Способ амплификации нуклеиновых кислот

005739 Область техники, к которой относится изобретение Настоящее изобретение относится к способу детекции нуклеиновой кислоты-мишени, полезному в области клинической медицины, и к способу синтеза ДНК, полезному в области генной инженерии. Оно относится к способу амплификации нуклеиновой кислоты как матрицы и к способу детекции нуклеиновой кислоты-мишени, амплифицированной указанным способом. Уровень техники Синтез ДНК используют для разных целей при исследованиях в области генной инженерии. Большинство синтезов ДНК, за исключением синтеза короткоцепных ДНК, таких как олигонуклеотиды, осуществляют ферментативными способами, при которых используют ДНК-полимеразу. Примером таких способов является способ полимеразной цепной реакции (ПЦР, PCR), подробно описанный в патентах США 4683195, 4683202 и 4800159. Другим примером является способ ПЦР с обратной транскриптазой (ОТ-ПЦР), являющийся сочетанием ПЦР и обратно-транскриптазной реакции, описанный в Trends inBiotechnology, 10:146-152 (1992). Развитие вышеуказанных способов делает возможной амплификацию представляющего интерес участка ДНК или РНК. Вышеуказанные способы синтеза ДНК осуществляют, например, с использованием реакции, состоящей из трех стадий. Три стадии представляют собой стадию диссоциации (денатурации) двухцепочечной ДНК до одноцепочечных ДНК, стадию отжига праймера к одноцепочечной ДНК и стадию синтеза (наращивания, достраивания) комплементарной цепочки с праймера для того, чтобы амплифицировать участок ДНК, представляющий интерес. С другой стороны, такие синтезы проводят с использованием реакции, называемой "челночной ПЦР" ("the shuttle PCR" (Recent advances in PCR methodology), Tanpakushitsu Kakusan Kouso, Bessatsu (Protein, Nucleic Acid and Enzyme, Supplement), 41 (5):425-428 (1996, где стадию отжига праймера и стадию наращивания проводят при одной и той же температуре. С другой стороны, можно использовать способ лигазной цепной реакции (ЛЦР, LCR), описываемый в ЕР 320308, опубликованном 14 июня 1989 г., или способ с системой амплификации на основе транскрипции (TAS), описанный в PCR Protocols, Academic Press Inc., 1990, pp. 245-252. Четыре способа, указанные выше, требуют повторения реакции при высокой температуре и реакции при низкой температуре несколько раз для того, чтобы регенерировать одноцепочечную молекулу-мишень для следующего цикла амплификации. Систему реакций надо осуществлять с использованием перемежающихся фаз или циклов, поскольку реакция ограничивается температурой, как указано выше. Таким образом, указанные способы требуют применения дорогостоящего термоциклера, который может точно поддерживать значение температуры в широком интервале по времени. Кроме того, при реакции требуется время для установления температуры на уровне двух или трех заранее определенных значений. Потеря времени увеличивается пропорционально числу циклов. Для того чтобы решить указанные проблемы, разрабатываются способы амплификации нуклеиновых кислот, которые можно осуществить в изотермических условиях. Примерами являются способ амплификации с замещением цепи (SDA), описанный в JP-B 7-114718, способ самоподдерживающейся репликации последовательности (3SR), способ амплификации на основе нуклеотидной последовательности(NASBA), описанный в патенте Японии 2650159, способ амплификации, опосредуемой транскрипцией (ТМА), способ с Q-репликазой, описанный в патенте Японии 2710159, и различные модификации способа SDA, описанные в патенте США 5824517, WO 99/09211, WO 95/25180 и WO 99/49081. Способ изотермического ферментативного синтеза олигонуклеотидов описывается в патенте США 5916777. В таких способах изотермической амплификации нуклеиновых кислот или синтеза олигонуклеотидов при реакции в реакционной смеси при постоянной температуре параллельно происходит достраивание с праймера и/или отжиг праймера к одноцепочечному достроенному продукту (или к исходной последовательности-мишени) с последующим достраиванием с праймера. Среди изотермических способов амплификации нуклеиновых кислот способ SDA является примером системы, в которой ДНК в конечном счете амплифицируется. Способ SDA является способом амплификации нуклеиновой кислоты-мишени (и ее комплементарной цепи) в образце путем замещения двух цепей с использованием ДНК-полимеразы и эндонуклеазы рестрикции. Для способа требуются четыре праймера, используемых для амплификации, два из которых должны быть сконструированы так,чтобы они содержали сайт узнавания эндонуклеазы рестрикции. Способ требует применения модифицированного дезоксирибонуклеозидтрифосфата в больших количествах в качестве субстрата для синтеза ДНК. Примером модифицированных дезоксирибонуклеозидтрифосфатов является (-S)-дезоксирибонуклеозидтрифосфат, в котором атом кислорода фосфатной группы в -положении заменен на атом серы (S). Проблема стоимости работ, связанная с применением модифицированного дезоксирибонуклеозидтрифосфата, становится серьезной, если реакцию проводят регулярно, например, при генетических исследованиях. Кроме того, введение в способе модифицированного нуклеотида, такого как (-S)дезоксирибонуклеотид, в состав амплифицированного фрагмента ДНК может ликвидировать возможность расщепления амплифицированного фрагмента ДНК рестриктазой, например, когда его подвергают анализу на полиморфизм длин рестрикционных фрагментов (RFLP). Модифицированный способ SDA, описанный в патенте США 5824517, является способом ам-1 005739 плификации ДНК, в котором используется химерный праймер, состоящий из РНК и ДНК и имеющий существенный элемент структуры, в котором ДНК располагается по меньшей мере на 3'-конце. Модифицированный способ SDA, описанный в WO 99/09211, требует использования рестриктазы, дающей 3'выступающий конец. Модифицированный способ SDA, описанный в WO 95/25180, требует использования по меньшей мере двух пар праймеров. Модифицированный способ SDA, описанный в WO 99/49081,требует использования по меньшей мере двух пар праймеров и по меньшей мере одного модифицированного дезоксирибонуклеозидтрифосфата. С другой стороны, способ синтеза олигонуклеотидов, описанный в патенте США 5916777, включает синтез ДНК с использованием праймера, содержащего рибонуклеотид на 3'-конце, осуществление реакции с использованием праймера, введение ника между праймером и наращенной цепью в достраиваемой с праймера цепи с помощью эндонуклеазы с целью их разделения, расщепление матрицы и возвращение праймера в исходное состояние для его повторного использования. Для этого праймер нужно отделить от реакционной системы и затем снова отжечь его к матрице для того, чтобы повторно использовать праймер в способе. Кроме того, для способа изотермической амплификации, опосредованной петлей (LAMP), описанного в WO 00/28082, требуется четыре праймера для амплификации, и продукты, амплифицированные с использованием такого метода, представляют собой ДНК разного размера, в которых участки-мишени для амплификации повторяются. Как описано выше, общепринятые способы изотермической амплификации нуклеиновых кислот тем не менее страдают различными недостатками. Таким образом, сохраняется потребность в способе амплификации нуклеиновых кислот, с помощью которого, при низкой стоимости работы, получают фрагмент ДНК, который затем можно использовать в генной инженерии. Цели изобретения Основными целями настоящего изобретения являются способ амплификации нуклеиновой кислоты-мишени, с помощью которого в образце с высокой чувствительностью специфически амплифицируется нуклеиновая кислота-мишень путем синтеза ДНК с использованием химерного олигонуклеотидного праймера, способ детекции амплифицированного фрагмента, полученного указанным способом, способ получения нуклеиновой кислоты-мишени с использованием указанного способа амплификации и химерный олигонуклеотидныйпраймер, используемый в указанных способах. Сущность изобретения В результате интенсивных исследований авторы сконструировали превосходную систему реакции амплификации гена. Конструирование осуществили путем разработки способа, при котором участок ДНК, представляющий интерес, амплифицируют в присутствии химерного олигонуклеотидного праймера, содержащего рибонуклеотид, расположенный на 3' -конце или в 3'-концевой области, эндонуклеазы и ДНК-полимеразы. Таким образом осуществлено настоящее изобретение. Способ представляет собой способ амплификации нуклеиновых кислот, в котором используют химерный олигонуклеотидный праймер, и называется в данном описании способом ICAN (изотермическая инициируемая химерным праймером амплификация нуклеиновых кислот). Первый аспект настоящего изобретения относится к способу амплификации нуклеиновой кислотымишени, включающему(a) приготовление реакционной смеси посредством смешивания нуклеиновой кислоты, используемой в качестве матрицы, дезоксирибонуклеозидтрифосфата, ДНК-полимеразы с активностью замещения цепи, по меньшей мере одного праймера и РНКазы Н, где праймер представляет собой химерный олигонуклеотидный праймер, существенно комплементарный нуклеотидной последовательности нуклеиновой кислоты как матрицы, и содержит рибонуклеотид, а также по меньшей мере один компонент, выбранный из группы, состоящей из дезоксирибонуклеотида и нуклеотидного аналога, причем рибонуклеотид располагается на 3'-конце или в 3'-концевой области праймера; и(b) инкубацию реакционной смеси в течение времени, достаточного для образования продукта реакции. По первому аспекту настоящего изобретения можно также использовать реакционную смесь, содержащую химерный олигонуклеотидный праймер с последовательностью, существенно гомологичной нуклеотидной последовательности нуклеиновой кислоты, используемой как матрица. Второй аспект настоящего изобретения относится к способу амплификации нуклеиновой кислоты,включающему(а) обработку нуклеиновой кислоты, используемой как матрица по меньшей мере одним праймером, существенно комплементарным нуклеотидной последовательности нуклеиновой кислоты, и ДНКполимеразой для синтеза достраиваемой с праймера цепи, комплементарной матрице, и синтеза двухцепочечной нуклеиновой кислоты, где праймер является химерным олигонуклеотидным праймером, содержащим рибонуклеотид, а также по меньшей мере один компонент, выбранный из группы, состоящей из дезоксирибонуклеотида и нуклеотидного аналога, причем рибонуклеотид располагается на 3'-конце или в 3'-концевой области праймера;(b) наращивание нуклеотидной последовательности, комплементарной двухцепочечной нуклеиновой кислоте, используемой как матрица, полученной на предыдущей стадии, с использованием ДНКполимеразы с активностью замещения цепи в присутствии РНКазы Н для осуществления замещения це-2 005739 пи и синтеза замещенной цепи и двухцепочечной нуклеиновой кислоты; и(c) повторное использование на стадии (b) двухцепочечной нуклеиновой кислоты, полученной на стадии (b), как матрицы. Третий аспект настоящего изобретения относится к способу амплификации нуклеиновой кислоты с использованием по меньшей мере двух праймеров, включающему(a) обработку нуклеиновой кислоты, используемой как матрица, по меньшей мере одним праймером, существенно комплементарным нуклеотидной последовательности нуклеиновой кислоты, и ДНКполимеразой для синтеза достроенной с праймера цепи, комплементарной матрице, где праймер является химерным олигонуклеотидным праймером, содержащим рибонуклеотид, а также по меньшей мере один компонент, выбранный из группы, состоящей из дезоксирибонуклеотида и нуклеотидного аналога, причем рибонуклеотид располагается на 3'-конце или в 3'-концевой области праймера;(b) наращивание нуклеотидной последовательности, комплементарной двухцепочечной нуклеиновой кислоте как матрице, полученной на предыдущей стадии, с использованием ДНК-полимеразы с активностью замещения цепи в присутствии РНКазы Н для осуществления замещения цепи и синтеза замещенной цепи и двухцепочечной нуклеиновой кислоты;(c) повторное использование на стадии (b) двухцепочечной нуклеиновой кислоты, полученной на стадии (b), как матрицы;(d) обработку замещенной цепи, полученной на стадии (b), используемой как матрица, по меньшей мере одним праймером, отличающимся от праймера, используемого на стадии (а), и ДНК-полимеразой для синтеза достроенной с праймера цепи, комплементарной замещенной цепи, где праймер, отличающийся от праймера, используемого на стадии (а), является химерным олигонуклеотидным праймером,существенно комплементарным нуклеотидной последовательности замещенной цепи, и содержит рибонуклеотид, а также по меньшей мере один компонент, выбранный из группы, состоящей из дезоксирибонуклеотида и нуклеотидного аналога, причем рибонуклеотид располагается на 3'-конце или в 3'-концевой области праймера;(e) наращивание нуклеотидной последовательности, комплементарной двухцепочечной нуклеиновой кислоте, используемой как матрица, полученной на предыдущей стадии, с использованием ДНКполимеразы с активностью замещения цепи в присутствии РНКазы Н для осуществления замещения цепи и синтеза замещенной цепи и двухцепочечной нуклеиновой кислоты; и(f) повторное использование на стадии (е) двухцепочечной нуклеиновой кислоты, полученной на стадии (е), как матрицы. По второму и третьему аспектам настоящего изобретения в качестве ДНК-полимеразы можно использовать ДНК-полимеразу с активностью замещения цепи. Четвертый аспект настоящего изобретения относится к способу амплификации нуклеиновой кислоты, включающему(а) обработку двухцепочечной нуклеиновой кислоты, используемой как матрица, двумя праймерами, существенно комплементарными нуклеотидным последовательностям соответствующих цепей двухцепочечной нуклеиновой кислоты, и ДНК-полимеразой с активностью замещения цепи для синтеза достроенных с праймеров цепей, комплементарных матрице, и получения двухцепочечной нуклеиновой кислоты, состоящей из синтезированных достроенных с праймеров цепей, отжегшихся одна с другой, где каждый праймер является химерным олигонуклеотидным праймером, содержащим рибонуклеотид, а также по меньшей мере один компонент, выбранный из группы, состоящей из дезоксирибонуклеотида и нуклеотидного аналога, причем рибонуклеотид располагается на 3'-конце или в 3'-концевой области праймера;(b) расщепление эндонуклеазой двухцепочечной нуклеиновой кислоты, состоящей из достроенных с праймеров цепей, полученной на стадии (а), по сайтам, содержащим рибонуклеотиды; и(c) наращивание нуклеотидных последовательностей, комплементарных матрице, с использованием ДНК-полимеразы с активностью замещения цепи, с 3'-концов соответствующих праймерных частей двухцепочечной нуклеиновой кислоты, в которой достроенные с праймеров цепи расщеплены, полученных на стадии (b), для осуществления замещения цепей и получения двухцепочечной нуклеиновой кислоты, состоящей из матрицы и достроенной с праймера цепи. Пятый аспект настоящего изобретения относится к способу амплификации нуклеиновой кислоты,включающему(a) обработку двухцепочечной нуклеиновой кислоты, используемой как матрица, двумя праймерами, существенно комплементарными нуклеотидным последовательностям соответствующих цепей двухцепочечной нуклеиновой кислоты, и ДНК-полимеразой с активностью замещения цепи для синтеза достроенных с праймеров цепей, комплементарных матрице, и получения двухцепочечной нуклеиновой кислоты, состоящей из синтезированных достроенных с праймеров цепей, отжегшихся одна с другой, где каждый праймер является химерным олигонуклеотидным праймером, содержащим рибонуклеотид, а также по меньшей мере один компонент, выбранный из группы, состоящей из дезоксирибонуклеотида и нуклеотидного аналога, причем рибонуклеотид располагается на 3'-конце или в 3'-концевой области праймера;(b) расщепление эндонуклеазой двухцепочечной нуклеиновой кислоты, состоящей из синтезированных достроенных с праймеров цепей, полученной на стадии (а), по сайтам, содержащим рибонуклеотиды; и(с) наращивание нуклеотидных последовательностей, комплементарных матрице, с использованием ДНК-полимеразы с активностью замещения цепи, от 3'-концов соответствующих праймерных частей двухцепочечной нуклеиновой кислоты, в которой достроенные с праймеров цепи расщеплены, полученных на стадии (b), для осуществления замещения цепей и получения двухцепочечной нуклеиновой кислоты, состоящей из достроенных с праймеров цепей, отжегшихся одна с другой. Шестой аспект настоящего изобретения относится к способу амплификации нуклеиновой кислоты,включающему(a) обработку двухцепочечной нуклеиновой кислоты, используемой как матрица, двумя праймерами, существенно комплементарными нуклеотидным последовательностям соответствующих цепей двухцепочечной нуклеиновой кислоты, и ДНК-полимеразой с активностью замещения цепи для синтеза достроенных с праймеров цепей, комплементарных матрице, и получения двухцепочечной нуклеиновой кислоты, состоящей из синтезированных достроенных с праймеров цепей, отжегшихся одна с другой, где каждый праймер является химерным олигонуклеотидным праймером, содержащим рибонуклеотид, а также по меньшей мере один компонент, выбранный из группы, состоящей из дезоксирибонуклеотида и нуклеотидного аналога, причем рибонуклеотид располагается на 3'-конце или в 3'-концевой области праймера;(b) расщепление эндонуклеазой двухцепочечной нуклеиновой кислоты, состоящей из синтезированных достроенных с праймеров цепей, полученной на стадии (а), по сайтам, содержащим рибонуклеотиды;(c) наращивание нуклеотидных последовательностей, комплементарных матрице, с использованием ДНК-полимеразы с активностью замещения цепи, от 3'-концов соответствующих праймерных частей двухцепочечной нуклеиновой кислоты, в которой достроенные с праймеров цепи расщеплены, полученных на стадии (b), для осуществления замещения цепей и получения двухцепочечной нуклеиновой кислоты, состоящей из достроенных с праймеров цепей, отжегшихся одна с другой, и двухцепочечной нуклеиновой кислоты, состоящей из матриц, отжегшихся одна с другой, к которой отжигаются два праймера на стадии (а);(d) наращивание нуклеотидных последовательностей, комплементарных матрице, с использованием ДНК-полимеразы с активностью замещения цепи, с 3'-концов соответствующих праймерных частей полученной на стадии (с) двухцепочечной нуклеиновой кислоты, к которой отожжены два праймера для осуществления замещения цепей и получения двухцепочечной нуклеиновой кислоты, состоящей из достроенных с праймеров цепей, отжегшихся одна с другой, и двухцепочечной нуклеиновой кислоты, состоящей из матриц, отжегшихся одна с другой, к которой отжигаются два праймера на стадии (а); и(e) повторное использование на стадии (d) двухцепочечной нуклеиновой кислоты, к которой отожжены два праймера, полученной на стадии (d). Седьмой аспект настоящего изобретения относится к способу амплификации нуклеиновой кислоты,включающему(a) обработку двухцепочечной нуклеиновой кислоты, используемой как матрица двумя праймерами,существенно комплементарными нуклеотидным последовательностям соответствующих цепей двухцепочечной нуклеиновой кислоты, и ДНК-полимеразой с активностью замещения цепи для синтеза достроенных с праймеров цепей, комплементарных матрице, и получения двухцепочечной нуклеиновой кислоты, состоящей из синтезированных достроенных с праймеров цепей, отжегшихся одна с другой, где каждый праймер является химерным олигонуклеотидным праймером, содержащим рибонуклеотид, а также по меньшей мере один компонент, выбранный из группы, состоящей из дезоксирибонуклеотида и нуклеотидного аналога, причем рибонуклеотид располагается на 3'-конце или в 3'-концевой области праймера;(b) расщепление эндонуклеазой двухцепочечной нуклеиновой кислоты, состоящей из достроенных с праймеров цепей, полученной на стадии (а), по сайтам, содержащим рибонуклеотиды;(c) наращивание нуклеотидных последовательностей, комплементарных матрице, с использованием ДНК-полимеразы с активностью замещения цепи, с 3'-концов соответствующих праймерных частей двухцепочечной нуклеиновой кислоты, в которой достроенные с праймеров цепи расщеплены, полученных на стадии (b), для осуществления замещения цепей и получения двухцепочечной нуклеиновой кислоты, состоящей из достроенных с праймеров цепей, отжегшихся одна с другой, и двухцепочечной нуклеиновой кислоты, состоящей из матриц, отжегшихся одна с другой, к которой отжигаются два праймера на стадии (а);(d) наращивание нуклеотидных последовательностей, комплементарных матрице, с использованием ДНК-полимеразы с активностью замещения цепи, с 3'-концов соответствующих праймерных частей полученной на стадии (с) двухцепочечной нуклеиновой кислоты, к которой отожжены два праймера для осуществления замещения цепей и получения двухцепочечной нуклеиновой кислоты, состоящей из матрицы и достроенной с праймера цепи;(e) расщепление эндонуклеазой двухцепочечной нуклеиновой кислоты, состоящей из матрицы и достроенной с праймера цепи, полученной на стадии (d), по сайту, содержащему рибонуклеотид; и(f) наращивание нуклеотидной последовательности, комплементарной матрице, с использованием ДНК-полимеразы с активностью замещения цепи, с 3'-конца праймерной части двухцепочечной нуклеиновой кислоты, в которой достроенная с праймера цепь расщеплена, полученной на стадии (е), для синтеза замещенной цепи. По четвертому-седьмому аспектам в качестве эндонуклеазы можно использовать эндорибонуклеазу, такую как РНКаза Н. По первому-седьмому аспектам, где используют РНКазу Н, можно использовать РНКазу Н из Escherichia coli, бактерии рода Thermotoga, бактерии рода Thermus, бактерии рода Pyrococcus, бактерии рода Archaeoglobus, бактерии рода Bacillus или подобной бактерии. По первому-седьмому аспектам примером подходящей длины специфически амплифицируемого фрагмента нуклеотидной последовательности нуклеиновой кислоты-мишени являются 200 п.