собой вид рака, наиболее распространенный у млекопитающих, особенно у мужчин в западных странах (Cancer Statistics 1997, СА Cancer J. Clin. 1997; 47; 5-27). В сложность указанного заболевания вносят свой вклад различные факторы, такие как неизвестная этиология, изменчивая патология, сложная связь с эндокринными факторами и анапластическое развитие. Группа исследователей из University of Wisconsin, Madison, Wis., и Case Western Reserve University,Cleveland, Ohio, представила данные, свидельствующие о роли полифенолов зеленого чая (ПЗЧ) в модулировании молекулярного пути, управляемого инсулиноподобным фактором роста (ИФР-1), в клетках опухоли предстательной железы в модели на мышах рака предстательной железы человека. Указанные наблюдения обретают значимость с учетом исследований, показывающих связь повышенных уровней ИФР-1 с повышенным риском развития некоторых видов рака, таких как рак предстательной железы,груди, легкого и толстой кишки. Полифенолы зеленого чая способствуют минимизации развития опухоли за счет влияния на количество фактора роста эндотелия сосудов (ФРЭС) в сыворотке в модели на мышах рака предстательной железы. Снижение ФРЭС может быть результатом вызванного ПЗЧ подавления уровней ИФР-1. ФРЭС влияет на образование и развитие новых кровеносных сосудов, доставляющих питательные вещества для развития опухолей. Уменьшая количество ФРЭС, ПЗЧ работают на минимизацию поступающих питательных веществ, поддерживающих рост опухолей. В источниках Clinical Cancer Research, July 1, 2006; pp. 4018-4026 и Clinical Cancer Research Vol. 12,4018-4026, July 1, 2006, представлены сведения о том, что экстракт граната может быть полезен для предотвращения или задержки развития рака предстательной железы. В Prostate Cancer and Prostatic Diseases (2002) 5, 6-12 представлены сведения о том, что ликопин может быть полезен для предотвращения или задержки развития рака предстательной железы. В WO 0057892 представлены сведения о том, что сереноа полезна для лечения рака предстательной железы. В WO 03035635 представлены сведения о том, что производные изофлавоноидов полезны для лечения рака предстательной железы. В WO 04091602 представлены сведения о том, что L-карнитин пригоден для лечения сердечнососудистых заболеваний. Селен в организме человека представляет собой микронутриент, действующий как кофактор для восстановительных и окислительных ферментов, таких как глутатионпероксидазы. Источниками селена в питании являются орехи, крупы, мясо, рыба и яйца. Программа предотвращения рака при помощи питания ("Nutritional Prevention of Cancer Project") (NPC) представляла собой контролируемое, рандомизированное клиническое исследование предотвращения рака, в котором 1312 пациентов получали суточную дозу 200 мкг селена или плацебо, на протяжении 10 лет. В указанном исследовании отмечено статистически значимое уменьшение частоты рака предстательной железы и скорости развития рака предстательной железы. Несмотря на то что противораковое действие экстракта зеленого чая и экстракта граната уже известно, ни в одном из приведенных выше документов предшествующего уровня техники не упомянуто и не предполагается применение указанных двух активных ингредиентов в комбинации для предотвращения или замедления развития рака предстательной железы. Кроме того, несмотря на то что для химиотерапии опухолей доступны другие агенты и существуют другие инвазивные варианты лечения рака предстательной железы, такие как удаление пораженной опухолью предстательной железы или введение радиоактивного источника, разработанного для сокращения опухоли, было бы более желательно предложить композицию, подходящую в качестве добавки или дополнения к традиционным видам лечения, обладающую низкой токсичностью для пациента, которая могла бы служить противораковым агентом при раке предстательной железы. Поэтому одним из объектов настоящего изобретения является синергическая композиция, содержащая