Нейротрофические факторы

1 Область применения Настоящее изобретение относится к полипептидам нейротрофических факторов, нуклеиновым кислотам, кодирующим полипептиды нейротрофических факторов и антителам, которые специфично связываются с нейротрофическими факторами. Предпосылки изобретения Нейротрофические факторы являются белками природного происхождения, которые способствуют выживаемости, обеспечивают фенотипическую дифференцировку, предотвращают дегенерацию и усиливают активность нервных клеток и тканей. Нейротрофические факторы выделены из нервной ткани и из ткани, отличной от нервной, но иннервированной нервной системой и подразделенной на функционально и структурно близкие группы, называемые также семействами, надсемействами или подсемействами. Среди надсемейств нейротрофических факторов имеются надсемейства фактора роста фибробластов, нейротрофина и трансформирующего фактора роста- (TGF-). Отдельные виды нейротрофических факторов различаются по физическому строению, по их взаимодействию с соответствующими им сложными рецепторами и по их влиянию на различные типы нервных клеток. По классификации к надсемейству TGF- (Massague, et al., Trends in Cell Biology, 1994, 4, 172-178) относятся лиганды, представляющие собой нейротрофические факторы,полученные из линии глиальных клеток("GDNF"; WO 93/06116, включенная сюда в качестве ссылки), к которым относится GDNF,персефин ("PSP"; Milbrandt et al., Neuron, 1998,20, 245-253, включенная сюда в качестве ссылки) и нейртурин ("NTN"; WO 97/08196, включенная сюда в качестве ссылки). Общим свойством лигандов подсемейства GDNF является их способность индуцировать передачу сигнала через тирозинкиназу рецептора RET. Эти три лиганда подсемейства GDNF различаются по своему относительному сродству к семейству нейротрофических рецепторов, рецепторовGFR. Поскольку нейротрофические факторы влияют на нервную ткань, существует потребность в идентификации и характеристике дополнительных нейротрофических факторов для диагностики и лечения нарушений нервной системы. Сущность изобретения Данное изобретение относится к новому нейротрофическому фактору, называемому здесь "нейбластином" или "NBN". Нейбластин отнесен к подсемейству GDNF, поскольку он содержит области, гомологичные таковым других лигандов GDNF (см. ниже табл. 3 и 4), и способен взаимодействовать с RET (см., например, Airaksinen et al., Mol. Cell. Neuroscience,1999, 13, 313-325), нейбластин является новым и 2 уникальным нейротрофическим фактором. В отличие от других лигандов GDNF, нейбластин проявляет высокое сродство к комплексу рецепторов GFR3-RET и имеет уникальные области в аминокислотной последовательности. Термин "полипептид нейбластина", в том смысле, в котором здесь используется, означает полипетид, который обладает нейротрофической активностью (например, как описано в примерах 6, 7, 8 и 9), и включает в себя такие полипептиды, которые имеют аминокислотную последовательность, по меньшей мере, на 70% гомологичную полипептидам нейбластина человека, представленным аминокислотными последовательностями AK-95-AK105 в SEQ ID NO: 2, AK1-AK105 в SEQ ID NO: 2, АК-97-АК 140 в SEQ(зрелый, 113 АК), и их варианты и производные. Кроме того, в данном изобретении рассматриваются такие полипептиды, которые имеют аминокислотную последовательность, по меньшей мере, на 70% гомологичную полипептидам нейбластина мышей, представленным AK1 АК 224 в SEQ ID NO: 16. Предпочтительно, С-концевая последовательность охарактеризованных выше полипептидов нейбластина имеет последовательность аминокислот, которая представлена AK72-AK105 в SEQ ID NO: 2 (т.е., AK107-AK140 в SEQ ID NO: 9), более предпочтительно AK41-AK105 в SEQ IDAK191-AK224 в SEQ ID NO: 16. Также предпочтительно, чтобы в полипептиде нейбластина были сохранены 7 консервативных остатков Суs, которые характерны для семейства GDNF и надсемейства TGF-бета. Предпочтительно полипептид нейбластина имеет аминокислотную последовательность,гомологичную более чем на 85%, более предпочтительно гомологичную более чем на 95%,упомянутым выше последовательностям (т.е. АК-95-АК 105 в SEQ ID NO: 2, AK1-AK105 в SEQ"Нуклеиновая кислота нейбластина", в используемом здесь смысле, означает полинуклеотид, который кодирует полипептид нейбластина. Соответственно, изолированная нуклеиновая кислота нейбластина является молекулой полинуклеотида, имеющего открытую рамку считывания нуклеотидных кодонов, несущую информацию или кодирующую полипептид нейбластина при действии соответствующих необходимых для трансляции компонентов. Нуклеиновыми кислотами нейбластина изобретения могут быть РНК или ДНК, например геномная ДНК или ДНК, которая комплементарна мРНК нейбластина и/или транскрибирована на этой мРНК ("кДНК"). Таким образом, нуклеиновая кислота нейбластина изобретения, кроме того,включает в себя полинуклеотидные молекулы,которые при очень жестких условиях гибридизации специфично гибридизуются с полинуклеотидом, который кодирует полипептид нейбластина. Данное изобретение также относится к праймерам нуклеиновых кислот, которые пригодны для идентификации, выделения и амплификации полинуклеотидов, которые кодируют полипептиды нейбластина или их фрагменты. В некоторых вариантах изобретения некоторые из этих праймеров являются зондами, специфичными для нейбластина, пригодными для гибридизации с нуклеиновой кислотой нейбластина,но не с нуклеиновыми кислотами, кодирующими другие представители семейства GDNF. Под терминами "специфичный", "специфичность" или "специфично" подразумевается способность гибридизоваться с нуклеиновой кислотой нейбластина и неспособность гибридизоваться с нуклеиновыми кислотами, не являющимися нуклеиновыми кислотами нейбластина, включая неспособность гибридизоваться с нуклеиновыми кислотами, которые однозначно кодируют лиганды GDNF (например GDNF, персефин и нейртурин). В другом варианте нуклеиновой кислотой нейбластина изобретения является такая кислота, которая идентифицируется как нуклеиновая кислота, комплементарная полинуклеотиду,который кодирует полипептид нейбластина либо благодаря тому, что имеет комплементарную последовательность нуклеиновой кислоты, либо путем демонстрации того, что она при очень жестких условиях гибридизации специфично гибридизуется с полинуклеотидом, который кодирует нейбластин. К конкретным нуклеиновым кислотам изобретения без ограничения относятся показанные здесь последовательности нуклеиновых кислот, обозначенные SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 13,SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 29 и SEQ ID NO: 30, а также праймеры SEQ ID NO: 17-28, 31 и 32. Нуклеиновая кислота изобретения, кроме того, включает в себя уникальную область или фрагмент нуклеиновой кислоты нейбластина, включая без ограничения фраг 003734 4 менты нуклеиновой кислоты, показанные на фиг. 8. Нуклеиновые кислоты нейбластина изобретения могут быть использованы для экспрессии полипептида нейбластина, например путем осуществления экспрессии полипептида нейбластина in vitro, или путем введения нуклеиновой кислоты нейбластина животному для экспрессии in vivo. Нуклеиновые кислоты нейбластина могут быть включены в состав векторной нуклеиновой кислоты, например в экспрессирующий вектор или клонирующий вектор. Нуклеиновая кислота нейбластина может, но это не обязательно необходимо, поддерживаться, репродуцироваться, передаваться или экспрессироваться как часть векторной нуклеиновой кислоты. Рекомбинантный экспрессирующий вектор, содержащий полинуклеотидную последовательность нейбластина, может быть введен и/или сохраняться внутри клетки. Клетками,выполняющими функции клеток хозяев для вектора нейбластина, могут быть прокариотические клетки. В альтернативном случае нуклеиновая кислота нейбластина может быть введена в эукариотическую клетку, например в эукариотическую клетку, которая содержит подходящий аппарат посттрансляционного процессинга полипептида в зрелый белок, и/или подходящий аппарат секреции полипептида во внеклеточное окружение клетки. В изобретении также дается характеристика нейбластинового нейротрофического фактора, "нейбластина". Нейбластин может быть в форме полипептида или может быть мультимером из двух или большего количества полипептидов нейбластина, например в форме нейбластинового димера. Полипептиды нейбластина ассоциированы в мультимеры с помощью межмолекулярных структурных связей, известных специалистам в данной области, включая без ограничения взаимодействия цистеин-цистеин,дисульфидные связи и нековалентные взаимодействия. К конкретным полипептидам нейбластина без ограничения относятся аминокислотные последовательности, заявленные здесь и обозначенные SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4,SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7,SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11,SEQ ID NO: 12 и SEQ ID NO: 16. Полипептид нейбластина изобретения пригоден для лечения дефекта нейрона, включая, без ограничения, пораженные нейроны и травмированные нейроны. Периферические нервы, которые испытывают травму, включают в себя, но не ограничиваются этим, черепномозговые нервы, происходящие из продолговатого мозга, или спинно-мозговые нервы. Полипептиды нейбластина пригодны для лечения нейродегенеративного заболевания, например повреждения нейронов в результате ишемии головного мозга, невропатии, например периферической невропатии, болезни Альцгеймера, 5 болезни Гентингтона, болезни Паркинсона, бокового амиотрофического склероза (БАС). Кроме того, предполагается применение полипептидов нейбластина для лечения ослабленной памяти, например ухудшения памяти, связанного с деменцией. Краткое описание рисунков Фиг. 1 является фотографическим изображением двух нозерн-блотов, анализируемых с помощью меченых 32P зондов кДНК нейбластина, где сравниваются относительные уровни экспрессии гена нейбластина в различных типах тканей взрослого человека (панель А) и в различных районах мозга взрослого человека (панель В). Фиг. 2 является фотографическим изображением нозерн-блота, анализируемого с помощью меченого 32P зонда кДНК нейбластина, где сравнивается количество кДНК нейбластина,экспрессированной в нетрансфицированной линии клеток HiB5, с количеством кДНК нейбластина, экспрессированной в линии клеток,трансфицированных кДНК нейбластина, и с линией клеток, трансфицированных GDNFкДНК. Фиг. 3 является фотографическим изображением двух вестерн-блотов, на которых сравниваются уровни экспрессии белка нейбластина в нетрансфицированных клетках HiB5 (дорожка 1) и в линии клеток HiB5, стабильно трансфицированных кДНК нейбластина (дорожка 2), где белок анализировали либо с помощью специфичных для нейбластина антител Ат-2 (левый блот; панель А), либо с помощью специфичных для нейбластина антител Ат-1 (правый блот; панель В). Фиг. 4 является графической иллюстрацией влияния нейбластина на выживаемость культивируемых в среде без сыворотки допаминэргических нейронов вентральной части среднего мозгового пузыря эмбрионов крыс и на ХАТ активность в холинэргических мотонейронах черепно-мозгового нерва. В частности, фиг.4 А является иллюстрацией кривой зависимости ХАТ активности от дозы рекомбинантногоGDNF (расп./мин/ч). Фиг. 4 В является иллюстрацией ХАТ активности (расп./мин/час) при использовании разведенной кондиционированной среды либо от продуцирующих нейбластин,либо от продуцирующих GDNF клеток. Фиг. 4 С является иллюстрацией количества иммунореактивных при анализе на тирозингидроксилазу клеток на лунку. Фиг. 5 является иллюстрацией влияния нейбластина,секретируемого из клетокHiB5pUbilzNBN22 на функционирование и выживаемость культивируемых срезов допаминэргических нейронов вентральной поверхности среднего мозгового пузыря эмбрионов свиней,культивируемых совместно либо с клетками[допамин (пмоль/мл)-день 12] и DIV21 [допамин (пмоль/мл) -день 21], соответственно. Фиг. 5 С является иллюстрацией количества иммунореактивных при анализе на тирозингидроксилазу клеток в культуре [ТГ-ир клеток в культуре] вDIV21. Фиг. 6 является иллюстрацией влияния нейбластина, продуцируемого лентивирусами,на допаминовые нейроны черного вещества invivo. Фиг. 7 представляет собой схематичную диаграмму геномной структуры гена нейбластина, включая нуклеотидные праймеры, которые могут применяться для идентификации полноразмерного гена нейбластина, и их пространственную ориентацию по отношению к геномной последовательности, кодирующей нейбластин (т.е. по отношению к гену). Фиг. 8 является иллюстрацией специфичных для нейбластина праймеров, применяемых для идентификации клона кДНК, кодирующего полипептид нейбластина человека, которые гибридизуются с нуклеиновыми кислотами, которые кодируют полипептиды нейбластина, но не гибридизуются с нуклеиновыми кислотами,кодирующими другие известные представители семейства GDNF (т.е., GDNF, персефин и нейртурин). На фиг. 9 показана нейротрофическая активность полипептидов, заявленных в данном изобретении, в культурах диссоциированных клеток ганглиев задних корешков крыс на различных стадиях развития по сравнению с активностями, достигнутыми в присутствии известных нейротрофических факторов [0 контрольный эксперимент (в отсутствии факторов)]; 1 в присутствии GDNF; 2 в присутствии нейртурина; 3 в присутствии нейбластина изобретения; Э 12 - 12-й эмбриональный день; Э 16 - 16-й эмбриональный день; П 0 - день рождения; П 7 - 7-й день после рождения; и П 15 -15-й день после рождения]. На фиг.10 показана продукция нейбластина линиями клеток СНО. На фиг. 11 показано сравнение связывания нейбластина и GDNF с рецепторами GFR-1 иGFR-3. Фиг.12 представляет собой фотографическое изображение вестерн-блота, на котором показано связывание антипептидного антителаR30 и антипептидного антитела R31 с нейбластином. Фиг.13 представляет собой изображение геля, где показана экстракция нейбластина с помощью аффинного связывания на RETL3-Ig. Фиг. 14 представляет собой карту плазмиды рЕТ 19b-нейбластин наряду с последовательностью синтетического гена нейбластина. Фиг. 15 представляет собой карту плазмиды pMJB164-His-нейбластин, наряду с последо 7 вательностью синтетического генаHisнейбластина. Подробное описание изобретения Заявители идентифицировали нуклеиновую кислоту, которая кодирует новый нейротрофический фактор, который здесь упоминается как "нейбластин" или "NBN". Нейбластин является членом подкласса нейротрофического фактора, полученного из линии глиальных клеток (GDNF) надсемейства нейротрофических факторов трансформирующего фактора роста(TGF-). кДНК, кодирующая нейбластин исходно была идентифицирована следующим образом. Сначала, используя алгоритм TBLASTN 1.4.11(GenBank Инв. AF040962), фрагмент длиной 290 п.н. в высокопроизводительной геномной последовательности (HGTS) двух искусственных бактериальных хромосом, содержащих ДНК человека (ИБХ), был отождествлен с элементами GenBank AC005038 и АС 005051. АС 005038 состоит примерно из 190000 п.н. 5 контигов неупорядоченных последовательностей и АС 005051 состоит примерно из 132000 п.н. 12 контигов неупорядоченных последовательностей. Доказано, что фрагмент длиной 290 п.н., идентифицированный в двух ИБХ клонах,имел районы, которые были гомологичны, но не идентичны кодирующему району кДНК нейротрофического фактора персефина человека. На этой последовательности 290 п.н. были синтезированы два праймера ПЦР, специфичные для нейбластина (праймер верхней цепи[SEQ ID NO: 17] и праймер нижней цепи [SEQID NO: 18]). Был проведен скрининг библиотеки кДНК мозга эмбриона человека. Начальный скрининг включал в себя 96-луночный скрининг, основанный на ПЦР с двумя ПЦРпраймерами [SEQ ID NO: 17 и 18], библиотеки кДНК в основном планшете "Master Plate" с 500000 клонами кДНК, содержащем примерно 5000 клонов/лунку. Вторая основанная на ПЦР проверка проводилась на библиотеке кДНК мозга эмбриона человека в суб-планшете "SubPlate", содержащем глицериновую культуруE.coli примерно с 5000 клонов/лунку. Фрагмент длиной 102 п.н. [SEQ ID NO: 13] был идентифицирован в результате основанного на ПЦР скрининга обеих библиотек в основном планшете (Master Plate) и суб-планшете (SubPlate). Позитивный клон кДНК (содержащий фрагмент длиной 102 п.н.) отбирали и высевали на два планшета, содержащих LB/антибиотик, и выращивали в течение ночи. Из этих планшетов отбирали в общей сложности 96 бактериальных колоний и отдельно высевали в лунки нового 96-луночного планшета для ПЦР, содержащие оба праймера ПЦР [SEQ ID NO: 17 и 18] и все необходимые реагенты для ПЦР амплификации. 8 Затем выполняли ПЦР амплификацию и 96 отдельных ПЦР реакций анализировали с помощью электрофореза в 2% агарозном геле. Затем была идентифицирована позитивная колония с клоном, содержащим фрагмент из 102 п.н. Из позитивной колонии, содержащей фрагмент длиной 102 п.н., была получена и секвенирована плазмидная ДНК. Последующий анализ путем секвенирования выявил наличие полноразмерной кДНК из 861 п.н. [SEQ ID NO: 8]. Открытая рамка считывания (ОРС) длиной 663 п.н. или кодирующий район (CDS), тождественный SEQSEQ ID NO: 9. На основании SEQ ID NO: 9 были идентифицированы три варианта полипептидов нейбластина. Эти варианты включают в себя:NBN140, который имеет аминокислотную последовательность, обозначенную SEQ ID NO: 10;(ii) полипептид из 116 АК, названный здесь NBN116, который имеет аминокислотную последовательность, обозначенную SEQ ID NO: 11; и(iii) полипептид из 113 АК, названный здесь NBN113, который имеет аминокислотную последовательность, обозначенную SEQ ID NO: 12. Полная последовательность кДНК, содержащая 782 п.н. 5' нетранслируемой ДНК, 663 п.н. кодирующей ДНК и 447 п.