Конструкция рекомбинантной днк для индуцирования стерильности в трансгенном растении, стерильные трансгенные растения и способы получения гибридных семян
Номер патента: 23885
Опубликовано: 29.07.2016
Авторы: Аллен Эдвардс, Гилбертсон Ларри А., Робертс Джеймс К., Хуанг Шихшиех, Ивашута Сергей И., Хумард Нэнси М.
Формула / Реферат
1. Конструкция рекомбинантной ДНК для индуцирования стерильности в трансгенном растении, которое экспрессирует указанную рекомбинантную конструкцию ДНК, где указанная рекомбинантная конструкция ДНК содержит промотор, функционально связанный с последовательностью ДНК, которая кодирует РНК, содержащую:
(a) по меньшей мере один экзогенный участок распознавания мкРНК, распознаваемый эндогенной зрелой мкРНК, которая специфически экспрессируется либо в мужской репродуктивной ткани, либо в женской репродуктивной ткани указанного трансгенного растения; и
(b) матричную РНК, кодирующую белок, обеспечивающий устойчивость к гербициду, где экспрессия указанной эндогенной зрелой мкРНК супрессирует экспрессию указанного белка либо в мужской репродуктивной ткани, либо женской репродуктивной ткани, таким образом индуцируя стерильность в указанном трансгенном растении при нанесении на него указанного гербицида.
2. Конструкция рекомбинантной ДНК по п.1, где указанная эндогенная зрелая мкРНК специфически экспрессируется в мужской репродуктивной ткани указанного трансгенного растения и указанная стерильность представляет собой мужскую стерильность.
3. Конструкция рекомбинантной ДНК по п.1, где указанная эндогенная зрелая мкРНК специфически экспрессируется в женской репродуктивной ткани указанного трансгенного растения и указанная стерильность представляет собой женскую стерильность.
4. Конструкция рекомбинантной ДНК по п.1, где указанный по меньшей мере один экзогенный участок распознавания мкРНК расположен, по меньшей мере, в пределах одной из следующих областей:
(a) 5'-нетранслируемой области указанной матричной РНК;
(b) 3'-нетранслируемой области указанной матричной РНК и
(c) кодирующей области указанной матричной РНК.
5. Конструкция рекомбинантной ДНК по п.1, где
указанная эндогенная зрелая мкРНК представляет собой по меньшей мере одну мкРНК, выбранную из группы, состоящей из
или где указанная эндогенная зрелая мкРНК имеет последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO:184, 187, 190, 193, 196, 297, 302, 314, 319, 323, 328, 333, 338.
6. Конструкция рекомбинантной ДНК по п.1, где указанный экзогенный участок распознавания мкРНК имеет последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1-19, 20-175, 185, 188, 191, 194, 197, 200-296, 298-301, 303-313, 315-318, 320-322, 324-327, 329-332, 334-337 и 339-343.
7. Конструкция рекомбинантной ДНК по п.1, где указанный промотор представляет собой конститутивный промотор.
8. Конструкция рекомбинантной ДНК по п.1, где указанный белок, обеспечивающий устойчивость к гербициду, выбран из группы, состоящей из 5-енолпирувилшикимат-3-фосфатсинтазы, предпочтительно из штамма Agrobacterium tumefaciens CP4, глифосатоксидоредуктазы, глифосатацетилтрансферазы, глифосатдекарбоксилазы, pat, bar, монооксигеназы дикамбы, дегалогеназы 2,2-дихлорпропионовой кислоты, синтазы ацетогидроксикислот, ацетолактатсинтазы, галоарилнитрилазы, модифицированной карбоксилазы ацетил-кофермента А, дигидроптероатсинтазы, полипептида фотосистемы II массой 32 кДа, антранилатсинтазы, синтетазы дигидродипиколиновой кислоты, фитоендесатуразы, гидроксифенилпируватдиоксигеназы, модифицированной протопорфириногеноксидазы I и арилоксиалканоатдиоксигеназы.
9. Конструкция рекомбинантной ДНК по п.1, где указанный гербицид выбран из группы, состоящей из глифосата, дикамбы, глуфосината, сульфонилкарбамидов, имидазолинонов, бромоксинила, 2,2-дихлорпропионовой кислоты, ингибиторов ацетолактатсинтазы, циклогександиона, арилоксифеноксипропионата, сульфонамидных гербицидов, триазиновых гербицидов, 5-метилтриптофана, аминоэтилцистеина, пиридазиноновых гербицидов, циклопропилизоксазоловых гербицидов, ингибиторов протопорфириногеноксидазы и гербицидов, содержащих арилоксиалканоатную группу.
10. Конструкция рекомбинантной ДНК по п.8, где указанный белок, обеспечивающий устойчивость к гербициду, представляет собой 5-енолпирувилшикимат-3-фосфатсинтазу.
11. Индуцибельно стерильное трансгенное растение, экспрессирующее конструкцию рекомбинатной ДНК по п.1, где стерильность указанного трансгенного растения индуцируется нанесением указанного гербицида на указанное трансгенное растение.
12. Индуцибельно стерильное трансгенное растение по п.11, где указанная эндогенная зрелая мкРНК специфически экспрессируется в мужской репродуктивной ткани указанного трансгенного растения, а указанная стерильность представляет собой мужскую стерильность.
13. Индуцибельно стерильное трансгенное растение по п.11, где указанная эндогенная зрелая мкРНК специфически экспрессируется в женской репродуктивной ткани указанного трансгенного растения, а указанная стерильность представляет собой женскую стерильность.
14. Индуцибельно стерильное трансгенное растение по п.11, выбранное из группы, состоящей из кукурузы, пшеницы, хлопка и сои.
15. Индуцибельно стерильное трансгенное растение по п.12, где указанный белок, обеспечивающий устойчивость к гербициду, представляет собой 5-енолпирувилшикимат-3-фосфатсинтазу.
16. Индуцибельно стерильное трансгенное растение по п.15, где (а) эндогенная зрелая мкРНК представляет собой miR393, и белок, обеспечивающий устойчивость к гербициду, представляет собой 5-енолпирувилшикимат-3-фосфатсинтазу из штамма Agrobacterium tumefaciens СР4, или (b) эндогенная зрелая мкРНК представляет собой miR156j, и белок, обеспечивающий устойчивость к гербициду, представляет собой 5-енолпирувилшикимат-3-фосфатсинтазу из штамма Agrobacterium tumefaciens CP4, или (с) эндогенная зрелая мкРНК представляет собой miR395, и белок, обеспечивающий устойчивость к гербициду, представляет собой 5-енолпирувилшикимат-3-фосфатсинтазу из штамма Agrobacterium tumefaciens CP4.
17. Способ получения гибридных семян из индуцибельно стерильного трансгенного растения по п.11, причем
(а) эндогенная зрелая мкРНК специфически экспрессируется в мужской репродуктивной ткани указанного трансгенного растения, и где мужская стерильность индуцируется в указанном трансгенном растении нанесением указанного гербицида на указанное трансгенное растение, и где полученное обладающее мужской стерильностью трансгенное растение скрещивают с нормально фертильным растением для получения гибридного семени, или
(b) указанная эндогенная зрелая мкРНК специфически экспрессируется в женской репродуктивной ткани указанного трансгенного растения, и где женская стерильность индуцируется в указанном трансгенном растении нанесением указанного гербицида на указанное трансгенное растение, и где полученное обладающее женской стерильностью трансгенное растение скрещивают с нормально фертильным растением для получения гибридного семени.
18. Способ по п.17, где указанное индуцибильно стерильное трансгенное растение и указанное нормально фертильное растение представляют собой (а) растения кукурузы, (b) растения сои, (с) растения хлопка или (d) растения пшеницы.
19. Способ по п.17, где указанная эндогенная зрелая мкРНК специфически экспрессируется в мужской репродуктивной ткани указанного трансгенного растения, и указанный белок, обеспечивающий устойчивость к гербициду, представляет собой 5-енолпирувилшикимат-3-фосфатсинтазу, где мужская стерильность индуцируется в указанном трансгенном растении нанесением глифосата на указанное трансгенное растение, и где полученное обладающее мужской стерильностью трансгенное растение скрещивают с нормально фертильным растением с получением гибридного семени.
20. Способ индуцирования стерильности трансгенного растения, экспрессирующего конструкцию рекомбинантной ДНК по п.1, включающий нанесение гербицида на трансгенное растение, причем указанный гербицид наносят в количестве, достаточном для индуцирования стерильности в указанном трансгенном растении.
21. Способ по п.20, где указанная эндогенная зрелая мкРНК специфически экспрессируется в мужской репродуктивной ткани указанного трансгенного растения, и указанная стерильность представляет собой мужскую стерильность.
22. Обладающее мужской стерильностью трансгенное растение, полученное способом по п.21.
23. Способ по п.20, где указанная эндогенная зрелая мкРНК специфически экспрессируется в женской репродуктивной ткани указанного трансгенного растения, и указанная стерильность представляет собой женскую стерильность.
24. Обладающее женской стерильностью трансгенное растение, полученное способом по п.23.
25. Способ по п.20, где указанный гербицид представляет собой системный гербицид.
26. Способ по п.20, где белок, обеспечивающий устойчивость к гербициду, выбран из группы, состоящей из 5-енолпирувилшикимат-3-фосфатсинтазы, предпочтительно из штамма Agrobacterium tumefaciens CP4, глифосатоксидоредуктазы, глифосатацетилтрансферазы, глифосатдекарбоксилазы, pat, bar, монооксигеназы дикамбы, дегалогеназы 2,2-дихлорпропионовой кислоты, синтазы ацетогидроксикислот, ацетолактатсинтазы, галоарилнитрилазы, модифицированной карбоксилазы ацетилкофермента А, дигидроптероатсинтазы, полипептида фотосистемы II массой 32 кДа, антранилатсинтазы, синтетазы дигидродипиколиновой кислоты, фитоендесатуразы, гидроксифенилпируватдиоксигеназы, модифицированной протопорфириногеноксидазы I и арилоксиалканоатдиоксигеназы.
27. Способ по п.20, где указанное трансгенное растение выбрано из группы, состоящей из кукурузы, сои, хлопка и пшеницы.
Текст
КОНСТРУКЦИЯ РЕКОМБИНАНТНОЙ ДНК ДЛЯ ИНДУЦИРОВАНИЯ СТЕРИЛЬНОСТИ В ТРАНСГЕННОМ РАСТЕНИИ, СТЕРИЛЬНЫЕ ТРАНСГЕННЫЕ РАСТЕНИЯ И СПОСОБЫ ПОЛУЧЕНИЯ ГИБРИДНЫХ СЕМЯН Данное изобретение предусматривает способы получения искусственных гибридных семян. Также раскрываются специфические микро-РНК и сайты узнавания микро-РНК, применимые для того, чтобы сообщить культурному растению (сельскохозяйственной культуре) индуцибельную стерильность, и конструкция рекомбинантной ДНК, включающие такие сайты узнавания экзогенной микро-РНК. Область техники Изобретение относится к способам получения гибридных семян и выведенных стерильных трансгенных растений и молекулярным конструкциям, применимым в таких способах. Предпосылки создания изобретения Гибридные семена, т.е семена, полученные гибридизацией или перекрестным оплодотворением близкородственных растений, можно выращивать в потомство гибридных растений, обладающих "гибридной силой" (гетерозисом), или желаемой (заданной) комбинацией признаков, которых нет ни у одного из родительских растений (которые обычно являются растениями инбредных линий). Гибридные растения могут проявлять более высокие хозяйственно-ценные характеристики, включая оптимизацию растения по размеру, выходу, питательному составу, устойчивости к заболеванию, устойчивости к гербицидам, к стрессу (тепловому, холодовому стрессу, засухе, к воздействию питательных веществ, к солевому стрессу), климатической адаптации и другим желательным признакам. Для высокоэффективного получения гибридных семян требуется, чтобы перекрстное опыление преобладало над самоопылением. Основным ограничением в прогнозировании производства гибридных семян многих сельскохозяйственных культур является отсутствие простых, наджных и экономичных методов создания стерильности (бесплодности) по меньшей мере у одного родителя (в частности, у мужского родителя, получая мужскую стерильность растения, в то же время женские гаметы остаются интактными и доступными для опыления пыльцой подходящего "донора"). Мужская стерильность также годится там, где нежелательно распространение пыльцы, например с домашнего растения к его диким родственникам, или если нежелательно оплодотворение цветов, например декоративных цветов, которые вырождаются после опыления. Мужскую стерильность можно получать, например, физически удаляя органы, содержащие мужские гаметы. У некоторых видов это является эффективным, хотя трудомким и, следовательно, дорогим процессом (например, удаление метлок (соцветий) у кукурузы). У других видов такая физическая кастрация затруднена из-за (соцветий) у кукурузы. У других видов такая физическая кастрация затруднена из-за анатомии растений. Альтернативные методы без применения ручной или физической кастрации могли бы дать значительную экономию. Также были описаны химические гематоциды как способ получения растений, обладающих мужской стерильностью. Обычно такой химический гематоцид является гербицидом, который при нанесении его на растение в соответствующей стадии развития или перед половым созреванием растения способен убивать или эффективно прекращать развитие мужских гамет растения, оставляя женские гаметы растения или, по меньшей мере, их значительную часть, способную подвергаться перекрстному опылению. Например, методом генетической инженерии (рекомбинантной ДНК) создают устойчивость кукурузы к глифозату (патент США 5554798), а применение гербицида глифозата (N-фосфонометилглицина) в качестве гематоцида и трансгенные растения, вегетативные органы и женские гаметы которых толерантны к глифозату, а мужские гаметы чувствительны к глифозату, раскрываются в патенте США 4735649 и в опубликованной международной патентной заявке РСТ WO 99/46396 A2. Однако уровни глифозата,необходимые для гибели большинства мужских гамет, но при этом оставляющие достаточное число женских гамет, вс ещ способных к оплодотворению, часто приводят к остановке роста или к хлорозу растений. Таким образом, основной недостаток применения глифозата в качестве гаметоцида, и это обычно справедливо для большинства химических гематоцидов, это фитотоксические побочные эффекты, являющиеся результатом недостаточной селективности в отношении гамет. Промышленное производство гибридных семян с применением химических гематоцидов ограничено, прежде всего, отсутствием селективности к гаметам в целом. Соединения, обладающие некоторой селективностью при нацеливании гамет в более высокой степени, чем вегетативные ткани, обычно являются неселективными относительно пола разрушаемых гамет. Поэтому методы повышения селективности химического гематоцида были бы в высшей степени желательны. Даже более желательны были бы методы, которые предусматривают первое родительское растение со стерильными мужскими гаметами, а второе родительское растение со стерильными женскими гаметами, тем самым гарантируется, что полученные семена являются результатом гибридизации двух родительских растений, а не результатом самооплодотворения. Это изобретение предусматривает способы получения гибридных семян и, кроме того, предусматривает конструкции рекомбинантной ДНК, хромосомы трансгенных растений, клетки, растения и семена, содержащие такие конструкции, применимые в этих методах. Конструкции рекомбинантной ДНК,хромосомы трансгенных растений, клетки, растения и семена и методы их применения для получения гибридных семян позволяют создать значительно улучшенный способ применения гербицидов в качестве химических гематоцидов. Конструкции рекомбинантной ДНК по изобретению включают экзогенный участок распознавания мкРНК, способствующий тому, чтобы экспрессия матричной РНК, кодирующей белок, придающий толерантность к гербициду, регулировалась микроРНК, эндогенной для растения, в котором транскрибируется конструкция рекомбинантной ДНК. Микро-РНК (микро-РНК) представляют собой РНК, не кодирующие белки, обычно состоят примерно из 19-25 нуклеотидов (обычно около 20-24 нуклеогидов в растениях), которые направляют расще-1 023885 пление в транс-положение целевых транскриптов, негативно регулируя экспрессию генов, участвующих в различных путях регуляции и развития (Bartel (2004) Cell, 116: 281-297). В некоторых случаях микроРНК служат для того, чтобы направлять синхронное процессирование первичных транскриптов siPHK(см. Alien et al. (2005) Cell, 121: 207-221). Некоторые гены микро-РНК (MIR гены) идентифицированы и общедоступны в базе данных("miRBase", доступна он лайн по адресу: microma.sanger.ac.uk/sequences). Заявители раскрывают новые MIR гены, зрелые микро-РНК и сайты распознавания (узнавания) микро-РНК в патентной заявке США 11/303745, поданной 15 декабря 2005 г. Дополнительные MIR гены и зрелые микро-РНК описаны также в опубликованных патентных заявках США 2005/0120415 и 2005/144669 А 1. Сообщалось, что MIR гены встречаются в межгенных областях как в изолированном виде, так и в виде кластеров в геноме, но могут также локализоваться, полностью или частично, внутри нитронов или других генов (как белоккодирующих, так и не кодирующих белок). Последний обзор, посвященный биогенезу микро-РНК, см.Kim (2005) Nature Rev. Mol. Cell Biol, 6: 376-385. Транскрипция MIR генов может происходить, по меньшей мере, в некоторых случаях под стимулирующим контролем собственного промотора MIR гена. Транскрипция MIR, вероятно, в целом опосредуется РНК-полимеразой II (см., например, Aukerman andSakai (2003) Plant Cell, 15: 2730-2741; Parizotto et al. (2004) Genes Dev., 18: 2237-2242) и, следовательно,могут быть восприимчивы к способам сайленсинга генов, которые применяются в других генах, транскрибируемых с помощью полимеразы II. Первичный транскрипт (который является полицистронным) называемый "pri-микро-РНК", молекула-предшественник микро-RNA, которая может быть довольно большой (несколько тысяч нуклеиновых оснований) и содержит одну или более локальных двухцепочечных областей или "шпилек", а также обычный 5' "кэп" и полиаденилированный хвост мРНК. См., например, фиг. 1 в Kim (2005) Nature Rev. Mol. Cell Biol, 6: 376-385. Полагают, что в растительных клетках молекулы предшественника микро-РНК процессируют,главным образом, в ядре. В растениях микро-РНК и siPHK образуются с помощью различных DICERподобных (DCL) ферментов, и, как полагают, в Arabidopsis для образования зрелой микро-РНК требуется нуклеарный DCL фермент (Xie et al. (2004) PLoS Biol., 2: 642-652). Другие обзоры, относящиеся к биогенезу и функции микроРНК, см., например, в Bartel (2004) Cell, 116: 281-297; Murchison and Hannon (2004)Curr. Opin. Cell Biol, 16: 223-229 и Dugas and Bartel (2004) Curr. Opin. Plant Biol, 7: 512-520. Таким образом, микроРНК можно описывать в терминах РНК (например, РНК последовательность зрелой микроРНК или РНК молекулы miRNA предшественника), или в терминах ДНК (например, последовательность ДНК, соответствующая РНК последовательности зрелой микро-РНК, или последовательность ДНК, кодирующая MIR ген или фрагмент MIR гена, или микро-РНК предшественник). По оценкам семейства MIR генов составляют 1%, по меньшей мере, некоторых геномов, и они способны влиять на экспрессию или регулировать экспрессию примерно трети всех генов (см., например,Tomari et al. (2005) Curr. Biol, 15: R61-64; G. Tang (2005) Trends Biochem. Sci., 30: 106- 14; Kim (2005)Nature Rev. Mol. Cell Biol, 6: 376-385). Так как микро-РНК являются важньми регуляторными элементами в эукариотах, включая животных и растения, трансгенная супрессия микро-РНК могла бы, например,привести к пониманию важных биологических процессов или сделала бы возможными манипуляции некоторыми путями обмена (например, регуляция клеточной дифференцировки, пролиферации и апоптоза), применимыми, например, в биотехнологии. См., например, O'Donnell et al. (2005) Nature, 435: 839843; Cai et al. (2005) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 102: 5570-5575; Morris and McManus (2005) Sci. STKE,pe41 (stke.sciencemag.org/cgi/reprint/sigtrans;2005/297/pe41.pdf). Гены микроРНК (MIR) имеют идентифицирующие признаки, включая сохранение среди вида растений, устойчивую структуру "скобку" (сложенную на себя, с конъюгацией "в себе" (foldback, FB и процессирование специфического дуплекса микро-РНК/микро-РНК с помощью Dicer- подобных ферментов (Ambros et al. (2003) RNA, 9: 277-279). Эти признаки используют для идентификации микро-РНК и их соответствующих генов в растениях (Xieet al. (2002) Genes Dev., 16: 1616-1626; Sunkar and Zhu (2004) Plant Cell, 16: 2001-2019). Общедоступные гены микроРНК перечислены (каталогизированы) в miRBase (Griffiths-Jones et al. (2003) Nucleic AcidsRes., 31:439-441). Микро-РНК экспрессируются в очень специфических типах клеток в Arabidopsis (см., например,Kidner and Martienssen (2004) Nature, 428: 81-84, Millar and Gubler (2005) Plant Cell, 17: 705-721). Супрессию можно ограничить стенкой, краем или другой границей между типами клеток, и полагают, что она требуется для соответствующего формирования изображения и описания типа клеток (см., например,Palatnik et al. (2003) Nature, 425: 257-263). Найдено, что супрессия (подавление) маркерного гена GFP,содержащего сайт узнавания эндогенной miR171, ограничивает экспрессию специфическими клетками в трансгенном Arabidopsis (Parizotto et al. (2004) Genes Dev., 18: 2237-2242). Сайты узнавания микро-РНК установлены во всех областях мРНК, включая 5' нетранслируемую область, кодирующую область и 3' нетранслируемую область, указывая, что положение микро-РНК целевого сайта относительно кодирующей последовательности необязательно влияет на супрессию (см., например, Jones-Rhoades and Bartel Зрелые микро-РНК, раскрываемые в данном описании, процессируют при использовании MIR генов, которые обычно относятся к классическим (каноническим) семействам, сохраняющимся (консервативным) в видах растений, состоящих в дальнем родстве. Эти MIR гены и кодируемые ими зрелые микро-РНК применимы также, например, для модификации путей развития (эволюционных путей), например, за счт влияния на дифференцировку или морфогенез клеток (см., например, Palatnik et al. (2003),Nature, 425: 257-263; Mallory et al. (2004) Curr. Biol, 14: 1035-1046), чтобы служить в качестве источников последовательностей для генно-инженерных (искусственных) микро-РНК, которые создают с целью сделать молчащими последовательности, отличные от транскриптов, на которые нацелены природные микро-РНК последовательности (см., например, Parizotto et al. (2004) Genes Dev., 18: 2237-2242; см. также опубликованные патентные заявки США 2004/3411 А 1 и 2005/0120415), и для стабилизации дц(двухцепочечной)РНК. Сам по себе ген MIR (или его нативные 5' или 3' нетранслируемые области, или его нативный промотор, или другие элементы, участвующие в его транскрипции) применим в качестве целевого гена (гена-мишени) для супрессии генов (например, методами по настоящему изобретению),когда желательна супрессия микро-РНК, кодируемой MIR геном. Промоторы MIR генов могут иметь очень специфические паттерны экспрессии (например, специфические в отношении клеток, тканеспецифические или специфические во времени) и поэтому они применимы в рекомбинантных конструкциях для индукции такой специфической транскрипции последовательности ДНК, с которой они функционально связаны. Данное изобретение предусматривает способы получения гибридных семян с применением конструкций рекомбинантной ДНК, включающих сайты узнавания, соответствующие новым зрелым микроРНК, имеющим специфические паттерны экспрессии в сельскохозяйственных культурах (хлебных злаках). Конструкции рекомбинантной ДНК по изобретению транскрибируются в РНК, включающую: (а) по меньшей мере один экзогенный участок распознавания мкРНК, распознаваемый зрелой микро-РНК, которая специфически экспрессируется в репродуктивной ткани растения; и (б) матричную РНК, кодирующую белок, придающий толерантность к гербициду. Эти конструкции применимы для получения и применения трансгенных растительных хромосом, клеток, трансгенных растений и семян трансгенных растений, включая выведенные (индуцируемо) стерильные трансгенные растения, применимые, например, для получения гибридных семян. Сущность изобретения В одном аспекте данное изобретение предусматривает способ получения искусственных гибридных семян, включающий следующие стадии: (а) предоставление (создание) индуцибельно стерильного,трансгенного первого растения, содержащего в свом геноме конструкцию рекомбинантной ДНК, которая транскрибируется в РНК, включающую: (i) по меньшей мере один экзогенный участок распознавания мкРНК, распознаваемый зрелой микро-РНК, которая специфически экспрессируется в репродуктивной ткани первого родительского растения; и (ii) первую матричную РНК, кодирующую белок, придающий толерантность к гербициду, причм зрелая микро-РНК специфически подавляет экспрессию белка в репродуктивной ткани, а стерильность первого родительского растения индуцируется нанесением первого гербицида на первое родительское растение; (б) скрещивание первого родительского растения со вторым родительским растением в условиях, в которых стерильность индуцирована в первом родительском растении, при этом получают искусственные гибридные семена. В другом аспекте данное изобретение предусматривает способ получения гибридных семян, включающий стадии: (а) предоставления (создания) первого родительского растения, включающего трансгенное растение, выращенное из клетки первого трансгенного растения, содержащей в свом геноме первую конструкцию рекомбинантной ДНК, которая транскрибируется в РНК, включающую: (i) по меньшей мере один экзогенный участок распознавания мкРНК, распознаваемый первой зрелой микро-РНК, и (ii) первую матричную РНК, кодирующую белок, придающий толерантность к первому гербициду, причм первая зрелая микро-РНК специфически экспрессируется в мужской репродуктивной ткани первого родительского растения, тем самым специфически подавляя экспрессию белка в мужской репродуктивной ткани, а стерильность мужских гамет (мужская стерильность) первого родительского растения индуцируется нанесением первого гербицида на первое родительское растение; (б) предоставления второго родительского растения, включающего трансгенное растение, выращенное из клетки второго трансгенного растения, содержащей в свом геноме вторую конструкцию рекомбинантной ДНК, которая транскрибируется в РНК, включающую: (i) по меньшей мере один экзогенный участок распознавания мкРНК, распознаваемый второй зрелой микро-РНК, и (ii) вторую матричную РНК, кодирующую белок, придающий толерантность ко второму гербициду, причм вторая зрелая микро-РНК специфически экспрессируется в женской репродуктивной ткани второго родительского растения, тем самым специфически подавляя экспрессию белка в женской репродуктивной ткани, а стерильность женских гамет (женская стерильность) второго родительского растения индуцируется нанесением второго гербицида на второе родительское растение; (в) нанесения первого гербицида и второго гербицида на родительские растения, тем самым индуцируется мужская стерильность в первом растении и женская стерильность во втором родительском растении; (г) скрещивания первого и второго родительских растений, отличающегося тем, что семяпочка первого родительского растения опыляется пыльцой второго родительского растения, при этом получа-3 023885 ют гибридные семена. В независимом аспекте данное изобретение предусматривает индуцибельно стерильное трансгенное растение, содержащее в свом геноме конструкцию рекомбинантной ДНК, которая транскрибируется в РНК, включающую: (а) по меньшей мере один экзогенный участок распознавания мкРНК, распознаваемый зрелой микро-РНК, которая специфически экспрессируется в репродуктивной ткани растения; и(б) матричную РНК, кодирующую белок, придающий толерантность к гербициду; причм зрелая микроРНК специфически подавляет экспрессию белка в репродуктивной ткани, а стерильность трансгенного растения индуцируется нанесением гербицида на первое растение. Ещ в одном аспекте данное изобретение предусматривает конструкцию рекомбинантной ДНК, которая транскрибируется в РНК, включающую: (а) по меньшей мере один экзогенный участок распознавания мкРНК, распознаваемый зрелой микро-РНК, которая специфически экспрессируется в репродуктивной ткани растения; и (б) матричную РНК, кодирующую белок, придающий толерантность к гербициду. Другие конкретные варианты изобретения раскрываются в нижеприведнном подробном описании. Краткое описание фигур На фиг. 1 А схематически изображены неограничивающие конструкции рекомбинантной ДНК по изобретению, описанные в примере 1. Для применения в опосредуемой Agrobacterium трансформации растительных клеток в каждую конструкцию обычно включают по меньшей мере одну границу Т-ДНК. Эти конструкции включают промоторный элемент ("pro"), интрон, фланкированный с одной или с обеих сторон не кодирующей белок ДНК, оптимальным терминаторным элементом ("ter"), по меньшей мере один элемент супрессии первого гена ("GSE" или "GSE1") для супрессии по меньшей мере одного первого целевого гена (гена-мишени) и, необязательно, может включать по меньшей мере один элемент супрессии второго гена ("GSE2") для супрессии по меньшей мере одного второго целевого гена, по меньшей мере один элемент экспрессии гена ("GEE") для экспрессии по меньшей мере одного представляющего интерес гена или обоих представляющих интерес генов. В вариантах изобретения, содержащих элемент экспрессии гена, этот элемент экспрессии гена может прилегать (извне) к интрону. В одной модификации этого варианта изобретения (не показана) элемент супрессии гена (встроенный в интрон,фланкированный с одной или с обеих сторон не кодирующей белок ДНК) расположен 3' к терминатору. В других конструкциях по изобретению (не показаны) элемент супрессии гена (не встроенный в интрон) расположен 3' к терминатору (см. пример 22). На фиг. 1 В схематически представлены примеры конструкций рекомбинантной ДНК, отличные от конструкций рекомбинантной ДНК по настоящему изобретению. Эти конструкции могут содержать элемент супрессии гена, который прилегает к интрону или расположен между двумя отдельными нитронами (другими словами, не встроен в единственный интрон),или может содержать элемент экспрессии гена, включающий элемент супрессии гена, встроенный в интрон, фланкированный с обеих сторон кодирующей белок ДНК (например, кодирующие белок экзоны,которые составляют элемент экспрессии гена). На фиг. 2 изображены различные неограничивающие примеры элементов экспрессии гена и транскрибируемых экзогенных ДНК, применимые в конструкциях рекомбинантной ДНК по изобретению,описанные в примере 1. Если они показаны в виде одноцепочечных транскриптов (фиг. 2 А-2 Е), то эти примеры традиционно изображают направление транскрипции 5' к 3' (слева направо), причм стрелками показана антисмысловая последовательность (стрелки указывают налево) или смысловая последовательность (стрелки указывают направо). Если они изображены в виде двухцепочечных (антипараллельных) транскриптов (фиг. 2F и 2G), то показано 5' и 3' направления транскрипции. Сплошными, пунктирными и точечными линиями показаны последовательности, которые нацелены на различные целевые гены. Эти элементы супрессии генов и транскрибируемые экзогенные ДНК могут включать ДНК, которая включает по меньшей мере один антисмысловой сегмент ДНК, который является антисмысловым по меньшей мере к одному сегменту по меньшей мере одного первого целевого гена, или ДНК, которая включает множественные копии по меньшей мере одного антисмыслового сегмента ДНК, который является антисмысловым по меньшей мере к одному сегменту по меньшей мере одного первого целевого гена (фиг. 2 А); ДНК, которая включает по меньшей мере один смысловой сегмент ДНК, который является по меньшей мере одним сегментом по меньшей мере одного первого целевого гена, или ДНК, которая включает множественные копии по меньшей мере одного смыслового сегмента ДНК, который является по меньшей мере одним сегментом по меньшей мере одного первого целевого гена (фиг. 2 В); ДНК, которая транскрибируется в РНК (ДНК, с которой считывается РНК) для супрессии по меньшей мере одного первого целевого гена за счт образования двухцепочечной РНК, и включает по меньшей мере один антисмысловой сегмент ДНК, который является антисмысловым по меньшей мере к одному сегменту по меньшей мере одного первого целевого гена, и по меньшей мере один смысловой сегмент ДНК, который является по меньшей мере одним сегментом по меньшей мере одного первого целевого гена (фиг. 2 С); ДНК, которая транскрибируется в РНК (ДНК, с которой считывается РНК) для супрессии по меньшей мере одного первого целевого гена за счт образования единичной двухнитевой (двухцепочечной) РНК и включает множественные серийные антисмысловые сегменты ДНК, которые являются антисмысловыми по меньшей мере к одному сегменту по меньшей мере одного первого целевого гена, и множественные серийные смысловые сегменты ДНК, которые являются по меньшей мере одним сегментом по меньшей мере одного первого целевого гена (фиг. 2D); ДНК, которая транскрибируется в РНК (ДНК, с которой считывается РНК) для супрессии по меньшей мере одного первого целевого гена за счт образования множественных двойных нитей (цепей )РНК и включает множественные антисмысловые сегменты ДНК,которые являются антисмысловыми по меньшей мере к одному сегменту по меньшей мере одного первого целевого гена, и множественные сегменты смысловой ДНК, которые являются по меньшей мере одним сегментом по меньшей мере одного первого целевого гена, и при этом указанные множественные антисмысловые сегменты