Способ очистки рекомбинантного чхг

006605 Область, к которой относится изобретение Настоящее изобретение относится к способу очистки хорионического гонадотропина, а в частности к очистке рекомбинантного человеческого хорионического гонадотропина (чХГ) из образца неочищенного рекомбинантного чХГ. Этот способ предусматривает использование ионообменной хроматографии и обращенно-фазовой ВЭЖХ. Хорионический гонадотропин представляет собой гормон, продуцируемый плацентой и обычно получаемый из мочи беременных женщин. Указанный гормон представляет собой гетеродимер, состоящий из нековалентно связанных - и субъединиц. Он действует преимущественно так же, как и лютеинизирующий гормон, гонадотропин. Хорионический гонадотропин вводят женщинам в целях индуцирования у них овуляции после созревания фолликула, стимулируемого фолликулостимулирующим гормоном или постменопаузальными гонадотропинами человека, для лечения бесплодия, которое является следствием ановуляции, обусловленной отсутствием или низкими концентрациями гонадотропинов. Для имитации пика выброса лютеинизирующего гормона, который обычно стимулирует овуляцию в середине цикла, вводят разовую дозу от 5000 до 10000 единиц путем внутримышечной инъекции. Хорионический гонадотропин также вводят в сочетании с менотропином, а иногда также с цитратом кломифена, используемым в качестве добавки для осуществления процедур in vitro-оплодотворения и процедур, связанных с оплодотворением и зачатием, включая суперовуляцию и сбор ооцитов. У мужчин этот гормон используют для лечения препубертатного крипторхидизма. Схемы лечения широко варьируются, но обычно дозы составляют от 500 до 4000 единиц и вводятся три раза в неделю путем внутримышечной инъекции. Указанный гормон также применяют для лечения мужского бесплодия, ассоциированного с гипогонадотропиновым гипогонадизмом. В этом случае предусматривается использование различных схем лечения, и используемые дозы могут варьироваться от 500 до 4000 единиц и вводиться два-три раза в неделю. Для обеспечения нормального сперматогенеза часто добавляют агент с фолликулостимулирующей активностью, такой как менотропин. Для лечения олигоспермии могут быть введены дозы вплоть до 3000 единиц хорионического гонадотропина вместе с менотропином и другим фолликулостимулирующим препаратом. При лечении гипогонадизма у мужчин, связанного с задержкой полового созревания,может быть введена доза 500-1500 единиц два раза в неделю; причем указанная доза должна титроваться против концентрации тестостерона в плазме. Для выделения и очистки чХГ из образцов мочи были использованы различные методы (Birken etal., Acta Endocrinol., 73(1): 133-45, 1973). Недавно был разработан другой метод аффинной хроматографии, названный аффинной хроматографией с фильтрацией на мембране, и этот метод был применен для очистки чХГ из мочи (Xu et al., Protein expression and purification, 16:221-3, 1999). Этот способ позволяет избежать использования BrCN-активированной сефарозы в качестве твердой фазы для аффинной хроматографической колонки и представляет собой вариант обычных способов аффинной хроматографии, используемых для очистки чХГ из образцов мочи. Иммуноактивность очищенного чХГ в соответствии с этим способом составляет 8554 МЕ/мг. Рекомбинантный чХГ имеет те преимущества, что он не содержит другие гонадотропные гормоны и примеси человеческого происхождения, а более конкретно, примеси, присутствующие в моче человека. Однако неочищенный препарат рекомбинантного чХГ содержит все остальные белки и примеси клеток,используемых для его рекомбинантного продуцирования, а поэтому разработка способа достижения абсолютной чистоты рекомбинантного хорионического гонадотропина является крайне необходимой. Краткое описание изобретения Авторами настоящего изобретения было обнаружено, что неочищенный препарат чХГ, происходящий от концентрированного образца культуральной среды, полученной после осуществления рекомбинантного способа или из неочищенного концентрата мочи беременных женщин, может быть очищен до такой степени, что полученный чХГ практически не будет содержать белков и/или других