Антигельминтная композиция

012284 Область изобретения Это изобретение касается композиции, демонстрирующей эффективность против инфекций Fasciolahepatica, Ostertagia ostertagi и Cooperia oncophora у восприимчивых жвачных животных, в особенности, у крупного рогатого скота. Предпосылки изобретения Инфекции Fasciola hepatica, Ostertagia ostertagi и Cooperia oncophora у крупного рогатого скота являются проблематичными и, в частности, во время первого сезонного выпаса крупный рогатый скот может быть восприимчив к зараженному подножному корму. В промышленности известно использование растворов для инъекций, содержащих ивермектин и клорсулон, при лечении коров и нелактирующего крупного рогатого скота. Клорсулон представляет собой соединение, принадлежащее к семейству бензолсульфонамидов(бензолсульфонамид - США), которое рекомендовано для борьбы с развитыми печеночными двуустками(Fasciola hepatica и Fasciola gigantica) у крупного рогатого скота в виде суспензий для перорального применения или инъекционных составов для подкожного введения. Концентрация, рекомендуемая для перорального приема, составляет 7 мг/кг массы тела (м.т.) для подкожного введения - 2 г/кг м.т. В настоящее время неизвестны составы для местного применения, вероятно, из-за предвидимых трудностей в достижении достаточной чрезкожной проницаемости клорсулона. Задачей изобретения является получение состава для местного применения, который является эффективным против вышеупомянутых инфекций, предпочтительно в виде состава для орошения. Следующей задачей изобретения является получение композиции, содержащей по меньшей мере один эффективный агент, производный Streptomyces avermitilis, а именно макроциклический лактон или его химически модифицированное или синтетическое производное вместе с другим антигельминтом сульфонамидного типа. Другой задачей изобретения является получение композиции, пригодной для лечения инфекции, вызванной незрелыми Fasciola hepatica. Подразумевая эти задачи, проводили исследование по определению выполнимости производства состава для местного применения, содержащего известные агенты, уже признанные в данной области в виде других форм доставки, например инъекций, предполагающих эффективность против инфекций Fasciola hepatica (развитой), Ostertagia ostertagi (развитой) и Cooperia oncophora (развитой) у крупного рогатого скота. Новый состав, рассматриваемый для целей данного исследования, включает по меньшей мере одно антигельминтное соединение дисульфонамидного типа, например клорсулон, член семейства бензолсульфонамидов (CAS. No. 60200-06-84; амино-6-(трихлорэтенил)-1,3-бензолдисульфонамид) и авермектин, пригодный для лечения незрелой Fasciola hepatica, например ивермектин, смесь полусинтетических макроциклических лактонов (CAS. No. 70288-86-7; 22,23-дигидро-С 076 В смесь 80% компонента ивермектина В 1 а (5-O-деметил-22,23-дигидроавермектина A1a) и 20% компонента ивермектина B1b (5-Oдеметил-35-де(1-метилпропил)-22,23-дигидро-35-(1-метилэтил)авермектина A1a. Это исследование проводили по утвержденному протоколу в соответствии с признанной производственной практикой и с использованием традиционных средств по исследованию животных NorbrookLaboratories Limited, Research Division на здоровых телятах-самцах Европейской породы коров. Во время исследования каждое животное инфицировали посредством 500 метацеркарий Fasciolahepatica, 10000 личинок Ostertagia ostertagi и 10000 личинок Cooperia oncophora. Через 79 дней после введения Fasciola hepatica и через 32 дня после введения Ostertagia ostertagi и Cooperia oncophora животных обрабатывали составом для орошения, недавно разработанным в Norbrook Laboratories Limited, содержащим ивермектин и клорсулон. Примерно через 3 недели после лечения всех животных забивали и удаляли печень, сычуг и тонкую кишку. Эти органы обрабатывали, чтобы получить возможность установить численность гельминтов, содержащихся в каждом. Все используемые в исследовании телята были здоровы при отборе и в течение периода исследования. Исследуемый продукт для орошения хорошо переносился крупным рогатым скотом, и в курсе исследования отсутствовали неблагоприятные реакции на лечение. Определение нагрузки Fasciola hepatica, Ostertagia ostertagi и Cooperia oncophora после забоя и сравнение с данными для непролеченной контрольной группы подтверждают эффективность 90% для каждого паразита и, таким образом, можно сделать вывод, что исследуемый продукт для орошения является эффективным при лечении инфекций: развитой Fasciola hepatica, развитой Ostertagia ostertagi и развитойCooperia oncophora у крупного рогатого скота. Эффективность исследуемого продукта для орошения, содержащего в этом случае ивермектин и клорсулон, против индуцированных инфекций: развитой Fasciola hepatica, развитой Ostertagia ostertagi и развитой Cooperia oncophora крупного рогатого скота после наружного применения при номинальной интенсивности дозы 500 мкг ивермектина и 5 мг клорсулона на кг массы тела является признанной. Сущность изобретения Таким образом, настоящее изобретение касается недоступного до сих пор состава для местного применения, содержащего активные ингредиенты, по меньшей мере один эффективный агент, производный Streptomyces avermitilis, т.