ДНК и множественные смысловые сегменты ДНК расположены последовательно в виде обращенных (инвертированных) повторов (фиг. 2 Е); и ДНК, которая включает нуклеотиды из микро-РНК, или ДНК, которая включает нуклеотиды из siPHK (фиг. 2F). На фиг. 2F изображены различные неограничивающие конфигурации двухнитевых РНК (днРНК), которые могут считываться при использовании вариантов элементов супрессии генов и транскрибируемых экзогенных ДНК, применимых в конструкциях рекомбинантных ДНК по изобретению. Когда образуется такая днРНК, она может подавлять один или более целевых генов и может образовывать единичную двухнитевую РНК или множественные двойные нити РНК, или единичный "стебель" или множество "стеблей" днРНК. Когда образуется множество "стеблей" днРНК, они могут располагаться в конфигурациях "головка молотка" или"клеверный лист". Спейсерная ДНК необязательна и может включать последовательность, с которой считывается РНК (например, большую петлю антисмысловой последовательности целевого гена (генамишени) или аптамера), которая предполагает вторичную структуру или трхмерную конфигурацию,придающую транскрипту заданный признак, такой как повышенная устойчивость, повышенный период полужизни in vivo, или клеточная или тканевая специфичность. На фиг. 3 представлены уровни экспрессии указанных зрелых микро-РНК в различных тканях кукурузы, подробно описанные в примере 2. На фиг. 4 представлен неограничивающий пример транскрибируемой последовательности ДНК,включая сайт узнавания экзогенной микро-РНК, нацеленная на хлоропласт (хлоропласт-направленная)TIC809 с сайтом распознавания микро-РНК (показан жирным шрифтом), расположенным 3' нетранслируемой области (SEQ ID NO. 176), подробно описанная в примере 3. Также показана транслируемая аминокислотная последовательность. На фиг. 5 представлен неограничивающий пример транскрибируемой последовательности ДНК,включая сайт узнавания экзогенной микро-РНК, не нацеленная на хлоропласты TIC809 с сайтом распознавания микро-РНК (показан жирным шрифтом), расположенным 3' нетранслируемой области (SEQ IDNO. 177), подробно описанная в примере 3. Также показана транслируемая аминокислотная последовательность. На фиг. 6 показана сильная и специфическая экспрессия в эндосперме микроРНК miR167g (SEQ IDNO. 178), клонированной при использовании эндосперма кукурузы, как подробно описано в примере 4. Нозерн-блоты РНК из тканей кукурузы (LH59) гибридизовали с меченным на конце 22-мерным зондом ЗНК (LNA, закрытая нуклеиновая кислота) зрелой miR167, специфическим к SEQ ID NO. 178 (фиг. 6 А),или с зондом из 400 п.о., специфическим к гену miR167g (фиг. 6 В). Профиль транскрипции в тканях кукурузы подтверждается результатами Нозерн-блоттинга (фиг. 6 С); транскрипт, соответствующийmiR167g, многокопийно и специфично экспрессируют в ткани эндосперма (копийность классифицируют следующим образом: 5000, высокая копийность, 97 я процентиль; 700-5000, умеренная копийность, 20 я процентиль; 400-700, средняя копийность; 200-400, низкая копийность; 200, не обнаруживается). Избранные сокращения: "DAP" или "DA", дни после опыления; "WK", цельное зерно; "endo" ("эндо"), эндосперм. На фиг. 7 изображена частичная аннотационная (поясняющая) карта, включающая местоположения генов miR167a и miR167g и зрелых микро-РНК, и промоторных элементов (например, ТАТА боксов),геномного кластера, внутри которого были идентифицированы промоторные последовательностиmiR167g, как подробно описано в примере 4. Сокращения: "PBF" проламин-бокс-связывающий фактор;Lys14- и адипат (адипинат)-семиальдегидзависимую активацию и кажущуюся репрессию; "GLN3", элемент, который связывает последовательность активации азот-5' глутаминсинтетазы. На фиг. 8 показаны результаты, подробно описанные в примере 5. На фиг. 8A изображена "скобочная" структура "foldback" (конъюгации "в себе", FB) SEQ ID NO. 186, ожидаемого (прогнозируемого) предшественника микро-РНК для SEQ ID NO. 184; зрелая микро-РНК находится в области оснований 106-126, соответствующей микро-РНК в области оснований 156-175, и также найдено, что другая многокопийная микро-РНК находится в области оснований 100-120 в стебле fold-back (FB, конъюгация в себе) структуры. "Количество" относится к частоте встречаемости малой РНК в отфильтрованном наборе из 381633 возможных последовательностей микро-РНК, которые анализировались. На фиг. 8 В изображн профиль транскрипции в тканях сои для предшественника микро-РНК SEQ ID NO. 186. На фиг. 8 С изображн профиль транскрипции в тканях сои для прогнозируемой мишени, полифенолоксидазы (SEQ IDSEQ ID NO. 187; зрелая микро-РНК находится в области оснований 163-183, а микро-РНК в области оснований 18-63. "Количество" относится к частоте встречаемости малой РНК в отфильтрованном наборе из 381633 возможных последовательностей микро-РНК, которые анализировались. На фиг. 9 В изображн профиль транскрипции в тканях сои для прогнозируемой мишени, полифенолоксидазы (SEQ IDNO. 190; зрелая микро-РНК находится в области оснований 87-107, а микро-РНК в области оснований 150-169. "Количество" относится к частоте встречаемости малой РНК в отфильтрованном наборе из 381633 возможных последовательностей микро-РНК, которые анализировались. На фиг. 11 показаны результаты, подробно описанные в примере 5. На фиг. 11 А изображена FBструктура SEQ ID NO. 195, ожидаемого (прогнозируемого) предшественника микро-РНК для SEQ IDNO. 193 зрелая микро-РНК находится в области оснований 61-81, а микро-РНК в области оснований 109-129. "Количество" относится к частоте встречаемости малой РНК в отфильтрованном наборе из 381633 возможных последовательностей микро-РНК, которые анализировались. На фиг. 12 показаны результаты, подробно описанные в примере 5. На фиг. 12 А (вверху) изображена FB-структура SEQ ID NO. 198, одного из прогнозируемых предшественников микро-РНК для SEQ IDNO. 196; зрелая микро-РНК находится в области оснований 157-178, а микро-РНК в области оснований 72-93. На фиг. 12 А (внизу) изображена FB-структура SEQ ID NO 199, другого из прогнозируемых предшественников микро-РНК для SEQ ID NO. 196; зрелая микро-РНК находится в области оснований 123144, а микро-РНК в области оснований 58-79. "Количество" относится к частоте встречаемости малой РНК в отфильтрованном наборе из 381633 возможных последовательностей микро-РНК, которые анализировались. На фиг. 12 В (вверху) изображн профиль транскрипции в тканях сои для предшественника микро-РНК SEQ ID NO. 198. На фиг. 12 В (внизу) изображн профиль транскрипции в тканях сои для предшественника микро-РНК SEQ ID NO. 199. На фиг. 13 и 14 изображены профили транскрипции последовательностей набора зондов, как было определено, эти зонды включают гены микро-РНК (представленные в табл. 6), они особенно применимы в способах по настоящему изобретению и имеют желаемые паттерны экспрессии, а именно, в женской репродуктивной ткани (фиг. 13) или в мужской репродуктивной ткани (фиг. 14), как подробно описано в примере 6. Подробное описание изобретения Если не указано иначе, все используемые технические и научные термины имеют значение, общепринятое среди специалистов в данной области техники, к которой относится настоящее изобретение. Как правило, применяемая номенклатура и методы получения или лабораторные методы, описанные ниже, общеизвестны и обычно применяются в технике. Для этих процессов применяются традиционные методы, такие как методы, представленные в уровне техники и различных общих ссылках. Если не указано иначе, нуклеотидные последовательности в тексте данного описания представлены так, что они читаются слева направо, в направлении от 5' к 3'. Если термин употребляется в единственном числе, заявители также рассматривают аспекты изобретения, описываемые множественным числом этого термина. Если имеются различия между терминами и определениями, даваемыми в ссылочных материалах, вводимых в качестве ссылок, термины в данной заявке имеют определяемое значение. Другие применяемые технические термины имеют обычное в уровне техники значение, приводимое в качестве примеров в различных технических словарях. Заявители не предполагают ограничивать механизм или способ действия. Ссылка на это датся только в целях иллюстрации. Способ получения семян искусственных гибридов Первый аспект настоящего изобретения предусматривает способ получения искусственных гибридных семян, включающий стадии: (а) предоставления (создания) индуцибельно (выведенного) стерильного, трансгенного первого родительского растения, содержащего в свом геноме конструкцию рекомбинантной ДНК, с которой считывается РНК, включающая: (i) по меньшей мере один сайт узнавания экзогенной микро-РНК, распознаваемый зрелой микро-РНК, которая специфически экспрессируется в репродуктивной ткани первого родительского растения; и (ii) первую матричную РНК, кодирующую белок, придающий толерантность к первому гербициду, причм зрелая микро-РНК специфически подавляет экспрессию белка в репродуктивной ткани, а стерильность первого родительского растения индуцируется нанесением первого гербицида на первое родительское растение; (б) скрещивания первого родительского растения со вторым родительским растением в условиях, в которых стерильность индуцирована в первом родительском растении, при этом получают семена искусственных гибридов. Растения. Способ по данному изобретению включает предоставление индуцибельно (выведенного) стерильного трансгенного растения, пригодного в качестве родительского растения, которое предпочтительно является сельскохозяйственной культурой (хлебным злаком), размножающейся семенами, таким как культуры, описанные ниже под заголовком "Получение и применение трансгенных растительных клеток и трансгенных растений". Неограничивающие примеры предпочтительных растений включают кукурузу, рис, пшеницу, овс, ячмень, рожь, тритикале, просо, сорго, квиною, ширицу, гречиху, кормовые злаки, дернообразующие злаки, люцерну, хлопок, сафлор красильный, подсолнечник, сою, канолу,рапс, лн, арахис, бобы, горох, чечевицу, люцерну, латук, спаржу (аспарагус), артишок, сельдерей, морковь, хрен, капусту, горчицу, брокколи, цветную капусту, брюссельскую капусту, турнепс, кольраби,огурцы, дыни, тыкву обыкновенную, тыкву зимнюю, лук, чеснок, лук-порей, лук-шалот, шнитт-лук, томаты, баклажаны, перец, физалис, свклу, мангольд, шпинат, декоративные растения и лесные деревья. Особенно предпочтительные растения включают кукурузу, рис, пшеницу, хлопок, сафлор, сою, канолу и рапс. В особенно предпочтительном варианте изобретения способ применим для семян искусственных гибридов кукурузы. Стерильность. Под "стерильностью" понимают неспособность успешно продуцировать жизнеспособные посевные семена. Мужская стерильность включает, например, неспособность давать мужские гаметы (например, зрелые всхожие пыльцевые зрна), способные оплодотворять женские гаметы, или неспособность продуцировать мужские репродуктивные структуры (например, пыльники, тычинки, тычиночные нити), необходимые для того, чтобы мужские гаметы были способны нормально оплодотворять женские гаметы. Женская стерильность включает, например, неспособность давать женские гаметы,способные оплодотворяться мужскими гаметами, или неспособность давать полностью развившиеся семена (жизнеспособные или стерильные), или неспособность давать жизнеспособные посевные семена,способные прорастать и развиваться в нормальное растение потомственного поколения. Репродуктивная ткань. В вариантах индуцибельно стерильного трансгенного растения, в которых стерильность представляет собой мужскую стерильность, репродуктивная ткань представляет собой мужскую репродуктивную ткань. Мужская репродуктивная ткань включает любую ткань, необходимую для развития мужских гамет до фертильности (т.е. способную оплодотворять женскую гамету), например, пыльцу или мужские гаметы на любой стадии развития, пыльники, тычинки, тычиночные нити, метлки и другие участки мужских цветков, питательные ткани и другие структуры, связанные со способностью мужского родительского растения оплодотворять женское родительское растение. В вариантах индуцибельно стерильного трансгенного растения, в которых стерильность представляет собой женскую стерильность, репродуктивная ткань представляет собой женскую репродуктивную ткань. Женская репродуктивная ткань включает любую ткань, необходимую для развития женских гамет до фертильности (т.е. способная оплодотворяться мужской гаметой, более предпочтительно способная давать полностью развившееся семя (либо жизнеспособное, либо стерильное), а во многих вариантах изобретения наиболее предпочтительно,имеющая способность давать жизнеспособное посевное семя,способное прорастать и развиваться в нормальное растение потомственного поколения). Женская репродуктивная ткань включает, например, семяпочки или женские гаметы на любой стадии развития, шлк(совокупности столбиков), пестики и другие участки женских цветков, семенные оболочки, плоды, главные оси цветоносного побега или стержни початка или другие питательные, поддерживающие или защитные ткани, и любые другие структуры, связанные со способностью (содействующие способности) женского родительского растения оплодотворяться мужским родительским растением, давать полностью развившееся семя или давать жизнеспособное посевное семя. В некоторых вариантах изобретения стерильность приводит к невозможности оплодотворнной семяпочки развиться в жизнеспособное семя, а"репродуктивная ткань" относится к оплодотворнной семяпочке (например, зигота или зародыш на любой стадии развития, или материнские ткани, необходимые для развития оплодотворнной яйцеклетки в семя, такие как эндосперм или другие питательные ткани). Зрелая микро-РНК. Под "зрелой микро-РНК" понимают малую РНК ("микроРНК"), процессируемую из предшественника микро-РНК (например, при-микро-РНК или пре-микро-РНК), способную распознавать и связываться со специфической последовательностью ("сайтом распознавания (узнавания) микро-РНК) внутри РНК транскрипта и направлять отщепление этого транскрипта. Предпочтительные зрелые микро-РНК включают зрелые микро-РНК, которые специфически экспрессируются в репродуктивной ткани растения. В неограничивающем варианте изобретения зрелая микро-РНК представляет собой микро-РНК сельскохозяйственной культуры, такая как микро-РНК кукурузы или микро-РНК сои. Неограничивающие примеры микро-РНК, применимых в данном изобретении, приводятся в демонстрационных примерах и включают, но без ограничения, микро-РНК, идентифицируемые в табл. 1, 2, 3, 4, 5 и 6, включающих микро-РНК, имеющие последовательности SEQ ID NO. 297, SEQ ID NO. 302, SEQ IDNO. 314, SEQ ID NO. 319, SEQ ID NO. 323, SEQ ID NO. 328, SEQ ID NO. 333 или SEQ ID NO. 338. Сайты распознавания (узнавания) зрелой микро-РНК. С конструкции рекомбинантной ДНК считывается РНК, включающая один или более сайтов узнавания микро-РНК, которые могут представлять собой одну или более копий того же самого сайта узнавания микро-РНК экзогенной микро-РНК или одну или более копий различных сайтов узнавания экзогенной микро-РНК. Сайт узнавания экзогенной микроРНК может локализоваться в любом месте в транскрибированной РНК, причм если отсутствует зрелая микро-РНК, транскрипция дат матричную РНК, транслируемую в заданный белок, устойчивый (толерантный) к гербициду, а если зрелая микро-РНК присутствует, зрелая микро-РНК связывается с РНК транскриптом и подавляет экспрессию матричной РНК. Один или более сайтов узнавания экзогенной микро-РНК может находиться в кодирующих областях или в некодирующих областях матричной РНК. В различных вариантах изобретения сайт узнавания экзогенной микро-РНК расположен по меньшей мере в одной из нижеприведнных областей: (а) области 5' к кодирующей последовательности матричной РНК;(б) области (3') к кодирующей РНК; и (в) в матричной РНК. В предпочтительном варианте изобретения по меньшей мере один сайт узнавания микро-РНК расположен в 3' нетранслируемой области матричной РНК. В различных вариантах изобретения конструкция рекомбинантной ДНК дополнительно включает по меньшей мере один элемент, выбранный из (а) растительного промотора; (б) элемента супрессии генов; (в) интрона; (г) элемента экспрессии гена; (д) ДНК, которая транскрибируется в РНК аптамер, способный связываться с лигандом; (е) ДНК, которая транскрибируется в РНК аптамер, способный связываться с лигандом, и ДНК, которая транскрибируется в регуляторную РНК, способную регулировать экспрессию целевой последовательности, характеризующуюся тем, что регуляция зависит от конформации регуляторной РНК, а на конформацию регуляторной РНК аллостерически влияет состояние связывания РНК аптамера; и (ж) по меньшей мере одной Т- ДНК границы. Эти дополнительные элементы подробно описаны ниже под заголовком "Индуцибельно (выведенные) стерильные трансгенные растения,содержащие конструкцию рекомбинантной ДНК". Любой сайт узнавания микро-РНК, который узнатся зрелой микро-РНК, имеющей заданный паттерн экспрессии (а именно, специфическую экспрессию в мужской или женской репродуктивной ткани),применим в вариантах данного изобретения. Для специфического подавления экспрессии белка в заданной комбинации репродуктивных тканей можно использовать многочисленные сайты узнавания микроРНК. Например, конструкция рекомбинантной ДНК может включать многочисленные сайты узнавания,причм каждый из них узнатся микро-РНК со специфической экспрессией в различной мужской (или женской) репродуктивной ткани (например, микро-РНК, экспрессирующаяся в пыльце, и микро-РНК,экспрессирующаяся в метлке (султане. Селекцию (отбор) подходящей зрелой микро-РНК или соответствующего ей сайта узнавания микро-РНК проводят методами, известными специалистам в данной области техники, включая методы, подробно проиллюстрированные в демонстрационных примерах, приведнных в данном описании. Методы включают клонирование зрелой микро-РНК или предшественников микро-РНК (пре-микро-РНК и при-микро-РНК) при использовании цельного растения, или семян, или отобранных тканей, идентификация микро-РНК с помощью биоинформационного анализа, Саузерн-блоттинг микро-РНК или предшественника микро-РНК,определение паттернов экспрессии промотора микро-РНК и т.