Способ оценки способности достижения одним или более эмбрионами человека стадии бластоцисты

СПОСОБ ОЦЕНКИ СПОСОБНОСТИ ДОСТИЖЕНИЯ ОДНИМ ИЛИ БОЛЕЕ ЭМБРИОНАМИ ЧЕЛОВЕКА СТАДИИ БЛАСТОЦИСТЫ(71)(73) Заявитель и патентовладелец: ДЗЕ БОРД ОФ ТРАСТИЗ ОФ ДЗЕ ЛЕЛЭНД СТЭНФОРД ДЖУНИОР ЮНИВЕРСИТИ (US) В изобретении предложен способ оценки способности достижения одним или более эмбрионами человека стадии бластоцисты, включающий культивирование одного или более эмбрионов человека в условиях, подходящих для развития эмбриона; цейтраферную съемку у одного или более эмбрионов длительности по меньшей мере одного явления цитокинеза или клеточного цикла; измерение по меньшей мере одного клеточного параметра, включающего (а) длительность первого цитокинеза; или (б) время между первым и вторым митозом; или (в) время между вторым и третьим митозом; и идентификацию эмбриона, который обладает способностью достижения стадии бластоцисты, когда указанный по меньшей мере один клеточный параметр для указанного эмбриона соответствует (i) длительности первого цитокинеза, составляющей до 33 мин; или (ii) времени между первым и вторым митозом, составляющим от около 7,8 до 14,3 ч; или (iii) времени между вторым и третьим митозом, составляющим до 5,8 ч. Перекрестная ссылка на родственные заявки Данная заявка претендует на приоритет временной заявки на патент США 61/332651 от 7 мая 2010 г. и временной заявки на патент США 61/236085 от 22 августа 2009 г., содержание которых целиком включено сюда в качестве ссылок. Область техники Настоящее изобретение относится к области биологических и клинических исследований и, в частности, к визуализации и оценке зигот/эмбрионов, яйцеклеток и стволовых клеток, полученных как от человека, так и от животных. Уровень техники Бесплодие является распространенной проблемой, затрагивающей 10-15% пар репродуктивного возраста. Только в Соединенных штатах в 2006 г. было выполнено примерно 140000 циклов экстракорпорального оплодотворения (ЭКО) (cdc.gov/art). Это привело к культивированию более чем миллиона эмбрионов ежегодно с различной, и часто неопределенной, способностью к имплантации и развитию до времени родов. Доля живорождений, на цикл, после ЭКО составляла всего 29%, при этом в среднем 30% живорождений давали многоплодные беременности (cdc.gov/art). Многоплодные беременности имеют хорошо задокументированные нежелательные последствия как для матери, так и для плодов, такие как выкидыши, преждевременные роды и низкий уровень рождаемости. Возможные причины неблагоприятного исхода ЭКО разнообразны; однако со времени появления ЭКО в 1978 г. одной из основных сложностей было определение эмбрионов, которые в наибольшей степени пригодны для переноса и с наибольшей вероятностью в результате приведут к доношенной беременности. В данной области понимание основ развития эмбрионов ограничено, так как исследования в области биологии эмбрионов человека остаются трудной задачей и часто лишены помощи фондов, финансирующих научные исследования. Вследствие этого, большая часть имеющихся сейчас знаний о развитии эмбрионов получена в исследованиях модельных организмов. Однако, хотя эмбрионы организмов разных видов проходят через схожие стадии развития, временные характеристики у разных видов отличаются. Эти и многие другие различия делают невозможным прямую экстраполяцию от одного вида на другой (Taft, R.E. (2008) Theriogenology 69(1): 10-16). Общие пути развития человека, а также лежащие в их основе молекулярные детерминанты, являются уникальными для развития эмбриона человека. Например, у мышей эмбриональная транскрипция активируется примерно через 12 ч после оплодотворения, одновременно с первым делением дробления, тогда как у человека эмбриональная активация генов(EGA) происходит на 3 день, примерно на 8-клеточной стадии (Bell, С.Е., et al. (2008) Mol. Hum. Reprod. 14:691-701; Braude, P., et al. (1988) Nature 332:459-461; Hamatani, T. et al. (2004) Proc. Natl. Acad. Sci. 101:10326-10331; Dobson, T. et al. (2004) Human Molecular Genetics 13 (14):1461-1470). Кроме того, гены,активность которых модулируется на ранних стадиях развития человека, являются уникальными(Dobson, Т. et al. (2004) Human Molecular Genetics 13(14): 1461-1470). Более того, у других видов, таких как мышь, более 85% эмбрионов, культивируемых in vitro, достигают стадии бластоцисты, одной из первых основных вех в развитии млекопитающих, в то время как культивируемые эмбрионы человека имеют среднюю частоту образования бластоцисты примерно 30-50%, с высокой встречаемостью мозаицизма и аномальных фенотипов, таких как фрагментация и блок развития (Rienzi, L. et al. (2005) Reprod. Biomed. Online 10:669-681; Alikani, M., et al. (2005) Mol. Hum. Reprod. 11:335-344; Keltz, M.D., et al. (2006)Fertil. Steril. 86:321-324; French, D.В., et al. (2009) Fertil. Steril.). Несмотря на такие различия, большинство научных данных о доимплантационном развитии эмбрионов получено на модельных организмах, и их трудно соотнести с развитием эмбрионов человека (Zernicka-Goetz, M. (2002) Development 129:815-829;Wang, Q., et al. (2004) Dev Cell. 6:133-144; Bell, С.Е., et al. (2008) Mol. Hum. Reprod. 14:691-701; ZernickaGoetz, M. (2006) Curr. Opin. Genet. Dev. 16:406-412; Mtango, N.R., et al. (2008) Int. Rev. Cell. Mol. Biol. 268:223-290). Традиционно, в проводящих ЭКО клиниках жизнеспособность эмбриона человека оценивают по простым морфологическим признакам, таким как наличие одинаковых по размеру, одноядерных бластомеров и степень клеточной фрагментации (Rijinders P.M., Jansen C.A.M. (1998) Hum Reprod 13:2869-73;Milki A.A., et al. (2002) Fertil Steril 77:1191-5). В последние годы для оценки качества эмбрионов стали также использовать дополнительные способы, такие как длительное культивирование эмбрионов (до стадии бластоцисты на 5 день) и анализ состояния хромосом посредством преимплантационной генетической диагностики (ПГД) (Milki A., et al. (2000) Fertil Steril 73:126-9; Fragouli E., (2009) Fertil Steril Jun 21 [EPub ahead of print]; El-Toukhy T., et al. (2009) Hum Reprod 6:20; Vanneste E., et al. (2009) Nat Med 15:577-83). Однако у этих способов существуют также потенциальные риски, так как приходится увеличивать период культивирования и нарушать целостность эмбриона (Manipalviratn S., et al. (2009) FertilSteril 91:305-15; Mastenbroek S., et al. (2007) N Engl J. Med. 357:9-17). Недавно было показано, что цейтраферная съемка может быть полезным приемом для наблюдения за ранним развитием эмбрионов. В некоторых способах цейтраферная съемка применяется для контроля за развитием эмбрионов человека после внутриплазматической инъекции сперматозоида (ИКСИ) (Nagyet al. (1994) Human Reproduction. 9 (9): 1743-1748; Payne et al. (1997) Human Reproduction. 12:532-541). Были проанализированы экструзия полярных телец и образование пронуклеуса, и установлено соотно-1 025172 шение этих процессов с правильной морфологией на 3 день. Однако ни один параметр не коррелировал с образованием бластоцисты или исходом беременности. В других способах в качестве критерия для прогноза в отношении жизнеспособности эмбрионов человека рассматривают начало первого деления дробления (Fenwick, et al. (2002) Human Reproduction, 17:407-412; Lundin, et al. (2001) Human Reproduction 16:2652-2657). Однако в этих способах не учитывают важность длительности цитокинеза или временных интервалов между ранними делениями. В других способах цейтраферная съемка применяется для измерения хронометража и продолжительности клеточных делений во время раннего развития эмбриона (WO/2007/144001). Однако в этих способах раскрыт только основной и общий способ цейтраферной съемки эмбрионов коровы, которые существенно отличаются от эмбрионов человека с точки зрения способности к развитию, морфологических особенностей, молекулярных и эпигенетических программ, и хронометража, и характеристик, связанных с переносом. Например, эмбрионам коровы необходимо существенно больше времени для имплантации, чем эмбрионам человека (30 и 9 дней соответственно) (Taft, (2008) Theriogenology 69(1):1016). Более того, не раскрыты типичные параметры визуализации или временные интервалы, которые могли бы быть применены для прогноза в отношении жизнеспособности эмбрионов человека. Совсем недавно цейтраферную съемку применили для наблюдения за развитием эмбриона человека в течение первых 24 ч после оплодотворения (Lemmen et al. (2008) Reproductive BioMedicine Online 17(3): 385-391). Обнаружено, что синхронность поведения ядер после первого деления коррелирует с исходом беременности. Однако в этой работе сделано заключение, что ранние первые деления дробления не были важным прогностическим параметром, что противоречит предшествующим исследованиям (Fenwick, et al. (2002) Human Reproduction 17:407-412; Lundin, et al. (2001) Human Reproduction 16:2652-2657). Наконец, не было проведено исследований по оценке пригодности параметров визуализации с точки зрения корреляции с молекулярными программами или хромосомным набором эмбрионов. Таким образом, способы оценки эмбрионов человека неудовлетворительны в нескольких отношениях и могут быть улучшены с помощью настоящих способов, которые включают новые применения цейтраферной микроскопии, анализ изображений и выявление связей между параметрами изображений и молекулярными профилями и хромосомным набором. Настоящее изобретение направлено на рассмотрение этих проблем. Сущность изобретения Предложены способы, композиции и наборы для определения способности к развитию одного или нескольких эмбрионов или плюрипотентных клеток, в одном или нескольких эмбрионах или плюрипотентных клетках. Эти способы, композиции и наборы находят применение при идентификации in vitro эмбрионов и яйцеклеток, имеющих хорошую способность к развитию, т.е. способность или возможность развиться в бластоцисту, которые, таким образом, полезны для применения в способах лечения бесплодия у человека и т.п. В некоторых воплощениях изобретения предложены способы для определения способности к развитию эмбриона или плюрипотентной клетки. В таких воплощениях измеряют один или несколько клеточных параметров эмбриона или плюрипотентной клетки с получением показателя клеточного параметра. После этого клеточный параметр используют для определения способности к развитию эмбриона или плюрипотентной клетки, и это определение может быть применено как определяющее клинический образ действия. В некоторых вариантах воплощения клеточный параметр является морфологическим явлением, которое может быть измерено с помощью цейтраферной микроскопии. В некоторых вариантах воплощения, например, при анализе эмбриона одним или несколькими клеточными параметрами являются длительность явления цитокинеза, например цитокинеза 1; временной интервал между цитокинезом 1 и цитокинезом 2; и временной интервал между цитокинезом 2 и цитокинезом 3. В некоторых воплощениях длительность клеточного цикла 1 также применяют в качестве клеточного параметра. В некоторых вариантах воплощения показатель клеточного параметра применяют путем сравнения его с соответствующим показателем клеточного параметра для референсного эмбриона и применения результатов этого сравнения с целью определения способности эмбриона к развитию. В некоторых воплощениях эмбрион является эмбрионом человека. В некоторых вариантах воплощения клеточный параметр является уровнем экспрессии гена, который измеряют с получением показателя экспрессии гена. В некоторых вариантах воплощения показатель экспрессии гена применяют путем сравнения его с показателем экспрессии гена для референсной плюрипотентной клетки или эмбриона, или одной или нескольких его клеток, при этом результаты такого сравнения применяют с целью определения способности к развитию плюрипотентной клетки или эмбриона. В некоторых воплощениях эмбрион является эмбрионом человека. В некоторых воплощениях изобретения предложены способы для ранжирования эмбрионов или плюрипотентных клеток по их способности к развитию относительно других эмбрионов или плюрипотентных клеток в группе. В таких воплощениях один или несколько клеточных параметров эмбрионов или плюрипотентных клеток в группе измеряют с получением показателя клеточного параметра каждого из эмбрионов или плюрипотентных клеток. После этого показатели клеточного параметра используют для определения способности к развитию каждого из эмбрионов или плюрипотентных клеток в группе в сравнении друг с другом, и это определение может быть применено как определяющее клинический образ действия. В некоторых вариантах воплощения клеточный параметр является морфологическим явлением, которое может быть измерено с помощью цейтраферной микроскопии. В некоторых вариантах воплощения, например, при ранжировании эмбрионов одним или несколькими клеточными параметрами есть длительность явления цитокинеза, например цитокинеза 1; временной интервал между цитокинезом 1 и цитокинезом 2; и временной интервал между цитокинезом 2 и цитокинезом 3. В некоторых воплощениях также измеряют длительность клеточного цикла 1. В некоторых вариантах воплощения клеточный параметр является уровнем экспрессии одного или нескольких генов. В некоторых вариантах воплощения один или несколько показателей клеточного параметра используют путем сравнения показателей клеточного параметра для каждого из эмбрионов или плюрипотентных клеток в группе друг с другом с целью определения способности к развитию эмбрионов или плюрипотентных клеток относительно друг друга. В некоторых вариантах воплощения показатели одного или нескольких клеточных параметров используют путем сравнения показателя каждого клеточного параметра с показателем клеточного параметра для референсного эмбриона или плюрипотентной клетки с целью определения способности к развитию каждого эмбриона или плюрипотентной клетки, а также путем сравнения этих способностей к развитию с целью определения способности к развитию эмбрионов или плюрипотентных клеток относительно друг друга. В некоторых воплощениях изобретения предложены способы для получения эмбрионов с хорошей способностью к развитию для переноса в организм женщины при вспомогательной репродукции (ЭКО). В таких воплощениях один или несколько эмбрионов культивируют в условиях, подходящих для развития эмбриона. После этого измеряют один или несколько клеточных параметров у одного или нескольких эмбрионов с получением показателя клеточного параметра. Потом показатель клеточного параметра используют с целью определения способности к развитию одного или нескольких эмбрионов. Один или несколько эмбрионов, демонстрирующие хорошую способность к развитию, после этого переносят в организм женщины. Краткое описание чертежей Пониманию сути изобретения лучше всего способствует чтение следующего подробного описания одновременно с обращением к сопутствующим графическим материалам. Следует обратить внимание,что в соответствии с обычной практикой различные детали графических материалов приведены не в масштабе. Наоборот, пространственные размеры различных деталей произвольно увеличены или уменьшены для лучшего понимания. В графические материалы включены следующие чертежи. Фиг. 1 представляет схему, демонстрирующую способы, применяемые для оценки эмбрионов. На фиг. 2 представлена серия фотографий, демонстрирующая клеточное дробление и деление в течение периода 6 дней. На изображениях проставлены метки от 1 до 6 дня. Масштабная метка соответствует 50 мкм. На фиг. 3 представлена столбчатая диаграмма, демонстрирующая процентное отношение случаев успешного развития в бластоцисту из 1-клеточных эмбрионов (зигот). В серии из 4 независимых экспериментов в сумме 100 эмбрионов исследовали до 5-6 дня с применением цейтраферной микроскопии. Показано процентное соотношение клеток, достигших каждой из указанных стадий (бластоциста, 8 клеточная, 4-7-клеточная, 2-3-клеточная и 1-клеточная). На фиг. 4 представлена серия из трех различных эмбрионов, за которыми велось наблюдение в течение указанных периодов времени (верхний, средние и нижний ряды). На фиг. 5 представлена диаграмма, демонстрирующая временные промежутки между стадиями, используемые при проведении данных оценок, включая длительность первого цитокинеза, время между первым и вторым делением (измеряемое как временной интервал между завершением цитокинеза 1 и началом цитокинеза 2) и время между 2-м и 3-м митозом (измеряемое как временной интервал между началом цитокинеза 2 и началом цитокинеза 3). На фиг. 6 представлена трехмерная точечная диаграмма, демонстрирующая показатели трех явлений, включая длительность первого цитокинеза, временной интервал между первым и вторым клеточными делениями (измеряемый как временной интервал между завершением цитокинеза 1 и началом цитокинеза 2) и временной интервал между вторым и третьим клеточными делениями (измеряемый как временной интервал между началом цитокинеза 2 и началом цитокинеза 3), для большой группы эмбрионов. Показано, что эмбрионы, которые достигли стадии бластоцисты (обозначенные кружками), образуют общий кластер на трехмерной диаграмме, в то время как эмбрионы с блоком развития (обозначенные крестиками) до достижения стадии бластоцисты дают разброс значений по всей диаграмме. На фиг. 7 приведен график, демонстрирующий характерную кривую обнаружения (ROC) для прогнозирования образования бластоцисты с применением 3 динамических морфологических параметров. На фиг. 8 приведена радиальная диаграмма, демонстрирующая уровни экспрессии 52 генов для шести 1-2-клеточных эмбрионов с блоком развития и 5 нормальных 1-2-клеточных эмбрионов. Различие уровней экспрессии между нормальными и отклоняющимися от нормы эмбрионами было статистически значимым для генов, выделенных желтым цветом и обозначенных звездочкой, согласно оценке по критерию Манна-Уитни. На фиг. 9 приведена столбчатая диаграмма, демонстрирующая уровни экспрессии различных генов у 2-клеточных эмбрионов с блоком развития и нормальных 2-клеточных эмбрионов. Выбранное количество цейтраферных изображений 2-клеточных эмбрионов с блоком развития показано сверху. На фиг. 10 приведена столбчатая диаграмма, демонстрирующая сравнительный анализ тех же генов, что представлены на фиг. 9, у 4-клеточных эмбрионов с блоком развития и нормальных 4-клеточных эмбрионов. Выбранное количество цейтраферных изображений 4-клеточных эмбрионов с блоком развития показано сверху. На фиг. 11 представлена серия столбчатых диаграмм, демонстрирующих профили экспрессии генов(ESSP), имеющих 4 характерных профиля. Указаны временные точки раннего переноса до эмбриональной активации генов (2 день) и экспрессия в типичном случае переноса на 3 день. На фиг. 12 демонстрируется экспрессия генов в единичных бластомерах на различных стадиях. a. Экспрессия двух генов, CTNNB1 и CDX2, в единичных бластомерах, нанесенная на график при различных клеточных стадиях и показывающая изменения уровней экспрессии этих генов на различных стадиях, например 2-клеточной, 3-клеточной, стадиях морулы и бластоцисты. b. Профили экспрессии генов в виде столбцов, представляющих гены, экспрессируемые в соответствии с материнской программой, в сравнении с генами, экспрессируемыми в соответствии с зиготической программой. На фиг. 13 представлено графическое изображение модели применения анализа цейтраферных изображений совместно с молекулярным анализом для оценки жизнеспособности эмбрионов. На фиг. 14 представлена серия фотографий, демонстрирующих три стадии