Способы обработки сред для культур клеток, применяемых в биореакторах

СПОСОБЫ ОБРАБОТКИ СРЕД ДЛЯ КУЛЬТУР КЛЕТОК, ПРИМЕНЯЕМЫХ В БИОРЕАКТОРАХ Изобретение относится к способам обработки сред для культур клеток, предназначенных для применения в биореакторе, ультрафиолетовым излучением спектра С (УФ-С) и фильтрованием. Изобретение предлагает способ обработки сред для культур клеток, предназначенных для применения в биореакторе, включающий воздействие на среду для культур клеток коротковолнового ультрафиолетового С (УФ-С) излучения; пропускание среды для культур клеток через стерильный фильтр и введение среды для культур клеток в биореактор. Согласно изобретению также предложены способы обработки сред для культур клеток, предназначенных для применения в биореакторе, включающие воздействие на среду для культур клеток УФ-С-излучения; пропускание среды для культур клеток через объемный фильтр; пропускание среды для культур клеток через стерильный фильтр и введение среды для культур клеток в биореактор. 017322 Область техники Изобретение относится к способам обработки сред для культур клеток, предназначенных для применения в биореакторе, ультрафиолетовым излучением спектра С (УФ-С) и фильтрованием. Предпосылки создания изобретения Загрязнение вирусами клеточных сред и супернатантов создает большие проблемы для производителей биофармацевтической продукции во всем мире. Для инактивации и/или удаления больших или малых, оболочечных и безоболочечных ДНК- или РНК-содержащих вирусных частиц из клеточных супернатантов применяли ряд методов. К таким методам относятся технология фильтрации через 20-нм фильтры, хроматография на Q-мембране и технология на основе объемного фильтра. Однако указанные методы применялись прежде всего как средство для инактивации вирусов (т.е. элиминации вирусов) из сред и супернатантов, собранных с клеточных линий или тканей (т.е. после получения белка). Такие способы элиминации вируса не применялись для обработки сред для культур клеток до выделения клеточных линий или тканей (т.е. до получения белка) по нескольким причинам. Во-первых,применение указанных способов для обработки сред большого объема (до 20000 л среды в сутки) затруднено вследствие больших затрат времени и высокой стоимости. Во-вторых, такие способы исторически применялись для удаления загрязнений из клеточных супернатантов большого объема в качестве начальной стадии очистки терапевтических белковых продуктов, полученных из таких клеточных супернатантов, прежде чем вводить терапевтические белковые продукты больным. В третьих, в отрасли отсутствует документированная необходимость инактивации или удаления вирусных частиц в предшествующих процессах продукции белка. Наконец, биореакторы и ферментаторы часто не оборудованы механизмами, необходимыми для осуществления указанных технологий, а стоимость модернизации существующего оборудования для монтажа дополнительной аппаратуры может оказаться непомерно высокой. Помимо упомянутых методов для обработки препаратов белков большого объема перед очисткой белков из клеточных супернатантов применяли ультрафиолетовое облучение. Однако, как и в случае других методов обработки клеточных супернатантов большого объема перед очисткой и выделением терапевтических белковых продуктов из клеточных супернатантов ультрафиолетовое облучение применялось прежде всего после производства белка. Другими словами, в уровне техники не существует способов, в которых ультрафиолетовое облучение (само по себе или в сочетании с другими способами очистки или обработки) применялось бы для воздействия на среду для культуры клеток перед введением указанной среды в биореактор. Таким образом, существует потребность в методах обработки сред для культур клеток, предназначенных для использования в биореакторе. Такие методы будут особенно полезны для защиты ценных клеточных линий от загрязнения вирусами, позволяя сэкономить потери средств на загрязненные или некондиционные среды и повышая эффективность продукции белка такими клеточными линиями. Следовательно, указанные способы найдут широкое применение в производстве биофармацевтических препаратов. Сущность изобретения В данном изобретении предложены способы обработки сред для культур клеток, предназначенных для применения в биореакторе, включающие действие