д. В неограничивающих вариантах изобретения сайт узнавания микро-РНК распознатся зрелой микро-РНК, образованной с помощью"скобочной" (FB) структуры MIR последовательности, идентифицируемой в табл. 1-6; особенно предпочтительны сайты узнавания микро-РНК, распознаваемые зрелыми микро-РНК, идентифицируемыми в табл. 6. целевого РНК транскрипта и последующая супрессия целевой РНК зависит от спариОтщепление вания оснований между зрелой микро-РНК и сайтом е узнавания родственной микро-РНК. Поэтому по меньшей мере один сайт узнавания экзогенной микро-РНК создают таким образом, чтобы его последовательность имела достаточную комплементарность со зрелой микро-РНК, что способствует узнаванию и связыванию зрелой микро-РНК. В растениях комплементарность последовательности микро-РНК и сайта е узнавания, как правило, является высокой, например абсолютная комплементарность 19, 20 или 21 из 21 нуклеотида (в случае зрелой микро-РНК протяжнностью 21 нуклеотид), т.е. комплементарность примерно 90% или выше. Аналогичная степень комплементарности предпочтительна для сайтов узнавания микро-РНК растений любой длины (например, 20, 21, 22, 23 и 24 нуклеотида). Требования к последовательностям для связывания микро-РНК с сайтом узнавания и методы предсказания связывания микро-РНК с данной последовательностью обсуждаются, например, в Llave et al. (2002) Science, 297: 20532056; Rhoades et al. (2002) Cell, 110: 513-520; Jones-Rhoades and Bartel (2004) Mol. Cell, 14: 787-799;Schwab et al. (2005) Developmental Cell, 8: 517-527 и Xie et al. (2005) Plant Physiol, 138: 2145-2154. При создании (проектировании) сайта узнавания микро-РНК, а также его точного местоположения в матричной РНК или рядом с (непосредственно прилегающий к) матричной РНК также предпочтительно избегать последовательностей с нежелательными признаками, таких последовательностей, кодирующих нежелательные полипептиды, как описано ниже в разделе под заголовком "Целевые гены". При создании(проектировании) матричной РНК в качестве трансгена, который должен экспрессироваться, если нежелательна супрессия с помощью зрелой микро-РНК, избегают случайного введения сайта узнавания микро-РНК. Специфическая экспрессия. Под "специфически экспрессируется в репродуктивной ткани" понимают, что зрелая микро-РНК транскрибируется (считывается) в репродуктивной ткани на уровне, достаточном для того, чтобы микро-РНК могла специфически подавлять (супрессия) экспрессию белка в репродуктивной ткани, то- есть, практически подавлять экспрессию белка, придающего толерантность к гербициду, в репродуктивной ткани, но существенно не подавлять экспрессию того же самого белка в тканях, отличных от репродуктивных тканей. Существенное (практическое) подавление экспрессии включает подавление экспрессии по меньшей мере на 30, по меньшей мере на 50, по меньшей мере на 60,по меньшей мере на 70, по меньшей мере на 80, по меньшей мере на 85, по меньшей мере на 90, по меньшей мере на 95, по меньшей мере на 98% по сравнению с экспрессией в контрольных клетках (а именно, в клетках, которые включают аналогичную конструкцию рекомбинантной ДНК, например конструкцию рекомбинантной ДНК, которая транскрибируется в РНК, включающую ту же самую матричную РНК, кодирующую белок, сообщающий толерантность к гербициду, но не включающую сайт узнавания экзогенной микро-РНК, распознаваемый зрелой микро-РНК, специфически экспрессирующейся в репродуктивной ткани растения). В предпочтительных вариантах изобретения зрелая микро-РНК специфически подавляет экспрессию белка в репродуктивной ткани до степени, достаточной для того, чтобы вызвать стерильность репродуктивной ткани при нанесении (применении) гербицида. Специалист в данной области техники понимает, что в определнных случаях толерантности к гербициду можно адекватно достичь при умеренных или даже низких уровнях экспрессии белка, способствующего толерантности к гербициду. Следовательно, ни то, чтобы зрелая микро-РНК полностью отсутствовала в тканях, отличных от репродуктивной ткани, ни то, чтобы экспрессия белка, сообщающего толерантность к гербициду,полностью подавлялась в репродуктивной ткани, не является необходимым условием. Белок, сообщающий толерантность к гербициду. Можно использовать любой белок, сообщающий растению толерантность (устойчивость) к гербициду. Во многих вариантах изобретения гербицид является системным гербицидом. Неограничивающие примеры гербицидов, применимых в аспектах данного изобретения, включают гербициды глифосат, дикамбу, глюфосинат, сульфонилмочевины, имидазолиноны, бромоксинил, далапон, циклогександионы, ингибиторы протопорфириноген оксидазы и изоксафлутол. Неограничивающие примеры белков, сообщающих толерантность к глифосату, включают 5 енолпирувилшикимат-3-фосфатсинтазу ("EPSPS" или "aroA", см. патенты США 5627061, 5633435,6040497 и 5094945), глифосат оксидоредуктазу ("GOX", см. патент США 5463175), глифосат декарбоксилазу (см. опубликованную патентную заявку США 2004/0177399), глифосат N-ацетилтрансферазу("GAT", см. опубликованную патентную заявку США 2003/0083480) или любой другой ген, который сообщает резистентность к глифосату. Один особенно предпочтительный вариант изобретения представляет собой "epsps-cp4" или 5-енолпирувилшикимат-3-фосфатсинтазу из Agrobacterium tumefaciens штамма СР 4; в патенте США 5633435 раскрываются нуклеотидные последовательности и аминокислотные последовательности epsps-cp4, трансформирующие векторы, содержащие этот ген, и методы получения резистентных к глифосату растений. Неограничивающие примеры белков, сообщающих толерантность к другим гербицидам, включают дикамба-монооксигеназу, которая придает устойчивость к ауксиноподобным гербицидам, таким как дикамба (см. опубликованные патентные заявки США 2003/0115626,2003/0135879); фосфинотрицин ацетилтрансферазу ("pat" или "bar"), которая придат толерантность к фосфинотрицину или глюфосинату (см. патенты США 5646024, 5561236, 5276268, 5637489 и 5273894; см. также европейскую патентную заявку ЕР 275957); дегалогеназу 2,2-дихлорпропионовой кислоты, которая придат толерантность к 2,2-дихлорпропионовой кислоте ("Dalapon", "Далапон") (см. опубликованную патентную заявку РСТ WO 99/27116); синтазу ацетогидроксикислоты или ацетолактатсинтазу, которая придат толерантность к ингибиторам ацетолактатсинтазы, таким как сульфонилмочевина, имидазолинон, тиазолпиримидин, пиримидилоксибензоаты и фталид (см. патенты США 6225105, 5767366, 4761373, 5633437, 6613963, 5013659, 5141870, 5378824 и 5605011); галоарилнитрилазу("Bxn"), которая придат толерантность к бромоксинилу (см. патент США 4810648; см. также опубликованные патентные заявки РСТ WO 89/00193 и WO 87/04181 A1); модифицированную ацетилкофермент А карбоксилазу, которая придат толерантность к циклогександиону ("сетоксидим") и арилоксифеноксипропионату ("галоксифоп") (см. патент США 6414222); дигидроптероатсинтазу ("sul I"),которая придат толерантность к сульфонамидным гербицидам (см. патенты США 5597717,5633444 и 5719046); полипептид 32 кДа фотосистемы II ("psbA"), который придат толерантность к триазиновым гербицидам (see Hirschberg et al. (1983) Science, 222: 1346-1349); антранилатсинтазу, которая придат толерантность к 5-метилтриптофану (см. 4581847); синтазу дигидропиколиновой кислоты ("dap А"), которая придат толерантность к аминоэтилцистеину (см. опубликованную патентную заявку WO 89/11789); фитоин десатуразу ("crtI" которая придат толерантность к гербицидам ряда пиридазинона,таким как норфлуразон (см. опубликованную японскую патентную заявку JP 06343473); гидроксифенилпируватдиоксигеназу, которая придат толерантность к гербицидам-производным циклопропилизоксазола (см. патент США 6268549; также см. опубликованную патентную заявку РСТ WO 96/38567); модифицированную протопорфириноген оксидазу I ("protox"), которая придат устойчивость к ингибиторам протопорфириноген оксидазы (см. патент США 5939602); арилоксиалканоат диоксигеназу ("AAD-1"),которая придат толерантность к гербициду, содержащему арилоксиалканоатный фрагмент (см. опубликованную патентную заявку РСТ WO 05/107437), примеры таких гербицидов включают феноксиауксины(такие как 2,4-D и дихлорпроп), пиридилоксиауксины (такие как флуроксипир и триклопир), арилоксифеноксипропионаты (АОРР), ингибиторы ацетил кофермент-А карбоксилазы (АССазы), (такие как галоксифоп, квизалофоп и диклофоп) и ингибиторы 5-замещнной феноксиацетат протопорфириноген оксидазы IX (такие как пирафлуфен и флумиклорак). Комбинации родительских растений. Способ по изобретению можно осуществлять, используя различные комбинации первых родительских растений и вторых родительских растений. Во многих вариантах этого способа второе родительское растение толерантно к первому гербициду; например, второе ро-9 023885 дительское растение содержит в свом геноме трансген, сообщающий толерантность к первому гербициду. Данное изобретение охватывает варианты способа, отличающиеся тем, что: (а) репродуктивная ткань является мужской репродуктивной тканью, первое родительское растение является растением с индуцибельной мужской стерильностью, а второе родительское растение является растением с нормальной фертильностью; или (б) репродуктивная ткань является мужской репродуктивной тканью, первое родительское растение является растением с индуцибельной мужской стерильностью, а второе родительское растение является растением с женской стерильностью; или (в) репродуктивная ткань является мужской репродуктивной тканью, первое родительское растение является растением с индуцибельной мужской стерильностью, а второе родительское растение является растением с индуцибельной женской стерильностью; или (г) репродуктивная ткань является женской репродуктивной тканью, первое родительское растение является растением с индуцибельной женской стерильностью, а второе родительское растение является растением с нормальной фертильностью; или (д) репродуктивная ткань является женской репродуктивной тканью, первое родительское растение является растением с индуцибельной женской стерильностью, а второе родительское растение является растением с мужской стерильностью; или (е) репродуктивная ткань является женской репродуктивной тканью, первое родительское растение является растением с индуцибельной женской стерильностью, а второе родительское растение является растением с индуцибельной мужской стерильностью. В одном варианте воплощения способа репродуктивная ткань является мужской репродуктивной тканью, первое родительское растение является растением с индуцибельной мужской стерильностью, а второе родительское растение представляет собой растение с индуцибельной женской стерильностью,причм трансгенное второе родительское содержит в свом геноме конструкцию рекомбинантной ДНК, с которой считывается РНК, включающая: (i) по меньшей мере один сайт узнавания экзогенной микроРНК, распознаваемый второй зрелой микро-РНК, которая специфически экспрессируется в женской репродуктивной ткани второго родительского растения, и (ii) вторую матричную РНК, кодирующую второй белок, сообщающий толерантность ко второму гербициду; причм вторая зрелая микро-РНК специфически подавляет (тормозит, супрессирует) экспрессию второго белка в женской репродуктивной ткани, и при этом женская стерильность второго родительского растения индуцируется при нанесении второго гербицида на второе родительское растение. В другом варианте репродуктивная ткань является женской репродуктивной тканью, первое родительское растение является растением с индуцибельной женской стерильностью, а второе родительское растение представляет собой растение с индуцибельной мужской стерильностью, причм трансгенное второе родительское растение содержит в свом геноме конструкцию рекомбинантной ДНК, с которой считывается РНК, включающая: (i) по меньшей мере один сайт узнавания экзогенной микро-РНК, распознаваемый второй зрелой микро-РНК, которая специфически экспрессируется в мужской репродуктивной ткани второго родительского растения, и (ii) вторую матричную РНК, кодирующую второй белок, сообщающий толерантность ко второму гербициду; причм вторая зрелая микро-РНК специфически подавляет (тормозит, супрессирует) экспрессию второго белка в мужской репродуктивной ткани, и при этом мужская стерильность второго родительского растения индуцируется при нанесении второго гербицида на второе родительское растение. В этих вариантах изобретения первая и вторая матричные РНК могут быть идентичными или могут быть различными. В этих вариантах изобретения первый гербицид и второй гербицид могут быть идентичными или могут быть различными. В некоторых случаях по меньшей мере один гербицид из первого гербицида и второго гербицида представляет собой (включает) системный гербицид. В предпочтительных вариантах изобретения по меньшей мере один гербицид из первого гербицида и второго гербицида представляет собой (включает) по меньшей мере один гербицид, выбранный из группы, состоящей из глифосата, дикамбы, глюфосината, сульфонилмочевин, имидазолинонов, бромоксинила, 2,2-дихлорпропионовой кислоты, ингибиторов ацетолактата, циклогександиона, арилоксифеноксипропионата, сульфонамидных гербицидов, триазиновых гербицидов, 5-метилтриптофана, аминоэтилцистеина, гербицидов производных перидазинона,гербицидов производных циклопропилизоксазола, ингибиторов протопорфириноген оксидазы и гербицидов, содержащих в качестве фрагмента арилалкилоксиалканоат. В одном варианте способа первое родительское растение является индуцибельно стерильным трансгенным растением, содержащим в свом геноме конструкцию рекомбинантной ДНК, с которой считывается РНК, включающая: (i) по меньшей мере один сайт узнавания экзогенной микро-РНК, распознаваемый зрелой микро-РНК, которая специфически экспрессируется в мужской репродуктивной ткани растения, и (ii) матричную РНК, кодирующую белок, сообщающий толерантность к гербициду; причм зрелая микро-РНК специфически подавляет (тормозит, супрессирует) экспрессию белка в мужской репродуктивной ткани, и при этом мужская стерильность трансгенного растения индуцируется при нанесении гербицида на растение, а второе родительское растение является растением с нормальной фертильностью. Для индукции мужской стерильности второго родительского растения гербицид, предпочтительно, наносят по схеме, которая приводит к тому, что неспособность первого родительского растения продуцировать мужские гаметы (или мужские репродуктивные структуры), необходимые для нормального опыления (оплодотворения) второго родительского растения. В таких вариантах изобретения второе родительское растение обычно толерантно к тому же гербициду, который используют для индукции мужской стерильности первого родительского растения, и, следовательно, первое и второе родительские растения можно обрабатывать одним и тем же гербицидом предпочтительно одновременно (например,совместно в поле). Скрещивание первого и второго родительских растений дат семена, которые являются результатом опыления первого родительского растения