Бактериальные плазмиды

1 Изобретение относится к бактериальным плазмидам. Плазмиды представляют собой маленькие,внехромосомные, в большинстве круговые и самореплицирующиеся молекулы ДНК, которые присутствуют почти во всех бактериях и также в некоторых эукариотах и в митохондриях. Размер плазмид вирьирует примерно от 1,5 до 300 тысяч пар нуклеодов (т.п.н.). Бактериальные плазмиды являются, как правило, круговыми, ковалентно замкнутыми и закрученными в суперспираль. Часто они несут гены резистентности против антибиотиков или тяжелых металлов, гены для метаболизации нетипичных субстратов или гены ряда видоспецифических характеристик, например метаболические свойства или факторы вирулентности. Некоторые плазмиды могут быть перенесены из одной клетки в другую клетку. Поскольку в настоящее время патогенность бактерий обусловлена частично также свойствами плазмид, то возрастает интерес к объяснению свойств плазмидных ДНК. Из характеристик семейства Enterobacteriaceae, к которому относятся 14 главных видов и 6 других видов, известно, что они могут приобретать различные свойства. Типичными примерами являются Escherichia, Salmonella и Klebsiella.Escherichia coli (E. coli) представляет собой классический объект генетики бактерий. Только открытие и характеристика различных факторов вирулентности E. coli позволили найти в общем удовлетворительное объяснение тому, что штаммы этого вида обнаруживают отчасти крайне различную патогенность для человека и животных, которая варьируется от авирулентности до высокой вирулентности, как в случае с распространяющимися в последнее время вариантами, называемыми ЕНЕС. Таким образом,описан ряд факторов вирулентности как для экстраинтестинальных, так и для интестинальных штаммов E.coli, которые отчасти хорошо охарактеризованы. Для патогенных штаммов Е.coli серогруппы 06:K5 обнаружены такие факторы вирулентности, как, например, гемолизин и Р-фимбринадгезин, которые не встречаются у непатогенных представителей этой серогруппы. Гены вирулентности, как правило, обнаружены у энтеробактерий на больших плазмидах (около 60 тысяч пар нуклеоитдов). Существуют также энтеробактерии с небольшими, так называемыми криптическими плазмидами,функция которых до сих пор еще окончательно не определена. Если известно, что факторы вирулентностиE.coli присутствуют, по меньшей мере, также частично в генах плазмид, то появляется необходимость в дальнейших исследованиях для обнаружения и характеристики плазмид у энтеробактерий и, в частности, у Escherichia, например, для улучшения диагностических и терапевтических возможностей при заболеваних, вызы 003700 2 ваемых заражением энтеробактериями. Плазмиды и, соответственно, их бактериальные носители или соответствующие синтезированные ДНК можно применять в микробиологической аналитике или диагностике, в терапии или профилактике, и также для физиологии питания или пробиотических целей. Кроме того, плазмиды, в частности от Е. coli, являются известными векторами экспрессии в генной инженерии, поэтому по этой причине также существует интерес, касающийся исследования свойств подобных плазмид. Кроме этого, были проведены молекулярно-генетические исследования со штаммами Е.coli DSM 6601. Полученные из этого штамма последовательности ДНК подвергали анализу секвенирования ДНК с помощью программ банка данных и сравнивали с уже имеющимися последовательностями ДНК других бактерий. Штамм DSM 6601 имеет две маленькие плазмиды размером 3177 и соответственно 5552 пар нуклеотидов (bр), которые обозначеныpMUT1 и соответственно pMUT2. После рестрикционного расщепления ДНК меньшей плазмиды pMUT1 субклонировали с ферментом HindIII в качестве линейного фрагмента в вектор pUC18, присоединив затем последовательность ДНК. Это очевидно из приведенной иллюстрации 1. Полученную таким образом последовательность ДНК подвергали гомологичному сравнению с банком данных GenEMBL. Результаты этого противопоставления изображены на фиг. 2. Для сравнения место разреза HindIII обозначено как позиция 1. От позиции 200 - 800 пар нуклеотидов ДНК плазмиды pMUT1 имеет характерные гомологии различных мест начала редупликации (начала репликации) другой энтеробактериальной плазмиды, специально для плазмид NTP1, NTP16 и CIODF13. В регионе позиции 950 пар нуклеотидов начинается гомология к плазмиде NTP16 величиной 570 