Система культивирования клеток

008157 Настоящее изобретение касается культивирования клеток. Данное изобретение предлагает новую систему культивирования для выращивания клеток в целом и растительных клеток в частности. Так как это устройство может быть одноразовым и эффективным в крупном масштабе, оно позволяет резко снизить производственные расходы в различных применениях. Традиционные системы культивирования обычно состоят из жесткого резервуара из стекла или нержавеющей стали, имеющего средства аэрации и перемешивания содержимого культуры (воздушный барботер, лопастная мешалка). Эти системы являются сложными, и обычно оборудование и средства,обеспечивающие асептический биопроцесс, являются очень дорогими, поскольку крупномасштабное производство основано на емкостях из нержавеющей стали, стерилизуемых на месте. Более 60% издержек производства обусловлено фиксированными расходами: высокими капитальными затратами на оборудование для ферментации, амортизацией, долевыми и капитальными расходами. Текущие расходы также являются высокими вследствие низкого выхода и необходимости очищать и стерилизовать биореактор после каждого цикла культивирования. Для промышленного применения, конкретно - для выращивания растительных клеточных культур, использовали различные хорошо известные системы культивирования, такие как резервуар с мешалкой или эрлифтные реакторы. Несмотря на многочисленные попытки коммерциализации растительных метаболитов, немногие получили коммерческий успех. Одной из причин этого является низкая производительность, несмотря на возможность получения более высокого содержания желательного соединения, чем в целом растении (розмариновая кислота,шиконин и т.п), до 20% по сухому веществу. Главным ограничивающим условием, ведущим к низкой производительности, остается низкая скорость роста (ниже 0,7 д-1, минимум 20 ч на удвоение) по сравнению с бактериями. Использование периодического выращивания культур в промышленных ферментерах означает проведение не более 10-20 циклов в год с растительными клеточными культурами при очень высокой стоимости оборудования. Это означает, что затруднения в отношении промышленного производства являются скорее экономическими, чем биологическими. Для преодоления этих проблем и снижения издержек производства недавно появившиеся новые технологии основаны на применении различных одноразовых пластиковых мешков вместо ферментера из нержавеющей стали. В этих новых системах применение предварительно стерилизованных одноразовых пластиковых мешков является многообещающим, так как оно снижает капитальные вложения, поскольку пластик является недорогим материалом и, кроме того, исключает чистку, стерилизацию, проверку и обслуживание оборудования, что требует времени и расходов. Они также допускают большую гибкость процесса, который может управляться людьми, не являющимися специалистами в данной области, так как мешки являются предварительно стерилизованными. С таким одноразовым устройством предлагались различные системы аэрации/перемешивания.Wave Biotech (Singh V., патент США 6190913) разработал систему, в которой используется наполненный газом мешок, помещенный на качающийся механизм, который двигает мешок, вызывая волнообразное движение содержащейся в нем жидкости. Качающийся механизм ограничивает размер резервуара,потому что такое механическое перемешивание требует сложного оборудования для больших объемов культуры. Другое предложение заключается в использовании газопроницаемых пластиковых мешков, перемешиваемых механической системой или не перемешиваемых совсем. В патенте США 5057429 газопроницаемый мешок вращают или встряхивают для диффузии кислорода и питательных веществ к животным клеткам. Неподвижный газопроницаемый мешок также описан в патенте США 5225346. До настоящего времени не существовало промышленной разработки таких систем культивирования, главным образом потому, что, с одной стороны, было затруднительно увеличить размер внешнего устройства для перемешивания, а с другой стороны, существовала проблема недостаточного снабжения кислородом клеток в неподвижном мешке, содержащем несколько литров культуральной среды. Реактор может состоять из рассеивающего газ пластикового мешка в резервуаре с верхней частью,приспособленной для внесения посевного материала и удаления образца среды. Одноразовые конические пластиковые мешки фирмы Osmotec являются небольшими по объему (несколько литров), использующими воздушные пузырьки для аэрации через впускное отверстие. Патент США 6432698 также описывает одноразовый биореактор для культивирования микроорганизмов или клеток, содержащий газовый барботер, генерирующий пузырьки газа для перемешивания и подачи