на среду для культур клеток коротковолнового ультрафиолетового излучения (УФ-С); пропускание среды для культур клеток через стерильный фильтр и введение среды для культур клеток в биореактор. В данном изобретениитакже предлагаются способы обработки сред для культур клеток, предназначенных для применения в биореакторе, включающие УФ-С-воздействие на среду для культур клеток; пропускание среды для культур клеток через объмный фильтр; пропускание среды для культур клеток через стерильный фильтр и введение среды для культур клеток в биореактор. Конкретные предпочтительные варианты осуществления данного изобретения поясняются ниже в более подробном описании и в формуле изобретения. Краткое описание чертежей На фиг. 1 приведена взаимосвязь между длиной волны света и повреждением вирусной ДНК/РНК. На фиг. 2 - эффективность удаления вируса мышиной лейкемии (MuLV) либо минут-вируса мышей(MMV) из сред для культур клеток с помощью двух типов объемных фильтров. На фиг. 3 - эффективность удаления парвовируса свиньи (PRV) и реовируса 3 (Reo-3) из сред для культур клеток с помощью двух типов объемных фильтров. Подробное описание изобретения Изобретение предлагает способ обработки сред для культур клеток, предназначенных для применения в биореакторе, включающий воздействие на среду для культур клеток коротковолнового ультрафиолетового С (УФ-С)-излучения; пропускание среды для культур клеток через стерильный фильтр и введение среды для культур клеток в биореактор. Согласно изобретению также предложены способы обработки сред для культур клеток, предназначенных для применения в биореакторе, включающие воздействие на среду для культур клеток УФ-С-излучения; пропускание среды для культур клеток через объемный фильтр; пропускание среды для культур клеток через стерильный фильтр и введение среды для культур клеток в биореактор.-1 017322 Согласно способам данного изобретения на среду для культур клеток воздействуют УФ-Сизлучением до введения указанной среды в биореактор. Термин ультрафиолетовое излучение относится к интервалу спектра электромагнитного излучения от границы рентгеновского диапазона (100 нм) до границы диапазона видимого света (400 нм). Конкретно ультрафиолетовое излучение обычно делится на четыре диапазона: (1) вакуумное ультрафиолетовое излучение с длиной волны 100-200 нм, (2) ультрафиолет С (УФ-С) с длиной волны 200-280 нм, (3) ультрафиолет В (УФ-В) с длиной волны 280-315 нм и(4) ультрафиолет А (УФ-А) с длиной волны 315-400 нм (см. фиг. 1). Согласно одному из способов осуществления изобретения на среду для культур клеток воздействуют УФ-С-излучением с длиной волны от 200 до 280 нм перед введением среды для культур клеток в биореактор. Согласно еще одному способу осуществления изобретения на среду для культур клеток воздействуют УФ-С-излучением с длиной волны 254 нм до введения среды для культур клеток в биореактор. Согласно другим вариантам осуществления изобретения на среду для культур клеток воздействуют УФС излучением с длиной волны 254 нм +/- 1 нм, или с длиной волны 254 нм +/- 2 нм, или с длиной волны 254 нм +/- 3 нм, или с длиной волны 254 нм +/- 4 нм, или с длиной волны 254 нм +/- 5 нм, или с длиной волны 254 нм +/- 6 нм, или с длиной волны 254 нм +/- 7 нм, или с длиной волны 254 нм +/- 8 нм, или с длиной волны 254 нм +/- 9 нм, или с длиной волны 254 нм +/- 10 нм, или с длиной волны 254 нм +/- 15 нм, или с длиной волны 254 нм +/- 20 нм, или с длиной волны 254 нм +/- 25 нм. Согласно способу настоящего изобретения УФ-С-излучение применяется для инактивации частиц безоболочечного вируса за счет повреждения вирусной ДНК или РНК. При повреждении нуклеиновых кислот вирусы инактивируются и их последующей репликации не происходит. В типовом аппарате или УФ-С-реакторе для УФ-С-облучения растворов применяется гидравлический спиральный поток вдоль источника излучения, генерирующего вихри Дина в потоке жидкости, что приводит к равномерному распределению дозы УФ-С-излучения по всему раствору. При использовании УФ-С-излучения для инактивации частиц безоболочечного вируса инактивация обычно происходит приблизительно после пяти минут облучения. Как указывалось, способы элиминации вирусов, известные в отрасли, как правило, применяются после продукции белка. Помимо высокой стоимости и продолжительности