развития в ходе созревания яйцеклетки in vitro. На фиг. 15 представлена серия фотографий, демонстрирующих процесс развития эмбриона после созревания яйцеклетки in vitro. На фиг. 16 представлена схема, демонстрирующая способы, применяемые для оценки яйцеклеток. На фиг. 17 представлена схема, демонстрирующая способы, применяемые для оценки стволовых клеток и плюрипотентных стволовых клеток. На фиг. 18 представлена серия фотографий, демонстрирующих процесс дифференцации индуцированных плюрипотентных стволовых клеток в нейронные розетки. На фиг. 19 представлена таблица категорий, на которые можно разделить гены, для которых проводится количественное определение уровня экспрессии, включающая указание количества генов в каждой категории. На фиг. 20 представлена таблица четырех типичных эмбриональных стадий профилей (ESSPs), которые были идентифицированы в ходе анализа экспрессии генов у 141 нормально развивающегося отдельного эмбриона и единичных бластомеров, а также указано разделение на категории генов в каждой из этих категорий. На фиг. 21 показан автоматизированный анализ изображений, демонстрирующий возможность с помощью параметров обработки изображения прогнозировать образование бластоцисты. a) Показаны результаты применения алгоритма слежения за единичным эмбрионом. b) Показан набор из 14 проанализированных эмбрионов. c) Показано сравнение ручного анализа изображений и автоматизированного анализа для случая оценки длительности цитокинеза и времени между первым и вторым митозами. d) Показано сравнение хорошей морфологии бластоцисты и плохой морфологии бластоцисты. На фиг. 22 представлено схематическое изображение темнопольного микроскопа по настоящему изобретению; вставка слева демонстрирует схему произведенного с помощью лазера темнопольного фильтра. На фиг. 23 представлена фотография комплекса из трех микроскопов, показанных на фиг. 22, смонтированных на подложке для установки в инкубатор и для соединения с компьютером. На фиг. 23 А показаны микроскопы, а на фиг. 23 В показаны микроскопы внутри инкубатора. На фиг. 24 приведен снимок экрана программного обеспечения для захвата изображения, применяемого в настоящей работе, который демонстрирует изображение эмбрионов, полученное с 3 каналов. На фиг. 25(a)-(d) приведена серия из четырех фотографий, демонстрирующих избранные цейтраферные изображения, полученные в эксперименте 2, станция 2. Фиг. 25(a) и (b) - изображения, захваченные до замены среды, а фиг. 25(c) и (d) - это изображения, захваченные после замены среды. На фиг. 26(a) и (b) представлены графики (слева) и фотографии клеток (справа), демонстрирующие клеточную активность нормальных и отклонившихся от нормы эмбрионов. При совместном рассмотрении фиг. 26(a) и (b) можно наблюдать, что на 3 день эмбрионы обладают схожей морфологией, но их графики клеточной активности существенно различны, и только один из них развивается в бластоцисту. На фиг. 27 А и 27 В представлены графические изображения стандартной чашки Петри с микролунками. На фиг. 27 А показано графическое изображение чашки с указанием размеров, а на фиг. 27 В показано трехмерное изображение микролунок. На фиг. 28(a) и (b) представлены графики, демонстрирующие клеточную активность с предварительной регистрацией изображения и без нее. Фиг. 28(a) и (b) при совместном рассмотрении демонстрируют, что регистрация очищает результаты и убирает примесные пики, вызванные сдвигом или вращением эмбриона. На фиг. 29(a) и (b) представлены графики (слева) и фотографии клеток (справа), демонстрирующие клеточную активность нормальных и отклонившихся от нормы эмбрионов. При совместном рассмотрении фиг. 29(a) и (b) можно наблюдать, что на 3 день эмбрионы обладают схожей морфологией, но их графики клеточной активности существенно различны, и только один из них развивается в бластоцисту. На фиг. 30 представлен график, демонстрирующий различие в интенсивности пикселей между последовательными парами изображений, полученных по мере развития эмбриона. Эти данные можно использовать сами по себе для оценки жизнеспособности эмбрионов, или как средство для улучшения других алгоритмов, таких как фильтр частиц, путем определения, сколько частиц (моделей прогнозируемых эмбрионов) следует использовать. На фиг. 31 A-G приведена серия из семи фотографий, демонстрирующих результаты двумерного слежения на различных клеточных стадиях. Прогрессивное развитие клеток указано с помощью номеров кадров, относящихся к каждой паре изображений: кадр 15 (фиг. 31 А), 45 (В), 48 (С), 189 (D), 190 (Е), 196(F) и 234 (G). В нижнем ряду показаны полученные наложением модельные изображения. Контуры представляют видимые клеточные мембраны, а пунктирные белые линии - скрытые от взгляда мембраны. Захват кадров изображения производят каждые 5 мин, и приведены только некоторые из них. На фиг. 32 А и В приведена серия фотографий и графических изображений, демонстрирующих два успешных случая трехмерного слежения за клетками. Иллюстрации под каждой фотографией эмбриона демонстрируют вид сверху вниз на трехмерную модель, за исключением кадра 314 и кадра 228, на которых показан вид сбоку на модели, представленные на кадре 314 и кадре 228 соответственно. Захват кадров изображения производили каждые 5 мин. На фиг. 33 в виде диаграммы представлены результаты, полученные с помощью фильтра частиц,для делений на 1-клеточной и 2-клеточной стадиях. Точки данных представляют пространственное расположение центров клеток. Показаны точки для 1-клеточных моделей, 2-клеточных моделей, 3 клеточных моделей и 4-клеточных моделей. В верхнем ряду показаны частицы после предсказания, а в нижнем ряду показаны частицы после повторного отбора проб. На фиг. 34(a) и (b) показаны графики, демонстрирующие сравнение автоматизированного и ручного анализа изображений для группы из 14 эмбрионов. На фиг. 34(a) показано сравнение для длительности первого цитокинеза, а на фиг. 34(b) показано сравнение для времени между 1-м и 2-м митозом. На фиг. 35 показана схема, демонстрирующая, как анализ изображений применяется для создания моделей эмбрионов и измерения некоторых морфологических параметров. Детальное описание изобретения Перед тем как приступить к описанию настоящих способов и композиций, следует отметить, что при этом понимается, что данное изобретение не ограничивается конкретным описанным способом или композицией, так как они, безусловно, могут варьировать. Также следует понимать, что терминология,используемая в этом документе, предназначена только для целей описания конкретных воплощений, и не подразумевается, что она является ограничивающей, так как объем настоящего изобретения ограничен только прилагаемой формулой изобретения. В случае, когда приведен диапазон значений, подразумевается, что каждое промежуточное значение с точностью до десятой доли единицы измерения нижнего предела, если иное не диктуется явно контекстом, между верхним и нижним пределами этого диапазона также явно относится к изобретению. Каждый более мелкий диапазон между любыми указанными значениями или промежуточное значение в указанном диапазоне, и любое другое указанное или промежуточное значение в этом указанном диапазоне, включены в объем изобретения. Верхний и нижний пределы этих более мелких диапазонов могут быть независимо включены или исключены из диапазона, и каждый диапазон, в котором либо ни один,либо оба предела включены в более мелкие диапазоны, также включен в объем изобретения, за исключением любого специально исключенного предела в указанном диапазоне. В случае если указанный диапазон включает один или оба предела, диапазоны, в которых исключены один или оба эти включенные пределы, также включены в объем изобретения. Если не указано иначе, все технические и научные термины, использованные в этом документе,имеют те значения, которые есть общепринятыми в области, к которой относится настоящее изобретение. Хотя при практическом осуществлении или тестировании настоящего изобретения возможно применение любых способов и материалов, схожих или эквивалентных описываемым в этом документе, некоторые возможные и предпочтительные способы и материалы будут описаны здесь. Все публикации,указанные в этом документе, включены сюда в качестве ссылки для раскрытия и описания способов и/или материалов, в связи с которыми эти публикации процитированы. При этом понимается, что настоящее раскрытие замещает собой любое раскрытие во включенной публикации, если имеются противоречия. Следует отметить, что при использовании в этом документе и в прилагаемой формуле изобретения формы слов в единственном числе включают ссылку на слова во множественном числе, если иное не диктуется явно контекстом. Таким образом, например, при употреблении слова "клетка" подразумевает,что сюда включено множество таких клеток, и употребление слова "пептид" подразумевает, что сюда включены один или несколько пептидов и их эквивалентов, например полипептидов, известных специа-5 025172 листам в данной области, и так далее. Публикации, обсуждаемые в этом документе, приведены исключительно из-за их раскрытия до даты подачи настоящей заявки. Ничто из изложенного в этом документе не следует толковать как допущение, что настоящее изобретение не имеет права датировать задним числом такую публикацию на основании предшествующего изобретения. Кроме того, указанные даты публикации могут отличаться от фактических дат публикации, которые могут требовать независимого подтверждения. Определения. Предложены способы, композиции и наборы для определения способности к развитию одного или нескольких эмбрионов или плюрипотентных клеток и/или наличия хромосомных нарушений в одном или нескольких эмбрионах или плюрипотентных клетках. Данные способы, композиции и наборы находят применение при идентификации in vitro эмбрионов и яйцеклеток, которые наиболее полезны для применения при лечении бесплодия у людей. Эти и другие цели, преимущества и особенности изобретения будут очевидны специалистам в данной области при чтении подробного описания рассматриваемых способов и композиций, которые более подробно описаны ниже. Термин "способность к развитию" применяется в этом документе для обозначения способности или возможности здорового эмбриона или плюрипотентной клетки расти или развиваться. Термин "эмбрион" применяется в этом документе для обозначения как зиготы, образовавшейся, когда две гаплоидные клетки гамет, например неоплодотворенная яйцеклетка II порядка и клетка спермы,сливаются с образованием диплоидной тотипотентной клетки, например оплодотворенной яйцеклетки,так и эмбриона, образующегося в результате следующих сразу последовательных клеточных делений,т.е. эмбрионального дробления, вплоть до этапа морулы, т.е. 16-клеточной стадии, и стадии бластоцисты(с дифференцированными трофэктодермой и внутренней клеточной массой). Термин "плюрипотентная клетка" применяется в этом документе для обозначения любой клетки,обладающей способностью дифференцироваться во множество типов клеток в организме. Примеры плюрипотентных клеток включают стволовые клетки, яйцеклетки и 1-клеточные эмбрионы (т.е. зиготы). Термин "стволовая клетка" применяется в этом документе для обозначения клетки или популяции клеток, которые (а) способны к самовоспроизведению и (b) обладают способностью давать начало различным типам дифференцированных клеток. Часто стволовая клетка обладает способностью давать начало многим линиям клеток. При использовании в этом документе стволовая клетка может являться тотипотентной стволовой клеткой, например оплодотворенной яйцеклеткой, которая дает начало всем эмбриональным и экстраэмбриональным тканям организма; плюрипотентной стволовой клеткой, например эмбриональной стволовой клеткой (ES), эмбриональной половой клеткой (EG) или индуцированной плюрипотентной стволовой клеткой (iPS), которая дает начало всем эмбриональным тканям организма,т.е. эндодермальной, мезодермальной и эктодермальной линиям; мультипотентной стволовой клеткой,например мезенхимной стволовой клеткой, которая дает начало по меньшей мере двум эмбриональным тканям организма, т.е. по меньшей мере двум линиям из эндодермальной, мезодермальной и эктодермальной, или она может являться тканехарактерной стволовой клеткой, которая дает начало множеству типов дифференцированных клеток в составе конкретной ткани. Тканехарактерные стволовые клетки включают тканехарактерные эмбриональные клетки, которые дают начало клеткам конкретной ткани, и соматические стволовые клетки, которые располагаются во взрослых тканях и могут давать начало клеткам конкретной ткани, например нейрональные стволовые клетки, которые дают начало всем клеткам центральной нервной системы, сателлитные клетки, которые дают начало скелетной мускулатуре, и гематопоэтические стволовые клетки, которые дают начало всем клеткам гематопоэтической системы. Термин "яйцеклетка" применяется в этом документе для обозначения неоплодотворенной женской половой клетки, или гаметы. Яйцеклетки в рассматриваемой заявке могут являться яйцеклетками I порядка, и в этом случае они позиционируются как вступающие или проходящие стадию мейоза I, или яйцеклетками II порядка и в этом случае они позиционируются как вступающие или проходящие стадию мейоза II. Под "мейозом" понимаются явления клеточного цикла, в результате которых образуются гаметы. В ходе первого мейотического клеточного цикла, или мейоза I, хромосомы клеток удваиваются и разделяются между двумя дочерними клетками. После этого данные дочерние клетки делятся в ходе второго мейотического клеточного цикла, или мейоза II, который не сопровождается синтезом ДНК, в результате чего образуются гаметы с гаплоидным числом хромосом. Под стадией "зародышевого пузырька" понимается стадия созревания яйцеклетки I порядка, которая коррелирует с профазой I мейоза I клеточного цикла, т.е. перед первым делением ядерного материала. Яйцеклетки на этой стадии также называют "яйцеклетками с зародышевым пузырьком", из-за наличия характерного крупного ядра, именуемого зародышевым пузырьком. В нормальной яйцеклетке человека, культивируемой in vitro, зародышевый пузырек появляется примерно через 6-24 ч после начала созревания. Под стадией "метафазы I" понимается стадия созревания яйцеклетки I порядка, которая коррелирует с метафазой I клеточного цикла мейоза I. По сравнению с яйцеклетками с зародышевым пузырьком,яйцеклетки метафазы I не содержат крупное, явно выраженное ядро. В нормальной яйцеклетке человека,-6 025172 культивируемой in vitro, метафаза I наступает примерно через 12-36 ч после начала созревания. Под стадией "метафазы II" понимается стадия созревания яйцеклетки II порядка, которая коррелирует с метафазой II клеточного цикла мейоза II. Отличительным признаком метафазы II является экструзия первого полярного тельца. В нормальной яйцеклетке человека, культивируемой in vitro, метафаза II наступает примерно через 24-48 ч после начала созревания. Под "митотическим клеточным циклом" понимаются явления в клетке, которые приводят к удвоению хромосом клетки и делению этих хромосом и содержимого цитоплазмы на две дочерние клетки. Митотический клеточный цикл подразделяют на две фазы: интерфаза и митоз. Во время интерфазы клетка растет и реплицирует свою ДНК. Во время митоза клетка начинает и завершаетклеточное деление,сначала разделяя свой ядерный материал, а после этого деля содержимое своей цитоплазмы и свой разделенный ядерный материал (в ходе цитокинеза) на две отдельные клетки. Под "первым митотическим клеточным циклом" или "клеточным циклом 1" понимается временной интервал от оплодотворения до завершения явления первого цитокинеза, т.е. деление оплодотворенной яйцеклетки на две дочерние клетки. В тех случаях, когда яйцеклетки оплодотворяют in vitro, в качестве замены этого временного интервала можно применять временной интервал между инъекцией хорионического гонадотропина человека (ХГЧ) (обычно вводимого перед извлечением яйцеклетки) до завершения явления первого цитокинеза. Под "вторым митотическим клеточным циклом" или "клеточным циклом 2" подразумевается явление второго клеточного цикла, наблюдаемое у эмбриона, временной интервал между образованием дочерних клеток из оплодотворенной яйцеклетки в результате митоза и образованием первого комплекта третичных клеток из одной из этих дочерних клеток ("лидирующей дочерней клетки", или дочерней клетки А) в результате митоза. По завершении клеточного цикла 2 эмбрион состоит из 3 клеток. Иначе говоря, клеточный цикл 2 можно визуально определить как время между эмбрионом, содержащим 2 клетки и эмбрионом, содержащим 3 клетки. Под "третьим митотическим клеточным циклом" или "клеточным циклом 3" подразумевается явление третьего клеточного цикла, наблюдаемое у эмбриона, в типичном случае временной интервал от образования дочерних клеток из оплодотворенной яйцеклетки в результате митоза и образованием второго комплекта третичных клеток из второй дочерней клетки ("запаздывающей дочерней клетки", или дочерней клетки В) в результате митоза. По завершении клеточного цикла 3 эмбрион состоит из 4 клеток. Иначе говоря, клеточный цикл 3 можно визуально определить как время между эмбрионом, содержащим 3 клетки и эмбрионом, содержащим 4 клетки. Под "явлением первого дробления" подразумевается первое деление, т.е. деление яйцеклетки на две дочерние клетки, т.е. клеточный цикл 1. По завершении явления первого дробления эмбрион состоит из 2 клеток. Под "явлением второго дробления" подразумевается второй комплект делений, т.е. деление лидирующей дочерней клетки на две третичные клетки и деление запаздывающей дочерней клетки на две третичные клетки. Иначе говоря, явление второго дробления состоит из клеточного цикла 2 и клеточного цикла 3. По завершении второго дробления эмбрион состоит из 4 клеток. Под "явлением третьего дробления" подразумевается третий комплект делений, т.е. деления всех третичных клеток. По завершении явления третьего дробления эмбрион состоит из 8 клеток. Под "цитокинезом" или "делением клетки" подразумевается фаза митоза, в которой клетка претерпевает деление. Иначе говоря, это стадия митоза, на которой разделенный ядерный материал и содержимое цитоплазмы клетки делятся с образованием двух дочерних клеток. Период цитокинеза можно определить как период, или промежуток, времени между первым наблюдением перетяжки клеточной мембраны ("борозды дробления") и завершением явления образования перетяжки, т.е. образованием двух дочерних клеток. Начало образования борозды дробления можно визуально определить как точку, в которой линия изгиба клеточной мембраны изменяет форму с выпуклой (закругленной наружу) на вогнутую (изогнутую внутрь с формированием вмятины или вдавливания). Это проиллюстрировано на верхней панели фиг. 4 с помощью белых стрелок, указывающих на 2 борозды дробления. Начало удлинения клетки также может применяться как метка начала цитокинеза, и в этом случае период цитокинеза определяют как период времени между началом удлинения клетки и завершением деления клетки. Под "первым цитокинезом" или "цитокинезом 1" подразумевается явление первого деления клетки после оплодотворения, т.е. деление оплодотворенной яйцеклетки с образованием двух дочерних клеток. Первый цитокинез обычно происходит примерно через один день после оплодотворения. Под "вторым цитокинезом" или "цитокинезом 2" подразумевается явления второго деления клетки,наблюдаемое у эмбриона, т.