о. или менее. В случае первого-седьмого аспектов настоящего изобретения можно использовать химерный олигонуклеотидный праймер, представленный общей формулой, приведенной ниже,общая формула: 5'-dNa-Nb-dNc-3',где (а: целое число 11 или большее; b: целое число 1 или большее; с: 0 или целое число 1 или большее;dN: дезоксирибонуклеотид и/или нуклеотидный аналог; N: немодифицированный рибонуклеотид и/или модифицированный рибонуклеотид, причем некоторые из dN в dNa могут быть заменены на N, и нуклеотид на 3'-конце может быть модифицирован, так что достраивание на 3'-конца под действием ДНКполимеразы не происходит). Примерами таких химерных олигонуклеотидных праймеров являются праймер, в котором с равно 0,и праймер, в котором нуклеотидный аналог представляет собой дезоксирибоинозиннуклеотид или дезоксирибоурацилнуклеотид, и модифицированный рибонуклеотид представляет собой (-S)-рибонуклеотид. Кроме того, когда используют такой химерный олигонуклеотидный праймер, реакцию достраивания ДНК проводят при температуре, подходящей для праймера. Способ амплификации по первому-седьмому аспектам может включать отжиг нуклеиновой кислоты, используемой как матрица, с химерным олигонуклеотидным праймером, существенно комплементарным нуклеотидной последовательности нуклеиновой кислоты, в растворе для отжига, содержащем вещество, которое усиливает отжиг нуклеиновой кислоты с праймером. Например, раствор для отжига может содержать спермидин и/или пропилендиамин. Отжиг можно провести путем инкубации раствора для отжига, содержащего нуклеиновую кислоту, используемую в качестве матрицы, и химерный олигонуклеотидный праймер, существенно комплементарный нуклеотидной последовательности нуклеиновой кислоты, при 90 или выше и последующего охлаждения раствора до температуры, при которой проводят реакцию амплификации, или до более низкой. Реакцию амплификации по первому-седьмому аспектам можно провести в буфере, содержащем буферный компонент, выбранный из группы, состоящей из бицина и HEPES. По первому-седьмому аспектам, например, в качестве ДНК-полимеразы с активностью замещения цепи можно использовать ДНК-полимеразу, выбранную из группы, состоящей из фрагмента Кленова ДНК-полимеразы I из Escherichia coli, Bst ДНК-полимеразы, лишенной 5'3' экзонуклеазной активности,из Bacillus stearothermophilus и Вса ДНК-полимеразы, лишенной 5'3' экзонуклеазной активности, изBacillus caldotenax. В одном из вариантов воплощения первого-седьмого аспекта в качестве ДНК-полимеразы с активностью замещения цепи используют Вса ДНК-полимеразу, лишенную 5'3' экзонуклеазной активности,из Bacillus caldotenax, и в качестве эндонуклеазы используют РНКазу Н из Escherichia coli, бактерии родаPyrococcus или бактерии рода Archaeoglobus. Примером РНКазы Н является РНКаза Н типа I из Escherichia coli или РНКаза Н типа II из бактерии рода Pyrococcus или бактерии рода Archaeoglobus. По первому-седьмому аспектам можно использовать ДНК-полимеразу с эндонуклеазной активностью. В качестве такой ДНК-полимеразы можно использовать Вса ДНК-полимеразу, лишенную 5'3' экзонуклеазной активности, из Bacillus caldotenax, и реакцию амплификации можно проводить в присутствии вещества, которое дает возможность проявиться эндонуклеазной активности ДНК-полимеразы. Примером вещества, дающего возможность проявиться эндонуклеазной активности Вса ДНКполимеразы, является ион марганца. Способ амплификации нуклеиновой кислоты-мишени по первому-седьмому аспектам можно осуществить в присутствии вещества, ингибирующего обратно-транскриптазную активность ДНКполимеразы. Примером вещества, ингибирующего обратно-транскриптазную активность ДНКполимеразы, является фосфономуравьиная кислота. Первый-седьмой аспекты настоящего изобретения могут быть воплощены с использованием в качестве матрицы одноцепочечной ДНК или двухцепочечной ДНК. Если нуклеиновая кислота, используемая в качестве матрицы, является двухцепочечной ДНК, амплификацию можно проводить после превраще-5 005739 ния ее в одноцепочечные ДНК. Нуклеиновая кислота, используемая в качестве матрицы, может представлять собой кДНК, полученную реакцией обратной транскрипции с использованием в качестве матрицы РНК. С одной стороны,реакцию амплификации проводят после синтеза кДНК в реакции обратной транскрипции с использованием в качестве матрицы РНК. Для реакции обратной транскрипции можно использовать ДНКполимеразу, обладающую активностью обратной транскриптазы. Например, реакцию обратной транскрипции и синтез достроенной цепи, комплементарной матрице, можно проводить с использованием только ДНК-полимеразы, обладающей обратно-транскриптазной активностью и активностью замещения цепи. Примерами такой ДНК-полимеразы являются Bst ДНК-полимераза, лишенная 5'3' экзонуклеазной активностью, из Bacillus stearothermophilus или Вса ДНК-полимераза, лишенная 53' экзонуклеазной активностью, из Bacillus caldotenax. По первому-седьмому аспектам реакцию амплификации можно проводить в изотермических условиях. Ее можно проводить в присутствии аналога дезоксинуклеозидтрифосфата, такого как дезоксиуридинтрифосфат или его производное. Восьмой аспект настоящего изобретения относится к композиции для амплификации нуклеиновой кислоты, содержащей(a) по меньшей мере один праймер, существенно комплементарный нуклеотидной последовательности нуклеиновой кислоты, используемой как матрица, где праймер представляет собой химерный олигонуклеотидный праймер, содержащий рибонуклеотид, а также по меньшей мере один компонент, выбранный из группы, состоящей из дезоксирибонуклеотида и нуклеотидного аналога, причем рибонуклеотид располагается на 3'-конце или в 3'-концевой области праймера;(c) ДНК-полимеразу с активностью замещения цепи. Девятый аспект настоящего изобретения относится к композиции для амплификации нуклеиновой кислоты, содержащей(a) по меньшей мере два праймера, существенно комплементарные нуклеотидным последовательностям соответствующих цепей двухцепочечной нуклеиновой кислоты, используемой как матрица, где каждый праймер представляет собой химерный олигонуклеотидный праймер, содержащий рибонуклеотид, а также по меньшей мере один компонент, выбранный из группы, состоящей из дезоксирибонуклеотида и нуклеотидного аналога, причем рибонуклеотид располагается на 3'-конце в 3'-концевой области праймера;(c) ДНК-полимеразу с активностью замещения цепи. Десятый аспект настоящего изобретения относится к композиции для амплификации нуклеиновой кислоты, полученной путем смешивания нуклеиновой кислоты, используемой как матрица, дезоксирибонуклеозидтрифосфата, ДНК-полимеразы с активностью замещения цепи, по меньшей мере одного праймера и эндонуклеазы, где праймер представляет собой химерный олигонуклеотидный праймер, существенно комплементарный нуклеотидной последовательности нуклеиновой кислоты, используемой как матрица, и содержит рибонуклеотид, а также по меньшей мере один компонент, выбранный из группы, состоящей из дезоксирибонуклеотида и нуклеотидного аналога, причем рибонуклеотид располагается на 3'-конце или в 3'-концевой области праймера. Одиннадцатый аспект настоящего изобретения относится к композиции для амплификации нуклеиновой кислоты, полученной путем смешивания нуклеиновой кислоты, используемой как матрица, дезоксирибонуклеозидтрифосфата, ДНК-полимеразы с активностью замещения цепи, по меньшей мере двух праймеров и эндонуклеазы, где каждый праймер представляет собой химерный олигонуклеотидный праймер, существенно комплементарный нуклеотидной последовательности каждой цепи двухцепочечной нуклеиновой кислоты, используемой как матрица, и содержит рибонуклеотид, а также по меньшей мере один компонент, выбранный из группы, состоящей из дезоксирибонуклеотида и нуклеотидного аналога, причем рибонуклеотид располагается на 3'-конце или в 3'-концевой области праймера. Примером праймера, входящего в состав композиции по восьмому-одиннадцатому аспектам настоящего изобретения, может являться химерный олигонуклеотидный праймер, представленный общей формулой, приведенной ниже,общая формула: 5'-dNa-Nb-dNc-3',где (а: целое число 11 или большее; b: целое число 1 или большее; с: 0 или целое число 1 или большее;dN: дезоксирибонуклеотид и/или нуклеотидный аналог; N: немодифицированный рибонуклеотид и/или модифицированный рибонуклеотид, причем некоторые из dN в dNa могут быть заменены на N, и нуклеотид на 3'-конце может быть модифицирован, так что достраивание с 3'-конца под действием ДНКполимеразы не происходит). Примерами таких химерных олигонуклеотидных праймеров являются праймер, в котором с равно 0,и праймер, в котором нуклеотидный аналог представляет собой дезоксирибоинозиннуклеотид или дезоксирибоурацилнуклеотид, и модифицированный рибонуклеотид представляет собой (-S)-рибонуклеотид.-6 005739 Композиция по восьмому-одиннадцатому аспектам может содержать буферный компонент, выбранный из группы, состоящей из бицина и HEPES. Примером композиции по восьмому-одиннадцатому аспектам является композиция, содержащая в качестве ДНК-полимеразы с активностью замещения цепи ДНК-полимеразу, выбранную из группы, состоящей из фрагмента Кленова ДНК-полимеразы I из Escherichia coli, Bst ДНК-полимеразы, лишенной 5'3' экзонуклеазной активности, из Bacillus stearothermophilus и Вса ДНК-полимеразы, лишенной 5'3' экзонуклеазной активности, из Bacillus caldotenax. В качестве эндонуклеазы можно использовать эндорибонуклеазу, такую как РНКаза Н. Примером РНКазы Н является РНКаза Н из Escherichia coli, бактерии рода Thermotoga, бактерии рода Thermus, бактерии рода Pyrococcus, бактерии рода Archaeoglobus или бактерии рода Bacillus. В одном из вариантов по восьмому-одиннадцатому аспектам композиция содержит в качестве ДНКполимеразы с активностью замещения цепи Вса ДНК-полимеразу, лишенную 5'3' экзонуклеазной активности, из Bacillus caldotenax, и в качестве эндонуклеазы используют РНКазу Н из Escherichia coli, бактерии рода Pyrococcus или бактерии рода Archaeoglobus. Примером РНКазы Н является РНКаза Н типа I из Escherichia coli или РНКаза Н типа II из бактерии рода Pyrococcus или бактерии рода Archaeoglobus. Композиция по восьмому-одиннадцатому аспектам может содержать ДНК-полимеразу, обладающую эндонуклеазной активностью. В качестве такой ДНК-полимеразы можно использовать Вса ДНКполимеразу, лишенную 5'3' экзонуклеазной активности, из Bacillus caldotenax, которую можно использовать в присутствии вещества, которое дает возможность проявиться эндонуклеазной активности ДНКполимеразы. Примером вещества, дающего возможность проявиться эндонуклеазной активности Вса ДНК-полимеразы, является ион марганца. Композиция по восьмому-одиннадцатому аспектам может содержать вещество, ингибирующее обратно-транскриптазную активность ДНК-полимеразы. Примером вещества, ингибирующего обратнотранскриптазную активность ДНК-полимеразы, является фосфономуравьиная кислота. Кроме того, композиция может содержать аналог дезоксинуклеозидтрифосфата, такой как дезоксиуридитрифосфата или его производное. Двенадцатый аспект настоящего изобретения относится к композиции для амплификации нуклеиновой кислоты по первому-третьему аспектам, содержащей(b) ДНК-полимеразу с активностью замещения цепи. Тринадцатый аспект настоящего изобретения относится к композиции для амплификации нуклеиновой кислоты по четвертому-седьмому аспектам, содержащей(b) ДНК-полимеразу с активностью замещения цепи. В качестве эндонуклеазы для композиции по тринадцатому аспекту можно использовать эндорибонуклеазу, такую как РНКаза Н. В качестве РНКазы Н для композиции по двенадцатому или тринадцатому аспекту, содержащей РНКазу Н, можно использовать РНКазу Н, выбранную из числа РНКаз Н из Escherichia coli, бактерии рода Thermotoga, бактерии рода Thermus, бактерии рода Pyrococcus, бактерии рода Archaeoglobus и бактерии рода Bacillus. Композиция по двенадцатому или тринадцатому аспекту также может содержать буферный компонент, подходящий для реакции амплификации нуклеиновой кислоты. Например, композиция может содержать буферный компонент, выбранный из группы, состоящей из бицина и HEPES. Примером по двенадцатому или тринадцатому аспекту является композиция, содержащая в качестве ДНК-полимеразы с активностью замещения цепи ДНК-полимеразу, выбранную из группы, состоящей из фрагмента Кленова ДНК-полимеразы I из Escherichia coli, Bst ДНК-полимеразы, лишенной 5'3' экзонуклеазной активности, из Bacillus stearothermophilus и Вса ДНК-полимеразы, лишенной 5'3' экзонуклеазной активности, из Bacillus caldotenax. В качестве эндонуклеазы можно использовать эндорибонуклеазу, такую как РНКаза Н. Примером РНКазы Н является РНКаза Н из Escherichia coli, бактерии рода Thermotoga, бактерии рода Thermus, бактерии рода Pyrococcus, бактерии рода Archaeoglobus или бактерии рода Bacillus. В одном из вариантов воплощения композиция по двенадцатому или тринадцатому аспекту содержит в качестве ДНК-полимеразы с активностью замещения цепи Вса ДНК-полимеразу, лишенную 5'3' экзонуклеазной активности, из Bacillus caldotenax, и в качестве эндонуклеазы РНКазу Н из Escherichiacoli, бактерии рода Pyrococcus или бактерии рода Archaeoglobus. Примером РНКазы Н является РНКаза Н типа I из Escherichia coli или РНКаза Н типа II из бактерии рода Pyrococcus или бактерии рода Archaeoglobus. Композиция по двенадцатому или тринадцатому аспектам может содержать ДНК-полимеразу, обладающую эндонуклеазной активностью. В качестве такой ДНК-полимеразы можно использовать Вса ДНК-полимеразу, лишенную 5'3' экзонуклеазной активности, из Bacillus caldotenax, которую можно использовать в присутствии вещества, которое дает возможность проявиться эндонуклеазной активности-7 005739 ДНК-полимеразы. Примером вещества, дающего возможность проявиться эндонуклеазной активности Вса ДНК-полимеразы, является ион марганца. Композиция по двенадцатому или тринадцатому аспектам может содержать вещество, ингибирующее обратно-транскриптазную активность ДНК-полимеразы. Примером вещества, ингибирующего обратно-транскриптазную активность ДНК-полимеразы, является фосфономуравьиная кислота. Кроме того, композиция может содержать аналог дезоксинуклеозидтрифосфата, такой как дезоксиуридинтрифосфат или его производное. Четырнадцатый аспект настоящего изобретения относится к набору для амплификации нуклеиновой кислоты, используемому в способе амплификации нуклеиновой кислоты по первому-третьему аспектам настоящего изобретения, содержащему(b) ДНК-полимеразу с активностью замещения цепи. Пятнадцатый аспект настоящего изобретения относится к набору для амплификации нуклеиновой кислоты, используемому в способе амплификации нуклеиновой кислоты по четвертому-седьмому аспектам настоящего изобретения, содержащему(b) ДНК-полимеразу с активностью замещения цепи. В качестве эндонуклеазы для композиции по пятнадцатому аспекту можно использовать эндорибонуклеазу, такую как РНКаза Н. Примером набора по четырнадцатому или пятнадцатому аспекту, содержащего РНКазу Н, является набор, содержащий РНКазу Н, выбранную из группы, состоящей из РНКазы Н из Escherichia coli,РНКазы Н из бактерии рода Thermotoga, РНКазы Н из бактерии рода Thermus, РНКазы Н из бактерии рода Pyrococcus, РНКазы Н из бактерии рода Archaeoglobus и РНКазы Н из бактерии рода Bacillus. Набор по четырнадцатому или пятнадцатому аспекту также может содержать буферный компонент,подходящий для реакции амплификации нуклеиновой кислоты. Например, композиция может содержать буферный компонент, выбранный из группы, состоящей из бицина и HEPES. Набор также может содержать раствор для отжига, содержащий вещество, усиливающее отжиг нуклеиновой кислоты, используемой как матрица, с праймером, существенно комплементарным нуклеотидной последовательности нуклеиновой кислоты. Например, раствор для отжига может содержать спермидин и/или пропилендиамин. Примером ДНК-полимеразы с активностью замещения цепи, входящей в состав набора по четырнадцатому или пятнадцатому аспекту, является ДНК-полимераза, выбранная из группы, состоящей из фрагмента Кленова ДНК-полимеразы I из Escherichia coli, Bst ДНК-полимеразы, лишенной 5'3' экзонуклеазной активности, из Bacillus stearothermophilus и Вса ДНК-полимеразы, лишенной 5'3' экзонуклеазной активности, из Bacillus caldotenax. В одном из вариантов набор по четырнадцатому или пятнадцатому аспекту содержит Вса ДНКполимеразу, лишенную 5'3' экзонуклеазной активности, из Bacillus caldotenax, и РНКазу Н из Escherichia coli, бактерии рода Pyrococcus или бактерии рода Archaeoglobus. Примером РНКазы Н является РНКаза Н типа I из Escherichia coli или РНКаза Н типа II из бактерии рода Pyrococcus или бактерии родаArchaeoglobus. Набор по четырнадцатому или пятнадцатому аспектам настоящего изобретения может содержать ДНК-полимеразу, обладающую эндонуклеазной активностью. В качестве такой ДНК-полимеразы можно использовать Вса ДНК-полимеразу, лишенную 5'3' экзонуклеазной активности, из Bacillus caldotenax. Набор может содержать вещество, дающее возможность проявиться эндонуклеазной активности ДНКполимеразы. Примером вещества, дающего возможность проявиться эндонуклеазной активности Вса ДНК-полимеразы, является ион марганца. Набор по четырнадцатому или пятнадцатому аспектам может содержать вещество, ингибирующее обратно-транскриптазную активность ДНК-полимеразы. Примером вещества, ингибирующего обратнотранскриптазную активность ДНК-полимеразы, является фосфономуравьиная кислота. Кроме того, набор может содержать аналог дезоксинуклеозидтрифосфата, такой как дезоксиуридинтрифосфат или его производное. Шестнадцатый аспект настоящего изобретения относится к набору для амплификации нуклеиновой кислоты, используемому в способе амплификации нуклеиновой кислоты