вторым родительским растением. В другом варианте способа первое родительское растение является индуцибельно стерильным трансгенным растением, содержащим в свом геноме конструкцию рекомбинантной ДНК, с которой считывается РНК, включающая: (i) по меньшей мере один сайт узнавания экзогенной микро-РНК, распознаваемый зрелой микро-РНК, которая специфически экспрессируется в женской репродуктивной ткани растения, и (ii) матричную РНК, кодирующую белок, сообщающий толерантность к гербициду; причм зрелая микро-РНК специфически подавляет (тормозит, супрессирует) экспрессию белка в женской репродуктивной ткани или в оплодотворнной женской зародышевой клетке, и при этом женская стерильность трансгенного растения индуцируется при нанесении гербицида на растение, а второе родительское растение является растением с нормальной фертильностью. Для индукции женской стерильности первого родительского растения гербицид предпочтительно наносят по схеме, которая приводит, например, к неспособности первого родительского растения продуцировать женские гаметы, способные оплодотворяться, или к неспособности давать полностью развившиеся семена (либо жизнеспособные, либо стерильные), либо к неспособности жизнеспособных посевных семян прорастать и развиваться в нормальное растение потомственного поколения. В таких вариантах изобретения второе родительское растение обычно толерантно к тому же гербициду, который используют для индукции женской стерильности первого родительского растения, и, следовательно, первое и второе родительские растения можно обрабатывать одним и тем же гербицидом предпочтительно одновременно. Скрещивание первого и второго родительских растений дат семена, которые являются результатом опыления второго родительского растения первым родительским растением. Другой аспект изобретения предусматривает способ получения искусственных гибридных семян,включающий стадии: (а) предоставления (создания) первого растения, являющегося трансгенным растением, выращенным из первой трансгенной растительной клетки (например, из первой трансгенной клетки кукурузы), содержащей в свом геноме конструкцию рекомбинантной ДНК, с которой считывается РНК, включающая: (i) по меньшей мере один сайт узнавания экзогенной микро-РНК, распознаваемый первой зрелой микро-РНК, и (ii) первую матричную РНК, кодирующую белок, придающий толерантность к первому гербициду, причм первая зрелая микро-РНК специфически экспрессируется белка в мужской репродуктивной ткани первого родительского растения, тем самым специфически подавляя экспрессию белка в мужской репродуктивной ткани, а мужская стерильность первого родительского растения индуцируется нанесением первого гербицида на первое родительское растение; (б) предоставления второго родительского растения, являющегося трансгенным растением, выращенным из второй трансгенной растительной клетки (например, из второй трансгенной клетки кукурузы), содержащей в свом геноме конструкцию рекомбинантной ДНК, с которой считывается РНК, включающая: (i) по меньшей мере один сайт узнавания экзогенной микро-РНК, распознаваемый второй зрелой микро-РНК, и (ii) вторую матричную РНК, кодирующую белок, придающий толерантность ко второму гербициду, причм вторая зрелая микро-РНК специфически экспрессируется белка в женской репродуктивной ткани второго родительского растения, тем самым специфически подавляя экспрессию белка в женской репродуктивной ткани, а женская стерильность второго родительского растения индуцируется нанесением второго гербицида на второе родительское растение; (в) нанесения первого гербицида и второго гербицида на родительские растения, тем самым индуцируется мужская стерильность в первом растении и женская стерильность во втором родительском растении; (г) скрещивания первого и второго родительских растений, отличающегося тем, что семяпочки первого родительского растения опыляются пыльцой второго родительского растения, при этом получают искусственные гибридные семена (например, семена искусственной гибридной кукурузы). При практическом применении любого из этих способов для получения гибридных семян термин"выращенный" относится к выращиванию трансгенного растения прямой регенерацией из первой трансгенной растительной клетки или к выращиванию трансгенного растения, потомка регенерированного трансгенного растения. Способы прямой регенерации трансгенного растения из трансгенной растительной клетки или к выращиванию трансгенных растений потомственного поколения (включая потомство растения инбредной линии и потомство растения гибридной линии) общеизвестны в уровне техники и описаны в разделе под заголовком "Получение и применение трансгенных растительных клеток и трансгенных растений". Вторая матричная РНК может быть такой же, как первая матричная РНК, или может отличаться от первой матричной РНК. В различных вариантах изобретения первая матричная РНК и вторая матричная РНК (а) идентичны; или (б) различны и кодируют разные сегменты белка; (в) различны и кодируют сегменты разных белков. В предпочтительных вариантах изобретения первая и вторая матричные РНК (либо одинаковые, либо различные) сообщают толерантность к одному и тому же гербициду, что делает удобным обработку поля смешанных первого и второго родительских растений единственным гербицидом; при необходимости гербицид наносят один или более раз, чтобы вызвать (индуцировать) мужскую стерильность первого родительского растения и женскую стерильность второго родительского растения. В некоторых случаях первая матричная РНК кодирует первый белок, придающий толерантность к гербициду, а вторая матричная РНК кодирует второй, отличный, белок, придающий толерантность к тому же самому гербициду; в неограничивающем примере первый и второй белки выбирают из группы (включающей 5-енолпирувилшикимат-3-фосфатсинтазу,глифосат-ацетилтрансферазу и глифосатдекарбоксилазу), в которой все белки сообщают толерантность к глифосату. В других вариантах изобретения первый и второй родительские растения, оба, содержат в свом геноме ДНК, кодирующую два белка, каждый из которых придат толерантность к одному или к двум гербицидам, это способствует тому, что поле как с первым, так и со вторым родительскими растениями следует обрабатывать двумя гербицидами (одновременно или по отдельности). В различных вариантах способа первый гербицид и второй гербицид (а) идентичны или (б) различны (причм первый и второй родители предпочтительно толерантны как к первому, так и ко второму гербицидам). Применяются такие схемы нанесения гербицидов, при которых достигается индуцируемая (индуцибельная) стерильность предпочтительно без снижения выхода или без других нежелательных результатов. Время нанесения гербицидов регулируют таким образом, чтобы индуцировать стерильность. В аналогичном примере найдено, что в линия трансгенного хлопка (RR1445), содержащая EPSPS под контролем FMV 35S конститутивного промотора, наблюдается высокая экспрессия EPSPS в большинстве вегетативных клеток, но низкая экспрессия EPSPS в некоторых типах мужских репродуктивных тканей(материнские клетки пыльцы, мужские гаметофиты и тапетум); нанесение глифосата после стадии четвртого листа вызывает мужскую стерильность (см. Chen et al. (2006) Plant Biotechnol J., 4: 477-487,опубликовано ранее 7 июня 2006 г., doi:10.1111/j.l467-7652.2006.00203.x). В предпочтительных вариантах изобретения способ применим для получения неприродных (искусственных) гибридных семян сельскохозяйственных растений, размножающихся семенами, таких, которые описаны в разделе под заголовком "Получение и применение трансгенных растительных клеток и трансгенных растений", например, такие как кукуруза, рис, пшеница, овс, ячмень, рожь, тритикале, просо, сорго, квиноя, ширица (амарант), гречиха, кормовые злаки, дернообразующие злаки, люцерна, хлопок, сафлор, подсолнечник, соя, канола, рапс, лн, арахис, бобы, горох, чечевица, латук, спаржа (аспарагус), артишок, сельдерей, морковь, хрен, капуста, горчица, брокколи, цветная капуста, брюссельская капуста, турнепс, кольраби, огурцы, дыни, тыква обыкновенная, тыква зимняя, лук, чеснок, лук-порей, лукшалот, шнитт-лук, томаты, баклажаны, перец, физалис, свкла, мангольд, шпинат, декоративные растения и лесные деревья. В особенно предпочтительном варианте изобретения неприродные (искусственные) гибридные семена представляют собой семена кукурузы. Неприродные (искусственные) гибридные семена, получаемые в результате деятельности человека, включая любой из вариантов способа, конкретно заявляются далее. Трансгенные растения с индуцибельной стерильностью, содержащие конструкцию рекомбинантной ДНК. Независимый аспект данного изобретения включает индуцибельно стерильные трансгенные растения, содержащие в свом геноме конструкцию рекомбинантной ДНК, с которой считывается РНК, включающая: (а) по меньшей мере один сайт узнавания экзогенной микро-РНК, распознаваемый зрелой микро-РНК, которая специфически экспрессируется в репродуктивной ткани растения, и (б) матричную РНК, кодирующую белок, сообщающий толерантность к гербициду; причм зрелая микро-РНК специфически подавляет (тормозит, супрессирует) экспрессию белка в репродуктивной ткани, а стерильность трансгенного растения индуцируется путм нанесения гербицида на растение. В одном варианте изобретения репродуктивная ткань представляет собой мужскую репродуктивную ткань, а стерильность является мужской стерильностью. В другом варианте изобретения репродуктивная ткань представляет собой женскую репродуктивную ткань, а стерильность является женской стерильностью. Ещ в одном варианте изобретения репродуктивная ткань включает оплодотворнную семяпочку, а стерильность к неспособности оплодотворнной семяпочки развиться в жизнеспособное семя. В предпочтительных вариантах изобретения индуцибельно стерильные трансгенные растения представляют собой сельскохозяйственные растения, размножающихся семенами, например, кукуруза, рис,пшеница, овс, ячмень, рожь, тритикале, просо, сорго, квиноя, ширица (амарант), гречиха, кормовые злаки, дернообразующие злаки, люцерна, хлопок, сафлор, подсолнечник, соя, канола, рапс, лн, арахис, бобы, горох, чечевица, латук, спаржа, артишок, сельдерей, морковь, хрен, капуста, горчица, брокколи,цветная капуста, брюссельская капуста, турнепс, кольраби, огурцы, дыни, тыква обыкновенная, тыква зимняя, лук, чеснок, лук-порей, лук-шалот, шнитт-лук, томаты, баклажаны, перец, физалис, свкла, мангольд, шпинат, декоративные растения и лесные деревья. Конструкции рекомбинантной ДНК. Индуцибельно стерильное трансгенное растение, предусматриваемое данным изобретением, содержит в свом геноме конструкцию рекомбинантной ДНК, с которой считывается РНК, включающая: (а) по меньшей мере один сайт узнавания экзогенной микро-РНК, распознаваемый зрелой микро-РНК, которая специфически экспрессируется в репродуктивной ткани растения,и (б) матричную РНК, кодирующую белок, сообщающий толерантность к гербициду; причм зрелая микро-РНК специфически подавляет (тормозит, супрессирует) экспрессию белка в репродуктивной тка- 12023885 ни, а стерильность трансгенного растения индуцируется путм нанесения гербицида на растение. Эта конструкция рекомбинантной ДНК применима для получения хромосом, клеток, семян трансгенного растения и растений, содержащих такую конструкцию, каждый из них в особенности применим для получения гибридных семян. В различных вариантах изобретения, включая варианты индуцибельно стерильного трансгенного растения, конструкция рекомбинантной ДНК дополнительно включает по меньшей мере один элемент,выбранный из (а) растительного промотора; (б) элемента супрессии генов; (в) интрона; (г) элемента экспрессии гена; (д) ДНК, с которой считывается РНК аптамер, способный связываться с лигандом; (е) ДНК, с которой считывается РНК аптамер, способный связываться с лигандом, и ДНК, с которой считывается регуляторная РНК, способная регулировать экспрессию целевого гена, характеризующуюся тем,что регуляция зависит от конформации регуляторной РНК, а на конформацию регуляторной РНК аллостерически влияет состояние связывания РНК аптамера; и (ж) по меньшей мере одной Т-ДНК границы. Эти дополнительные элементы (например, терминаторы и спейсерная ДНК) подробно описаны ниже в разделах под заголовками "Промоторы", "Элементы супрессии генов", "Интроны", "Элементы экспрессии генов", "Аптамеры", "Лиганды", "Регуляторная ДНК", "Т-ДНК-границы", "Терминаторы" и"Спейсерная ДНК" и в других местах данного описания. Неограничивающие примеры того, как эти различные элементы можно расположить, представлены на фиг. 1 и 2. Методы создания и применения конструкций рекомбинантной ДНК по изобретению для получения трансгенных растительных клеток, содержащих конструкции рекомбинантной ДНК, и трансгенных растений, семян и полученных из них растений потомственного поколения и для анализа влияния транскрипции конструкций рекомбинантной ДНК подробно описаны в разделах под заголовками "Получение и применение конструкций рекомбинантной ДНК", "Получение и применение трансгенных растительных клеток и трансгенных растений" и в других местах данного раскрытия. Промоторы. Обычно конструкции рекомбинантной ДНК включают промотор, функционально связанный с транскрибируемой ДНК. Подходящим промотором является любой промотор, способный транскрибировать ДНК в растительной клетке, в которой желательна транскрипция. Неконститутивные промоторы, пригодные для применения с конструкциями рекомбинантной ДНК по изобретению, включают пространственно специфические промоторы, специфические во времени промоторы и индуцибельные промоторы. Пространственно специфические промоторы могут включать органелло-, клеточно-,ткане- или органоспецифические промоторы, функциональные в растениях (например, пластидспецифический, корнеспецифический, пыльцаспецифический или семяспецифический промотор для подавления экспрессии первой целевой РНК в пластидах, корнях, пыльце или семенах соответственно). Во многих случаях особенно пригоден семяспецифический, эмбрионоспецифический, алейроноспецифический или эндоспермоспецифический промотор. Специфические во времени промоторы могут включать промоторы, которые имеют тенденцию промотировать экспрессию во время определнных стадий развития в процессе роста или репродуктивного цикла астения, или в различное время дня или ночи, или в различное время года. Индуцибельные промоторы включают промоторы, индуцируемые химическими веществами (например, экзогенными или синтетическими химическими веществами, а также эндогенными феромонами или другими молекулами (соединениями), передающими сигнал) или условиями окружающей среды, таким как, но без ограничения, биотический или абиотический стресс (например, недостаток воды или засуха, жара, холод, высокие или низкие количества питательных веществ или соли, избыточные или недостаточные уровни света или сельскохозяйственный вредитель или патогенная инфекция). Промотор со специфический экспрессией может также включать промоторы, которые обычно конститутивно экспрессируются, но с разной степенью или "силой" экспрессии, включая промоторы, обычно рассматриваемые как "сильные промоторы" или как "слабые промоторы". Так как сайт узнавания микро-РНК обеспечивает тканеселективную регуляцию экспрессии матричной РНК, во многих предпочтительных вариантах изобретения промотор является просто конститутивным промотором. Неограничивающие конкретные примеры промоторов, применимых в растениях, включают, наряду с другими, промотор опалинсинтазы, выделенный из Т-ДНК Agrobacterium, и промотор вируса мозаики цветной капусты 35S, a также расширенные (усовершенствованные) промоторные элементы или химерные промоторные элементы, например расширенный промотор вируса мозаики цветной капусты (CaMV) 35S, связанный с энхансерным элементом (интрон белка теплового шока 70 кукурузы). Многие специфически экспрессирующие промоторы, функциональные в растениях и применимые в аспектах изобретения, известны в уровне техники. Например, в патентах США 5837848; 6437217 и 6426446 раскрываются"корнеспецифические" промоторы; в патенте США 6433252 раскрывается промотор L13 олеозина кукурузы; в опубликованной патентной заявке США 2004/0216189 раскрывается промотор гена ядра растений, кодирующий локализованную в пластиде альдолазу; в патенте США 6140078 раскрываются солеиндуцибельные промоторы; в патенте США 6294714 раскрываются светоиндуцибельные промоторы; в патенте США 6252138 раскрываются патоген-индуцибельные промоторы; и в опубликованной патентной заявке США 2004/0123347 A1 раскрываются дефицит-индуцибельные промоторы. Промоторный элемент