примесей, находящихся в неочищенном препарате чХГ. Данный способ очистки основан на использовании ионообменной хроматографии и обращеннофазовой ВЭЖХ. Возможное дополнительное использование вытеснительной колонки позволяет удалять любые следовые количества примесей. Оптимальные результаты были получены при осуществлении по крайней мере двух стадий ионообменной хроматографии. Способ настоящего изобретения может быть использован для очистки рекомбинантного чХГ из неочищенного препарата культуральной среды, полученной в результате рекомбинантного способа. р-чХГ,полученный с высокой степенью чистоты и с высокой удельной биологической активностью (в пределах 23000-28000 МЕ/мг), практически не содержит белков фетальной телячьей сыворотки (FBS), если она присутствует в культуральной среде, и нуклеиновых кислот или других примесей, присутствующих в клетках-хозяевах, используемых в данном рекомбинантном способе. Способ настоящего изобретения может быть также использован для очистки уринарного чХГ, полученного из неочищенного концентрата мочи беременных женщин, и для очистки ХГ, происходящего от других видов млекопитающих, включая, например, коров, лошадей, свиней, овец и обезьян.-1 006605 Следовательно, целью настоящего изобретения является способ очистки чХГ из образца, предусматривающий использование ионообменной хроматографии и обращенно-фазовой ВЭЖХ. Указанный способ включает стадии, в которых данный образец подвергают ионообменной хроматографии, и стадии,в которых элюат подвергают обращенно-фазовой ВЭЖХ. Кроме того, может быть проведена дополнительная стадия нанесения элюата на вытеснительную колонку. Две стадии ионообменной хроматографии предпочтительно осуществляют в различных условиях в целях получения оптимальных результатов указанного способа очистки. Предпочтительный вариант способа настоящего изобретения включает стадии:(a) элюирования образца через хроматографическую колонку с двуокисью кремния;(b) элюирования через ионообменную хроматографическую колонку с DEAE-сефарозой;(с) элюирования через ионообменную хроматографическую колонку с СМ-сефарозой.(е) элюирования через вытеснительную хроматографическую колонку с сефакрилом. В предпочтительном варианте осуществления изобретения элюирование через ионообменную колонку с DEAE-сефарозой осуществляют в фосфатно-натриевом буфере при рН примерно 7,5. Элюирование через ионообменную колонку с СМ-сефарозой предпочтительно осуществляют в фосфатно-натриевом буфере при рН примерно 6. Стадию (d) обращенно-фазовой ВЭЖХ предпочтительно осуществляют с использованием смеси 2 пропанола/Трис-фосфатного буфера в качестве подвижной фазы. ХГ настоящего изобретения предпочтительно представляет собой человеческий ХГ, а наиболее предпочтительно, рекомбинантный чХГ, полученный из культуральной среды клеток СНО, используемых в данном рекомбинантном способе. Другой целью настоящего изобретения является получение фармацевтической композиции, содержащей терапевтически эффективное количество очищенного рекомбинантного чХГ, продуцированного рекомбинантным способом, описанным выше, вместе с подходящими наполнителями. Примером подходящего наполнителя является сахароза, которая способствует стабилизации лиофилизованного продукта. Фармацевтическая композиция указанного рекомбинантного чХГ является особенно подходящей для подкожного введения. Подробное описание изобретения Настоящее изобретение относится к способу очистки чХГ, а в частности, к способу очистки рекомбинантного чХГ из неочищенного препарата культуральной среды, полученного в процессе осуществления рекомбинантных процедур. р-чХГ, полученный с высокой степенью чистоты и с высокой удельной активностью, практически не содержит белков фетальной телячьей сыворотки (FBS), которые присутствуют в культуральной среде, и нуклеиновых кислот или других примесей, находящихся в клеткаххозяевах, используемых в указанном рекомбинантном способе. Настоящее изобретение предполагает использование биологических материалов, в частности неочищенных смесей, содержащих чХГ и другие примесные белки, и называемых в данной заявке образцами исходного материала. В примерах, подробно