е. деление дочерней клетки оплодотворенной яйцеклетки ("лидирующей дочерней клетки" или дочерней клетки А) на первый комплект из двух третичных клеток. Под "третьим цитокинезом" или "цитокинезом 3" подразумевается явления третьего деления клетки, наблюдаемое у эмбриона, т.е. деление второй дочерней клетки оплодотворенной яйцеклетки ("запаздывающей дочерней клетки" или дочерней клетки В) на второй комплект из двух третичных клеток. Термины "масштабная метка" или "координатная метка" обозначают объект, помещаемый в поле зрения системы формирования изображений, который появляется на полученном изображении с целью использования в качестве точки привязки или измерения. Это может быть либо что-то помещенное внутрь или на объект для визуализации, либо метка или набор меток на окулярной шкале оптического прибора. Термин "микролунка" относится к контейнеру, имеющему размеры, сопоставимые по масштабам с клеточными, предпочтительно для обеспечения размещения одиночной эукариотической клетки. Представляющие интерес плюрипотентные клетки и эмбрионы. В способах по изобретению один или несколько эмбрионов или плюрипотентных клеток оценивают по их способности к развитию путем измерения одного или нескольких клеточных параметров у эмбриона(ов) или плюрипотентной(ых) клетки(ок) и применения этих значений измерения для определения способности к развитию эмбриона(ов) или плюрипотентной(ых) клетки(ок). Информацию, полученную таким образом, можно применять для принятия решений в клинической практике, например переносить или нет полученный оплодотворением in vitro эмбрион, трансплантировать или нет культивируемую клетку или клетки. Примеры эмбрионов, оценку которых можно осуществлять с применением способов по изобретению, включают 1-клеточные эмбрионы (также называемые зиготами), 2-клеточные эмбрионы, 3 клеточные эмбрионы, 4-клеточные эмбрионы, 5-клеточные эмбрионы, 6-клеточные эмбрионы, 8 клеточные эмбрионы и т.д., в типичном случае - вплоть до и включая 16-клеточные эмбрионы, любой из которых может быть получен любым стандартным способом, например из яйцеклетки, созревшей в организме, или из яйцеклетки, созревшей in vitro. Примеры плюрипотентных клеток, оценку которых можно осуществлять с применением способов по изобретению, включают тотипотентные стволовые клетки, например яйцеклетки, такие как яйцеклетки I порядка и яйцеклетки II порядка; плюрипотентные стволовые клетки, например клетки ES, клеткиEG, клетки iPS и т.п.; мультипотентные клетки, например мезенхимные стволовые клетки; и тканеспецифичные стволовые клетки. Они могут быть получены на любой стадии жизни, например эмбриональной, неонатальной, ювенальной или от взрослого организма, и принадлежать любому из полов, т.е. XX или XY. Эмбрионы и плюрипотентные клетки могут происходить от любого организма, например от любого вида млекопитающих, например человека, примата, лошади, коровы, свиньи, собаки, кошки и т.д. Предпочтительно, чтобы они были получены от человека. Они могут быть ранее заморожены, например эмбрионы, подвергнутые криоконсервации на 1-клеточной стадии и затем размороженные, или замороженные и размороженные яйцеклетки и стволовые клетки. В качестве альтернативного варианта они могут быть свежеприготовленными, например эмбрионы, свежеприготовленные из яйцеклеток с применением методики экстракорпорального оплодотворения; яйцеклетки, являющиеся свежеизвлеченными и/или созревшими без предварительной заморозки с применением методик манипуляций in vitro, или полученные из плюрипотентных стволовых клеток, дифференциировавшихся in vitro в половые клетки и созревших в яйцеклетки; стволовые клетки, свежеприготовленные путем дезагрегации и культивирования тканей способами, известными специалистам в данной области; и т.п. Они могут культивироваться в любых стандартных условиях, известных специалистам в данной области, для обеспечения выживания, роста и/или развития образца, подвергаемого оценке, например, в случае эмбрионов, в таких условиях, как условия, применяемые в области экстракорпорального оплодотворения; смотрите, например, патент США 6610543, патент США 6130086, патент США 5837543, открытия, которые включены сюда в качестве ссылок; в случае яйцеклеток, в таких условиях, как условия, применяемые в данной области для обеспечения созревания яйцеклеток; смотрите, например, патент США 5882928 и патент США 6281013, открытия, которые включены сюда в качестве ссылок; в случае стволовых клеток, в таких условиях, как условия, применяемые в данной области для обеспечения пролиферации; смотрите, например,США 6777233, патент США 7037892, патент США 7029913, патент США 5843780 и патент США 6200806, заявку на патент США 2009/0047263; заявку на патент США 2009/0068742, открытия, которые включены сюда в качестве ссылок. Часто эмбрионы/плюрипотентные клетки культивируют в имеющейся в продаже среде, такой как Knockout DMEM, DMEM-F12 или среда Дульбекко в модификации Искова, с добавлением сыворотки или заменителя сыворотки, аминокислот и факторов роста,адаптированных к потребностям конкретного эмбриона/плюрипотентной клетки, предназначенных для оценки. Анализ с применением цейтраферной съемки. В некоторых вариантах воплощения эмбрионы/плюрипотентные клетки оценивают путем измерения клеточных параметров с применением цейтраферной съемки. Эмбрионы/плюрипотентные клетки можно культивировать в стандартных культуральных чашках. В качестве альтернативы эмбрионы/плюрипотентные клетки можно культивировать в изготовленных на заказ культуральных чашках,например изготовленных на заказ чашках с микролунками оптического качества, как описано ниже. В таких изготовленных на заказ чашках в каждой микролунке помещается одиночный эмбрион/плюрипотентная клетка, и поверхность дна каждой микролунки имеет полировку оптического качества, таким образом, может быть получено изображение целой группы эмбрионов в пределах одной чашки одновременно с помощью одного миниатюрного микроскопа с разрешением, достаточным для наблюде-8 025172 ния за процессами клеточного митоза. Целая группа микролунок делит между собой одну и ту же каплю среды в культуральной чашке, и также может включать наружную стенку, расположенную вокруг микролунок, для стабилизации капли среды, а также масштабные метки, расположенные рядом с микролунками. Гидрофобность поверхности можно контролировать с применением плазменного травления или другой обработки для предотвращения образования пузырьков в микролунках при наполнении средой. Независимо от того, применяются стандартные культуральные чашки или изготовленные на заказ культуральные чашки во время культивирования, один или несколько развивающихся эмбрионов можно культивировать в одной и той же культуральной среде, например можно культивировать от 1 до 30 эмбрионов на чашку. Изображения получают в течение определенного периода времени и потом анализируют для получения показателей для одного или нескольких клеточных параметров. Цейтраферную съемку можно производить с применением любого управляемого компьютером микроскопа, который оборудован для хранения и анализа цифровых изображений, например инвертированных микроскопов, оборудованных нагревательными платформами и камерами для инкубирования, или изготовленных на заказ составными комплектами миниатюрных микроскопов, которые помещают в стандартный инкубатор. Комплект миниатюрных микроскопов позволяет проводить одновременное культивирование множества чашек с образцами в одном и том же инкубаторе, а также позволяет проводить масштабирование для обеспечения наличия множества каналов без ограничения минимального временного интервала между последовательными захватами изображения. Применение множества микроскопов освобождает от необходимости перемещать образец, что повышает точность системы и общую надежность системы. Отдельные микроскопы в инкубаторе могут быть частично или полностью изолированными, обеспечивая каждой культуральной чашке свою собственную контролируемую окружающую среду. Это позволяет перемещать чашки в установку для получения изображений и из нее, не нарушая окружающую среду других образцов. В системе формирования изображений для цейтраферной съемки могут применяться светлопольное освещение, темнопольное освещение, фазовый контраст, модуляционный контраст Хоффмана, дифференциально интерференционный контраст или флуоресценция. В некоторых вариантах воплощения темнопольное освещение может применяться для получения усиленного контраста изображения с целью последующего выделения признаков и анализа изображения. Кроме того, источники красного и ближнего инфракрасного света могут применяться для снижения фототоксичности и улучшения контрастности между клеточными мембранами и внутриклеточной частью. Полученные изображения можно сохранять непрерывно, как при живом видео, или периодически,как при цейтраферной фотографии, когда получают повторяющиеся изображения объекта в виде стопкадра. Предпочтительно временной интервал между изображениями должен составлять от 1 до 30 мин для того, чтобы запечатлеть значимые морфологические явления, как описано ниже. В соответствии с другим вариантом воплощения, временной интервал между изображениями может меняться в зависимости от интенсивности клеточной активности. Например, во время активных периодов изображения могут получать каждые несколько секунд или каждую минуту, в то время как во время неактивных периодов изображения могут получать каждые 10 или 15 мин или через более длинные промежутки. Анализ изображений в реальном времени в отношении захваченных изображений можно применять для определения того, когда и каким образом изменять временные интервалы. В предложенных нами способах подсчитано, что суммарное количество света, полученного образцами за 5 дней визуализации, эквивалентно примерно 2 4 мин непрерывной экспозиции при низкой освещенности. Интенсивность света в системе для цейтраферной съемки существенно ниже, чем интенсивность света, применяемого в типичном случае в микроскопе, используемом в области вспомогательной репродукции, благодаря низкой мощности светодиодов (LEDs) (например, применение 1 Вт LED, по сравнению с типичной 100 Вт галогеновой лампой) и высокой чувствительности сенсора камеры. Таким образом, суммарное количество световой энергии, получаемой эмбрионом при применении системы для цейтраферной съемки, сопоставимо или ниже,чем количество энергии, получаемой во время стандартных процедур в клинике для проведения ЭКО. Кроме того, время экспозиции можно существенно уменьшить с целью снижения суммарного количества световой экспозиции эмбриона/плюрипотентной клетки. В случае 2-дневного анализа, с захватом изображений каждые 5 мин при 0,5 с световой экспозиции на каждое изображение, суммарное количество экспозиции при низкой освещенности составляет менее 5 мин. После получения изображений последние подвергают выделению и анализу в отношении различных клеточных параметров, например размера клеток, толщины блестящей оболочки (zona pellucida),степени фрагментации, симметрии дочерних клеток, образующихся в результате клеточного деления,временных интервалов между несколькими первыми митозами и длительности цитокинеза. Клеточные параметры, которые можно измерить с применением цейтраферной съемки, обычно представляют собой морфологические явления. Например, при оценке эмбрионов цейтраферную съемку можно применять для измерения длительности явления цитокинеза, например цитокинеза 1, цитокинеза 2, цитокинеза 3 или цитокинеза 4, при этом длительность явления цитокинеза определяют как временной интервал между первым наблюдением появления борозды дробления (началом цитокинеза) и разделением борозды дробления на две дочерние клетки (т.е. образованием двух дочерних клеток). Другим пред-9 025172 ставляющим интерес параметром есть длительность клеточного цикла, например клеточного цикла 1,клеточного цикла 2, клеточного цикла 3 или клеточного цикла 4, при этом длительность клеточного цикла определяют как временной интервал между образованием клетки (в случае клеточного цикла 1 - при оплодотворении яйцеклетки; в случае последующих клеточных циклов - при завершения цитокинеза) и образованием двух дочерних клеток из этой клетки. Другие представляющие интерес клеточные параметры, которые можно измерить с применением цейтраферной съемки, включают временные интервалы,которые определяют в отношении следующих клеточных явлений: например, (а) временной интервал между цитокинезом 1 и цитокинезом 2, определяемый как любой из интервалов между началом цитокинеза 1 и началом цитокинеза 2, интервал между завершением цитокинеза 1 и завершением цитокинеза 2,интервал между началом цитокинеза 1 и завершением цитокинеза 2; или интервал между завершением цитокинеза 1 и началом цитокинеза 2; или (b) временной интервал между цитокинезом 2 и цитокинезом 3, определяемый как любой из интервалов между началом цитокинеза 2 и началом цитокинеза 3, или интервал между завершением цитокинеза 2 и завершением цитокинеза 3, или интервал между началом цитокинеза 2 и завершением цитокинеза 3, или интервал между завершением цитокинеза 2 и началом цитокинеза 3. Считается, что для целей экстракорпорального оплодотворения полезен перенос эмбриона в матку на ранней стадии развития, например на 2 день или 3 день, т.е. вплоть до 8-клеточной стадии, для снижения вероятности потери эмбриона из-за неблагоприятного воздействия условий культивирования, относящихся к окружающей среде in vitro, а также для снижения потенциальных нежелательных исходов,связанных с эпигенетическими ошибками, которые могут возникнуть во время культивирования (Katariet al. (2009) Hum Mol Genet. 18 (20):3769-78; Sepulveda et al. (2009) Fertil Steril. 91(5):1765-70). Исходя из этого, предпочтительно, чтобы измерение клеточных параметров производились в течение 2 дней после оплодотворения, хотя более длинные периоды проведения анализа, например примерно 36 ч, примерно 54 ч, примерно 60 ч, примерно 72 ч, примерно 84 ч, примерно 96 ч или более, также рассматриваются в условиях применения существующих способов. Примеры клеточных параметров созревающей яйцеклетки, которые можно оценить с применением цейтраферной съемки, включают, в частности, изменения морфологии мембраны яйцеклетки, например скорость и степень отделения от блестящей оболочки; изменения морфологии ядра яйцеклетки, например, начало, завершение и скорость разрушения зародышевого пузырька (GVBD); скорость и направление движения гранул в цитоплазме и ядре; цитокинез яйцеклетки и первого полярного тельца и движение и/или длительность экструзии первого полярного тельца, другие параметры включают длительность цитокинеза зрелой яйцеклетки II порядка и второго полярного тельца. Примеры клеточных параметров стволовой клетки или популяции стволовых клеток, которые можно оценить с применением цейтраферной съемки, включают, в частности, длительность явлений цитокинеза, время между явлениями цитокинеза, размер и форму стволовых клеток перед и во время явлений цитокинеза, количество дочерних клеток, образующихся в результате явления цитокинеза, пространственное расположение борозды дробления, скорость и/или количество наблюдаемых асимметричных делений (т.е. делений, при которых одна дочерняя клетка остается стволовой клеткой, а другая дифференцируется), скорость и/или количество наблюдаемых симметричных делений (т.е. делений, при которых обе дочерние клетки либо остаются стволовыми клетками, либо дифференцируются) и временной интервал между завершением явления цитокинеза и моментом, когда стволовая клетка начинает дифференцироваться. Параметры можно измерять вручную или их можно измерять автоматически, например, с помощью программного обеспечения для анализа изображений. Если применяют программное обеспечение для анализа изображений, могут применять алгоритмы анализа изображений, в которых используется методика оценки вероятностных моделей, основанная на поэтапном применении метода Монте-Карло, например, путем генерирования распределений, предложенных гипотезой моделей эмбрионов/плюрипотентных клеток, моделирования изображений на основании простой оптической модели и сравнения этих смоделированных изображений с данными наблюдаемых изображений. При применении таких оценок вероятностных моделей клетки можно моделировать как имеющие любую подходящую форму, например как совокупности эллипсов в двумерном пространстве, совокупности эллипсоидов в трехмерном пространстве и т.п. Для учета окклюзии и неоднозначностей определения глубины способ может обеспечивать соблюдение пространственных ограничений, которые соответствуют ожидаемым физическим характеристикам. Для улучшения устойчивости изображения можно делать захват в одной или нескольких фокальных плоскостях. Анализ экспрессии генов В некоторых вариантах воплощения эмбрионы или плюрипотентные клетки оценивают путем измерения экспрессии генов. В таких воплощениях клеточным параметром является уровень экспрессии гена или профиль экспрессии генов. Определение экспрессии одного или нескольких генов, т.е. получение экспрессионного профиля или оценку экспрессии, можно осуществлять путем измерения представленных нуклеиновыми кислотами транскриптов, например мРНК, одного или нескольких целевых генов, например профиля экспрессии на уровне нуклеиновых кислот; или путем измерения уровней одного или нескольких различных белков/полипептидов, являющихся продуктами экспрессии одного или нескольких целевых генов, например протеомного профиля экспрессии. Иначе говоря, термины "экспрессионный профиль" и "оценка экспрессии" широко используются как включающие профиль экспрессии генов на уровне РНК или на уровне белка. В некоторых вариантах воплощения экспрессию генов можно оценивать путем получения экспрессионного профиля на уровне нуклеиновых кислот, при этом определяют количество или уровень одной или нескольких нуклеиновых кислот в пробе, например, представленного нуклеиновой кислотой транскрипта одного или нескольких целевых генов. В этих вариантах воплощения проба, которую количественно оценивают для получения экспрессионного профиля, является пробой нуклеиновой кислоты. Проба нуклеиновой кислоты включает множество или популяцию отдельных нуклеиновых кислот, которая содержит информацию об экспрессии целевых генов в оцениваемом эмбрионе или клетке. Нуклеиновая кислота может включать нуклеиновые кислоты, относящиеся к РНК или ДНК, например мРНК, кРНК,кДНК и т.д., при условии, что проба сохраняет информацию об экспрессии в клетке-хозяине или в ткани,из которой она получена. Пробу можно приготовить с применением ряда различных способов, известных специалистам в данной области, например, путем выделения мРНК из клетки, при этом выделенную мРНК используют как есть, амплифицируют, используют для получения кДНК, кРНК и т.