может включать нуклеотидные последовательности, которые не являются природными промоторами или промоторными элементами или их гомологами, но которые могут регу- 13023885 лировать экспрессию гена. Примеры таких "геннезависимых" регуляторных последовательностей могут включать природные или искусственно созданные последовательности РНК, которые содержат лигандсвязывающую область или аптамер и регуляторную область (которая может быть цис-действующей или транс-действующей). См., например, Isaacs et al. (2004) Nat. Biotechnol, 22: 841-847; Bayer and SmolkeSudarsan et al. (2003) RNA, 9: 644- 647; и Mandal and Breaker (2004) Nature Struct. Mol. Biol, 11: 29-35. Такие "риборегуляторы" можно выбирать или создавать (проектировать) для конкретной пространственной или временной специфичности, например для регуляции трансляции экзогенного гена только в присутствии (или в отсутствие) данной концентрации подходящего лиганда. Элементы супрессии генов. Элемент супрессии гена может представлять собой транскрибируемую ДНК любой подходящей длины и обычно включает по меньшей мере около 19-27 нуклеотидов (например, 19, 20, 21, 22, 23 или 24 нуклеотида) для каждого целевого гена, который предполагает подавить конструкция рекомбинантной ДНК. Во многих вариантах изобретения элементы супрессии генов включают более 23 нуклеотидов (например, более примерно 30, примерно 50, примерно 100, примерно 200,примерно 300, примерно 500, примерно 1000, примерно 150, примерно 2000, примерно 3000, примерно 4000 или примерно 5000 нуклеотидов) для каждого целевого гена, который предполагает подавить конструкция рекомбинантной ДНК. Целевые гены описаны в разделе под заголовком "Целевые гены (генымишени)". Подходящие элементы супрессии генов, применимые для конструкций рекомбинантной ДНК по изобретению, включают по меньшей мере один элемент (и в некоторых вариантах изобретения несколько элементов), выбранных из группы, состоящей из(а) ДНК, которая включает по меньшей мере один антисмысловой сегмент ДНК, который является антисмысловым по отношению по меньшей мере к одному сегменту по меньшей мере одного целевого гена;(б) ДНК, которая включает множественные копии по меньшей мере одного антисмыслового сегмента ДНК, который является антисмысловым по меньшей мере к одному сегменту по меньшей мере одного первого целевого гена;(в) ДНК, которая включает по меньшей мере один смысловой сегмент ДНК, который является по меньшей мере одним сегментом по меньшей мере одного первого целевого гена;(г) ДНК, которая включает множественные копии по меньшей мере одного смыслового сегмента ДНК, который является по меньшей мере одним сегментом по меньшей мере одного первого целевого гена;(д) ДНК, которая транскрибируется в РНК (ДНК, с которой считывается РНК) для супрессии по меньшей мере одного первого целевого гена за счт образования двухцепочечной (двухтяжевой, двухнитевой) РНК и включает по меньшей мере один антисмысловой сегмент ДНК, который является антисмысловым по меньшей мере к одному сегменту по меньшей мере одного первого целевого гена, и по меньшей мере один смысловой сегмент ДНК, который является по меньшей мере одним сегментом по меньшей мере одного первого целевого гена;(е) ДНК, которая транскрибируется в РНК (ДНК, с которой считывается РНК) для супрессии по меньшей мере одного первого целевого гена за счт образования единичной двухцепочечной РНК и включает множественные серийные антисмысловые сегменты ДНК, которые являются антисмысловыми по меньшей мере к одному сегменту по меньшей мере одного первого целевого гена, и множественные серийные смысловые сегменты ДНК, которые являются по меньшей мере одним сегментом по меньшей мере одного первого целевого гена;(ж) ДНК, которая транскрибируется в РНК (ДНК, с которой считывается РНК) для супрессии по меньшей мере одного первого целевого гена за счт образования множественных двойных цепей РНК и включает множественные антисмысловые сегменты ДНК, которые являются антисмысловыми по меньшей мере к одному сегменту по меньшей мере одного первого целевого гена, и множественные смысловые сегменты ДНК, которые являются по меньшей мере одним сегментом по меньшей мере одного первого целевого гена, и при этом указанные множественные антисмысловой сегменты ДНК и множественные смысловые сегменты ДНК расположены последовательно в виде обращенных (инвертированных) повторов;(з) ДНК, которая включает нуклеотиды из микро-РНК, предпочтительно микро-РНК растений;(и) ДНК, которая включает нуклеотиды из siPHK;(к) ДНК, которая транскрибируется в РНК аптамер (ДНК, с которой считывается РНК аптамер),способный связываться с лигандом; и(л) ДНК, которая транскрибируется в РНК аптамер, способный связываться с лигандом, и ДНК, которая транскрибируется в регуляторную РНК, способную регулировать экспрессию по меньшей мере одного первого целевого гена, причм регуляция зависит от конформации регуляторной РНК, а на конформацию регуляторной РНК аллостерически влияет состояние связывания РНК аптамера. Нелимитирующие изображения этих элементов супрессии генов показаны на фиг. 2. Любой из этих элементов супрессии генов, вне зависимости от того, транскрибируется ли он в единичную двухцепочечную РНК или во множественные двухцепочечные РНК, можно создать таким образом, чтобы подавлять более одного целевого гена, включая, например, более одного аллеля целевого гена, многих целевых генов (или множественных сегментов по меньшей мере одного целевого гена) единственного вида или целевых генов различных видов. Аптамеры, регуляторная РНК и лиганды описаны ниже в разделах под соответствующими заглавиями. Антисмысловые сегменты ДНК. В одном варианте изобретения по меньшей мере один антисмысловой сегмент ДНК, который является антисмысловым по меньшей мере к одному сегменту по меньшей мере одного первого целевого гена, включает последовательность ДНК, антисмысловую или комплементарную, по меньшей мере, к сегменту по меньшей мере одного первого целевого гена, и может включать множественные антисмысловые сегменты ДНК, т.е. множественные копии по меньшей мере одного антисмыслового сегмента ДНК, который является антисмысловым по меньшей мере к одному сегменту по меньшей мере одного первого целевого гена. Множественные антисмысловые сегменты ДНК могут включать последовательность ДНК, антисмысловую или комплементарную ко многим сегментам по меньшей мере одного первого целевого гена или ко многим копиям сегмента по меньшей мере одного первого целевого гена или к сегментам многих первых целевых генов или к любой их комбинации. Множественные антисмысловые сегменты ДНК могут быть слиты в химеру, например, включающую последовательности ДНК, антисмысловые к множественным сегментам одного или более первых целевых генов и слитые вместе. Антисмысловая последовательность ДНК, антисмысловая или комплементарная (т.е. может образовывать пары оснований Уотсона-Крика), по меньшей мере, сегменту по меньшей мере одного первого целевого гена предпочтительно по меньшей мере примерно на 80%, или по меньшей мере примерно на 85%, или по меньшей мере примерно на 90%, или по меньшей мере примерно на 95% комплементарна,по меньшей мере, сегменту по меньшей мере одного первого целевого гена. В одном предпочтительном варианте изобретения последовательность ДНК, антисмысловая или комплементарная, по меньшей мере,сегменту по меньшей мере одного первого целевого гена примерно на 95-100% комплементарна, по меньшей мере, сегменту по меньшей мере одного первого целевого гена. Если по меньшей мере один антисмысловой сегмент ДНК включает множественные антисмысловые сегменты ДНК, степень комплементарности может быть, но не обязательно, идентичной для всех множественных антисмысловых сегментов ДНК. Смысловые сегменты ДНК. В другом варианте изобретения по меньшей мере один смысловой сегмент ДНК, который является по меньшей мере одним сегментом по меньшей мере одного первого целевого гена, включает последовательность ДНК, которая соответствует (т.е. имеет последовательность,идентичную или практически идентичную), по меньшей мере, сегменту по меньшей мере одного первого целевого гена и может включать множественные смысловые сегменты ДНК, т.е. множественные копии по меньшей мере одного смыслового сегмента ДНК, который соответствует (т.е. имеет последовательность, идентичную или практически идентичную) по меньшей мере одному сегменту по меньшей мере одного первого целевого гена. Множественные смысловые сегменты ДНК могут включать последовательность ДНК, которая представляет собой или которая соответствует множественным сегментам по меньшей мере одного первого целевого гена, или множественным копиям сегмента по меньшей мере одного первого целевого гена, или сегментам множественных первых целевых генов, или любой их комбинации. Множественные смысловые сегменты ДНК могут быть слиты в химеру, т.е. могут включать последовательности ДНК, соответствующие множественным сегментам одного или более первых целевых генов и слитые вместе. Смысловая последовательность ДНК, которая соответствует, по меньшей мере, сегменту целевого гена предпочтительно по меньшей мере примерно на 80%, или по меньшей мере примерно на 85%, или по меньшей мере примерно на 90%, или по меньшей мере примерно на 95% идентична, по меньшей мере, сегменту целевого гена. В одном предпочтительном варианте изобретения последовательность ДНК,которая соответствует, по меньшей мере, сегменту целевого гена примерно на 95-100% идентична, по меньшей мере, сегменту целевого гена. Если по меньшей мере один смысловой сегмент ДНК включает множественные смысловые сегменты ДНК, степень идентичности последовательностей может быть, но не обязательно, идентичной для всех множественных смысловых сегментов ДНК. Множественные копии. Если элемент супрессии генов включает множественные копии антисмысловой или смысловой последовательности ДНК, эти множественные копии могут быть расположены последовательно в виде тандемных повторов. В некоторых вариантах изобретения эти множественные копии могут быть расположены конец-в-конец, т.е. в виде непосредственно связанных тандемных повторов. В некоторых вариантах изобретения эти множественные копии (дубликаты) могут быть расположены последовательно в виде прерывных тандемных повторов, в которых один или более сегмент спейсерной ДНК может прилегать к одной или более множественных копий. Тандемные повторы, либо непосредственно связанные, либо прерывные, либо их комбинация могут включать множественные копии единичной антисмысловой или множественные копии единичной смысловой последовательности ДНК в последовательном (сериальном) расположении или могут включать множественные копии более одной антисмысловой последовательности ДНК или более одной смысловой последовательности ДНК, расположенные последовательно (сериально). Двухнитевая (двухцепочечная, двухтяжевая) РНК. В тех вариантах изобретения, в которых элемент супрессии генов включает либо по меньшей мере один антисмысловой сегмент ДНК, который является антисмысловым по меньшей мере к одному сегменту по меньшей мере одного целевого гена, либо по меньшей мере один смысловой сегмент ДНК, который является по меньшей мере одним сегментом по меньшей мере одного целевого гена, РНК, считываемая либо по меньшей мере с одной антисмысловой,либо по меньшей мере с одной смысловой ДНК может стать двухнитевой под действием РНК-зависимой РНК-полимеразы. См., например, патент США 5283184. В других вариантах изобретения элемент супрессии генов может включать ДНК, которая считывается в РНК, для супрессии по меньшей мере одного первого целевого гена за счт образования двухнитевой РНК и включает по меньшей мере один антисмысловой сегмент ДНК, который является антисмысловым по меньшей мере к одному сегменту по меньшей мере одного целевого гена (как описано выше в разделе под заголовком "Антисмысловые сегменты ДНК"), и по меньшей мере один смысловой сегмент ДНК, который является по меньшей мере одним сегментом по меньшей мере одного первого целевого гена (как описано выше в разделе под заголовком "Смысловые сегменты ДНК"). Такой элемент супрессии генов может дополнительно включать сегменты спейсерной ДНК. Каждый по меньшей мере один антисмысловой сегмент ДНК является комплементарным по меньшей мере к части смыслового сегмента ДНК, чтобы способствовать образованию двухнитевой РНК за счт внутримолекулярной гибридизации по меньшей мере одного антисмыслового сегмента ДНК и по меньшей мере одного смыслового сегмента ДНК. Такая комплементарность между антисмысловым сегментом ДНК и смысловым сегментом ДНК может являться, но необязательно, 100%- ной комплементарностью; в некоторых вариантах изобретения эта комплементарность может составлять по меньшей мере примерно 80%, или по меньшей мере примерно 85%, или по меньшей мере примерно 90%, или по меньшей мере примерно 95%. Двухнитевая РНК может быть в виде единственного "стебля" днРНК (области спаривания оснований между смысловой и антисмысловой нитями) или может иметь множественные "стебли" днРНК. В одном варианте изобретения элемент супрессии гена может включать ДНК, которая считывается в РНК для супрессии по меньшей мере одного первого целевого гена за счт образования преимущественно единичной двухнитевой РНК и включает множественные серийные антисмысловые сегменты ДНК, которые являются антисмысловыми по меньшей мере к одному сегменту по меньшей мере одного первого целевого гена, и множественные серийные смысловые сегменты ДНК, которые представляют собой по меньшей мере один сегмент по меньшей мере одного первого целевого гена; множественные серийные антисмысловые и множественные серийные смысловые сегменты могут образовывать единичный "стебель" двухнитевой РНК или множественные "стебли", расположенные последовательно (с не содержащей спаренных оснований спейсерной ДНК или без такой спейсерной ДНК, разделяющей множественные "стебли"). В другом варианте изобретения элемент супрессии генов включает ДНК, которая считывается в РНК для супрессии по меньшей мере одного первого целевого гена за счт образования множественных днРНК "стеблей" РНК, и включает множественные антисмысловые сегменты ДНК, которые являются антисмысловыми по меньшей мере к одному сегменту по меньшей мере одного первого целевого гена, и множественные смысловые сегменты ДНК, которые являются по меньшей мере одним сегментом по меньшей мере одного первого целевого гена, и при этом указанные множественные антисмысловые сегменты ДНК и множественные смысловые сегменты ДНК расположены в виде ряда "стеблей" днРНК (таких, но без ограничения, как "обращенные повторы"). Такие множественные днРНК "стебли" можно далее располагать в виде ряда или кластеров с образованием тандемных обращенных повторов или структур, похожих на очертания "головки молотка" или "клеверного листа". Любой из этих элементов супрессии генов может дополнительно включать сегменты спейсерной ДНК, находящиеся внутри"стебля" днРНК (например, в виде спейсера между множественными антисмысловыми или смысловыми сегментами ДНК или в виде спейсера между образующими пары оснований антисмысловым сегментом ДНК и смысловым сегментом ДНК), или вне "стебля" двухнитевой РНК (например, в области петли, разделяющей пару обращенных повторов). В тех случаях, когда образующие пары оснований антисмысловой и смысловой сегменты ДНК имеют разную длину, более длинный сегмент может играть роль спейсера. На фиг. 2 проиллюстрированы возможные варианты этих конструкций супрессии генов по изобретению. Микро-РНК. В другом варианте изобретения элемент супрессии генов может включать ДНК, которая содержит нуклеотиды из miPHK (микро-РНК), т.е. последовательность ДНК, которая соответствует микро-РНК, нативной для представляющих интерес вируса или эукариот (включая растения и животных,в особенности беспозвоночных), или последовательность ДНК, образованную из такой нативной микроРНК, но модифицированную включением нуклеотидных последовательностей, которые не соответствуют нативной микро-РНК. Хотя до настоящего времени не сообщалось о микро-РНК в грибах, микро-РНК грибов, если они существуют, также пригодны для применения в данном изобретении. Один предпочтительный вариант изобретения включает элемент супрессии генов, содержащий ДНК, которая включает нуклеотиды из вирусной или растительной микро-РНК. В неограничивающем примере нуклеотиды из микро-РНК могут включать ДНК, которая содержит нуклеотиды, соответствующие петле нативной микро-РНК, и нуклеотиды, выбираемые из последовательности целевого гена. В другом неограничивающем примере нуклеотиды из микро-РНК могут включать ДНК, образованную при использовании последовательности предшественника микро-РНК, или нуклеотиды, соответствующие областям нативной микро-РНК, и нуклеотиды, выбранные из ряда последовательностей целевого гена таким образом, что сохраняется общая структура (например, расположение ошибочных спариваний в структуре стебля пре-микро-РНК), чтобы содействовать процессированию пре-микро-РНК в зрелую микро-РНК. Ещ в одном варианте изобретения элемент супрессии гена может включать ДНК, которая включает нуклеотиды из микро-РНК и способна индуцировать или направлять синхронное отщепление эндогенного транскрипта в трансдействующие siPHK, как описано Allen et al.