Способ выявления цитогенетического и цитотоксического действия факторов окружающей среды в клетках щитовидной железы

СПОСОБ ВЫЯВЛЕНИЯ ЦИТОГЕНЕТИЧЕСКОГО И ЦИТОТОКСИЧЕСКОГО ДЕЙСТВИЯ ФАКТОРОВ ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЫ В КЛЕТКАХ ЩИТОВИДНОЙ ЖЕЛЕЗЫ Изобретение направлено на упрощение и удешевление способа получения клеток, повышение достоверности, информативности и в целом эффективности оценки действия различных факторов на клетки щитовидной железы экспериментальных животных и человека. Указанный технический результат достигается тем, что подготовку клеток к исследованию проводят фиксацией ткани органа в формалине путем щелочной диссоциации клеток с помощью 50% раствора гидроксида калия, приготавливают мазки клеток и окрашивают азур-эозином по Романовскому. С помощью светового микроскопа анализируют 1000 фолликулярных тироцитов, дополнительно определяют и оценивают клетки с ядерными протрузиями, клетки с межъядерными мостами и сумму упомянутых клеток в качестве показателей цитогенетического действия, а также определяют и оценивают клетки с атипичной формой ядра, двухъядерные клетки, трехъядерные клетки, клетки со сдвоенными ядрами, сумму клеток с тремя и более ядрами, митоз, конденсацию хроматина,кариопикноз, кариолизис, кариорексис, апоптический индекс и вакуолизацию цитоплазмы в качестве показателей цитотоксического действия.(56) ГАНСБУРГСКИЙ М.А., "Анализ клеток с микроядрами в оценке пролиферации эпителия щитовидной железы", Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук, М., 2005, с. 4, 8, 9,17-19 КРАВЦОВ В.Ю. и др.,"Кариопатологические изменения в клеточных популяциях ироцитов у жителей гомельской области, облученных в детском и подростковом возрасте в результате аварии на Чернобыльской АЭС", Медико-биологические и социальнопсихологические проблемы безопасности в чрезвычайных ситуациях. 2009,2, с. 63-68,особенно с. 64-66 БЕЛОВ Л.Н. и др.,"Получение изолированных клеток методом щелочной диссоциации фиксированных формалином тканей", Цитология, Ленинград, "Наука", 1975, т. 17,11, с. 1332-1337, особенно с. 1333, 1334RU-C1-2104524 КОГАН М.Е. и др., "Определение количества клеток в различных органах и тканях после щелочной диссоциации", Архив патологии. 1976, т. 38,1, с. 77-80(71)(73) Заявитель и патентовладелец: УЧРЕЖДЕНИЕ РАМН НАУЧНОИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ЭКОЛОГИИ ЧЕЛОВЕКА И ГИГИЕНЫ ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЫ ИМ. А.Н. СЫСИНА РАМН (RU) 016530 Настоящее изобретение относится к медицине и может быть использовано для диагностики мутагенного (цитогенетического) и цитотоксического действия различных экзогенных и эндогенных факторов на организм человека и животных, а также для углубленного морфологического анализа. Щитовидная железа активно участвует в функционировании всех органов и систем организма человека. Кроме того, она одна из первых реагирует на изменения как эндогенного, так и экзогенного характера. В связи с этим исследования по изучению влияния окружающей среды на данный орган столь важны. При различных патологических процессах или воздействии на организм человека ионизирующей радиации, химических соединений, вирусов у человека наблюдаются различные формы аномалий ядер клеток, которые анализируют в основном в периферических лимфоцитах крови и полихроматофильных эритроцитах красного костного мозга. Клетки щитовидной железы для цитогенетического и цитотоксического анализа используются крайне редко. В то же время многие канцерогены обладают тропностью к щитовидной железе. Оценка цитогенетических и цитотоксических показателей наряду с морфологическим исследованием значительно расширяет возможности оценки мутагенного и токсического действия исследуемых факторов. Кроме того, такой подход позволяет прогнозировать канцерогенное действие,так как цитогенетические нарушения являются прогностическим критерием новообразований. В большинстве исследований разных органов для оценки цитогенетических повреждений определяют только частоту клеток с микроядрами и в редких случаях другие показатели. Известен способ выявления цитогенетического и цитотоксического действия факторов окружающей среды в клетках щитовидной железы, включающий получение отдельно лежащих клеток щитовидной железы, нанесение на сухие предметные стекла, окрашивание и учет клеток с микроядрами (Гансбургский М.