Способ установления безопасной для человека и животных дозы химических средств защиты растений

Скачать PDF файл.

Формула / Реферат

Способ установления безопасной для человека и животных дозы химических средств защиты растений на основе воспроизведения in vitro ферментативного фосфолиполиза в виде ламеллярной фазы в присутствии тестируемого препарата как моделирования степени разрушения биологических мембран клеток, в частности пищеварительного тракта, отличающийся тем, что выявляют изменение активности панкреатической ФЛА2 путем установления содержания метаболитов фосфолиполиза с помощью тонкослойной хроматографии, включающим получение липосом из фосфатидилхолина в трис-HCl буферном растворе с конечной концентрацией субстрата 1,3 мМ, обработкой полученной эмульсии ультразвуком, преинкубацией фермента с исследуемым соединением, растворенным в диметилсульфоксиде, проведением реакции гидролиза липосом из фосфатидилхолина добавлением в среду инкубации раствора ФЛА2 и остановкой реакции добавлением ЭДТА до конечной концентрации 15 мМ, экстракцией продуктов смесью хлороформ/метанол в соотношении 2:1 (по объему), выпариванием растворителя и последующим разделением продуктов реакции с помощью ТСХ на силикагеле в системе растворителей хлороформ/метанол/вода 65:25:4 и определением содержания фосфора в фосфолипидах и их лизопроизводных, характеристикой активности ФЛА2 по степени гидролиза субстрата как отношения количества образованного лизофосфолипида к сумме негидролизованного субстрата и продукта (%) и последующим расчетом превышения установленного в контроле уровня активности определяемого фермента вычислением относительной степени (скорости) гидролиза в каждом случае отдельно и анализа хода ее изменения во времени по сравнению с контролем определяют пестицид как безопасный при условии изменения относительной степени (скорости) гидролиза под действием ФЛА2 в его присутствии в пределах не выше 20% от контроля.