применение указанных способов в основном после продукции белка связано с тем, что задачей при этом является инактивация и/или удаление вирусных частиц из клеточных супернатантов большого объема перед очисткой и выделением терапевтических белковых продуктов из клеточных супернатантов. В отношении применения УФ-С-излучения для инактивации вирусных частиц в биологических процессах больших масштабов одной из причин отсутствия в уровне техники технологий применения УФ-С-облучения, предшествующих продукции белка, является значительное поглощение УФ-С-излучения средой для культур клеток на длине волны 254 нм, а также влияние этого поглощения на способность такой среды обеспечивать эффективный рост клеток. Способы данного изобретения позволяют обойти эту проблему за счет повышения энергии используемого УФ-С-излучения. Термин энергия относится к характеристике ультрафиолетового излучения, которым воздействуют на среду для культур клеток, выраженной в Дж/м 2. В одном из осуществлений изобретения на среду для культур клеток воздействуют УФ-С-излучением с плотностью энергии 120-320 Дж/м 2 перед введением среды для культур клеток в биореактор. Согласно еще одному варианту осуществления на среду для культур клеток воздействуют УФ-С-излучением с плотностью энергии 238 Дж/м 2 перед введением среды для культур клеток в биореактор. Согласно другим способам осуществления изобретения на среду для культур клеток воздействуют УФ-С-излучением с плотностью энергии 238 Дж/м 2 +/- 1 Дж/м 2, или с плотностью энергии 238 Дж/м 2 +/- 2 Дж/м 2, или с плотностью энергии 238 Дж/м 2 +/- 3 Дж/м 2, или с плотностью энергии 238 Дж/м 2 +/- 4 Дж/м 2, или с плотностью энергии 238 Дж/м 2 +/- 5 Дж/м 2, или с плотностью энергии 238 Дж/м 2 +/- 10 Дж/м 2, или с плотностью энергии 238 Дж/м 2 +/- 15 Дж/м 2, или с плотностью энергии 238 Дж/м 2 +/- 20 Дж/м 2, или с плотностью энергии 238 Дж/м 2 +/- 25 Дж/м 2, или с плотностью энергии 238 Дж/м 2 +/- 30 Дж/м 2, или с плотностью энергии 238 Дж/м 2 +/- 40 Дж/м 2, или с плотностью энергии 238 Дж/м 2 +/- 50 Дж/м 2, или с плотностью энергии 238 Дж/м 2 +/- 60 Дж/м 2, или с плотностью энергии 238 Дж/м 2 +/- 70 Дж/м 2. Способы в соответствии с данным изобретением пригодны для процессов инактивации стендовых масштабов, но в большей степени - для обработки сред для культур клеток большого объема перед введением среды для культур клеток в биореактор. В одном из способов осуществления изобретения на среду для культур клеток воздействуют УФ-С-излучением при скорости потока 1-12 л/ч перед введением указанной среды для культур клеток. Согласно еще одному способу осуществления изобретения на среду для культур клеток воздействуют УФ-С-излучением при скорости потока 6 л/ч перед введением указанной среды в биореактор. Согласно другим осуществлениям изобретения на среду для культур клеток воздействуют УФ-С-излучением при скорости потока 6 л/ч +/-1 л/ч, или при скорости потока 6 л/ч +/- 2 л/ч, или при скорости потока 6 л/ч +/- 3 л/ч, или при скорости потока 6 л/ч +/- 4 л/ч, или при скорости потока 6 л/ч +/- 5 л/ч. Логарифмический показатель снижения (LRV) - мера эффективности фильтрации, эквивалентная-2 017322 логарифму отношения концентрации контрольной среды к концентрации фильтрата (LRV =Log10 контроль/фильтрат). Согласно настоящему изобретению концентрация контроля соответствует концентрации вирусного материала в среде для культур клеток. Для целей данного изобретения фильтрат(т.е. среда для культур клеток) считается стерильным, если его величина LVR составляет по меньшей мере 4,85, а предпочтительны фильтраты с величиной LRV от 6 до 7. В одном осуществлении изобретения в результате обработки среды для культур клеток может быть достигнут логарифмический показатель снижения, превышающий или равный 4,85. Согласно еще одному способу осуществления в результате обработки среды для культур клеток может быть достигнут логарифмический показатель снижения от 6 до 7. В способах согласно данному изобретению среда для культур клеток направляется на стадию фильтрации после воздействия УФ-С-излучения. Термин стерильная фильтрация или стерильный фильтр относится к удалению микроплазмы и других потенциальных загрязнений из сред для культур клеток при использовании стандартного биологического стерильного