А. Анализ клеток с микроядрами в оценке пролиферации эпителия щитовидной железы//Автореферат дисс. канд. мед. наук. Ярославль, 2005). Недостатками известного способа являются использование коллагеназы для диссоциации клеток щитовидной железы, так как этот реактив является дорогостоящим, работа с ним требует определенных условий, а его ферментативная активность снижается при длительном хранении; использование данного метода при проведении больших экспериментов и скринингового обследования населения экономически невыгодно; возможность имитации микроядер некоторыми штаммами микробов при окраске по Фельгену (NairU. et al., 1991); окраска препаратов по методу Фельгена затрудняет проведение морфологической дифференцировки различных типов клеток щитовидной железы; оценка цитогенетического эффекта исследуемых факторов проводится только по одному показателю - учету клеток с микроядрами; оценка проводится без учета морфологии клеток щитовидной железы; учитывается только 1 показатель цитотоксического действия исследуемого вещества - плоидность клеток. Техническими задачами настоящего изобретения являются упрощение и удешевление способа получения клеток, повышение достоверности, информативности и в целом эффективности оценки действия различных факторов на клетки щитовидной железы экспериментальных животных и человека. Указанные технические результаты достигаются тем, что в способе выявления цитогенетического и цитотоксического действия факторов окружающей среды в клетках щитовидной железы, включающем получение отдельно лежащих клеток щитовидной железы, нанесение на сухие предметные стекла, окрашивание и учет клеток с микроядрами, препараты клеток щитовидной железы получают путем фиксации органа в 10% формалине, щелочной диссоциации с помощью 50% КОН, наносят методом мазка на сухое предметное стекло, высушивают на воздухе, окрашивают азур-эозином по Романовскому, промывают дистиллированной водой, высушивают на воздухе, с помощью светового микроскопа количественно путем анализа 1000 фолликулярных тироцитов (А-клеток) определяют 4 показателя цитогенетического действия (клетки с микроядрами, клетки с ядерными протрузиями, клетки с межъядерными мостами,сумму клеток с этими показателями) и 11 показателей цитотоксического действия (клетки с атипичной формой ядра, двухъядерные клетки, трехъядерные клетки, клетки со сдвоенными ядрами, сумму клеток с тремя и более ядрами, митоз, конденсацию хроматина, кариопикноз, кариолизис, кариорексис, апоптический индекс и вакуолизацию цитоплазмы). Основными отличиями предлагаемого способа являются следующие. 1. Для получения препаратов орган фиксируют в 10% формалине, а затем получают отдельные клетки с помощью щелочной диссоциации (50% КОН). 2. Клетки окрашивают азур-эозином по Романовскому. 3. Учитывает дополнительные цитогенетические показатели (клетки с протрузиями, клетки с межъядерными мостами, сумму цитогенетических показателей). 4. Учитывает 11 показателей цитотоксического действия (клетки с атипичной формой ядра, двухъядерные клетки, трехъядерные клетки, клетки со сдвоенными ядрами, сумму клеток с тремя и более ядра-1 016530 ми, митоз, конденсацию хроматина, карипикноз, кариолизис, кариорексис, апоптический индекс и вакуолизацию цитоплазмы). Предлагаемый способ позволяет преодолеть указанные выше недостатки прототипа: заменить диссоциацию клеток ферментом коллагеназой на диссоциацию с помощью недорогого,общедоступного КОН после рутинной фиксации органа в формалине; заменить многоэтапную окраску по Фельгену простым общедоступным методом окраски азурэозином