Текст

Смотреть все

СПОСОБ УСТАНОВЛЕНИЯ БЕЗОПАСНОЙ ДЛЯ ЧЕЛОВЕКА И ЖИВОТНЫХ ДОЗЫ ХИМИЧЕСКИХ СРЕДСТВ ЗАЩИТЫ РАСТЕНИЙ Изобретение относится к области клинической биохимии, биотехнологии и медицины. Описывается способ выявления допустимых для человека и животных доз пестицидов на основе изменения активности панкреатической фосфолипазы А 2 в присутствии пестицида (опыт) и без него (контроль) по отношению к фосфатидилхолину в виде искусственных липидных мембран (липосом) путем определения содержания продуктов гидролиза с помощью тонкослойной хроматографии. Для опытной и контрольной проб по содержанию фосфора в фосфолипидах и их лизопроизводных определяют степень гидролиза субстрата, которая характеризуют изменение активности фермента под влиянием пестицида. Определяют дозу пестицида как безопасную при условии изменения активности фермента в его присутствии в пределах не выше 20% от контроля. Заявленный способ на небольшом количестве доступного сырья (10-100 мкг пестицида) без использования лабораторных животных позволяет по величине относительной степени гидролиза липосом, как модели клеточной мембраны, провести измерение активности фосфолипазы А 2 в сравнении с контрольной величиной как индикатора разрушения клеточных стенок при пищеварении в присутствии тестируемого пестицида и без него.UA-U-26675 ПРОДАНЧУК Н.Г. и др. Принципы и пути оценки опасности комплексного и комбинированного действия пестицидов на организм человека. Современные проблемы токсикологии,2001, 2,стр. 1-8,[Найдено в Интернет 06.07.2010], Найдено в Интернет URL:http://www.medved.kiev.ua/"грасп" на активность панкреатической фосфолипазы A2, Известия Нац. академии наук Беларуси. Сер. хим. наук, 2007, 3, стр. 82-87, реферат, Найдено в Интернет:(71)(73) Заявитель и патентовладелец: ГОСУДАРСТВЕННОЕ НАУЧНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ "ИНСТИТУТ БИООРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ НАЦИОНАЛЬНОЙ АКАДЕМИИ НАУК БЕЛАРУСИ" (BY) 017381 Изобретение относится к области клинической биохимии, биотехнологии и медицины, в частности к способу установления безопасной для человека и животных дозы химических средств защиты растений на основе воспроизведения in vitro ферментативного фосфолиполиза в виде ламеллярной фазы, и может быть использовано для предварительного тестирования токсичности новых биологически активных соединений, обладающих гербицидной активностью. Использование химических средств защиты растений (гербицидов) в сельском хозяйстве становится обычной практикой. При этом главным показателем экологической безопасности пестицидов, в частности гербицидов, считается общая токсичность препарата, определяемая, как правило, на животных, на основании которой рассчитываются допустимые суточные дозы (ДСД) [1, 2]. Моделируют острое отравление путем однократного введения препарата в желудок экспериментальных животных при помощи иглы-зонда. В острых опытах каждую дозу испытывают на 6-12 животных с последующим наблюдением в течение 14 суток с учетом характера симптомов интоксикации, количества погибших животных, срока их гибели. Затем определяют общие биохимические показатели - содержание белка в моче, мочевины в крови и моче, гемоглобина, лейкоцитов в периферической крови, активности аланин- и аспартатаминотрансфераз в сыворотке крови, хлоридов в крови и моче, общего холестерина, щелочной фосфатазы,триглицеридов, креатинина, диеновых конъюгатов и кетодиенов и др. С целью гигиенической оценки условий труда при применении средств защиты растений выполняются натурные исследования на опытных участках, где работают с гербицидами. Исследования проводятся в соответствии с Методическими рекомендациями [3, 4]. Таким образом, существующие методы определения биобезопасности гербицидов при возможном попадании в организм в остаточных количествах с пищей или при работе с ними, трудоемки, требуют больших затрат экспериментальных животных (мышей, крыс, кроликов), времени, а также специальных многоступенчатых исследований и реактивов, что создает большие трудности при необходимости быстрого определения уровня токсичности применяемых в растениеводстве современных средств защиты растений. В то же время фосфолипазы А 2 (КФ 3.1.1.4, ФЛА 2), обладая способностью к избирательному и типичному воздействию на фосфолипиды, могут быть использованы для контролируемого разрушения биологической мембраны (фосфолиполиз) и стать