Устройство для быстрого измерения ферментативной активности

1 Настоящее изобретение касается устройства для быстрого измерения ферментативной активности в твердом пищевом продукте, содержащего: (i) резервуар для содержания исследуемого образца, (ii) реактив, подходящий для фермента, активность которого измеряется, и(iii) буферный раствор, позволяющий растворить этот фермент. Пищевым продуктом предпочтительно является твердый пищевой продукт, не прошедший тепловую обработку перед измерением. В пищевые продукты, предназначенные для корма скота, обычно добавляют ферменты, служащие в основном для улучшения усвоения пищевого рациона. Эти ферменты обычно диспергируют в жидком состоянии в пищевых продуктах так,как описано, в частности, в ЕР 0789291. Ферменты могут также добавляться в пищевой продукт в порошкообразном виде. В этой связи возникают две проблемы,первая связана с проверкой однородности распределения добавленных в пищевой продукт ферментов, а вторая - с тем, чтобы быстро определить активность фермента или ферментов,добавленных в пищевые продукты. Эти проблемы были подняты, в частности, производителями кормов и животноводами, которые хотят проверять качество кормов, которые они дают животным. До настоящего времени ферментативная активность могла измеряться только в лаборатории, что вызывало проблемы, связанные с интерпретацией и сроками, и эти проблемы являлись неудобным обстоятельством в случаях, когда требовалось получить результат немедленно. Настоящее изобретение решает данную проблему с помощью предлагаемого устройства для измерения ферментативной активности любого обогащенного ферментом продукта для кормления скота. Данное устройство, принцип измерения которого основан на колориметрической реакции, позволяет одновременно осуществлять качественное измерение ферментативной активности образца и полуколичественное измерение данного образца. На фиг.1 представлен вид устройства по изобретению, а именно устройства для измерения ферментативной активности, имеющего форму столбика. В последующем описании ссылка дается на упомянутую выше фигуру. Устройство, являющееся предметом настоящего изобретения, включает резервуар для содержания исследуемого образца, реактив,подходящий для фермента, активность которого измеряется, и буферный раствор, позволяющий растворить этот фермент. Резервуаром данного устройства может быть столбик (фиг. 1) (в не ограничивающем смысле), образованный из нижней узкой градуированной части (11) и верхней широкой части в виде воронки (12), облегчающей введение 2 различных реактивов в устройство, а также их перемешивание путем взбалтывания. Воронка может также быть снабжена системой герметичного закрывания (13), такой как крышка,прикрепленная к воронке перемычкой (131). Резервуар может быть также образован трубкой одноразового использования (см. фиг. 2). Резервуар может быть выполнен из синтетического материала, такого как пластик одноразового использования. Предпочтительно, столбик может иметь на своем основании удлинение (14), отсекаемое для вытекания жидкой фазы содержимого столбика. Над этим удлинением имеется сужение(141), удерживающее фрагменты твердого пищевого продукта. Измерение ферментативной активности основано на реакции окрашивания Azoметодом. Принцип реакции окрашивания Azoметодом основан на ферментативном гидролизе специфичного для фермента субстрата, связанного с хромофором. В результате реакции получаются растворимые олигомеры, которые окрашивают среду в синий цвет. Абсорбционная способность может измеряться при 590 нм. Реактив, используемый в устройстве, - это связанный с хромофором субстрат катализируемой ферментом реакции. Устройство включает также буферный раствор, позволяющий растворять ферменты,нанесенные на пищевой продукт методом распыления, и поддерживающий оптимальный уровень рН. В качестве неограничивающего примера можно привести устройство для определения ксиланазной активности. Для измерения ксиланазной активности используют реактив, представляющий собой комплекс ремазол-ксилана овса или пшеницы с бриллиантовым синим R, или "Ксиламазу АХ"(фирмы Megazyme), состоящую из арабоксилана овса или пшеницы, связанного с красителем. Применяемый буферный раствор выбран из растворов уксусной кислоты/ацетата натрия,хлоргидрата глицина/глицина, аконитовой кислоты/гидроокиси натрия, муравьиной кислоты/формиата натрия. В качестве примера можно также привести устройство для определения бета-глюканазной активности, основанное также на реакции окрашивания Azo-методом. Из применяемых субстратов можно упомянуть 1,3:1,4D-глюкан с Ремазолбриллиантовым синим R и Бета-Глюказим, продаваемый фирмой Megazyme и состоящий из бета-глюкана, связанного с азурином. Применяемый буферный раствор выбран из растворов уксусной кислоты/ацетата натрия,хлоргидрата глицина/глицина, аконитовой кислоты/гидроокиси натрия, муравьиной кислоты/формиата натрия. Для измерения целлюлазной