по первому-третьему аспектам настоящего изобретения, находящемуся в упакованной форме и содержащему инструкции по применению ДНК-полимеразы с активностью замещения цепи и РНКазы Н. Семнадцатый аспект настоящего изобретения относится к набору для амплификации нуклеиновой кислоты, используемому в способе амплификации нуклеиновой кислоты по четвертому-седьмому аспектам настоящего изобретения, находящемуся в упакованной форме и содержащему инструкции по применению ДНК-полимеразы с активностью замещения цепи и эндонуклеазы. Восемнадцатый аспект настоящего изобретения относится к продукту с реагентом для амплификации нуклеиновой кислоты, состоящему из упаковки и реагента для амплификации нуклеиновой кислоты,заключенного в упаковку, где реагент для амплификации нуклеиновой кислоты содержит ДНК-8 005739 полимеразу с активностью замещения цепи и/или РНКазу Н, и на этикетке, наклеенной на упаковку, или в инструкциях, прилагаемых к упаковке, содержится описание того, что реагент для амплификации нуклеиновой кислоты можно использовать для амплификации нуклеиновой кислоты в изотермических условиях. Девятнадцатый аспект настоящего изобретения относится к продукту с реагентом для амплификации нуклеиновой кислоты, состоящему из упаковки и реагента для амплификации нуклеиновой кислоты,заключенного в упаковку, где реагент для амплификации нуклеиновой кислоты содержит ДНКполимеразу, обладающую активностью замещения цепи, и/или эндонуклеазу, и на этикетке, наклеенной на упаковку, или в инструкциях, прилагаемых к упаковке, содержится описание того, что реагент для амплификации нуклеиновой кислоты можно использовать для амплификации нуклеиновой кислоты в изотермических условиях. Двадцатый аспект настоящего изобретения относится к способу детекции в образце нуклеиновой кислоты-мишени, включающему(a) амплификацию нуклеиновой кислоты способом амплификации нуклеиновой кислоты по первому-седьмому аспектам настоящего изобретения и(b) детекцию нуклеиновой кислоты-мишени, амплифицированной на стадии (а). Способ детекции по двадцатому аспекту настоящего изобретения может включать детекцию амплифицированной нуклеиновой кислоты с использованием зонда для детекции. Зонд может представлять собой зонд, меченный веществом-меткой. Например, можно использовать РНК-зонд, меченный двумя или большим числом флуоресцентных веществ, пространственно разнесенных так, что происходит тушение. Двадцать первый аспект настоящего изобретения относится к химерному олигонуклеотидному праймеру, используемому для двадцатого аспекта. Примером химерного олигонуклеотидного праймера является праймер, представленный общей формулой, приведенной ниже,общая формула: 5'-dNa-Nb-dNc-3',где (а: целое число 11 или большее; b: целое число 1 или большее; с: 0 или целое число 1 или большее;dN: дезоксирибонуклеотид и/или нуклеотидный аналог; N: немодифицированный рибонуклеотид и/или модифицированный рибонуклеотид, причем некоторые из dN в dNa могут быть заменены на N, и нуклеотид на 3'-конце может быть модифицирован, так что достраивание на 3'-конца под действием ДНКполимеразы не происходит). Примерами таких химерных олигонуклеотидных праймеров являются праймер, в котором с равно 0,и праймер, в котором нуклеотидный аналог представляет собой дезоксирибоинозиннуклеотид или дезоксирибоурацилнуклеотид, и модифицированный рибонуклеотид представляет собой (-S)-рибонуклеотид. Примером праймера по двадцать первому аспекту настоящего изобретения является праймер для детекции патогенного микроорганизма или связанного с заболеванием гена. Настоящее изобретение охватывает химерные олигонуклеотидные праймеры для детекции патогенных микроорганизмов, таких как энтерогеморрагическая Escherichia coli, Clostridium botulinum, Staphylococcus aureus, Mycobacterium tuberculosis, Chlamydia, вирус папилломы, вирус гепатита С или вироид. Двадцать второй аспект настоящего изобретения относится к химерному олигонуклеотидному праймеру для детекции энтерогеморрагической Escherichia coli, имеющему нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID No 31-34, 47, 48, 51-53, 64-72, 84, 85, 113, 114,130 и 131. Двадцать третий аспект настоящего изобретения относится к химерному олигонуклеотидному праймеру для детекции вироида, имеющему нуклеотидную последовательность, выбранную из группы,состоящей из SEQ ID No 59, 60, 119, 120, 122 и 123. Двадцать четвертый аспект настоящего изобретения относится к химерному олигонуклеотидному праймеру для детекции Clostridium botulinum, имеющему нуклеотидную последовательность, представленную SEQ ID No 116 или 117. Двадцать пятый аспект настоящего изобретения относится к химерному олигонуклеотидному праймеру для детекции вируса папилломы, имеющему нуклеотидную последовательность, представленную SEQ ID No 96 или 97. Двадцать шестой аспект настоящего изобретения относится к химерному олигонуклеотидному праймеру для детекции вируса гепатита С, имеющему нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID No 101, 102, 138, 139, 200, 201, 205 и 206. Двадцать седьмой аспект настоящего изобретения относится к химерному олигонуклеотидному праймеру для детекции Staphylococcus aureus, имеющему нуклеотидную последовательность, представленную SEQ ID No 136 или 137. Двадцать восьмой аспект настоящего изобретения относится к химерному олигонуклеотидному праймеру для детекции Mycobacterium tuberculosis, имеющему нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID No 155, 156, 159-162, 194 и 195. Двадцать девятый аспект настоящего изобретения относится к химерному олигонуклеотидному праймеру для детекции Chlamydia, имеющему нуклеотидную последовательность, выбранную из груп-9 005739 пы, состоящей из SEQ ID No 157, 158, 203 и 204. Тридцатый аспект настоящего изобретения относится к набору для амплификации нуклеиновой кислоты, используемому в способе амплификации нуклеиновой кислоты по первому-пятому аспектам настоящего изобретения, содержащему химерный олигонуклеотидный праймер по двадцать первомудвадцать девятому аспектам. Тридцать первый аспект настоящего изобретения относится к набору для детекции нуклеиновой кислоты-мишени, используемому в способе детекции нуклеиновой кислоты-мишени по двадцатому аспекту настоящего изобретения, содержащему химерный олигонуклеотидный праймер по двадцать первому-двадцать девятому аспектам. Тридцать второй аспект настоящего изобретения относится к зонду, используемому в способе по двадцатому аспекту. Тридцать третий аспект настоящего изобретения относится к зонду, гибридизующемуся с нуклеиновой кислотой, амплифицированной по способу по первому-седьмому аспектам. Тридцать четвертый аспект настоящего изобретения относится к зонду, гибридизующемуся с фрагментом, амплифицированным с использованием химерного олигонуклеотидного праймера по двадцать первому-двадцать девятому аспектам. Зонд по тридцать второму-тридцать четвертому аспектам может представлять собой зонд, меченный веществом-меткой, например РНК-зонд, меченный двумя или большим числом флуоресцентных веществ, разнесенных пространственно так, что происходит тушение. Тридцать пятый аспект настоящего изобретения относится к набору, используемому для детекции нуклеиновой кислоты-мишени способом по двадцатому аспекту, содержащему зонд по тридцать второму-тридцать четвертому аспектам. Тридцать шестой аспект настоящего изобретения относится к способу амплификации нуклеиновой кислоты, включающему использование ДНК-полимеразы с активностью замещения цепи, для осуществления реакции переключения матрицы. Примером ДНК-полимеразы с активностью замещения цепи, используемой по тридцать шестому аспекту, является ДНК-полимераза, выбранная из группы, состоящей из фрагмента Кленова ДНКполимеразы I из Escherichia coli, Bst ДНК-полимеразы, лишенной 5'3' экзонуклеазной активности, изBacillus stearothermophilus и Вса ДНК-полимеразы, лишенной 5'3' экзонуклеазной активности, из Bacillus caldotenax. Тридцать седьмой аспект настоящего изобретения относится к способу получения материала, содержащего иммобилизованную нуклеиновую кислоту, в котором нуклеиновая кислота нанесена в виде упорядоченного массива в предварительно заданном месте, включающему(a) амплификацию нуклеиновой кислоты, подлежащей иммобилизации способом амплификации нуклеиновой кислоты по первому-седьмому аспектам настоящего изобретения, и(b) нанесение в виде упорядоченного массива и иммобилизацию нуклеиновой кислоты, амплифицированной на стадии (а), в предварительно заданном месте. Тридцать восьмой аспект настоящего изобретения относится к материалу с иммобилизованной нуклеиновой кислотой, в котором нуклеиновая кислота нанесена в виде упорядоченного массива в предварительно заданном месте, полученному способом по тридцать седьмому аспекту. Тридцать девятый аспект настоящего изобретения относится к способу получения нуклеиновой кислоты в больших количествах, включающему(a) амплификацию нуклеиновой кислоты способом амплификации нуклеиновой кислоты по первому-седьмому аспектам настоящего изобретения и(b) сбор нуклеиновой кислоты, полученной на стадии (а). Сороковой аспект настоящего изобретения относится к способу амплификации нуклеиновой кислоты, включающему(a) дупликацию ДНК или РНК, содержащей последовательность, подлежащую амплификации, для получения нуклеиновой кислоты, используемой как матрица, и(b) амплификацию нуклеиновой кислоты, используемой как матрица, полученной на стадии (а),способом амплификации нуклеиновой кислоты по первому-седьмому аспектам. Сорок первый аспект настоящего изобретения относится к способу определения нуклеотидной последовательности нуклеиновой кислоты, включающему амплификацию нуклеиновой кислоты согласно способу по первому-седьмому, тридцать девятому или сороковому аспектам. Краткое описание чертежей Фиг. 1 иллюстрирует картину электрофореза в агарозном геле амплифицированных фрагментов ДНК, амплифицированных способом настоящего изобретения; фиг. 2 - картину электрофореза в агарозном геле амплифицированных фрагментов ДНК, амплифицированных способом настоящего изобретения; фиг. 3 - картину электрофореза в агарозном геле амплифицированных фрагментов ДНК, амплифицированных способом настоящего изобретения; фиг. 4 - картину электрофореза в агарозном геле амплифицированных фрагментов ДНК, амплифи- 10005739 цированных способом настоящего изобретения; фиг. 5 - картину электрофореза в агарозном геле амплифицированных фрагментов ДНК, амплифицированных способом настоящего изобретения; фиг. 6 - картину электрофореза в агарозном геле амплифицированных фрагментов ДНК, амплифицированных способом настоящего изобретения; фиг. 7 - картину электрофореза в агарозном геле амплифицированных фрагментов ДНК, амплифицированных способом настоящего изобретения; фиг. 8 - картину электрофореза в агарозном геле амплифицированных фрагментов ДНК, амплифицированных способом настоящего изобретения; фиг. 9 - картину электрофореза в агарозном геле амплифицированных фрагментов ДНК, амплифицированных способом настоящего изобретения; фиг. 10 - картину электрофореза в агарозном геле амплифицированных фрагментов ДНК, амплифицированных способом настоящего изобретения. A: ICAN; В: ПЦР; фиг. 11 - картину электрофореза в агарозном геле амплифицированных фрагментов ДНК, амплифицированных способом настоящего изобретения; фиг. 12 - картину электрофореза в агарозном геле амплифицированных фрагментов ДНК, амплифицированных способом настоящего изобретения; фиг. 13 - картину электрофореза в агарозном геле амплифицированных фрагментов ДНК, амплифицированных способом настоящего изобретения; фиг. 14 - картину электрофореза в агарозном геле амплифицированных фрагментов ДНК, амплифицированных способом настоящего изобретения; фиг. 15 - картину электрофореза в агарозном геле амплифицированных фрагментов ДНК, амплифицированных способом настоящего изобретения; фиг. 16 - картину электрофореза в агарозном геле амплифицированных фрагментов ДНК, амплифицированных способом настоящего изобретения; фиг. 17 - картину электрофореза в агарозном геле амплифицированных фрагментов ДНК, амплифицированных способом настоящего изобретения; фиг. 18 - картину электрофореза в агарозном геле амплифицированных фрагментов ДНК, амплифицированных способом настоящего изобретения; фиг. 19 - картину электрофореза в агарозном геле амплифицированных фрагментов ДНК, амплифицированных способом настоящего изобретения; фиг. 20 - картину электрофореза в агарозном геле амплифицированных фрагментов ДНК, амплифицированных способом настоящего изобретения; фиг. 21 - картину электрофореза в агарозном геле амплифицированных фрагментов ДНК, амплифицированных способом настоящего изобретения; фиг. 22 - картину электрофореза в агарозном геле амплифицированных фрагментов ДНК, амплифицированных способом настоящего изобретения; фиг. 23 - картину электрофореза в агарозном геле амплифицированных фрагментов ДНК, амплифицированных способом настоящего изобретения; фиг. 24 - картину электрофореза в агарозном геле амплифицированных фрагментов ДНК, амплифицированных способом настоящего изобретения; фиг. 25 - картину электрофореза в агарозном геле амплифицированных фрагментов ДНК, амплифицированных способом настоящего изобретения; фиг. 26 - картину электрофореза в агарозном геле амплифицированных фрагментов ДНК, амплифицированных способом настоящего изобретения; фиг. 27 - картину электрофореза в агарозном геле амплифицированных фрагментов ДНК, амплифицированных способом настоящего изобретения; фиг. 28 - картину электрофореза в агарозном геле амплифицированных фрагментов ДНК, амплифицированных способом настоящего изобретения, и картину дот-блоттинг гибридизации; фиг. 29 - картину электрофореза в агарозном геле амплифицированных фрагментов ДНК, амплифицированных способом настоящего изобретения; фиг. 30 представляет собой диаграмму, на которой сравниваются количества продуктов амплификации, амплифицированных способом настоящего изобретения и при помощи ПЦР; фиг. 31 иллюстрирует картину электрофореза в агарозном геле амплифицированных фрагментов ДНК, амплифицированных способом настоящего изобретения; фиг. 32 - картину электрофореза в полиакриламидном геле амплифицированных фрагментов ДНК,амплифицированных способом настоящего изобретения; фиг. 33 - один из аспектов способа амплификации нуклеиновой кислоты настоящего изобретения; фиг. 34 - один из аспектов способа амплификации нуклеиновой кислоты настоящего изобретения; фиг. 35 - один из аспектов способа амплификации нуклеиновой кислоты настоящего изобретения; фиг. 36 - один из аспектов способа амплификации нуклеиновой кислоты настоящего изобретения; фиг. 37 - картину электрофореза в агарозном геле амплифицированных фрагментов ДНК, амплифи- 11005739 цированных способом настоящего изобретения; фиг. 38 - картину электрофореза в агарозном геле амплифицированных фрагментов ДНК, амплифицированных способом настоящего изобретения; фиг. 39 - картину электрофореза в агарозном геле амплифицированных фрагментов ДНК, амплифицированных способом настоящего изобретения. Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретения В контексте данного изобретения дезоксирибонуклеотид (также обозначаемый как dN) относится к нуклеотиду, в котором углеводная часть представлена D-2-дезоксирибозой. Дезоксирибонуклеотиды включают, например, дезоксирибонуклеотиды, содержащие в качестве основания аденин, цитозин, гуанин или тимин. Кроме того, дезоксирибонуклеотиды также включают дезоксирибонуклеотид, содержащий модифицированное основание, такое как 7-деазагуанозин, и аналог дезоксирибонуклеотида, такой как дезоксиинозиннуклеотид. В контексте данного изобретения рибонуклеотид (также обозначаемый как N) относится к нуклеотиду, в котором углеводная часть представлена D-рибозой. Рибонуклеотиды включают, например, рибонуклеотиды, содержащие в качестве основания аденин, цитозин, гуанин или урацил. Рибонуклеотиды также включают модифицированные рибонуклеотиды, такие как модифицированный рибонуклеотид, в котором атом кислорода фосфатной группы в -положении заменен на атом серы (называемый также (S)-рибонуклеотидом или (-S)N), или другие производные. В контексте данного изобретения химерный олигонуклеотидный праймер относится к праймеру,содержащему дезоксирибонуклеотид и рибонуклеотид. Праймер может содержать нуклеотидный аналог и/или модифицированный рибонуклеотид. Химерные олигонуклеотидные праймеры, используемые в настоящем изобретении, включают любые химерные олигонуклеотидные праймеры, содержащие рибонуклеотид, расположенный на 3'-конце или в 3'-концевой области праймера, и могут использоваться для наращивания цепи нуклеиновой кислоты по способу настоящего изобретения, могут расщепляться эндонуклеазой и могут использоваться для осуществления реакции замещения цепи. В контексте данного изобретения 3'-концевая область означает часть от центра к 3'-концу нуклеиновой кислоты, такой как праймер. Аналогично, 5'-концевая область означает часть от центра к 5'-концу нуклеиновой кислоты. В контексте данного изобретения эндонуклеаза может представлять собой любую эндонуклеазу,действующую на двухцепочечную ДНК, полученную путем достраивания ДНК с химерного олигонуклеотидного праймера, отожженного с нуклеиновой кислотой, используемой как матрица, и специфически расщепляющую ее по участку праймера, содержащему рибонуклеотид. В контексте данного изобретения ДНК-полимераза относится к ферменту, синтезирующему цепь ДНК de novo с использованием цепи ДНК как матрицы. К ДНК-полимеразам относятся ДНКполимеразы, встречающиеся в природе, и варианты ферментов, обладающие вышеуказанной активностью. Например, к таким ферментам относится ДНК-полимераза с активностью замещения цепи, ДНКполимераза, лишенная 5'3' экзонуклеазной активности, и ДНК-полимераза, обладающая активностью обратной транскриптазы или эндонуклеазной активностью. В контексте данного изобретения термин "активность замещения цепи" относится к активности, которая может приводить к замещению цепи, т.е. которая может осуществлять дупликацию ДНК на основе нуклеотидной последовательности, служащей матрицей, в то же время замещая цепь ДНК, с высвобождением комплементарной цепи, которая была отожжена с матричной целью. Кроме того, цепь ДНК, высвобождаемая из нуклеиновой кислоты, служащей матрицей, в результате замещения цепи, в данном описании обозначается как "замещенная цепь". Далее настоящее изобретение будет описано подробнее.(1). Химерный олигонуклеотидный праймер, используемый в настоящем изобретении. Праймер, используемый в способе настоящего изобретения, представляет собой химерный олигонуклеотидный праймер, содержащий рибонуклеотид, а также по меньшей мере один компонент, выбранный из группы, состоящей из дезоксирибонуклеотида и нуклеотидного аналога. К таким праймерам также относится олигорибонуклеотидный праймер, содержащий немодифицированный рибонуклеотид и/или модифицированный рибонуклеотид. Химерный олигонуклеотидный праймер, используемый в настоящем изобретении, представляет собой химерный олигонуклеотидный праймер, имеющий нуклеотидную последовательность, существенно комплементарную фрагменту нуклеотидной последовательности нуклеиновой кислоты, используемой как матрица. Он может вносить вклад в наращивание цепи ДНК в используемых условиях. Кроме того,рибонуклеотид располагается на 3'-конце или в 3'-концевой области химерного олигонуклеотидного праймера. Как правило, праймер конструируют таким образом, чтобы он был комплементарен участку,расположенному выше (upstream), относительно участка, подлежащего амплификации, т.