(2005) Cell, 121: 207-221. Таким образом, ДНК, которая включает нуклеотиды из микро-РНК, может включать последовательность природных микро-РНК или предшественника микро-РНК, синтетическую последовательность или и ту и другую.siPHK. Ещ в одном варианте изобретения элемент супрессии генов может включать ДНК, которая включает нуклеотиды малой интерферирующей РНК (siPHK). siPHK может представлять собой одну или более нативных siPHK (таких как siPHK, выделенные из нетрансгенных эукариот или из трансгенных эукариот) или может представлять собой одну или более ДНК последовательностей, которые, по прогнозам, обладают siPHK активностью (например, используя средства прогностического анализа, известные в уровне техники, см., например, Reinolds et al. (2004) Nature Biotechnol, 22: 326-330). Многие нативные или предсказанные последовательности siPHK можно соединять в химерную последовательность siPHK для супрессии генов. Такая ДНК, которая включает нуклеотиды siPHK, предпочтительно включает по меньшей мере 19 нуклеотидов, а в некоторых вариантах изобретения предпочтительно включает по меньшей мере 21, по меньшей мере 22, по меньшей мере 23 или по меньшей мере 24 нуклеотида. В других вариантах изобретения ДНК, которая включает нуклеотиды siPHK, может содержать значительно больше 21 нуклеотида, например более примерно 50, примерно 100, примерно 300, примерно 500, примерно 1000, примерно 3000 или примерно 5000 нуклеотидов или более. Целевые гены (гены- мишени). Элемент супрессии генов можно создать таким образом, чтобы подавлять любой первый целевой ген. В некоторых вариантах изобретения конструкция дополнительно включает элемент супрессии второго гена для супрессии по меньшей мере одного второго целевого гена,причм элемент супрессии второго гена прилегает к интрону. Любой целевой ген, первый или второй,может включать единичный ген или часть единичного гена, супрессия которого планируется или может включать, например, множественные последовательные сегменты целевого гена, множественные непоследовательные сегменты целевого гена, множественные аллели целевого гена или множественные целевые гены одного или более видов. Целевой ген может быть транслируемой (кодирующей) последовательностью, или может быть некодирующей последовательностью (такой как некодирующая регуляторная последовательность), или и той, и другой и может включать по меньшей мере один ген, выбранный из группы, состоящей из целевого гена эукариот, целевого гена неэукариот, последовательности ДНК предшественника микро-РНК и промотора микро-РНК. Целевой ген может быть нативным (эндогенным) для клетки (например, клетки растения или животного), в которой транскрибируется конструкция рекомбинантной ДНК по изобретению, или может быть нативной для вредителя или возбудителя заболевания (патогенного организма) у растения или животного, в котором транскрибируется конструкция. Целевой ген может быть любым экзогенным геном, таким как трансген в растении. Целевой ген может быть нативным геном, на который нацелена супрессия, с конкурентной экспрессией экзогенного трансгена или без не, например, путм включения элемента экспрессии генов в ту же самую конструкцию рекомбинантной ДНК или в отдельные конструкции рекомбинантной ДНК. Например, может быть желательным заместить нативный ген на экзогенный трансгенный гомолог. Целевой ген может включать единственный участок единственного гена, супрессия которого намечена или может включать, например, множественные последовательные сегменты целевого гена, множественные непоследовательные сегменты целевого гена, множественные аллели целевого гена или множественные целевые гены одного или более видов. Последовательность целевого гена может включать любую последовательность любого вида (включая, но без ограничения, не-эукариоты, такие как бактерии, и вирусы; грибы; растения, включая однодольные и двудольные, такие как сельскохозяйственные растения, декоративные растения, и неодомашненные, или дикие, растения; беспозвоночные, такие как членистоногие, кольчатые черви, нематоды и моллюски; и позвоночные, такие как земноводные, рыбы,птицы, домашние или дикие млекопитающие и даже человек. Один аспект изобретения предусматривает конструкции рекомбинантной ДНК, в которых целевой ген является экзогенным для растения, в которое нужно транскрибировать конструкцию, но эндогенным для вредителя растения или патогенов (возбудителей заболеваний) растения (например, для вирусов,бактерий, грибов, оомицетов, и беспозвоночных, таких как насекомые, нематоды и моллюски). Целевой ген может включать множественные целевые гены или множественные сегменты одного или более генов. В одном предпочтительном варианте изобретения целевой ген или гены представляет(ют) собой ген или гены беспозвоночного вредителя или патогена растения. Эти конструкции рекомбинантной ДНК,пригодные для получения трансгенных растений, устойчивых к одному или более вредителей или патогенов растений, например устойчивых к нематоде, такой как соевая нематода или яванская галловая нематода, или к насекомому-вредителю. Целевой ген может представлять собой транслируемую (кодирующую) последовательность, или некодирующую последовательность (такую как некодирующая регуляторная последовательность), или ту и другую. Неограничивающие примеры целевого гена включают нетранслируемую (некодирующую) последовательность, такую как, но без ограничения, 5' нетранслируемые области, промоторы, энхансеры или другие некодирующие области транскрипции, 3' нетранслируемые области, терминаторы и интроны. Целевые гены включают гены, кодирующие микро-РНК, малые интерферирующие РНК, РНК компоненты рибосом или рибозимов, малые ядерные РНК и другие некодирующие РНК (см., например, некодирующие РНК последовательности, доступные в Интернете на сайте rfam.wustl.edu4 Erdmann et al. (2001)Nucleic Acid Res., 29: 189-193; Gottesman (2005) Trends Genet., 21: 399-404; Griffith-Jones et al. (2005) Nucleic Acid Res., 33: 121-124). Конкретным примером целевого гена является сайт узнавания микро-РНК(т.е. сайт на нити РНК, с которым связывается зрелая микро-РНК и индуцирует расщепление). Другим конкретным примером целевого гена является последовательность предшественника микро-РНК, нативной для вредителя или патогена трансгенного растения, т.е. первичный транскрипт, кодирующий микроРНК или РНК интермедиаты, процессированные при использовании первичного транскрипта (например,ограниченные ядром при-микро-РНК или пре-микро-РНК, которые могут направляться (экспортироваться) из ядра в цитоплазму). См., например, Lee et al. (2002) EMBO Journal, 21: 4663-46704; Reinhart et al.Funct. Integr Genomics, 5: 129-135. Целевые гены могут также включать транслируемую (кодирующую) последовательность генов, кодирующих факторы транскрипции, и гены, кодирующие ферменты, участвующие в биосинтезе или катаболизме представляющих интерес молекул (таких, но без ограничения, как аминокислоты, жирные кислоты и другие липиды, сахара и другие углеводы, биологические полимеры, и вторичные метаболиты, включая алкалоиды, терпеноиды, поликетиды, нерибосомные пептиды, и вторичные метаболиты смешанного биосинтетического происхождения). Во многих предпочтительных вариантах изобретения целевой ген представляет собой незаменимый ген вредителя или патогена растения. Незаменимые гены включают гены, необходимые для развития вредителя или патогена в фертильный репродуктивный взрослый организм. Незаменимые гены включают гены, сайленсинг или супрессия которых приводит к смерти организма (как взрослого, так и на любой стадии развития, включая гаметы) или к неспособности организма успешно репродуцироваться (например, к стерильности мужского или женского родителя или летальности зиготы, зародыша или личинки). Описание незаменимых генов нематод имеется, например, в Kemphues K. "Essential Genes" (December 24,2005), WormBook, ed. The C. elegans Research Community, WormBook, doi/10.1895/wormbook. 1.57.1, доступном в Интернете он лайн на сайте www.wormbook.org. Неограничивающие примеры незаменимых генов нематод включают основной белок спермы, РНК-полимеразу II и хитинсинтазу (см., например,опубликованную патентную заявку США US 20040098761 А 1); другие независимые гены соевой нематоды представлены в патентной заявке США 11/360355, поданной 23 февраля 2006 г. Описание генов насекомых общедоступно в базе данных генома дрозофилы (Drosophila) (он лайн в Интернете на сайтеflybase.bio.indiana.edu/). Функцию большинства предсказанных генов дрозофилы (Drosophila) анализировали скринингом РНК-интерференции клеточных культур, в результате было идентифицировано 438 незаменимых генов; см. Boutros et al. (2004) Science, 303: 832-835, и данные, представленные он лайн в Интернете на сайте www.sciencemag.org/cgi/content/full/303/5659/832/DC1. Описание незаменимых генов бактерий и грибов приводится в базе данных незаменимых генов ("DEG", находится на сайтеtubic.tju.edu.cn/deg/); см. Zhang et al. (2004) Nucleic Acids Res., 32: D271-D272. Беспозвоночные вредители растений включают, но без ограничения, вредные нематоды, вредные моллюски (слизни и улитки) и вредные насекомые. Представляющие интерес патогены растений включают грибы, оомицеты, бактерии (например, бактерии, которые вызывают пятнистость листьев, бактериальный ожог, корневой рак и бактериальный вилт), молликуты и вирусы (например, вирусы, которые вызывают мозаику, исчерченность вдоль жилок листа, крапинки, пятнистость или аномальный рост). См. также в G.N. Agrios, "Plant Pathology" (Fourth Edition), Academic Press, San Diego, 1997, 635 pp., описание грибов, бактерий, молликутов ("мягкокожих") (включая микоплазмы и спироплазмы), вирусов, нематод,паразитических высших растений и жгутиковых простейших, каждый из которых является представляющим интерес вредителем или патогеном растений. См. также постоянно обновляемый свод данных о вредителях и патогенах растений и вызываемых ими заболеваниях в "Common Names of Plant Diseases" Американского фитопатологического общества (APS), составляемый Комиссией по стандартизации обычных названий болезней растений Американского фитопатологического общества (Committee onStandardization of Common Names for Plant Diseases of The American Phytopathological Society), 1978-2005,на сайте www.apsnet.org/onlme/common/top.asp. Неограничивающие примеры грибковых патогенов растений, представляющих особый интерес,включают, например, грибки, которые вызывают мучнистую росу, ржавчину, пятнистость и завядание листьев, выпревание, корневую гниль, гниль корневой шейки, гниль коробочек хлопчатника, рак стеблей, рак побегов, поражение сосудов, головню или плесень, включая Fusarium spp., Phakospora spp., Rhizoctonia spp., Aspergillus spp., Gibberella spp., Pyricularia spp. и Alternaria spp Конкретные примеры грибковых патогенов растений включают Phakospora pachirhizi (азиатская ржавчина сои), Puccinia sorghi (бурая ржавчина кукурузы), Puccinia polysora ("южная ржавчина кукурузы), Fusarium oxysporum и другиеsubglutinans), Diplodia maydis, Sporisorium hold- sorghi, Colletotrichum graminicola, Setosphaeria turcica,Aureobasidium zeae, Sclerotinia sclerotiorum и различные виды грибов, приведнные в табл. 4 и 5 в патенте США 6194636. Неограничивающие примеры патогенов растений включают патогены, ранее отнеснные к грибам, но позднее классифицированные как оомицеты. Конкретные примеры представляющих интерес патогенов растений класса оомицетов включают представителей рода Pythium (например, Pythiumaphanidermatum) и Phytophthora (e. g., Phytophthora infestans, Phytophthora sojae) и организмы, которые вызывают мучнистую росу (например, Peronospora farinosa). Неограничивающие примеры бактериальных патогенов включают микоплазмы, которые вызывают желтуху, и спироплазмы, такие как Spiroplasma kunkelii, которая вызывает карликовость злаков, эубактерии, такие как Pseudomonas avenae, Pseudomonas andropogonis, Erwinia stewartii, Pseudomonas syringae pv.syringae, Xylella fastidiosa и различные виды бактерий, приведнные в табл. 3 в патенте США 6194636. Неограничивающие примеры представляющих интерес вирусных патогенов растений включают вирус карликовой мозаики кукурузы (MDMV), вирус мозаики сахарного тростника (SCMV, ранееMDMV штамма В), вирус полосатой мозаики пшеницы (WSMV), вирус хлорозной карликовости кукурузы (MCDV), вирус жлтой карликовости ячменя (ВЖКЯ, BYDV), вирус верхушки грозди бананов(ратные) черви", точильщики, листовртки и т.д. Членистоногие (Arthropoda) вредители, специально охватываемые данным изобретением, включают различные виды совок, включая совку Agrotis repleta, совку ипсилон (Agrotis ipsilon), совку Anicla ignicans, "зернистую" совку (Feltia subterranea), "gusano spero"(жсткого червяка, Agrotis malefida); средиземноморскую огнвку мельничную (Anagasta kuehniella), мукоеда (Catliartus quadricollis), земляную блошку (Chaetocnema spp), огнвку рисовую (Corcyracephalonica), блошку длинноусую (божью коровку или "коровку Святого Антония" ("vaquita de San Antonio") (Diabotica speciosa), огнвку сахарного тростника (Diatraea saccharalis), кукурузного точильщика(Elasmopalpus lignosellus), клопа (Euschistus spp.), хлопковую совку (Helicoverpa zed), мукоеда крошечного (Laemophloeus minutus), пяденицу травяную (Mods latipes), мукоеда суринамского (Oryzaephilus surinamensis), огнвку мучную (Pyralis farinalis), огнвку амбарную южную (Plodia interpunctella), тлю кукурузную листовую (Rhopalosiphum maidis), земляного щитника или подземного клопа ("chinche subterranea, Scaptocoris castanea), тлю злаковую обыкновенную (Schizaphis graminum), каландрина (долгоносика кукурузного, Sitophilus zeamais), моль зерновую (Sitotroga cerealella), совку травяную (Spodoptera(Bemisia tabaci), различные виды трипсов (Frankliniella spp.), хлопковую совку (Helicoverpa zed), тлю хлебную ("oruga bolillera")(например, Helicoverpa geletopoeon), совку Heliothis virescens, щитника (Nezaraviridula), розового коробочного червя (Pectinophora gossypiella), совку малую (Spodoptera exigua), клеща паутинного (Tetranychus spp.), трипе табачный (Thrips tabaci), белокрылку тепличную (Trialeurodes vaporarium), совку Anticarsia gemmatalis, пятнистого кукурузного жука, или "astilo moteado" (Astylus atromaculatus), "oruga de la alfalfa" ("гусеница люцерны", Colias lesbia), каштанового клопа ("chinche marron") или клопа с усиками ("chinche de los cuernos") (Dichelops furcatus), "alquiche chico" (Edessa miditabunda), нарывников (Epicauta spp.), "barrenador del brote" (сверлильщика побегов) (Epinotia aporema), "oruga verdespp.), "oruga cuarteadora" (Mods repanda), южные формы щитников (Nezara viridula), "chinche de la alfalfa"(люцерного клопа) (Piezodorus guildinii), зелного вредителя клевера (Plathypena scabrd), соевую пяденицу (Pseudoplusia includens), пяденицу подсолнечника "isoca medidora del girasol" (Rachiplusia пи), жлтую медведицу (Spilosoma Virginian), желто-полосатых "походных (ратных) червей" (Spodoptera ornithogalli),различных долгоносиков (семейство Curculionidae), различных проволочников (семейство Elateridae) и различных личинок хруща (семейство Scarabaeidae). Вредители класса нематод, конкретно охватываемые данным изобретением, включают нематод кукурузы (Belonolaimus spp., Trichlodorus spp., Longidorus spp.,- 19023885spp.), сахарного тростника (Heterodera sacchari, Pratylenchus spp., Meloidogyne spp.), апельсинов (Tylenchulus spp., Radopholus spp., Belonolaimus spp., Pratylenchus spp., Xiphinema spp.), кофе (Meloidogyne spp.,Pratylenchus spp.), кокосовой пальмы (Bursaphelenchus spp.), томатов (Meloidogyne spp., Belonolaimus spp.,Nacobbus spp.), винограда (Meloidogyne spp., Xiphinema spp., Tylenchulus spp., Criconemella spp.), лимона и лайма (Tylenchulus spp., Radopholus spp., Belonolaimus spp., Pratylenchus spp., Xiphinema spp.), какао (Meloidogyne spp., Rotylenchulus reniformis), ананаса (Meloidogyne spp., Pratylenchus