индикатором для оценки неблагоприятного воздействия гербицидов на клеточные стенки, моделью которых будут служить липосомы - концентрические фосфолипидные бислои, что позволяет с высокой точностью охарактеризовать степень биобезопасности гербицидов, не используя лабораторных животных (прототип) [5]. Метод дал положительный результат,однако он оказался узкоприменимым, так как определение воздействия гербицидов по скорости гидролиза липосом указывало только на увеличение деградации модельных липидных мембран в начальный период времени и нивелирование его к моменту насыщения фермента субстратом, но не давало возможности различить особенности действия разных гербицидов и механизм взаимодействия с гербицидами на разных стадиях липолиза, знание которого необходимо для нахождения адекватных методов борьбы при возможном отравлении гербицидами. Задачей настоящего изобретения является разработка способа установления безопасной для человека и животных дозы химических средств защиты растений на основе воспроизведения in vitro ферментативного фосфолиполиза в виде ламеллярной фазы, как модели клеточной мембраны, в присутствии тестируемого препарата, позволяющего установить особенности действия гербицидов на организм человека для нахождения адекватных методов борьбы при возможном отравлении гербицидами. Поставленная задача решается способом установления безопасной для человека и животных дозы химических средств защиты растений на основе воспроизведения in vitro ферментативного фосфолиполиза в виде ламеллярной фазы в присутствии тестируемого гербицида как имитации (моделирования) степени разрушения биологических мембран клеток, в частности пищеварительного тракта, заключающимся в выявлении изменения активности панкреатической ФЛА 2 путем установления содержания метаболитов фосфолиполиза с помощью тонкослойной хроматографии, включающим получение липосом из фосфатидилхолина (ФХ) в трис-HCl буферном растворе с конечной концентрацией субстрата 1,3 мМ,обработкой полученной эмульсии ультразвуком, преинкубацией фермента с исследуемым соединением,растворенным в диметилсульфоксиде, проведением реакции гидролиза липосом из фосфатидилхолина добавлением в среду инкубации раствора ФЛА 2 и остановкой реакции добавлением ЭДТА до конечной концентрации 15 мМ, экстракцией продуктов смесью хлороформ/метанол в соотношении 2:1 (по объему), выпариванием растворителя и последующим разделением продуктов реакции с помощью ТСХ на силикагеле в системе растворителей хлороформ/метанол/вода 65:25:4 и определением содержания фосфора в фосфолипидах и их лизопроизводных, характеристикой активности ФЛА 2 по степени гидролиза субстрата как отношения количества образованного лизофосфолипида к сумме негидролизованного субстрата и продукта (%) и последующим расчетом превышения установленного в контроле уровня активности определяемого фермента вычислением относительной степени гидролиза в каждом случае отдельно и анализа хода ее изменения во времени по сравнению с контролем определяют пестицид как безопасный при условии изменения относительной степени (скорости) гидролиза под действием ФЛА 2 в его присутствии в пределах не выше 20% от контроля (фиг. 2). Заявляемый способ позволяет использовать-1 017381 10-100 мкг пестицида для определения его безопасности (фиг. 2). Таким образом, заявленный способ на небольшом количестве доступного сырья без использования лабораторных животных позволяет по величине относительной степени гидролиза липосом, как модели клеточной мембраны, провести измерение активности ФЛА 2 в сравнении с контрольной величиной как индикатора разрушения клеточных стенок при пищеварении в присутствии тестируемого пестицида и без него и обеспечивает достижение результата с большей эффективностью, чем в способе-прототипе,где характеристика активности ФЛА 2 определяется только по степени гидролиза субстрата как отношения количества образованного лизофосфолипида к сумме негидролизованного субстрата и продукта (%) без соотнесения с контрольной величиной, что не позволяет в достаточной степени оценить пределы относительной безопасности исследуемого вещества. На фиг. 1 представлена относительная степень гидролиза липосом из ФХ в присутствии и в отсутствие исследуемых соединений. На фиг. 2 представлена зависимость "доза-эффект" соединения I на относительный гидролиз липосом под действием ФЛА 2 и показаны пределы чувствительности