е. участку,находящемуся в 3'-положении по отношению к нуклеотидной последовательности, соответствующей участку, подлежащему амплификации, в нуклеиновой кислоте, используемой как матрица. Используе- 12005739 мый в данном описании термин "существенно комплементарная нуклеотидная последовательность" означает нуклеотидную последовательность, которая может отжигаться с ДНК, используемой как матрица,в используемых условиях реакции. Химерный олигонуклеотидный праймер, используемый в способе настоящего изобретения, может содержать один или несколько модифицированных рибонуклеотидов. В контексте данного изобретения рибонуклеотид может представлять собой немодифицированный рибонуклеотид и/или модифицированный рибонуклеотид, который может располагаться на 3'-конце или в 3'-концевой области химерного олигонуклеотидного праймера, и который узнается или расщепляется эндонуклеазой. Рибонуклеотиды включают как немодифицированные рибонуклеотиды, так и модифицированные рибонуклеотиды, как описано выше. Немодифицированный рибонуклеотид, модифицированный рибонуклеотид или их сочетание могут быть использованы для химерного олигонуклеотидного праймера настоящего изобретения до тех пор,пока они не уничтожают функцию праймера. Примерами модифицированных рибонуклеотидов являются(-S)-рибонуклеотид, в котором атом кислорода, связанный с фосфатной группой, заменен на атом серы,и рибонуклеотид, в котором гидроксигруппа в положении 2 рибозы заменена на метоксигруппу, но не ограничиваясь ими. Такой химерный олигонуклеотидный праймер, содержащий модифицированный рибонуклеотид, можно получить, используя, например, (-S)-рибонуклеозидтрифосфат, который получают способом с использованием реагента для реакции сульфурирования (Glen Research), как описано в патенте США 5003097, или реагента 2-ОМе-РНК-цианоэтилфосфоамидита (Glen Research). Можно сконструировать химерный олигонуклеотидный праймер, который можно использовать в способе амплификации по настоящему изобретению, так, чтобы он содержал модифицированный рибонуклеотид, придающий устойчивость к расщеплению эндонуклеазой. Такой праймер полезен в том отношении, что можно контролировать сайт расщепления эндонуклеазой во время стадий реакции амплификации. В способе настоящего изобретения можно использовать один или два химерных олигонуклеотидных праймера, в зависимости от требуемой формы фрагмента ДНК после амплификации (одноцепочечной или двухцепочечной). Конкретно, используют один химерный олигонуклеотидный праймер, когда нужна одноцепочечная ДНК, тогда как два праймера используют, когда нужна двухцепочечная ДНК. Длина химерного олигонуклеотидного праймера, используемого в способе настоящего изобретения,конкретно не ограничивается, но предпочтительно составляет от примерно 12 нуклеотидов до примерно 100 нуклеотидов, предпочтительнее от примерно 15 нуклеотидов до примерно 40 нуклеотидов. Предпочтительно, чтобы нуклеотидная последовательность химерного олигонуклеотида была существенно комплементарной нуклеиновой кислоте, используемой как матрица, так что он отжигается с нуклеиновой кислотой, используемой как матрица, в используемых условиях реакции. Праймер содержит на 3'-конце или в 3'-концевой области последовательность, узнаваемую эндонуклеазой, которая используется на стадии, описываемой ниже. Например, в способе синтеза ДНК настоящего изобретения в качестве праймера можно использовать олигонуклеотид структуры, представленной приведенной далее общей формулой, хотя имеется в виду, что она не предназначена для ограничения настоящего изобретения. Общая формула: 5'-dNa-Nb-dNc-3',где (а: целое число 11 или большее; b: целое число 1 или большее; с: 0 или целое число 1 или большее;dN: дезоксирибонуклеотид и/или нуклеотидный аналог; N: немодифицированный рибонуклеотид и/или модифицированный рибонуклеотид, причем некоторые из dN в dNa могут быть заменены на N, и нуклеотид на 3'-конце может быть модифицирован, так что достраивание с 3'-конца под действием ДНКполимеразы не происходит). Например, в настоящем изобретении предпочтительно можно использовать химерный олигонуклеотидный праймер, представленный общей формулой, где а = целому числу 11 или большему, и b = 1 и с= 0, или b = 2 и с = 0, или b = 3-5 и с = 0, или b = 2 и с = 0-5. Длина рибонуклеотидного звена на 3'-конце или в 3'-концевой области химерного олигонуклеотидного праймера, используемого в способе настоящего изобретения, предпочтительно соответствует 1-меру-15-меру, предпочтительнее 1-меру-10-меру, наиболее предпочтительно 1-меру-5-меру. Число с в общей формуле конкретно не ограничивается, но можно выбрать любое число, которое можно использовать в способе настоящего изобретения. Как правило,предпочтительно число 5 или меньшее. Лучшие результаты реакции получают, выбирая значение с, равное 3, а не 4, равное 2, а не 3, и равное 1, а не 2. В частности, наиболее эффективно реакцию можно осуществить в случае с = 0. Химерный олигонуклеотидный праймер, используемый в способе настоящего изобретения, имеет структуру, в которой эндонуклеаза узнает или расщепляет цепь ДНК, достроенную с праймера с использованием ДНК-полимеразы (достроенная с праймера цепь) по сайту, содержащему рибонуклеотид, располагающийся на 3'-конце или в 3'-концевой области химерного олигонуклеотидного праймера. Хотя настоящее изобретение не предполагается ограничить случаем, когда, например, РНКаза Н действует на двухцепочечную ДНК, образовавшуюся путем достраивания ДНК с химерного олигонуклеотидного- 13005739 праймера, представленного приведенной выше общей формулой, отожженного с нуклеиновой кислотой,используемой как матрица, химерный олигонуклеотидный праймер расщепляется по рибонуклеотидной части. Затем получают двухцепочечную ДНК, в которую вводят ник (одноцепочечный разрыв) между олигонуклеотидным праймером и цепью ДНК, синтезированной путем наращивания. Затем из ник-сайта с помощью ДНК-полимеразы проводят реакцию замещения цепи. Таким образом, в способе настоящего изобретения можно использовать любой химерный олигонуклеотидный праймер, который можно использовать для достраивания цепи нуклеиновой кислоты с 3'-конца праймера, который можно расщепить эндонуклеазой и с которым ДНК-полимераза может осуществлять реакцию замещения цепи. Кроме того,к химерным олигонуклеотидным праймерам настоящего изобретения относятся праймеры, 3'-концы которых модифицированы, так что достраивания под действием ДНК-полимеразы не происходит, и достраивание ДНК происходит с 3'-конца, образованного в результате расщепления эндонуклеазой. Кроме того, в 5'-концевую область химерного олигонуклеотидного праймера может быть включена промоторная последовательность для РНК-полимеразы. Примерами таких РНК-полимераз являются РНК-полимераза фага Т 7 и РНК-полимераза фага SP6. Кроме того, химерный олигонуклеотидный праймер, используемый в способе настоящего изобретения, может содержать нуклеотидный аналог или другие вещества. Иными словами, в химерном олигонуклеотидном праймере настоящего изобретения могут содержаться один или несколько нуклеотидных аналогов до тех пор, пока сохраняется способность праймера к осуществлению реакции достраивания полимеризацией с 3'-конца под действием ДНК-полимеразы. Можно использовать несколько типов нуклеотидных аналогов в сочетании. Примерами нуклеотидных аналогов являются дезоксиинозиннуклеотид, дезоксиурацилнуклеотид, нуклеотидный аналог с модифицированным основанием, таким как 7 деазагуанин, нуклеотидный аналог, содержащий производное рибозы, и т.п., но не ограничиваются ими. Кроме того, химерные олигонуклеотидные праймеры, используемые в настоящем изобретении, могут содержать дезоксинуклеотиды, рибонуклеотиды или нуклеотидные аналоги, содержащие различные модификации, такие как присоединение меченных соединений, до тех пор, пока они сохраняют функции,описанные выше. Введение нуклеотидного аналога в праймер эффективно для подавления образования структуры высшего порядка самого праймера и стабилизации отжига с матрицей. Рибонуклеотид можно ввести в праймер для такой же цели. Хотя не имеется в виду ограничение настоящего изобретения, предпочтительно можно использовать модифицированный рибонуклеотид, такой как (-S)-рибонуклеотид, для того, чтобы предотвратить расщепление праймера неспецифической эндонуклеазой (РНКазой). Химерный олигонуклеотидный праймер, содержащий нужную нуклеотидную последовательность,можно синтезировать с использованием, например, синтезатора ДНК типа 394 производства Applied Biosystems Inc. (ABI), согласно фосфоамидитному методу. С другой стороны, для синтеза химерного олигонуклеотидного праймера можно использовать любые способы, включая фосфаттриэфирный способ, Нфосфонатный способ и тиофосфонатный способ.(2). Эндонуклеаза, используемая в настоящем изобретении. В настоящем изобретении можно использовать любую эндонуклеазу, которая может действовать на двухцепочечную ДНК, полученную достраиванием ДНК с химерного олигонуклеотидного праймера, как описано выше в (1), который отжигается с нуклеиновой кислотой, используемой как матрица, и расщеплять достроенную цепь для осуществления реакции замещения цепи. Иными словами, эндонуклеаза представляет собой фермент, который может вносить ник (одноцепочечный разрыв) в участок двухцепочечной ДНК, соответствующий химерному олигонуклеотидному праймеру. Примерами эндонуклеаз,которые можно использовать в настоящем изобретении, но не ограничиваясь ими, являются рибонуклеазы. Из них предпочтительно можно использовать эндорибонуклеазу Н (РНКазу Н), которая действует на РНК-часть двухцепочечной нуклеиновой кислоты, состоящей из ДНК и РНК. Любую рибонуклеазу, обладающую вышеуказанными активностями, можно предпочтительно использовать в настоящем изобретении, включая мезофильные и термоустойчивые рибонуклеазы. Например, РНКазу Н из Е. coli можно использовать в способе настоящего изобретения для реакции при примерно 50-70 С, как описывается ниже в примерах. Термоустойчивые рибонуклеазы предпочтительно можно использовать в способе настоящего изобретения. Примерами термоустойчивых рибонуклеаз, которые можно предпочтительно использовать, но не ограничиваясь ими, являются коммерчески доступная рибонуклеаза-термоустойчивая РНКаза Н Hybridase (Epicenter Technologies), а также РНКаза Н из термофильной бактерии рода Bacillus, бактерии рода Thermus, бактерии рода Pyrococcus, бактерии рода Thermotoga, бактерии рода Archaeoglobus или подобной бактерии. Кроме того, можно предпочтительно использовать как рибонуклеазы, встречающиеся в природе, так и варианты. Единица активности фермента РНКазы, указанная в данном описании, является величиной, выраженной согласно методу определения единицы активности фермента, описанному в ссылочных примерах. Конкретных ограничений для РНКазы Н не существует до тех пор, пока ее можно использовать в способе настоящего изобретения. Например, РНКаза Н может происходить из разных вирусов, фагов,прокариот или эукариот. Она может представлять собой или клеточную РНКазу, или вирусную РНКазу. Примером клеточной РНКазы Н является РНКаза HI из Escherichia coli, и примером вирусной РНКазы Н- 14005739 является РНКаза ВИЧ-1. В способе настоящего изобретения можно использовать РНКазу Н типа I, типаII или типа III. Например, предпочтительны без ограничений РНКаза HI из Escherichia coli или РНКаза НII из бактерии рода Pyrococcus или бактерии рода Archaeoglobus. Эффективность реакции расщепления эндонуклеазой, такой как РНКаза Н, используемой в способе настоящего изобретения, может изменяться в зависимости от нуклеотидной последовательности вблизи 3'-конца праймера и влиять на эффективность амплификации нужной ДНК. Поэтому естественно конструировать праймер, оптимальный для используемой РНКазы Н. Используемый в данном описании термин "введение ника" или "введение одноцепочечного разрыва" (nicking), означает внутреннее расщепление одной из двух цепей двухцепочечной нуклеиновой кислоты. Например, РНКаза Н действует на гибридную двухцепочечную нуклеиновую кислоту, состоящую из ДНК и рибонуклеотидсодержащей ДНК, селективно расщепляя из двух цепей рибонуклеотидсодержащую цепь по рибонуклеотидной части, посредством чего в гибридную двухцепочечную нуклеиновую кислоту вводится ник.(3). ДНК-полимераза, используемая в настоящем изобретении. В настоящем изобретении можно использовать ДНК-полимеразу, обладающую активностью замещения цепи ДНК. В частности, можно предпочтительно использовать ДНК-полимеразу, лишенную 5'3'-экзонуклеазной активности. Используемый в данном описании термин "активность замещения цепи" относится к активности,которая может осуществлять замещение цепи, т.е. которая может проводить дупликацию ДНК на основе нуклеотидной последовательности, служащей матрицей, в то же время замещая цепь ДНК с высвобождением комплементарной цепи, отожженной с матричной цепью. Кроме того, цепь ДНК, высвобожденная из нуклеиновой кислоты, используемой как матрица, в результате замещения цепи, в данном описании называется "замещенной цепью". В настоящем изобретении можно использовать любую ДНК-полимеразу, обладающую активностью замещения цепи. Ее примерами являются варианты ДНК-полимераз, лишенные 5'3'-экзонуклеазной активности, полученные из термофильных бактерий рода Bacillus, таких как Bacillus caldotenax (далее обозначаемой как В. са), и Bacillus stearothermophilus (далее обозначаемой как В. st) , a также большой фрагмент (фрагмент Кленова) ДНК-полимеразы I из Escherichia coli (E. coli). Как мезофильные, так и термоустойчивые ДНК-полимеразы можно предпочтительно использовать в настоящем изобретении. В.са является термофильной бактерией с оптимальной температурой роста примерно 70 С. Известно, что Вса ДНК-полимераза из этой бактерии обладает ДНК-зависимой ДНК-полимеразной активностью, РНК-зависимой ДНК-полимеразной активностью (обратно-транскриптазной активностью), 5'3'экзонуклеазной активностью и 3'5'-экзонуклеазной активностью. Фермент может представлять собой или фермент, выделенный в чистом виде из источника своего происхождения, или рекомбинантный белок, полученный с использованием методов генной инженерии. Фермент может быть подвергнут модификации, такой как замещение, делеция, присоединение или вставка с использованием методов генной инженерии или других способов. Примером таких ферментов является ДНК-полимераза BcaBEST (Takara Shuzo), представляющая собой Вса ДНК-полимеразу, лишенную ее 5'3'-экзонуклеазной активности. Известно, что некоторые ДНК-полимеразы в определенных условиях обладают эндонуклеазной активностью, такой как активность РНКазы Н. Такую ДНК-полимеразу можно использовать в способе настоящего изобретения. В одном аспекте ДНК-полимеразу можно использовать в условиях, допускающих проявление активности РНКазы Н, например, в присутствии Мn2+. В таком случае способ настоящего изобретения можно осуществлять без добавления РНКазы Н. Авторы изобретения впервые показали, что Вса ДНК-полимераза обнаруживает РНКазную активность в буфере, содержащем Мn2+, и что способ амплификации по настоящему изобретению можно осуществлять в реакционной смеси, не содержащей других ферментов, помимо Вса ДНК-полимераза. Вышеуказанный аспект не ограничивается применением Вса ДНК-полимеразы. В настоящем изобретении можно использовать ДНК-полимеразы, о которых известно, что они обладают активностью РНКазы Н, такие как Tth ДНК-полимераза из Thermus thermophilus.(4). Состав реакционного буфера, используемого в настоящем изобретении. В настоящем изобретении используют реакционный буфер, содержащий буферный компонент, соль магния или другого металла и dNTP. Конечно, тип и концентрацию соли оптимизируют в зависимости от потребностей используемого фермента в металлах и т.п. Примерами буферного компонента, который можно предпочтительно использовать, являются, но не ограничиваются перечисленным, Бицин, Трицин,HEPES, Трис и фосфат (такой как фосфат натрия и фосфат калия). Среди них для настоящего изобретения предпочтителен буфер, содержащий в качестве буферного компонента Бицин, Трицин, HEPES или фосфат. Например, но без намерения ограничивать настоящее изобретение, когда температура реакции высокая, предпочтительно использовать бициновый буфер, рН которого мало изменяется с изменением температуры. Буфер HEPES может быть предпочтительным в зависимости от типа используемой РНКазы Н. Таким образом, оптимальный буфер можно выбирать в зависимости от температуры реакции,- 15005739 используемых эндонуклеазы или ДНК-полимеразы и т.п. Конечная концентрация буферного компонента колеблется от 5 до 100 мМ, предпочтительно в интервале 20-50 мМ. Величина рН колеблется от 6,0 до 9,5, предпочтительно от 7,0 до 9,2. Например, предпочтительно используют буфер, содержащий 22-46 мМ Трицина с рН 7,5-9,2, или буфер, содержащий 2550 мМ фосфата калия с рН 7,0-8,0. Примерами солей магния, которые можно использовать, предпочтительно являются, но не ограничиваются перечисленным, хлорид магния, ацетат магния или сульфат магния. Конечная концентрация соли магния колеблется от 1 до 20 мМ, предпочтительно от 2 до 10 мМ. Конечная концентрация dNTP (смесь dATP, dCTP, dGTP и dTTP) в смеси как субстратов для реакции достраивания ДНК колеблется от 0,1 до 3,0 мМ, предпочтительно от 0,2 до 1,2 мМ. Количество праймеров, используемых в реакционном объеме 50 мкл, колеблется от 1 до 1000 пмоль, предпочтительно от 10 до 150 пмоль. Кроме того, реакционная смесь может содержать добавки, например, для того, чтобы стабилизировать реакцию амплификации. Можно добавлять бычий сывороточный альбумин (БСА) в конечной концентрации 0,1% или менее, диметилсульфоксид (ДМСО) в конечной концентрации 10% или менее, дигидрохлорид путресцина в конечной концентрации 4 мМ или менее или пропилендиамин в конечной концентрации 0,01% или менее. Кроме того, в смеси могут содержаться NMP (1-метил-2 пирролидинон), глицерин, полиэтиленгликоль, диметилсульфоксид и/или -формамид. Ожидается, что добавление такого органического растворителя уменьшает неспецифический отжиг олигонуклеотидных праймеров. Способ настоящего изобретения можно осуществлять, добавляя вещество, ингибирующее обратнотранскриптазную активность ДНК-полимеразы, такое как фосфономуравьиная кислота (PFA). Если добавляют вещество, ингибирующее обратно-транскриптазную активность, уменьшается амплификация неспецифических продуктов, отличающихся от нуклеиновой кислоты-мишени. В другом аспекте отжиг нуклеиновой кислоты, используемой как матрица, с химерным олигонуклеотидным праймером, используемым в настоящем изобретении, перед реакцией амплификации, эффективен для уменьшения неспецифического отжига олигонуклеотидного праймера в способе детекции, амплификации или получения по настоящему изобретению. Предпочтительно проводить отжиг с использованием раствора для отжига, содержащего вещество, усиливающее отжиг, такое как полиамин (например, спермин или спермидин) или пропилендиамин. Предпочтительно раствор для отжига, содержащий полиамин, содержит также соль. Например, без ограничений, раствор для отжига может содержать хлорид натрия, хлорид калия, ацетат калия, ацетат натрия или подобную соль и полиамин. Отжиг обычно проводят путем инкубации раствора для отжига, содержащего праймер и нуклеиновую кислоту, используемую как матрица, при температуре, при которой денатурируется двухцепочечная нуклеиновая кислота (например, при 90 С или выше), и последующего охлаждения раствора до температуры реакции, используемой для способа настоящего изобретения, или до более низкой температуры. После отжига инициируют реакцию амплификации нуклеиновой кислоты, добавляя в смесь другие необходимые компоненты, такие как ДНК-полимераза, РНКаза Н и dNTP. Количество РНКазы Н из Escherichia coli, как пример эндонуклеазы, в реакционном объеме 50 мкл колеблется предпочтительно от 3 до 200 Е, предпочтительнее от 15 до 60 Е. Сходным образом количество РНКазы Н из бактерии рода Pyrococcus или бактерии рода Archaeoglobus, как примеры эндонуклеазы,в реакционном объеме 50 мкл колеблется предпочтительно от 3 до 200 Е, предпочтительнее от 4 до 40 Е. Количество ДНК-полимеразы BcaBEST (Takara Shuzo), как пример эндонуклеазы, в реакционном объеме 50 мкл колеблется предпочтительно от 0,5 до 100 Е, предпочтительнее от 1 до 22 Е. Когда в способе настоящего изобретения используют сочетание эндонуклеазы и ДНК-полимеразы,например, без ограничений, предпочтительно использовать сочетание РНКазы Н из Escherichia coli, бактерии рода Pyrococcus или бактерии рода Archaeoglobus и ДНК-полимеразы BcaBEST. Считается, что предпочтительное количество единиц активности эндонуклеазы и ДНК-полимеразы может меняться в зависимости от типов ферментов. В таком случае состав используемого буфера и количество добавляемых ферментов можно подбирать, ориентируясь на повышение чувствительности детекции или количество продукта амплификации в качестве показателя. В любом случае естественно оптимизировать состав реакционного буфера и т.