н. 3' нетранслируемой ДНК (в общем насчитывающая 1992 п.н.), была представлена в GenBank под инвентарным номером AF 120274. Геномная последовательность, кодирующая нейбластин, была идентифицирована следующим образом. С целью клонирования геномной последовательности, кодирующей нейбластин, был получен дополнительный набор праймеров. В частности, пара праймеров 1 включала в себя= SEQ ID NO: 24] и пара праймеров 2 включала в себя [смысловую = SEQ ID NO: 25 и антисмысловую = SEQ ID NO: 26]. С помощью пары праймеров 2 в результате ПЦР из препарата геномной ДНК человека был амплифицирован фрагмент ДНК длиной 887 п.н., клонирован в вектор pCRII (Invitrogen) и в результате трансформации введен в E.coli. Полученная в результате плазмида была секвенирована, и предполагаемая последовательность кДНК из 861 п.н. (кодирующей белок, названный здесь нейбластином) была рассчитана (как указано в SEQ ID NO: 3). Сходным образом, с помощью пары праймеров 1 в результате ПЦР геномной ДНК человека был получен фрагмент ДНК длиной 870 п.н. В этом фрагменте, по сравнению с последовательностью длиной 887 п.н., был обнаружен дополнительный 9 район из 42 п.н. на 3'-конце открытой рамки считывания (ОРС). Геномная структура гена нейбластина была предсказана путем его сравнения с последовательностями нуклеиновых кислот других нейротрофических факторов,путем картирования экзонинтронных границ. Этот анализ показал, что ген нейбластина имеет,по меньшей мере, два экзона, разделенных интроном длиной 70 п.н. Эта последовательность также была использована для скрининга GenBank на наличиеEST последовательностей нейбластина. Три последовательности были идентифицированы с помощью элементов GenBank AA844072,АА 931637 и АА 533512, что свидетельствует о том, что нуклеиновые кислоты нейбластина транскрибируются в мРНК. Сравнение полной последовательности полученной кДНК (AF 120274) и геномной последовательности, присутствующей в элементахGenBank FC005038 и FC005051, показало, что ген нейбластина состоит, по меньшей мере, из пяти экзонов (включая три кодирующих), разделенных четырьмя интронами (см., например,фиг. 8). Вместе экзоны имеют предсказанную последовательность для аминокислот полипептида нейбластина полной длины. Следует также отметить, что было обнаружено, что фрагмент длиной 887 п.н. содержит полный кодирующий район про-нейбластина. Рассчитанная кДНК[SEQ ID NO: 3] содержит открытую рамку считывания (ОРС), кодирующую про-нейбластин(181 аминокислотный остаток), которая проявляет гомологию с тремя известными белками человека - персефином, нейртурином и GDNF. Нуклеиновые кислоты нейбластина по настоящему изобретению Другим аспектом изобретения является предоставление полинуклеотидов, способных экспрессировать полипептиды изобретения. Полинуклеотиды изобретения включают в себя последовательности ДНК, кДНК и РНК, а также антисмысловые последовательности, и включают полинуклеотиды природного происхождения, синтетические и специально приготовленные полинуклеотиды. К полинуклеотидам изобретения также относятся последовательности,которые являются генетически вырожденными,но которые кодируют экспрессию полипептида нейбластина. Как здесь определено, термин "полинуклеотид" относится к полимерной форме нуклеотидов длиной, по меньшей мере, 10 нуклеотидов, предпочтительно, по меньшей мере, длиной 15 нуклеотидов. Под "изолированным полинуклеотидом" подразумевается полинуклеотид, который не соприкасается непосредственно с двумя кодирующими последовательностями, с которыми он непосредственно соседствует (одна на 5' конце и одна на 3' конце) в геноме природного происхождения того организма, из которого он получен. Поэтому термин включает в 10 себя рекомбинантную ДНК, которая встроена в экспрессирующий вектор, в автономно реплицирующуюся плазмиду или вирус, или в геномную ДНК прокариота или эукариота, или который существует в виде отдельной молекулы,например кДНК, независимо от других последовательностей. Полинуклеотиды изобретения также включают в себя аллельные варианты и "мутантные полинуклеотиды", имеющие нуклеотидную последовательность, которая отличается от нуклеотидной последовательности, представленной здесь, по одной или большему количеству нуклеотидных положений. В предпочтительном варианте полинуклеотид изобретения имеет последовательность нуклеиновой кислоты (ДНК), способную гибридизоваться с полинуклеотидной последовательностью, представленной в виде SEQ ID NO: 1,полинуклеотидной последовательностью, представленной в виде SEQ ID NO: 3, полинуклеотидной последовательностью, представленной в виде SEQ ID NO: 8, или полинуклеотидной последовательностью, представленной в виде SEQID NO: 15, с комплементарными им нитями или их суб-последовательностями при, по меньшей мере, средних, средних/жестких или очень жестких условиях, как описано ниже более детально. В другом предпочтительном варианте изолированный полинуклеотид изобретения имеет последовательность нуклеиновой кислотыSEQ ID NO: 1, полинуклеотидной последовательности, представленной в виде SEQ ID NO: 3, полинуклеотидной последовательности, представленной в виде SEQ ID NO: 8, или полинуклеотидной последовательности, представленной в виде SEQ ID NO: 15. В наиболее предпочтительном варианте полинуклеотид имеет последовательность ДНК,представленную в виде SEQ ID NO: 1, последовательность ДНК, представленную в виде SEQID NO: 3, последовательность ДНК, представленную в виде SEQ ID NO: 8, или полинуклеотидную последовательность, представленную в виде SEQ ID NO: 15. Данное изобретение также предоставляет новые праймеры и последовательности ДНК для идентификации, выделения и амплификации полинуклеотидов нейбластина, которые кодируют экспрессию полипептидов нейбластина или их фрагментов. Такие праймеры включают в себя полинуклеотиды, приведенные в SEQ IDNO: 17-28 и 31-32. Кроме того, данное изобретение предоставляет последовательности ДНК нейбластина, образованные с этих праймеров, 11 включая последовательности, приведенные вSEQ ID NO: 13 и 14. Кроме того, данное изобретение предоставляет последовательности ДНК из 3' или 5' нетранслируемых областей ("НТО") геномной ДНК, которые фланкируют экзоны нейбластина; такие последовательности пригодны для идентификации, выделения и амплификации полинуклеотидов нейбластина, которые кодируют экспрессию полипептидов нейбластина или их фрагментов. 3'НТО последовательности изобретения включают в себя последовательности, представленные следующими нуклеотидами: нуклеотиды 721-865 в SEQ ID NO: 1,нуклеотиды 718-861 в SEQ ID NO: 3,нуклеотиды 718-861 в SEQ ID NO: 8,нуклеотиды 1647-2136 в SEQ ID NO: 15 и примыкающие последовательности от 10 до 25 нуклеотидов, полученные из (т.е. являющиеся частью) предшествующих последовательностей (которые пригодны, например, в качестве праймеров). 5'НТО последовательности изобретения включают в себя последовательности, представленные следующими нуклеотидами: нуклеотиды 1-10 в SEQ ID NO: 1,нуклеотиды 1-57 в SEQ ID NO: 8,нуклеотиды 1-974 в SEQ ID NO: 15, и примыкающие последовательности от 10 до 25 нуклеотидов, полученные из (т.е. являющиеся частью) предшествующих последовательностей (которые пригодны, например, в качестве праймеров). Полинуклеотиды изобретения предпочтительно могут быть получены с помощью процедур клонирования, например как описано вWileySons, Inc.]. В предпочтительном варианте полинуклеотид клонируют из или получают на основе геномной ДНК человека или библиотеки кДНК мозга человека. Гомология последовательностей ДНК Гомология последовательностей ДНК, указанных выше, может быть определена по степени идентичности между двумя последовательностями, показывающей происхождение первой последовательности из второй. Гомология может быть надлежащим образом определена с помощью компьютерных программ, известных в данной области, таких как GAP, предоставляемой в пакете программ GCG [Needleman, S.B.and Wunsch C.D., Journal of Molecular Biology 1970, 48, 443-453]. Используя GAP со следующими установочными параметрами для сравнения последовательностей ДНК: штрафной балл при создании GAP 5,0 и штрафной балл при расширении GAP 0,3, кодирующие районы вышеуказанных аналогичных последовательностей ДНК проявляют идентичность предпочтительно, по меньшей мере, на уровне 70%, более предпочтительно, по меньшей мере, 80%, более предпочтительно, по меньшей мере, 90%, болееSEQ ID NO: 15. Термин "идентичность последовательностей" относится к степени, с которой две полинуклеотидные последовательности идентичны по основаниям нуклеотид за нуклеотидом на протяжении конкретной области сравнения. Термин "процент идентичности последовательностей" означает процент, рассчитанный путем сравнения двух оптимально выровненных последовательностей по всей этой области сравнения, определения числа позиций, в которых идентичные основания нуклеиновой кислоты(например А, Т, С, G, U или I) встречаются в обеих последовательностях, чтобы получить количество совпадающих позиций, путем деления количества совпадающих позиций на общее количество позиций в области сравнения (т.е. размер окна) и умножения результата на 100,чтобы получить процент идентичности последовательностей. Термин "значительная идентичность" в том смысле, в котором здесь используется, означает характеристику полинуклеотидной последовательности, при которой полинуклеотид включает в себя последовательность, которая идентична, по меньшей мере, на 80% по последовательности, предпочтительно идентична, по меньшей мере, на 85%, и часто идентична по последовательности на 90-95%,чаще, по меньшей мере, на 99% идентична по последовательности эталонной последовательности на всем протяжении области сравнения. Протокол гибридизации Полинуклеотидами изобретения являются такие полинуклеотиды, которые имеют нуклеотидную последовательность, способную к гибридизации с полинуклеотидной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 1, с полинуклеотидной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 3, или с полинуклеотидной последовательностью, представленной вSEQ ID NO: 8, или с полинуклеотидной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 15, или с комплементарными им цепями, или с их суб-последовательностями, по меньшей мере, при средних, средних/жестких или очень жестких условиях, как более детально описано ниже. Приемлемый экспериментальный режим определения гибридизации между нуклеотидным зондом и гомологичной ДНК или РНК последовательностью включает в себя предварительное вымачивание фильтра, содержащего фрагменты ДНК или РНК, для гибридизации в 5 х SSC [хлорид натрия/цитрат натрия; сравниHarbor, NY 1989] в течение 10 мин и предгибридизацию фильтра в растворе 5 х SSC, 5 х растворе Денхардта [сравни Sambrook et al.; уже цитированная работа], 0,5% SDS и 100 мкг/мл денатурированной озвученной ДНК спермы лосося [сравни Sambrook et al.; уже цитированная работа] с последующей гибридизацией в таком же растворе, содержащем полученный методом рассеянной затравки [Feinberg A. P.Vogelstein В.; Anal.Biochem., 1983, 132, 6-13],меченый 32 Р-дЦТФ (удельная активность 1 х 109 имп/мин/мкг) зонд, в концентрации 10 нг/мл, в течение 12 ч при температуре примерно 45 С. Затем фильтр дважды промывали в течение 30 мин в 0,1 х SSC, 0,5% SDS при температуре, по меньшей мере, 60 С (условия средней жесткости), предпочтительно, по меньшей мере,при 65 С (условия средней/высокой жесткости),более предпочтительно, по меньшей мере, при 70 С (условия высокой жесткости) и еще более предпочтительно, по меньшей мере, при 75 С(условия очень высокой жесткости). Молекулы,с которыми гибридизуется олигонуклеотидный зонд при этих условиях, могут быть выявлены с помощью рентгеновской пленки. Клонированные полинуклеотиды Изолированным полинуклеотидом изобретения, в частности, может быть клонированный полинуклеотид. Как здесь определено, термин"клонированный полинуклеотид" относится к полинуклеотиду или последовательности ДНК,клонированной в соответствии со стандартными процедурами клонирования, используемыми в настоящее время в генетической инженерии для перемещения сегмента ДНК, который, в частности может быть представлен кДНК, т.е. ДНК,полученной ферментативным путем на основе РНК, из его природного положения в другой сайт, где он будет репродуцироваться. Клонирование может осуществляться различными приемлемыми путями и может включать в себя такие методики, как технология, основанная на обратной транскриптазе, ПЦР технология и им подобные, а также вырезание и выделение требуемого сегмента ДНК. Клонированный полинуклеотид изобретения может альтернативно называться "ДНК конструкцией" или "изолированной последовательностью ДНК" и может, в частности, представлять собой комплементарную ДНК (кДНК). Биологические источники Изолированный полинуклеотид изобретения может быть получен из любого приемлемого источника. В предпочтительном варианте этот полинуклеотид изобретения клонируется или создается на основе библиотеки кДНК, например библиотеки кДНК мозга плода или взрослого организма, в частности переднего мозга, заднего мозга, коры головного мозга, полосатого тела, 003734 14 миндалевидного тела, мозжечка, хвостатого ядра, мозолистого тела, гиппокампа, ядер таламуса, ядер гипоталамуса, обонятельного ядра,скорлупы, черного вещества, ганглия заднего корешка, ганглия тройничного, нерва, верхней брыжеечной артерии или таламуса; спинного мозга; сердца; плаценты; легкого; печени; скелетной мышцы; почки; поджелудочной железы; кишечника; глаза; сетчатки; пульпы зуба; волосяного фолликула; предстательной железы; гипофиза; или трахеи. Коммерческие библиотеки кДНК различных тканей, как человека так и других организмов, можно приобрести, например, в Stratagene и Clontech. Изолированный полинуклеотид изобретения может быть получен стандартными способами, например способами, описанными в рабочих примерах. Полипептиды нейбластина по настоящему изобретению Как отмечено выше, "полипептид нейбластина" в используемом здесь смысле представляет собой полипептид, который обладает нейротрофической активностью (например, как описано в примерах 6, 7, 8 и 9) и этот термин включает в себя такие полипептиды, которые имеют аминокислотную последовательность,которая имеет, по меньшей мере, 70% гомологии с полипептидами "нейбластина", представленными AK-95-AK105 в SEQ ID NO: 2, AK1AK105 в SEQ ID NO: 2, AK-97-AK140 в SEQ IDNO: 9 (про), AK1-AK140 в SEQ ID NO: 5 (зрелый,140 АК), AK1-AK116 в SEQ ID NO: 6 (зрелый,116 АК), AK1-АК 113 в SEQ ID NO: 7 (зрелый,113 АК), AK1-AK140 в SEQ ID NO: 10 (зрелый,140 АК), AK1-АК 116 в SEQ ID NO: 11 (зрелый,116 АК), AK1-АК 113 в SEQ ID NO: 12 (зрелый,113 АК), AA1-AA224 в SEQ ID NO: 16 (препро мыши) и варианты, и производные каждого упомянутого выше полипептида. Предпочтительно С-концевая последовательность охарактеризованных выше полипептидов нейбластина имеет аминокислотную последовательность, представленную АК 72-АК 105 вNO: 2 (т.е. АК 76-АК 140 в SEQ ID NO: 9). Также предпочтительно, чтобы в полипептиде нейбластина были сохранены 7 консервативных остатков Cys, которые характерны для семейства GDNF и надсемейства TGF-бета. Предпочтительно полипептид нейбластина имеет аминокислотную последовательность гомологичную более чем на 85%, более предпочтительно гомологичную более чем на 95%,упомянутым выше последовательностям (т.е. 15 4, AK-80-AK140 в SEQ ID NO: 9 (препро "дикого типа"), AK-41-AK140 в SEQ ID NO: 9 (про), AK1AK140 в SEQ ID NO: 5 (зрелый, 140 АК), AK1 АК 116 в SEQ ID NO: 6 (зрелый, 116 АК), AK1 АК 113 в SEQ ID NO: 7 (зрелый, 113 АК), AK1AK140 в SEQ ID NO: 10 (зрелый, 140 АК), AK1 АК 116 в SEQ ID NO: 11 (зрелый, 116 АК), AK1 АК 113 в SEQ ID NO: 12 (зрелый, 113 АК), AK1AK224 в SEQ ID NO: 16 (препро мыши, и предпочтительно любой из вышеупомянутых полипептидов с С-концевой последовательностью охарактеризованных выше полипептидов нейбластина имеет аминокислотную последовательность, представленную АК 72-АК 105 в SEQID NO: 2 (т.е. AK107-AK140 в SEQ ID NO: 9), более предпочтительно AK41-AK105 в SEQ ID NO: 2 (т.