описанных ниже, используются образцы исходного материла, содержащие р-чХГ, полученный из супернатанта клеточной культуры в биореакторе. Альтернативно, указанным образцом является неочищенная концентрированная моча, взятая у беременных женщин. Указанный образец представляет собой свежесобранный супернатант среды клеточной культуры,пропускаемый через биореактор в течение двух дней. Предпочтительно супернатант осветляют путем фильтрации. Если необходимо, неочищенный раствор концентрируют и подвергают хроматографии на двуокиси кремния С 4 для удаления примесей, присутствующих в клеточной культуре. Затем после ультрафильтрации, полуочищенный сбор подвергают ионообменной хроматографии,которую предпочтительно осуществляют два раза и предпочтительно в различных условиях, и обращенно-фазовой ВЭЖХ. Первая стадия ионообменной хроматографии на DEAE-сефарозе может быть, в основном, осуществлена как стадия "сквозного прохождения" чХГ, в которой удаляется большая часть белков, не являющихся чХГ, и ДНК. Вторую стадию ионообменной хроматографии предпочтительно осуществляют на колонке с СМ-сефарозой как стадию связывания с чХГ, и в этой стадии удаляются остаточные ДНК и примеси клеток-хозяев или примесные белки среды. В предпочтительном варианте осуществления изобретения эту стадию проводят при температуре примерно 5 С, элюируя фосфатнонатриевым буфером примерно при рН 6. Обращенно-фазовая хроматография позволяет эффективно удалять следовые количества нуклеиновых кислот и примесей клеточной культуры. Колонку предпочтительно элюируют смесью 2 пропанола/трис-фосфатного буфера, используемой в качестве подвижной фазы. Затем раствор ретентата(удерживаемой фракции) предпочтительно подвергают ультрафильтрации с отсечкой молекулярной массы 10 кД и концентрируют, после чего он может быть выделен с использованием бикарбоната аммония,рН 8. Затем концентрированный продукт может быть нанесен на вытеснительную хроматографическую колонку с сефакрилом S200 HR. В этой стадии разделение молекул по размерам достигается элюированием бикарбонатом аммония, рН 8, проводимом для удаления возможно еще присутствующих следовых количеств примесей клеточной культуры, возможных агрегатов и свободных субъединиц чХГ. Затем-2 006605 элюат может быть подвергнут диализу путем ультрафильтрации на мембранах с 10 кД-отсечкой предпочтительно в фосфатно-натриевом буфере, рН 7. После фильтрации очищенную массу чХГ предпочтительно хранят в стерильных сосудах при низкой температуре. Пример 1. Реагенты Аммиак, аналитической чистоты. Бикарбонат аммония, аналитической чистоты (В.Р.). Двухосновный гидрофосфат натрия, аналитической чистоты. Абсолютный денатурированный этанол. Фосфорная кислота, аналитической чистоты (Ph.Eur.). 2-Пропанол, аналитической чистоты (Ph.Helv.). Хлорид натрия, аналитической чистоты (Ph.Eur.). Дигидрофосфат натрия, аналитической чистоты. Гранулы гидроксида натрия, аналитической чистоты (Ph.Eur.). Трифторуксусная кислота (TFA) для ВЭЖХ. Трис-(гидроксиметил)аминометан, аналитической чистоты. Краткая блок-схема способа очистки Собранный материал, продуцируемый в процессе культивирования клеток, очищают и концентрируют путем проведения серии пяти хроматографических стадий. В нижеследующей блок-схеме (табл. 1) систематизирован предпочтительный вариант осуществления способа очистки р-чХГ, а также описаны смолы, используемые в хроматографических колонках и принципы осуществления каждой из промежуточных стадий. Таблица 1 Блок-схема, в которой систематизирован способ очистки р-чХГ Подробное описание блок-схемы и всего процесса приводится ниже. Условиями для стадии захвата(стадия I) являются условия, которые обычно применяются к неочищенному материалу, полученному рекомбинантным способом. Стадия I (стадия захвата). В данной стадии (стадия I) осуществляют предварительное концентрирование и буфер заменяют так, чтобы он имел регулируемый состав. Эту стадию начинают при комнатной температуре (хроматография на двуокиси кремния С 4), а затем продолжают примерно при +5 С. Предпочтительный интервал-3 006605 температуры составляет 53 С. Эту стадию повторяют отдельно для каждого сбора в течение цикла продуцирования в биореакторе.