в качестве активных ингредиентов экстракт зеленого чая и экстракт граната. Вышеуказанная композиция может дополнительно содержать ликопин, селен, цинк, сереноа, производные изофлавоноидов и L-карнитин. Другим объектом настоящего изобретения является композиция, содержащая:(а) экстракт зеленого чая в качестве активного ингредиента в дозе от 25 до 800 мг, предпочтительные дозировки составляют 125 и 250 мг;(б) экстракт граната в качестве активного ингредиента в дозе от 25 до 800 мг, предпочтительные дозировки составляют 40, 125 и 250 мг;(в) ликопин в дозе от 0,03 до 30,0 мг, предпочтительные дозировки составляют 1,25 и 5 мг;(г) селен в дозе от 8,2 до 500 мкг, предпочтительные дозировки составляют 55 и 82,5 мкг;(д) цинк в дозе от 1 до 200 мг, предпочтительная дозировка составляет 20 мг;(е) сереноа в дозе от 10 до 400 мг, предпочтительные дозировки составляют 160 и 320 мг;(ж) производные изофлавоноидов (изофлавон сои) в дозе от 10 до 500 мг, предпочтительная дозировка составляет 100 мг;(з) L-карнитин в дозе от 50 до 500 мг, предпочтительная дозировка составляет 200 мг. Еще одним объектом настоящего изобретения является применение описанной выше композиции для предотвращения или замедления развития рака предстательной железы. Еще одним объектом настоящего изобретения является применение описанной выше композиции для приготовления лекарства для предотвращения или замедления развития рака предстательной железы. Еще одним объектом настоящего изобретения является применение описанной выше композиции для приготовления пищевой добавки для предотвращения или замедления развития рака предстательной железы. Композиция согласно настоящему изобретению может дополнительно содержать коферменты, минеральные вещества, антиокислители, витамины и агенты, подходящие для лечения рака предстательной железы. Следующие неограничивающие примеры дополнительно иллюстрируют настоящее изобретение. Пример 1. Для описанных экспериментов применяли следующие стандартные линии клеток карциномы предстательной железы человека LNCaP и PC3 (полученные из коллекции American Type Culture CollectionRockville, MD). Клетки LNCaP культивировали в среде RPMI 1640 (Life Technologies, Rockville, MD), дополненной 10% фетальной бычьей сыворотки (ФБС) и 1% пенициллина и стрептомицина. Клетки инкубировали при 37C в увлажненной атмосфере с содержанием 5% CO2 в воздухе. Оба набора культур клеток выращивали до 80% смыкания монослоя в 10-см культуральных флаконах и разводили 1:8. Клетки высевали на культуральные планшеты на 96 ячеек и оставляли прикрепиться и достичь 60-70% слияния монослоя к моменту применения в эксперименте. Действие на рост клеток in vitro На культивированный набор клеток LNCaP и PC3 воздействовали или экстрактом зеленого чая (40 мкг/мл в ФСБ), или экстрактом граната (40 мкг/мл в ФСБ), или в комбинации (одновременно экстракт зеленого чая и экстракт граната) в 10 ячейках, содержащих полную культуральную среду. Клетки, используемые в качестве контроля, инкубировали с таким же количеством ФСБ в полной культуральной среде. Также изучали действие ликопина (5 ммоль/л), селена (30 нг/мл), цинка (10 мкг/мл), сереноа (10 мкг/мл) и изофлавона сои (10 мкг/мл), добавляя указанные вещества к культуре клеток отдельно или в комбинации с экстрактом зеленого чая и экстрактом граната. Пролиферацию клеток определяли при помощи колориметрического анализа с 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолием (МТТ) через 24 ч инкубирования при 37C в присутствии исследуемых веществ или без них. Добавляли во все ячейки МТТ (5 нг/мл) и инкубировали еще в течение 2 ч. Затем содержимое планшетов центрифугировали при 500 g в течение 5 мин при 4C. Удаляли из ячеек раствор МТТ при помощи осторожной аспирации, добавляли в каждую ячейку забуференный ДМСО (0,1 мл) и встряхивали планшеты в течение 15 мин. Измеряли поглощение на устройстве для прочтения микротитрационных планшетов на длине