пар нуклеотидов, которую первоначально выделяли из Salmonella typhimurium. Эта гомология охватывает ген mobA, который необходим для мобилизируемости плазмиды NTP16, а также начала переноса (оriТ). Кроме того, от позиции 1790-1920 пар нуклеотидов обнаружены характерные гомологии к генам раrА и сеr, которые важны для стабильности и непрерывного воспроизведения и распределения плазмидных молекул при делении клеток. Для обычных областей ДНК никто не мог идентифицировать характерные гомологии. Кроме того, описана последовательность ДНК плазмиды pMUT1 в последовательности аминокислот и проведен анализ на наличие открытых "читаемых астеров". Исследовано 6 различных возможностей "читаемых астеров". Обнаружено всего 5 открытых "читаемых астеров" величиной 143, 62, 56, 49 и 48 аминокислот. 3 Графическое изображение анализа представлено на фиг. 3. ДНК большей плазмиды pMUT2 после линеаризации с рестрикционным энзимом SphI также субклонировали в вектор pUC18, и затем полностью секвенировали. Последовательность ДНК представлена на фиг. 4. Полученную таким образом последовательность ДНК исследовали с помощью программы банка данных GenEMBL на гомологию к уже известным последовательностям ДНК. Результат графически изображен на фиг. 5. У ДНК плазмиды pMUT2 обнаружена характерная гомология к области репликации различных СоlЕ 1-плазмид от Е.coli в позиции от 890 до 1660 пар нуклеотидов. Другая характерная гомология к СоlЕ 1-плазмиде находится в регионе позиции от 3800 до 4950 пар нуклеотидов. Здесь речь идет о гомологии к области мобилизации СоlЕ 1-плазмиды. В регионе позиции от 3770 до 4980 пар нуклеотидов обнаружены гомологии к плазмиде штамма А 1 Pasteurellahaemolytica. На этой плазмиде расположены гены, которые у Pasteurella кодируют белки антимикробной резистентности. Тем не менее,гомология распространяется на интергенную область таким образом, что возможно речь идет о последовательностях, которые необходимы для мобилизируемости плазмиды. Идентифицированы два региона, имеющие характерные гомологии с другими энтеробактериальными плазмидами. При этом речь идет о регионе начала репликации и mob-регионе, которые необходимы для мобилизируемости плазмиды. Для pMUT 2 не удалось идентифицировать характерную гомологию для обычного участка ДНК. Далее описана также последовательность ДНК плазмиды pMUT2 в последовательности аминокислот и проведен анализ на наличие открытых "читаемых астеров". Результат графически представлен на фиг. 3. Обнаружено 5 открытых "читаемых астеров" с последовательностью аминокислот размером порядка 327, 318,264, 76 и 63 аминокислот. Наряду с неизвестными до сих пор плазмидами pMUT1 и pMUT2, также до сих пор не найдена комбинация в штаммах Е.coli или других энтеробактериях. Возможно, наличие плазмид связано с метаболическими и медицинскими свойствами и/или свойствами физиологии питания и, соответственно,пробиотическими свойствами штамма DSM 6601. Исследование плазмид позволяет более точно определять и анализировать энтеробактерии и, в частности, группу Escherichia. Кроме того, эти плазмиды предоставляют несомненные векторы экспрессии для генной инженерии. В дальнейшем изобретение поясняется подробно с помощью примеров: Пример 1. Изоляция плазмиды. 4 Изоляцию плазмиды ДНК осуществляют по методу Birnboim et al. (Birnboim, A.C. andDoly, J. (1979) Nucl. Acids Res. 7:1513-1523 Методика быстрой экстракции щелочи для скрининга рекомбинантных плазмид ДНК). В колонию бактерий засевают 3 мл средыLB и взбалтывают в течение ночи при 37 С. Эту культуру центрифугируют в специальной емкости, остаток среды удаляют с помощью пипетки. Осадок клеток ресуспендируют со 100 мкл раствора I (50 мМ глюкозы; 10 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты, рН 8; 25 мМ TrisHCl, рН 8). Через 5 мин инкубации при комнатной температуре добавляют 200 мкл раствора II(0,2 Н NaOH; 1% додецилсульфат натрия), перемешивают до просветления и помещают специальную емкость на следующие 5 мин на лед. Далее добавляют 150 мкл раствора III (3 М ацетата натрия, рН 4,8), непродолжительное время взбалтывают до выпадения хромосомальной ДНК в виде хлопьев и помещают осадок еще раз на 5 мин на лед. Выпавшую хромосомальную ДНК и остатки клеток разделяют 5 мин в центрифуге и избыток плазмидной ДНК отводят в новый сосуд. Для очистки плазмидной ДНК добавляют 