е. AK76-AK140 в SEQ ID NO: 9) или AK191AK224 в SEQ ID NO: 16. Кроме того, в изобретении рассматриваются такие полипептиды, которые имеют аминокислотную последовательность, которая, по меньшей мере, на 70% гомологична полипептидам "нейбластина" мышей, представленнымAK1-AK224 в SEQ ID NO: 16. Среди предпочтительных полипептидов изобретения в одном варианте представлены препропоследовательность (как представлено вNO: 4 и 9, соответственно) и последовательность зрелого нейбластина (как представлено вSEQ ID NO: 5, 6, 7, 10, 11 или 12, предпочтительно SEQ ID NO: 10, 11, 12). К полипептидам изобретения относятся варианты полипептидов. В контексте данного изобретения термин "вариант полипептида" означает полипептид (или белок), имеющий аминокислотную последовательность, которая отличается от последовательности, представленной в виде SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ IDNO: 12 или SEQ ID NO: 16 в одном или большем количестве аминокислотных положений. К таким вариантам полипептидов относятся модифицированные полипептиды, описанные выше, а также полипептиды с консервативными заменами, варианты сплайсинга, изоформы, гомологи других видов и полиморфные варианты. Как определено здесь, термин "консервативные замены" означает замену аминокислотного остатка другим, биологически сходным остатком. Например, следует ожидать, что консервативные аминокислотные замены будут оказывать небольшое влияние или не будут оказывать влияния на биологическую активность,особенно если они представляют менее 10% общего количества остатков в полипептиде или белке. Предпочтительно, консервативные аминокислотные замены представляют собой изменения менее 5% полипептида или белка, наибо 003734 16 лее предпочтительно менее 2% полипептида или белка (например, когда расчет проводили в отношении NBN113, наиболее предпочтительно консервативные замены были представлены менее чем 3 аминокислотными заменами в зрелой аминокислотной последовательности дикого типа). В особенно предпочтительном варианте имеется единственная аминокислотная замена в зрелой последовательности, где обе аминокислоты, замещаемая и замещающая, являются нециклическими. К другим конкретным примерам консервативных замен относится замена одним гидрофобным остатком, таким как изолейцин, валин,лейцин или метионин другого остатка, или замена одним полярным остатком другого, такая как замена лизина аргинином, аспарагиновой кислоты глутаминовой кислотой или аспарагина глутамином, и им подобные. Термин "консервативная замена" также включает в себя использование замещенного аминокислотного остатка на месте незамещенного исходного аминокислотного остатка при условии, что антитела, наработанные к замещенному полипептиду, также иммунореактивны по отношению к незамещенному полипептиду. Результатом модификаций этой первичной аминокислотной последовательности могут быть белки, которые, в основном, обладают эквивалентной активностью по сравнению с не модифицированной копией полипептида, и, таким образом, могут считаться функциональными аналогами исходных белков. Такие модификации могут быть преднамеренными, например,как модификации путем сайт-специфичного мутагенеза, или они могут происходить спонтанно и включают в себя варианты сплайсинга,изоформы, гомологи других видов и полиморфные формы. Такие функциональные аналоги также рассматриваются согласно данному изобретению. Кроме того, результатом модификаций первичной аминокислотной последовательности могут быть белки, которые не сохраняют биологическую активность исходного белка, включая доминантные негативные формы, и т.д. Доминантный негативный белок может конкурировать с белком дикого типа, связываясь или другим путем образуя комплекс с регуляторными агентами, такими как компоненты выше по течению или ниже по течению, которые обычно функционально взаимодействуют с полипептидом. Такие доминантные негативные формы также рассматриваются согласно изобретению."Сигнальный пептид" означает пептидную последовательность, которая направляет синтезированный полипептид, с которым этот сигнальный пептид соединен, к эндоплазматическому ретикулюму для дальнейшего посттрансляционного процессинга и размещения."Гетерологичный сигнальный пептид", используемый здесь в контексте с нейбластином, 17 означает сигнальный пептид, который не является сигнальным пептидом нейбластина человека, обычно сигнальный пептид другого белка млекопитающих, отличного от нейбластина. Специалисту понятно, что последовательность ДНК нейбластина человека (либо кДНК,либо геномная ДНК), или последовательности,которые отличаются от ДНК нейбластина человека либо молчащими изменениями кодонов,либо изменениями кодонов, которые вызывают консервативные аминокислотные замены, могут быть использованы для того, чтобы генетически модифицировать культивируемые клетки человека, так что они будут осуществлять сверхэкспрессию и секретировать фермент. Полипептиды данного изобретения также включают химерные полипептиды или способные расщепляться гибридные полипептиды, в которых другой полипептид сливается с Nконцом или С-концом полипептида или его фрагмента. Химерный полипептид может быть получен путем слияния последовательности нуклеиновой кислоты (или ее части), кодирующей другой полипептид, с последовательностью нуклеиновой кислоты (или ее части) данного изобретения. Способы получения химерных полипептидов представляют собой стандартные способы. Такие способы обычно требуют соединения последовательностей таким способом, что они обе оказываются в одной и той же рамке считывания, и экспрессия гибридного полипептида находится под контролем одного и того же промотора(ров) и терминатора. Полипептиды данного изобретения также включают в себя укороченные формы полноразмерной молекулы нейбластина. В таких укороченных молекулах одна или большее количество аминокислот делетированы на N-конце или на С-конце, предпочтительно на N-конце. Гомология аминокислотных последовательностей Степень гомологии отобранного для испытаний полипептида с полипептидом нейбластина изобретения определяется как степень идентичности между двумя аминокислотными последовательностями. Высокий уровень идентичности последовательностей свидетельствует о вероятности того, что первая последовательность получена из второй. Гомология определяется с помощью компьютерного анализа, таким является, но не ограничивает, анализ с помощью ClustalX компьютерной программы выравнивания [Thompson(24): 4876-82], и здесь предлагаются используемые по умолчанию параметры. С использованием этой программы показано, что зрелая часть полипептида, кодируемая аналогичной последо 003734NO: 11, SEQ ID NO: 12 или SEQ ID NO: 16. На основании определения гомологии подтверждено, что полипептид изобретения, относящийся к надсемейству TGF-, относится к субсемейству GDNF, но представляет собой особый член этого семейства. Биологически активные полипептиды Полипептид изобретения может быть представлен какой-либо биологически активной формой, включая форму пре-про-белков, пробелков, зрелых белков, гликозилированных белков, фосфорилированных белков или любого другого посттрансляционно модифицированного белка. Полипептидом изобретения, в частности,может быть N-гликозилированный полипептид,и этот полипептид предпочтительно гликозилирован по N-остаткам, указанным в списках последовательностей. В предпочтительном варианте полипептид изобретения имеет аминокислотную последовательность, представленную в виде SEQ ID NO: 9, содержащую гликозилированный остаток аспарагина в положении 122; аминокислотную последовательность, представленную в видеSEQ ID NO: 10, содержащую гликозилированный остаток аспарагина в положении 122; аминокислотную последовательность, представленную в виде SEQ ID NO: 11, содержащую гликозилированный остаток аспарагина в положении 98; или аминокислотную последовательность,представленную в виде SEQ ID NO: 12, содержащую гликозилированный остаток аспарагина в положении 95. В данном изобретении также рассматриваются гибридные белки нейбластина, такие какIg-гибриды, как описано, например, в патенте США 5434131, включенном сюда в качестве ссылки. В одном варианте изобретение предоставляет полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, показанную в виде SEQ IDNO: 2, или аминокислотную последовательность, которая, по меньшей мере, примерно на 85%, предпочтительно, по меньшей мере, примерно на 90%, более предпочтительно, по меньшей мере, примерно на 98% и наиболее предпочтительно, по меньшей мере, примерно на 99% гомологична последовательности, представленной в виде SEQ ID NO: 2. В другом варианте изобретение предоставляет полипептид, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4 или аминокислотную последовательность, которая, по 19 меньшей мере, на 90%, более предпочтительно,по меньшей мере, на 95%, еще более предпочтительно, по меньшей мере, на 98%, наиболее предпочтительно по меньшей мере на 99% гомологична последовательности, представленной в виде SEQ ID NO: 4. В третьем варианте изобретение предоставляет полипептид, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5 или аминокислотную последовательность, которая, по меньшей мере, на 90%, более предпочтительно,по меньшей мере, на 95%, наиболее предпочтительно, по меньшей мере, на 98%, гомологична последовательности, представленной в видеSEQ ID NO: 5. В четвертом варианте изобретение предоставляет полипептиды, имеющие аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6 или аминокислотную последовательность, которая,по меньшей мере, на 90%, более предпочтительно, по меньшей мере, на 95%, наиболее предпочтительно, по меньшей мере, на 98% гомологична последовательности, представленной в виде SEQ ID NO: 6. В пятом варианте изобретение предоставляет полипептиды, имеющие аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7 или аминокислотную последовательность, которая, по меньшей мере, на 90%, более предпочтительно,по меньшей мере, на 95%, наиболее предпочтительно, по меньшей мере, на 98% гомологична последовательности, представленной в видеSEQ ID NO: 7. Полипептид нейбластина изобретения включает в себя аллельные варианты, например аминокислотные последовательности полипептидов SEQ ID NO: 5-7, в которых Хаа означаетAsn или Thr, и Yaa означает Аlа или Pro. В шестом варианте изобретение предоставляет полипептиды, имеющие аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9 или аминокислотную последовательность, которая,по меньшей мере, на 90%, более предпочтительно, по меньшей мере, на 95%, наиболее предпочтительно, по меньшей мере, на 98% гомологична последовательности, представленной в виде SEQ ID NO: 9. В седьмом варианте изобретение предоставляет полипептид, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10 или аминокислотную последовательность, которая, по меньшей мере, на 90%, более предпочтительно,по меньшей мере, на 95%, наиболее предпочтительно, по меньшей мере, на 98% гомологична последовательности, представленной в видеSEQ ID NO: 10. В восьмом варианте изобретение предоставляет полипептид, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11 или аминокислотную последовательность, которая, по меньшей мере, на 90%, более предпочтительно,по меньшей мере, на 95%, наиболее предпочти 003734SEQ ID NO: 11. В девятом варианте изобретение предоставляет полипептид, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12 или аминокислотную последовательность, которая, по меньшей мере, на 90%, более предпочтительно,по меньшей мере, на 95%, наиболее предпочтительно, по меньшей мере, на 98% гомологична последовательности, представленной в видеSEQ ID NO: 12. В десятом варианте изобретение предоставляет полипептид, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 16 или аминокислотную последовательность, которая, по меньшей мере, на 90%, более предпочтительно,по меньшей мере, на 95%, наиболее предпочтительно, по меньшей мере, на 98% гомологична последовательности, представленной в видеSEQ ID NO: 16, которая является пре-пронейбластином, источником получения которого являются мыши. В другом варианте полипептид изобретения имеет "отпечаток пальцев" субсемействаGDNF, т.е. аминокислотные остатки, подчеркнутые в таблице 3. В следующем варианте изобретение предоставляет полипептид, кодируемый полинуклеотидной последовательностью, способной гибридизоваться в условиях высокой жесткости с полинуклеотидной последовательностью,представленной в виде SEQ ID NO: 1, с комплементарной ей цепью, или ее суб-последовательностью. В предпочтительном варианте полипептид изобретения кодируется полинуклеотидной последовательностью, по меньшей мере,на 70% гомологичной полинуклеотидной последовательности, представленной в виде SEQ IDNO: 1. В наиболее предпочтительном варианте полипептид изобретения кодируется полинуклеотидной последовательностью, представленной в виде SEQ ID NO: 1. В еще одном варианте изобретение предоставляет новые полипептиды, которые кодируются полинуклеотидной последовательностью, способной гибридизоваться в условиях высокой жесткости с полинуклеотидной последовательностью, представленной в виде SEQ IDNO: 3, с комплементарной ей цепью или ее субпоследовательностью. В предпочтительном варианте полипептид изобретения кодируется полинуклеотидной последовательностью,по меньшей мере, на 70% гомологичной полинуклеотидной последовательности, представленной в виде SEQ ID NO: 3. В наиболее предпочтительном варианте полипептид изобретения кодируется полинуклеотидной последовательностью, представленной в виде SEQ ID NO: 3. В еще одном варианте изобретение предоставляет новые полипептиды, которые кодируются полинуклеотидной последовательно 21 стью, способной гибридизоваться в условиях высокой жесткости с полинуклеотидной последовательностью, представленной в виде SEQ IDNO: 8, с комплементарной ей цепью или ее субпоследовательностью. В предпочтительном варианте полипептид изобретения кодируется полинуклеотидной последовательностью,по меньшей мере, на 70% гомологичной полинуклеотидной последовательности, представленной в виде SEQ ID NO: 8. В наиболее предпочтительном варианте полипептид изобретения кодируется полинуклеотидной последовательностью, представленной в виде SEQ ID NO: 8. В еще одном варианте изобретение предоставляет новые полипептиды, которые кодируются полинуклеотидной последовательностью, способной гибридизоваться в условиях высокой жесткости с полинуклеотидной последовательностью, представленной в виде SEQ IDNO: 15, с комплементарной ей цепью или ее субпоследовательностью. В предпочтительном варианте полипептид изобретения кодируется полинуклеотидной последовательностью, по меньшей мере, на 70% гомологичной полинуклеотидной последовательности, представленной в виде SEQ ID NO: 15. В наиболее предпочтительном варианте полипептид изобретения кодируется полинуклеотидной последовательностью, представленной в виде SEQ ID NO: 15. Биологический источник Полипептид изобретения может быть выделен из клеток млекопитающих, предпочтительно из клеток человека или из клеток мыши. В наиболее предпочтительном варианте полипептид изобретения может быть выделен из ткани сердца человека, из скелетной мышцы человека, из поджелудочной железы человека или из ткани головного мозга человека, в частности из хвостатого ядра или из таламуса, или он может быть получен из ДНК, происходящей из клеток млекопитающих, как обсуждается более подробно ниже. Нейротрофическая активность Полипептиды нейбластина изобретения применимы для замедления метаболизма, роста,дифференцировки или выживания нервов или нервных клеток. В частности, полипептиды нейбластина применимы для лечения или смягчения расстройства или заболевания у существующих животных, например у человека, такого нарушения или заболевания, которое поддается действию нейротрофических агентов. Такие обработки и способы лечения более подробно описаны ниже. Антитела Полипептиды нейбластина или полипептидные фрагменты изобретения применяются для получения антител, специфичных для нейбластина. В используемом здесь смысле "специфичными для нейбластина антителом" является антитело, например поликлональное антитело или моноклональное антитело, которое 22 является иммунореактивным по отношению к полипептиду нейбластина или полипептидному фрагменту или которое специфично связывается с эпитопами полипептидов нейбластина. Получение поликлональных и моноклональных антител хорошо известно в данной области. Поликлональные антитела могут быть, в частности, получены, как описано, например,Green et al.,: "Production of Polyclonal Antisera" вmanual" Cold Spring Harbor Lab. Press, 1988. Эти протоколы, таким образом, включены сюда в качестве ссылки. Моноклональные антитела могут быть, в частности, получены как описано,например, KohlerMilstein, Nature, 1975, 256: 495; Coligan et al., в Current Protocols in Immunology, 1992, Section 2.5.1-2.6.7; и Harlow et al., вHarbor, Pub., 1988, page 726; и эти протоколы включены сюда в качестве ссылки. Коротко, моноклональные антитела могут быть получены путем инъекции, например, мышам композиции, содержащей антиген, проверки наличия продукции антител путем отбора образца сыворотки, извлечения селезенки, чтобы получить В-лимфоциты, слияния Влимфоцитов с клетками миеломы для получения гибридом, клонирования гибридом, отбора позитивных клонов, которые продуцируют антитела против антигена, и выделения антител из гибридомных культур. Моноклональные антитела могут быть выделены и очищены из гибридомных культур с помощью множества хорошо разработанных способов, включая аффинную хроматографию с использованием белок-А-сефарозы, эксклюзионную хроматографию по размеру молекул и ионообменную хроматографию, смотри, например, Coligan et аl. в Current Protocols in Immunology, 1992, Section 2.7.1-2.7.12, and Section 2.9.1-2.9.3; и Barnes et al.: "Purification of Immunoglobulin G (IgG)" в Methods in Molecular Biology; Humana Press, 1992, Vol.10, Pages 79-104. Поликлональные или моноклональные антитела далее могут быть необязательно очищены, например, путем связывания и элюирования из матрикса, с которым связан полипептид, к которому выработаны антитела. Антитела, которые связываются с полипептидом нейбластина изобретения, могут быть получены с использованием в качестве иммунизирующего антигена интересующего интактного полипептида или фрагментов, содержащих небольшие пептиды. Полипептид, используемый для иммунизации животного, может быть получен с помощью технологии рекомбинантных ДНК или путем химического синтеза и может 23 быть необязательно конъюгирован с белкомносителем. Обычно используемые белкиносители, которые химически связываются с пептидом, включают в себя гемоцианин моллюска блюдечко (keyhole limpet) (ГМБ), тироглобулин, бычий сывороточный альбумин (БСА) и токсоид столбняка. Затем связанный пептид может использоваться для иммунизации животного, которым может быть, в частности, мышь,крыса, хомячок или кролик. В одном варианте антитела получают, используя следующие пептиды: пептид 1:SEQ ID NO: 9). Способы получения антител с использованием этих полипептидов описаны в примере 10. Авторы также получили поликлональные антитела кролика к следующим