заявляемого способа. Приведенные ниже примеры определения активности ФЛА 2 с использованием липосом подтверждают возможность осуществления изобретения, не ограничивая его объем. Пример 1. Определение влияния гербицида 5-(2,4,6-триметилфенил)-2-(1-этоксииминопропил)циклогексан 1,3-диона (тралкоксидим, соединение I) - действующего вещества пестицида "Грасп" на липолитические реакции в ламеллярной фазе (липосомы) с участием ФЛА 2. Для получения липосом из фосфатидилхолина хлороформ, в котором растворен фосфолипид, выпаривают на роторном испарителе. Остатки растворителя удаляют в течение 30 мин с помощью вакуумного насоса. К образовавшейся фосфолипидной пленке добавляют 0,05 М трис-HCl буферного раствора рН 7,4 до получения конечной концентрации субстрата 1,3 мМ. Полученную эмульсию обрабатывают ультразвуком 5 раз по 0,5 мин с перерывом в 1 мин с помощью УЗДН-2 Т (22 кГц, 20 мА). Эффекторы (соединения I-II, фиг. 1) растворяют в диметилсульфоксиде (100 мкг/мл). Фермент преинкубируют с эффекторами в течение 120 мин. Реакционная смесь содержит субстрат 1,3 мкмоль, 2 мМ CaCl2 и 0,05 М трисHCl, рН 7,4. Реакцию гидролиза липосом из фосфатидилхолина начинают добавлением в среду инкубации при 37 С раствора ФЛА 2 (4 мкг/мл) после преинкубации с соединениями I-II, останавливают добавлением ЭДТА до конечной концентрации 15 мМ. Продукты ферментативной реакции из реакционной среды экстрагируют двумя объемами смеси хлороформ/метанол 2:1 (по объему). Нижний слой отделяют,растворитель выпаривают и продукты реакции анализируют с помощью ТСХ на силикагеле в системе растворителей хлороформ/метанол/вода 65:25:4. Пластины проявляют реагентом на фосфолипиды [6],пятна фосфолипида и их лизопроизводных вырезают и анализируют в них содержание фосфора по методу, описанному в работе [6]. Активность ФЛА 2 характеризуют по степени гидролиза субстрата как отношения количества образованного лизофосфолипида к сумме негидролизованного субстрата и продукта(%). Скорость реакции выражают в количестве образованного продукта (мкмоль) в мин/мг белка. В работе используют коммерческий препарат ФЛА 2 поджелудочной железы свиньи (фирмы "Sigma"). Пример 2. В условиях примера 1 проводят исследование 2-пропаноил-5-(2,4,6-триметилфенил)циклогексан 1,3-диона - предшественника в химическом синтезе тралкоксидима (соединение II). В таблице представлена кинетическая характеристика гидролиза ФХ в ламеллярной фазе под действием ФЛА 2 в отсутствие (контроль) и в присутствии соединений I и II. Как следует из представленных данных, обнаружено инициирующее действие соединений I, II на начальном этапе реакции: от 2 до 5 мин активность фермента при гидролизе панкреатической ФЛА 2 липосом из ФХ в присутствии тралкоксидима и его предшественника в химическом синтезе увеличивается в 1,1-1,5 раза. Кинетическая характеристика гидролиза ФХ в ламеллярной фазе под действием ФЛА 2 в отсутствие (контроль) и в присутствии соединений I и II На фиг. 1 представлено изменение во времени относительной степени гидролиза (фактическая степень гидролиза в определенный момент времени к степени гидролиза в начале реакции - до 2 мин) ФЛА 2 субстрата в ламеллярной фазе в отсутствие (К) и в присутствии соединений I и II. На графике зависимости от времени относительной степени ферментативного гидролиза субстрата в реакции без эффекторов четко выражен лаг-период (до 5 мин), после которого кривая стремится вверх. В присутствии испытуемых соединений лаг-период отсутствует, что свидетельствует об улучшении связывания фермента с субстратом в начальный период времени. Однако в период реакции от 6 до 10 мин-2 017381 активность фермента в опыте по сравнению с контролем снижается. Тралкоксидим через 10 мин подавляет активность ФЛА 2 в 1,3 раза. Причем в присутствии соединения II насыщение фермента субстратом происходит раньше, чем в присутствии соединения I, поскольку относительная степень гидролиза субстрата в период с 5 до 10 мин снижается, а во втором случае продолжает увеличиваться. Отсутствие к этому времени выраженного насыщения фермента субстратом в присутствии соединения I предполагает различные механизмы взаимодействия эффекторов с ферментом на разных стадиях липолиза (начальном и в период насыщения фермента субстратом). На фиг. 2. показана зависимость "доза-эффект" для соединения I, которая показывает высокую чувствительность заявляемого способа - возможность определять