волны 540 нм. Действие каждого из соединений, отдельно и в комбинации, на рост клеток оценивали как процент выживаемости, где не получившие воздействия контрольные клетки принимали за полностью выживаемые и имеющие возможность свободно расти. Полученные результаты приведены в следующих табл. 1-4. Таблица 1 Действие исследуемых соединений на пролиферацию клеток LNCaP А=экстракт зеленого чая; В=экстракт граната; С=ликопин; D=селен; Е=цинк Таблица 2 Действие исследуемых соединений на пролиферацию клеток РС 3 Таблица 3 Действие исследуемых соединений на пролиферацию клеток LNCaP А=экстракт зеленого чая; В=экстракт граната; F=сереноа; G=изофлавон сои; Н=Lкарнитин Таблица 4 Действие исследуемых соединений на пролиферацию клеток РС 3 А=экстракт зеленого чая; В=экстракт граната; F=сереноа; G=изофлавон сои; Н=L-карнитин Результаты, приведенные в табл. 1, 2, 3 и 4, показывают, что композиция согласно настоящему изобретению статистически более активна по сравнению с отдельно взятыми составляющими. Кроме того, присутствие ликопина, селена и цинка или сереноа, изофлавона сои и L-карнитина, не увеличивает ингибирующую активность композиции согласно настоящему изобретению. Пример 2. Эксперимент 2. Действие на деление клеток in vitro. На клетки LNCaP и PC3 в культуральных флаконах объемом 25 мл воздействовали экстрактом зеленого чая (40 мкг/мл в ФСБ), экстрактом граната (40 мкг/мл в ФСБ), сереноа (10 мкг/мл), изофлавоном сои (10 мкг/мл), или комбинацией экстракта зеленого чая и экстракта граната. Контрольные клетки обрабатывали только ФСБ. Обработку начинали через 48 ч после прикрепления. Клетки оставляли расти в культуре до 72 ч, а затем проводили анализ методом проточной цитометрии. В клетки вводили импульсные метки при помощи 10 мМ бромдезоксиуридина (BrdU) в течение 2 ч,с предварительной обработкой асинхронно растущих клеток экстрактом зеленого чая, или экстрактом граната, или обоими экстрактами, или без указанной обработки. Затем клетки собирали, фиксировали 70% этанолом, обрабатывали 0,1% HCl и нагревали в течение 10 мин при 90C для проявки меченой ДНК. Окрашивали клетки FITC, конъюгированным с антителом к BrdU (Becton Dickinson), и контрокрашивали пропидий иодидом. Анализ клеточного цикла проводили на Becton-Dickinson FACScan, с использованием программного обеспечения Lysis II. Результаты проточного цитометрического анализа, полученные с использованием композиции согласно настоящему изобретению, по сравнению с отдельными компонентами представлены в следующих таблицах. Таблица 5 Экстракт зеленого чая, деление клеток LNCaP, BrdU Таблица 9 Экстракт зеленого чая плюс экстракт граната, деление клеток LNCaP, BrdU Таблица 10 Экстракт зеленого чая, деление клеток РС 3, BrdU Таблица 11 Экстракт граната, деление клеток РС 3, BrdU Таблица 12 Экстракт сереноа, деление клеток РС 3, BrdU Таблица 13 Экстракт изофлавона сои, деление клеток РС 3, BrdU Таблица 14 Экстракт зеленого чая плюс экстракт граната, деление клеток РС 3, BrdU Применение отдельных соединений показало ингибирующее действие на пролиферацию как клетокLNCaP, так и клеток PC3 (см. табл. 5-8 и 10-13). Результаты, приведенные в табл. 9 и 14, показали, что комбинированная композиция согласно настоящему изобретению обладает неожиданным синергическим эффектом ингибирования пролиферации как клеток LNCaP, так и клеток РС 3. Линии клеток, заторможенные в фазе S, сохраняются в течение 72 ч на максимуме в 60,9% и 54,8% в линиях LNCaP и РС 3 соответственно. В контрольных образцах, обработанных средой, не наблюдалось никакого действия ни на деление клеток, ни на задержку роста. Пример 3. Противоопухолевое действие in vivo. Для оценки противоопухолевого действия комбинации согласно настоящему изобретению применяли штамм солидной опухоли LNCaP (АТСС). Клетки культивировали от пяти до шести раз в безтимусных мышах. Фрагмент солидной раковой опухоли указанного штамма рака (квадрат 3 мм) вживляли под кожу