пептидам: пептид R27: GPGSRARAAGARGC (аминокислоты 30-43 SEQ ID NO: 9); пептид R28: LGHRSDELVRFRFC (аминокислоты 57-70 SEQ ID NO: 9); пептид R29: CRRARSPHDLSL (аминокислоты 74-85 SEQ ID NO: 9); пептид R30: LRPPPGSRPVSQPC (аминокислоты 94-107 SEQ ID NO: 9); и пептид R31: STWRTVDRLSATAC (аминокислоты 123-136 SEQ ID NO: 9). В данной группе только антитела против пептидов R30 и R31, расположенных относительно близко к С-концу, узнавали денатурированный белок при восстанавливающих условиях на вестерн-блоте. Авторы также идентифицировали дополнительные пептиды, производные нейбластина,полученные из зрелого белка, как описано более детально ниже, которые являются предполагаемыми, экспонированными на поверхности, петлями, это предположение сделано на основании известной структуры GDNF (Eigenbrot and Gerber, Nat.Struct.Biol., 1997, 4, 435-438), и поэтому они пригодны для образования антител: Район 1: CRLRSQLVPVRALGLGHRSDELVDRLSATAC (АК 108-136 SEQ ID NO: 9). Согласно другому аспекту изобретения антитела, которые специфично связывают нейбластин, или полученные на основе нейбластина пептиды, могут применяться для выявления наличия таких нейбластиновых нейротрофических факторов в различных средах, и, в частности,для диагностики состояний или заболеваний,связанных с молекулами нейбластина изобретения. Многочисленные протоколы такого выявления известны в данной области, включая 24 Антитела изобретения также могут применяться для блокирования действия нейротрофического фактора, и, в частности, могут быть нейтрализующими антителами. Способы получения полипептидов изобретения Клетку, содержащую последовательность ДНК, кодирующую полипептид нейбластина изобретения, культивируют в условиях, обеспечивающих продукцию полипептида, с последующим извлечением полипептида из культуральной среды, как описано более подробно ниже. В том случае, когда клетки надо генетически модифицировать в целях получения полипептида нейбластина, клетки могут быть модифицированы обычными способами или путем активации гена. Согласно традиционным способам, молекула ДНК, которая содержит кДНК или геномную последовательность ДНК нейбластина, может находиться в экспрессирующей конструкции и может быть трансфицирована в клетки стандартными способами, включая, но не ограничивая этими способами, трансфекцию, опосредованную липосомами, полибреном или ДЭАЭ декстраном, электропорацию, преципитацию фосфатом кальция, микроинъекцию или скоростные управляемые микроснаряды ("biolistics"). В альтернативном случае можно использовать систему, которая доставляет ДНК с помощью вирусного вектора. К известным вирусам, пригодным для переноса генов, относятся аденовирусы, аденоассоциированный вирус,лентивирус, герпесвирус, вирус эпидемического паротита, полиовирус, ретровирусы, вирус Синдбис и вирус осповакцины, такой как вирус оспы канареек, а также бакуловирусная инфекция клеток насекомых, в частности клеток насекомых SfP9. В альтернативном случае клетки могут быть модифицированы с помощью метода активации генов ("ГА"), такого как описано в патентах США 5733761 и 5750376, каждый из которых включен сюда в качестве ссылки. Таким образом, термин "генетически модифицированный", используемый здесь в отношении клеток, означает получение клеток, которые экспрессируют конкретный генный продукт вследствие введения молекулы ДНК, кодирующей данный генный продукт, и/или регуляторных элементов, которые контролируют экспрессию последовательности, кодирующей генный продукт. Молекула ДНК может быть введена путем направления гена в определенную мишень, что позволяет включать молекулу ДНК в конкретный геномный сайт. Рекомбинантные экспрессирующие векторы Согласно следующему аспекту, изобретение предоставляет рекомбинантный экспрессирующий вектор, содержащий полинуклеотид изобретения. Рекомбинантным экспрессирующим вектором изобретения может быть любой 25 приемлемый эукариотический экспрессирующий вектор. Предпочтительными рекомбинантными экспрессирующими векторами являются вектор pTEJ-8, содержащий промотор убиквитина (Johansen ТЕ, Schoeller MS, Tolstoy S,Schwartz Т; FEBS Lett., 1990, 276, 289-294), и его производные, например pUbilZ. Предпочтительным доступным коммерческим эукариотическим экспрессирующим вектором является,например, вектор pcDNA-3, содержащий вирусный промотор (доступный для приобретения вInvitrogen). В другом предпочтительном экспрессирующем векторе используются ранний промотор SV40 и главный поздний промотор аденовируса(полученные из плазмиды рАD2 бета; Norton and Coffin, Mol.Cell.Biol.,1985, 5, 281). Данное изобретение также предоставляет прокариотические экспрессирующие векторы и синтетические гены (сингены) с оптимизацией кодонов для экспрессии у прокариот. Были сконструированы сингены с более низким содержанием GC и предпочтительно бактериальными (например, E.coli) кодонами. Синген клонирован в двух векторах, рЕТ 19b и pMJB164,производном рЕТ 19b. Конструкции с рЕТ 19b показаны на фиг.14. В этой конструкции последовательность, кодирующая домен зрелого нейбластина, непосредственно сливается с инициирующим кодоном метионина. Конструкция сpMJB164 показана на фиг.15. Клетки-продуценты Согласно еще одному аспекту изобретение предоставляет клетки-продуценты, которые в результате генетических манипуляций содержат изолированную полинуклеотидную последовательность изобретения и/или рекомбинантный экспрессирующий вектор изобретения. Клеткой изобретения может быть, в частности, полученная в результате генетических манипуляций клетка, которая временно или стабильно экспрессирует, сверхэкспрессирует или совместно экспрессирует полипептид изобретения. Способы получения временной или стабильной экспрессии известны в данной области. Полинуклеотид изобретения может быть встроен в экспрессирующий вектор, например в плазмиду, вирус или другой экспрессирующий переносчик, и путем лигирования оперативно сцеплен с последовательностями, контролирующими экспрессию так, чтобы экспрессия кодирующей последовательности достигалась при условиях, которые сочетаются с последовательностями, контролирующими экспрессию. Приемлемые контролирующие экспрессию последовательности включают в себя промоторы,энхансеры, терминаторы транскрипции, стартовые кодоны, сигналы сплайсинга интронов и стоп-кодоны, все они содержатся в правильной рамке считывания полинуклеотида изобретения так, чтобы обеспечить правильную трансляцию мРНК. Последовательности, контролирующие 26 экспрессию, также могут включать в себя дополнительные компоненты, такие как лидерные последовательности и последовательности гибридного партнера. Промотор может быть, в частности, конститутивным или индуцибельным промотором. При клонировании в бактериальных системах могут быть использованы такие индуцибельные промоторы, как pL бактериофага , plac, ptrp,ptac (ptrp-lac гибридный промотор). При клонировании в системах млекопитающих могут использоваться промоторы, полученные из генома клеток млекопитающих, например промотор убиквитина, промотор ТК или промотор металлотионеина, или из вирусов млекопитающих,например длинный концевой повтор ретровирусов, поздний промотор аденовирусов или промотор 7,5 К вируса осповакцины. Для обеспечения транскрипции полинуклеотида изобретения также могут быть использованы промоторы,полученные с помощью техники рекомбинантных ДНК или синтетическим способом. Обычно приемлемые экспрессирующие векторы содержат точку начала экспрессии,промотор, а также специфичные гены, которые позволяют проводить фенотипическую селекцию трансформированных клеток, и включают в себя векторы, подобные основанному на Т 7 экспрессирующему вектору для экспрессии в клетках бактерий [Rosenberg et al.; Gene, 1987,56, 125], pTEJ-8, pUbilZ, pcDNA-3 и pMSXND экспрессирующие векторы для экспрессии в клетках млекопитающих [Lee and Nathans, J.Biol. Chem., 1988, 263, 3521], векторы, полученные на основе бакуловирусов, для экспрессии в клетках насекомых, и экспрессирующий вектор ооцитов PTLN [Lorenz С, Pusch М.Jentsch T.novel properties; Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1996,93, 13362-13366]. В предпочтительном варианте клетка изобретения является эукариотической клеткой,например клеткой млекопитающих, например клеткой человека, ооцитом или дрожжевой клеткой. Клеткой изобретения, без ограничения,может быть клетка эмбриональной почки человека (НЕК), например клетка НЕК 293, клетка ВНК 21, клетка яичника китайского хомячка(СНО), клетка ооцита Xenopus laevis (XLO). В другом варианте клетка изобретения является клеткой грибов, например клеткой нитчатого гриба. В другом предпочтительном варианте клетка представляет собой клетку насекомого,наиболее предпочтительно клетку Sf9. Дополнительными предпочтительными клетками млекопитающих изобретения являются линии клеток РС 12, HiB5, RN33b и клетки-предшественники нервных клеток человека. Наиболее предпочтительными являются клетки человека. Примеры первичных или вторичных клеток включают в себя фибробласты, эпителиальные клетки, включая эпителиальные клетки мо 27 лочной железы и кишечника, эндотелиальные клетки, форменные элементы крови, включая лимфоциты, и клетки костного мозга, глиальные клетки, гепатоциты, кератиноциты, мышечные клетки, нервные клетки или предшественники этих типов клеток. Примеры иммортализованных линий клеток человека, пригодные для применения в представленных способах, включают в себя, но не ограничиваются этим, клетки меланомы Bowes (ATCC инвентарный No. CRL 9607), клетки Daudi (ATCC инвентарный No.(АТСС инвентарный No. CCL 243), клетки рака молочной железы MCF-7 (АТСС инвентарный(АТСС инвентарный No. CCL 155), клетки U937 (АТСС инвентарный No. CRL 1593), сублиния WI-38VA13 клеток 2R4 (АТСС инвентарный No. CLL 75.1) и клетки карциномы яичника 2780AD (Van der Blick et al., Cancer Res., 1988,48, 5927-5932), а также гетерогибридомные клетки, полученные путем слияния клеток человека и клеток других видов. Также могут быть использованы вторичные линии фибробластов человека, такие как WI-38 (АТСС инвентарныйCCL 171). В том случае, когда клетка изобретения представляет собой эукариотическую клетку,включение гетерологичного полинуклеотида изобретения может быть, в частности, проведено путем инфекции (с применением вирусного вектора), путем трансфекции (с применением плазмидного вектора), с помощью преципитации фосфатом кальция, микроинъекции, электропорации, липофекции или другими физикохимическими способами, известными в данной области. В более предпочтительном варианте изолированная последовательность полинуклеотида изобретения и/или рекомбинантный экспрессирующий вектор изобретения трансфицируются в клетку-хозяина млекопитающих, клеткупредшественника нервной клетки, астроглиальную клетку, Т-клетку, гемопоэтическую стволовую клетку, неделящуюся клетку или эндотелиальную клетку мозга, содержащую, по меньшей мере, одну молекулу ДНК, способную опосредовать иммортализацию клеток и/или трансформацию. Активация эндогенного гена в клеткехозяине может быть выполнена путем введения регуляторных элементов, в частности путем 28 введения промотора, способного влиять на транскрипцию эндогенного гена, кодирующего полипептид нейбластина изобретения. Фармацевтические композиции Согласно другому аспекту изобретение предоставляет новые фармацевтические композиции, содержащие терапевтически эффективное количество полипептида изобретения. Для применения в терапевтических целях полипептид изобретения может быть введен в любой подходящей форме. В предпочтительном варианте полипептид изобретения включается в фармацевтическую композицию вместе с одним или большим количеством адъювантов, наполнителей, носителей и/или разбавителей, и фармацевтическая композиция готовится специалистом стандартными способами, известными в данной области. Такие фармацевтические композиции могут содержать полипептид изобретения или антитело против него. Композиция может вводиться отдельно или в комбинации с одним или с большим количеством других агентов, лекарственных средств или гормонов. Фармацевтическая композиция данного изобретения может быть введена любым приемлемым способом, включая, но не ограничивая этим, пероральное, внутривенное, внутримышечное, внутриартериальное, интрамедуллярное, внутритрахеальное, внутрижелудочковое,трансдермальное, подкожное, внутрибрюшинное, интраназальное, через тонкий кишечник,локальное, подъязычное или ректальное применение, трансбуккальное, вагинальное, внутриглазничное, интрацеребральное, внутричерепное, интраспинальное, внутрижелудочковое,внутрицистерновое, интракапсулярное, внутрилегочное, через слизистые оболочки или путем ингаляции. Способы, аппаратура и приготовление лекарственного средства для внутрилегочной доставки описаны, например, в патентах США 5785049, 5780019 и 5775321, каждый из которых включен сюда в качестве ссылки. Введение может быть в виде периодических инъекций ударных доз препарата, или может проводиться более непрерывно путем внутривенного или внутриперитонеального введения из резервуара, который находится снаружи (например, баллонIV) или внутри (например, биологически разлагаемый имплантат, искусственный биологический орган или колония имплантированных клеток, продуцирующие нейбластин). См., например, патенты США 4407957, 5798113 и 5800828, каждый из которых включен сюда в качестве ссылки. Способы и аппаратура для внутрилегочной доставки описаны, например, в патентах США 5654007, 5780014 и 5814607,каждый из которых включен сюда в качестве ссылки. Введение нейбластина согласно данному изобретению может быть достигнуто, в частно 29 сти, с помощью любых приемлемых способов доставки, включая:Cancer Research, 44:1698 (1984), включенные сюда в качестве ссылки),(b) микрокапсулирование (смотри, например, патенты США 4352883; 4353888 и 5084350,включенные сюда в качестве ссылки),(c) полимерный имплантат непрерывного высвобождения (смотри, например, Sabel, патент США 4883666, включенный сюда в качестве ссылки),(d) макрокапсулирование (смотри, например, патенты США 5284761, 5158881, 4976859 и 4968733 и опубликованные РСТ заявки на патент WO 92/19195, WO 95/05452, каждая из которых включена сюда в качестве ссылки),(e) непокрытые или некапсулированные клеточные трансплантаты в ЦНС (смотри, например, патенты США 5082670 и 5618531, каждый из которых включен сюда в качестве ссылки),(f) инъекции, либо подкожные, внутривенные, внутриартериальные, внутримышечные,либо в другое приемлемое место; и(g) пероральное введение в капсуле, жидкости, таблетке, пилюле или композиции замедленного высвобождения. В одном варианте данного изобретения нейбластин доставляется непосредственно в ЦНС, предпочтительно в желудочки мозга, паренхиму мозга, подоболочечное пространство или в другие приемлемые места ЦНС, наиболее предпочтительно в подоболочечное пространство. Другим предпочтительным вариантом авторы считают системную доставку путем подкожной инъекции, внутривенного введения или внутривенной инфузии. Другие применяемые парентеральные системы доставки включают в себя частицы сополимера этиленавинилацетата, осмотический насос, имплантируемые системы инфузии, доставку с помощью насоса, доставку капсулированных клеток, доставку липосомами, инъекции через иглу, инъекции без иглы, распылитель,аэрозоли-затор, электропорацию и трансдермальный пластырь. Дальнейшие детали способов получения композиции и введения можно найти в последней редакции Remington's Pharmaceutical Sciences (Maack Publishing Co., Easton, PA). Активный ингредиент может вводиться в виде одной или нескольких доз в сутки. В настоящее время подходящими считаются дозы между 0,5 нг нейбластина/кг веса тела до примерно 50 мкг/кг на одно введение и примерно от 1,0 нг/кг до примерно 100 мкг/кг в сутки. Фармацевтическая композиция, содержащая нейбластин, должна обеспечивать локальную концентрацию нейротрофического фактора при 003734("ЦСЖ") до 25 нг/мл ЦСЖ. Конечно, вводимая доза должна быть тщательно подобрана в соответствии с возрастом,весом и состоянием человека, которому проводится лечение, и также, конечно, практикующий врач должен определять путь введения, лекарственную форму и схему приема лекарственного средства, желаемый результат и точную дозу. В следующем варианте полипептид нейбластина изобретения может быть введен с помощью генной доставки, с применением клеточных линий и векторов, как описано ниже в способах лечения. Чтобы создать такие терапевтические линии клеток, полинуклеотид изобретения может быть встроен в экспрессирующий вектор, например плазмиду, вирус или другой экспрессирующий переносчик, и сцеплен в одном опероне с последовательностями, контролирующими экспрессию, путем лигирования так, чтобы экспрессия кодирующей последовательности достигалась при условиях, совместимых с последовательностями, контролирующими экспрессию. Приемлемые контролирующие экспрессию последовательности включают в себя промоторы, энхансеры, терминаторы транскрипции, стартовые кодоны, сигналы сплайсинга интронов и стоп-кодоны, все они содержатся в правильной рамке считывания полинуклеотида изобретения так, чтобы обеспечить правильную трансляцию мРНК. Последовательности, контролирующие экспрессию,также могут включать в себя дополнительные компоненты, такие как лидерные последовательности и последовательности гибридного партнера. Промотор может быть, в частности, конститутивным или индуцируемым промотором. Конститутивные промоторы могут быть синтетическими, вирусными или полученными из генома клеток млекопитающих, например промотор убиквитина человека. В предпочтительном варианте терапевтическая клеточная линия будет представлять