газа, подобно эрлифтному биореактору, за исключением того, что он выполнен из пластикового материала. В этих изобретениях имеются два главных ограничивающих условия: при высокой плотности или больших объемах культур существует потребность в создании газовых пузырьков меньшего размера или циркуляции жидкости во всем реакторе для соответствующего перемешивания и аэрации. Эти результаты в сложных барботирующих системах (газовые диффузоры, секционированные резервуары, ) не согласуются с простой одноразовой технологией. Кроме того, маленькие пузырьки повреждают чувствительные клетки, усиливая их адгезию к стенке и/или удаляя некоторые полезные газы из культуральной среды (например, этилен для растений). Применение газовых пузырьков для аэрации биореактора или ферментера хорошо известно. В настоящее время диффузор для введения микропузырьков используют для улучшения переноса газа в-1 008157 культуральной среде. Биореактор, в котором аэрация и перемешивание происходят с помощью газового потока без механического перемешивания, также хорошо известен и в настоящее время называется специалистами эрлифтным биореактором. Например, патент США А-4649117 описывает культивирующую систему эрлифтного биореактора, используемого для переноса клеточной культуры и ферментации. Подходящей скоростью газового потока является скорость в диапазоне 10-300 см 3/мин, и газ равномерно и непрерывно барботируется независимо от размера пузырьков, или периодически генерируется единственный большой пузырь, как в настоящем изобретении. Используют две камеры - камеру для выращивания и камеру для перемешивания. Для перемешивания и гомогенизации различных материалов, таких как химикаты, напитки или масла, известно использование единственного пузыря, обозначенного как большой, но с объемом менее 3 см 3. WO-A-8503458 описывает способ и устройство для вызываемого газом перемешивания и гомогенизации, не влияющего на рост и культивирование живых клеток. Способ основан на инжекции газовых пузырьков заданного размера и частоты в резервуар через одно или более воздушных впускных отверстий. Этот способ решает задачу сокращения общего времени гомогенизации и перемешивания, которая отличается от задач настоящего изобретения. Инжекция служит для получения единственного пузыря или нескольких отдельных пузырей, причем размер пузыря и количество воздуха в нем определяют эмпирически, пузырь не должен быть слишком большим (1 кубический дюйм (2,54 см 3) - цитировано) и,в частности, не должен иметь диаметр, близкий к диаметру резервуара. Это резко отличается от настоящего изобретения, в котором размер пузыря и количество воздуха являются критическими для роста живых клеток. В WO-A-8503458 в случае нескольких воздушных впускных отверстий генерируется несколько отдельных пузырей, имеющих кольцевые, вертикально-тороидальные рисунки потока. В WO-A8503458 используют открытые или вентилируемые резервуары, которые не совместимы с культивированием живых клеток в стерильных условиях. Патент США А-4136970 описывает также способ и устройство для регуляции размера и частоты пузырьков для перемешивания жидкостей. Этот патент не касается ни насыщения кислородом и культивирования живых клеток, ни увеличения размера пузырей и вообще не описывает пузырьков объемом более 1,5 см 3. Способ, описанный в патенте США А-4136970, может использоваться для подсчета тромбоцитов крови, но не может быть адаптирован, использован или заявлен для культивирования или выращивания живых клеток. Задача настоящего изобретения состоит в создании недорогой системы культивирования клеток с одноразовым устройством, эффективным в крупном масштабе и удобным в применении. Настоящее изобретение состоит в использовании предварительно стерилизованного гибкого или негибкого пластикового мешка, в котором культивируют клетки при перемешивании/аэрации единственным большим газовым пузырем. В настоящем изобретении единственный большой газовый пузырь генерируют периодически в основании колонны, частично заполненной жидкой средой и клетками. Как только большой пузырь почти заполняет поперечное сечение колонны, создается небольшое пространство между пузырем и боковыми стенками цилиндрического резервуара, по которому может протекать жидкость, когда поднимается пузырь. Эта струящаяся пленка жидкости, контактируя с газовым пузырем, обеспечивает удобное перемешивание и аэрацию объема в устройстве при его работе без повреждения клеток. Такая система перемешивания/аэрации позволяет осуществить успешное масштабирование, поскольку кислородные реакции и массоперенос происходят на уровне тонкой жидкой пленки. Кроме того, поскольку система имеет простую конструкцию, капитальные затраты и