50 мкл фенола и 150 мкл хлороформа/изоаминоспирта (24:1) и после недолгого взбалтывания центрифугируют в течение 2 мин. Водную фазу добавляют в новый сосуд с помощью пипетки. Плазмидная ДНК выпадает в осадок после добавления 2 объемов ледяного этанола и центрифугирования в течение 10 мин. Осадок промывают 70%-ным этанолом и высушивают в скоростном вакууме. Плазмидную ДНК ресуспендируют в 20 мкл Н 2Oбидистиллят и хранят при -20 С. Пример 2. Секвенирование ДНК. Секвенирование ДНК осуществляют по методу F.Sanger et al. (Sanger, P., Nicklen, S. andCoulson. A.R. (1977) Proc. Nati. Acad. Sci. США 74: 5463-5467 Секвенирование ДНК с помощью ингибиторов терминации цепи). Секвенирование ДНК осуществляют с помощью набора для секвенирования Т 7 фирмыPhamacia LKB. Для стадии денатурации смешивают 8 мклNaOH, непродолжительное время центрифугируют и инкубируют в течение 10 мин при комнатной температуре. ДНК выпадает в осадок после добавления 3 мкл 3 М ацетата натрия, рН 4,8, а также 7 мкл Н 2Oбидистиллят и 60 мкл ледяного чистого этанола в течение 15 мин при 70 С. Выпавшую ДНК центрифугируют в течение 10 мин, промывают 70 % этанолом и высушивают. Для реакции отжига денатурированную ДНК суспендируют в 10 мкл Н 2 Обидистиллят и смешивают с 2 мкл буфера для отжига и 2 мкл праймера (40 нг). Осадок инкубируют в течение 20 мин при 37 С таким образом, что может происходить связывание праймера на матрице ДНК. Осадок реакции охлаждают в течение 10 5 мин при комнатной температуре и затем либо используют сразу для реакции маркировки, либо замораживают при -20 С. Для реакции маркировки в осадок реакции отжига с помощью пипетки добавляют 3 мкл смеси маркировки, 1 мкл [-Р 32] дАТФ и 2 мкл T7-полимеразы (Т 7 полимеразу разбавляют в соотношении 1:5 буфером с энзимом разбавления) и после недолгого перемешивания инкубируют в течение 5 мин при комнатной температуре. Тем временем для реакции терминации подогревают уже приготовленные смеси для секвенирования (по 1 сосуду с 2,5 мкл 'G'-, 'А'-, 'Т'- и 'С'-смесями, "коротко") при 37 С. По истечении реакции маркировки добавляют соответственно 4 мкл от этой смеси к четырем смесям секвенирования и смешивают непродолжительное время с помощью пипетки. Реакцию терминации инкубируют в течение 5 мин при 37 С. По окончании реакции терминации добавляют по 5 мкл останавливающего-раствора. Теперь осадки отводят в инкубатор с температурой 95 С, денатурируют в течение 2 мин и затем помещают на лед. На гель секвенирования наносят по 2,5 мкл реакции[25,2 г мочевины, 22 мл Н 2 Обидистиллят, 6 мл 10 х ТВЕ, 10 мл полиакриламида (40 %), 2 мл персульфата аммония (16 мг/мл), 60 мкл TEMED] в последовательности 'G', 'А', 'Т', 'С'. Электрофорез осуществляют при 40 Вт и 1500 В в течение 4,5 ч. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Плазмида, имеющая нуклеотидную последовательность, представленную на фиг. 1. 2. Последовательности ДНК с или из представленных на фиг.1 последовательностей нуклеотидов. 3. Применение плазмиды по пп.1-2 в микробиологической аналитике и/или диагностике. 4. Применение последовательностей ДНК по пп.1-2 в микробиологической аналитике и/или диагностике. 5. Применение плазмиды по пп.1-2 для медицинских целей и/или целей физиологии питания и соответственно пробиотических целей. 6. Применение последовательностей ДНК по пп.1-2 для медицинских целей и/или целей физиологии питания и соответственно пробиотических целей. 7. Применение плазмиды по пп.1-2 в качестве вектора экспрессии. 8. Применение последовательностей ДНК по пп.1-2 в качестве векторов экспрессии. Фиг. 1. Изображение последовательности нуклеотидов плазмиды pMUT1 штамма DSM 6601 величиной примерно 3 тысячи пар нуклеотидов. Фиг. 2. Рестрикционная карта плазмиды pMUT1. Черные полосы символизируют обнаруженные гомологии последовательности ДНК к последовательностям ДНК плазмид других энтеробактерий. Показаны позиции релевантных мест рестрикции. Фиг. 3. Изображение обнаруженных для обеих плазмид Фиг. 4. Изображение последовательности нуклеотидов плазмиды pMUT2 штамма DSM 6601 величиной примерно 5 тысяч пар нуклеотидов Фиг. 5: Рестрикционная карта плазмиды pMUT2. Черные полосы символизируют обнаруженные гомологии последовательности ДНК к последовательностям ДНК плазмид других энтеробактерий. Позиции релевантных мест рестрикции представлены.