собой непрерывно делящуюся линию нервных клеток, экспрессирующую полипептид изобретения. При имплантации авторы полагают имплантировать примерно от 105 до 1010 клеток, более предпочтительно от 106 до примерно 108 клеток. Способы лечения Данное изобретение, которое относится к полинуклеотидам и белкам, полипептидам, пептидным фрагментам или полученным на их основе производным, а также к антителам, направленным против таких белков, пептидов или производных, может применяться для лечения или облегчения расстройства или заболевания животных, включая человека, тех расстройств или заболеваний, которые восприимчивы к действию нейротрофических агентов. Полипептиды данного изобретения могут применяться непосредственно, например, по 31 средством инъекционных, имплантируемых или принимаемых внутрь фармацевтических композиций для лечения патологического процесса,чувствительного к полипептидам нейбластина. Полинуклеотиды изобретения, включая комплементарные им последовательности, могут применяться для экспрессии нейротрофического фактора изобретения. Это может достигаться с помощью линий клеток, экспрессирующих такие белки, пептиды или производные изобретения, или с помощью вирусных векторов, кодирующих такие белки, пептиды или производные изобретения, или с помощью клеток-хозяев, экспрессирующих такие белки, пептиды или производные. Эти клетки, векторы и композиции могут вводиться для обработки области-мишени, чтобы повлиять на процесс заболевания, чувствительный к полипептидам нейбластина. Приемлемые экспрессирующие векторы могут быть получены на основе лентивирусов,ретровирусов, аденовирусов, герпесвирусов или вирусов осповакцины, или на основе плазмид,полученных из бактерий, и могут применяться для in vivo доставки нуклеотидных последовательностей в целый организм или в мишень в виде органа, ткани или популяции клеток. К другим способам относятся, но не ограничивают этим, трансфекция с помощью липосом, электропорация, трансфекция с помощью пептидов носителей, содержащих сигналы ядерной или другой локализации, и генная доставка посредством систем замедленного высвобождения. Согласно еще одному аспекту изобретения для ингибирования или усиления экспрессии нейбластина могут применяться "антисмысловые" нуклеотидные последовательности, комплементарные гену нейбластина или его частям. Согласно еще одному аспекту изобретение относится к способу лечения или облегчения расстройства или заболевания животных, включая человека, такого расстройства или заболевания, которое чувствительно к действию нейротрофических агентов. Расстройством или заболеванием может быть, в частности, повреждение нервной системы в результате травмы, операции, ишемии,инфекции, болезней обмена веществ, дефицита питательных веществ, злокачественного процесса или токсических агентов и генетических или идиопатических процессов. Повреждение может, в частности, произойти в чувствительных нейронах или клетках ретинального ганглия, включая нейроны ганглия заднего корешка или в любой из следующих тканей: ганглий коленца, нижний ганглий языкоглоточного нерва или узловатый ганглий; вестибулярно-слуховой комплекс VIII-го черепного нерва; вентролатеральный полюс верхне- и нижнечелюстной доли узла тройничного нерва; и ядро среднемозгового тракта тройничного нерва. 32 В предпочтительном варианте способа изобретения заболеванием или расстройством является нейродегенеративное заболевание, в которое вовлечены поврежденные или травмированные нейроны, в частности, травматические повреждения периферических нервов, продолговатого мозга и/или спинного мозга, повреждение нейронов в результате ишемии головного мозга, невропатия и особенно периферическая невропатия, травма или повреждение периферического нерва, ишемический инсульт, острое повреждение головного мозга, острое повреждение спинного мозга, опухоли нервной системы, рассеянный склероз, воздействие нейротоксинов, болезни обмена веществ, такие как сахарный диабет или нарушение функции почек, и повреждение, вызванное инфекционными агентами, нейродегенеративные заболевания, включая болезнь Альцгеймера, болезнь Гентингтона,болезнь Паркинсона, синдром с проявлениями болезни Паркинсона, прогрессирующий супрануклеарный паралич (синдром Стила-Ричадсона-Ольшевского),оливопонтоцеребеллярную дегенерацию (ОПЦД), синдром Шая-Дрейджера(множественная системная атрофия), комплекс деменция-паркинсонизм (Гуам-тип), боковой амиотрофический склероз или любое другое врожденное или нейродегенеративное заболевание, и ухудшение памяти, связанное с деменцией. Предпочтительным вариантом авторы считают лечение чувствительных нейронов и/или нейронов автономных систем. Другим предпочтительным вариантом авторы полагают лечение заболеваний мотонейронов, таких как боковой амиотрофический склероз ("БАС") и спинальная амиотрофия. Еще одним предпочтительным вариантом авторы считают применение молекул нейбластина данного изобретения для ускорения восстановления нервов после травматического поражения. В одном варианте авторы предполагают применение канала управления нервом с помощью матрикса, содержащего полипептиды нейбластина. Такие каналы управления нервами заявлены, например, в патенте США 5834029, включенном сюда в качестве ссылки. В предпочтительном варианте полипептиды и нуклеиновые кислоты изобретения (и фармацевтические композиции, которые их содержат) используются для лечения периферических невропатий. Среди периферических невропатий предполагается лечить молекулами данного изобретения индуцированные травмами невропатий, например такие, которые вызваны физическим повреждением или патологическим состоянием, физическое повреждение головного мозга, физическое повреждение спинного мозга,инсульт, связанный с повреждением мозга, и неврологические нарушения, связанные с нейродегенерацией. 33 Авторы также предполагают лечение невропатий, индуцированных химиотерапией (таких как невропатий, вызванные поступлением химиотерапевтических средств, например таксола или цисплатина); невропатий, индуцированных токсинами, невропатий, индуцированных лекарственными средствами, невропатий,индуцированных недостатком витаминов; идиопатических невропатий; и диабетических невропатий. См., например, патенты США 5496804 и 5916555, каждый из которых включен сюда в качестве ссылки. Авторы также предполагают лечение не невропатических болезней, множественных мононевропатий, полиневропатий, включая аксональную и демиелинизирующую невропатий, с помощью нуклеотидов и полипептидов нейбластина изобретения. В другом предпочтительном варианте полипептиды и нуклеиновые кислоты данного изобретения (и фармацевтические композиции,которые их содержат) применяются для лечения различных заболеваний глаза, включая разрушение фоторецепторов сетчатки у пациентов,страдающих дегенерацией желтого пятна, пигментным ретинитом, глаукомой и сходными заболеваниями. Другим объектом данного изобретения является предоставление способа предотвращения дегенеративных изменений, связанных с указанными выше заболеваниями и расстройствами, путем имплантации в мозг млекопитающих,включая человека, векторов или клеток, способных продуцировать биологически активную форму нейбластина или предшественника нейбластина, т.е. молекулу, которая в организме легко может быть превращена в биологически активную форму нейбластина, или клетки, которые секретируют нейбластин, могут быть дополнительно капсулированы, например, в полупроницаемые мембраны. Клетки могут выращиваться in vitro в целях применения для трансплантации или приживления в мозг млекопитающих, включая человека. В предпочтительном варианте ген, кодирующий полипептид изобретения, трансфицируется в подходящую клеточную линию, например в линию непрерывно делящихся стволовых нервных клеток крыс, подобную HiB5 иRN33b, или в линию иммортализованных предшественников нервных клеток человека, и полученная в результате линия клеток имплантируется в мозг живого организма, включая человека, чтобы секретировать терапевтический полипептид изобретения в ЦНС, например с помощью экспрессирующих векторов, описанных в заявке на международный патент WO 98/32869. Способы диагностики и скрининга Нуклеиновая кислота нейбластина может быть использована для определения того, пред 003734 34 расположен ли индивидуум к развитию неврологического расстройства, возникающего из-за дефекта в гене нейбластина, например дефекта в аллели нейбластина, который получен благодаря генетическому наследованию, из-за аномального эмбрионального развития или в результате приобретенного повреждения ДНК. Анализ может проводиться, например, путем выявления делеции(ций) или точковой мутации(ций) в пределах гена нейбластина или путем выявления наследования такой предрасположенности к этим генетическим дефектам на основе полиморфизма длин специфичных фрагментов рестрикции (ПДРФ), путем выявления наличия или отсутствия нормального гена нейбластина с помощью гибридизации образца нуклеиновой кислоты пациента с зондом(ами) нуклеиновой кислоты, специфичным для гена нейбластина, и выявлением способности зонда гибридизоваться с нуклеиновой кислотой. В частности, в качестве зонда для гибридизации может использоваться нуклеиновая кислота нейбластина. Такие гибридизационные исследования могут применяться для обнаружения, прогнозирования, диагностики или наблюдения за различными состояниями, расстройствами или заболеваниями, связанными с отклоняющимися от нормы уровнями мРНК, кодирующих белок нейбластина. Нуклеиновая кислота нейбластина может быть сконструирована в качестве "маркера" физиологических процессов, зависимых от нейротрофического фактора нейбластина. К таким процессам относятся, но не ограничиваются ими, "нормальные" физиологические процессы (например, функция нейронов) и патологические процессы (например, нейродегенеративные болезни). Характеристика конкретной субпопуляции пациентов с аберрантными (т.е. повышенными или недостаточными) уровнями белка нейбластина и или мРНК, кодирующей нейбластин, может привести к разработке новой классификации болезней. Термин "аберрантные уровни" в используемом здесь смысле, означает повышенный или пониженный уровень относительно уровня контрольного образца или индивидуума, не имеющего нарушений, выявляемых количественными или качественными способами. Нуклеиновые кислоты и полипептиды нейбластина изобретения могут быть также использованы для скрининга и идентификации аналогов нейбластина, включая небольшие молекулы миметиков нейбластина. В одном рассматриваемом варианте изобретение предоставляет способ идентификации соединения, предполагаемого кандидата, которое индуцирует опосредуемое нейбластином биологическое действие, способ, включающий в себя этапы подготовки тестируемой клетки, в которой при контакте с нейбластином индуцируется экспрессия регистрируемого продукта, воздействие на эту клетку выбранного для исследования со 35 единения и выявление регистрируемого продукта. Экспрессия регистрируемого продукта является показателем способности выбранного для исследования соединения индуцировать опосредуемое нейбластином биологическое действие. Кроме того, нуклеиновые кислоты и полипептиды нейбластина данного изобретения могут быть использованы в ДНК чипах или белковых чипах или в компьютерных программах для идентификации близких новых генных последовательностей и белков, кодируемых ими, включая аллельные варианты и полиморфные формы, отличающиеся только одним нуклеотидом("ОНП"). Такие способы описаны, например, в патентах США 5795716, 5754524, 5733729,5800992, 5445934, 5525464, каждый из которых включен сюда в качестве ссылки. Примеры Пример 1. Способы выделения нуклеиновых кислот нейбластина. Способ 1. Быстрый скрининг кДНК мозга эмбриона человека на наличие гена нейбластина. Фрагмент длиной 290 п.н. был идентифицирован в двух высокопроизводительных геномных последовательностях (ВПГП), представленных в GenBank (Инвентарный No.AC005038 и АС 005051), на основе их гомологии с персефином человека. На последовательности нуклеиновой кислоты фрагмента длиной 290 п.н. были синтезированы два специфичных для нейбластина праймера. Праймер верхней цепи гена нейбластина ("NBNint.смысловой") имел последовательность 5'-ССТ GGC CAG CCTACT GGG-3' [SEQ ID NO: 17]. Праймер нижней цепи гена нейбластина ("NBNint. антисмысловой") имел последовательность 5'-AAG GAGACC GCT TCG TAG CG-3' [SEQ ID NO: 18]. С использованием этих праймеров были выполнены 96-луночные ПЦР реакции. 96-луночный основной планшет, содержащий плазмидную ДНК 500000 клонов кДНК,был заполнен примерно по 5000 клонов в лунке. 96-луночный суб-планшет использовали с глицериновой культурой E.coli DH10B, и он содержал по 50 клонов в лунке. Нуклеиновую кислоту нейбластина идентифицировали в результате трех раундов амплификации с помощью технологии полимеразной цепной реакции ("ПЦР"); амплификация увеличивала число копий нуклеиновой кислоты в образце. Скрининг на основном планшете. С помощью метода 96-луночного ПЦР скрининга, описанного выше, был проведен скрининг кДНК мозга эмбриона человека на основном планшете с помощью ген-специфичных праймеров, чтобы выделить кДНК нейбластина человека. Из соответствующей лунки основного планшета было получено тридцать нанограмм(30 нг) кДНК мозга эмбриона человека (6 36 нг/мкл; Origen Technologies) и ее вносили в смесь общим объемом 25 мкл, которая содержала следующие реагенты: 0,2 мМ каждого из указанных выше ген-специфичных праймеров (т.е.NBNint.смысловой и NBNint.антисмысловой), 1 х стандартный буфер ПЦР (Буфер V, AdvancedLaboratories, USA); и 0,5 единиц ДНК полимеразы Taq (5 ед/мкл; Advanced Biotechnologies,UK). Термоциклические ПЦР реакции проводили с помощью следующей процедуры и при следующих условиях. Вначале ДНК денатурировали при 94 С в течение 3 мин, и затем следовали 35 циклов денатурации при 94 С по 1 мин каждая, отжиг при 55 С в течение 1 мин, первая элонгация при 72 С в течение 90 с; и конечная элонгация при 72 С в течение 5 мин. Продукты 96 индивидуальных ПЦР реакций анализировали путем гель-электрофореза с использованием 2% агарозного геля, содержащего краситель бромид этидия. Было обнаружено, что выявленный в лунке позитивный ПЦР продукт длиной 102 п.н. соответствует единственному 96 луночному суб-планшету. Фрагмент нуклеиновой кислоты длиной 102 п.н. имел следующую последовательность Скрининг на суб-планшетах. Проводили скрининг 96-луночного суб-планшета мозга эмбриона человека с помощью опосредованной ПЦР амплификации, путем помещения 1 мкл глицериновой культуры из соответствующей лунки суб-планшета в смесь с общим объемом 25 мкл, содержащую: 0,2 мМ каждого из двух ген-специфичных праймеров; 1 х стандартный буфер ПЦР (Буфер V, Advanced Biotechnologies,UK), 0,2 мМ дНТФов (Amersham-Pharmacia),0,1 М GC-расплав (Clontech Laboratories, USA); и 0,5 единиц ДНК полимеразы Taq (5 ед/мкл; Advanced Biotechnologies, UK). Были использованы такие же условия термоциклических ПЦР, как описано для скрининга на основном планшете. 96 индивидуальных ПЦР реакций анализировали на 2% агарозном геле, содержащем бромид этидия, и идентифицировали позитивную лунку, из которой получали фрагмент ПЦР длиной 102 п.н. ПЦР колоний: 1 мл глицериновой культуры из позитивной лунки суб-планшета разбавляли 1:100 в среде Луриа (LB). 1 мл и 10 мл указанного выше разведения помещали в два отдельных планшета с агаром, содержащим среду Луриа ("LB"), и 100 мкг/мл карбенициллина. Затем LB планшеты инкубировали в течение ночи при 30 С. 96 колоний из этих планшетов собирали в новый 96-луночный ПЦР планшет,содержащий 0,2 мМ каждого из двух указанных 37 выше ген-специфичных праймеров, 1 х стандартный буфер ПЦР (Буфер V, Advanced Biotechnologies, UK), 0,2 мМ дНТФов (AmershamPharmacia), 0,1M GC-расплав (Clontech Laboratories, USA); и 0,5 единиц ДНК полимеразы Taq (5 ед/мкл; Advanced Biotechnologies, UK) в конечном объеме 25 мкл. Были использованы такие же условия термоциклических ПЦР, как описано для скрининга на основном планшете. 96 индивидуальных ПЦР реакций анализировали на 2% агарозном геле, содержащем бромид этидия. Потом идентифицировали позитивную колонию, содержащую фрагмент длиной 102 п.н. При секвенировании плазмидной ДНК, полученной из этой позитивной колонии, обнаружена кДНК полной длины из 861 п.н. [SEQ ID[SEQ ID NO: 9]. Автоматизированное секвенирование ДНК выполняли с помощью набора терминаторов цикла секвенирования BigDye(РЕ Applied Biosystems, USA). Разделение в секвенирующих гелях проводили на ABI Prism 377(РЕ Applied Biosystems, USA). Способ 2. Клонирование кДНК нейбластина мозга человека. Дополнительный способ амплификации кДНК нейбластина полной длины или фрагмента кДНК может быть выполнен с помощью RACE (быстрая амплификация концов кДНК) и специфичных для нейбластина праймеров NBNint. смыслового и NBNint. антисмыслового, описанных выше, в комбинации с праймерами, специфичными для вектора или адаптера, например, используя набор для амплификации ДНК Marathon (Clontech Laboratories, USA, Cat. No. K1802-1). Готовая полная кДНК мозга человекаNo. 7400-1) может быть использована для амплификации полноразмерной кДНК нейбластина. К пригодным для амплификации праймерам относятся праймер верхней цепи нейбластина 5'-ATGGAACTTGGACTTGG-3' [SEQ ID NO: 19] ("NBNext.смысловой") и праймер нижней цепи нейбластина 5'-TCCATCACCCACCGGC-3'[SEQ ID NO: 20] ("NBNext.