д., как это известно специалистам в области анализа дифференциальной экспрессии. Пробу можно приготовить из единичной клетки, например плюрипотентной клетки из культуры целевых плюрипотентных клеток или из единичной клетки (бластомера) из целевого эмбриона; или из нескольких клеток, например из части культуры плюрипотентных клеток, или 2, 3 или 4 или более бластомеров из целевого эмбриона, применяя стандартные протоколы. Экспрессионный профиль может быть получен из исходной пробы нуклеиновой кислоты с применением любого стандартного протокола. Хотя известно множество различных способов получения экспрессионных профилей, таких как применяемые в области анализа дифференциальной экспрессии генов,одними из типичных и распространенных типов протоколов для получения экспрессионных профилей есть протоколы получения экспрессионных профилей, основанные на применении чипов. Такие типы применения представляют собой гибридизационный анализ, при котором для получения профилей применяют нуклеиновую кислоту, предоставляющую являющиеся нуклеиновыми кислотами "зонды" для каждого из генов, который будет анализироваться/наноситься на профиль. При анализе такого типа сначала приготавливают пробу целевой нуклеиновой кислоты из исходной анализируемой пробы нуклеиновой кислоты, при этом приготовление может включать маркировку целевых нуклеиновых кислот меткой,например, принадлежащей к системе, продуцирующей сигнал. После приготовления пробы целевой нуклеиновой кислоты эта проба контактирует с чипом в условиях гибридизации, посредством чего образуются комплексы между целевыми нуклеиновыми кислотами и комплементарными последовательностями зондов, присоединенных к поверхности чипа. После этого детектируют наличие гибридизованных комплексов, качественно или количественно. Специфичная гибридизационная технология, которую можно применять на практике для получения экспрессионных векторов, применяемых в рассматриваемых способах, включает технологию, описанную в патентах США : 5143854; 5288644; 5324633; 5432049; 5470710; 5492806; 5503980; 5510270; 5525464; 5547839; 5580732; 5661028; 5800992; содержание каждого из которых включено сюда в качестве ссылок; а также в WO 95/21265; WO 96/31622; WO 97/10365; WO 97/27317; ЕР 373 203; и ЕР 785280. В этих способах чип с "зондами", являющимися нуклеиновыми кислотами, который содержит зонд для каждого из определяющих фенотип генов, экспрессию которых оценивают, контактирует с целевыми нуклеиновыми кислотами, как описано выше. Контакт происходит в условиях гибридизации, например,жестких условиях гибридизации, и несвязанная нуклеиновая кислота удаляется. Термин "жесткие условия анализа" при использовании в этом документе означает условия, совместимые с получением комплементарно связанных пар нуклеиновых кислот, например связанных с поверхностью и находящихся в растворе нуклеиновых кислот, обладающих достаточной степенью комплементарности для обеспечения желаемого уровня специфичности анализа, и которые одновременно в меньшей степени совместимы с образованием комплементарно связанных пар между взаимодействующими членами с недостаточной степенью комплементарности для обеспечения желаемой специфичности. Жесткие условия анализа являются суммой или комбинацией (совокупностью) условий как гибридизации, так и отмывки. Выявленные в результате паттерны гибридизованных нуклеиновых кислот дают информацию относительно экспрессии каждого из генов, у которого был маркер, при этом информация об экспрессии представлена с точки зрения того, экспрессируется ген или нет и, в типичном случае, на каком уровне при этом данные об экспрессии, т.е. экспрессионный профиль (например, в форме транскриптома), может быть как качественным, так и количественным. В соответствии с другим вариантом для количественного определения уровня одной или нескольких нуклеиновых кислот в пробе могут применять способы, не основанные на использовании чипов,включая те, которые основаны на протоколах амплификации, например анализ на основе полимеразной цепной реакции (ПЦР), включая количественную ПЦР, обратную транскрипцию с последующей ПЦР(ОТ-ПЦР), ПЦР в реальном времени и т.п. В некоторых вариантах воплощения экспрессию генов можно оценивать путем получения экспрес- 11025172 сионного профиля на уровне протеома, при этом определяют количество или уровень одного или нескольких белков/полипептидов в пробе, например белка/полипептида, кодируемого целевым геном. В этих вариантах воплощения проба, которую количественно оценивают для получения применяемого в данных способах экспрессионного профиля, есть белковой пробой. В том случае, если экспрессионный профиль есть экспрессионным профилем на уровне протеома, т.е. профилем уровней одного или нескольких белков в пробе, могут применять любой стандартный протокол для оценки уровней белка, при этом определяют уровень одного или нескольких белков в анализируемой пробе. Хотя специалистам в данной области известно множество различных способов анализа уровней белка, одним из характерных и распространенных типов протоколов для оценки уровней белка являетсяELISA (твердофазный иммуноферментный анализ). При ELISA и анализе, основанном на ELISA, одно или несколько антител, характерных для целевых белков, могут быть иммобилизованы на выбранной твердой поверхности, предпочтительно поверхности, обладающей аффинностью к белкам -такой как лунки титрационного микропланшета из полистирола. После отмывки для удаления не адсорбировавшегося полностью материала лунки аналитического планшета покрывают неспецифичным "блокирующим" белком, о котором известно, что он антигенно нейтрален по отношению к испытуемой пробе, таким как бычий сывороточный альбумин (БСА), казеин или растворы сухого молока. Это позволяет блокировать все места нетипичной адсорбции на иммобилизующей поверхности, тем самым снижая фоновый сигнал,вызванный неспецифичным связыванием антигена на поверхности. После отмывки для удаления не связанного блокирующего белка иммобилизующая поверхность контактирует с испытуемой пробой в условиях, способствующих образованию иммунного комплекса (антиген/антитело). Такие условия включают разбавление пробы разбавителем, таким как БСА или бычий гамма-глобулин (БГГ) в фосфатно-солевом буфере (PBS)/Твин или PBS/Тритон-Х 100, что также способствует снижению неспецифичного фонового сигнала, и способствует инкубации пробы в течение 2-4 ч при температуре порядка 25-27 С (хотя можно применять и другие температурные значения). После инкубации проконтактировавшую с антисывороткой поверхность отмывают так, чтобы удалить не связанный в иммунокомплексы материал. Характерная методика отмывки включает отмывку таким раствором, как PBS/Твин, PBS/Тритон-Х 100 или боратным буфером. Наличие и количественную характеристику образования иммунокомплексов можно определить путем последующего исследования связанных иммунокомплексов с помощью второго антитела, обладающего типичностью для целевой молекулы, отличной от типичности первого антитела, и детекции связывания второго антитела. В некоторых воплощениях второе антитело будет нести связанный фермент, например уреазу, пероксидазу или щелочную фосфатазу, который будет обеспечивать образование окрашенного осадка при инкубации с соответствующим хромогенным субстратом. Например, можно применять IgG против белков человека, которые конъюгированные с уреазой или пероксидазой, в течение периода времени и в условиях, способствующих "проявке" образования иммунокомплексов (например, инкубация в течение 2 ч при комнатной температуре в содержащем PBS растворе, таком какPBS/Твин). После такой инкубации со вторым антителом и отмывки для удаления несвязанного материала проводят количественное определение маркера, например, путем инкубации с хромогенным субстратом, таким как мочевина и бромкрезоловый пурпурный в случае маркировки уреазой, или 2,2'-азино-ди(3-этилбензтиазолин)-6-сульфоновая кислота (ABTS) и H2O2, в случае маркировки пероксидазой. После этого количественное определение достигается путем измерения степени развившегося окрашивания,например, с применением спектрофотометра для видимой части спектра. Вышеуказанный формат может быть изменен посредством связывания на первом этапе пробы с аналитическим планшетом. После этого с аналитическим планшетом инкубируют первое антитело, после чего детектируют связывание первого антитела с применением маркированного второго антитела, обладающего специфичностью для первого антитела. Твердая подложка, на которую иммобилизуют антитело или антитела, может быть изготовлена из большого множества материалов и в самых разнообразных формах, например титрационный микропланшет, микрошарик, щуп, частица смолы и т.д. Подложка может быть выбрана так, чтобы сделать максимальным соотношение сигнал-шум, минимизировать фоновое связывание, а также с учетом простоты разделения и цены. Отмывки можно проводить таким способом, который наиболее пригоден для используемой подложки, например, путем удаления шарика или щупа из резервуара, удаления или разбавления содержимого резервуара, такого как лунка титрационного микропланшета, или промывка шарика, частицы, хроматографической колонки или фильтра промывочным раствором или растворителем. Как альтернативу, для измерения уровней одного или нескольких белков в пробе можно применять методы, не основанные на ELISA. Типичные примеры включают, но не есть ограничивающими для массспектрометрии, протеомных чипов, технологии применения микросфер хМАР, проточной цитометрии,Вестерн-блоттинга и иммуногистохимии. Полученные в результате данные предоставляют информацию относительно экспрессии каждого из маркерованных генов, при этом информация об экспрессии представлена с точки зрения того, экспрессируется ген или нет и, в типичном случае, на каком уровне, при этом данные об экспрессии могут быть как качественными, так и количественными. При получении экспрессионного профиля в некоторых вариантах воплощения пробу исследуют для получения экспрессионного профиля, который содержит данные об экспрессии по меньшей мере для одного гена/белка, иногда для множества генов/белков, при этом под множеством понимают как минимум два различных гена/белка, и часто как минимум около 3, в типичном случае миниум около 10 и наиболее часто минимум около 15 различных генов/белков или более, например 50 или более, или 100 или более и т.д. В самом широком смысле оценка экспрессии может быть качественной или количественной. По существу, если определение качественное, способы обеспечивают толкование или оценку, например оценку того, присутствует ли целевой аналит, например нуклеиновая кислота или продукт экспрессии, в анализируемой пробе. В других вариантах воплощения способы обеспечивают количественное определение того, присутствует ли целевой аналит в анализируемой пробе, т.е. оценку или определение фактического количества или относительного количества целевого аналита, например нуклеиновой кислоты или белка, в анализируемой пробе. В таких воплощениях количественное определение может быть абсолютным или, если способ есть способом определения в пробе двух или нескольких различных аналитов,например нуклеиновых кислот или белков, относительным. По существу, термин "количественное определение", при использовании в контексте количественного определения в пробе целевого аналита, например нуклеиновой(ых) кислоты (кислот) или белка(ов), может означать абсолютное или относительное количественное определение. Абсолютное количественное определение может быть осуществлено путем включения известной(ых) концентрации(ий) одного или нескольких контрольных аналитов и сравнения с контролем, т.е. нормирования определенного уровня целевого аналита с известным контрольным аналитом (например, путем построения стандартной кривой). В соответствии с другим вариантом, относительное количественное определение может быть осуществлено путем сравнения определенных уровней или количеств между двумя или несколькими различными целевыми аналитами для получения относительного количественного значения для каждого из двух или нескольких различных аналитов, например, относительно друг друга. Примеры генов, уровни экспрессии которых есть прогностическими в отношении способности зиготы к развитию, включают гены кофилина Другие гены, уровни экспрессии которых могут служить в качестве клеточного параметра, прогностического в отношении способности эмбриона к развитию, представлены на фиг. 8. При проведении количественного определения уровня экспрессии гена уровень экспрессии часто оценивают и потом нормируют относительно стандартного контроля, например уровня экспрессии в пробе гена, о котором известно, что его уровень экспрессии постоянен в течение периода развития, например GAPDH илиRPLPO, или гена, для которого известен уровень экспрессии в данной временной точке. Уровни экспрессии генов можно определить для одной клетки, например бластомера из целевого эмбриона, или выделенной яйцеклетки, или выделенной клетки из культуры стволовых клеток и т.д., или их можно определить для эмбриона, например 2, 3 или 4 или более бластомеров целевого эмбриона,вплоть до и включая весь целевой эмбрион, или для множества клеток из культуры стволовых клеток,вплоть до и включая всю культуру стволовых клеток и т.д. Другой особенностью настоящего изобретения является то, что оно включает протокол для одновременного проведения генотипирования и анализа экспрессии генов для единичной клетки. В случае эмбрионов, этот протокол можно применять для улучшения преимплантационной генетической диагностики (ПГД), процедуры, при которой из эмбриона извлекают единичную клетку и исследуют ее ДНК на наличие кариотипических дефектов или присутствие генов, характерных для заболеваний. Наш способ позволяет одновременно проводить генетический анализ и анализ экспрессии генов. Способ включает следующие этапы: (1) отбор единичной клетки в небольшом объеме среды или буфера, (2) проведение за один этап обратной транскрипции и амплификации в ходе полимеразной цепной реакции (ПЦР) с применением смеси праймеров для генотипирования и для анализа экспрессии генов, (3) отбор аликвот амплифицированной кДНК менее чем через 18 циклов ПЦР для сохранения линейности амплификации, (4) использование аликвот кДНК для проведения анализа экспрессии генов с применением стандартных методик, таких как количественная ПЦР в реальном времени, (5) использование оставшейся пробы для проведения второго раунда ПЦР с целью дополнительной амплификации генетической информации для задач генотипирования и (6) проведение генотипирования с применением стандартных методик, таких как гель-электрофорез. Определение способности к развитию с помощью анализа изображений и/или экспрессии гена. После получения показателей клеточных параметров эти показатели применяют для определения способности к развитию эмбриона/плюрипотентной клетки. Как обсуждалось выше, термин "способность к развитию" означает способность или возможность плюрипотентной клетки или ткани расти или развиваться. Например, в случае яйцеклетки или эмбриона способность к развитию может представлять собой способность или возможность этих яйцеклетки или эмбриона расти или развиться в здоровую бластоцисту. В качестве еще одного примера, в случае стволовой клетки способность к развитию является способностью или возможностью расти или развиться в одну или несколько представляющих интерес клеток, например в нейрон, мышечную клетку, В- или Т-клетку и т.п. В некоторых вариантах воплощения способность к развитию яйцеклетки или эмбриона является способностью или возможностью этих яйцеклетки или эмбриона развиться в здоровую бластоцисту; успешно имплантироваться в матку; пройти беременность; и/или в результате привести к живорождению. В некоторых вариантах воплощения способность к развитию плюрипотентной клетки является способностью или возможностью этой плюрипотентной клетки развиться в одну или несколько представляющих интерес клеток, например в нейрон, мышечную клетку, В- или Т-клетку и т.п.; и/или войти в состав представляющей интерес ткани invivo. Под "хорошей способностью к развитию" понимают, что существует статистически значимая вероятность, что эмбрион/плюрипотентная клетка разовьется необходимым образом, т.е. существует 55, 60,70, 80, 90, 95% или более высокая вероятность, например 100% вероятность, развития необходимым образом. Иными словами, 55 из 100, 60 из 100, 70 из 100, 80 из 100, 90 из 100, 95 из 100 или 100 из 100 эмбрионов или плюрипотентных клеток, демонстрирующих показатели клеточных параметров, ранее приведшие к определению хорошей способности к развитию, на самом деле продолжают развиваться необходимым образом. И наоборот, под "плохой способностью к развитию" понимают, что не существует статистически значимой вероятности, что эмбрион/плюрипотентная клетка разовьется необходимым образом, т.е. существует 50, 40, 30, 20, 10, 5% или менее вероятность, например 0% вероятность, развития необходимым образом. Иными словами, только 50 из 100, 40 из 100, 30 из 100, 20 из 100, 10 из 100, 5 из 100 или менее эмбрионов или плюрипотентных клеток, демонстрирующих показатели клеточных параметров, ранее приведшие к определению плохой способности к развитию, на самом деле продолжают развиваться необходимым образом. При использовании в этом документе "нормальные" или "здоровые" эмбрионы и плюрипотентные клетки демонстрируют хорошую способность к развитию, тогда как эмбрионы и плюрипотентные клетки "с отклонениями от нормы" демонстрируют плохую способность к развитию. В некоторых вариантах воплощения показатель клеточного параметра применяют непосредственно для определения способности к развитию эмбриона/плюрипотентной клетки. Иначе говоря, абсолютное значение показателя само по себе является достаточным для определения способности к развитию. Примеры этого в воплощениях с применением цейтраферной съемки для измерения клеточных параметров включают, в частности, следующие примеры, каждый из которых отдельно или в сочетании служат признаком хорошей способности к развитию у эмбриона человека: (а) цитокинез 1, длящийся примерно 0-30 мин, например примерно 6-20 мин, в среднем примерно 12-14 мин; (b) клеточный цикл 1, длящийся примерно 20-27 ч, например около 25-27 ч; (с) временной интервал между завершением цитокинеза 1 и началом цитокинеза 2, составляющий примерно 8-15 ч, например около 9-13 ч, со средним значением примерно 11+/-2,1 ч; (d) временной интервал, т.е. синхронность, между началом цитокинеза 2 и началом цитокинеза 3, составляющий примерно 0-5 ч, например около 0-3 ч, со средним временем примерно 1+/-1,6 ч. Примеры прямых показателей, каждый из которых отдельно или в сочетании служат признаком плохой способности к развитию у эмбриона человека, включают, в частности: (а) цитокинез 1, длящийся более чем примерно 30 мин, например около 32, 35, 40, 45, 50, 55 или 60 мин или более; (b) клеточный цикл 1, длящийся более чем примерно 27 ч, например 28, 29 или 30 или более часов; (с) временной интервал между завершением цитокинеза 1 и началом цитокинеза 2, длящийся более чем 15 ч, например около 16, 17, 18, 19 или 20 или более часов, или менее чем 8 ч, например около 7, 5, 4 или 3 или менее часов; (d) временной интервал между началом цитокинеза 2 и началом цитокинеза 3, составляющий 6, 7,8, 9 или 10 или более часов. В некоторых вариантах воплощения показатель клеточного параметра применяют путем сравнения его с показателем клеточного параметра для референсного, или контрольного, эмбриона/плюрипотентной клетки, и применения результатов этого сравнения с целью определения способности эмбриона/плюрипотентной клетки к развитию. Термины "референсный объект" или "контроль" при использовании в этом документе означают стандартизированный эмбрион или клетку, которые применяют для интерпретации показателей клеточных параметров данного эмбриона/плюрипотентной клетки и установления определения их способности к развитию. Референсный объект или контроль могут являться эмбрионом/плюрипотентной клеткой, о которых известно, что они обладают требуемым фенотипом, например хорошей способностью к развитию, и вследствие этого могут служить положительным референсным или контрольным эмбрионом/плюрипотентной клеткой. В соответствии с другим вариантом, референсным/контрольным эмбрионом/плюрипотентной клеткой может быть эмбрион/плюрипотентная клетка, о которых известно, что они не обладают требуемым фенотипом, и вследствие этого являются отрицательным референсным/контрольным эмбрионом/плюрипотентной клеткой. В некоторых воплощениях полученный(е) показатель(и) клеточного параметра сравнивают с сопоставимым показателем(ями) клеточного параметра для единичного референсного/контрольного эмбриона/плюрипотентной клетки с целью получения информации относительно фенотипа анализируемого эмбриона/плюрипотентной клетки. В других воплощениях полученный(е) показатель(и) клеточного параметра сравнивают с сопоставимым показателем(ями) клеточного параметра для двух или более референсных/контрольных эмбрионов или плюрипотентных клеток с целью получения более подробной информации относительно фенотипа анализируемого эмбриона/клетки. Например, полученные показатели клеточного параметра для эмбриона(ов) или плюрипотентной(ых) клетки (клеток) можно сравнить как с положительным, так и с отрицательным контрольным эмбрионом или плюрипотентной клеткой с целью получения достоверной информации о том, имеет ли эмбрион/клетка целевой фенотип. В качестве примера цитокинез 1 у нормального эмбриона человека, т.