подмышечной области самцов безтимусных мышей nu-nu в возрасте 8 недель (NxGen Biosciences, San Diego, CA). Мышей, у которых опухоль достоверно принялась (примерно через 20 дней), случайным образом распределяли в 4 группы по 10 животных в каждой. Указанные группы животных получали среду, экстракт зеленого чая, экстракт граната или комбинацию экстрактов зеленого чая и граната. Животные в контрольной группе получали только питьевую воду, тогда как экстракты зеленого чая или граната или их комбинацию вводили с питьевой водой в концентрации 1% (мас./об., ad libitum) один раз в сутки утром в течение 28 следующих друг за другом дней. Диаметр опухоли измеряли дважды в неделю и вычисляли объем опухоли по формуле 0,5238L1L2H, где L1 представляет собой большой диаметр, L2 представляет собой малый диаметр,а Н представляет собой высоту опухоли. Всех животных подвергали эвтаназии по достижении размера опухоли около 1300 мм 3 у контрольных животных, что наступало примерно через 28 дней. Полученные результаты (среднее и СО) показали, что объемы опухолей в день 28 составляли 130587 в контрольной группе, тогда как в группах экстрактов зеленого чая и граната указанные величины составляли 102698 (р 0,05) и 101191 (р 0,05) соответственно. При этом при комбинированном лечении (экстракты зеленого чая плюс граната) показано определенное синергическое действие на уменьшение опухоли, 623112 (р 0,001). Следовательно, ингибирование составило 52,3% для комбинации по сравнению с зеленым чаем(21,4%) или гранатом (22,5%) в отдельности. Полученные результаты, представленные в табл. 15, показывают, что композиция согласно настоящем изобретению статистически более активна по сравнению с отдельными компонентами. Таблица 15 Пищевая добавка или лекарственное средство согласно настоящему изобретению содержит активные ингредиенты, хорошо известные специалистам в области медицины и уже применяемые в клинической практике, с известными фармакотоксикологическими профилями. Следовательно, их очень легко закупать, поскольку они являются продуктами, представленными на рынке уже долгое время и подходящими для введения животному или человеку. Далее представлены неограничительные примеры композиций согласно настоящему изобретению. Композиция 1. Экстракт зеленого чая - 250 мг; экстракт граната - 250 мг. Композиция 2. Экстракт зеленого чая - 250 мг; экстракт граната - 250 мг; ликопин - 1,25 мг; селен - 82,5 мкг; цинк - 20 мг. Композиция 3. Экстракт зеленого чая - 125 мг; экстракт граната - 125 мг; ликопин - 5 мг; селен - 82,5 мкг; цинк - 20 мг; сереноа - 160 мг; изофлавон сои - 100 мг. Композиция 4. Экстракт зеленого чая - 125 мг; экстракт граната - 40 мг; ликопин - 5 мг; селен - 55 мкг; цинк - 20 мг; сереноа - 320 мг; изофлавон сои - 100 мг. Композиция 5. Экстракт зеленого чая - 125 мг; экстракт граната - 125 мг; ликопин - 5 мг; селен - 82,5 мкг; цинк - 20 мг;L-карнитин - 200 мг. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Композиция, содержащая в качестве активных ингредиентов экстракт зеленого чая в количестве от 25 до 800 мг и экстракт граната в количестве от 25 до 800 мг для предотвращения или замедления развития рака предстательной железы. 2. Композиция по п.1, дополнительно содержащая ликопин в количестве от 0,03 до 30 мг; селен в количестве от 8,2 до 500 мкг; цинк в количестве от 1 до 200 мг; сереноа в количестве от 10 до 400 мг; изофлавон сои в количестве от 10 до 500 мг и L-карнитин в количестве от 50 до 500 мг. 3. Композиция по п.1 или 2, дополнительно включающая коферменты, минеральные вещества, антиокислители, витамины и средства, подходящие для лечения рака предстательной железы. 4. Применение композиции по п.1 или 2 для получения лекарственного средства для предотвращения или замедления развития рака предстательной железы. 5. Применение композиции по п.1 или 2 для получения пищевой добавки для предотвращения или замедления развития рака предстательной железы.