антисмысловой") в комбинации с адаптерным праймером AP1,включенным в набор с готовой кДНК Marathon. Также использовали альтернативный праймер верхней цепи 5'-CTAGGAGCCCATGCCC-3'[SEQ ID NO: 28]. Также может быть использован другой альтернативный праймер нижней цепи 5'-GAGCGAGCCCTCAGCC-3' [SEQ IDNO: 33]. Подобным образом, также могут использоваться альтернативные праймеры нижней цепи SEQ ID NO: 24 и 26. Способ 3. Клонирование кДНК нейбластина мозга человека. Другим способом клонирования кДНК нейбластина является скрининг библиотек мозга взрослого организма и эмбриона человека с помощью одного или большего количества описанных здесь зондов нейбласти 003734 38 на (и как приведено в примере на фигуре 1). К этим библиотекам относятся: gt11 библиотека мозга человека (Clontech Laboratories, USA, Cat.No HL3002b); или gt11 библиотека мозга эмбриона человека (Clontech Laboratories, USA,Cat. No HL3002b). Способ 4. Быстрый скрининг кДНК эмбриона мыши на ген нейбластина. Процедура быстрого скрининга на наличие гена нейбластина была выполнена следующим способом. 96-луночный основной планшет, содержащий плазмидную ДНК 500000 клонов кДНК, был заполнен примерно по 5000 клонов на лунку. 96-луночный суб-планшет был использован с глицериновой культурой E.coli и содержал по 50 клонов на лунку. Было выполнено три раунда опосредованной ПЦР амплификации, чтобы идентифицировать интересующий ген (т.е. ген нейбластина). Скрининг на основном планшете: проводили скрининг основного планшета, заполненного очищенной кДНК мыши, с помощью ПЦР в 96 лунках, используя ген-специфичные праймеры, чтобы выделить кДНК нейбластина мыши. Были синтезированы следующие два праймера:GGTTCTCCAG-3' [SEQ ID NO: 22]. С помощью этих двух ген-специфичных праймеров был идентифицирован позитивный ПЦР продукт длиной 220 п.н. Нуклеиновая кислота длиной 220 п.н. имела следующую последовательность Затем были выполнены ПЦР реакции в 96 лунках следующим образом. Тридцать нанограмм кДНК мозга эмбриона мыши (6 нг/мкл;Origen Technologies) получали из соответствующих лунок основного планшета и вносили в смесь общим объемом 25 мкл, которая также содержала: 0,2 мМ каждого из двух указанных выше ген-специфичных праймеров (т.е. С 2 праймера (NBNint.смысловой) и праймера нейбластина С 2 ас (NBNint.антисмысловой, 1 х стандартный буфер ПЦР (Буфер V, AdvancedLaboratories, USA); и 0,5 единиц ДНК полимеразы Taq (5 ед/мкл; Advanced Biotechnologies,UK). Были использованы следующие условия ПЦР термоциклирования: начальная денатурация при 94 С в течение 3 мин, с последующими 35 циклами денатурации при 94 С по 1 мин ка 39 ждая, отжига при 55 С в течение 1 мин, элонгации при 72 С в течение 90 с; и конечной элонгации при 72 С в течение 5 мин. 96 индивидуальных ПЦР реакций анализировали в 2% агарозном геле, содержащем краситель бромид этидия. Было обнаружено, что позитивный ПЦР продукт длиной 220 п.н., выявленный в лунке, соответствует единственному 96-луночному суб-планшету. Затем 96 индивидуальных ПЦР реакций анализировали с помощью электрофореза в 2% агарозном геле, содержащем краситель бромид этидия. Позитивный ПЦР продукт, который был идентифицирован, соответствовал единственной лунке 96 луночного суб-планшета. Скрининг на суб-планшете: проводили скрининг 96-луночного суб-планшета мозга эмбриона мыши с помощью опосредованной ПЦР амплификации, путем помещения 1 мкл глицериновой культуры из соответствующих лунок суб-планшета в смесь с конечным общим объемом 25 мкл, которая содержала: 0,2 мМ каждого из двух указанных выше ген-специфичных праймеров; 1 х стандартный буфер ПЦР (БуферV, Advanced Biotechnologies, UK), 0,2 мМ дНТФов (Amersham-Pharmacia), 0,1 М GCрасплав (Clontech Laboratories, USA); и 0,5 единиц ДНК полимеразы Taq (5 ед/мкл; AdvancedBiotechnologies, UK). ПЦР термоциклирование было выполнено в соответствии с условиями,описанными выше для скрининга основного планшета. Затем 96 индивидуальных ПЦР реакций анализировали на 2% агарозном геле, содержащем бромид этидия и идентифицировали позитивную лунку, в которой получали фрагмент длиной 220 п.н. ПЦР колоний: один мл глицериновой культуры из позитивной лунки суб-планшета разбавляли 1:100 в среде Луриа (LB). Затем один мл и 10 мл указанного выше разведения помещали в два отдельных LB планшета, содержащих 100 мкг/мл карбенициллина, и инкубировали в течение ночи при 30 С. Были выделены в общей сложности 96 колоний и перенесены в 96-луночный ПЦР планшет, содержащий: 0,2 мМ каждого из двух указанных выше ген-специфичных праймеров, 1 х стандартный буфер ПЦР (Буфер V, Advanced Biotechnologies,UK), 0,2 мМ дНТФов (Amersham-Pharmacia),0,1M GC-расплав (Clontech Laboratories, USA); и 0,5 единиц ДНК полимеразы Taq (5 ед/мкл; Advanced Biotechnologies, UK) в конечном объеме 25 мкл. ПЦР термоциклирование было выполнено в соответствии с условиями, описанными выше(см. "скрининг на основном планшете" ниже). 96 индивидуальных ПЦР реакций анализировали с помощью гель-электрофореза в 2% агарозном геле, содержащем бромид этидия. Идентифицировали позитивную колонию по наличию фрагмента длиной 220 п.н. Из этой позитивной 40 колонии была получена плазмидная ДНК. Клон секвенировали с помощью автоматизированного секвенирования ДНК, используя набор терминаторов цикла секвенирования BigDye (РЕ Applied Biosystems, USA) с ДНК полимеразой AmpliTaq. Разделение в секвениру-ющих гелях проводили на ABI Prism 377 (РЕ Applied Biosystems, USA). В полученной последовательности этого клона выявлена полноразмерная кДНК из 2136 п.н. [SEQ ID NO: 15]. кДНК включает в себя открытую рамку считывания с рассчитанной аминокислотной последовательностью, показанной в SEQ ID NO: 16, которая кодирует полипептид пре-про-нейбластина. Пример 2. Клонирование геномной последовательности нейбластина. Как обсуждалось выше, заявители идентифицировали фрагмент нуклеиновой кислоты длиной 290 п.н. в двух ИБХ клонах человека с помощью элементов GenBank (с инвентарнымиNo. AC005038 и АС 005051), которые имели области гомологии с персефином и с фланкирующими последовательностями персефина. Заявители использовали 861 п.н. предсказанной последовательности, описанной выше, чтобы разработать дополнительные праймеры с целью клонирования нуклеиновой кислоты, кодирующей дополнительные нуклеиновые кислоты нейбластина, с помощью компьютерной программы Lasergene (DNAStar, Inc.). Были использованы две пары праймеров, чтобы клонировать ген нейбластина с помощью ПЦР реакций на геномной ДНК. Две пары праймеров показаны ниже. Пара праймеров No. 1 5'-CCA AgC CCA CCT ggg TgC ССТ СТТ ТСТ СС-3' (смысловой) [SEQ ID NO: 23]. 5'-CAT CAC CCA CCg gCA ggg gCC TCTTCTgC-3' (антисмысловой) [SEQ ID NO: 26]. Используя пару праймеров No.1, амплифицировали фрагмент ДНК длиной 887 п.н. из препарата геномной ДНК человека, приобретенной в Clontech Laboratories (Кат. No. 6550-1). Протокол ПЦР: ПЦР была выполнена с использованием высокоточной ПЦР системыExpand (Boehringer Mannheim) с буфером 1. В реакционную смесь для ПЦР добавляли 5% диметилсульфоксида (ДМСО) и 17,5 пмоль каждого из дНТФ в общем объеме 50 мкл. Термоциклирование выполняли с этапом предварительной денатурации при 94 С в течение 2 мин, с последующими 35 двухстадийными циклами при 94 С в течение 10 с и при 68 С в течение 1 мин, соответственно. Термоциклирование заканчивали инкубацией при 68 С в течение 5 мин. Термоциклирование проводили в термоциклере ДНК РТС-225 Engine Tetrad thermocy 41cler (MJ Research, MA). Продукты ПЦР анализировали с помощью электрофореза в 2% агарозе (FMC) и затем фотографировали. Фрагмент длиной 887 п.н., амплифицированный на геномной ДНК человека с помощью пары праймеров 1, клонировали в вектореpCRII (Invitrogen) и использовали для трансформации компетентных клеток E.coli XL 1Blue (Stratagene). Полученная в результате плазмида, названная нейбластин-2, была секвенирована с помощью термосеквеназы (Amersham Pharmacia Biotech). Продукты секвенирования анализировали с помощью электрофореза на автоматическом секвенаторе ALFExpress(Amersham Pharmacia Biotech). Фрагменты, полученные ПЦР амплификацией геномной ДНК человека с помощью второй пары праймеров (пара праймеров 2, указанная выше), секвенировали, при этом выявили дополнительную область из 42 п.н. на 3'-конце открытой рамки считывания. Последовательность полной длины анализировали путем ее сравнения с последовательностями нуклеиновых кислот других нейротрофических факторов,а также путем картирования экзон-интронных границ с помощью компьютерных программ нахождения генов, которые идентифицируют возможные соединения при сплайсинге и области с высокой вероятностью кодирования, используя компьютерные программы Netgene иGene Mark (Brunak et al., J. Mol. Biol., 1991, 220,49-65); Borodovsky et al., Nucl.Acids Res., 1995,23, 3554-62). Границы экзонов-интронов были подтверждены с помощью кДНК, полученной при быстром скрининге, описанном выше. Как показано на фиг.7, полученный в результате ген нейбластина имеет два экзона, разделенных интроном длиной 70 п.н. Вместе экэоны содержат предсказанную аминокислотную последовательность полипептида нейбластина полной длины. Предсказанная кДНК [SEQID NO: 3] содержит открытую рамку считывания (ОРС), кодирующую 238 аминокислотных остатков [SEQ ID NO: 4]. Клон нейбластин-2 содержал полную кодирующую последовательность про-нейбластина. Аминокислотная последовательность, кодируемая геном, проявляла высокую гомологию с тремя белками, персефином, нейртурином и GDNF. Пример 3. Экспрессия нуклеиновых кислот нейбластина. Экспрессия РНК нейбластина была выявлена как в нервной, так и в ненервной ткани у грызунов и человека и на различных стадиях развития молодого и взрослого организма с помощью способов, описанных ниже. Способ выявления экспрессии РНК нейбластина с помощью ОТ-ПЦР На основании последовательности ДНК нейбластина, обозначенной SEQ ID NO: 1, были синтезированы следующие праймеры:GGTCCACGGTTCTCCAG-3' [SEQ ID NO: 22]. Этот набор праймеров был использован для ОТ-ПЦР амплификации фрагмента ДНК на мРНК целого мозга взрослого организма и эмбриона человека. Среди фрагментов ДНК, полученных с помощью этой реакции, один был длиной 220 п.н. Идентификация этого фрагмента ДНК длиной 220 п.н. подтвердила, что ген нейбластина экспрессируется в тканях мозга взрослого организма и эмбриона. Фрагмент ДНК длиной 220 п.н. был также амплифицирован на геномной ДНК с использованием этих праймеров. Способ выявления экспрессии РНК нейбластина с помощью нозерн-блот гибридизации Нозерн блоты с полиА+ РНК из тканей взрослого человека были получены от коммерческого поставщика (Clontech Laboratories,USA) и исследованы с помощью 32P-меченого зонда нейбластиновой кДНК. Меченая кДНК нейбластина была получена в соответствии со способом, описанным выше в примере 1. Подготовка зондов: фрагмент нуклеиновой кислоты нейбластина (нуклеотиды 296-819 SEQID NO: 8) метили с помощью набора для мечения Rediprime II (Amersham; Катал. No.RPN1633) для того, чтобы использовать в качестве зонда при гибридизации, как рекомендовано изготовителем. Коротко, образец ДНК разбавляли до концентрации 2,5-25 нг в 45 мкл 10 мМ буфера ТЭ (10 мМ трис-НСl, рН 8,0, 1 мМ ЭДТА). Затем ДНК денатурировали нагреванием образца до 95-100 С в течение 5 мин в кипящей водяной бане, быстро охлаждали образец,помещая его в лед на 5 мин, и затем его недолго центрифугировали, чтобы содержимое переместилось ко дну реакционной пробирки. Все количество денатурированной ДНК добавляли вместе с 5 мкл [32 Р]дЦТФ Redivue (Amersham Pharmacia Biotech Ltd.) в реакционную пробирку,содержащую буферный раствор дАТФ, дГТФ,дТТФ, свободный от экзонуклеазы фермент Кленова и случайный праймер в сухой стабилизированной форме. Раствор перемешивали пипетированием вверх и вниз 2 раза, вращая кончик пипетки в растворе, и реакционную смесь инкубировали при 37 С в течение 10 мин. Реакцию мечения останавливали добавлением 5 мкл 0,2 М ЭДТА. Для использования в качестве зонда для гибридизации меченую ДНК денатурировали до одноцепочечных нитей путем нагревания образца ДНК до 95-100 С в течение 5 мин, затем мгновенно охлаждая образец ДНК на льду в течение 5 мин. Пробирку центрифугировали, и ее содержимое хорошо перемешивали. В конце одноцепочечный ДНК зонд очищали с помощью набора для удаления нуклеотидов 43 Способы гибридизации: готовые нозерн блоты были приобретены от коммерческого поставщика ("Multiple Tissue Northern Blots, Clontech Laboratories, USA, No. по каталогу 7760-1 и 7769-1), и гибридизацию проводили в соответствии с инструкциями изготовителя, используя 32 Р-меченый нейбластиновый зонд, приготовленный как описано выше. Для гибридизации использовали раствор ExpressHyb (ClontechLaboratories, USA) и применяли концентрацию меченого зонда примерно 3 нг/мл. Раствор ExpressHyb нагревали до 68 С и затем перемешивали, чтобы растворить какой бы то ни было осадок. Каждую нозерн блот мембрану (10 х 10 см) предгибридизовали по меньшей мере в 5 мл раствора ExpressHyb при 68 С в течение 30 мин в термостате для гибридизации Hybaid в соответствии с инструкциями производителя. 32 Рмеченый нейбластиновый зонд денатурировали при 95-100 С в течение 2 мин и затем быстро охлаждали на льду. Четырнадцать микролитров(14 мкл) меченого зонда добавляли к 5 мл свежего ExpressHyb и тщательно перемешивали. Раствор ExpressHyb, использованный в предварительной гибридизации, заменяли путем равномерного распределения над блотами 5 мл свежего раствора ExpressHyb, содержащего меченый зонд ДНК. Блоты инкубировали при 68 С в течение 1 ч в термостате для гибридизацииHybaid. После инкубации блоты смывали и несколько раз промывали в мягких условиях (2 х(Amersham Pharmacia Biotech Ltd.) при -80 С,используя усиливающие экраны. Результаты экспериментов по нозерн блот гибридизации представлены на фиг.1. Фиг.1 А(слева) и фиг.1 В (справа) представляют собой нозерн блоты полиА+ РНК, которые были тестированы с помощью 32 Р-меченого зонда кДНК нейбластина, как описано в примере 3. Маркеры представлены нуклеотидами размером 1,35 тысяч пар нуклеотидов ("т.п.н."), 2,4 т.п.н., 4,4 т.п.н., 7,5 т.п.н. и 9,5 т.п.н. Мембрана, представленная на фиг. 1 А, была получена с мРНК, экстрагированной из различных тканей взрослого человека. На основании результатов анализа с помощью нозерн блот гибридизации заявители сделали вывод, что мРНК нейбластина экспрессируется во многих тканях взрослого человека. Самый высокий уровень экспрессии нейбластина выявлен в сердце, скелетной мышце и в поджелудочной железе. Мембрана, показанная на фиг. 1 В, была получена с РНК, экстрагированной из различных районов головного мозга взрослого человека. В пределах головного мозга взрослого организма самый высокий уровень экспрессии наблюдается в хвостатом ядре и в 44 таламусе. Предпочтительной формой мРНК нейбластина, экспрессируемой в мозге был транскрипт мРНК длиной примерно 5 т.п.н. Способ выявления экспрессии мРНК нейбластина с помощью in situ гибридизации в тканях Чтобы измерить экспрессию РНК нейбластина в тканях животных, например тканях грызунов, с помощью антисмыслового нейбластинового зонда, использовали следующие способы. Экспрессия у мышей Подготовка образцов ткани: мышей (ВКUniversal, Stockholm, Sweden) забивали во время беременности путем смещения шейных позвонков на 13,5 или 18,5 день беременности. При вскрытии в стерильных условиях извлекали эмбрионы и сразу же погружали в раствор 0,1 М фосфатного буфера (ФБ), содержащего 4% параформальдегида ("ПФА"), на 24-30 часов и затем извлекали из ПФА и хранили в ФСБ(фосфатно-солевой буфер). Ткань готовили для получения срезов путем погружения ткани в раствор 30% сахарозы и затем заключали в блоки Tissue Tech (О.С.