е. с хорошей способностью к развитию, занимает примерно 0-30 мин, чаще около 6-20 мин, в среднем примерно 12-14 мин, т.е. около 1, 2, 3, 4 или 5 мин, чаще около 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20 мин, в некоторых случаях 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или вплоть до примерно 30 мин. Более длинный период времени для завершения цитокинеза 1 у оцениваемого эмбриона, по сравнению с таковым, наблюдаемым у нормального референсного эмбриона, является признаком плохой способности к развитию. В качестве второго примера, клеточный цикл 1 у нормального эмбриона, т.е. период от времени оплодотворения до завершения цитокинеза 1, в типичном случае завершается примерно через 20-27 ч, чаще примерно через 25-27 ч, т.е. примерно 15, 16, 17, 18 или 19 ч, чаще около 20, 21, 22, 23 или 24 ч, и чаще около 25, 26 или 27 ч. Клеточный цикл 1, длящийся у оцениваемого эмбриона дольше, по сравнению с таковым, наблюдаемым у нормального референсного эмбриона, является признаком плохой способности к развитию. В качестве третьего примера, завершение цитокинеза 1 и начало цитокинеза 2 у нормального эмбриона человека занимает примерно 8-15 ч, чаще около 9-13 ч, со средним значением примерно 11 + /-2,1 ч; т.е. 6, 7 или 8 ч, чаще около 9, 10, 11, 12, 13, 14 или вплоть до примерно 15 ч. Более длинный или более короткий клеточный цикл 2 у оцениваемого эмбриона, по сравнению с таковым, наблюдаемым у нормального референсного эмбриона, является признаком плохой способности к развитию. В качестве четвертого примера,временной интервал между началом цитокинеза 2 и началом цитокинеза 3, т.е. синхронность второго и третьего митозов, у нормального эмбриона человека обычно составляет примерно 0-5 ч, чаще около 0, 1,2 или 3 ч, со средним временем примерно 1+/-1,6 ч; более длинный интервал между завершением цитокинеза 2 и цитокинеза 3 у оцениваемого эмбриона, по сравнению с таковым, наблюдаемым у нормального референсного эмбриона, является признаком плохой способности к развитию. Наконец, в качестве примера приложения данного воплощения, при использовании в качестве параметров для оценки способности к развитию уровней экспрессии генов, более низкие уровни экспрессии генов кофилина, DIAPH1, ЕСТ 2, MYLC2, DGCR8, Dicer, TARBP2, СРЕВ 1, симплекина, YBX2, ZAR1, CTNNB1, DNMT3B,TERT, YY1, IFGR2, BTF3 и/или NELF, т.е. в 1,5, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 50 или 100 раз более низкие уровни экспрессии, у оцениваемых 2-клеточных эмбрионов, по сравнению с таковыми, наблюдаемыми у нормального референсного 2-клеточного эмбриона, являются признаком плохой способности к развитию,тогда как уровни экспрессии, равные или выше, чем таковые, наблюдаемые у нормального референсного 2-клеточного эмбриона, являются признаком хорошей способности к развитию. Другие примеры могут быть получены из эмпирических данных, например, путем наблюдения одного или нескольких референсных эмбрионов или плюрипотентных клеток параллельно с оцениваемыми эмбрионами/плюрипотентными клетками. Можно использовать любой референсный эмбрион/плюрипотентную клетку, например нормальный референсный образец с хорошей способностью к развитию или референсный образец с отклонением от нормы с плохой способностью к развитию. В некоторых случаях можно использовать более одного референсного образца, например можно использовать одновременно и нормальный референсный образец, и референсный образец с отклонением от нормы. В некоторых вариантах воплощения предпочтительнее применение показателей клеточных параметров, полученных с применением цейтраферной микроскопии или выяснения профиля экспрессии, но не с применением одновременно и цейтраферной микроскопии, и выяснения профиля экспрессии. В других вариантах воплощения предпочтительнее применение показателей клеточных параметров, полученных с применением цейтраферной микроскопии, а также показателей клеточных параметров, полученных с применением выяснения профиля экспрессии. Как обсуждалось выше, для определения способности к развитию эмбриона или плюрипотентной клетки могут быть измерены и использованы один или несколько параметров. В некоторых вариантах воплощения для достижения определения способности к развитию может быть достаточно показателя единичного параметра. В некоторых вариантах воплощения может быть желательно использование показателей более, чем одного параметра, например 2 клеточных параметра, 3 клеточных параметра или 4 или более клеточных параметра. В некоторых воплощениях желательным есть проведение анализа множества параметров, так как проведение анализа множества параметров может обеспечить более высокую чувствительность и типичность. Под чувствительностью понимается доля фактических положительных образцов, которые правильно определены как положительные. Это можно выразить математически как: Таким образом, в способе, где "положительными образцами" есть эмбрионы, обладающие хорошей способностью к развитию, т.е. те, которые разовьются в бластоцисты, а "отрицательными образцами" есть эмбрионы, обладающие плохой способностью к развитию, т.е. те, которые не разовьются в бластоцисты, чувствительность, равная 100%, означает, что испытание распознает, по существу, все эмбрионы,которые разовьются в бластоцисты. В некоторых вариантах воплощения чувствительность анализа может составлять примерно 70, 80, 90, 95, 98% или более, например 100%. Под типичностью понимается доля отрицательных образцов, которые правильно определены как отрицательные. Это можно выразить математически как Таким образом, в способе, где положительными образцами являются эмбрионы, обладающие хорошей способностью к развитию, т.е. те, которые разовьются в бластоцисты, а отрицательными образцами являются эмбрионы, обладающие плохой способностью к развитию, т.е. те, которые не разовьются в бластоцисты, специфичность, равная 100%, означает, что испытание распознает, по существу, все эмбрионы, которые не разовьются в бластоцисты, т.е. претерпят блок развития до достижения стадии бластоцисты. В некоторых вариантах воплощения типичность анализа может составлять примерно 70, 80,90, 95, 98 или более, например 100%. Как демонстрируется в разделе примеров ниже и на фиг. 7, применение трех параметров обеспечивает чувствительность 94% и типичность 93%, с пороговой точкой, равной трем стандартным отклонениям распределения бластоцист. Иначе говоря, способы по изобретению способны правильно определять количество эмбрионов, которые в дальнейшем разовьются в бластоцисты в 94% случаев (чувствительность) и количество эмбрионов, которые в дальнейшем претерпят блок развития до достижения стадии бластоцисты, в 93% случаев (типичность). Кроме того, указанные средние значения и/или пороговые точки могут быть изменены в зависимости от набора данных, используемого для вычисления этих значений, а также от типичных использований. В некоторых вариантах воплощения оценка эмбриона или плюрипотентной клетки включает составление письменных отчетов, которые содержат оценку специалистом исследуемого эмбриона/плюрипотентной клетки, например, "оценку способности к развитию", "оценку хромосомных нарушений" и т.д. Таким образом, рассматриваемый способ может дополнительно включать этап составления или вывода отчета, представляющего результаты такой оценки, при этом данный отчет может быть представлен в электронной форме (например, электронный дисплей компьютерного монитора) или в материальной форме (например, отчет, напечатанный на бумаге или ином материальном носителе)."Отчет" согласно описанию в этом документе является электронным или материальным документом, содержащим элементы отчета, которые сообщают представляющую интерес информацию относительно оценки, полученной с применением способов по изобретению. Указанный отчет может быть полностью или частично составлен с помощью электронных средств. Указанный отчет содержит, по меньшей мере, оценку способности к развитию исследуемого эмбриона или плюрипотентной клетки, оценку вероятности существования хромосомных нарушений и т.д. Указанный отчет может дополнительно содержать один или несколько из пунктов: 1) информацию, касающуюся испытательного оборудования; 2) информацию о поставщике услуги; 3) данные о субъекте исследования; 4) данные об образце; 5) подробный раздел отчета об оценке, сообщающий информацию о том, как была получена оценка, например а) об определяемых показателях клеточных параметров, b) о применяемых референсных значениях, если они использовались; и 6) другие характеристики. Отчет может содержать информацию об испытательном оборудовании, при этом данная информация относится к больнице, клинике или лаборатории, в которых проводили отбор образцов и/или получение данных. Отбор образцов может содержать информацию о том, как получали образец, например как его извлекали у субъекта и/или как его культивировали и т.д. Получение данных может содержать информацию о том, как получали изображения или анализировали профили экспрессии генов. Эта информация может содержать одно или несколько подробных описаний, относящихся, например, к названию и расположению испытательного оборудования, личности технического сотрудника лаборатории, проводившего анализ и/или вводившего входные данные, дате и времени проведения исследования и/или анализа данных, месту хранения образца и/или полученных в результате данных, номеру серии реагентов(например, набора и т.д.), использованных при проведении анализа, и т.п. Разделы отчета с этой информацией в общем случае могут быть заполнены с использованием информации, предоставляемой пользователем. Отчет может содержать информацию о поставщике услуг, который может располагаться вне учреждения здравоохранения, в котором находится пользователь, или в составе учреждения здравоохранения. Примеры такой информации могут содержать название и месторасположение поставщика услуг, название органа надзора и, если это необходимо или желательно, имя сотрудника, который осуществлял приготовление образца и/или получение данных. Разделы отчета с этой информацией в общем случае могут быть заполнены с использованием данных, введенных пользователем, которые могут быть выбраны из заранее заданных вариантов (например, с помощью выпадающего меню). Другая информация о поставщике услуг в отчете может содержать контактную информацию для получения технической информации о результатах и/или об интерпретирующем отчете. Отчет может содержать раздел данных субъекта исследования, заключающий в себе историю болезни субъекта, от которого были получены яйцеклетки или плюрипотентные клетки, возраст пациента,характеристики цикла экстракорпорального оплодотворения (например, частота оплодотворения, уровень фолликулстимулирующего гормона (ФСГ) на 3 день) и, при получении яйцеклеток, - параметры когорты зигот/эмбрионов (например, суммарное количество эмбрионов). Эти данные субъекта исследования могут быть использованы для улучшения оценки эмбриона и/или для того, чтобы помочь определить оптимальное количество эмбрионов для переноса. Отчет может также содержать административные данные субъекта (т.е. данные, которые не существенны для оценки способности к развитию), такие как информация для идентификации субъекта (например, имя, дату рождения (DOB) субъекта, пол, почтовый адрес и адрес проживания, номер истории болезни (MRN), номер палаты и/или кровати в учреждении здравоохранения), информацию о страховании и т.п.), имя лечащего врача субъекта или другого работника здравоохранения, заказавшего проведение оценки способности к развитию, и, если это не был врач, заказавший исследование, имя штатного врача, ответственного за обслуживание субъекта (например, основного лечащего врача). Отчет может содержать раздел, посвященный данным образца, в котором может быть представлена информация об анализируемом при оценке биологическом образце, такая как тип образца (эмбрион или плюрипотентная клетка, и тип плюрипотентной клетки), условия работы с образцом (например, температура хранения, протоколы приготовления) и дата и время получения. Разделы отчета с этой информацией в общем случае могут быть заполнены с использованием данных, введенных пользователем, некоторые из которых могут быть представлены в виде заранее заданных вариантов (например, с помощью выпадающего меню). Отчет может содержать раздел отчета об оценке, который может заключать в себе информацию, относящуюся к тому, как были получены оценки/определения, как описано в этом документе. Интерпретирующий отчет может вмещать, например, цейтраферные изображения оцениваемого эмбриона или плюрипотентной клетки и/или результаты анализа экспрессии генов. Оценочная часть отчета может также необязательно содержать раздел рекомендаций. Например, в случае, если результаты свидетельствуют о хорошей способности эмбриона к развитию, рекомендации могут содержать совет во время лечения бесплодия трансплантировать в матку ограниченное количество эмбрионов, как рекомендуют специалисты в данной области. Совершенно ясно, что отчеты могут содержать дополнительные элементы или измененные элементы. Например, если отчет электронный, то он может содержать гиперссылки, указывающие на внутренние и внешние базы данных, в которых представлена более подробная информация о выбранных элементах отчета. Например, элемент отчета с данными пациента может содержать гиперссылку на электронную карту больного или на сайт, на котором можно получить доступ к такой карте больного, при этом карта больного хранится в конфиденциальной базе данных. Данный последний вариант воплощения может представлять интерес для больничных и клинических систем. Если отчет представлен в электронной форме, его записывают на подходящий физический носитель, такой как машиночитаемый носитель, например, в память компьютера, на ZIP-диск, CD, DVD и т.д. Совершенно ясно, что отчет может содержать все или некоторые из перечисленных выше элементов, при условии, что отчет в общем случае содержит, по меньшей мере, элементы, достаточные для обеспечения аналитических данных, необходимых пользователю (например, оценку способности к развитию). Полезность. Как обсуждалось выше, способы по изобретению могут применяться для оценки эмбрионов или плюрипотентных клеток с целью определения их способности к развитию. Определение способности к развитию может применяться для принятия решений и/или действий в клинической практике. Например,для повышения частот возникновения беременности, клиницисты часто переносят в организм пациентки множество эмбрионов, что потенциально может привести к многоплодной беременности, что, в свою очередь, создает риски для здоровья как матери, так и плодов. При применении результатов, полученных с помощью способов по изобретению, способность к развитию эмбрионов, предназначенных для перено- 17025172 са с развитием в плод, определяют до трансплантации, что позволяет практикующему врачу принять решение, сколько эмбрионов переносить с таким расчетом, чтобы максимизировать шанс на успех с полностью доношенной беременностью, при этом минимизировав риск. Оценки, произведенные с применением следующих способов по изобретению, могут также найти применение для ранжирования эмбрионов или плюрипотентных клеток в группе эмбрионов или плюрипотентных клеток по их способности к развитию. Например, в некоторых случаях множество эмбрионов могут иметь возможность развиться в бластоцисты, т.е. будут иметь хорошую способность к развитию. Однако некоторые эмбрионы будут обладать большей вероятностью достижения стадии бластоцисты или давать бластоцисту более высокого качества, чем другие, т.е. они будут обладать лучшей способностью к развитию, чем другие эмбрионы. В таких случаях способы по изобретению можно применять для ранжирования эмбрионов в группе. В таких способах один или несколько клеточных параметров для каждого эмбриона/плюрипотентной клетки измеряют с получением показателя клеточного параметра для каждого эмбриона/плюрипотентной клетки. Один или несколько показателей клеточного параметра для каждого из эмбрионов или плюрипотентных клеток после этого используют с целью определения способности к развитию эмбрионов или плюрипотентных клеток относительно друг друга. В некоторых вариантах воплощения показатели клеточного параметра для каждого из эмбрионов или плюрипотентных клеток применяют путем их сравнения непосредственно друг с другом с целью определения способности к развитию эмбрионов или плюрипотентных клеток. В некоторых вариантах воплощения показатели клеточных параметров для каждого из эмбрионов или плюрипотентных клеток используют путем сравнения показателей клеточных параметров с показателями клеточных параметров для референсного эмбриона/плюрипотентной клетки с целью определения способности к развитию для каждого эмбриона/плюрипотентной клетки, и потом сравнивая определенные способности к развитию для каждого эмбриона/плюрипотентной клетки с целью определения способности к развитию эмбрионов или плюрипотентных клеток относительно друг друга. Таким образом, практикующий врач, оценивающий, например,множество зигот/эмбрионов, может выбрать для переноса только эмбрионы с наилучшим качеством, т.е. те из них, которые обладают наилучшей способностью к развитию, так, чтобы максимизировать шанс на успех с полностью доношенной беременностью, при этом минимизировав риск. Оценки, полученные с применением следующих способов по изобретению, также могут найти применение для определения способности к развитию яйцеклеток, которые созрели in vitro, и стволовых клеток, которые культивируют in vitro. Информация о способности к развитию яйцеклеток, полученная способами по изобретению, может служить руководством для выбора практикующим врачом яйцеклетки для оплодотворения, что приведет к более высокой вероятности успешного получения бластоцист из таких яйцеклеток. Точно так же, информация о способности к развитию стволовых клеток может помочь практикующему врачу сделать выбор стволовых клеток для применения в ходе процедур, например, для восстановления или замещения ткани in vivo у нуждающегося в этом субъекта. Реагенты, устройства и наборы. Также предложены реагенты, устройства и их наборы для применения в практике одного или нескольких из описанных выше способов. Указанные реагенты, устройства и наборы могут существенно варьировать. Представляющие интерес реагенты и устройства содержат те, которые упомянуты выше в связи со способами измерения любого из вышеуказанных клеточных параметров, при этом такие реагенты могут содержать культуральные чашки, культуральную среду, микроскопы, программное обеспечение для получения изображений, программное обеспечение для анализа изображений, праймеры в виде нуклеиновых кислот, чипы с маркерами в виде нуклеиновых кислот, антитела, реагенты сигналпродуцирующих систем и т.