расходы на техническое обслуживание резко снижаются. Это одноразовое устройство изготавливают из способных стерилизоваться гибких пластиковых листов, сваренных по краям с образованием колонны. Такая одноразовая система обеспечивает гибкость процесса и уменьшает простои, поскольку не требуются очистка, стерилизация, обслуживание или тестирование, осуществляемые в традиционных устройствах из нержавеющей стали. Так как устройство по изобретению является одноразовым и эффективно масштабируемым, оно является хорошей альтернативой для снижения производственных расходов в промышленном применении. Эта система культивирования может быть применена для растительных и животных культур, культур насекомых или микроорганизмов, в суспензии или иммобилизованной на различных носителях. Способ позволяет продуцировать большое разнообразие молекулярных метаболитов (вновь созданных или полученных биотрансформацией) или рекомбинантных белков, либо может использоваться для размножения эмбриогенной растительной клеточной линии посредством периодического или непрерывного культивирования, а также для любого другого применения, которое может быть очевидным специалисту. На чертежах: Фиг. 1 - вид сбоку устройства, показывающий мешок и явление, создаваемое поднимающимся пузырем. Фиг. 2 - вид сбоку соединения пластикового мешка с трубопроводом. Фиг. 3 - схематичный вид пневматического и электрического контуров, используемых для генерации пузырей и управления их частотой и размером. Фиг. 4 - верхняя часть резервуара в форме обратного конуса.-2 008157 Фиг. 5 - диаграмма кинетики роста клеток сои в колбах, в резервуаре реактора с мешалкой и в предлагаемой системе культивирования клеток, выраженного в сырой массе на литр жидкой культуры. Фиг. 6 - диаграмма кинетики роста клеток сои в колбах, в резервуаре реактора с мешалкой и в предлагаемой системе культивирования клеток по сухому весу на литр жидкой культуры. Настоящее изобретение состоит в использовании очень больших отдельных пузырей, периодически производимых (любым способом их получения), имеющих диаметр, близкий, насколько это возможно, к диаметру самого биореактора, для аэрации/перемешивания (обеспечивая эффективное насыщение кислородом) клеточных культур. В результате культуральная среда протекает через очень тонкую пленку между большим пузырем и внутренней стенкой биореактора. В принципиальной конструкции, показанной на фиг. 1, биореактор (или реактор) состоит из различных частей, включающих в себя по меньшей мере один резервуар 1, выполненный из такого материала, как пластиковые листы, сваренные по своим краям 2, например, для создания внутреннего пространства. Резервуар является неподвижным. В предпочтительном варианте осуществления резервуар(ы) изготовлен из гибкого полипропилена вследствие его способности термосвариваться и выдерживать автоклавирование, так что резервуар может стерилизоваться в небольшом лабораторном автоклаве или с помощью других средств, хорошо известных в данной области. Однако другие виды материалов также пригодны, такие как Pyrex, нержавеющая сталь, полугибкие, жесткие или формованные пластики, которые среди прочих могут быть стерилизованы любым способом, известным специалистам в данной области, таким как гамма-облучение. В предпочтительном варианте осуществления гибкий, биосовместимый, водостойкий материал термосварен по краям 2, например, с помощью аппарата для термоимпульсной сварки. Однако другие технологии герметизации могут быть также использованы в соответствии со способами, хорошо известными в данной области, включая, без ограничения этим, ультразвуковую или радиоволновую сварку. Другие виды пластика могут быть изготовлены иным способом, таким как, например, литьевое формирование. В настоящем изобретении, как показано на фиг. 1, реактор может быть цилиндрическим или может иметь овальное поперечное сечение, он может иметь высоту 2 м и его диаметр может быть 12 см при рабочем объеме 20 л. Меньший или больший объемы могут быть использованы в соответствии с настоящим изобретением. Например, диаметр реактора может быть всего лишь 5 см или может быть увеличен до 40 см или более. Высота реактора может варьироваться в соответствии с потребностями пользователя и выбранным диаметром. Реактор также может иметь разную форму, но, предпочтительно, чтобы высота формы по меньшей мере в 5 раз превышала его ширину. Он может быть выполнен, например, в форме параллелепипеда. Размеры и форма резервуара 1 могут варьироваться в соответствии с потребностями пользователей; однако предпочтительна цилиндрическая форма колонны. Это важно для того, чтобы избежать застойной зоны, в которой перемешивание не происходит, когда культивируемые