активности в качестве субстрата используют пластинки Cellazyme (продаваемые фирмой Megazyme). В состав этих пластинок входят субстраты на базе целлюлозы иили целлюлозы и ксилогликанов,полимеризованных с красителем азурином. Предпочтительный вариант способа осуществления настоящего изобретения использует твердый реактив. Предпочтительно, для более легкого растворения фермента к субстрату, содержащему хромофор, может быть добавлено поверхностно-активное вещество. Таким поверхностноактивным веществом может быть лаурилсульфат натрия или додецилсульфат натрия. В соответствии с наиболее предпочтительным способом осуществления изобретения измерение проводят в четыре стадии:- в резервуар (1) вводят 10 мл образца,ферментативную активность которого требуется измерить, а если образец твердый, то он должен заполнить резервуар до отметки 10 мл;- вводят специальный буферный раствор до отметки 20 мл; и- многократно интенсивно встряхивают столбик после закрытия его крышкой. При необходимости можно предусмотреть дополнительную стадию разделения жидкой и твердой фаз (центрифугированием или фильтрацией), чтобы собрать жидкую фазу и измерить интенсивность окрашивания спектрофотометрически или путем простого сравнения с цветовой шкалой. Появление синей окраски через 4-8 ч после начала реакции подтверждает присутствие ферментативной активности, причем интенсивность Образец Ксиланаза TRLC на гранулах Ксиланаза TRLC на гранулах Ксиланаза TRLC на гранулах Ксиланаза порошок до гранулирования Ксиланаза LC на гранулах Ксиланаза LC на гранулах Ксиланаза LC на гранулах Ксиланаза LC на гранулах 4 окраски пропорциональна ферментативной активности, присутствующей в образце. Другое преимущество настоящего изобретения заключается в том, что оно позволяет осуществить полуколичественное измерение ферментативной активности. Жидкая фаза может быть извлечена из столбика путем срезания отсекаемого удлинения. Интенсивность ее окрашивания можно затем сравнить с градуированным эталоном оптической плотности (DO). Кроме того, что данный способ позволяет осуществлять быстрое измерение, он очень прост и не требует специального оборудования. Например, производитель кормов или животновод могут провести контрольное измерение сразу после изготовления пищевого продукта. Настоящее изобретение далее поясняется с помощью следующих примеров, которые не должны рассматриваться как ограничивающие данное изобретение. Примеры. Две серии опытов были проведены на ксилане LC Rovabio (смесь ксиланазы и бетаглюканазы Penicillium funiculosum) и на ксиланазе TRLC Rovabio (ксиланаза Trichodermareesi), ксиланазная активность которых составляет 350-550 uAXC/мл. По оценкам, в результате обработки пищевых продуктов путем распыления в них жидких соединений получают активность порядка 70-110 uAXC на кг пищевого продукта. Применяемый буферный раствор - это ацетатный буферный раствор, рН которого составляет 4,7. Обработке распылением может подвергаться порошкообразный или гранулированный пищевой продукт.D.O. при 590 нм Наблюдение через 8 ч через 8 ч ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Устройство для быстрого измерения ферментативной активности в образце твердого материала, содержащее контейнер для приема исследуемого образца, реагент, подходящий для фермента, активность которого измеряется, и подходящий буферный раствор для помещения в него упомянутого образца и реагента, который является субстратом для указанного фермента и содержит хромофор, причем устройство снабжено градуированным эталоном, позволяющим определить ферментативную активность с учетом цвета полученной жидкой фазы в контейнере. 2. Устройство по п.1, отличающееся тем,что указанным резервуаром является градуированная трубка или одноразовый столбик, снабженный системой герметичного закрывания. 3. Устройство по п.2, отличающееся тем,что указанный контейнер имеет на своем основании удлинение, отсекаемое для вытекания жидкой фазы. 6 4. Устройство по любому из пп.1-3, отличающееся тем, что указанный реагент находится в твердом или жидком состоянии. 5. Устройство по п.1, отличающееся тем,что указанный буферный раствор выбран из группы, состоящей из растворов уксусной кислоты/ацетата натрия, хлоргидрата глицина/глицина, аконитовой кислоты/гидроокиси натрия, муравьиной кислоты/формиата натрия. 6. Способ измерения ферментативной активности образца твердого материала с использованием устройства по любому из пп.1-5, предусматривающий помещение образца определенного веса в контейнер указанного устройства, введение реагента в форме твердого шарика,добавление определенного количества подходящего буферного раствора, герметичное закрывание контейнера, энергичное встряхивание,отделение полученной жидкой фазы от твердой фазы, сбор жидкой фазы и определение ферментативной активности путем сравнения окрашивания жидкой фазы с цветом эталона. Колонна устройства для измерения ферментативной активности