фильтра. Согласно одному из способов осуществления изобретения среду для культур клеток пропускают через стерильный фильтр с максимальным размером пор 200 нм перед введением среды для культур клеток в биореактор. Согласно еще одному способу осуществления изобретения среду для культур клеток пропускают через объемный фильтр. Термин объемный фильтр относится к фильтру, имеющему множество фильтрационных слоев, каждый из которых пропускает частицы определенного размера и плотности. Процесс фильтрации данного типа аналогичен процессу эксклюзионной хроматографии с разделением частиц по размеру. Легкий материал оказывается в верху фильтрующего слоя. К нижним слоям среда оказывается более мелкой и плотной. Более крупные частицы суспензии удаляются в верхних слоях, а более мелкие частицы удаляются в нижних слоях. Способность объемных фильтров удалять определенные типы вирусных частиц зависит от pH фильтруемого раствора. Например, при пропускании через объемный фильтр среды для культур клеток с низкой величиной pH происходит более эффективная элиминация безоболочечных вирусных частиц. Среда для культур клеток обычно имеет высокую электропроводность около 15-20 мСм/см и pH 7,4, что способствует захвату оболочечных вирусных частиц. Проведение фильтрации в условиях нейтральной величины рН, таким образом, приводит к более высоким LRV для оболочечных вирусов с величинами pi 6,0-7,8. В одном из способов осуществления осуществлении изобретения среду для культур клеток пропускают через объемный фильтр при кислотных величинах рН. Согласно еще одному способу осуществления изобретения, среду для культур клеток пропускают через объемный фильтр при pH 5,0. Согласно другим способам осуществления изобретения, среду для культур клеток пропускают через объемный фильтр при pH 4,0-5,0, или при pH 5,0-6,0, или при pH 6,0-7,0. Способы настоящего изобретения пригодны для инактивации вирусных частиц, которые могут содержаться в среде для культур клеток, перед введением указанных сред в биореактор. Другие способы настоящего изобретения также могут служить для удаления вирусных частиц (в том числе вирусных частиц, которые не были инактивированы воздействием УФ-С-излучения). В одном из способов настоящего изобретения на среду для культур клеток воздействуют УФ-С-излучением с длиной волны, энергией или при скорости потока, достаточными для повреждения нуклеиновых кислот любых безоболочечных вирусов в среде для культур клеток. Согласно еще одному способу настоящего изобретения среду для культур клеток пропускают через объемный фильтр с размером пор, либо при скорости потока, достаточными для удаления любых оболочечных вирусов из среды для культур клеток. В способах осуществления настоящего изобретения среду для культур клеток обрабатывают перед введением указанной среды в биореактор. Термин биореактор относится к аппаратуре или системе,предназначенной для крупномасштабного выращивания линий клеток или тканей для получения биофармацевтических препаратов. Например, в типовом биореакторе осуществляется генерирование 20020000 л клеточного супернатанта (содержащего целевой побочный продукт биопроцесса - биофармацевтический белок). Согласно одному из способов осуществления данного изобретения биореактор может обеспечить рост клеток для крупномасштабного производства, например, антител. Данное изобретение предлагает способ инактивации и/или удаления вирусных частиц из сред для культур клеток перед введением указанных сред в биореактор. Одним из достоинств данного изобретения является то, что обработка среды для культур клеток перед ее введением в биореактор позволяет снизить риск загрязнения в момент инокуляции, что создает более благоприятные условия для максимального роста клеток и максимального образования белка (например, титра антител). Помимо этого настоящее изобретение позволяет снизить риск потерь в производственных затратах (например, связанных с остановкой биофармацевтического процесса на техническое обслуживание в связи с вирусным загрязнением). Обработанная среда для культур клеток может служить для обеспечения роста ряда различных типов клеток. Согласно одному из способов осуществления изобретения обработанная среда для культур клеток применяется для обеспечения роста клеток млекопитающих. Согласно еще одному