клетки находятся в виде суспензии. Застойные зоны появляются, главным образом, в углах, поэтому предпочтительно изготавливать округлые основания, особенно для клеток, которые имеют тенденцию формировать плотные агрегаты(например растительные клетки), которые осаждаются более быстро, чем отдельные клетки. Если резервуар выполнен из гибкого материала, такого как пластик, рекомендуется поместить указанный резервуар в жесткий наружный контейнер для поддержания формы и массы резервуара. Этот жесткий контейнер может быть выполнен из любого материала, такого как поликарбонат, но этот материал будет выбран в основном вследствие его жесткости и прочности (определяемых толщиной и/или композицией). Этот наружный контейнер может быть полупрозрачным для удобства наблюдения за культурой 3, если пластиковый мешок также является полупрозрачным, или для улучшения прохождения света при выращивании, например, фотоаутотрофных клеток. Размеры и формы наружных контейнеров, предпочтительно, сконструированы в соответствии с размерами и формами резервуаров, обсужденных выше. В принципиальной конструкции, показанной на фиг. 1, по меньшей мере четыре трубы присоединены к резервуару. Первую трубу в верхней части используют для удаления избытка газов 4. Вторую трубу в основании резервуара 5 используют для подачи воздуха в жидкую культуру посредством газового пузыря 6. Эти трубы в наиболее предпочтительном варианте осуществления снабжены фильтрами 7,такими как, например, фильтры 0,22 мкм для предотвращения загрязнения от поступающего воздуха. Труба с впускным воздушным отверстием может быть оборудована вентилем для предотвращения противотока жидкости в трубу. Кроме того, одна впускная труба 8, расположенная в верхней части резервуара, позволяет заполнять биореактор стерильной средой и посевным материалом, и одна выпускная труба 9, расположенная около основания, может потребоваться для сбора культуры и/или взятия образца. В предпочтительном варианте трубопровод является полугибким, изготовленным из автоклавируемого силикона, но также могут быть использованы другие типы трубопровода, такие как C-flex или PVC. В предпочтительном варианте настоящего изобретения внутренний диаметр трубопровода составляет 8 мм, за исключением трубопровода с впускным воздушным отверстием, который является большим - 11-3 008157 мм в диаметре. Длина трубопровода в данном изобретении составляет от около 1 до 2 м, но пользователи по желанию могут регулировать эти размеры. Трубопровод может быть соединен с резервуаром через впускной патрубок, приваренный к пластиковому листу по традиционной технологии, такой как термосваривание. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения, как показано на фиг. 2, трубопровод соединен с резервуаром через отверстие в пластиковом листе панельной монтажной муфтой 10 с гайками 11 и прокладками 12. Герметичность может быть получена путем затягивания гаек на прокладках на пластиковом листе. Внутренний диаметр панельной монтажной муфты равен внутреннему диаметру соответствующих трубопроводов в данном изобретении, однако в случае необходимости возможна регулировка размеров. Однако следует иметь в виду, что любые средства, обеспечивающие циркуляцию воздуха или газа,могут быть адаптированы к настоящему изобретению. Для целей настоящего изобретения важно, чтобы аэрация и перемешивание среды обеспечивались большими газовыми/воздушными пузырями, и, предпочтительно, с помощью единственного большого пузыря, генерируемого каждые несколько секунд,имеющего диаметр, обусловленный диаметром резервуара. Следовательно, предпочтительные средства перемешивания и аэрации по изобретению заключаются в пузыре, который является более длинным, чем широким. Однако система также работает, когда длина пузыря равна его ширине. Предпочтительно, форма большого пузыря определяется формой резервуара; другими словами,пространство между пузырем и резервуаром ограничено до минимума - до пленки среды, содержащей клетки. Предпочтительно, культуральная среда протекает в виде очень тонкой пленки между большим пузырем и внутренней стенкой биореактора. Однако система также работает, когда пленка является менее тонкой и пузырь занимает 50-99% ширины резервуара, предпочтительно 60-99% ширины резервуара,более предпочтительно 98,5%. Относительно больших пузырей следует иметь в виду, что объем каждого отдельного и большого пузыря составляет по меньшей мере 65 см 3, предпочтительнее по меньшей мере 500 см 3. Например, в реакторах, имеющих диаметр окружности 20 см, объемы больших пузырей могут варьироваться предпочтительно между 2600 и 4100 см 3, или, более предпочтительно, между 3000 и 4100 см 3, или даже, более предпочтительно, между 