е. макроциклический лактон, например авермектин или его химически-1 012284 модифицированное или синтетическое производное, например ивермектин, вместе с другим антигельминтом сульфонамидного типа, например клорсулоном, в носителе, который содействует местному применению и трансдермальной доставке активных ингредиентов. Носитель, который пригоден для этой цели, содержит спиртовые растворители, такие как этанол и изопропанол, с необязательными наполнителями и вспомогательными добавками, которые могут содержать полимеры, такие как PVP или полоксамер. В предпочтительной форме получают состав для орошения, содержащий клорсулон и ивермектин. Вариант такого состава по данному изобретению содержит Номинальная доза составляет 500 мкг ивермектина и 5 мг клорсулона на кг массы тела. При использовании такого состава возможен способ противодействия инфекции незрелой Fasciolahepatica. Экспериментальная методика Это исследование включало одну группу из четырех телят самцов, возраста примерно от 3 до 4 месяцев во время введения Fasciola hepatica. Используя независимые средства, производили подсчет яиц в фекалиях для определения отсутствия гельминтов у животных до инфицирования метацеркариями Fasciola hepatica. Животные акклиматизировались в течение 19 дней до введения печеночной двуустки. Перед лечением (за 79 дней до лечения) всех телят сначала инфицировали посредством 500 метацеркарий Fasciola hepatica, вводимых перорально и затем (за 32 дня до лечения) каждого теленка инфицировали 10000 личинок Ostertagia ostertagi и 10000 личинок Cooperia oncophora, вводимых перорально. Телят взвешивали за 3 дня до применения рассматриваемого продукта для орошения для рассчета дозы,подлежащей введению каждому животному. Телят забивали на 18-й день после лечения, удаляли печень,сычуг и тонкую кишку каждого животного и обрабатывали для получения возможности установления количества гельминтов. Продукт для орошения по изобретению номинально содержал 0,5% мас./об. ивермектина и 5,0% мас./об. клорсулона и имел оцененное количество 0,498% мас./об. ивермектина и 4,94% мас./об. клорсулона. Это обеспечивает номинальную интенсивность дозы 500 мкг ивермектина и 5 мг клорсулона на кг массы тела. Каждому животному вводили продукт для орошения способом местного применения вдоль срединной линии спины на узкой полоске между загривком и корнем хвоста на область, которая составляет 24 дюйма в длину. Это соответствует способу введения, предложенному для продукта, используемого посредством орошения. Все дозы вводили каждому животному один раз, используя шприцы на 20 мл, которые имеют точность 0,5 мл. Дозы, вводимые каждому животному, подробно указаны в табл. 1. Определение печеночной двуустки: подсчитывали печеночную двуустку, выливая содержимое маркированного контейнера в стеклянную чашку с плоским дном. Темная поверхность под чашкой помогала идентифицировать мелкие или незрелые трематоды. Регистрировали общее количество. Подсчет выполнялся независимым внешним поставщиком услуг и в отношении группы проводился вслепую. Подсчет нематод: содержимое каждого маркированного сосуда исследовали отдельно. Небольшие количества выливали в линованные чашки Петри с параллельными линиями, нанесенными на расстоянии 1 см друг от друга на оборотной стороне чашек, и подсчитывали червей, используя препаровальный стереомикроскоп. Так как в процессе обработки образцов для окрашивания нематод добавляют йод, то для обесцвечивания фона, если необходимо, используют раствор тиосульфата натрия. Итоговую сумму для каждого сосуда регистрировали отдельно и умножали на 100 (коэффициент первоначального разведения). Серии из 2 сумм усредняли, получая конечную сумму. Нематоды идентифицировали, выбирая самцов червей в чашку для зародышей, содержащую лактофенол, перенося на стекла микроскопа с добавлением капли лактофенола и помещая поверх покровные стекла. Идентифицировали червей, используя стандартные руководства по паразитологии. Подсчет проводили независимыми средствами и вслепую в отношении группы. Анализ После забоя производили подсчет Fasciola hepatica, Ostertagia ostertagi и Cooperta oncophora для каждого животного и суммировали, используя среднее значение, геометрическое среднее значение, минимальное количество, максимальное количество и размер образца. Так как это исследование не