по Романовскому. Предлагаемый способ подготовки материала к микроскопическому исследованию удобен, прост в исполнении, экономичен, не требует специального оборудования. Окраска азур-эозином по Романовскому позволяет: отличать учитываемые изменения ядра от микробов, цитоплазматических включений или детрита; дифференцировать три вида клеток щитовидной железы с учетом их индивидуальных особенностей: окраски ядра и цитоплазмы; учитывать вместо одного четыре цитогенетических показателя: микроядра, протрузии, межъядерные мосты и сумму этих показателей, что значительно повышает информативность предлагаемого способа; учитывать 11 дополнительных показателей цитотоксического действия. Микроядра отражают наличие хромосомных и геномных мутаций. Появление микроядер может быть связано либо с повреждением ДНК (образовано фрагментом хромосомы), либо с повреждением веретена деления (образовано одной или несколькими отставшими хромосомами, не вошедшими в основное ядро). Протрузии - это ДНК-содержащие образования, прочно связанные с ядром, имеющие различную форму. Отражают наличие аберрантных хромосом в интерфазном ядре или, по мнению некоторых авторов, расцениваются как промежуточный этап перед образованием микроядра. Межъядерные мосты появляются в результате нерасхождения хромосом в процессе митоза. Микроядра, протрузии и мосты являются маркерами мутагенного и канцерогенного эффектов. Наличие цитогенетического действия исследуемого фактора диагностируют, если он вызывает статистически значимое повышение частоты клеток щитовидной железы с микроядрами, протрузиями,межъядерными мостами и суммарно всех трех показателей (суммы цитогенетических нарушений) в группе воздействия по сравнению с контролем. Ядра атипичной формы (ядра с аномальной формой ядра, атипичные клетки) имеют отличия по форме и размерам от ядер клеток своей популяции. Данный признак широко используется при морфологических и цитологических исследованиях и является одним из прогностических признаков новообразований. Учет количества митозов и клеток с двумя, тремя ядрами, сдвоенными ядрами позволяет оценивать пролиферативные процессы в клеточной популяции. Изменение пролиферативной активности при действии экзогенных или эндогенных факторов характеризует их цитотоксическое действие. Двухъядерные клетки встречаются наиболее часто. Они образуются путем деления ядра без разделения цитоплазмы и содержат удвоенный набор генетического материала. Также образуются клетки с тремя и более ядрами, что характеризует патологический процесс митоза. Наряду с отдельными показателями пролиферации важно оценивать суммарный показатель клеток с двумя и более ядрами. Митозы хорошо визуализируются при проведении данного анализа и существенно дополняют общую картину состояния пролиферации. Данный способ позволяет также оценивать деструкцию клеток (апоптоз и некроз). Апоптоз - запрограммированная клеточная гибель. Этот процесс поддерживает клеточный гомеостаз, удаляя поврежденные и "старые" клетки. Апоптоз характеризуется уменьшением объема клетки, их сморщиванием, конденсацией хроматина, кариорексисом (образованием отдельных глыбок хроматина), кариопикнозом(сжатием и уплотнением ядра), кариолизисом (сначала частичным, а затем полным растворением хроматина). В предлагаемом нами способе можно учитывать все эти показатели, а также их сумму - апоптотический индекс. Другой вариант клеточной гибели - некроз. Некроз характеризуется разрывом цитоплазматической и внутриклеточных мембран, что приводит к разрушению органелл, высвобождению лизосомальных ферментов и выходу содержимого цитоплазмы в межклеточное пространство. Увеличение частоты клеток с вакуолизацией цитоплазмы характеризует некроз и также является показателем цитотоксического действия. Эффективность данного подхода апробирована при исследовании цитогенетического и цитотоксического действия акриламида. Акриламид - низкомолекулярное химическое соединение, которое широко используется в химической промышленности и может образовываться при приготовлении пищи. Материал для исследования получен и проанализирован указанным выше способом. Исследованные показатели подтверждены примерами 1 и 2, результаты которых представлены в табл. 1 и 2.