д., в зависимости от конкретного выполняемого протокола измерения. Например, реагенты могут содержать праймеры для ПЦР, типичные для одного или нескольких генов кофилина, DIAPH1, ЕСТ 2, MYLC2/MYL5, DGCR8, Dicer/DICER1, TARBP2, СРЕВ 1, симплекина/SYMPK,YBX2, ZAR1, CTNNB1, DNMT3B, TERT, YY1, IFGR2/IFNGR2, BTF3 и NELF, как описано выше. Другие примеры реагентов содержат чипы с маркерами, характерные для одного или нескольких целевых генов,или антитела к белкам, кодируемым этими целевыми генами. В дополнение к вышеуказанным компонентам, рассматриваемые наборы будут дополнительно содержать инструкции для практического применения рассматриваемых способов. Эти инструкции могут присутствовать в рассматриваемых наборах во множестве форм, одна или несколько из которых могут находиться в наборе. Одной из форм, в которой могут находиться эти инструкции, это информация в печатном виде на подходящем носителе или основе, например лист или листы бумаги, на которых напечатана информация, на упаковке набора, на листовке-вкладыше в упаковке и т.д. Другим способом может быть использование машиночитаемых носителей, например, дискет, CD и т.д., на которые была записана информация. Еще одним способом, который может применяться, есть адрес веб-сайта, который можно использовать посредством Интернета для доступа к информации на удаленном веб-сайте. Любые доступные способы могут применяться в наборах. Автоматизированная визуализация клеток с применением комплекта микроскопов. Некоторые из описанных выше способов требуют возможности наблюдать за развитием эмбриона и стволовой клетки посредством цейтраферной съемки. Это может быть достигнуто применением системы,состоящей из миниатюрного многоканального комплекта микроскопов, который может поместиться внутри стандартного инкубатора. Это позволяет получать быстро и одновременно изображения множества образцов без физического перемещения чашек. Один из иллюстративных прототипов, показанный на фиг. 20, состоит из 3-канального комплекта микроскопов с темнопольным освещением, хотя могут применяться и другие типы освещения. Под "трехканальным" необходимо понимать, что имеется три независимых микроскопа, дающих изображения трех различных чашек одновременно. Шаговый двигатель используют для регулировки положения фокуса с целью фокусировки или получения трехмерных стеков изображений. Для освещения применяют светодиоды (LEDs) белого света, хотя мы наблюдали,что в случае эмбрионов человека применение светодиодов (LEDs) красного или ближнего инфракрасного (ИК) света может улучшить контрастность между клеточными мембранами и внутриклеточной частью. Эта улучшенная контрастность может быть полезна как при ручном, так и при автоматизированном анализе изображений. Кроме того, смещение в инфракрасную область спектра может снизить фототоксичность по отношению к образцу. Изображения захватывают с применением недорогих веб-камер с высоким разрешением, но могут использоваться и камеры других типов. Как показано на фиг. 22, каждый микроскоп описанной выше прототипной системы используется для получения изображения культуральной чашки, которая может содержать примерно 1-30 эмбрионов. Микроскоп собирает свет от светодиода (LED) белого света, соединенного с теплоотводом, способствующим рассеиванию любой тепловой энергии, образованной светодиодом (LED), которая очень мала в случае коротких периодов экспозиции. Свет проходит через стандартный темнопольный фильтр для отсечения прямого света, через линзы конденсора и падает на образец, обозначенный "чашка Петри", который представляет собой культуральную чашку, содержащую эмбрионы для культивирования и исследования. Культуральная чашка может содержать лунки, которые помогают сохранять порядок расположения эмбрионов и не позволяют им перемещаться, когда чашку переносят в инкубатор и из него. Лунки могут располагаться достаточно близко друг к другу, так, чтобы эмбрионы находились в одной и той же капле среды. После этого рассеянный свет проходит через объектив микроскопа, потом через ахроматический дублет и падает на КМОП-матрицу. КМОП-матрица действует как цифровая камера и соединена с компьютером для анализа изображений и слежения, как описано выше. Данную схему легко масштабировать для обеспечения существенно большего количества каналов и различных методик освещения, и она может быть изменена с целью размещения струйных элементов для подачи питательной среды к образцам. Кроме того, схема может быть интегрирована с системой управления с обратной связью, при этом условия культивирования, такие как температура, CO2 (для контроля рН) и среда, оптимизируются в реальном времени на основании обратной связи и исходя из данных визуализации. Данную систему применяли для получения цейтраферного видео развития эмбриона человека, что полезно при определении жизнеспособности эмбрионов для методик экстракорпорального оплодотворения (ЭКО). Другие применения включают терапию с применением стволовых клеток, лекарственный скрининг и тканевую инженерию. В одном из вариантов воплощения устройства освещение обеспечивается с применением белых светодиодов (LED) фирмы Luxeon, смонтированных на алюминиевом теплоотводе и получающих питание от стабилизированного источника тока фирмы BuckPuck. Свет от LED проходит через коллиматорную линзу. После этого коллимированный свет проходит через изготовленный на заказ с помощью лазера фильтр, как показано на фиг. 22, и фокусируется в виде полого конуса света с применением асферической конденсорной линзы. Свет, который напрямую проходит через образец, не воспринимается объективом, тогда как свет, рассеянный образцом, собирается. В одном из вариантов воплощения применяют объективы фирмы Olympus с 20-кратным увеличением, хотя может применяться меньшее увеличение для увеличения поля зрения, или может применяться большее увеличение для повышения разрешающей способности. После этого собранный свет проходит через ахроматический дублет линз (т.е. тубусную линзу) для снижения влияния хроматических и сферических аберраций. В альтернативном варианте собранный свет от формирующего изображение объектива может проходить через еще один объектив, направленный в противоположном направлении, который действует как замена тубусной линзы. В одной конфигурации формирующий изображение объектив может являться объективом с 10-кратным увеличением, в то время как объектив тубусной линзы может являться объективом с 4-кратным увеличением. Сформированное в результате изображение захватывается КМОП-матрицей с разрешением 2 мегапикселя (16001200 пикселей). Также могут применяться различные типы матриц и разрешений. На фиг. 23 А показана фотография многоканального комплекта микроскопов, содержащего 3 идентичных микроскопа. Все оптические компоненты смонтированы в тубусах объектива. При эксплуатации системы комплекта микроскопов чашки Петри расположены на акриловых платформах, которые установлены на ортостатических подставках, наклон которых можно регулировать вручную по 2-м осям, что позволяет регулировать положение плоскости изображения относительно оптической оси. Эти подставки закреплены на основании микроскопа и не перемещаются после первоначального выравнивания. Модули освещения, состоящие из светодиодов, коллиматорные линзы, фильтры и конденсорные линзы смонтированы на подставках, позволяющих осуществлять перемещение вручную в пространстве в трех направлениях для расположения и фокусировки освещающего света. Модули формирования изображения, состоящие из объективов, ахроматических линз и КМОП-матриц, также смонтированы на подставках, позволяющих осуществлять перемещение вручную в пространстве в трех направлениях для расположения поля зрения и фокусировки объективов. Все 3 модуля формирования изображения присоединены к линейным направляющим и поддерживаются одноплечевой консолью, которую приводят в движение с помощью шагового двигателя. Это позволяет производить контролируемое компьютером фокусирование и автоматический захват стеков изображений. Могут применяться другие способы автоматического фокусирования, а также приведения в действие. Комплект микроскопов поместили внутрь стандартного инкубатора, как показано на фиг. 23 В. КМОП-матрицы соединены посредством USB-соединения с общим концентратором, расположенным внутри инкубатора, который выведен к внешнему ПК вместе с другими коммуникационными и электрическими проводами. Все электрические кабели выходят из инкубатора через центр каучуковой пробки,герметично закупоренной силиконовым клеем. Описанный выше комплект микроскопов применяли для регистрации цейтраферных изображений на ранних стадиях развития эмбриона человека и задокументировали рост от стадии зиготы вплоть до стадии бластоцисты. В сумме в четырех независимых экспериментах провели наблюдение за 2 42 эмбрионами. Из этой группы для 100 получали снимки вплоть до 5 или 6 дня; другие были удалены из установок для получения изображений в различных временных точках для анализа экспрессии генов. Снимок экрана программного обеспечения для захвата изображения и изображений эмбрионов показан на фиг. 24. Изображения захватывали каждые 5 мин с примерно 1-секундной экспозицией при низкой освещенности для каждого изображения. Суммарное количество света, полученного образцами, было эквивалентно 24 мин непрерывной экспозиции, подобно суммарному уровню, получаемому при работе с материалом в клинике по проведению ЭКО. 1-секундная длительность световой экспозиции на изображение может быть уменьшена. Перед проведением работ с эмбрионами человека были проведены всесторонние контрольные эксперименты на преимплантационных эмбрионах мыши для того, чтобы убедиться, что как на скорость образования бластоцисты, так и на профили экспрессии генов не влияет процесс визуализации. На фиг. 25 и 26 показаны избранные изображения из цейтраферных последовательностей. Показаны изображения для временных точек: 1, 2,5, 4 и 5,5 дней. В случае последовательности, показанной на фиг. 25, 3 из 9 эмбрионов развились в бластоцисты, а в случае последовательности, показанной на фиг. 26, 5 из 12 эмбрионов развились в бластоцисты. За отдельными эмбрионами наблюдали в течение определенного периода времени, несмотря на то, что их положение в фотографическом поле изменилось, так как эмбрионы претерпели смену среды на 3 день. Применение последовательной смены среды необходимо для удовлетворения специфичных для стадии потребностей развивающихся эмбрионов. Во время смены среды эмбрионы вынимали из установки для получения изображений на несколько минут и перемещали в новые чашки Петри. Для того чтобы проследить за идентичностью каждого из эмбрионов при смене среды, перенос образцов из одной чашки в другую записывали на видео, чтобы убедиться, что эмбрионы не были перепутаны. Этот процесс также применяли во время отбора образцов для анализа экспрессии генов. Проблема слежения за идентичностью эмбрионов может быть облегчена применением лунок, помогающих располагать эмбрионы в определенном порядке. Чашки Петри с микролунками. При перемещении чашек Петри между различными установками иногда эмбрионы могут перемещаться, что делает трудным задачу слежения за идентичностью эмбрионов. Это создает трудности при осуществлении цейтраферной съемки на одной установке, а потом эмбрионы перемещают во вторую установку для выбора эмбрионов и переноса. Один из способов - это культивирование эмбрионов в индивидуальных чашках Петри. Однако в этом случае у каждого эмбриона буде своя капля среды. При типичной методике ЭКО обычно желательно культивировать все полученные эмбрионы пациентки в одной чашке Петри и в одной и той же капле среды. Для решения этой проблемы нами была разработана изготовляемая на заказ чашка Петри с микролунками. Это позволяет предотвратить перемещение эмбрионов и сохранить их расположение на чашке Петри при перемещении в инкубатор или установку для получения изображений и из них. Кроме того, лунки достаточно малы и расположены близко друг к другу, таким образом, что они могут делить между собой одну и ту же каплю среды и могут все одновременно находиться в поле зрения одного и того же микроскопа. Поверхность дна каждой микролунки имеет полировку оптического качества. На фиг. 27 А показан чертеж с размерами для одного воплощения. В этом варианте имеется 25 микролунок, расположенных близко друг к другу в пределах поля зрения размером 1,71,7 мм. На фиг. 27 В приведено трехмерное изображение микролунок, которые углублены в поверхность чашки примерно на 100 мкм. Координатные маркеры, включая буквы, числа и другие маркеры,нанесены на чашку для помощи при идентификации. Содержание всех процитированных справочных материалов целиком включено сюда в качестве ссылок. Примеры Следующие примеры приведены для того, чтобы предоставить специалистам в данной области раскрытие и описание того, как осуществлять и применять настоящее изобретение, и не предназначены для ограничения объема того, что изобретатели рассматривают как свое изобретение, а также они не предназначены для представления точки зрения, что описанные ниже эксперименты являются всеми или единственными проведенными экспериментами. Предприняты усилия для обеспечения точности в отношении используемых числовых значений (например, количеств, температуры и т.д.), но следует учитывать возможность каких-то экспериментальных ошибок и отклонений. Если не указано иначе, части являются частями по массе, молекулярная масса представляет среднюю молекулярную массу, температура приведена в градусах Цельсия, а давление равно или приблизительно равно атмосферному. Источник образцов. Все эмбрионы, применяемые в данном исследовании, были собраны в течение многолетнего периода, оплодотворены и подвергнуты криоконсервации множеством эмбриологов. Среднее количество эмбрионов на пациентку в нашем исследовании составило 3, и были включены все возрастные группы, которые обращаются в обычные центры по проведению ЭКО. Следует отметить, что все эмбрионы, применяемые в данных экспериментах, были образованы в результате ЭКО (в противоположность ИКСИ), т.е. эмбрионы были получены с использованием сперматозоидов, обладающих относительно нормальным функционированием (по меньшей мере, с точки зрения их способности проникать через яйценосный бугорок, блестящую оболочку и оолемму и формировать пронуклеус). Протоколами стимуляции были стандартные длинные протоколы с люпроном (cdc.gov/art). Криоконсервацию избыточных эмбрионов человека проводили путем помещения их в среду для заморозки (1,5 М 1,2-пропандиол + 0,2 М сахароза) на 25 мин при комнатной температуре (22+2 С). После этого эмбрионы замораживали с применением протокола медленной заморозки (от -1 С в течение 7 мин до -6,5 С; выдержать в течение 5 мин; разделить на аликвоты; выдержать в течение 5 мин; со скоростью -0,5 С/мин до -80 С; погрузить в жидкий азот). Комитет. С эмбрионами не была связана какая-либо подлежащая защите информация, касающаяся здоровья. Большую группу криоконсервированных эмбрионов валидировали и сделали следующие наблюдения: 1) эмбрионы демонстрировали хронометраж, свидетельствующий о нормальном развитии эмбриона с точки зрения основных этапов, в том числе: дробление на 2 клетки (происходило в начале 2 дня), начало деградации РНК (происходило в 1-3 дня), дробление на 4 и 8 клеток (происходило в конце 2 дня и на 3 день соответственно), активация генома эмбриона (на 3 день на 8-клеточной стадии) и образование морулы и бластоцисты (происходило на 4 и 5 день соответственно). 2) Эмбрионы демонстрировали эффективность в достижении стадии бластоцисты, типичную для эмбрионов, полученных в клинических условиях. Причиной этого, вероятно, является тот факт, что эмбрионы были подвергнуты криоконсервации на стадии двух пронуклеусов (2PN) и представляли собой набор всех эмбрионов, встречающихся в практике клиник по проведению ЭКО, так как перед криоконсервацией на 1-клеточной стадии никакой "сортировки" на те эмбрионы, которые способны развиваться, и те, которые не способны развиваться, не проводили (подобно тому, как в типичном случае проводят сортировку эмбрионов, подвергаемых криоконсервации на более поздних стадиях развития - на 3 день или на стадии бластоцисты). Таким образом,наши данные подтверждают, что эти эмбрионы проявляют схожие частоты образования бластоцисты, в сравнении с таковыми, наблюдаемыми в типичном случае в клиниках по проведению ЭКО. 3) Предшествующие исследования продемонстрировали, что эмбрионы, которые заморожены на стадии двух пронуклеусов, проявляют схожую способность к развитию, имплантации, клинической беременности и родам, в сравнении со свежеприготовленными эмбрионами. В других исследованиях также показали схожие результаты для замороженных яйцеклеток, и это предполагает, что самые ранние явления в развитии эмбриона человека сохраняют соответствующий хронометраж после криоконсервации. 4) Мы сфокусировались на параметрах, которые не зависели от времени оплодотворения или времени разморозки. Первый параметр, который мы измеряли (длительность первого цитокинеза), имеет малую длительность (примерно 10-15 мин) и не зависит от времени оплодотворения в данном исследовании (его можно измерить независимо для всех эмбрионов, вне зависимости от конечного исхода). Более того, все последующие параметры измеряют относительно этой начальной точки измерений и сравнивают между теми эмбрионами, которые успешно развились до бластоцисты, и теми, которые не смогли развиться. 