(i) Осветление сборов. Свежесобранную культуральную среду из биореактора обычно сначала осветляют путем фильтрации.(ii) Хроматография на двуокиси кремния С 4. После осветления сборы загружают на хроматографическую колонку с двуокисью кремния С 4,предварительно уравновешенную в 25 мМ фосфате натрия, рН 7. Предпочтительный диапазон рН составляет от 6,6 до 7,7. Колонку промывают фосфатом натрия 25 мМ до тех пор, пока УФ-сигнал на мониторе не возвратится на базовую линию. Затем продукт элюируют 34,2% (мас./мас.) 2-пропанола в 25 мм фосфате натрия.(iii) Обработка аммиаком. Затем к раствору добавляют аммиак до конечной концентрации 1 М. Эту смесь инкубируют в течение 6 ч. После этого раствор 2-кратно разбавляют водой и рН доводят до 7,5 с использованием 85%-ной фосфорной кислоты. Предпочтительный диапазон рН составляет 7,50,2.(iv) Концентрирование и диализ. Мембраны с 10 кД-отсечкой, которые между циклами хранились в 0,05 М гидроксиде натрия, промывают очищенной водой до тех пор, пока рН не понизится приблизительно до 8. Продукт концентрируют и диализуют (путем ультрафильтрации на 10 кД-мембране) для удаления материала, имеющего молекулярную массу ниже 10 кДа, и для удаления следовых количеств 2 пропанола, а также для замены раствора аммиака 40 мМ фосфатом натрия, рН 7,5. Предпочтительный диапазон рН составляет 7,50,2. Конечный ретентат отделяют от мембран с использованием 40 мМ фосфата натрия с достижением концентрации целевого белка 3-15 мг/мл. Затем раствор фильтруют и полученный концентрат хранят в замороженном виде приблизительно при -15 С. Стадия II (фильтрация и ионообменная хроматография на DЕАЕ-сефарозе FF). Данная хроматографическая стадия представляет собой стадию "сквозного прохождения" р-чХГ, в которой удаляется большая часть белков, не являющихся не-р-чХГ, и нуклеиновых кислот. Если фильтрацию проводят при комнатной температуре, то хроматографическую стадию, в которой продукт пропускают через колонку, осуществляют в холодном помещении.(i) Оттаивание и объединение концентрированных неочищенных сборов р-чХГ. Замороженные концентраты оттаивают и объединяют. Партию очищенной массы р-чХГ получают из пула, состоящего из различного числа неочищенных концентратов р-чХГ, продуцированных из того же самого рабочего банка клеток. Критерий для числа неочищенных концентратов р-чХГ, объединенных в пул, основан на максимальной способности связывания белков в следующей хроматографической стадии данного способа очистки (4 мг общего белка/мг смолы).(ii) Осветление путем фильтрации. Раствор р-чХГ предпочтительно пропускают через фильтрующее устройство и фильтры промывают 40 мМ фосфатом натрия, рН 7,5. Отфильтрованный раствор и промывки объединяют.(iii) Ионообменная хроматография на DEAE-сефарозе FF. Колонку, слабо упакованную анионообменной смолой диэтиламиноэтан(DEAE)сефароза Fast Flow,уравновешивают 40 мМ фосфатом натрия (рН 7,5). Раствор р-чХГ загружают на колонку. В колонку подают 40 мМ фосфата натрия, рН 7,5. Мониторинг хроматографического процесса осуществляют с помощью спектрофотометрии при 280 нм. Первую фракцию отбрасывают до тех пор, пока не начинает элюироваться пик. Затем собирают несвязанные фракции, содержащие р-чХГ. Стадия III (хроматография на сефарозе FF). В данной хроматографической стадии удаляется большая часть контаминатов от клеток-хозяев. Эту хроматографическую стадию осуществляют примерно при +5 С. Предпочтительный интервал температуры составляет 53 С.(i) Разведение элюата из колонки с DEAE-сефарозой FF. К элюату из колонки с DEAE-сефарозой FF добавляют воду для инъекций и рН доводят до 6 с использованием 85% фосфорной кислоты. Предпочтительный диапазон рН составляет 60,1.(ii) Ионообменная хроматография на СМ-сефарозе FF. Колонку, слабо упакованную анионообменной смолой карбоксиметил(СМ)-сефароза Fast Flow,уравновешивают 20 мМ фосфатно-натриевым буфером (рН 6). Предпочтительный диапазон рН составляет 60,1. Раствор р-чХГ загружают на колонку.