включало контрольную группу, использовали результаты для контрольной группы из параллельного исследования,в котором применяли такие же уровни инфицирования с инфекциями на такой же стадии при забое (развитые Fasciola hepatica и развитые нематоды) для расчета эффективности, как подробно описано ниже Средние геометрические суммы для групп сравнивали при помощи двухвыборочного t-теста после логарифмического преобразования, нормируя данные. Если данные не соответствовали нормальному распределению, то для сравнения групп применяли непараметрический тест, называемый тестом МаннаУитни для несогласованных пар. При анализе данных не использовали ковариантов. Результаты. Подсчеты яиц в фекалиях. Обнаружено, что все образцы фекалий, взятые до лечения, не содержат яиц гельминтов. Три из образцов фекалий, взятые через 29 дней после инфицирования Ostertagia ostertagi и Cooperia oncophora, как обнаружено, содержат яйца стронгилидного типа (см. табл. 2). Подсчеты Fasciola hepatica после забоя. Краткие итоги подсчета Fasciola hepatica Общий средний установившийся процент трематод в не прошедшей лечение контрольной группе составляет 39,7%, это немного выше диапазона, ожидаемого (примерно 30-35% на основании аналогичных исследований этого типа) для количества вводимых метацеркарий (500 каждому животному) и возраста крупного рогатого скота. Достигаемый уровень инфицирования значительно выше минимального среднего значения 20 трематод на животное (что подробно описано в VICH GL 12 Efficacy of Anthelmintics: Specific Recommendations for Bovines), необходимого для того, чтобы считать инфицирование достаточным. Во время лечения инфекция Fasciola hepatica находится на стадии развития 8-12 недель (что подробно описано в VICH GL 12 Efficacy of Anthelmintics: Specific Recommendations for Bovines), что необходимо для классификации ее как развитой. Эффективность обработки составом, убивающим трематод, составляет 97,3% (см. в табл. 6 краткие результаты расчетов эффективности). Статистические различия между количествами трематод, извлеченных из пролеченных тестовых животных и непролеченных контрольных животных, являются высокозначимыми (р=0,0117) по непараметрическому тесту Манна-Уитни (критерию суммы рангов Уилкоксона) на логарифмически-преобразованных данных, когда не удовлетворяется допущение нормальности. См. в табл. 3 индивидуальные суммы Fasciola hepatica. Подсчеты Ostertagia ostertagi после забоя. Краткие результаты подсчетов Ostertagia ostertagi Средний установившийся процент Ostertagia ostertagi в не прошедшей лечение контрольной группе составляет 19,4% в рамках диапазона, ожидаемого (на основании опыта аналогичных исследований) для количества введенных личинок (10000 на каждое животное) и возраста крупного рогатого скота. Уровень достигаемого инфицирования существенно выше минимального среднего значения 100 нематод на животное (что подробно описано в VICH GL 12 Efficacy of Anthelmintics: Specific Recommendations for Bovines), необходимого для того, чтобы считать инфицирование достаточным. Обработку исследуемых животных проводят на 32 день после введения личинок Ostertagia ostertagi всем животным. Следовательно, во время лечения инфекция Ostertagia ostertagi находится на стадии развития 28-32 дня (что подробно описано в VICH GL 12 Efficacy of Anthelmintics: Specific Recommendationsfor Bovines), что необходимо для классификации ее как развитой. Эффективность лечения составляет 100,0% (см. в табл. 6 краткие результаты расчетов эффективности). Статистические разницы между количествами нематод, извлеченных из пролеченных тестовых животных и непролеченных контрольных животных, являются высокозначимыми (р=0,0107) по непара-3 012284 метрическому тесту Манна-Уитни (критерию суммы рангов Уилкоксона) на логарифмическипреобразованных данных, когда не удовлетворяется допущение нормальности. См. в табл. 4 индивидуальные суммы Ostertagia ostertagi. Подсчеты Cooperia oncophora после забоя. Краткие результаты подсчетов Cooperia oncophora Установившийся процент в не прошедшей лечение контрольной группе составляет 56,6% в рамках диапазона, ожидаемого (на основании практики аналогичных исследований) для количества введенных личинок (10000 каждому животному) и возраста крупного рогатого скота. Достигаемый уровень инфицирования существенно выше минимального среднего значения 100 нематод на животное (что подробно описано в VICH GL 12 Efficacy of Anthelmintics: Specific Recommendations for Bovines), необходимого для того, чтобы считать инфицирование достаточным. Во время лечения инфекция Cooperia oncophora находится на стадии развития 28-32 дня (что подробно описано в VICH GL 12 Efficacy of Anthelmintics: Specific Recommendations for Bovines), что необходимо для классификации ее как развитой. Эффективность