5) Наконец,следует отметить, что, как известно, свежеприготовленные (не замороженные) эмбрионы с тремя пронуклеусами (3PN) развиваются в тех же временных рамках, что и свежеприготовленные нормальные эмбрионы; мы провели сравнение параметров для свежеприготовленных эмбрионов с тремя пронуклеусами, полученных из Стенфордской клиники по проведению ЭКО, и показали, что они не отличаются от параметров наших криоконсервированных эмбрионов или данных опубликованных отчетов. План эксперимента. В четырех сериях экспериментов прослеживали развитие 242 эмбрионов на пронуклеарной стадии(61, 80, 64 и 37 соответственно). В каждой серии экспериментов зиготы человека размораживали в 1 день и культивировали в небольших группах во множестве чашек. За каждой чашкой наблюдали независимо с применением цейтраферной микроскопии с темнопольным освещением на отдельных установках для получения изображений. Приблизительно с 24-часовыми интервалами одну чашку с эмбрионами вынимали из системы формирования изображений и отбирали либо единичные эмбрионы, либо единичные клетки (бластомеры) для проведения анализа экспрессии генов с высокой производительностью с применением количественной ПЦР в реальном времени. Каждая чашка в типичном случае содержала смесь эмбрионов, которые достигли ожидаемой стадии развития на момент сбора (называемых "нормальными"), и эмбрионов, у которых был блок развития, или задержка на более ранних стадиях развития, или имелась существенная фрагментация (называемых "с отклонением от нормы"). Эмбрионы анализировали либо как единичные интактные эмбрионы, либо дезагрегировали их на единичные бластомеры с последующей ген-специфичной амплификацией РНК. Для подгруппы эмбрионов (100 из 242) получали изображения вплоть до 5 или 6 дня с целью мониторинга образования бластоцисты. Культивирование и микроскопия эмбрионов человека. Эмбрионы человека размораживали путем выемки криофлаконов из резервуара для хранения в жидком азоте и помещения их в условия комнатной температуры. После оттаивания флакона его открывали и проводили визуальный осмотр эмбрионов под препаровальной лупой. После этого содержимое флакона выливали на дно культуральной чашки 3003. Эмбрионы располагались в капле, и проводилась оценка и регистрация выживания каждого эмбриона. При комнатной температуре эмбрионы перенесли в культуральную чашку 3037, содержащую 1,0 М 1,2-пропандиол + 0,2 М сахарозу, на 5 мин, после этого в 0,5 М 1,2-пропандиол + 0,2 М сахарозу на 5 мин и в 0,0 М 1,2-пропандиол + 0,2 М сахарозу на 5 мин. После этого эмбрионы культивировали в среде Квина усовершенствованной для культивирования эмбрионов (CooperSurgical) с добавлением 10% заменителя белков сыворотки Квина (SPS; CooperSurgical) с 1 дня по 3 день и в среде Квина усовершенствованной для культивирования бластоцист (CooperSurgical) с 10% SPS после 3 дня, с применением микрокапель под слоем масла. Во всех экспериментах использовали один и тот же тип среды на стадии дробления, за исключением двух установок во время первого эксперимента, в которых использовали среду Global medium (LifeGlobal, Гилфорд, Коннектикут, США). В этой небольшой подгруппе (из 12 эмбрионов) эмбрионы проявляли несколько меньшую частоту образования бластоцисты (3 из 12, или 25%), но чувствительность и специфичность наших прогностических параметров для этой группы в обоих случаях равнялись 100%. Цейтраферную съемку производили на множестве систем для обеспечения одновременности анализа множества образцов, а также для валидации согласованности данных между различными платформами. Система состояла из 7 отдельных микроскопов: (1) двух модифицированных микроскопов OlympusIX-70/71, оборудованных нагревательными платформами Tokai Hit, светодиодом Luxeon белого света и апертурой для темнопольного освещения; (2) двух модифицированных микроскопов Olympus CKX40/41, оборудованных нагревательными платформами, светодиодом Luxeon белого света и освещением по типу модуляционного контраста Хоффмана (примечание: данные системы применяли только во время первого из 4 экспериментов, после чего было принято решение, что темнопольное освещение предпочтительнее для измерения параметров); и (3) изготовленный на заказ 3-канальный комплект миниатюрных микроскопов, который помещается внутри стандартного инкубатора, оборудованного светодиодомLuxeon белого света и апертурой для темнопольного освещения. Не наблюдалось существенных различий в характеристике развития, частотах образования бластоцисты или профилях экспрессии генов между эмбрионами, культивируемыми в этих различных системах; и действительно, выбранные нами параметры для прогноза образования бластоцисты были стабильны в случае множества систем и экспериментов. Интенсивность света во всех системах была существенно ниже, чем интенсивность света, применяемого в типичном случае в микроскопе, используемом в области вспомогательной репродукции, благодаря низкой мощности светодиода (по сравнению с типичной 100 Вт галогеновой лампой) и высокой чувствительности сенсоров камер. С применением измерителя оптической мощности определили, что мощность типичного микроскопа, используемого в области вспомогательной репродукции (Olympus IX71 модуляционный контраст Хоффмана), при длине волны 473 нм находится в диапазоне примерно от 7 до 10 мВт, в зависимости от увеличения, тогда как измеренные значения мощности наших систем формирования изображений находились от 0,2 до 0,3 мВт при той же длине волны. Изображения захватывали с 1-секундным временем экспозиции каждые 5 мин в течение периода вплоть до 5 или 6 дня, что дало в результате примерно 24 мин непрерывной световой экспозиции. При мощности 0,3 мВт это эквивалентно примерно 1 мин экспозиции в типичном микроскопе, используемом в области вспомогательной репродукции. Для слежения за идентичностью каждого эмбриона во время скоррелированных экспериментов по визуализации и анализу экспрессии генов установили на стереомикроскоп видеокамеру и регистрировали процесс переноса образцов во время смены среды и отбора образцов. Были проведены контрольные эксперименты на преимплантационных эмбрионах мыши (n=56) и небольшой подгруппе эмбрионов человека (n=22), и не наблюдалось значимых различий (р=0,96) в частотах образования бластоцисты между эмбрионами, для которых получали изображения, и контрольными эмбрионами. Высокопроизводительный анализ количественной ОТ-ПЦР. Для проведения анализа количественной ОТ-ПЦР единичного эмбриона или единичного бластоме- 22025172 ра сначала эмбрионы обрабатывали кислым раствором Тайрода для удаления блестящей оболочки. Для отбора единичных бластомеров эмбрионы инкубировали в среде Квина усовершенствованной, без Са 2+ иMg2+, с HEPES (N-2-гидроксиэтилпиперазин-N'-2-этансульфоновая кислота) (CooperSurgical) в течение 5-20 мин при 37 С с тщательным пипетированием. Образцы отбирали непосредственно в 10 мкл реакционного буферного раствора; далее проводили в один этап обратную транскрипцию и реакцию преамплификации как описано выше. Объединенную смесь 20 Х раствора праймеров ABI, изготавливаемых на заказ для анализа количественной ПЦР и маркеров (Applied Biosystems) применяли в качестве гентипичных праймеров во время реакций обратной транскрипции и пре-амплификации. Реакции высокопроизводительной количественной ПЦР проводили с применением чипа Fluidigm Biomark 96.96 DynamicArray, как описано ранее, с применением маркеров ABI, изготавливаемых на заказ для анализа количественной ПЦР. Все образцы наносили в 3 или 4 технических повторах. Анализ данных количественной ОТПЦР проводили с применением qBasePlus (Biogazelle), Microsoft Excel и изготовленного на заказ программного обеспечения. Некоторые гены были исключены из анализа данных либо из-за низкого качества данных (например, плохого качества кривых амплификации при ПЦР), либо из-за стабильно низкой экспрессии или отсутствия экспрессии в оцениваемых эмбрионах. Для анализа возраста бластомеров применяемая панель материнских транскриптов включает DAZL, GDF3, IFITM1, STELLAR, SYCP3,VASA, GDF9, PDCD5, ZAR1 и ZP1, тогда как панель эмбриональных генов включает ATF7IP, CCNA1,EIF1AX, EIF4A3, H2AFZ, HSP70.1, JARID1B, LSM3, РАВРС 1 и SERTAD1. Значения уровней экспрессии каждого гена относительно референсных генов GAPDH и RPLP0, а также относительно среднего значения для гена, вычисляли с помощью методов geNorm и Ct. GAPDH и RPLP0 были выбраны в качестве референсных генов в данном исследовании эмпирически, исходя из значения стабильности гена и коэффициента вариации: 1,18 и 46% для GAPDH и 1,18 и 34% для RPLP0. Они были наиболее стабильны среди 10 генов "домашнего хозяйства", которые были протестированы, и находились в диапазоне, характерном для типичного набора гетерогенных образцов. Во-вторых, мы наблюдали, что в единичных бластомерах, как и ожидалось, количество транскриптов RPLP0 и GAPDH снижалось примерно на значение 1Ct на одно деление в стадиях с 1-клеточной до 8-клеточной, что соответствует ожиданию, что каждая клетка наследует примерно половину пула мРНК при каждом делении дробления, в отсутствие новых транскриптов на этапах до эмбриональной активации генов во время первых 3 дней развития эмбриона человека. В-третьих, мы заметили, что уровень экспрессии этих референсных генов в единичных бластомерах оставался стабильным от 8-клеточной стадии до стадии морулы, после начала эмбриональной активации генов. На уровне интактного эмбриона значения Ct как для RPLP0, так и для GAPDH оставались в основном постоянными вплоть до развития до стадии морулы, с небольшим повышением на стадии бластоцисты, возможно, из-за повышенных уровней транскриптов в большем количестве присутствующих бластомеров. Однако большая часть анализа экспрессии генов, проводимого в данном исследовании, фокусируется на стадиях развития, предшествующих стадии морулы, когда уровень экспрессии референсных генов был крайне стабилен. Автоматизированное слежение за клетками. В нашем алгоритме слежения за клетками применяется вероятностная рамка, основанная на последовательном методе Монте-Карло, которая в области компьютерной визуализации часто называют фильтром частиц. Фильтр частиц следит за развитием с течением времени трех основных переменных: состояние, контроль и показатель. Переменная состояния - это модель эмбриона, представленная как набор эллипсов. Переменная контроля - это входной сигнал, который трансформирует переменную состояния,и она состоит из нашей модели развития и деления клеток. Переменная показателя - это наблюдение состояния, и она состоит из полученных нами путем цейтраферной микроскопии изображений. Наша оценка текущего состояния в каждой временной точке представлена распределением апостериорной вероятности, которое аппроксимировано набором взвешенных образцов, называемых частицами. Мы используем термины частицы и модели эмбрионов как взаимозаменяемые, при этом частица - это одна гипотеза модели эмбриона в данной временной точке. После инициализации фильтр частиц повторяет три этапа: предсказание, измерение и обновление. Предсказание. Клетки представлены в виде эллипсов в двумерном пространстве, и каждая клетка обладает ориентацией и индексом перекрывания. Индекс перекрывания задает относительную высоту клетки. В общем случае имеется два типа поведения, которые мы хотим предсказывать: движение клетки и деление клетки. В случае движения клетки наш контрольный входной сигнал достигает частицы и случайным образом вызывает возмущение каждого параметра каждой клетки, включая положение, ориентацию и длину большой и малой осей. Возмущение случайным образом выбирают из нормального распределения с относительно маленькой дисперсией (5% от начальных значений). В случае деления клеток мы применяем следующий подход. В данной временной точке для каждой частицы мы назначаем 50% вероятность того,что одна из клеток будет делиться. Это значение было выбрано эмпирически и охватывает широкий диапазон возможных делений клеток, при этом сохраняя хорошее покрытие текущей конфигурации. Если предсказано деление, то делящуюся клетку выбирают случайным образом. Когда выбрана клетка, которая будет делиться, мы применяем симметричное деление вдоль большой оси эллипса, с образованием двух дочерних клеток одинакового размера и формы. После этого мы случайным образом нарушаем равновесное состояние каждого значения для дочерних клеток. Наконец, мы случайным образом выбираем индексы перекрывания двух дочерних клеток, при этом сохраняя их общее перекрывание относительно остальной части клеток. После применения контрольного входного сигнала мы конвертируем каждую частицу в модельное изображение. Это достигается путем проекции эллиптической формы каждой клетки на модельное изображение с учетом индекса перекрывания. Соответствующие значения пикселей установлены на бинарное значение 1, и они расширены для отображения толщины мембраны, сопоставимой с данными изображений, полученных при наблюдении. Так как эмбрионы частично прозрачны, и собирается несфокусировнный свет, клеточные мембраны нижней части эмбриона видны только иногда. Соответственно скрытые от взгляда клеточные мембраны добавлены с вероятностью 10%. На практике мы обнаружили,что эти точки невидимых взгляду мембран важны для точного моделирования формы, но важно делать их в достаточной степени редкими, так, чтобы они не напоминали видимый край. Измерение. После генерирования распределения гипотетических моделей соответствующие модельные изображения сравнивают с фактическим микроскопическим изображением. Микроскопическое изображение предварительно обрабатывают для создания бинарного изображения клеточных мембран с применением метода, основанного на главных кривизнах с последующей пороговой бинаризацией. Точность сравнения оценивают с применением размера симметричного усеченного диагонального сопряжения, который потом применяют для установления веса, или вероятности, для каждой частицы. Обновление. После определения весов частицы отбирают пропорционально этим весам с созданием нового набора частиц для следующего повтора. Это смещает распределение частиц в область наибольшей вероятности. Частицы с низкой вероятностью отбрасываются, а частицы с высокой вероятностью умножаются. Повторный отбор частиц проводят с применением метода низкой дисперсии. После моделирования эмбрионов можно провести выделение динамических параметров визуализации, таких как длительность цитокинеза и время между митозами, как описано в основном тексте. Наше программное обеспечение для слежения за клетками ранее выполнялось в среде Matlab, и время вычислений было в диапазоне от пары секунд до половины минуты для каждого изображения, в зависимости от количества частиц. Текущая версия нашего программного обеспечения выполняется в среде С, и время вычислений находится в диапазоне от 1 до 5 с, в зависимости от количества частиц. Пример 1. Анализ с применением визуализации для определения способности эмбрионов к развитию. Способы. Замороженные 1-клеточные эмбрионы человека, также называемые зиготами, разморозили и перенесли в культуру и культивировали в условиях, таких же, как и в методиках ЭКО. Исходя из описания выше, эти эмбрионы, представляют собой наглядный образец типичной популяции после экстракорпорального оплодотворения (ЭКО), так как они были заморожены на стадии двух пронуклеусов и, таким образом, были подвергнуты криоконсервации без проведения отбора. Эта ситуация противоположна той,которая наблюдается в типичном случае при криоконсервации эмбрионов на более поздних стадиях развития, после переноса эмбрионов, отобранных как обладающих наивысшим качеством, во время циклов при свежем приготовлении. В некоторых экспериментах эмбрионы помещали в стандартную культуральную чашку. В других экспериментах эмбрионы культивировали в изготовленной на заказ культуральной чашке с микролунками оптического качества. За растущими эмбрионами, в типичном случае располагавшимися в количестве от 1 до 30 на чашку,наблюдали индивидуально с применением цейтраферной съемки с помощью контролируемого компьютером микроскопа, оборудованного для хранения и анализа цифровых изображений. В одних случаях цейтраферную съемку проводили с применением инвертированных микроскопов, оборудованных нагревательными платформами и инкубационными камерами. В других случаях цейтраферную съемку проводили с применением изготовленных на заказ комплектов миниатюрных микроскопов, которые помещаются внутри стандартного инкубатора, что позволило проводить одновременное культивирование множества чашек с образцами в одном и том же инкубаторе и позволило проводить масштабирование для обеспечения наличия множества каналов без ограничения в отношении минимального временного интервала между последовательными захватами изображения. Использование множества микроскопов также освободило от необходимости перемещать образец, что повысило точность и общую надежность системы. В системе формирования изображений применяли темнопольное освещение, что обеспечило повышение контрастности изображений для последующего выделения признаков и анализа изображений, хотя было замечено, что другие типы освещения были бы достаточными. Отдельные микроскопы в инкубаторе были изолированы друг от друга, обеспечивая каждой культуральной чашке свою собственную контролируемую окружающую среду. Это позволило перемещать чашки в установку для получения изображений и из нее, не нарушая окружающую среду других образцов. Цейтраферные изображения собирали для последующего анализа клеточной морфологии, включая измерение минимум одного из следующих клеточных параметров: длительность первого цитокинеза,временной интервал между первым и вторым клеточными делениями и временной интервал между вторым и третьим клеточными делениями. Изображения, показанные на чертежах, были сделаны со временем экспозиции 1 с каждые 5 мин в течение периода вплоть до 5 или 6 дня. Как более подробно описано далее, первый цитокинез обычно происходит через один день после оплодотворения и длится примерно 14 мин. Первое и второе клеточные деления обычно разделены в среднем примерно 11 часами. Второе и третье клеточные деления обычно разделены в среднем примерно 1 часом. Таким образом, визуализацию проводили в течение периода времени, длившегося примерно 36 ч (плюс-минус несколько часов) после оплодотворения. Результаты. Временную шкалу развития здорового преимплантационного эмбриона человека в культуре документировали в течение шести дней посредством цейтраферной съемки (фиг. 2). Наблюдали, что нормальная зигота человека претерпевает первое деление дробления в начале 2-го дня. Далее эмбрион претерпевает дробление до 4-клеточного и 8-клеточного эмбриона в конце 2-го дня и на 3-й день соответственно перед компактизацией в морулу на 4-й день. Первая морфологически различимая дифференцировка клеток наблюдается на 5-й и 6-й день во время образования бластоцисты, когда тотипотентные бластомеры дифференцируются либо в клетки трофэктодермы, которые дают начало внезародышевым структурам, таким как плацента, либо во внутреннюю клеточную массу, которая развивается в плод invivo и в плюрипотентные эмбриональные стволовые клетки in vitro. После этого мы проследили развитие 242 нормально оплодотворенных эмбрионов в четырех независимых сериях экспериментов и задокументировали распределение нормальных эмбрионов и эмбрионов с блоком развития среди образцов, которые культивировали вплоть до 5 или 6 дня. Из 242 эмбрионов 100 были в культуре вплоть до 5 или 6 дня, и наблюдаемая частота образования бластоцисты была от 33 до 53%, что схоже с частотой образования бластоцисты в типичном случае для клиник по проведению ЭКО (фиг. 3). У остальных эмбрионов был блок развития на различных стадиях развития, наиболее часто между 2-клеточной и 8-клеточной стадиями, и их определили как имеющие отклонения от нормы (фиг. 3). Для выявления количественных параметров изображения, которые прогнозируют успешное развитие эмбриона до стадии бластоцисты, мы выделили и проанализировали несколько параметров из цейтраферных видеозаписей, включая размер бластомеров, толщину блестящей оболочки, степень фрагментации, длину первого клеточного цикла, временные интервалы между несколькими первыми митозами и длительность первого цитокинеза. В ходе анализа видеоизображений, как нормальных с точки зрения развития эмбрионов, так и с отклонением от нормы, мы наблюдали, что многие эмбрионы с блоком развития претерпевали аберрантный цитокинез во время первого клеточного деления. Нормальные эмбрионы завершали цитокинез в течение узкого временного окна 14,3+/-6,0 мин от