п. в зависимости от типа используемого фермента.(5). Способ амплификации нуклеиновой кислоты настоящего изобретения. Способ настоящего изобретения можно осуществлять с использованием по меньшей мере одного олигонуклеотидного праймера, описанного выше в (1), в сочетании с эндонуклеазой, описанной выше в(2), и ДНК-полимеразой, описанной выше в (3). С другой стороны, можно использовать ДНКполимеразу, обладающую активностью РНКазы Н, в условиях, позволяющих проявиться активности РНКазы Н, как описано выше.dNTP, используемые для ПЦР, и т.п. (смесь dATP, dCTP, dGTP и dTTP) могут быть предпочтительно использованы в качестве нуклеозидтрифосфатов, служащих в способе в качестве субстратов реакции наращивания. Кроме того, в качестве субстрата можно использовать dUTP. dNTP могут содержать аналог dNTP (дезоксирибонуклеозидтрифосфата), такой как 7-деаза-dGTP, dITP и т.п., до тех пор, пока он может служить субстратом для используемой ДНК-полимеразы. Можно использовать производное dNTP или аналог dNTP. Может содержаться производное с функциональной группой, такое как dUTP, содер- 16005739 жащий аминогруппу. В способе используют химерный олигонуклеотидный праймер. Праймер можно получить, например, с использованием синтезатора ДНК согласно обычному способу синтеза. В способе настоящего изобретения можно использовать сочетание химерного олигонуклеотидного праймера и обычного олигонуклеотидного праймера. Если активность фермента, используемого в реакции, может снизиться в ходе реакции, в способе настоящего изобретения фермент можно добавлять по ходу реакции. Например, без намерения ограничивать настоящее изобретение, во время реакции, в которой используют РНКазу Н, можно дополнительно добавлять РНКазу Н из Escherichia coli. Добавляемый фермент может быть таким же, какой содержится в реакционной смеси в начале реакции, или он может быть другим ферментом, проявляющим такую же активность. Таким образом, тип или свойство добавляемого фермента не ограничивается конкретным одним ферментом до тех пор, пока добавление во время реакции производит действие, такое как повышение чувствительности детекции или повышение количества продукта амплификации. Нуклеиновую кислоту (ДНК или РНК), используемую в способе настоящего изобретения в качестве матрицы, можно получить или выделить из любого образца, который может содержать нуклеиновую кислоту. С другой стороны, образец можно использовать непосредственно при реакции амплификации нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению. Примерами образцов, которые могут содержать нуклеиновую кислоту, являются, но не ограничиваются перечисленным, образцы, полученные из организмов, такие как цельная кровь, сыворотка, лейкоцитная пленка, моча, фекалии, спинномозговая жидкость, семенная жидкость, слюна, ткань (например, раковая ткань или ткань лимфоузлов), и клеточная культура (например, культура клеток млекопитающего или культура бактериальных клеток), образцы, содержащие нуклеиновую кислоту, такие как вироид, вирус, бактерия, гриб, дрожжи, растение или животное, образцы, предположительно загрязненные или инфицированные микроорганизмами, такими как вирусы или бактерии (например, пища или биологическая композиция), и образцы, которые могут содержать микроорганизмы, такие как почва или сточные воды. Образец может представлять собой препарат, содержащий нуклеиновую кислоту, полученную обработкой вышеуказанных образцов известным способом. Примерами препаратов, которые можно использовать в настоящем изобретении, являются продукт разрушения клеток или образец, полученный путем фракционирования такого продукта, нуклеиновая кислота в образце или образец, обогащенный молекулами определенной нуклеиновой кислоты,такой как мРНК. Кроме того, можно предпочтительно использовать нуклеиновую кислоту, такую как ДНК или РНК, полученную амплификацией нуклеиновой кислоты, содержащейся в образце. Препарат, содержащий нуклеиновую кислоту, можно получить из указанных выше материалов с использованием, например, лизиса с детергентом, ультразвука, встряхивания/перемешивания с использованием стеклянных шариков или пресса Френча, без ограничений. В некоторых случаях для способа выгодно дополнительно очистить полученную нуклеиновую кислоту (например, в случае, когда присутствует эндогенная нуклеаза). В таких случаях нуклеиновую кислоту очищают известным способом, таким как фенольная экстракция, хроматография, ионный обмен, гель-электрофорез или центрифугирование в градиенте плотности. Когда нужно амплифицировать нуклеиновую кислоту с последовательностью, происходящей от РНК, способ настоящего изобретения можно осуществлять с использованием в качестве матрицы кДНК,синтезированной в реакции обратной транскрипции, в которой в качестве матрицы используют РНК. В способе настоящего изобретения можно применить любую РНК, для которой можно создать праймер,используемый в реакции обратной транскрипции, включая тотальную РНК в образце, молекулы РНК,такие как мРНК, тРНК и рРНК, а также определенные виды молекул РНК. Любой праймер, который в условиях реакции отжигается с РНК, служащей матрицей, можно использовать в реакции обратной транскрипции. Праймер может представлять собой праймер с олигонуклеотидной последовательностью, комплементарной специфической РНК, используемой как матрица(специфический праймер), олиго-dT (дезокситимин) праймер, и праймер со случайной последовательностью (случайный праймер). С учетом специфического отжига, длина праймера для обратной транскрипции составляет, предпочтительно, 6 нуклеотидов или более, предпочтительнее 9 нуклеотидов или более. С учетом синтеза олигонуклеотида длина составляет предпочтительно 100 нуклеотидов или менее, предпочтительнее 30 нуклеотидов или менее. Химерный олигонуклеотидный праймер можно использовать в качестве праймера для обратной транскрипции. Химерный олигонуклеотидный праймер также можно использовать в качестве праймера в стандартной реакции замещения цепи в способе амплификации нуклеиновой кислоты настоящего изобретения с использованием в качестве матрицы кДНК, полученной после обратной транскрипции. Такой праймер может представлять собой любой праймер, который имеет свойства, описанные выше в (1), и который можно использовать в реакции обратной транскрипции РНК. В реакции обратной транскрипции можно использовать любой фермент, обладающий активностью синтеза кДНК, с использованием РНК в качестве матрицы. Его примерами являются обратные транскриптазы, полученные из различных источников, такие как обратная транскриптаза, происходящая из вируса миелоидного лейкоза птиц (AMV RTase), обратная транскриптаза, происходящая из вируса мышиного лейкоза Молони (MMLV RTase), и обратная транскриптаза из вируса саркомы Рауса 2 (обратная транскриптаза RAV-2). Кроме того, можно использовать ДНК-полимеразу, которая также обладает об- 17005739 ратно-транскриптазной активностью. Для настоящего изобретения предпочтителен фермент, обладающий обратно-транскриптазной активностью при высокой температуре, такой как ДНК-полимераза из бактерии рода Thermus (например, Tth ДНК-полимераза) и ДНК-полимераза из термофильной бактерии рода Bacillus. Например, предпочтительны ДНК-полимеразы из термофильных бактерий рода Bacillus,такие как ДНК-полимераза из В. st (Bst ДНК-полимераза) и Вса ДНК-полимераза, хотя они и не предназначаются для ограничения настоящего изобретения. Например, Вса ДНК-полимераза не требует иона марганца для обратно-транскриптазной реакции. Кроме того, она может синтезировать кДНК, подавляя в то же время образование вторичной структуры РНК, используемой как матрица, в условиях высокой температуры. Как встречающиеся в природе ферменты, так и варианты ферментов с обратнотранскриптазной активностью можно использовать до тех пор, пока они обладают такой активностью. В другом аспекте в способе настоящего изобретения после дупликации ДНК или РНК, содержащей нуклеотидную последовательность, которая должна быть заранее амплифицирована, продукт дупликации можно использовать в качестве нуклеиновой кислоты, служащей матрицей. Примером способа дупликации является, но не ограничивается им, способ, при котором соответствующего хозяина трансформируют вектором, в который встроен фрагмент нуклеиновой кислоты, содержащий амплифицируемую нуклеотидную последовательность, полученный трансформант культивируют, вектор, в который встроен фрагмент нуклеиновой кислоты, содержащий амплифицируемую нуклеотидную последовательность,экстрагируют и используют. Можно использовать любые векторы до тех пор, пока они устойчиво реплицируются в хозяине. Например, предпочтительно использовать вектора серии pUC, серии pBluescript,серии pGEM, вектора космидного типа и вектора фагового типа. Можно использовать любые хозяева до тех пор, пока они могут поддерживать используемые вектора. Например, примером является Escherichiacoli, которая легко культивируется. В другом аспекте способа дупликации после того, как РНК, имеющая нуклеотидную последовательность, которая должна быть амплифицированна, транскрибирована с использованием РНКполимеразы и фрагмента нуклеиновой кислоты, содержащего такую нуклеотидную последовательность,в качестве матрицы, РНК может быть использована в способе настоящего изобретения в качестве матрицы непосредственно или после превращения ее в кДНК в реакции обратной транскрипции. Фрагмент нуклеиновой кислоты, содержащий подлежащую амплификации нуклеотидную последовательность,специально не ограничивается до тех пор, пока он содержит промоторную последовательность для РНКполимеразы. Он может быть встроен в вектор, содержащий промоторную последовательность для РНКполимеразы, лигирован с адаптором или кассетой, содержащими промоторную последовательность для РНК-полимеразы на своих концах, или синтезирован ферментативно с использованием праймера, содержащего промоторную последовательность для РНК-полимеразы, и соответствующей матрицы. Таким образом, фрагмент нуклеиновой кислоты, содержащий подлежащую амплификации нуклеотидную последовательность, можно дуплицировать или амплифицировать в форме РНК с использованием промоторной последовательности для РНК-полимеразы, расположенной так, как описано выше. Любые вектора можно использовать до тех пор, пока они содержат промоторные последовательности для РНКполимераз. Например, предпочтительно использовать вектора серии pUC, серии pBluescript, серииpGEM, вектора космидного типа и вектора фагового типа. Вектор можно предпочтительно использовать в его кольцевой форме или после преобразования в линейную форму. Для способа дупликации или амплификации можно использовать любые РНК-полимеразы. Например, можно предпочтительно использовать РНК-полимеразу фага SP6, РНК-полимеразу фага Т 7, РНК-полимеразу фага Т 3 или подобную РНК-полимеразу. В настоящем изобретении в качестве матрицы можно предпочтительно использовать как двухцепочечную ДНК, такую как геномная ДНК, выделенная так, как описано выше, или фрагмент ПЦР, и одноцепочечную ДНК, такую как кДНК, полученная реакцией обратной транскрипции тотальной РНК или мРНК. Двухцепочечную ДНК предпочтительно используют после ее денатурации до одноцепочечных ДНК или без такой денатурации. В способе амплификации нуклеиновой кислоты настоящего изобретения стадию денатурации можно исключить, если в качестве матрицы используют линейную двухцепочечную ДНК, такую как продукт ПЦР-амплификации. Исключение можно осуществить путем размещения сайта отжига для праймера,используемого в способе настоящего изобретения, примерно на расстоянии 50 оснований от конца ДНК. Если необходимо амплифицировать нуклеиновую кислоту с последовательностью, происходящей от РНК, реакцию амплификации можно инициировать путем добавления двухцепочечной нуклеиновой кислоты РНК-кДНК, полученной в реакции обратной транскрипции с использованием РНК в качестве матрицы, в реакционную смесь для амплификации настоящего изобретения, содержащую РНКазу Н для расщепления цепи РНК и превращения нуклеиновой кислоты в одноцепочечную кДНК. Кроме того, при синтезе ДНК по способу настоящего изобретения реакционно-обратной транскрипции с использованием РНК в качестве матрицы и реакцию амплификации ДНК с использованием в качестве матрицы полученной в реакции обратной транскрипции кДНК можно проводить с одной лишь ДНК-полимеразой. Такая ДНК-полимераза обладает обратно-транскриптазной активностью и активностью замещения цепи. Подходящей длиной матрицы является длина, обеспечивающая достаточное связывание праймер- 18005739 ной последовательности благодаря наличию в фрагменте полной последовательности-мишени или по меньшей мере достаточной части последовательности-мишени. Без ограничений, если ДНК, используемая в качестве матрицы, представляет собой двухцепочечную ДНК, в способе настоящего изобретения ДНК можно денатурировать до одноцепочечных ДНК для того, чтобы позволить праймеру связываться с цепью ДНК, служащей матрицей. Для денатурации предпочтительна инкубация двухцепочечной ДНК при температуре, при которой она денатурируется (например, около 95 С). Другие способы включают процесс, при котором используют повышенный рН. В таком случае рН перед амплификацией необходимо снизить для того, чтобы позволить олигонуклеотидному праймеру связаться с мишенью. Нуклеиновую кислоту непрерывно амплифицируют в изотермических условиях после денатурации двухцепочечной ДНК до одноцепочечных ДНК или, если в качестве матрицы используют РНК, после получения кДНК (одноцепочечной ДНК) в реакции обратной транскрипции."Непрерывно" означает, что реакция протекает без изменения температуры реакции или состава реакционной смеси. Используемый в данном описании термин "изотермические" относится к условиям с существенно постоянной температурой, при которых фермент и цепь нуклеиновой кислоты функционируют на каждой стадии. Реакцию амплификации нуклеиновой кислоты настоящего изобретения можно проводить при обычной температуре (например, 37 С) с использованием мезофильной ДНК-полимеразы, такой как фрагмент Кленова. Ее также можно проводить при высокой температуре (например, 50 С или выше, или 60 С или выше) с использованием термостойких ферментов (эндонуклеазы и ДНК-полимеразы). В таком случае подавляется неспецифический отжиг праймера, что приводит к повышению специфичности амплификации ДНК. Кроме того, решается проблема образования вторичной структуры ДНК, используемой как матрица, что приводит к повышению способности ДНК-полимеразы к наращиванию цепи. По способу можно последовательно проводить реакцию обратной транскрипции амплификацию нуклеиновой кислоты. В таком случае ДНК с последовательностью, происходящей от РНК, можно амплифицировать путем сочетания использования обратной транскриптазы и вышеуказанной реакции или путем использования ДНК-полимеразы с обратно-транскриптазной активностью. В каждом аспекте настоящего изобретения химерный олигонуклеотидный праймер, комплементарный одноцепочечной ДНК как матрице, предпочтительно сначала отжигают с ДНК, хотя это не предполагается как ограничение настоящего изобретения. ДНК, комплементарную ДНК, используемую как матрица (цепь, достроенная с праймера), затем наращивают вдоль остальной последовательности ДНК,используемой как матрица с 3'-конца праймера под действием ДНК-полимеразы, и синтезируют двухцепочечную ДНК. Эндонуклеаза действует на двухцепочечную ДНК и позволяет инициировать вновь наращивание ДНК, начиная с праймерной части достроенной с праймера de novo цепи. В одном аспекте настоящего изобретения эндонуклеаза действует как ник-фермент, вводящий ник в двухцепочечную ДНК, или она изменяет структуру двухцепочечной ДНК, состоящей из химерного олигонуклеотидного праймера и ДНК, используемой как матрица, хотя настоящее изобретение не ограничивается какой-либо теорией. ДНК-полимераза с активностью замещения цепи вновь достраивает цепь ДНК с 3'-конца ника,введенного в двухцепочечную ДНК, с образованием новой достроенной с праймера цепи, причем в то же время высвобождая ДНК ниже (downstream) от 3'-конца ника. Таким образом, новая достроенная с праймера цепь замещает синтезированную ранее достроенную с праймера цепь. Способ амплификации нуклеиновой кислоты настоящего изобретения можно осуществить с использованием двух праймеров, т.е. химерного олигонуклеотидного праймера, комплементарного нуклеиновой кислоте, служащей матрицей, и другого химерного олигонуклеотидного праймера, комплементарного замещенной цепи. В таком случае один праймер связывается с цепью ДНК, служащей матрицей,чтобы вызвать реакцию замещения цепи, в то время как другой праймер связывается с замещенной цепью, высвобождаемой в результате реакции замещения цепи, для инициации другой реакции замещения цепи. Ясно, что продукт реакции с одним праймером может функционировать как матрица для другого праймера, если используется такой аспект. Таким образом, количество продукта амплификации нелинейно возрастает с увеличением количества матрицы. Когда способ амплификации нуклеиновой кислоты настоящего изобретения осуществляют с использованием в качестве матрицы двухцепочечной ДНК, обе цепи могут служить матрицами в реакции амплификации с использованием химерных олигонуклеотидных праймеров, которые отжигаются к соответствующим двум цепям. Если реакцию инициируют после денатурации двухцепочечной ДНК, в реакционную смесь перед или после денатурации двухцепочечной ДНК добавляют химерный олигонуклеотидный праймер, четыре дезоксирибонуклеозидтрифосфата (dNTP), ДНК-полимеразу и эндонуклеазу. Если для денатурации двухцепочечной ДНК используют тепловую обработку и не используют термостойкий фермент, предпочтительно добавлять фермент после денатурации. По аспекту способа амплификации нуклеиновой кислоты настоящего изобретения, когда в качестве матрицы используют двухцепочечную ДНК и используют два химерных олигонуклеотидных праймера,может происходить переключение матриц между промежуточными достроенными с матрицы цепями во время реакции достраивания с праймеров, с образованием двухцепочечной нуклеиновой кислоты, со- 19005739 стоящей из синтезированных достроенных с праймеров цепей, отожженных одна с другой, хотя это зависит от условий реакции и т.