Т. Compound, Sakura FinetekUSA, CA). Делали шесть серий коронарных или сагиттальных срезов (12 мкм каждый) в криостате и размораживали, помещая на положительно заряженные предметные стекла. Головы/мозг новорожденных (П 1, П 7) фиксировали,следуя такому же протоколу, как и для эмбриональных стадий, и ткани мозга взрослого организма рассекали, сразу же замораживали на сухом льду и делали срезы в криостате без какоголибо предварительного заключения в блоки. Подготовка рибозондов нейбластина: антисмысловой нейбластиновый РНК зонд (ниже"рибозонд нейбластина") получали следующим образом. Нуклеотиды 1109-1863 последовательности кДНК нейбластина мыши [SEQ ID NO: 15] субклонировали в векторе BlueScript (Stratagene). Полученную в результате плазмиду разрезали для получения линейной ДНК с помощью рестрикционной эндонуклеазы EcoRI.EcoRI фрагмент ДНК транскрибировали in vitro с помощью РНК полимеразы Т 3 и набора для мечения РНК дигоксигенином ("ДИГ") в соответствии с инструкциями производителя (Boehringer Mannheim). Гибридизация: криостатированные срезы фиксировали в течение 10 мин в 4% ПФА, обрабатывали в течение 5 мин 10 мг/мл протеиназы К, последовательно дегидратировали в 70% и 95% этаноле в течение 5 и 2 мин, соответственно, и затем давали высохнуть на воздухе. Буфер для гибридизации (50% деионизованного формамида, 10% раствора сульфата декстрана 50% концентрации, 1% раствор Денхардта, 250 мкг/мл дрожжевой тРНК, 0,3 М NaCl, 20 мМ трис-HCl (рН 8), 5 мМ ЭДТА, 10 мМ NaPO4, 1% саркозил), содержащий 1 мкг/мл ДИГ-меченого зонда, нагревали при 80 С в течение 2 мин и наносили на срезы. Затем срезы покрывали па 45 рафильмом и инкубировали при 55 С в течение 16-18 ч. На следующий день срезы промывали в условиях высокой жесткости (2 х SSC, содержащий 50% формамид) при 55 С в течение 30 мин и затем промывали в буфере для РНКазы и инкубировали с 20 мкг/мл РНКазыА в течение 30 мин при 37 С. Чтобы выявить ДИГ-меченый зонд, срезы предварительно инкубировали в блокирующем растворе (ФСБ, содержащий 0,1% твина-20 и 10% инактивированной нагреванием сыворотки козы) в течение 1 ч и затем инкубировали в течение ночи при 4 С с антиДИГ антителами, соединенными со щелочной фосфатазой, в разведении 1:5000 (BoehringerMannheim). На следующий день для каждого среза проводили четыре двухчасовые промывки в ФСБ, содержащем 0,1% твин-20, и затем проводили две десятиминутные промывки в буфереNTMT (100 мМ NaCl, 100 мМ трис-НСl (рН 9,5),50 мМ MgCl2, 0,1% твин-20). Затем срезы инкубировали в ВМ-фиолетовом субстрате, содержащем 0,5 мг/мл левамизола в течение 48 ч. Цветную реакцию останавливали промыванием в ФСБ. Срезы сушили на воздухе и покрывали покровным стеклом с DPX (KEBO-lab, Sweden). Результаты реакций in situ гибридизаций представлены в табл. 1. Таблица 1. Экспрессия нейбластина у мышей Взрослый Э 13.5 Э 18.5 П 1 П 7 организм Передний мозг Вентральная часть среднего мозга Ганглии дорсаль ных корешков Спинной мозг ного нерва Полосатое тело Как показано в табл. 1, на 13,5 эмбриональный день ("Э 13,5") нейбластин экспрессировался в спинном мозге и в заднем мозге и слабо в переднем мозге. Экспрессия нейбластина также была выявлена в развивающейся сетчатке и в чувствительных ганглиях (ганглии дорсальных корешков и ганглии тройничного нерва (V. Вне нервной системы слабый сигнал был обнаружен в почке, легком и кишечнике,что свидетельствует о том, что нейбластин также экспрессируется в этих тканях. На 18,5 эмбриональный день ("Э 18,5") более заметно нейбластин экспрессировался в ганглии тройничного нерва (V). Экспрессия нейбластина была также выявлена в сетчатке,полосатом теле и коре головного мозга. Кроме того, экспрессия наблюдалась в зачатке зуба. 46 Снова обращаясь к табл. 1, увеличенная экспрессия нейбластина от временной точки,соответствующей Э 18,5, до постнатальных дней 1 и 7 наблюдалась в коре головного мозга, полосатом теле и ганглии тройничного нерва (V). Экспрессия нейбластина была более заметной в наружных слоях коры головного мозга, чем во внутренних слоях коры головного мозга. На П 7 экспрессия была обнаружена в тех же структурах, как и на 1 день, дополнительно экспрессия нейбластина была обнаружена в гиппокампе,особенно в зубчатой извилине и в мозжечке. В мозге взрослых мышей нейбластин строго экспрессировался в зубчатой извилине при очень низких или нерегистрируемых уровнях экспрессии нейбластина в других тестируемых тканях. Экспрессия у крыс Следующий эксперимент описывает гибридизацию тканей крыс с олигодезоксинуклеотидным нейбластиновым антисмысловым зондом, меченым щелочной фосфатазой. Подготовка образцов тканей: эмбрионы крыс (Э 14) получали от беременных крыс Wistar(Mollegaard Breeding, Denmark) после анестезии пентобарбиталом. Крыс в постнатальный период (П 0, П 7, взрослых) забивали декапитацией. Вскрытый мозг и целые головы сразу же погружали в холодный 0,9% NaCl, свежезамораживали и готовили срезы по 20 мкм в криостате (коронарные и сагиттальные срезы, 10 серий).In situ гибридизация: Две серии срезов гибридизовали, используя антисмысловой олигодезоксинуклеотидный зонд,коньюгированный с щелочной фосфатазой (ЩФ) (5'NCA GGT GGT CCG TGG GGG GCG CCA AGACCG G-3' [SEQ ID NO: 27], Oligo. No. 164675,DNA Technology, Denmark). Этот зонд комплементарен основаниям с 1140 до 1169 кДНК нейбластина мыши SEQ ID NO: 15. Перед гибридизацией срезы сушили на воздухе при комнатной температуре, нагревали до 55 С в течение 10 мин и затем обрабатывали 96% этанолом при 4 С в течение ночи. Затем срезы сушили на воздухе и инкубировали в среде для гибридизации (5,0 пмоль зонда/мл) в течение ночи при 39 С (Finsen et al., Neurosci.,1992, 47, 105-113; West et al., J.Comp.Neurol.,1996, 370, 11-22). Пост-гибридизационная обработка состояла из четырех тридцатиминутных промывок в 1 х SSC (0,15M NaCl, 0,015 М цитрат Na) при 55 С с последующими тремя десятиминутными промывками в трис-HCl, рН 9,5, при комнатной температуре перед нанесением проявителя ЩФ. Проявитель ЩФ готовили непосредственно перед использованием, и он содержал нитросиний тетразолий (NBT, Sigma), 5-бром, 4-хлор, 3 индолилфосфат (BCIP, Sigma) и трис-HCl-MgCl2 буфер, рН 9,5 (Finsen et al., Neurosci., 1992, 47,105-113). Проявление ЩФ проходило в темноте при комнатной температуре в течение 48 ч. Цветную реакцию останавливали промыванием 47 срезов в дистиллированной воде. Срезы дегидратировали градиентными промывками ацетоном, размягчали в ксилолфенол креозоте (Allchem, UK), очищали в ксилоле и покрывали покровными стеклами, используя Eukitt (BieBerntsen, Denmark). Контрольные реакции состояли из (1) предварительной обработки срезов РНКазойА(50 мкг/мл, Pharmacia, Sweden) перед гибридизацией; (2) гибридизации срезов со стократным избытком немеченого зонда; и (3) гибридизации срезов только в присутствии одного буфера для гибридизации. Результаты реакций гибридизации представлены в табл. 2. Таблица 2. Экспрессия нейбластина у крыс Взрослый Э 14 П 0/П 1 П 7 организм Передний мозг Вентральная часть среднего мозга Ганглии дорсальных В эмбрионах крыс на 14 эмбриональный день (Э 14) нейбластин слабо экспрессировался в переднем мозге, в заднем мозге и в спинном мозге. мРНК нейбластина была также выявлена в глазе (сетчатка), ганглиях дорсальных корешков, ганглиях тройничного нерва (V) и в почках,легких, сердце, печени и кишечнике. У новорожденных крыс (ПО) заметная экспрессия нейбластина была в коре головного мозга и полосатом теле. Экспрессия нейбластина была также выявлена в обонятельной доле и в гиппокампе. У 7-дневных крыс (П 7) нейбластин экспрессировался в коре головного мозга, полосатом теле,обонятельной доле и в мозжечке. Заметный сигнал был виден в гиппокампе. У взрослых крыс в большинстве областей мозга были выявлены очень низкие или нерегистрируемые уровни экспрессии нейбластина. Слабые сигналы были выявлены в таламическом ядре, и заметная экспрессия нейбластина была выявлена в гиппокампе. Пример 4. Полипептиды нейбластина. Открытая рамка считывания или кодирующий район (КДП), обозначенный SEQ IDNO: 8, кодирует пре-про-полипептид (называемый "пре-про-нейбластин"). Аминокислотная последовательность, предсказанная на основе открытой рамки считывания, показана в SEQ IDNO: 9. На основании SEQ ID NO: 9 были идентифицированы три варианта полипептидов нейбластина. К этим вариантам относятся:NBN116, который имеет аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 11; иNBN113, который имеет аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 12; Сходным образом, на основании кодирующего района (КДП), указанного в SEQ ID(указанную в SEQ ID NO: 4), были идентифицированы три варианта нейбластина. К этим вариантам относятся:(i) полипептид, который имеет аминокислотную последовательность, указанную в SEQ(ii) полипептид, который имеет аминокислотную последовательность, указанную в SEQ(iii) полипептид, который имеет аминокислотную последовательность, указанную в SEQID NO: 7; На основании множественного совмещения последовательностей, которое базируется наGDNF, персефина и нейртурина. Это совмещение показано в табл. 3. Таблица 3. Сравнение аминокислотной последовательности нейбластина с персефином, нейртурином и GDNF показывает положения, которые имеют отдельный полностью консервативный остаток;: показывает, что одна из следующих "строгих" групп полностью консервативна: - STA, NEQK, NHQK, NDEQ,QHRK, MILV, MILF, НY, FYW;показывает, что одна из следующих "менее строгих" групп полностью консервативна:- CSA, ATV, SAG, STNK, STPA,SGND, SNDEQK, NDEQHK, NEQHRK, VLIM, HFY. На основании совмещения аминокислотных последовательностей, показанных в табл. 3,можно видеть, что нейбластин имеет семь кон 49 сервативных остатков в положениях, которые консервативны в пределах надсемейства TGF-. В одном варианте предпочтительный полипептид нейбластина содержит (семь) цистеи-нов,консервативных как в SEQ ID NO: 2 в положениях 8, 35, 39, 72, 73, 101 и 103, или как в SEQID NO: 4 и 9 в положениях 43, 70, 74, 107, 108,136 и 138. Известно, что эти семь консервативных остатков цистеина в надсемействе TGFобразуют внутримономерные дисульфидные связи (предполагаемые, например, в SEQ IDNO: 2 между остатками цистеина 8-73, 35-101 и 39-103, и, например, в SEQ ID NO: 4 и 9 между остатками цистеина 43-108, 70-136 и 74-138) и одну дисульфидную связь между мономерами 50 между остатками цистеина 72-72, и, например, вSEQ ID NO: 4 и 9 между остатками цистеина 107-107), которая вместе с протяженным бета районом нити составляет консервативный структурный мотив надсемейства TGF-. См.,например, Daopin et al., Proteins, 1993, 17, 176192. На основании этого совмещения последовательностей было показано, что нейбластин является членом GDNF субсемейства нейротрофических факторов (LGLG-FR(Y/F)CSGSCQxCCRP-SAxxCGC, фингерпринт субсемействаGDNF, подчеркнутый в табл. 3). Была рассчитана гомология нейбластина и других представителей семейства GDNF и результаты представлены ниже в табл. 4. Таблица 4. Гомология полипептидов нейбластина с другими представителями семейства GDNF Зрелый белок NBN140 Зрелый белок NBN113 Гомология полноГомология размерных пептиГомология дов Нейротрофический факторGDNF = нейротрофический фактор, полученный из линии глиальных клеток.IHA = ингибинTGF-2 = трансформирующий фактор роста - 2. Строгая гомология указывает на то, что следующие "строгие" группы являются консервативными: STA, NEQK, NHQK, NDEQ, QHRK,MILV, MILF, HY, FYW. Пример 5. Получение нейбластина. Авторы получили нейбластин в обоих типах клеток эукариотических и прокариотических, как описано ниже. Экспрессирующие векторы Полноразмерная кДНК, кодирующая нейбластин, была встроена в эукариотический экспрессирующий вектор pUbilZ. Этот вектор был создан путем клонирования промотора UbC человека в модифицированную версию pcDNA3.1/Zeo. Немодифицированный pcDNA3.1/Zeo доступен для коммерческого приобретения (Invitrogen). Модифицированный pcDNA3.1/Zeo меньше чем исходный вектор, поскольку из него были удалены ген ампициллина (положения с 3933 до 5015) и последовательность в положениях от 2838 до 3134. В этой модифицированной версииpcDNA3.1/Zeo промотор CMV был заменен промотором UbC из pTEJ-8 (Johansen et al.,FEBS Lett., 1990, 267, 289-294), давая в результате pUbilZ. Экспрессия в клетках млекопитающих Затем вектор pUbilZ, содержащий кодирующие последовательности нейбластина, был трансфицирован в линию клеток млекопитающих HiB5, которая является иммортализованной линией нервных клеток крысы (Renfranz et al.,Cell, 1991, 66, 713-729). Было создано несколько линий клеток HiB5, стабильно экспрессирующих нейбластин (как было определено с помощью ОТ-ПЦР). В одной из этих стабильных клеточных линий HiB5pUbilzNBN22 экспрессия была подтверждена с помощью гибридизации суммарной РНК на нозерн блоте с нейбластиновым зондом, меченым 32P. Результаты этих исследований показаны на фиг. 2. ЗатемHiB5pUbilzNBN22 была использована в качестве источника нейбластина для изучения нейротрофической активности нейбластина. На фиг. 2 показана экспрессия кДНК нейбластина в клоне HiB5pUbilzNBN22 (т.е. нозерн блот анализ с помощью 32 Р-меченой нейбластиновой кДНК данного изобретения, как описано ниже). Блот был приготовлен с помощью суммарной РНК, экстрагированной из нетрансфицированных клеток HiB5, клеток HiB5pUbilzNBN22 и HiB5pUbilzGDNF14, соответственно,как показано. На блоте указаны положения 28S и 18S рРНК полос, соответствующих 4,1 т.п.н. и 1,9 т.п.н, соответственно. Как показано на фиг. 3, антитела, индуцированные против полипептидов производных нейбластина, также узнавали белок размером примерно 13 килодальтон ("кД") в кондиционированной среде клона HiB5pUbilzNBN22, но не в среде нетрансфицированных клеток HiB5(сравни пример 6). Были определены предсказанные молекулярные массы немодифицированных (т.е. при отсутствии пост-трансляционных модификаций) полипептидов нейбластина NBN140 [SEQ ID[SEQ ID NO: 12] - 14,7 килодальтон ("кД"), 12,4 кД и 12,1 кД, соответственно. Способы Нозерн блот с суммарной РНК (10 мкг) из нетрансфицированных клеток HiB5 и клонаHiB5pUbilzNBN22 был приготовлен путем электрофореза в 0,8% формальдегидно-агарозном геле и блотированием на нейлоновую мембрану(Duralone, Stratagene). Блот гибридизовали и промывали, как описано в примере 3, с использованием 32 Р-меченого зонда размером 1,3 т.п.н., полученного путем случайного мечения,охватывающего SEQ ID NO: 8 и дополнительные нуклеотиды из 5'НТР и 3'НТР кДНК нейбластина. Блот экспонировали с Hyperfilm MP(Amersham) при -80 С, используя усиливающие экраны. Кондиционированную среду от клетокHiB5pUbilzNBN22 или нетрансфицированных клеток HiB5, инкубированных в течение ночи в среде без сыворотки с добавлением N2 добавкиNo. 80-1262-01). Белки переносили на PVDFмембраны (Amersham Pharmacia Biotech; Cat.No. RPN-303F) и сайты неспецифичного связывания белка блокировали 5% обезжиренным сухим молоком в ФСБ с 0,1% твином-20. Мембраны инкубировали в течение ночи с поликлональными нейбластиновыми антителами(1:1000), после чего инкубировали со вторыми антителами против IgG кролика (AmershamPharmacia Biotech; Cat. No. NA 934), конъюгированными с пероксидазой хрена (1:2000). Визуализацию иммунного окрашивания проводили с использованием усиленной хемилюминисценции (УХЛ) (Amersham Pharmacia Biotech; Cat.Biotech; Cat. No. RPN2132) в соответствии с инструкциями изготовителя (Amersham). Результаты этих экспериментов показаны на фиг. 3. Фиг. 3 А и 3 В являются иллюстрациями экспрессии белка нейбластина в трансфицированных клетках HiB5. Среду от культивированных в течение ночи нетрансфицированных 52 клеток HiB5 [дорожка 1] или от клона HiB5,стабильно трансфицированного кДНК нейбластина [дорожка 2], концентрировали, как описано ниже. Затем среду анализировали с помощью вестерн-блоттинга, используя два различных типа поликлональных антител Ат-1 и Ат-2, описанных в примере 10, специфичных для нейбластина. Обнаружено, что в среде, полученной от трансфицированных клеток, оба типа антител узнают белок с молекулярной массой примерно 15 кД. Этот белок не выявляется в нетрансфицированных клетках HiB5. Клонированная кДНК, кодирующая нейбластин, также может быть встроена в другой эукариотический экспрессирующий вектор, например, в эукариотический экспрессирующий вектор TEJ-8 (Johansen et al., FEBS Lett., 1990,267, 289-294) или pcDNA-3 (Invitrogen), и полученная в результате экспрессирующая плазмида может быть трансфицирована в альтернативную линию клеток млекопитающих, например в клетки яичника китайского хомячка ("СНО"), в линии клеток НЕК 293, COS, PC12 или RN33b или в стволовые нервные клетки человека. Стабильные клеточные линии, экспрессирующие нейбластин, используются, например, для получения белка нейбластина. Экспрессия в клетках СНО Конструирование плазмиды pJC070.14. Чтобы экспрессировать кДНК нейбластина в клетках яичника китайского хомячка, фрагмент кДНК, кодирующий пре-про-форму нейбластина человека, встраивали в экспрессирующий вектор млекопитающих pEAG347, чтобы создать плазмиду pJC070.14. pEAG347 содержит тандем раннего промотора SV40 и главного позднего промотора аденовируса (полученный из плазмиды рАD2 бета; Norton and Coffin,Mol.Cell.Biol., 1985, 5, 281), уникальный сайт клонирования Notl, после чего следует сигнал поздней терминации транскрипции SV40 и полиА сигнал (полученные из плазмиды pCMV бета; MacGregor and Caskey, Nucl. Acids Res.,1989, 17, 2365). Кроме того, pEAG347 содержит остов, полученный из плазмиды pUC19, и генdhfr, полученный из pSV2dhfr, для селекции в присутствии метотрексата (МТХ) и амплификации в трансфицированных клетках СНО. Плазмида pJC070.14 была создана в два этапа. Сначала фрагмент, кодирующий пре-проформу нейбластина человека, был выделен из плазмиды pUbilZ-NBN с помощью полимеразной цепной реакции с олигонуклеотидами KD2824 5'AAGGAAAAAAGCGGCCGCCA TGGAAAGGC AGCCGCAGG3' [SEQ ID NO: 32] и полимеразы PFU. Фрагмент был клонирован в Srf1 сайте pPCR-Script Amp SK(+), чтобы создать плазмиду pJC069. На втором этапе было проведено частичное переваривание Not-1 плазмидыpJC069, чтобы образовать фрагмент длиной 685 53 п.н. (содержащий ген нейбластина), который был клонирован в Not-1 сайт плазмидыpEAG347, чтобы создать плазмиду pJC070.14. Транскрипция гена нейбластина в плазмидеpJC070.14 контролируется главным поздним промотором аденовируса. Создание линий клеток СНО, экспрессирующих нейбластин. 200 мкг pJC070.14 переводили в линейную форму перевариванием эндонуклеазой рестрикции Mlu-1. ДНК экстрагировали фенолом : хлороформом : изоамиловым спиртом (25:24:1) и осаждали этанолом. Линеаризованную ДНК ресуспендировали в 20 мМNa2HPO4, 6 мМ декстрозе (HEBS) и вводили в 4 Е 7 СНО dukx B1(dhfr-) клетки (р 23) путем электропорации (280 В и 960 мкФ). После электропорации клетки возвращали в культуру в + модифицированную среду Игла (МСИ) с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки(ФБС) на два дня. Затем клетки трипсинизировали и повторно высевали в 100 мм чашки(100000 клеток/чашку) в -МСИ (в отсутствии рибо- и дезоксирибонуклеозидов) с добавлением 10% диализованной ФБС на пять дней. Потом клетки делили до плотности 100000 клеток/100 мм чашку и проводили селекцию в 200 нМ метотрексате. Резистентные колонии отбирали и наращивали в 6 луночных планшетах; кондиционированную среду от каждого клона подвергали скринингу с помощью специфичного анализа на нейбластин, описанного ниже. Двенадцать клонов, экспрессирующих наиболее высокий уровень нейбластина, наращивали во флаконах Т 162 и потом исследовали повторно. Как показано на фиг. 10, линии клеток СНО продуцировали нейбластин в пределах от 25 до 50 нг/мл. Исследование нейбластина путем анализа тройного комплекса. Авторы исследовали наличие нейбластина в среде из надосадков линии клеток СНО с помощью модифицированного анализа тройного комплекса, описанного Sanicola et al. (Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 1997, 94,6238). В данном исследовании возможностиGDNF-подобных молекул могут быть оценены по их способности опосредовать связывание между внеклеточным доменом RET и различными ко-рецепторами, GFR1, GFR2 иGFR3. Растворимые формы RET и ко-рецепторов были получены в виде гибридных белков. Гибридный белок, образованный внеклеточным доменом RET крыс и плацентарной щелочной фосфатазой (RET-ЩФ), и гибридный белок между внеклеточным доменом GFR1 крыс (заявлен в опубликованной заявке WO 9744356; 27 ноября 1997, включена сюда в качестве ссылки) и Fc доменом IgG1 человека (rGFR1-Ig) описаны (Sanacola et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 1997,94, 6238). 