способу осуществления изобретения, клетки млекопитающих способны продуцировать антитела. Еще один способ-3 017322 осуществления изобретения предполагает применение обработанных сред для культур клеток для обеспечения роста клеток насекомых. Приведенные ниже примеры иллюстрируют конкретные способы осуществления изобретения и их различное применение. Примеры служат только для пояснения и не должны считаться ограничивающими область применения изобретения. Пример 1. Характеристики сред для культур клеток. Способы осуществления настоящего изобретения могут служить для обработки сред для культур клеток, предназначенных для применения в биореакторе. Анализировали три типа сред для культур клеток, определяя осмотическое давление, электропроводность при 25C и оптическую плотность на длине волны 254 нм (см. табл. I). Таблица I Пример 2. Инактивация вирусов действием УФ-С-излучения. Проводили исследования для определения инактивации нескольких вирусов под действием УФ-Сизлучения. В табл. II приведены модельные вирусы, выбранные для исследования: ксенотропный вирус мышиной лейкемии (x-MuLV), мышиный минут-вирус (MMV), свиной парвовирус (PRV) и реовирус 3 Инактивацию вирусов MMV(i) и MMV(p) в продуцирующей среде проводили при различных скоростях потока. Достигалась инактивация с величиной LRV более 4,85 в случае MMV(p) (см. табл. III) и Данные анализы повторяли для инактивации MuLV как из продуцирующей, так и из питательной среды. Результаты анализов (т.е., величины LRV менее 1) показывают, что дополнительная стадия инактивации или удаления может повысить эффективность способов в соответствии с настоящим изобретением (см. табл. V и VI). Пример 3. Удаление вирусов путем объемной фильтрации. Проведены исследования по удалению оболочечных вирусных частиц, а также прочего нежелательного клеточного материала из сред для культур клеток с помощью объемного фильтра. В табл. VII приведены данные по инактивации для трех оболочечных вирусов, а также для безоболочечного вируса. На основании полученных величин LRV можно заключить, что объемный фильтр обеспечивает эффективное удаление оболочечных вирусных частиц из сред для культур клеток. Таблица VII Проведены испытания двух типов объемных фильтров в отношении эффективности удаления вирусных частиц (см. фиг. 2 и 3). ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Способ обработки сред для культур клеток, предназначенных для применения в биореакторе,включающий следующие последовательно осуществляемые стадии:(a) воздействие на среду для культур клеток ультрафиолетовым излучением диапазона С (УФ-С) при плотности энергии 120-320 Дж/м 2;(b) пропускание среды для культур клеток через стерилизующий фильтр, содержащий поры макси-6 017322 мального размера 200 нм. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что среду перед пропусканием через стерилизующий фильтр пропускают через объемный фильтр. 3. Способ по п.1 или 2, отличающийся тем, что УФ-С-излучение имеет длину волны 254 нм. 4. Способ по п.1 или 2, отличающийся тем, что на среду для культур клеток воздействуют УФ-Сизлучением при скорости потока 1-12 л/ч. 5. Способ по п.4, отличающийся тем, что на среду для культур клеток воздействуют УФ-Сизлучением при скорости потока 6 л/ч. 6. Способ по п.1 или 2, отличающийся тем, что логарифмический показатель снижения вирусного материала в среде превышает или равен 4,85. 7. Способ по п.6, отличающийся тем, что логарифмический показатель снижения вирусного материала в среде составляет 6-7. 8. Способ по п.1 или 2, отличающийся тем, что на среду для культур клеток воздействуют УФ-Сизлучением при плотности энергии 238 Дж/м 2. 9. Способ по п.1 или 2, отличающийся тем, что обработанная среда для культур клеток служит для обеспечения роста клеток млекопитающих или насекомых. 10. Способ по п.9, отличающийся тем, что клетки млекопитающих способны продуцировать антитела. 11. Способ по п.2, отличающийся тем, что среду для культур клеток пропускают через объемный фильтр при кислом рН. 12. Способ по п.11, отличающийся тем, что среду для культур клеток пропускают через объемный фильтр при pH 5,0. 13. Способ по п.2, отличающийся тем, что стадия пропускания среды для культур клеток через объемный фильтр обеспечивает удаление любого оболочечного вируса из среды для культур клеток.