3500 или 3700 и 4100 см 3. Для создания больших пузырей генератор пузырей 13 соединен с трубой для впуска воздуха. Генератор пузырей, как показано на фиг. 3, например, состоит из электроклапана 17, управляемого таймером 18 и соединенного с газовым насосом 19. В такой конфигурации электроклапан, управляемый таймером,непосредственно соединен с отверстием для впуска воздуха и газовым насосом. Регулярно таймер (запрограммированный пользователем) посылает электрический сигнал к электроклапану в течение очень короткого периода времени. На этот период электроклапан открывается и пропускает газ от насоса в биореактор. Когда большой поток газа подается за очень короткий период времени в колонну, это создает единственный большой пузырь, который заполняет почти все поперечное сечение колонны. В настоящем изобретении сечение электроклапана составляет 15 мм, давление воздуха в газовом насосе составляет 0,5 бар, электрический сигнал длительностью 0,1 с посылается каждые 5 с, что создает большой пузырь каждые 5 с. Пользователи, в зависимости от своих потребностей, могут регулировать эти параметры. Этот тип генератора предпочтителен, но также могут быть использованы другие устройства, создающие большой газовый пузырь в колонне. По настоящему изобретению используемым газом является воздух, но другие газы, отдельно или в смеси, или рециркулированные из биореактора могут быть использованы для обеспечения потребностей клеток, например СO2 для фотоаутотрофных клеток. Когда пузырь достигает верхней части колонны, он разрывается, и некоторая часть среды/клеток может быть потеряна на стенках резервуара 1. Для избежания этого недостатка в варианте осуществления настоящего изобретения верхняя часть резервуара расширена, например, в предпочтительном варианте осуществления она имеет форму обратного конуса, так что среда/клетки могут падать обратно в резервуар (что показано на фиг. 4 стрелкой 20). При работе происходит испарение, снижающее объем культуры и изменяющее концентрацию различных соединений в среде, что может быть вредным для клеток. Чтобы избежать этих проблем, могут быть добавлены устройства, такие как конденсаторы для выпуска газа или увлажнители для подачи газа. Кроме того, можно присоединить большее количество труб для впуска и/или выпуска к колонне, что может быть использовано, например, при добавлении кислот, щелочей, противовспенивающих агентов или экстрагирующих растворов. Необязательно к этой системе культивирования могут быть присоединены устройства для контролирования и/или регулирования условий культивирования, такие как (без ограничения) термометр, рН-метр, системы анализа газа, клеточной плотности, контроля давления и контроля массы Также возможно размещение устройства для генерации света вокруг биореактора, например для фотоаутотрофных растительных клеток. Регуляция температуры в биореакторе может быть достигнута с помощью различных систем, таких как (без ограничения) размещение биореактора в комнате, в которой температура контролируется с помощью подходящего кондиционирования воздуха, использование облицованных наружных контейнеров, в которых предусмотрено регулируемое водой или воздухом изменение температуры, или любых других средств, известных квалифицированному специалисту.-4 008157 Настоящее изобретение основано на том факте, что жидкая культура просачивается между поднимающимся газовым пузырем 6 и боковыми стенками биореактора, как показано стрелками 14 на фиг. 1. Это приводит к образованию вихревых воронок 15 для перемешивания массы, избежания клетками оседания и к контакту в тонкой жидкой пленке 16 с газовыми пузырями 6, где массоперенос легко достигается за счет аэрации. Эта система культивирования является простой в эксплуатации, так как пользователь может выбирать объем и частоту пузырей путем программирования генератора пузырей, как описано ранее. Система изобретения может быть использована для выращивания живых клеток, таких как, например, растительные клетки, животные клетки или микроорганизмы, такие как, например, дрожжевые клетки. Указанные клетки могут продуцировать, например, клеточную биомассу, эмбриогенные растительные клетки, метаболиты, вторичные растительные метаболиты и/или рекомбинантные молекулы. Следующий пример иллюстрирует некоторые продукты и способы в объеме настоящего изобретения и не должен рассматриваться как ограничивающий этот объем каким-либо образом. В изобретении возможны изменения и модификации. То есть квалифицированный специалист сможет распознать много вариантов на этом примере, включающих широкий круг формул, ингредиентов, обработок и смесей для рациональной регулировки природных уровней соединений изобретения для