54 Чтобы создать гибридный белок между внеклеточным доменом GFR3 мыши и Fc доменом IgG1 человека (mGFR3-Ig), фрагмент ДНК, кодирующий аминокислоты 1-359 RETL3 мышей, лигировали с фрагментом, содержащимFc домен IgG1 человека и клонировали в экспрессирующем векторе pEAG347, чтобы создать плазмиду pGJ144. Плазмидой pGJ144 трансфицировали клетки яичника китайского хомячка(СНО), чтобы получить стабильную линию клеток, продуцирующих гибридный белок, который был очищен на иммуноаффинной колонке, содержащей белок А-сефарозу, с помощью стандартных методов. В общем, если в данном исследовании GDNF-подобная молекула может опосредовать связывание ко-рецептора с RET,то RET-ЩФ гибридный белок будет удерживаться на планшетах, и количество, которое будет удерживаться, может быть измерено с помощью хемилюминисцирующего субстрата щелочной фосфатазы. Планшеты Dynex Microlite-1 ELISA (DynexTechnologis) покрывали антителами козы, специфичными для Fc человека, в концентрации 1 мкг/мл в 50 мМ бикарбонате/карбонате, рН 9,6,в течение 16 ч. Содержимое планшетов сливали и их наполняли 300 мкл 1% I-блокирующего агента (Tropix) в ТБС/0,5% твин-20 (ТБСТ) на 1 ч. После трехразовой промывки ТБСТ лунки заполняли 100 мкл 1 мкг/мл rGFR1-Ig илиmGFR3-Ig, разведенных в кондиционированной среде клеток 293EBNA, экспрессирующих гибридный ген RET-ЩФ. Затем добавляли 100 мкл кондиционированной среды из нейбластиновых клонов СНО в верхнюю лунку колонки ячеек и делали двукратные серийные разведения в каждом нижнем ряду лунок и инкубировали в течение 1,5 ч при комнатной температуре. Затем планшеты промывали три раза ТБСТ и дважды 200 мМ трис, рН 9,8, 10 мМ MgCl2, (буферCSPD). Затем промывочный раствор заменяли 425 мкМ CSPD (Tropix) в буфере CSPD, содержащем 1 мг/мл усилителя темно-синей хемилюминисценции (Tropix), и инкубировали в течение 30' при комнатной температуре. Выход хемилюминисценции измеряли с помощью люминометра Dynatech. В начальных экспериментах авторы исследовали, могут ли продуцирующие нейбластин линии клеток СНО опосредовать связываниеRET. Как показано на фиг. 11, кондиционированная среда клона клеток СНО 53 давала сильный сигнал в исследовании тройного комплекса в том случае, когда был включенmGFR3-Ig гибридный белок, но не давала сигнала, когда был включен rGFR1-Ig гибридный белок, что свидетельствует о том, что нейбластин связывается с GFR3, но не с GFR1. Такое поведение четко отличает нейбластин отGDNF; как показано на фиг. 11, GDNF связыва 55 ется с GFR1, но не связывается с GFR3. Сигнала не наблюдалось ни с какими гибридными белками ко-рецепторов при исследовании кондиционированной среды исходной линии клеток СНО или чистой среды. Чтобы количественно оценить уровни экспрессии нейбластина в линиях клеток СНО, была получена стандартная кривая с использованием rGFR1-Ig и GDNF, начиная с концентрации 1 нг/мл. Затем с помощью стандартной кривой были рассчитаны концентрации нейбластина для различных линий клеток СНО; уровни,продуцируемые пятью линиями клеток СНО,показаны на фиг. 10. Поскольку это определение зависит от непроверенного предположения о том, что сродство связывания между GDNF иGFR1 сходно со сродством связывания между нейбластином и GFR3, эти уровни являются только приблизительными. Анализ нейбластина из надосадков линий клеток СНО Для того чтобы провести дальнейший анализ нейбластина, продуцируемого линиями клеток СНО, с помощью GFR3-Ig гибридного белка из среды был экстрагирован белок и проанализирован с помощью вестерн-блотов с использованием поликлональных антител, полученных против пептидов нейбластина. В первом эксперименте нейбластин был экстрагирован с помощью mGFR3-Ig, прикрепленного к сефарозным шарикам. mGFR3-Ig был присоединен к шарикам сефарозы в условиях, рекомендованных изготовителем, Pharmacia Inc. 100 мкл mGFR3-Ig-сефарозы добавляли к 1,0 мл образцам кондиционированной среды из линии клеток СНО, являющихся негативным контролем, или из линии клеток СНО 16, продуцирующих нейбластин. Суспензии инкубировали в течение двух часов на качалке. Каждую суспензию центрифугировали и удаляли надосадок после трех промывок по 1,0 мл 10 мМHEPES, 100 мМ NaCl, pH 7,5. В каждом случае смолу ресуспендировали в 100 мкл 2 Х восстанавливающего буфера для образца и нагревали до 100 С в течение 5 мин. 20 мкл надосадка буфера для образца и 10 мкл стандарта молекулярной массы (FMC) наносили в каждую лунку 10-20% готового геля для SDS-ПААГ (Owl Scientific). Электрофорез в геле проводили при постоянном токе в 40 мА в течение 72 мин. Для вестерн-блот анализа белок с помощью электроблоттинга переносили на нитроцеллюлозу (Schleicher and Schuell) в прибореHofer Scientific в буферной системе, содержащей 10 мМ CAPS, 10% метанол, 0,05% SDS, pH 11,2 (45 мин при постоянном токе в 400 мА). После переноса нитроцеллюлозный фильтр извлекали из кассеты и визуализацию маркеров молекулярной массы проводили путем окрашивания раствором 0,1% красного S в 1% уксусной кислоте в течение 60 с. Мембрану разрезали на 56 две части и избыток красителя удаляли мягким покачиванием в дистиллированной воде. Мембраны блокировали в 2% растворе обезжиренного сухого молока в ТБС в течение ночи при 4 С. Мембраны инкубировали отдельно с двумя аффинно-очищенными антителами против пептида нейбластина (R30 и R31) при концентрации 1,0 мкг/мл в 2% растворе обезжиренного сухого молока в ТБС. Мембраны промывали три раза по десять минут в ТБС-твине и инкубировали с конъюгатом антител козы против IgG кролика-HRP (Biorad) в разведении 1:5000 в течение 30 мин. Мембраны промывали три раза по 10 мин ТБС-твином и проявляли с помощью субстрата УХЛ (Amersham). Как показано на фиг. 12, специфичные полосы были выявлены в случае белков, экстрагированных из линии клеток СНО, продуцирующей нейбластин, с помощью обоих антител (дорожки 2 и 4) при сравнении с полосами, наблюдаемыми в белках, экстрагированных из линии клеток, служащей негативным контролем (дорожки 1 и 3). Вид белка, расположенного внизу, имеет молекулярную массу примерно 13 кД и, вероятно, представляет собой зрелый домен нейбластина, возникший после отщепления продомена. Такое расщепление могло произойти после любого из трех остатков Arg-пре-пробелка нейбластина (например, -RXXR-), давая либо 140AK, 116AK, либо 113 АК формы, указанные в SEQ ID NO: 10, 11 или 12, соответственно. Предсказанные молекулярные массы не модифицированных (т.е. без посттрансляционных модификаций) полипептидов нейбластинаNBN140 [SEQ ID NO: 10], NBN116 [SEQ ID NO: 11] и NBN113 [SEQ ID NO: 12] были определены равными 14,7 кД, 12,4 кД и 12,1 кД, соответственно. Необходим дополнительный анализ,чтобы подтвердить структуру этих видов, а также других специфичных для нейбластина полос. Во втором эксперименте нейбластин экстрагировали с помощью hGFR3-Ig, фиксированных на планшетах ELISA. Чтобы получить гибридный белок между внеклеточным доменомGFR3 человека (заявлен в опубликованной заявке WO97/44356, 27 ноября 1997, включенной сюда в качестве ссылки) и Fc доменом IgG1 человека (hGFR3-Ig), фрагмент ДНК, кодирующий аминокислоты 1-364, GFR3 человека лигировали с фрагментом, содержащим Fc домен IgG1 человека и клонировали в экспрессирующий вектор СН 269, описанный Sanicola etal. (Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 1997, 94, 6238). Гибридный белок, кодируемый этой плазмидой,временно экспрессировался в клетках с ядерным антигеном, кодируемым вирусом Эпштейн Барра 293 (EBNA), и его очищали на иммуноаффинной колонке с белокА-сефарозой стандартными способами. Шесть лунок 96-луночного планшета были покрыты в течение ночи при 4 С антителами 57 козы против IgG человека (специфичны для Fcy фрагмента; Jackson Immunologics) при концентрации 25 мг/мл в ФСБ (300 мкл/лунку). Лунки блокировали в течение 1 ч при комнатной температуре с помощью 400 мкл 1% БСА в ФСБ. После трех промывок ФСБТ (ФСБ+0,05% твин 20) в каждую лунку добавляли 300 мл hGFR3Ig (10 мг/мл в ФСБ, содержащем 0,1% БСА). Планшет инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре и мягком встряхивании(200 ударов/мин), чтобы обеспечить максимальное связывание. Затем лунки опорожняли и снова 3 раза промывали ФСБТ. 250 мкл кондиционированной среды из линии клеток СНО, служащей негативным контролем, или из линии клеток СНО 25, продуцирующей нейбластин,добавляли в каждую из 3 лунок. Планшет инкубировали в течение 3 ч при комнатной температуре и мягком встряхивании (300 ударов/мин). Затем лунки дважды промывали ФСБТ. 25 мкл невосстанавливающего буфера для нанесения Лэммли добавляли в первую лунку и планшет быстро встряхивали в течение 5 мин, чтобы элюировать связанные белки (1300 ударов/мин). Содержимое переносили в следующую лунку и процедуру повторяли, чтобы элюировать белки,связанные во второй и третьей лунках. После добавления -меркаптоэтанола (5% конечная концентрация) образцы кипятили 5 мин и анализировали с помощью SDS-ПААГ в 10-20% полиакриламидном геле. Для вестерн-блот анализа белки переносили на нитроцеллюлозу. Мембрану блокировали и анализировали в 5% растворе обезжиренного сухого молока, ФСБТ и промывали в ФСБТ. Нейбластин выявляли с помощью электрохемилюминисценции после реакции с поликлональными антителами (R30 и R31), направленными против двух пептидов нейбластина (при концентрации 1 мкг/мл), с последующей реакцией с антителами козы против Ig кролика, коньюгированными с HRP (BioRad). Как показано на фиг. 13, пять специфичных для нейбластина полос было выявлено в белках, экстрагированных из линии клеток СНО, продуцирующих нейбластин (дорожка 2). Две нижние полосы очень сходны с полосами, видимыми на фиг. 12; и снова, нижняя полоса, по-видимому, представляет собой зрелый домен нейбластина, возникший после отщепления про-домена. Последующий анализ (данные не показаны) полос на фиг. 13 показал, что дегликозилирование PGNaзoй F белка в полосе, соответствующей примерно 18 кД, восстанавливает белок в этой полосе до размера, эквивалентного самой нижней полосе в геле на фиг. 13. Это подтверждает, что нейбластин может продуцироваться в клетках млекопитающих в виде гликозилированного белка. Экспрессия нейбластина в E.coli 58 Чтобы экспрессировать ген нейбластина вE.coli, были сконструированы сингены с более низким содержанием GC и предпочтительными кодонами E.coli. Синген клонируется в двух векторах, рЕТ 19b и pMJB164, производном рЕТ 19b. Конструкция с рЕТ 19b показана на фиг. 14. В этой конструкции последовательность,кодирующая зрелый домен нейбластинаpMJB164 показана на фиг. 15. В этой конструкции зрелый домен нейбластина слит с гистидиновой меткой (т.е. 10 гистидинами), отделенной сайтом расщепления энтерокиназой. Инициирующий метионин предшествует гистидиновой метке. Нуклеотидная последовательность, кодирующая нейбластин на фиг. 14. Нуклеотидная последовательность, кодирующая меченый гистидином нейбластин на фиг. 15. Пример 6. Влияние нейбластина на выживаемость допаминэргических нейронов эмбрионов крыс и ХАТ активность. В этой серии экспериментов оценивали влияние кондиционированной среды от продуцирующих нейбластин клеток HiB5pUbilzNBN22,описанных выше. Подготовка культур. Вентральную часть среднего мозгового пузыря или спинной мозг извлекали из вскрытых эмбрионов крыс Э 14 и помещали в холодный буферный солевой раствор Хенкса (БСРХ). Кусочки ткани инкубировали в стерильно отфильтрованном 0,1% трипсине (Worthington) и 0,05% ДНКазе (Sigma) в БСРХ при 37 С в течение 20 мин. Затем кусочки ткани четыре раза промывали в БСРХ+0,05% ДНКаза и диссоциировали с помощью автоматической пипетки объемом 1 мл. Затем суспензию центрифугировали при 600 об/мин в течение 5 мин и осадок ресуспендировали в кондиционированной среде с сывороткой (КСС;DMEM с 10% фетальной сыворотки теленка). Общее количество клеток оценивали с помощью метода исключения с красителем трипановым синим, и клетки высевали при плотности 100000 клеток/см 2 в покрытые поли-L-лизином восьмилуночные камеры (Nunc) для оценки выживаемости допаминэргических нейронов, или при 59 плотности 200000 клеток/см 2 в 48 луночные планшеты (Nunc) для измерений ХАТ активности. Клетки инкубировали в КСС при 5% СO2/95% O2 и 95% влажности при 37 С в течение 24-48 ч до смены на среду без сыворотки(СБС) с добавлением нейротрофических факторов. Для оценки выживаемости допаминэргических нейронов клетки оставляли на 5 дней в СБС + добавки трофических факторов и затем фиксировали в течение 5 мин в 4% ПФА и красили на тирозингидроксилазу с помощью иммуногистохимии. Для определения ХАТ активности клетки оставляли на 3 дня в СБС и затем лизировали в БСРХ + 0,1% тритон Х-100 и сразу же замораживали в сухом льду вплоть до измерения ХАТактивности. Добавление трофических факторов. Собирали кондиционированную среду от нетрансфицированных HiB5 контрольных клеток или отDNF-L17). HiB5pUbilzNBN22 продуцирует примерно 20 нг GDNF/24 ч/105 клеток, как было определено с помощью GDNF-ELISE в кондиционированной среде, собранной от клеток. Соответствующие линии клеток инкубировали в течение ночи в DMEM + 1% ФБС и отбирали надосадок и хранили при -20 С вплоть до использования. При добавлении к клеткам надосадки разводили 1:50 в СБС. Отдельные лунки обрабатывали надосадком от контрольных клеток HiB5 (1:50) + очищенный рекомбинантныйGDNF крысы (от 0,03 - 10 нг/мл). Результаты этих экспериментов показаны на фиг. 4. Фиг. 4 А-4 С являются иллюстрациями влияния нейбластина, секретируемого клеткамиHiB5pUbilzNBN22, на выживаемость культивируемых допаминэргических нейронов вентральной части среднего мозгового пузыря эмбрионов крыс и на ХАТ активность в холинэргических мотонейронах черепно-мозгового нерва в бессывороточной среде, как описано ниже в примере 5.1. Фиг. 4 А является иллюстрацией кривой зависимости ХАТ активности от дозы рекомбинантного GDNF (расп./мин/ч), измеренной наDIV 5 в бессывороточных культурах, которые исходно были созданы из вентральной части средних мозговых пузырей эмбрионов Э 14 [т.е.HiB5; GDNF 0,03 нг/мл; GDNF 0,1 нг/мл; GDNF 0,3 нг/мл; GDNF 1 нг/мл; GDNF 10 нг/мл; GDNF 100 нг/мл]. Фиг. 4 В является иллюстрацией ХАТ активности (расп./мин/час), измеренной на DIV5 в бессывороточных культурах, которые исходно были созданы из вентральной части средних мозговых пузырей эмбрионов Э 14. Разбавленную кондиционированную среду либо от продуцирующих нейбластин клеток HiB5pUbilz 60 продуцирующих HiB5GDNFL-17 (GDNFL-17) клеток добавляли, как показано на фигуре [т.е. нейбластин 1:10; нейбластин 1:50; GDNFL-17 1:50]. Фиг. 4 С является иллюстрацией количества иммунореактивных при анализе на тирозингидроксилазу клеток в лунке [No. ТГ+ клеток/лунку] на DIV7 в бессывороточных культурах, которые исходно были созданы из вентральных частей средних мозговых пузырей эмбрионов крыс Э 14. Разбавленную кондиционированную среду либо от нетрансфицированных клеток HiB5 (HiB5), либо от продуцирующих нейбластин клеток HiB5pUbilzNBN22(нейбластин) или рекомбинантный GDNF добавляли в различных концентрациях, как показано на фигуре [т.е. HiB5 1:10; HiB5 1:40; GDNF 0,1 нг/мл; GDNF 10 нг/мл; GDNF 100 нг/мл; и нейбластин 1:40]. Кондиционированная среда от трансфицированных нейбластином клеток HiB5 в разведении 1:40 значительно увеличивала количество ТГ-иммунореактивных клеток на лунку, по сравнению с контрольными (нетрансфицированными) клетками HiB5 при эквивалентном и меньшем разведении (1:10 и 1:40) (см., например, фиг. 4 В). Увеличение количества ТГиммунореактивных клеток сравнимо с увеличением, наблюдаемым при максимальной концентрации GDNF (10 нг/мл). Это свидетельствует о том, что нейбластин, секретируемый в среду,оказывает влияние на выживаемость популяции допаминэргических нейронов вентральной части среднего мозгового пузыря эмбрионов крыс. Напротив, в отличие от GDNF, секретируемого трансфицированными клетками HiB5, не наблюдалось влияния кондиционированной среды от трансфицированных нейбластином клетокHiB5 на другую популяцию нейронов в такой же культуре на холинэргические нейроны (см.,например, фиг. 4 А). Пример 7. Влияние нейбластина на выживаемость культур срезов допаминэргических нейронов вентральной части среднего мозгового пузыря эмбрионов свиней. В этом эксперименте оценивали результат совместного культивирования продуцирующих нейбластин клеток HiB5pUbilzNBN22 и культивируемых срезов вентральной части средних мозговых пузырей эмбрионов свиней. Подготовка культур. Вентральные части средних мозговых пузырей (ВСМ) выделяли из эмбрионов свиней (Э 28; n=12) в стерильных условиях, нарезали 400 мкл срезы и помещали в охлажденный сбалансированный солевой раствор Гейза (GIBCO) с глюкозой (6,5 мг/мл). Тканевые срезы культивировали с помощью метода контактирующих культур, первоначально разработанного Stoppini et al. [L.Stoppini,P.A.Buchs, D.Muller, J.Neurosci. Methods, 1991,37, 173-182].