-2 016530 Пример 1. В табл. 1 представлены результаты исследования цитогенетического и цитотоксического действия акриламида. Сравнивали две группы животных: контрольную и опытную, животным которой вводили акриламид в дозе 0,5 мг/кг. Цитогенетическое действие акриламида выявлено при сравнении с контролем по повышению частоты клеток протрузиями в 9 раз, суммы клеток с цитогенетическими нарушениями в 8 раз. Цитотоксическое действие акриламида выявлено по сравнению с контролем по повышению частоты клеток с ядрами атипичной формы в 4 раза, двухъядерных клеток - в 1,8 раза, клеток со сдвоенным ядром - в 2,4 раза, суммы клеток с двумя и более ядрами - в 2 раза, клеток в митозе - в 3,7 раза, клеток с конденсацией хроматина - в 27 раз, клеток с кариопикнозом - в 2,2 раза, апоптотического индекса - в 2,2 раза. Таблица 1 Цитогенетическое и цитотоксическое действие акриламида на клетки щитовидной железы лабораторных крыс Примечание:р 0,05;р 0,005;р 0,001 - значимые отличия от условно контрольной группы при сравнении данных по 2. Пример 2. Проведено сравнение цитогенетического и цитотоксического действия акриламида при его однократном и трехкратном введении лабораторным крысам в дозе 12,4 мг/кг (табл. 2). Показано более выраженное цитогенетическое действие акриламида при трехкратном введении по сравнению с однократным по частоте клеток с межъядерными мостами (повышение в 4,4 раза); цитотоксическое действия по частоте двухъядерных клеток (повышение в 4 раза), клеток со сдвоенными ядрами (повышение в 4,2 раза),сумме клеток с двумя и более ядрами (повышение в 4 раза), частоте клеток в митозе (снижение в 5 раз),клеток с кариопикнозом (повышение в 2,4 раза), апоптотического индекса (повышение в 2,4 раза). В то же время способ, изложенный в прототипе, направленный на учет клеток с микроядрами, не позволил бы в этих экспериментах выявить цитогенетическое действие акриламида или показать более выраженное трехкратное действие этого вещества, так как отличия по учитываемой в прототипе частоте клеток с микроядрами были статистически не достоверны.-3 016530 Таблица 2 Сравнение цитогенетического и цитотоксического действия акриламида в двух группах крыс при однократном и трехкратном введении Примечание:р 0,05;р 0,005;р 0,001 - значимые отличия от условно контрольной группы при сравнении данных по 2. Таким образом, предлагаемый способ выявления цитогенетического и цитотоксического действия факторов окружающей среды в клетках щитовидной железы является более информативным, простым в исполнении и экономически выгодным. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Способ выявления цитогенетического и цитотоксического действия факторов окружающей среды в клетках щитовидной железы, включающий изолирование клеток щитовидной железы, приготовление мазков клеток, их окрашивание, определение и оценку клеток с микроядрами, отличающийся тем, что изолированные клетки щитовидной железы получают из фиксированной в 10% растворе формалина ткани органа путем щелочной диссоциации с помощью 50% раствора гидроксида калия, окрашивание производят азур-эозином по Романовскому, после чего с помощью светового микроскопа количественно путем анализа 1000 фолликулярных тироцитов дополнительно определяют и оценивают клетки с ядерными протрузиями, клетки с межъядерными мостами и сумму упомянутых клеток в качестве показателей цитогенетического действия, а также определяют и оценивают клетки с атипичной формой ядра,двухъядерные клетки, трехъядерные клетки, клетки со сдвоенными ядрами, сумму клеток с тремя и более ядрами, митоз, конденсацию хроматина, кариопикноз, кариолизис, кариорексис, апоптический индекс и вакуолизацию цитоплазмы в качестве показателей цитотоксического действия.