различных применений. Пример. Сравнение роста культур клеток сои. Способность изобретения выращивать клетки сои показана с помощью периодических культур. Она сравнима или лучше, чем в колбе Эрленмейера или в биореакторе в виде резервуара с перемешиванием,даже в большом масштабе. Штаммы тканевой культуры Glycine max (L.) Merr. стимулировали из трех различных сортов растения на среде по Gamborg et al. (1968) с добавлением 20 г/л сахарозы, 7 г/л агара (бакто-агар Дифко) и 1 мг/л 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты. рН регулировали до 5,8 перед автоклавированием в течение 30 мин при 115 С. Один штамм (13406, сорт Maple arrow) переносили в жидкую среду (такая же среда,как для тканевых культур, без агара и с 30 г/л сахарозы) и субкультивировали в 250-мл колбе Эрленмейера (3 г/л свежей массы на 100 мл среды) каждые две недели в тех же условиях, что и коллекцию тканевых культур. Колбы Эрленмейера помещали в качалку с круговым вращением при 100 об./мин (диаметр качания 20 мм). Биореактор в виде резервуара с перемешиванием на 14 л (New Brunswick Scientific) с двумя шестигранными лопастями крыльчатки использовали с той же средой, условиями температуры и рН, как упомянуто выше. Биореактор, содержащий 9 л свежей среды, автоклавировали 40 мин при 115 С. 14 дневные клетки сои фильтровали из двух колб Эрленмейера (на 1 л 500 мл среды). 300 г свежей массы помещали в 1 л свежей среды в стерильный резервуар с выходом, асептически соединенным с биореактором для внесения посевного материала. Скорость перемешивания регулировали до 100 об./мин. Растворенный кислород поддерживали на уровне 30% путем повышения или снижения скорости потока воздуха с помощью биодатчика, оборудованного в стерилизованном кислородном зонде (Ingold), и массового расходомера. Систему культивирования клеток на 25 л, названную большой пузырьковой колонной, как описано ранее, помещенную в жесткий наружный контейнер, заполняли 20 л клеток сои в свежей культуральной среде (30 г/л свежей массы). Температуру комнаты регулировали до 25 С, генерировали пузырь 12 см в диаметре (около 10 см высотой) каждые 5 с (посредством программирования генератора пузырей, как упомянуто выше). Измерение роста: образцы культивированной массы отбирали в определенные периоды роста из колб, биореактора в виде резервуара с перемешиванием и большой пузырьковой колонны и замеряли их объем. Клетки затем удаляли из жидкой культуры посредством фильтрации. Биомассу взвешивали (свежая масса). Аликвоту этой биомассы (весом около 1 г) взвешивали точно и помещали в сушильную камеру при 100 С в течение 24 ч и затем снова точно взвешивали (по сухом весу). Этот пример показывает, что колонна, масштабированная до объема 20 л, обеспечит благоприятную окружающую среду для клеток по сравнению с колбами, и лучшую, чем в резервуаре реактора с мешалкой. Клеточные повреждения незначительны, а массоперенос и газоснабжение эффективны в условиях эксплуатации. Как уже упомянуто выше, настоящее изобретение обеспечивает многие преимущества, которые, в свою очередь, обеспечивают благоприятную среду для роста растительных клеток; легкое масштабирование; одноразовое устройство и простоту эксплуатации. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Биореактор для культивирования живых клеток в жидкой культуральной среде, содержащий по меньшей мере один неподвижный резервуар, содержащий клетки и жидкую культуральную среду, и по меньшей мере одно средство введения единственного большого газового пузыря в основание емкости,причем ширина единственного большого пузыря составляет 50-99% ширины резервуара, предпочтительно 60-99%, более предпочтительно 98,5%.-5 008157 2. Биореактор по п.1, в котором единственный большой пузырь имеет объем, составляющий по меньшей мере 65 см 3. 3. Биореактор по п.1 или 2, в котором биореактор также содержит по меньшей мере одно средство программирования объема и частоты больших пузырей. 4. Биореактор по любому из пп.1-3, в котором резервуаром является гибкий или негибкий пластиковый мешок. 5. Биореактор по любому из пп.1-4, в котором неподвижный резервуар окружен жестким наружным контейнером. 6. Биореактор по любому из пп.1-5, в котором верхняя часть резервуара расширена. 7. Биореактор по любому из пп.1-6, в котором резервуар является цилиндрическим или имеет овальное поперечное сечение. 8. Применение биореактора по любому из пп.1-7, в котором клетками являются растительные клетки, или животные клетки, или микроорганизмы. 9. Применение биореактора по любому из пп.1-8, в котором клетки продуцируют клеточную биомассу, эмбриогенные растительные клетки, метаболиты, вторичные растительные метаболиты и/или рекомбинантные молекулы.