-4 006605 Колонку промывают 20 мМ фосфатно-натриевым буфером, рН 6. Мониторинг хроматографического процесса осуществляют с помощью спектрофотометрии при 280 нм. Продукт элюируют с использованием 130 мМ фосфатно-натриевого буфера, рН 6. Первую фракцию отбрасывают до тех пор, пока не начнет элюироваться пик. Полный пик, содержащий р-чХГ, собирают. На этой стадии, для удаления вирусных примесей, продукт может быть, но необязательно, отфильтрован. Стадия IV (ОФ-ВЭЖХ на двуокиси кремния С 18). Эта хроматографическая стадия ОФ-ВЭЖХ является эффективной для удаления следовых количеств контаминатов от клеточной культуры, остатков нуклеиновой кислоты и эндотоксинов. После этой стадии осуществляют ультрафильтрацию с 10 кД-отсечкой и необязательную фильтрацию.(i) Получение аликвот. рН аликвот доводят до 5 и добавляют 2-пропанол до конечной концентрации 15% (об./об.).(ii) ОФ-ВЭЖХ-хроматография на двуокиси кремния С 18. Колонку, упакованную смолой двуокисью кремния С 18, сначала уравновешивают в 15% (об./об.) 2 пропаноле в 0,5 М трис-фосфатном буфере. Первую аликвоту загружают на колонку и проводят мониторинг хроматографии с помощью УФспектрофотометрии. Колонку промывают тем же самым уравновешивающим буфером. Затем осуществляют элюирование р-чХГ линейным градиентом смеси 2-пропанола/0,5 трисфосфатного буфера от 15 до 25% (об./об.), используемой в качестве подвижной фазы. Когда соответствующий пик детектируется с помощью спектрофотометрии (A280), то р-чХГ фракционируют. Фракции,оптическая плотность которых превышает 65% высоты максимального пика в восходящей части и превышает 20% высоты максимального пика в нисходящей части, объединяют. Затем четыре пула, содержащие р-чХГ, объединяют и разбавляют в эквивалентном объеме воды для инъекций (WFI). Продукт концентрируют и диализуют (путем ультрафильтрации на 10 кД-мембране) против WFI для удаления материала, имеющего молекулярную массу меньше чем 10 кД, и для удаления 2-пропанола. Затем продукт диализуют путем ультрафильтрации против 0,1 М аммонийбикарбонатного буфера,рН 8. Полученное промежуточное соединение хранят примерно при +5 С или замораживают, если это необходимо. Предпочтительные температуры хранения составляют 53 С, либо равны или ниже -15 С соответственно. Стадия V (вытеснительная хроматография на сефакриле S200 HR). Эта стадия вытеснительной хроматографии является эффективной для удаления следовых количеств примесей от клеточной культуры, возможных агрегатов и/или свободных субъединиц. После этой стадии осуществляют ультрафильтрацию с 10 кД-отсечкой. Стадию хроматографии на сефакриле S-200HR и стадию ультрафильтрации с 10 кД-отсечкой проводят примерно при +5 С. Предпочтительная температура составляют 53 С.(i) Вытеснительная хроматография на сефакриле S200 HR. Колонку, упакованную смолой сефакрил S200 HR, уравновешивают бикарбонатом аммония, 0,5 М(рН 8). Предпочтительный диапазон рН составляет 80,2. Раствор р-чХГ загружают на колонку и элюирование инициируют бикарбонатом аммония, 0,5 М, рН 8. Предпочтительный диапазон рН составляет 80,2. Сбор фракции р-чХГ начинают от начала пика и продолжают вплоть до достижения в нисходящей части этого пика отметки 50% от высоты максимального пика.(ii) Ультрафильтрация с 10 кД-отсечкой. Мембраны с 10 кД-отсечкой, которые в промежутках между циклами хранили в 0,05 М гидроксиде натрия, промывают WFI до тех пор, пока рН не снижался примерно до 8. Полученный продукт концентрируют и диализуют (путем ультрафильтрации) против WFI. Затем продукт диализуют (путем ультрафильтрации) против 0,01 М фосфатно-натриевого буфера,рН 7, и конечную концентрацию белка доводят до нужной конечной концентрации 3,5 мг/мл. Конечный объемный раствор полученного р-чХГ предпочтительно хранят в замороженном виде примерно при -15 С. Хроматографические смолы В указанном способе очистки могут быть использованы следующие хроматографические смолы,указанные ниже. Могут быть также использованы эквивалентные смолы. Результаты Масса и размер молекул. Электрофорез в ПААГ с ДСН. Относительная молекулярная масса р-чХГ, полученного после проведения способа очистки настоящего изобретения, была определена с помощью электрофореза в ПААГ с ДСН против стандартных белков с известной молекулярной