п. Двухцепочечная нуклеиновая кислота содержит химерные олигонуклеотидные праймеры по обоим концам. Затем с обоих концов можно снова инициировать реакцию наращивания комплементарных цепей, включая замещение цепи. В результате реакции образуется продукт амплификации, содержащий на одном конце праймерную последовательность. Кроме того, если во время реакции происходит переключение матриц, снова образуется двухцепочечная нуклеиновая кислота, подобная той, что была описана выше. Настоящее изобретение предусматривает способ амплификации нуклеиновой кислоты, включающий использование ДНК-полимеразы с активностью замещения цепи для осуществления реакции переключения матрицы. При реакции переключения матрицы в присутствии двухцепочечной нуклеиновой кислоты, служащей в качестве матрицы, двух химерных олигонуклеотидных праймеров, существенно комплементарных нуклеотидным последовательностям соответствующих цепей, и ДНК-полимеразы с активностью замещения цепи синтезируются две достроенные с праймеров цепи, комплементарные матрице. Во время синтеза достраиваемых с праймеров цепей для каждой достраиваемой с праймера цепи происходит переключение с матрицы на другую достроенную с праймера цепь. Используемый в данном описании термин "реакция переключения матрицы" относится к реакции,при которой, когда комплементарные цепи синтезируются с обеих сторон двухцепочечной нуклеиновой кислоты в реакции замещения цепей, ДНК-полимераза переключает матрицу и затем синтезирует комплементарную цепь с использованием в качестве матрицы другой комплементарной цепи, вновь синтезированной с помощью другой молекулы ДНК-полимеразы. Иными словами, реакция переключения матрицы относится к реакции, при которой двухцепочечную нуклеиновую кислоту, служащую матрицей,обрабатывают праймерами и ДНК-полимеразой с активностью замещения цепи, с образованием достроенных цепей, комплементарных матрице, где ДНК-полимераза, которая синтезирует достроенные с праймеров цепи, во время синтеза достроенных цепей активно переключает матрицу с исходных матриц на другие достроенные с праймеров цепи. Способность ДНК-полимеразы осуществлять реакцию переключения матрицы можно определить, например, согласно способу, описанному ниже в примере 32, хотя такой способ не предназначен для ограничения настоящего изобретения. ДНК-полимеразу, способную осуществлять реакцию переключения матрицы во время реакции замещения цепи, предпочтительно можно использовать для настоящего изобретения. Например, предпочтительно использовать, в частности, фермент Вса ДНК-полимеразу, лишенную 5'3'-эндонуклеазной активности. Такой фермент коммерчески доступен как ДНК-полимераза BcaBEST (Takara Shuzo). Ее также можно выделить из штамма Escherichia coli HB101/pU1205 (FERM BP-3720), который содержит ген для фермента, согласно способу, описанному в патенте Японии 2978001. Штамм Escherichia coliHB101/pU1205 (FERM BP-3720) депонирован в Международном депозитарии патентованных микроорганизмов, (International Patent Organism Depositary, National Institute od Advanced Industrial Science andTechnology, AIST Tsukuba Central 6, 1-1, Higashi 1-chome, Tsukubashi, Ibaraki 305-8566, Япония) с 10 мая 1991 (дата исходного депозита). Без намерения ограничивать настоящее изобретение, далее рассматривается, примерный механизм реакции по способу амплификации нуклеиновой кислоты настоящего изобретения. В способе амплификации нуклеиновой кислоты настоящего изобретения двухцепочечную нуклеиновую кислоту, служащую матрицей обрабатывают в присутствии РНКазы Н двумя химерными олигонуклеотидными праймерами, существенно комплементарными нуклеотидным последовательностям соответствующих цепей, и ДНК-полимеразой с активностью замещения цепи, для синтеза достроенных с праймеров цепей, комплементарных матрице. В результате реакции переключения матрицы могут быть получены двухцепочечная нуклеиновая кислота, состоящая из синтезированных достроенных с праймеров цепей, отжегшихся одна с другой, и двухцепочечная нуклеиновая кислота, состоящая из матриц, отжегшихся одна с другой, с которыми отжигаются два праймера. Последнюю двухцепочечную нуклеиновую кислоту используют повторно в качестве матрицы. Двухцепочечную нуклеиновую кислоту, состоящую из достроенных с праймеров цепей, отжегшихся одна с другой, расщепляют РНКазой Н в сайтах, содержащих рибонуклеотиды. Нуклеиновые кислоты,комплементарные матрице, с использованием ДНК-полимеразы с активностью замещения цепи достраивают с 3'-концов соответствующих праймерных участков двухцепочечной нуклеиновой кислоты, с осуществлением замещения цепей. В результате реакции переключения матрицы могут быть получены двухцепочечная нуклеиновая кислота, состоящая из достроенных с праймеров цепей, отжегшихся одна с другой, и двухцепочечная нуклеиновая кислота, состоящая из матриц, отжегшихся одна с другой, с которой отжигаются оба праймера. Если реакция переключения матрицы не происходит, может быть получено два типа двухцепочечных нуклеиновых кислот, состоящих из матрицы и достроенной с праймера цепи каждая. Нуклеиновые кислоты, комплементарные матрице, для осуществления замещения цепей достраивают с использованием ДНК-полимеразы с активностью замещения цепи с 3'-концов соответствующих праймерных частей двухцепочечной нуклеиновой кислоты, с которой отжигаются два праймера. В результате реакции переключения матрицы могут быть получены двухцепочечная нуклеиновая кислота,- 20005739 состоящая из достроенных с праймеров цепей, отжегшихся одна с другой, и двухцепочечная нуклеиновая кислота, состоящая из матриц, отжегшихся одна с другой, с которой отжигаются два праймера. Двухцепочечная нуклеиновая кислота, с которой отжигаются оба праймера, используется повторно как матрица. Если реакции переключения матрицы не происходит, можно получить два типа двухцепочечных нуклеиновых кислот, состоящих из матрицы и достроенной с праймера цепи каждая. Два типа двухцепочечных нуклеиновых кислот расщепляют РНКазой Н в сайтах, содержащих рибонуклеотиды. Нуклеиновые кислоты, комплементарные матрице, с использованием ДНК-полимеразы с активностью замещения цепи достраивают с 3'-концов соответствующих праймерных частей двухцепочечной нуклеиновой кислоты для осуществления замещения цепей. В способе амплификации нуклеиновой кислоты настоящего изобретения двухцепочечную нуклеиновую кислоту, служащую матрицей, обрабатывают в присутствии РНКазы Н двумя химерными олигонуклеотидными праймерами, существенно комплементарными нуклеотидным последовательностям соответствующих цепей, и ДНК-полимеразой с активностью замещения цепи, и синтезируют достроенные с праймеров цепи, комплементарные матрице. Если реакции переключения матриц не происходит, можно получить два типа двухцепочечных нуклеиновых кислот, состоящих из матрицы и достроенной с праймера цепи каждая. В способе амплификации нуклеиновой кислоты настоящего изобретения цепь, достроенную с химерного олигонуклеотидного праймера, можно расщепить в сайте, содержащем рибонуклеотид, так что 5'-фрагмент (праймерная часть), полученная при расщеплении, не будет содержать рибонуклеотид. Достроенная с праймера цепь, достроенная с образовавшейся таким образом праймерной части, далее не будет расщепляться эндонуклеазой. В результате образуется продукт амплификации, содержащий праймерную последовательность. Как описано выше, методом амплификации нуклеиновых кислот настоящего изобретения можно получить продукт амплификации без праймерной последовательности или продукт, содержащий праймерную(ые) последовательность(и) на одном или обоих концах. Такие продукты в контексте данного изобретения включаются в продукты амплификации. Пример способа амплификации нуклеиновой кислоты настоящего изобретения иллюстрируется фиг. 33-36. Иными словами, фиг. 33-36 иллюстрируют примеры амплификации нуклеиновой кислоты по способу амплификации нуклеиновых кислот настоящего изобретения. Фиг. 33-36 иллюстрируют пример амплификации нуклеиновой кислоты в присутствии в качестве матрицы ДНК, представляющей собой двухцепочечную нуклеиновую кислоту, пары химерных олигонуклеотидных праймеров, синтезированных на основе информации о нуклеотидной последовательности ДНК, используемой как матрица (на фигурах химерные олигонуклеотидные праймеры содержат три рибонуклеотида на своих 3'-концах; незаштрихованные кружочки на фигурах представляют рибонуклеотиды), ДНК-синтетазы (ДНК-полимеразы) с активностью замещения цепи, РНКазы Н, представляющей собой рибонуклеазу, расщепляющую гибридный сайт ДНК-РНК, и dNTP, являющихся субстратами,включаемыми в достроенные цепи. Как видно на фиг. 33, пара химерных олигонуклеотидных праймеров, синтезированных на основе информации о нуклеотидной последовательности ДНК, используемой как матрица, отжигаются к специфическим частям ДНК, служащей матрицей. Цепи ДНК достраиваются с 3'-концов соответствующих химерных олигонуклеотидных праймеров в результате реакции замещения цепи, как показано на стадии 1. Затем, как видно на фиг. 34, некоторые из достроенных с праймеров цепей, достроенные в обратном и прямом направлении, освобождаются от исходных матриц в результате реакции переключения матрицы, как показано на стадии 2. Достроенные с праймеров цепи отжигаются одна с другой в их 3'-частях. Комплементарные цепи наращиваются с отожженных цепей, образуя двухцепочечную ДНК, состоящую из достроенных с праймеров цепей, отжегшихся одна с другой. Кроме того, образуется двухцепочечная ДНК, состоящая из замещенных цепей, отжегшихся одна с другой, с которой отжигается упомянутая выше пара химерных олигонуклеотидных праймеров. Она служит в качестве исходного материала на фиг. 34. Как показано на стадии 3 на фиг. 35, только одна цепь двухцепочечной ДНК на фиг. 34, состоящей из достроенных с праймеров цепей, отжегшихся одна с другой, содержащая РНК, происходящую из химерного олигонуклеотидного праймера, расщепляется под действием РНКазы Н в ДНК/РНК гибридном сайте двухцепочечной ДНК, в результате чего в двухцепочечную ДНК вводится ник. Затем из ника в двухцепочечной ДНК происходит реакция замещения цепи, и ДНК наращивается,как указывается на стадии 4 на фиг. 35. Затем происходит реакция переключения матрицы, подобная реакции на стадии 2 на фиг. 34, в некоторой степени или с некоторой частотой, как указывается на стадии 5 на фиг. 35, результатом чего является двухцепочечная ДНК, состоящая из продуктов амплификации, т.е. достроенных с праймеров цепей, отжегшихся одна с другой. Кроме того, образуется двухцепочечная ДНК, состоящая из замещаемых цепей, отжегшихся одна с другой, с которой отжигается упомянутая выше пара химерных олигонуклеотидных праймеров. Затем, как показано на фиг. 36, в результате реакции замещения цепи ДНК достраиваются с 3'- 21005739 концов соответствующих химерных олигонуклеотидных праймеров в двухцепочечной ДНК на фиг. 35,состоящей из замещаемых цепей, отожженных одна с другой, с которой отжигаются химерные олигонуклеотидные праймеры. В некоторой степени происходит реакция переключения матрицы, подобная реакции на стадии 2 и на стадии 5, результатом которой является двухцепочечная ДНК, состоящая из достроенных с праймеров цепей, отжегшихся одна с другой. Такую двухцепочечную ДНК возвращают на стадию 3, фиг. 35. Снова начинается реакция стадии 3, фиг. 35. Образуется двухцепочечная ДНК, состоящая из замещаемых цепей, отжегшихся одна с другой, с которой отжигается пара химерных олигонуклеотидных праймеров, и используется в качестве исходного материала в реакции, отображенной на фиг. 36. В результате происходит цепная реакция, при которой повторно образуются указанные двухцепочечные нуклеиновые кислоты, приводящая к специфической амплификации и образованию фрагмента,ограниченного парой химерных олигонуклеотидных праймеров. В способе амплификации нуклеиновых кислот настоящего изобретения с использованием химерных олигонуклеотидных праймеров может быть получен полимер, в котором амплифицируемые участки соединены друг с другом. Полимер имеет структуру, в которой множество амплифицируемых участков повторяется в одном и том же направлении. Полимеры обнаруживают при анализе продуктов амплификации методом электрофореза в виде мультимерных полос. Полагают, что на образование таких полимеров влияет амплифицируемый участок, размер участка, фланкирующие области, нуклеотидная последовательность используемого химерного олигонуклеотидного праймера, условия реакции и т.п. Полимер, описанный выше, содержит множество амплифицируемых участков. Например, поскольку при гибридизации с соответствующей пробой он гибридизуется с несколькими пробами и дает интенсивный сигнал, полимер может быть использован, когда имеется ввиду детекция нуклеиновой кислоты,содержащей амплифицируемый фрагмент. Амплифицируемый участок или его часть можно получить в виде мономера из полимера с использованием расщепления рестриктазой или подобного в сочетании. ДНК-полимераза, используемая в настоящем изобретении, должна синтезировать достроенную цепь с 3'-конца праймерной части в прямом направлении (downstream), в то же время замещая достроенную ранее цепь ДНК. Важно, что ДНК-полимераза не должна проявлять 5'3'-экзонуклеазную активность, которая может расщепить замещаемую цепь. Например, в качестве таких ДНК-полимераз могут использоваться фрагмент Кленова, представляющий собой лишенный экзонуклеазы вариант ДНКполимеразы I из Escherichia coli, аналогичный фрагмент, полученный из Bst ДНК-полимеразы (NewEngland Biolabs), и ДНК-полимераза BcaBEST из В.са (Takara Shuzo). Также можно использовать Sequenase 1.0 и Sequenase 2.0 (United States Biochemical) и ДНК-полимеразу фага Т 5 и ДНК-полимеразу фага ф 29, описанную в Gene, 97:13-19 (1991). Полимеразу, обычно обладающую 5'3'-экзонуклеазной активностью, можно использовать в способе настоящего изобретения, если ингибировать такую активность может добавление соответствующего ингибитора. Способ амплификации нуклеиновой кислоты настоящего изобретения можно осуществлять при переменной температуре или его можно осуществлять изотермически. Переменная температура означает,что температура реакции изменяется для соответствующих стадий таким образом, что изменение не мешает реакциям на этих стадиях. Конкретно, переменная температура относится к ее изменению до таких значений, которые будут подходить, например, для отжига праймера, для реакции синтеза комплементарной цепи, для введения ника в комплементарную цепь и для реакции замещения. С другой стороны, термин "изотермическая" означает, что температура реакции для каждой стадии неизменна, и каждую стадию проводят при существенно постоянной температуре. Естественно, что в обоих случаях выбирают температуру так, чтобы оптимизировать условия реакции. Одной из особенностей способа амплификации нуклеиновой кислоты настоящего изобретения является то, что способ не требует повышения и понижения температуры во время синтеза нуклеиновой кислоты. Таким образом, настоящее изобретение относится к способу изотермического синтеза нуклеиновой кислоты. Во многих известных способах амплификации нуклеиновых кислот требуется повышение и понижение температуры для диссоциации мишени от синтезированной цепи. Такие способы требуют специального оборудования для указанной цели, такого как термоциклер. Однако способ настоящего изобретения можно проводить с использованием только оборудования, позволяющего поддерживать постоянную температуру. Как описано выше, способ настоящего изобретения можно осуществлять при одной температуре. Предпочтительно, его осуществляют, выбирая температуру реакции и уровень строгости такими, чтобы уменьшить неспецифический отжиг праймера, и такими, чтобы праймер специфически отжигался к нуклеиновой кислоте, служащей матрицей. Без намерения ограничивать настоящее изобретение, способ настоящего изобретения можно осуществить в условиях высокой температуры, используя термостойкий фермент, как описано выше. Кроме того, предпочтительно осуществлять способ настоящего изобретения при соответствующей температуре для поддержания активности используемого фермента для того, чтобы сохранить эффективность реакции на высоком уровне. Таким образом, температура реакции предпочтительно составляет от примерно 20 до примерно 80 С, предпочтительнее от примерно 30 до примерно 75 С, наиболее предпочтительно от примерно 50 до примерно 70 С, хотя она изменяется в зависимости от используемого фермента. Когда реакцию проводят, в частности, в высоко- 22005739 температурных условиях, предпочтительно использовать более длинный праймер, чем в случае реакции при нормальной температуре. Последовательность и длину праймера, соответствующие температуре реакции, можно определить, например, в соответствии с величиной его температуры плавления Тm. С другой стороны, для создания праймера можно использовать коммерчески доступное программное обеспечение, такое как программа OLIGO Primer Analysis (Takara Shuzo). Например, когда используют температуру реакции 55-60 С или 65 С, праймер, используемый для способа настоящего изобретения, может иметь, например, без ограничений, длину 12-100 нуклеотидов, предпочтительно длину 14-50 нуклеотидов, предпочтительнее длину 15-40 нуклеотидов. Примером влияния, привносимого повышенной температурой реакции, является решение проблемы образования вторичной структуры ДНК, используемой как матрица. Повышенная температура реакции создает возможность амплификации нужной нуклеиновой кислоты даже в том случае, если в качестве матрицы используют нуклеиновую кислоту с высоким содержанием GC. Кроме того, она также эффективна при амплификации участка с большой длиной цепи. Такое действие наблюдают в интервале от примерно 60 п.о. до примерно 20 т.п.о., конкретно от примерно 110 п.о. до примерно 4,3 т.п.о., конкретнее от примерно 130 п.о. до примерно 1500 п.о. Эффективность амплификации можно повысить путем подбора температуры реакции в соответствии с содержанием GC в нуклеиновой кислоте, служащей матрицей. Например, если в качестве матрицы используют нуклеиновую кислоту с низким содержанием GC, реакцию амплификации по настоящему изобретению можно проводить при 50-55 С, хотя температура зависит от длины амплифицируемой цепи и величины Тm праймера. Использование ДНК-полимеразы с обратно-транскриптазной активностью (например, ДНКполимеразы BcaBEST) в способе настоящего изобретения может сделать удобным проведение амплификации нуклеиновой кислоты, начиная с РНК, включающее стадию получения кДНК из РНК (реакция обратной транскрипции). В качестве альтернативы продукт, полученный путем независимого проведения стадии получения кДНК из РНК, т.