лечения составляет 99,8% (см. в табл. 6 краткие результаты расчетов эффективности). Статистические различия между количествами нематод, полученных от пролеченных исследуемых животных и не пролеченных контрольных животных, являются высокозначимыми (р=0,0244) по параметрическому t-тесту на логарифмически-преобразованных данных, когда удовлетворяется допущение нормальности. См. в табл. 5 индивидуальные суммы Cooperia oncophora. Результаты демонстрируют, что применение продукта для орошения по данному изобретению дает эффективность 97,3% относительно Fasciola hepatica возраста 11 недель после инфицирования и, следовательно, удовлетворяют требованию 90% эффективности VICH GL 12 (Efficacy of Anthelmintics: Specific Recommendations for Bovines). Анализ данных показывает, что эффект лечения дает статистически высокозначимые различия в трематодной нагрузке. Исследование также показывает, что рассматриваемая смесь ивермектин/клорсулон для орошения по изобретению имеет эффективность 100,0% против развитой инфекции Ostertagia ostertagi и 99,8% против развитой инфекции Cooperia ancophora, также удовлетворяя требованию 90% эффективностиVICH GL 12. Анализ данных показывает, что эффект лечения дает статистически высокозначимые различия в нематодной нагрузке. Продукт для орошения хорошо переносится крупным рогатым скотом при применении, и ни на одной стадии после обработки не регистрируют местных или системных неблагоприятных реакций. Можно сделать вывод, что продукт для орошения ивермектин/клорсулон по данному изобретению,применяемый местно при значении дозы 500 мкг ивермектина и 5 мг клорсулона на кг массы тела, является клинически эффективным при лечении развитой инфекции Fasciola hepatica, развитой инфекцииOstertagia ostertagi и развитой инфекции Cooperia oncophora у крупного рогатого скота. Для каждого паразита эффективность составляет более 90% и имеется статистически существенная разница (Р 0,05) между подсчетами у животных, прошедших и не прошедших лечение. При использовании этого конкретного состава наблюдают уровни клорсулона в плазме крови от 1,20 до 2,4 мкг на мл у прошедших лечение животных при Tmax 5422,9. Таблица 1 Конкретные животные и дозировки 1 - Примерный возраст при отборе. 2 - Животных взвешивают за 3 дня до введения продукта для орошения.-4 012284 Таблица 2 Результаты подсчета яиц в фекалиях (за 3 дня до лечения) Таблица 6 Краткие результаты расчетов эффективности ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Антигельминтный состав для местного применения, содержащий в качестве активных ингредиентов терапевтически эффективное количество по меньшей мере одного антигельминтного агента, производного Streptomyces avermitilis, с терапевтически эффективным количеством по меньшей мере одного другого антигельминтного средства сульфонамидного типа, в носителе на основе спиртового растворителя, адаптированном для местного применения и трансдермальной доставки активных ингредиентов,при этом носитель содержит по меньшей мере 30% (об./об.) этанола с достаточным количеством изопропанола, которые вместе составляют 100%, с необязательными наполнителями и вспомогательными добавками. 2. Антигельминтный состав для местного применения по п.1, где состав предназначен для орошения. 3. Антигельминтный состав для местного применения по п.1, где состав содержит авермектин. 4. Антигельминтный состав для местного применения по п.1, где состав содержит ивермектин. 5. Антигельминтный состав для местного применения по любому из предыдущих пунктов, в котором антигельминтное средство сульфонамидного типа представляет собой клорсулон. 6. Антигельминтный состав для местного применения по п.1 или 2, содержащий клорсулон и ивермектин. 7. Антигельминтный состав для местного применения по любому из предыдущих пунктов, обладающий такой эффективностью, чтобы при нанесении на кожу животного, инфицированного F. hepatica,данный состав уничтожал по меньшей мере 90% развитых F. hepatica. 8. Антигельминтный состав для местного применения по п.5, в котором терапевтически эффективное количество клорсулона для крупного рогатого скота составляет по меньшей мере 5% (мас./об.). 9. Антигельминтный состав для местного применения по любому из предыдущих пунктов, в котором носитель содержит полимеры. 10. Антигельминтный состав для местного применения по п.1, который при использовании обеспечивает по меньшей мере 2 мкг бензолсульфонамида на 1 мл плазмы крови. 11. Антигельминтный состав для местного применения по п.6 для использования на крупном рога-7 012284 том скоте, в котором дозировку регулируют, обеспечивая примерно 500 мкг ивермектина и 5 мг/кг клорсулона. 12. Антигельминтный состав для местного применения для использования на крупном рогатом скоте, предназначенный для орошения и включающий