исследуемый пестицид в количестве от 10 мкг с высокой точностью. Подавление активности фермента под действием соединения I от 20% и ниже, как следует из кривой на фиг. 2, наблюдается при количестве исследуемых веществ от 200 мкг, что соответствует превышению допустимой дозы (ДСД 0,002 мг/кг массы тела человека [7]) в 2 раза и выше. Следовательно, пестицид может считаться биобезопасным при условии изменения активности ФЛА 2 в среднем на 20%. Таким образом, на примере известных гербицидов установлено, что использование in vitro фосфолиполитической реакции в качестве простой модели процесса разрушения фосфолипидов липосом, как модели клеточной мембраны, позволяет достоверно оценивать безопасность пестицида для организма животных и человека. Разработанный экспресс-метод имеет явные преимущества, поскольку не требует длительных испытаний на лабораторных животных и создает благоприятные условия для определения среди широкого ассортимента средств защиты растений безопасных для человека пестицидов новых поколений. Источники информации, принятые во внимание. 1. Инструкция 1.1.11-12-35-2004. "Требования к постановке экспериментальных исследований для первичной токсикологической оценки и гигиенической регламентации веществ". 2. Елизарова О.Н. Определение пороговых доз промышленных ядов при пероральном введении. М.: Медицина, 1971. 3. Метод оценки риска воздействия гербицидов на работающих 201/73, утв. Зам. Министра здравоохранения РФ Онищенко Г.Г. 16.04.2001 г. 4. Методические указания по гигиенической оценке новых гербицидов, Киев, 1988. -4263-87. 5. Литвинко Н.М., Кучуро СВ., Рубинов Д.Б., Герловский Д.О. Биоиндикация экологической безопасности гербицидов новых поколений на основе фосфолиполитической реакции. 7-я Межд. науч. конф."Сахаровские чтения 2007 года: экологические проблемы XXI века", 17-18 мая 2007 года, г. Минск, Беларусь", с. 102-103. 6. VaskovskyV.E.//J. Chromat. 1975. Vol. 114, N 1, p. 129-141. 7. Белан С.Р., Грапов А.Ф., Мельникова Г.М. Новые пестициды: Справочник. М., 2001. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Способ установления безопасной для человека и животных дозы химических средств защиты растений на основе воспроизведения in vitro ферментативного фосфолиполиза в виде ламеллярной фазы в присутствии тестируемого препарата как моделирования степени разрушения биологических мембран клеток, в частности пищеварительного тракта, отличающийся тем, что выявляют изменение активности панкреатической ФЛА 2 путем установления содержания метаболитов фосфолиполиза с помощью тонкослойной хроматографии, включающим получение липосом из фосфатидилхолина в трис-HCl буферном растворе с конечной концентрацией субстрата 1,3 мМ, обработкой полученной эмульсии ультразвуком, преинкубацией фермента с исследуемым соединением, растворенным в диметилсульфоксиде, проведением реакции гидролиза липосом из фосфатидилхолина добавлением в среду инкубации раствора ФЛА 2 и остановкой реакции добавлением ЭДТА до конечной концентрации 15 мМ, экстракцией продуктов смесью хлороформ/метанол в соотношении 2:1 (по объему), выпариванием растворителя и последующим разделением продуктов реакции с помощью ТСХ на силикагеле в системе растворителей хлороформ/метанол/вода 65:25:4 и определением содержания фосфора в фосфолипидах и их лизопроизводных, характеристикой активности ФЛА 2 по степени гидролиза субстрата как отношения количества образованного лизофосфолипида к сумме негидролизованного субстрата и продукта (%) и последующим расчетом превышения установленного в контроле уровня активности определяемого фермента вычислением относительной степени (скорости) гидролиза в каждом случае отдельно и анализа хода ее изменения во времени по сравнению с контролем определяют пестицид как безопасный при условии изменения относительной степени (скорости) гидролиза под действием ФЛА 2 в его присутствии в пределах не выше 20% от контроля.

МПК / Метки

МПК: C12Q 1/44, G01N 30/90

Метки: способ, защиты, средств, дозы, установления, растений, химических, безопасной, человека, животных

Код ссылки

<a href="https://eas.patents.su/5-17381-sposob-ustanovleniya-bezopasnojj-dlya-cheloveka-i-zhivotnyh-dozy-himicheskih-sredstv-zashhity-rastenijj.html" rel="bookmark" title="База патентов Евразийского Союза">Способ установления безопасной для человека и животных дозы химических средств защиты растений</a>

Похожие патенты