е. кДНК, можно использовать в способе настоящего изобретения в качестве ДНК, служащей матрицей. В каждом случае реакцию в способе настоящего изобретения проводят до остановки ее подходящим способом, например, путем инактивации фермента или путем снижения температуры реакции, или до тех пор, пока реакционная смесь не истощится по одному из субстратов. Способ амплификации нуклеиновой кислоты настоящего изобретения можно использовать для различных экспериментальных процедур, в которых используют амплификацию нуклеиновых кислот,включая детекцию, мечение и секвенирование нуклеиновой кислоты. Кроме того, способ амплификации нуклеиновой кислоты настоящего изобретения можно использовать для способа амплификации нуклеиновой кислоты in situ, способа амплификации нуклеиновой кислоты на твердой подложке, такой как ДНК-чип, или метода мультиплексной амплификации нуклеиновых кислот, при котором одновременно амплифицируют несколько фрагментов. Одной из особенностей способа амплификации нуклеиновой кислоты настоящего изобретения является возможность получения одноцепочечной ДНК. В способе для указанной цели можно использовать один или два химерных олигонуклеотидных праймера. Например, если используют два химерных олигонуклеотидных праймера, способ настоящего изобретения можно осуществлять, используя соотношение праймеров, подобное тому, что используется в так называемой асимметричной ПЦР, при которой реакция амплификации осуществляется с использованием избыточного количества одного олигонуклеотидного праймера относительно другого. Отношение праймеров находится, без ограничений, предпочтительно в интервале от 1:10 до 1:500, предпочтительнее в интервале от 1:10 до 1:100. В результате количество продукта замещения одной цепи становится избыточным относительно продукта другой цепи. По способу амплификации нуклеиновой кислоты настоящего изобретения можно получить одноцепочечную ДНК, в значительной мере свободную от комплементарной ей цепи. Например, можно легко получить за короткий промежуток времени одноцепочечную ДНК для получения материала с иммобилизованной нуклеиновой кислотой, такого как ДНК-чип, одноцепочечную ДНК-зонд для детекции нуклеиновой кислоты-мишени или мегапраймер для "длинной" ПЦР. С использованием способа настоящего изобретения можно селективно амплифицировать только смысловую или антисмысловую последовательность. Таким образом, настоящее изобретение также может быть использовано как способ получения нуклеиновой кислоты со смысловой последовательностью или с антисмысловой последовательностью. Участок нуклеиновой кислоты, представляющий интерес, можно амплифицировать даже из следового количества нуклеиновой кислоты, являющейся матрицей, путем осуществления способа настоящего изобретения в буфере с бицином, Трицином, HEPES, фосфатом или Трис. Кроме того, способы амплификации нуклеиновой кислоты настоящего изобретения не требуют специального оборудования для реакции, которое может регулировать температуру по времени. Поэтому реакцию амплификации можно проводить в большом объеме реакционной смеси. Таким образом, можно промышленно получать нуклеиновую кислоту (например, для применения в медицине) в больших количествах. Эффективность использования праймера в способе амплификации нуклеиновой кислоты настояще- 23005739 го изобретения составляет примерно 100%, что может быть в 5-10 раз выше, чем эффективность при обычном способе, таком как ПЦР. Способом амплификации нуклеиновой кислоты настоящего изобретения можно получить продукт амплификации с высоким соответствием нуклеотидной последовательности матричной нуклеиновой кислоты. Когда подтверждали частоту ошибок при синтезе ДНК по способу настоящего изобретения путем анализа нуклеотидных последовательностей полученных продуктов амплификации, частота ошибок, обнаруженная в продуктах амплификации, полученных по способу настоящего изобретения, была эквивалента частоте ошибок при LA-PCR, которая, как известно, позволяет амплифицировать нуклеиновую кислоту с высокой точностью. Иными словами, способ настоящего изобретения имеет точность, эквивалентную таковой при LA-PCR.(6). Способ детекции нуклеиновой кислоты-мишени настоящего изобретения и набор для такого способа. Нуклеиновую кислоту-мишень в образце можно обнаружить, используя способ амплификации нуклеиновой кислоты настоящего изобретения. Способ детекции включает(a) амплификацию нуклеиновой кислоты-мишени способом амплификации нуклеиновой кислоты настоящего изобретения, как описано выше; и(b) детекцию нуклеиновой кислоты-мишени, полученной на указанной выше стадии. На указанной выше стадии (а), если в качестве матрицы используют РНК, реакцию обратной транскрипции и реакцию амплификации нуклеиновой кислоты можно проводить в одну стадию. Без намерения ограничивать настоящее изобретение, в качестве сочетания обратной транскриптазы и ДНКполимеразы с активностью замещения цепи можно предпочтительно использовать, например, сочетание обратной транскриптазы AMV, обратной транскриптазы MMLV или обратной транскриптазы RAV-2 и Вса ДНК-полимеразы. Способ можно использовать для детекции или количественного определения гена в образце. Иными словами, конкретный ген можно обнаружить или определить количественно во всех образцах, где предполагается наличие нуклеиновой кислоты, такой как ДНК или РНК. Примерами образцов, в которых можно обнаружить конкретный ген или определить его количественно, являются, но не ограничиваются перечисленным, образцы, полученные из организмов, такие как цельная кровь, сыворотка, лейкоцитная пленка, моча, фекалии, спинномозговая жидкость, семенная жидкость, слюна, ткань (например, раковая ткань или ткань лимфоузлов), и клеточная культура (например, культура клеток млекопитающего или культура бактериальных клеток), образцы, содержащие нуклеиновую кислоту, такие как вироид, вирус,бактерия, гриб, дрожжи, растение или животное, образцы, предположительно загрязненные или инфицированные микроорганизмами, такими как вирусы или бактерии (например, пища или биологическая композиция), и образцы, которые могут содержать микроорганизмы, такие как почва или сточные воды. Например, вироиды, вирусы, грибы, бактерии или другие микроорганизмы в образце можно обнаружить или определить количественно на основании присутствия или содержания в специфического гена, происходящего из таких микроорганизмов и являющегося мишенью. В частности, способ детекции патогенных микроорганизмов может быть использован в областях санитарии и охраны окружающей среды. Кроме того, способ настоящего изобретения можно использовать для того, чтобы отличить генотип организма или определить уровень экспрессии гена. В частности, детекция или подтверждение уровня экспрессии гена, связанного с заболеванием, например, гена, связанного с появлением признаков злокачественности клеток, может быть использовано в области медицины. При детекции в качестве нуклеиновой кислоты, служащей матрицей можно предпочтительно использовать как РНК, так и ДНК. Способ детекции нуклеиновой кислоты-мишени по настоящему изобретению можно использовать для того, чтобы распознавать отличие в нуклеотидной последовательности нуклеиновой кислотымишени. В таком аспекте используемый химерный олигонуклеотидный праймер конструируют так, чтобы 3'-концевая часть праймера располагалась вблизи специфического распознаваемого основания нуклеотидной последовательности-мишени. Например, его конструируют так, чтобы между основанием и 3'концевым основанием праймера образовывалась водородная связь. Если имеет место мисматч между нуклеотидной последовательностью 3'-концевой части праймера и нуклеотидной последовательностью матрицы, амплификации нуклеиновой кислоты-мишени не происходит, и продукт амплификации с использованием в реакции амплификации вышеуказанного химерного олигонуклеотидного праймера не образуется. С использованием способа можно получить информацию о специфическом основании в гене,такую как информация о точечной мутация или однонуклеотизном полиморфизме (SNP). Способ детекции нуклеиновой кислоты-мишени по настоящему изобретению можно осуществить путем амплификации нуклеиновой кислоты-мишени непосредственно из образца, содержащего нуклеиновую кислоту. В таком случае длина цепи амплифицируемой нуклеиновой кислоты-мишени на ограничивается определенной длиной. Например, для чувствительной детекции нуклеиновой кислоты-мишени эффективен участок в 200 п.о. или короче, предпочтительно в 150 п.о. или короче. Нуклеиновую кислоту-мишень можно обнаружить в образце с высокой чувствительностью, сконструировав химерные олигонуклеотидные праймеры по настоящему изобретению для того, чтобы в результате получить длину амплифицируемой цепи, указанную выше.- 24005739 Кроме того, нуклеиновую кислоту-мишень можно обнаружить с большей чувствительностью даже из следового количества образца нуклеиновой кислоты способом детекции по настоящему изобретению с использованием реакционного буфера, содержащего бицин, Трицин, HEPES, фосфат или Трис в качестве буферного компонента, и раствора для отжига, содержащего спермидин или пропилендиамин, приведенные в качестве примеров выше в (4). В таком случае используемые эндонуклеаза и ДНКполимераза не ограничиваются какими-либо конкретными. Например, предпочтительно сочетание РНКазы Н из Escerichia coli, бактерии рода Pyrococcus или бактерии рода Archaeoglobus и ДНКполимеразы BcaBEST. Полагают, что предпочтительное количество единиц активности эндонуклеазы и ДНК-полимеразы может меняться в зависимости от типа ферментов. В таком случае состав буфера и количество добавляемых ферментов можно подобрать, используя в качестве показателя повышение чувствительности детекции или количество продукта амплификации. В способе детекции настоящего изобретения во время амплификации нуклеиновой кислотымишени в качестве субстрата можно вводить dUTP. Таким образом, если в качестве субстрата используют dUTP, возможно предотвратить контаминацию продуктами амплификации за счет разрушения продуктов амплификации с использованием урацил-N-гликозилазы (UNG). Для стадии (b) можно использовать известные способы детекции нуклеиновой кислоты. Примерами таких способов являются детекция продукта реакции, имеющего специфический размер, методом электрофореза и детекция путем гибридизации с зондом. Кроме того, можно предпочтительно применять способ детекции, сочетающий использование магнитных бус. При детекции методом электрофореза, как правило, используют флуоресцирующее вещество, такое как бромистый этидий. Гибридизацию с зондом можно сочетать с детекцией методом электрофореза. Зонд может быть мечен радиоизотопом или нерадиоактивным веществом, таким как биотин или флуоресцирующее вещество. Кроме того, использование меченого олигонуклеотида на стадии (а) может облегчить детекцию продукта амплификации, в который включен меченый нуклеотид, или, используя метку, можно усилить сигнал для детекции. Также можно использовать для детекции метод поляризации флуоресценции, метод переноса энергии флуоресценции или подобный метод. Нуклеиновую кислоту-мишень можно обнаружить автоматизированным способом или определить количественно, сконструировав подходящую систему детекции. Кроме того, можно предпочтительно использовать детекцию невооруженным глазом с помощью метода гибридной хроматографии. В способе детекции настоящего изобретения можно использовать рибонуклеотидный (РНК) зонд,меченный двумя или большим числом пространственно разнесенных флуоресцирующих веществ, что приводит к состоянию тушения. Зонд не дает флуоресценции. Когда его отжигают с ДНК, амплифицированной с нуклеиновой кислоты-мишени, комплементарной зонду, РНКаза Н расщепляет зонд. В результате увеличивается расстояние между флуоресцирующими веществами на зонде, что приводит к появлению флуоресценции. Таким образом, испускание обнаруживает присутствие нуклеиновой кислотымишени. Если в способе амплификации нуклеиновой кислоты настоящего изобретения используют РНКазу Н, нуклеиновую кислоту-мишень можно обнаружить путем одного лишь добавления зонда в реакционную смесь. Например, для мечения зонда можно предпочтительно использовать сочетание флуоресцирующих веществ 6-карбоксифлуоресцеина (6-FAM) и N,N,N',N'-тетраметил-6-карбоксиродамина (TAMRA). Настоящее изобретение также предусматривает зонд, используемый в вышеописанном способе детекции нуклеиновой кислоты-мишени. Зонд настоящего изобретения на ограничивается каким-либо конкретным зондом до тех пор, пока он в нормальных условиях гибридизации может гибридизоваться с нуклеиновой кислотой-мишенью, амплифицированной способом амплификации нуклеиновых кислот настоящего изобретения. Имея ввиду специфическую детекцию продукта амплификации, предпочтителен зонд, гибридизующийся в условиях, например, известных специалистам в данной области техники как строгие. Строгие условия гибридизации описываются, например, в Т. Maniatis et al., (eds.), MolecularCloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., 1989, Cold Spring Harbor Laboratory. Конкретно, примером строгих условий являются следующие условия: инкубация при температуре примерно на 25 С ниже Tm используемого зонда на протяжении от 4 ч до ночи в 6 х SSC (1 х SSC: 0,15 М NaCl, 0,015 М цитрат натрия, рН 7,0), содержащем 0,5% додецилсульфат натрия (SDS), 5 х раствор Денхардта (0,1% бычий сывороточный альбумин (BSA), 0,1% поливинилпирролидон, 0,1% фиколл 400) и 100 мкг/мл ДНК спермы лосося. Зонд с меткой, описанный выше, можно использовать в качестве зонда для облегчения детекции нуклеиновой кислоты-мишени. Способ амплификации нуклеиновой кислоты в изотермических условиях по настоящему изобретению не требует применения оборудования, такого как термоциклер. Число праймеров, используемых в способе амплификации настоящего изобретения, может равняться одному или двум, что меньше, чем число праймеров, используемых в обычном способе. Так как реагенты, такие как dNTP, используемый для ПЦР и подобных способов, можно применять в способе настоящего изобретения, эксплуатационные расходы могут быть уменьшены по сравнению с обычным способом. Таким образом, способ настоящего изобретения можно использовать предпочтительно, например, в области генетических анализов, при которых обычно проводят детекцию. Способ настоящего изобретения дает большее количество продукта- 25005739 амплификации за более короткий промежуток времени, чем ПЦР. Поэтому способ настоящего изобретения можно использовать как удобный, быстрый и чувствительный способ детекции гена. При генетическом анализе на геномном уровне предпринимаются попытки сделать реакционную систему небольшой и повысить степень интеграции для того, чтобы анализировать большое количество нуклеотидных последовательностей. Была разработана система для указанной цели с использованием новейших сверхтонких технологий производства, в которой основные процессы для геномного анализа(например, экстракция ДНК из клеток, реакция амплификации ДНК, электрофорез, гибридизация, обнаружение ДНК, представляющей интерес, и т.п.) интегрированы на микрочипе размером от нескольких квадратных сантиметров до кончика пальца. Такая система называется микрочипом или наночипом. В настоящее время рассматривается использование ПЦР в системе в качестве реакции для амплификации гена. Однако так как для ПЦР требуются средства для повторяющегося регулирования температуры с ее повышением и понижением во времени, система становится сложной. Напротив, так как систему можно упростить, используя способ настоящего изобретения, по которому можно амплифицировать нуклеиновую кислоту в изотермических условиях, такой способ является вполне подходящим для использования в интегрированной системе, описанной выше. Высокоинтегрированную систему можно сконструировать, используя методы настоящего изобретения.(7). Набор настоящего изобретения. Настоящее изобретения предусматривает набор, используемый для способа амплификации или детекции нуклеиновой кислоты настоящего изобретения, описанного выше. В одном из вариантов воплощения набор находится в упакованной форме и содержит инструкции, касающиеся применения ДНКполимеразы и эндонуклеазы в реакции замещения цепи. Также для способа настоящего изобретения предпочтительно использовать набор, содержащий ДНК-полимеразу с активностью замещения цепи,эндонуклеазу и буфер для реакции замещения цепи. В качестве альтернативы можно выбрать коммерчески доступную ДНК-полимеразу с активностью замещения цепи и/или эндонуклеазу и использовать согласно инструкциям. Кроме того, набор может содержать реагент для реакции обратной транскрипции,который используют, когда в качестве матрицы используют РНК. ДНК-полимеразу можно выбрать из числа ДНК-полимераз, используемых в настоящем изобретении, описанных выше в (3). Эндонуклеазу можно выбрать из числа эндонуклеаз, описанных выше в (2). Реакционный буфер, имеющий состав, описанный выше в (4), можно предпочтительно использовать в качестве буфера для реакции замещения цепи."Инструкции" представляют собой отпечатанный материал, где описывается способ применения набора, например, способ получения раствора реагентов для реакции замещения цепи, рекомендуемые условия реакций и т.п. Инструкции включают руководство по использованию в форме проспекта или листовки, этикетку, наклеенную на набор, и описание на поверхности упаковки, содержащей набор. Инструкции также включают сведения, доступные или предоставляемые через электронные средства передачи данных, такие как Интернет. Набор настоящего изобретения также может содержать реакционный буфер, содержащий в качестве буферного компонента бицин, Трицин, HEPES, фосфат или Трис, и раствор для отжига, примеры которого приводятся выше в (4). Кроме того, он может содержать ДНК-полимеразу, обладающую активностью замещения цепи, и РНКазу Н. Кроме того, набор может содержать модифицированный дезоксирибонуклеотид или аналог дезоксинуклеозидтрифосфата. Набор, используемый в способе детекции нуклеиновой кислоты-мишени, также может содержать,кроме инструкций и реагентов для амплификации, описанных выше, соответствующий химерный олигонуклеотидный праймер для амплификации нуклеиновой кислоты-мишени и реагент для детекции амплифицированной нуклеиновой кислоты-мишени, такой как зонд. Кроме того, наборы настоящего изобретения включают набор, содержащий химерный олигонуклеотидный праймер, используемый в настоящем изобретении, и/или зонд настоящего изобретения, описанные выше.(8). Композиция настоящего изобретения. Настоящее изобретение предусматривает композицию, используемую в способе амплификации нуклеиновой кислоты настоящего изобретения или способе детекции нуклеиновой кислоты настоящего изобретения, описанных выше. Например, композиция может содержать эндонуклеазу, описанную выше в (2), и ДНК-полимеразу, описанную выше в (3). Композиция также может содержать буферный компонент, магниевую соль, dNTP и т.п., как компоненты для проведения реакции амплификации. Кроме того,он может содержать модифицированный дезоксирибонуклеотид или аналог дезоксинуклеозидтрифосфата. Вещества, описанные выше в (4), можно использовать в качестве буферного компонента и других добавок. В особенно предпочтительном аспекте композиция может содержать подходящие количества различных компонентов, как перечислено выше для способа амплификации нуклеиновых кислот настоящего изобретения. Реакцию амплификации можно проводить, добавив в композицию лишь соответствующие матрицу и химерный(ые) олигонуклеотидный(ые) праймер(ы). Если амплифицируемый объект заранее известен, композиция предпочтительно содержит химерный(ые) олигонуклеотидный(ые) прай- 26005739 мер(ы), пригодные для амплификации такого объекта.