массой. Окрашивание кумасси бриллиантовым голубым после электрофореза в нередуцирующем ПААГ с ДСН выявило одну широкую полосу для гетеродимера р-чХГ с молекулярной массой приблизительно 70 кД (в диапазоне 65-75 кД). Идентичность этой полосы была подтверждена с помощью Вестерн-блотанализа. Биологическая активность. Биологическая активность различных партий р-чХГ после очистки способом настоящего изобретения представлена в табл. 2. Концентрацию белка определяли с помощью спектрофотометрии при 276,5 нм, а = 0,616. Средняя удельная активность препарата р-чХГ является особенно высокой и составляет примерно 25000 МЕ/мг. Таблица 2 Композиции. Жидкие и лиофилизованные композиции были получены с использованием высокоочищенного рекомбинантного чХГ настоящего изобретения. Жидкая композиция. Две жидкие композиции при концентрации 10000 МЕ/мл получали во флаконах DIN 2R с использованием маннита или сахарозы в качестве наполнителя (табл. 3) и тестировали на стабильность при 50, 40,25 и 4 С. Эта композиция описана в табл. 3 и 4. Объем наполнения: 0,5 мл. Результаты тестов на стабильность, проведенных с помощью биоанализа, вытеснительной ВЭЖХ и ОФ-ВЭЖХ, показали, что композиция с маннитом была более стабильной, чем композиция с сахарозой. Условия хранения в холодильниках являются предпочтительными и необходимы для минимизации окисления белка и образования свободных субъединиц. Лиофилизованная композиция. Лиофилизованную композицию при концентрации 5000 ME получали во флаконах DIN 2R с использованием сахарозы в качестве наполнителя и тестировали на стабильность при 50, 40, 25 и 4 С. Эта композиция описана в табл. 5. Таблица 5 Результаты тестов на стабильность, проведенных с помощью биоанализа, вытеснительной ВЭЖХ и ОФ-ВЭЖХ, показали, что данная лиофилизованная композиция была стабильной при 40 и 50 С, по крайней мере, в течение 19 недель. Тесты на стабильность при 25 и 4 С проводили вплоть до 6 месяцев, что указывало на отсутствие разложения активного вещества. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Способ очистки рекомбинантного чХГ из образца, включающий последовательные стадии:(a) элюирования образца через хроматографическую колонку с двуокисью кремния;(b) элюирования препарата через ионообменную хроматографическую колонку;(c) элюирования через вторую ионообменную хроматографическую колонку;(е) обработки элюата вытеснительной хроматографией. 2. Способ очистки рекомбинантного чХГ из образца по п.1, включающий последовательные стадии:(a) элюирования образца через хроматографическую колонку с двуокисью кремния;(b) элюирования препарата образца через ионообменную хроматографическую колонку с DEAEсефарозой;(c) элюирования через ионообменную хроматографическую колонку с СМ-сефарозой.(e) обработки элюата с помощью вытеснительной хроматографии на сефакриле. 3. Способ по п.2, где элюирование через ионообменную колонку с DEAE-сефарозой осуществляют в фосфатно-натриевом буфере при рН 7,5. 4. Способ по любому из пп.2-3, где элюирование через ионообменную колонку с СМ-сефарозой осуществляют в фосфатно-натриевом буфере при рН 6.-7 006605 5. Способ по любому из пп.2-4, где стадию обращенно-фазовой ВЭЖХ осуществляют с использованием 2-пропанол/трис-фосфатного буфера в качестве подвижной фазы. 6. Способ по любому из пп.2-5, где стадию вытеснительной хроматографии осуществляют с использованием аммонийбикарбонатного буфера в качестве подвижной фазы. 7. Способ по любому из пп.2-6, где образцом является культуральная среда клеток СНО. 8. Рекомбинантный чХГ, имеющий удельную биологическую активность в диапазоне от 23000 до 28000 МЕ/мг, получаемый способом по любому из пп.1-7. 9. Фармацевтическая композиция, содержащая рекомбинантный чХГ по п.8 и приемлемые наполнители. 10. Фармацевтическая композиция по п.9, где указанным наполнителем является сахароза. 11. Фармацевтическая композиция по п.9, где указанным наполнителем является маннит. 12. Фармацевтическая композиция по любому из пп.9-11 для подкожного введения. 13. Применение рекомбинантного чХГ по п.8 для получения лекарственного средства для лечения заболеваний, связанных с бесплодием.