появления борозд дробления до полного разделения дочерних клеток, плавным и контролируемым образом. Это показано на фиг. 4 вверху. В противоположность этому, эмбрионы с отклонениями от нормы обычно демонстрировали один из двух аберрантных фенотипов цитокинеза. В случае фенотипа с более мягкими нарушениями морфология и механизм цитокинеза внешне выглядели нормально, но время, необходимое для завершения процесса, было больше, в диапазоне от нескольких дополнительных минут до часа (фиг. 4). Иногда эмбрион, который претерпевал немного более длинный цитокинез, тем не менее, развивался до бластоцисты. При фенотипе с более тяжелыми нарушениями морфология и механизм цитокинеза были нарушены. Например, как показано в примере на нижней панели фиг. 4, эмбрионы образовывали одностороннюю борозду дробления и претерпевали необычные серии явлений активного перемещения в мембране клетки в течение нескольких часов, перед тем, как окончательно фрагментироваться на более мелкие компоненты. Также наблюдались другие варианты подобного поведения. Кроме того, эмбрионы с отклонениями от нормы, демонстрирующие эти фенотипы с более тяжелыми нарушениями, часто фрагментировались, и это напрямую доказывает, что фрагментация эмбриона, вероятно, является побочным продуктом аберрантного цитокинеза, что, в свою очередь, приводит к развитию эмбриона с отклонениями от нормы. Подробный анализ результатов для полученных нами изображений показал, что нормальные эмбрионы следовали строгому хронометражу при цитокинезе и митозе во время ранних делений, до начала эмбриональной активации генов (EGA), и это предполагает, что способность эмбриона к развитию предопределяется наследуемыми материнскими программами. В частности, мы заметили три временных интервала, или параметра, в клеточном цикле эмбриона на ранних стадиях, которые жестко регулировались: (1) длительность первого цитокинеза, (2) временной интервал между первым и вторым митозами и(3) синхронность второго и третьего митозов. Взаимосвязь между этими тремя временными интервалами и морфологическими изменениями показана на фиг. 5. В случае нормальных эмбрионов эти параметры,согласно нашим измерениям, составляли примерно 14,3+/-6,0 мин, 11,1+/-2,1 ч и 1,0+/-1,6 ч соответственно (здесь приведены средние значения плюс-минус стандартное отклонение). Мы также провели визуализацию небольшого набора (n=10) свежеприготовленных (без криоконсервации) эмбрионов, которые содержали три пронуклеуса (были триплоидными), начиная с одноклеточной стадии. Было показано, что эмбрионы с тремя пронуклеусами следуют той же временной шкале основных явлений, что и нормальные свежеприготовленные эмбрионы, в течение минимум первых трех клеточных циклов. Изображения для этих эмбрионов были получены перед началом наших основных экспериментов с целью проверки достоверности систем формирования изображений (но по техническим причинам развитие до бластоцисты прослежено не было). Из этой группы свежеприготовленных эмбрионов 3 эмбриона следовали временной шкале явлений, схожей с таковой для подвергнутых криоконсервации на стадии двух пронуклеусов эмбрионов, с длительностью цитокинеза в диапазоне от 15 до 30 мин, временем между первым и вторым митозами в диапазоне от 9,6 до 13,8 ч и временем между вторым и третьим митозами в диапазоне от 0,3 до 1,0 ч. Однако у 7 эмбрионов наблюдали уникальный фенотип цитокинеза, который характеризовался одновременным появлением 3 борозд дробления, немного более длинным цитокинезом и, в конечном счете, разделением на три дочерние клетки (фиг. 4). У данных эмбрионов длительность цитокинеза находилась в диапазоне от 15 до 70 мин (охарактеризованная как время между началом появления борозд дробления и полным разделением на 3 дочерние клетки),время между первым и вторым митозами (от 3-клеточной до 4-клеточной стадии) - в диапазоне от 8,7 до 12,7 ч и время между вторым и третьим митозами (от 4-клеточной до 5-клеточной стадии) - в диапазоне от 0,3 до 2,6 ч. Это наблюдение, вместе с разнообразным диапазоном фенотипов цитокинеза, проявляемых эмбрионами с отклонениями от нормы, предполагает, что у наших подвергнутых криоконсервации эмбрионов не было задержки в развитии, вызванной процессом криоконсервации, и они показывали поведение, схожее с таковым свежеприготовленных зигот, которые разделяются в ходе дробления на 2 бластомера. Касательно эмбрионов, которые достигли стадии бластоцисты, можно было сделать прогноз с чувствительностью и типичностью 94 и 93% соответственно, по признакам длительности первого цитокинеза от 0 до 33 мин, времени между первым и вторым митозами от 7,8 до 14,3 ч и времени между вторым и третьим митозами от 0 до 5,8 ч (фиг. 6). И наоборот, для эмбрионов, которые показывали значения, находящиеся вне одного или нескольких из этих окон, был предсказан блок развития. Все нормальные эмбрионы, которые успешно развились в бластоцисту, проявляли схожие значения всех трех параметров. И наоборот, эмбрионы с отклонениями от нормы проявляли высокую степень изменчивости длин временных периодов, необходимых им для завершения процессов (фиг. 6). Мы наблюдали, что (1) более длинный период времени для завершения первого цитокинеза, чем в норме, является признаком плохой способности к развитию; (2) более длинный или более короткий интервал между первым и вторым клеточными делениями, чем в норме, является признаком плохой способности к развитию; и (3) более длинный интервал между вторым и третьим клеточными делениями, чем в норме, является признаком плохой способности к развитию. Таким образом, эти параметры были прогностическими в отношении способности эмбриона продолжать развитие до образования бластоцисты и качества бластоцисты. Наконец, мы отметили, что в то время, как каждый параметр был автономно прогностическим в отношении способности эмбриона к развитию, применение всех трех параметров обеспечивало чувствительность и типичность, которые в обоих случаях превышали 90%, с пороговой точкой, равной трем стандартным отклонениям. Характеристическая кривая обнаружения (ROC) для данных параметров показана на фиг. 7. Кривая на этом чертеже демонстрирует частоту истинных положительных образцов(чувствительность) относительно частоты ложных положительных образцов (1 - типичность) для различных порогов, выраженных относительно стандартного отклонения. Для построения данной характеристической кривой обнаружения использовали следующие числовые значения: Количество истинных положительных образцов = 34 (правильно предсказано достижение стадии бластоцисты); количество истинных отрицательных образцов = 54 (правильно предсказан блок развития); количество ложных положительных образцов = 4 (неправильно предсказано достижение стадии бластоцисты); количество ложных отрицательных образцов = 2 (неправильно предсказан блок развития). Обсуждение. Наш анализ показывает, что эмбрионы, которые следуют строгому хронометражу митоза и цитокинеза во время первых трех делений дробления, с большей вероятностью как разовьются до стадии бластоцисты, так и образуют бластоцисту высокого качества с лучше развитой внутренней клеточной массой (ВКМ). Динамические морфологические параметры можно применять для отбора оптимальных эмбрионов для переноса или криоконсервации во время процедуры ЭКО. Эти параметры также могут быть применены для выявления различных по качеству бластоцист, что позволяет ранжировать эмбрионы в группе по относительной способности к развитию. Стандартной практикой в клиниках по проведению ЭКО является перенос на 8-клеточной стадии (на 3 день). Некоторые клиники выбирают вариант культивирования эмбрионов до стадии бластоцисты 95 день), так как перенос бластоцист обеспечивает до двух раз более высокую частоту имплантации, по сравнению с переносом на 3 день. Однако во многих клиниках избегают применения длительного культивирования из-за повышенного риска эпигенетических нарушений. Прогностические параметры визуализации можно применять для прогнозирования жизнеспособности эмбрионов до 4-клеточной стадии (на 2 день) и до начала эмбриональной активации генов. Это может позволить переносить или подвергать криоконсервации эмбрионы на целый день раньше, чем это практикуется в типичном случае, и до того как эмбрионы претерпят существенные изменения в их молекулярных программах. Это также может позволить выбирать наиболее оптимальные эмбрионы для ПГД или других типов анализа. Пример 2. Валидация параметров визуализации при помощи анализа экспрессии генов и применение анализа экспрессии генов для определения способности к развитию. Способы. Замороженные 1-клеточные эмбрионы человека, также называемые зиготами, разморозили и перенесли в культуру и культивировали в условиях, таких же, как применяют в методиках ЭКО. В некоторых экспериментах эмбрионы помещали в стандартную культуральную чашку. В других экспериментах эмбрионы культивировали в изготовленной на заказ культуральной чашке с микролунками оптического качества. Эмбрионы вынимали из системы для культивирования и визуализации и собирали в виде либо единичных эмбрионов, либо единичных клеток (бластомеров) для проведения анализа экспрессии генов. Каждая чашка в типичном случае содержала смесь эмбрионов, при этом некоторые из них достигли ожидаемой стадии развития на момент сбора, а у других был блок развития на более ранних стадиях развития или имелась существенная фрагментация. Те эмбрионы, которые достигли ожидаемой стадии развития на момент сбора, классифицировали как "нормальные", тогда как те, у которых был блок развития,считали "имеющими отклонения от нормы". Например, когда чашку с эмбрионами вынимали из установки для получения изображений в конце 2 дня для отбора образцов, любой эмбрион, достигший 4 клеточной стадии или более поздней, был бы определен как нормальный, тогда как те эмбрионы, которые не смогли достигнуть 4-клеточной стадии, были бы помечены как имеющие блок развития. Эти эмбрионы с блоком развития разделили на категории по стадии развития, на которой у них наступил блок,таким образом, что эмбрион, содержащий всего 2 бластомера, в конце 2 дня был бы проанализирован как 2-клеточный эмбрион с блоком развития. Было уделено внимание исключению эмбрионов, которые, согласно морфологическим признакам, были мертвыми и неполными на момент отбора образцов (например, с дегенерировавшими бластомерами). Только эмбрионы, которые выглядели живыми (в случаях как нормальных, так и с блоком развития), применяли для анализа экспрессии генов. Тем не менее, существует вероятность того, что выглядящие как нормальные во время отбора эмбрионы могут в конечном итоге получить блок развития, если им позволить расти до достижения более поздней стадии. Анализ экспрессии генов для эмбрионов, представляющих каждый из этих классов, проводили путем количественной ОТ-ПЦР. С приблизительно 24-часовыми интервалами эмбрионы отбирали из индивидуальных систем формирования изображений для анализа экспрессии генов с применением высокопроизводительной количественной ОТ-ПЦР с множеством реакций для количественного определения вплоть до 96 генов в 96 образцах. Анализ экспрессии генов проводили в системе Fluidigm Biomark, в которой возможно одновременное проведение до 9216 реакций ОТ-ПЦР на основе метода TaqMan с нанолитровыми объемами проб. Результаты. Для разьяснения молекулярных механизмов, которые могут лежать в основе морфологических явлений, выполнили получение профилей скоррелированной экспрессии генов. В каждом образце было проведено количественное определение уровней экспрессии 96 различных генов, принадлежащих к различным категориям, включая гены "домашнего хозяйства", маркеры половых клеток, материнские факторы, маркеры эмбриональной активации генов, маркеры трофобласта, маркеры внутренней клеточной массы, маркеры плюрипотентности, эпигенетические регуляторы, транскрипционные факторы, рецепторы гормонов и другие (табл. 1 на фиг. 19). Два незначительно различающихся, но перекрывающихся,набора генов количественно исследовали в двух различных сериях экспериментов, получив в результате уникальный набор генов, пригодных для диагностирования судьбы эмбриона человека. Уникальные наборы генов были составлены, исходя из данных относительно экспрессии генов у эмбрионов модельных организмов или в эмбриональных стволовых клетках человека, а также на основании наших собственных неопубликованных данных анализа на микрочипах. Состояние экспрессии для этих наборов генов в преимплантационных эмбрионах человека выяснено в данном исследовании впервые. Значения уровней экспрессии каждого гена относительно референсных генов GAPDH и RPLPO, а также относительно среднего значения для гена вычисляли с помощью методов geNorm (El-Toukhy T., etal. (2009) Hum Reprod) и AACt (Vanneste E., et al. (2009) Nat Med 15:577-83). Значения стабильности гена и коэффициента вариации составили 1,18 и 46% для GAPDH и 1,18 и 34% для RPLPO, эти показатели наиболее стабильны среди 10 генов "домашнего хозяйства", которые были протестированы, и находятся в диапазоне, характерном для типичного набора гетерогенных образцов. В единичных бластомерах, как и ожидалось, количество транскриптов RPLPO и GAPDH снижалось примерно на значение 1 Ct на одно деление в стадиях с 1-клеточной до 8-клеточной в результате деления дробления, а также отсутствия эмбриональной активации генов во время первых 3 дней развития эмбриона человека. Уровень экспрессии этих референсных генов в единичных бластомерах оставался стабильным от 8-клеточной стадии до стадии морулы. На уровне интактного эмбриона значения Ct как для RPLPO, так и для GAPDH оставались в основном постоянными вплоть до развития до стадии морулы. Уровень экспрессии RPLPO и GAPDH значимо повышался на стадии бластоцисты, скорее всего, из-за увеличения количества присутствующих бластомеров. Эти отклонения не влияли на пригодность RPLPO и GAPDH в качестве референсных генов. Большая часть анализа экспрессии генов, проведенного в данном исследовании, фокусировалась на стадиях развития, предшествующих стадии морулы, когда уровень экспрессии референсных генов был крайне стабилен. Дифференциальная экспрессия генов у нормальных эмбрионов и эмбрионов с отклонениями от нормы. На фиг. 8 показаны средние уровни экспрессии 52 генов для 6 эмбрионов с отклонениями от нормы (1- и 2-клеточных) и 5 нормальных эмбрионов (1- и 2-клеточных), представленные в виде радиальной диаграммы с логарифмической шкалой. Эмбрионы с блоком развития в общем случае показывали снижение количества мРНК, по сравнению с нормальными эмбрионами, при этом наиболее сильному влиянию подвержены гены, связанные с цитокинезом, процессингом РНК и биогенезом микроРНК. Гены, отмеченные звездочкой, демонстрируют статистически значимое различие (р 0,05) между нормальными эмбрионами и эмбрионами с отклонениями от нормы, согласно критерию Манна-Уитни. Этими 18 генами являются гены кофилина, DIAPH1, ЕСТ 2, MYLC2, DGCR8, Dicer, TARBP2, СРЕВ 1, симплекина,YBX2, ZAR1, CTNNB1, DNMT3B, TERT, YY1, IFGR2, BTF3 и NELF. Каждый ген принадлежит к одной из групп, указанных на чертеже, а именно к группе "цитокинез": ген кофилина, DIAPH1, ЕСТ 2 иMYCL2; "биогенез микроРНК": DGCR8, Dicer и TARBP2; "процессинг РНК": YBX2; "материнские факторы": ZAR1; "гены домашнего хозяйства": CTNNB1; "плюрипотентность": DNMT3B, TERT и YY1; "рецептор": IGFR2; и "транскрипционный фактор": BTF3 и NELF. В большинстве случаев экспрессия этих генов была выше в нормальных 1- и 2-клеточных эмбрионах, чем в 1- и 2-клеточных эмбрионах с блоком развития. Интересно отметить, что некоторые категории генов были более подвержены влиянию в эмбрионах с отклонениями от нормы, чем другие. Например, у эмбрионов с отклонениями от нормы большинство генов "домашнего хозяйства", рецепторов гормонов и материнских факторов не было подвержено существенному изменению их экспрессии, тогда как многие гены, участвующие в цитокинезе и биогенезе микроРНК, демонстрировали существенно сниженную экспрессию. Дополнительно, среди генов, на которые было оказано влияние, некоторые гены демонстрировали намного большее различие между нормальными эмбрионами и эмбрионами с отклонениями от нормы, чем другие. Например, гены, участвующие в путях биогенеза микроРНК, такие как DGCR8, Dicer и TARBP2, проявляли существенно сниженные уровни экспрессии у эмбрионов с отклонениями от нормы. Примечательно, что СРЕВ 1 и ген симплекина, два гена, на которые оказывалось наиболее существенное влияние, принадлежали к одному и тому же молекулярному механизму, который регулирует хранение материнских мРНК и реактивацию посредством изменения длины поли(А)-хвоста транскрипта (Bettegowda, A. et al. (2007) Front. Biosci. 12:3713-3726). Эти данные предполагают, что наличие отклонений от нормы у эмбриона коррелирует с нарушениями у эмбриона программы регуляции мРНК. Установление корреляции цитокинеза с профилями экспрессии генов. Анализ экспрессии генов проводили в отношении генов, кодирующих ключевые компоненты цитокинеза. За идентичностью каждого эмбриона следили при помощи установки на стереомикроскоп видеокамеры и видеорегистрации процесса переноса образцов во время смены среды и отбора образцов. При оценке профилей экспрессии генов для эмбрионов с отклонениями от нормы наблюдали сильную корреляцию между аберрантным цитокинезом и низким уровнем экспрессии гена для ключевых компонентов цитокинеза. Интересно отметить, что профили экспрессии генов для эмбрионов с отклонениями от нормы были столь же разнообразны и изменчивы, как и их аберрантные морфологические фенотипы. Обнаружено, что экспрессия генов цитокинеза варьировала как при сравнении нормальных 2 клеточных эмбрионов и 2-клеточных эмбрионов с отклонениями от нормы (фиг. 9), так и при сравнении 4-клеточных эмбрионов - нормальных и с отклонениями от нормы (фиг. 10). На фиг. 9 и 10 показаны относительные уровни экспрессии генов, которые имеют более высокую экспрессию у нормальных 2 клеточных эмбрионов (фиг. 9) и нормальных 4-клеточных эмбрионов (фиг. 10), скоррелированные с различными фенотипами цитокинеза. Как показано на фиг. 9, 2-клеточный эмбрион с блоком развития, который демонстрирует аномальное активные перемещения в мембране клетки во время первого цитокинеза, имел существенно сниженный уровень экспрессии всех исследованных генов, регулирующих цитокинез. Гены, демонстрирующие различия на фиг. 9, - это гены аниллина, кофилина, DIAPH1, DIAPH2,DNM2, ЕСТ 2, MKLP2, MYCL2 и RhoA. Нормальные уровни экспрессии приведены в столбцах справа и,как можно видеть, они выше в случае каждого гена. На приведенных над диаграммой на фиг. 9 фотографиях, демонстрирующих 2-клеточные эмбрионы с отклонениями от нормы, масштабная метка соответствует 50 мкм. На фиг. 10 показаны результаты для 4-клеточного эмбриона с блоком развития, который претерпел аберрантный цитокинез с односторонней бороздой дробления и существенно увеличенной длительностью цитокинеза во время первого деления, и который продемонстрировал снижение экспрессии генов регуляторов цитокинеза аниллина и ЕСТ 2. Масштабная метка на фиг. 10 также соответствует 50 мкм. Типичные для эмбриональных стадий профили экспрессии генов. На фиг. 11 представлены специфичные для четырех эмбриональных стадий профили (ESSP), которые были идентифицированы в ходе анализа экспрессии генов у 141 нормально развивающегося единичного эмбриона и единичных бластомеров. Гены, попадающие в каждый из четырех ESSP, перечислены в