(9). Материал настоящего изобретения с иммобилизованной нуклеиновой кислотой, нанесенной в виде матрицы в заранее определенном участке, и способ его получения. ДНК-чип (также называемый ДНК-микроматрицей или ДНК-матрицей) представляет собой материал с иммобилизованной нуклеиновой кислотой, в котором различные фрагменты генов или ДНК нанесены в виде матрицы и иммобилизованы на твердой подложке, такой как предметное стекло, в заранее определенном участке или в заранее определенном положении. ДНК-чип используют для проверки наличия нуклеиновой кислоты в образце нуклеиновой кислоты с последовательностью, комплементарной ДНК, нанесенной и иммобилизованной в заранее определенном участке ДНК-чипа. Проверку осуществляют, приводя ДНК-чип в контакт с образцом нуклеиновой кислоты, полученной из образца, предпочтительно образцом меченной нуклеиновой кислоты для гибридизации. Так как ДНК-чип можно использовать для детекции или количественного определения в образце в одной процедуре нескольких нуклеиновых кислот, он является очень полезным средством, существенно ускоряющим анализ экспрессии генов или анализ мутаций или полиморфизма. ДНК-чип, в котором в заранее определенном участке нанесена и иммобилизована двухцепочечная нуклеиновая кислота, используют в гибридизации после того, как его подвергли соответствующей денатурации. ДНК-чип, в котором в заранее определенном участке нанесена и иммобилизована одноцепочечная ДНК, комплементарная детектируемой нуклеиновой кислоте, особенно предпочтителен для обнаружения нуклеиновой кислоты-мишени. Как описано выше, нужную ДНК по способу настоящего изобретения можно амплифицировать в одноцепочечной форме. Хотя можно использовать любой способ очистки продукта амплификации,предпочтительна очистка с использованием осаждения изопропанолом. Полученную таким образом ДНК, предпочтительно одноцепочечную ДНК, в значительной мере свободную от комплементарной цепи, можно предпочтительно использовать в качестве фрагмента ДНК для иммобилизации на ДНК-чипе. Таким образом, способ настоящего изобретения предпочтительно используют как способ получения ДНК для нанесения и иммобилизации в заранее определенном участке для получения ДНК-чипа. Можно использовать любой нерастворимый субстрат в качестве подложки, на которой в заранее определенном участке наносят в виде матрицы и иммобилизуют полученную таким образом ДНК, но предпочтительно используют подложку в форме пластины, изготовленной из стекла или пластмассы, и подложку в форме мембраны, изготовленной из нитроцеллюлозы или нейлона. Для иммобилизации нуклеиновой кислоты можно использовать известный способ иммобилизации. ДНК можно иммобилизовать непосредственно на подложке. В качестве альтернативы ДНК можно иммобилизовать через подходящий линкер или после лигирования нескольких молекул ДНК. Кроме того, так как по способу настоящего изобретения в амплифицированную нуклеиновую кислоту можно ввести модифицированный дезоксирибонуклеотид, материал, содержащий иммобилизованную нуклеиновую кислоту, можно получить, используя модифицирующую группу. Нуклеиновую кислоту-мишень, гибридизующуюся с нуклеиновой кислотой на материале с иммобилизованной нуклеиновой кислотой, в котором в заранее определенном участке нанесена и иммобилизована ДНК, амплифицированная по способу настоящего изобретения (например, ДНК-чипе), можно обнаружить или определить количественно. Такую детекцию или количественное определение можно осуществить путем приведения материала в контакт с образцом нуклеиновой кислоты, полученным из образца, предположительно содержащего нуклеиновую кислоту-мишень, с целью гибридизации. Из таких материалов ДНК-чип, в котором в заранее определенном участке нанесена и иммобилизована одноцепочечная ДНК, амплифицированная по способу настоящего изобретения, позволяет осуществить детекцию нуклеиновой кислоты удобнее, с более высокой чувствительностью и лучшей воспроизводимостью, по сравнению с обычными материалами.(10). Способ настоящего изобретения получения нуклеиновой кислоты в больших количествах. Как описано выше, один из аспектов настоящего изобретения относится к способу амплификации нуклеиновой кислоты, который можно осуществить в изотермических условиях. Нужную нуклеиновую кислоту можно получить, смешивая нуклеиновую кислоту, служащую матрицей для получения амплифицированной нуклеиновой кислоты, и различные компоненты, необходимые для реакции, и проведения реакции в смеси в изотермических условиях. Так как для ПЦР требуется изменение температуры реакционной смеси во времени, реакционный объем ограничивается объемом, в котором можно регулировать температуру (как правило, 200 мкл или менее). Поэтому объем трудно увеличить. С другой стороны, в способе настоящего изобретения такого ограничения не имеется. Можно получить большое количество нуклеиновой кислоты, увеличивая объем реакционной смеси. В способе настоящего изобретения объем составляет, например, предпочтительно более 200 мкл, предпочтительнее 300 мкл или более и наиболее предпочтительно 500 мкл или более, хотя такой объем не предназначен для ограничения настоящего изобретения. В способе настоящего изобретения из одной матричной молекулы синтезируют несколько молекул комплементарной цепи. Кроме того, нуклеиновые кислоты можно синтезировать с использованием этих молекул комплементарной цепи в качестве матриц. Таким образом, нужную нуклеиновую кислоту можно эффективно получить в больших количествах, выбрав соответствующим образом матрицу и праймер. Кроме того, тот факт, что, в отличие от ПЦР, способ настоящего изобретения не требует специ- 27005739 ального оборудования или сложного изменения температуры, делает его выгодным с точки зрения стоимости оборудования и энергии. Следовательно, способ является превосходным промышленным способом получения нуклеиновых кислот в больших количествах. Нуклеиновую кислоту, представляющую интерес, можно амплифицировать или получать даже из следового количества нуклеиновой кислоты, служащей матрицей, по способу получения настоящего изобретения, используя буфер для реакции и раствор для отжига, примеры которых приводятся выше в(4). В таком случае используемые эндонуклеаза и ДНК-полимераза не ограничиваются какими-то конкретными вариантами. Например, предпочтительно сочетание РНКазы Н из Escherichia coli и ДНКполимеразы BcaBEST. Полагают, что предпочтительные количества единиц активности эндонуклеаза и ДНК-полимераза могут меняться в зависимости от типов ферментов. В таком случае состав буфера и количество добавляемых ферментов можно подбирать, ориентируясь в качестве показателя на максимальное количество продукта амплификации. Кроме того, способ настоящего изобретения полезен как способ получения в больших количествах различных фрагментов ДНК, таких как фрагменты для иммобилизации на ДНК-чипе. Конкретно, в одном из вариантов воплощения фрагменты ДНК можно получить в больших количествах с помощью простых реакционных стадий. В другом варианте воплощения для получения различных фрагментов ДНК можно использовать ограниченное число праймеров. В последний вариант воплощения можно включить предварительную стадию амплификации нуклеиновой кислоты, служащей в качестве матрицы в способе настоящего изобретения, известным способом амплификации нуклеиновой кислоты, таким как ПЦР. Все виды нуклеиновых кислот, служащих матрицами, можно амплифицировать с использованием ограниченного числа праймеров, например, на основе способа амплификации нуклеиновой кислоты с использованием случайного праймера с tag-последовательностью (Nucleic Acids Research, 24 (19):3778-3783(1996 или ПЦРс вырожденным олигонуклеотидом в качестве затравки (DOP-PCR; Genomics, 13:718-725(1992, где используют вырожденный праймер. Способ амплификации нуклеиновых кислот настоящего изобретения можно осуществить с использованием на вышеуказанной стадии одного или нескольких праймеров для всех нуклеиновых кислот, служащих матрицами. Это можно осуществить путем конструирования такого праймера, используемого в способе амплификации нуклеиновых кислот настоящего изобретения, который соответствует tag-последовательности, добавляемой к случайному или вырожденному праймеру. Таким образом, сочетание подходящей стадии подготовки нуклеиновой кислоты для использования как матрицы и способа настоящего изобретения может обеспечить получение различных фрагментов ДНК в больших количествах и при более низкой стоимости по сравнению с обычным способом. Фармацевтическая композиция, содержащая нуклеиновую кислоту, может содержать двухцепочечную ДНК для экспрессии полезного полипептида в клетке или одноцепочечную антисмысловую ДНК для подавления экспрессии гена, представляющего интерес. Такую нуклеиновую кислоту вводят в организм с использованием подходящих средств доставки, например, носителя для переноса генов, такого как липосома. Способ получения нуклеиновой кислоты настоящего изобретения предпочтителен для получения одноцепочечной или двухцепочечной нуклеиновой кислоты в больших количествах для медицинского применения. Кроме того, способом настоящего изобретения легко получить нуклеиновую кислоту, содержащую аналог dNTP, который, например, подавляет разрушение нуклеиновой кислоты invivo. Так как фрагмент ДНК, амплифицированный по настоящему изобретению, состоит из обычных нуклеотидов, амплифицированную ДНК можно, например, субклонировать в подходящий вектор с использованием сайта рестрикционного фермента в ДНК. Кроме того, ДНК можно без сложностей обработать рестрикционным ферментом, например, для RFLP. Следовательно, ДНК можно широко использовать в области генетического анализа. Кроме того, в амплифицированный фрагмент можно ввести промоторную последовательность для РНК-полимеразы. Амплифицированный фрагмент можно использовать в качестве матрицы для синтеза РНК, которую можно использовать, например, как зонд. Безусловно, можно получить ДНК-зонд, меченный флуоресцирующим веществом, осуществляя способ амплификации нуклеиновой кислоты настоящего изобретения с использованием меченного флуоресцентной меткой dNTP вместо обычного dNTP. Ниже перечисляются особенности способа амплификации нуклеиновой кислоты настоящего изобретения. 1. Можно амплифицировать большое количество нуклеиновой кислоты из небольшого количества матрицы. Количество продукта амплификации возрастает квадратично при использовании двух праймеров. 2. Способ можно осуществлять изотермически. В таком случае не требуется использования такого оборудования, как термоциклер. Поэтому можно легко увеличить реакционный объем. 3. Как правило, реакцию амплификации проводят с использованием одного или двух химерных олигонуклеотидных праймеров и двух ферментов (ДНК-полимеразы и эндонуклеазы). 4. Так как с одной молекулы праймера синтезируется несколько цепей ДНК, количество праймера не ограничивает количество продукта амплификации. Кроме того, эффективность использования прай- 28005739 мера близка к 100%, что значительно выше, чем эффективность ПЦР. 5. Можно селективно амплифицировать одноцепочечную или двухцепочечную ДНК, в зависимости от цели. 6. Так как для реакции амплификации не требуется аналог dNTP, такой как (-S)-dNTP, стоимость реагентов низкая. Кроме того, можно получить нуклеиновую кислоту в естественной форме, не содержащую аналога dNTP. 7. Можно получать амплифицированный фрагмент ДНК с низкой стоимостью в больших количествах, комбинируя способ настоящего изобретения с другим способом дупликации нуклеиновой кислоты. 8. Способ детекции настоящего изобретения имеет равную или более высокую чувствительность детекции по сравнению с обычным способом. Способ детекции настоящего изобретения можно осуществить с равной чувствительностью за более короткий промежуток времени, чем тот, который требуется для обычного способа. 9. Способ подходит для амплификации нуклеиновой кислоты, автоматизированной детекции, детекции малого количества и высокоинтегрированной детекции на микрочипе или наночипе. Как описано выше, способ настоящего изобретения подходит для детекции генов и промышленного получения нуклеиновой кислоты. Примеры Приведенные далее примеры иллюстрируют изобретение подробнее, но не должны рассматриваться как ограничивающие его объем. Ссылочный пример 1. Получение РНКазы Н из термофила Bacillus caldotenax.Bacillus caldotenax YT-G (приобретенную у Deutsche Summlung von Mikroorganismen; DSM406) инокулировали в 100 мл среды, содержащей 0,2% триптона (Difco Laboratories) и 1,5% дрожжевого экстракта (Difco Laboratories) (pH 6,5), культивировали при 60 С в течение 140 мин при встряхивании и использовали в качестве стартовой культуры. Стартовую культуру (30 мл) инокулируют в 3 л среды того же состава и культивируют при температуре 60 С в течение 5 ч с аэрацией 2,5 л/мин и при перемешивании при 250 об./мин. Клетки собирают путем центрифугирования культуры при 5000 х g в течение 15 мин. Клетки (402 г,масса во влажном состоянии) суспендируют в 1000 мл 50 мМ Трис-HCl буфера (рН 7,5), содержащего 10 мМ меркаптоэтанол, 0,5 М NaCl, 1 мМ ЭДТА и 20 мкМ PAPMSF, и разрушают с использованием MINILab (APV GAULIN/ RANNIE). Клеточный дебрис удаляют центрифугированием для получения супернатанта. К полученному супернатанту добавляют раствор полиэтиленимина до конечной концентрации 0,1%. После перемешивания смесь оставляют на 1 ч. Затем супернатант извлекают центрифугированием. К супернатанту добавляют сульфат аммония до 50%-ного насыщения. Осадок, полученный центрифугированием, растворяют в 20 мл Трис-HCl буфера (рН 7,5), содержащего 10 мМ меркаптоэтанол, 0,11 мМ ЭДТА, 50 М NaCl и 10% глицерин. Раствор диализуют против такого же буфера. Диализованный образец наносят на 280-мл колонку с DE52 (Whatman), уравновешенную тем же буфером, и собирают фракции несвязавшегося материала. Затем колонку промывают 420 мл буфера, используемого для уравновешивания, и собирают вымывающиеся фракции. Несвязавшиеся фракции и фракции, вымытые при колоночной хроматографии наDE52, смешивают вместе и наносят на 240-мл колонку с Р-11 (Whatman), уравновешенную 20 мМ ТрисHCl буфером (рН 7,5), содержащим 10 мМ меркаптоэтанол, 0,1 мМ ЭДТА, 50 М NaCl и 10% глицерин. Затем осуществляют элюирование с использованием буфера для уравновешивания, содержащего 0-0,5 МNaCl. Полученные активные фракции помещают в мешок для диализа. Мешок помещают на твердый полиэтиленгликоль 20000 при 4 С для дегидратации-концентрирования. Затем концентрат фермента наносят на 300-мл колонку с Superdex G-200 (Amersham Pharmacia Biotech), уравновешенную 25 мМ ТрисHCl буфером (рН 7,5), содержащим 5 мМ меркаптоэтанол, 0,5 мМ ЭДТА, 30 М NaCl и 50% глицерин. Осуществляют элюирование буфером, используемым для уравновешивания, для получения активных фракций. Активные фракции наносят на 15-мл колонку с гепарин-Сефарозой (Amersham Pharmacia Biotech), уравновешенную 20 мМ Трис-HCl буфером (рН 7,5), содержащим 10 мМ меркаптоэтанол, 0,1 мМ ЭДТА, 50 М NaCl и 10% глицерин. Элюирование осуществляют буфером, используемым для уравновешивания, содержащим 0-0,5 М NaCl. Полученные активные фракции наносят на 5-мл колонку с Hitrap-SP (Amersham Pharmacia Biotech),уравновешенную 20 мМ Трис-HCl буфером (рН 7,5), содержащим 10 мМ меркаптоэтанол, 0,1 мМ ЭДТА,50 М NaCl и 10% глицерин. Элюирование осуществляют буфером, используемым для уравновешивания,содержащим 0-0,5 М NaCl. Полученные активные фракции снова наносят на 300-мл колонку с SuperdexG-200 (Amersham Pharmacia Biotech), уравновешенную 25 мМ Трис-HCl буфером (рН 7,5), содержащим 5 мМ меркаптоэтанол, 0,5 мМ ЭДТА, 30 М NaCl и 50% глицерин. Полученные активные фракции используют в качестве препарата РНКазы Н (раствор фермента). Активность термостойкой РНКазы Н измеряют следующим образом. В 1 мл 40 мМ Трис-HCl (рН 7,7), содержащем 1 мМ ЭДТА, растворяют 1 мг поли(rА) или поли(dТ)(оба препарата от Amersham Pharmacia Biotech), и получают раствор поли(rА) и раствор поли(dТ). Затем добавляют раствор поли(rА) (до конечной концентрации 20 мкг/мл) и раствор поли(dТ) (до конечной концентрации 30 мкг/мл) к 40 мМ Трис-HCl буферу (рН 7,7), содержащему 4 мМ МdСl2, 1 мМDTT, 0,003% BSA и 4% глицерин. Смеси дают реагировать при 37 С в течение 10 мин и затем охлаждают до 4 С для получения раствора поли(rА)-поли(dT). К 100 мкл раствора поли(rА)-поли(dT) добавляют 1 мкл раствора фермента. Смеси дают реагировать при 40 С в течение 10 мин. К смеси добавляют 10 мкл 0,5 М ЭДТА для остановки реакции. Затем измеряют поглощение при 260 нм. В качестве контроля к реакционной смеси добавляют 10 мкл 0,5 М ЭДТА, полученной смеси дают реагировать при 40 С в течение 10 мин и затем измеряют поглощение. Получают величину (разница в поглощении), вычитая поглощение в случае контроля из поглощения в случае реакции в отсутствии ЭДТА. Таким образом, на основании разницы в поглощении, определяют концентрацию нуклеотида, высвобожденного из гибрида поли(rА)-поли(dT) в ходе ферментативной реакции. Одна единица РНКазы Н определяется как количество фермента, увеличивающее А 260, соответствующее высвобождению 1 нмоль рибонуклеотида за 10 мин, вычисленное согласно уравнению, приведенному далее. Если используют разбавленный раствор фермента, величину, полученную с использованием уравнения, приведенного далее, корректируют с учетом степени разбавления. Единица = [разница в поглощении х реакционный объем (мл)]/0,0152 Ссылочный пример 2. Клонирование гена РНКазы НII из Bacillus caldotenax.(1). Получение геномной ДНК из Bacillus caldotenax.Bacillus caldotenax YT-G (DSM406) инокулируют в 60 мл среды LB (1% триптона, 0,5% дрожжевого экстракта и 0,5% NaCl, рН 7,2) и культивируют при 65 С в течение 20 ч. После культивирования культуру центрифугируют и собирают клетки. Клетки суспендируют в 2 мл 25% сахарозы и 50 мМ Трис-HCl(рН 8,0). Добавляют к суспензии 0,2 мл раствора 10 мг/мл хлорида лизоцима (Nacalai Tesque) в воде. Смеси дают реагировать при 20 С в течение 1 ч. После реакции к реакционной смеси добавляют 12 мл смеси, содержащей 150 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА и 20 мМ Трис-HCl (рН 8,0), 0,1 мл 20 мг/мл протеиназы К(Takara Shuzo) и 1 мл 10% водного раствора лаурилсульфата натрия. Смесь инкубируют при 37 С в течение 1 ч. Затем к смеси добавляют 2,1 мл 5 М раствора NaCl и 2 мл раствора CTAB-NaCl [10% бромида цетилтриметиламмония (Nacalai Tesque) и 0,7 М NaCl] и полученную смесь тщательно перемешивают и инкубируют при 65 С в течение 10 мин. Добавляют к смеси равный объем смеси хлороформа и изоамилового спирта (24:1, об./об.). Полученную смесь осторожно перемешивают в течение 10 мин и затем центрифугируют в течение 10 мин при 10000 х g. После центрифугирования к полученному супернатанту добавляют равный объем смеси фенола, насыщенного 100 мМ Трис-HCl (рН 8,0)/хлороформа/ изоамилового спирта (25:24:1, об./об.). Полученную смесь осторожно перемешивают в течение 10 мин и затем центрифугируют в течение 10 мин при 10000 х g. После центрифугирования к полученному супернатанту добавляют 0,6 об. 2-пропанола. Полученный волокнистый осадок вытягивают с использованием стеклянной палочки, промывают 70% этанолом в воде, сушат на воздухе и затем растворяют в 0,5 мл буфера ТЕ и получают раствор геномной ДНК.(2). Клонирование средней части гена РНКазы. Синтезируют олигонуклеотиды BsuII-3 и BsuII-6, представленные SEQ ID No 1 и 2, на базе мотива I и мотива III - консервативных участков аминокислотных последовательностей РНКаз НII из различных организмов (Biochemistry, 38:605-608 (1999. Осуществляют ПЦР в объеме 100 мкл с использованием в качестве матрицы 1 мкл раствора геномной ДНК Bacillus caldotenax, полученного так, как в ссылочном примере 2-(1), и 100 пмоль BsuII-3 и 100 пмоль BsuII-6 в качестве праймеров. В качестве ДНК-полимеразы для ПЦР используют TaKaRa Taqполимеразу (Takara Shuzo) согласно прилагаемому протоколу. ПЦР осуществляют следующим образом: 50 циклов 94 С в течение 30 с, 45 С в течение 30 с и 72 С в течение 1 мин. После реакции реакционную смесь подвергают обработке фенолом с последующим осаждением этанолом для очистки ДНК. У полученной ДНК "тупят" концы с использованием ДНК-полимеразы фага Т 4 (Takara Shuzo), и затем подвергают ее электрофорезу в агарозном геле, и извлекают из геля амплифицированный фрагмент ДНК длиной около 0,4 т.п.о. Фрагмент ДНК примерно в 0,4 т.п.о. с использованием ДНК-лигазы фага Т 4 (TakaraShuzo) лигируют с плазмидой pUC119 (Takara Shuzo), расщепленной Sma I (Takara Shuzo). Лигазную смесь используют для трансформации Escherichia coli JM109. Полученные трансформанты культивируют и получают плазмиду 21-12, в которую встроена ДНК примерно в 0,4 т.п.о.(3). Клонирование расположенной против хода транскрипции (upstream) части гена РНКазы II. Была определена нуклеотидная последовательность встроенного фрагмента примерно в 0,4 т.п.о.,полученного в ссылочном примере 2-(2). На базе установленной нуклеотидной последовательности синтезируют олигонуклеотиды RNII-S1 и RNII-S2, представленные SEQ ID No 3 и 4. Геномную ДНК Bacillus caldotenax, полученную так, как в ссылочном примере 2-(1), расщепляютBamH I (Takara Shuzo) и лигируют с кассетой Sau3AI (Takara Shuzo) с использованием Т 4 ДНК-лигазы. Процедуру осуществляют согласно протоколу, приложенному к набору для клонирования in vitro TaKaRa LA PCR (Takara Shuzo), с использованием лигазной смеси в качестве матрицы, RNII-S2 в качестве