spp., Rotylenchulus reniformis),папайи (Meloidogyne spp., Rotylenchulus reniformis), грейпфрута (Tylenchulus spp., Radopholus spp. Belonolaimus spp., Pratylenchus spp., Xiphinema spp.) и кормовых бобов (Meloidogyne spp.). Целевые гены вредителей могут включать гены беспозвоночных для основного белка спермы, альфа-тубулина, бета-тубулина, вакуолярной АТФазы, глицеральдегид-3-фосфат-дегидрогеназы, РНК полимеразы II, хитинсинтазы, цитохромов, микро-РНК, предшественников микро-РНК, промоторов микроРНК, а также другие гены, такие как гены, раскрываемые в опубликованной патентной заявке США 2006/0021087 A1, патентной заявке PCT/US 05/11816 и в табл. II опубликованной патентной заявки США 2004/0098761 A1. Целевые гены патогенов могут включать гены вирусных факторов инициации трансляции, вирусных репликаз, микро-РНК, предшественников микро-РНК, тубулина грибов, вакуолярной АТФазы грибов, хитинсинтазы грибов, MAP-киназ грибов, Pad Tyr/Thr фосфатазы грибов, ферментов,участвующих в транспорте (переносе) питательных веществ (например, переносчиков аминокислот или сахаров), ферментов, участвующих в биосинтезе клеточных стенок грибов, кутиназ, ферментов биосинтеза меланина, полигалактоуроназ, пектиназ, пектинлиаз, целлюлаз, протеаз, гены, которые взаимодействуют с генами авирулентности растений, и другие гены, участвующие в инвазии и репликации патогена в инфицированном растении. Таким образом, необязательно, чтобы целевой ген был эндогенным для растения, в котором транскрибируется конструкция рекомбинантной ДНК. Конструкцию рекомбинантной ДНК по изобретению можно транскрибировать в растении и использовать для супрессии гена патогена или вредителя, которые могут заражать растение. Конкретные нелимитирующие примеры подходящих целевых генов включают также гены аминокислот катаболических ферментов (таких, но без ограничения, как ген LKR/SDH кукурузы, кодирующий лизин-кетоглутарат редуктазу (LKR) и сахаропин-дегидрогеназу (SDH), и его гомологи), гены кукурузы,гены, участвующие в синтезе жирных кислот (например, гены растительных микросомных десатураз жирных кислот и растительных ацил-АПБ(АСР)-тиоэстераз, такие, но без ограничения, как гены, раскрываемые в патентах США 6426448, 6372965 и 6872872), гены, участвующие в многостадийных путях биосинтеза, где они могут представлять интерес в качестве регуляторов уровня одного или более интермедиатов, такие как гены, кодирующие ферменты для биосинтеза полигидроксиалканоатов (см.,например, патент США 5750848); и гены, кодирующие регуляторные белки клеточного цикла, такие как белки с активностью, подобной активности ингибитора циклинзависимых киназ (CDK) (см., например,гены, раскрываемые в Международной опубликованной патентной заявке WO 05007829 A2). Целевые гены могут включать гены, кодирующие нежелательные белки (например, аллергены или токсины) или ферменты для биосинтеза нежелательных соединений (например, компонентов с нежелательным запахом или вкусом). Так, в одном варианте изобретения предусматривается трансгенное растение или ткань такого растения, улучшенные за счт супрессии аллергенных белков или токсинов, например арахис, соя или зерно пшеницы с пониженной аллергенностью. Целевые гены могут включать гены, участвующие в созревании фруктов, такие как полигалактуроназа. Целевые гены могут включать гены, у которых экспрессия предпочтительно ограничена конкретной клеткой или тканью или стадией развития или в которых экспрессия предпочтительно является транзиторной, другими словами, когда не обязательна конститутивная или общая супрессия или супрессия, которая распространяется на многие ткани. Так, другие примеры подходящих целевых генов включают гены, кодирующие белки, которые, экспрессируясь в трансгенных растениях, делают трансгенные растения устойчивыми к вредителям или патогенам (см.,например, гены холестериноксидазы, раскрываемые в патенте США 5763245); гены, экспрессия которых индуцируется вредителями или патогенами; и гены, которые могут индуцировать или восстанавливать фертильность (см., например, гены barstar/barnase, описанные в патенте США 6759575). Можно создать такие конструкции рекомбинантной ДНК по изобретению, чтобы они более специфически подавляли целевой ген, этого можно добиться, включая в элемент или элементы супрессии области, практически неидентичные последовательности нецелевого гена. Нецелевые гены могут включать любой ген, который не предполагается подвергать сайленсингу (делать молчащим) или подавлять либо в растении, в котором осуществляется транскрипция конструкции рекомбинантной ДНК, либо в организме, который может контактировать с РНК, считываемой с конструкции рекомбинантной ДНК. Нецелевая последовательность гена может включать любую последовательность любого вида (включая, но без ограничения, не-эукариоты, такие как бактерии, и вирусы; грибы; растения, включая однодольные и двудольные, такие как сельскохозяйственные растения, декоративные растения, и неодомашненные, или дикие, растения; беспозвоночные, такие как членистоногие, кольчатые черви, нематоды и моллюски; и позвоночные, такие как земноводные, рыбы, птицы, домашние или дикие млекопитающие и даже человек). В одном варианте изобретения целевой ген представляет собой ген, эндогенный для данного вида,такого как данное растение (такое, но без ограничения, как растения, имеющие важное сельскохозяйственное или промышленное значение, включая однодольные и двудольные), а нецелевой ген может представлять собой, например, ген нецелевого вида, такого, как другой вид растения, или ген вируса, гриба,бактерии, беспозвоночного или позвоночного, даже человека. Неограничивающим примером является пример, в котором элемент супрессии гена создатся для супрессии целевого гена, который является геном, эндогенным для единичного вида (например, для западного кукурузного жука, Diabrotica virgiferavirgifera LeConte), но не подавляет нецелевой ген, такой как гены родственного, даже близкородственного, вида (например, северный кукурузный жук, Diabrotica barberi Smith и Lawrence, или блошка одиннадцатиточечная - "южный кукурузный жук", Diabrotica undecipunctata). В других вариантах изобретения (например, где желательно подавлять целевой ген во многих видах) может быть желательным создать элемент супрессии генов для супрессии последовательности целевого гена, общей для многих видов, в которой нужно сделать молчащим целевой ген. Так, можно выбрать элемент супрессии гена, который специфичен к одному таксону (например, специфичен к роду,семейству или даже к большему таксону, такому как тип, например, членистоногих), но не к другим токсонам (например, к растениям, или позвоночным, или млекопитающим). В одном неограничивающем примере данного варианта изобретения элемент супрессии гена для сайленсинга гена можно выбирать таким образом, чтобы нацеливаться на патогенные грибы (например, Fusarium spp.), но не нацеливаться на какую-либо последовательность полезных грибов. В другом неограничивающем примере данного варианта изобретения элемент супрессии для сайленсинга гена кукурузного жука (длинноусой блошки) можно выбрать таким образом, чтобы он был специфичен ко всем членам рода Diabrotica. В другом примере данного варианта изобретения такой нацеленный на Diabrotica элемент супрессии генов можно выбрать таким образом, чтобы он не был нацелен на какую-либо последовательность полезных жуков (например, хищных коровок, общеизвестных как божьи коровки) или полезных млекопитающих других видов. Степень специфичности РНК, необходимая для сайленсинга целевого гена, зависит от различных факторов. Например, РНК для сайленсинга целевого гена включает двухнитевую РНК (днРНК), и, следовательно, факторы могут включать размер меньших днРНК фрагментов, которые, как ожидается, образуются под действием Dicer-белка или Dicer-подобных белков, и относительную значимость уменьшения возможности (потенциала) днРНК подавлять нецелевые гены. Например, когда предполагается, что фрагменты днРНК будут иметь размер 21 пар оснований, особенно предпочтительный вариант изобретения включает РНК для сайленсинга целевого гена, который кодирует области, практически неидентичные последовательности нецелевого гена, такие как области внутри которых в каждом соседнем фрагменте, включающем по меньшей мере 21 нуклеотид, соответствие наблюдается меньше чем у 21 (например, меньше чем у 21, или меньше чем у 20, или меньше чем у 19, или меньше чем у 18, или меньше чем у 17) из 21 соседнего нуклеотида последовательности нецелевого гена. В другом варианте изобретения области, практически неидентичные нецелевой генной последовательности, включают области, внутри которых в каждом соседнем фрагменте, включающем по меньшей мере 19 нуклеотидов, соответствие наблюдается меньше чем у 19 (например, меньше чем у 19, или меньше чем у 18, или меньше чем у 17,или меньше чем у 16) из 19 соседних нуклеотидов последовательности нецелевого гена. В некоторых вариантах изобретения может быть желательно создать РНК для сайленсинга целевого гена таким образом, чтобы она включала области, предсказанные как области, при использовании которых не образуются нежелательные полипептиды, например, скринингом РНК для сайленсинга целевого гена на последовательности, которые могут кодировать известные нежелательные полипептиды, или их близкие гомологи. Нежелательные полипептиды могут включать, но без ограничения, полипептиды, гомологичные известным аллергенным полипептидам, и полипептиды, гомологичные известньм полипептидным токсинам. Общедоступные последовательности, кодирующие такие нежелательные теоретически аллергенные пептиды, находятся в базе данных аллергенов исследовательской программы по пищевым аллергенам и ресурсам (FARRP) (на сайте allergenonline.com) или в базах данных "Биотехнологические сведения о пищевой безопасности" (Biotechnology Information for Food Safety) (на сайтеwww.iit.edu/sgendel/fa.htm) (см. также, например, Gendel (1998) Adv. Food Nutr. Res., 42: 63-92). Нежелательные последовательности могут также включать, например, полипептидные последовательности, аннотированные как известные токсины или как возможные или известные аллергены и содержащиеся в находящихся в открытом доступе базах данных, таких как GenBank, EMBL, SwissProt и другие, которые можно искать с помощью системы ввода Entrez (www.ncbi.nih.gov/Entrez). Неограничивающие примеры нежелательных, потенциально аллергенных пептидных последовательностей включают соевый белок глицинии, олеозин и агглютинин в арахисе, глютенины в пшенице, казеин, лактальбумин и лактоглобулин в коровьем молоке и тропомиозин в различных моллюсках и ракообразных (allerjgenonline.com). Неограничивающие примеры нежелательных, потенциально токсических пептидов включают столбнячный токсин tetA Clostridium tetani, диарейные токсины Staphylococcus aureus, и яды, такие как конотоксины изConus spp. и нейротоксины в земноводных и рептилиях (www.ncbi.nih.gov/Entrez). В одном неограничивающем примере проводят скрининг РНК для сайленсинга целевого гена с це- 21023885 лью выяснить транскрибируемые последовательности, кодирующие полипептиды с абсолютной гомологией с известным аллергеном или токсином в пределах 8 соседних аминокислот, или с идентичностью по меньшей мере 35% в пределах по меньшей мере 80 аминокислот; такой скрининг (контроль, просеивание) осуществляют во всех возможных рамках считывания в обоих направлениях, в потенциальных открытых рамках считывания, которые начинаются с AUG (ATG в соответствующей ДНК), или во всех возможных рамках считывания вне зависимости от того, начинаются они с AUG (или ATG) или нет. Если наблюдается "попадание" или совпадение, т.е. если идентифицируется последовательность, которая кодирует потенциальный полипептид с абсолютной гомологией с известным аллергеном или токсином на протяжении (в пределах) 8 соседних аминокислот (или с идентичностью по меньшей мере 35% в пределах по меньшей мере 80 аминокислот), нуклеотидные последовательности, соответствующие совпадению, можно обойти, избегнуть, их можно исключить или модифицировать при выборе последовательностей, которые следует использовать в РНК для сайленсинга целевого гена. Обход, исключение или модификацию нежелательной последовательности можно осуществить любым методом, известным специалистам в данной области техники. В некоторых случаях в результате получают новые последовательности, которые, как полагают, не существуют в природе. Например,обойти некоторые последовательности (избегнуть их) можно, соединяя вместе "чистые" последовательности в новые "химерные" последовательности для применения в качестве РНК для сайленсинга целевого гена. Так как РНК для сайленсинга целевого гена включает двухнитевую РНК (днРНК), заявители признают, что при сайленсинге генов, опосредуемых некоторыми днРНК, в случае отсутствия абсолютного соответствия последовательностей днРНК возможен эффективный сайленсинг генов. Например, было показано, что несоответствия (ошибочные нуклеотиды) близ центра комплементарного сайта микро-РНК оказывают более сильное влияние на сайленсинг гена под действием микро-РНК, чем далее (более дистально) локализованные несоответствия (несоответствующие, ошибочные нуклеотиды). См., например,фиг. 4 в Mallory et al. (2004) EMBO J., 23: 3356-3364. В другом примере сообщалось, что как положение несоответствующих (ошибочных) пар оснований, так и идентичность нуклеотидов, образующих ошибочное спаривание, влияют на способность данной siPHK заставить молчать целевой ген, и что ошибочные спаривания аденозин-цитозин, помимо неоднозначно соответствующей (гипотеза "качелей") пары оснований G:U, вполне допускались (см. Du et al. (2005) Nucleic Acids Res., 33: 1671-1677). Таким образом, последовательность днРНК, которая включается в РНК для сайленсинга целевого гена, не обязательно должна всегда быть на 100% идентична заданному целевому гену, но обычно предпочтительно степень идентичности последовательности с последовательностью заданного целевого гена должна быть значительной, а именно составлять примерно 95%, примерно 90%, примерно 85%, примерно 80%. Специалист в данной области техники сможет понять всю важность с учтом скрининга на области, предсказанные как области, более высокоспецифические к целевому гену, или предсказанные как области, которые не образуют нежелательные полипептиды, связанные с важностью других критериев, таких как, но без ограничения, процент идентичности последовательности с заданным целевым геном или предсказанная эффективность данной последовательности в сайленсинге гена. Например, может быть желательным,чтобы РНК для сайленсинга целевого гена была активна в нескольких видах, и тогда специалист в данной области техники может определить, что более важно включить в РНК для сайленсинга целевого гена области, специфические для нескольких представляющих интерес видов, и менее важно проводить скрининг на области, предсказанные как области с более высокой эффективностью сайленсинга гена, или на области, предсказанные как области, генерирующие нежелательные полипептиды. РНК-аптамеры. Нуклеотидные аптамеры представляют собой нуклеотидные молекулы, которые связываются с лигандом по механизму связывания, который, прежде всего, не основан на спаривании оснований по Уотсону-Крику (в противоположность, например, спариванию оснований, происходящему между комплементарными, антипараллельными нуклеотидными нитями с образованием двухнитевой(двухцепочечной) нуклеотидной структуры). См., например, Ellington and Szostak (1990) Nature, 346: 818822. Нуклеотидный аптамер обычно включает первичную нуклеотидную последовательность, которая позволяет аптамеру образовывать вторичную структуру (например, образование структур стебель-петля),способствующую связыванию аптамера с его лигандом. Связывание аптамера с его лигандом предпочтительно является специфическим, позволяющим аптамеру сделать различие между двумя или более молекул, сходных по структуре (см., например, Bayer and Smolke (2005) Nature Biotechnol.,23: 337-343). Аптамеры, применимые в данном изобретении, могут, однако, быть одновалентными (связывание с единичным лигандом) или мультивалентным (связывание более чем с одним отдельным лигандом, например,связывание одного элемента с двумя или более различных лигандов). См., например, Di Giusto and King(2004) J. Biol. Chem., 279: 46483-46489, где описывается дизайн и конструкция мультивалентных аптамеров кольцевой ДНК. Аптамеры, применимые в данном изобретении, могут включать ДНК, РНК, нуклеотидные аналоги(например, пептид-нуклеиновые кислоты), замкнутые нуклеиновые кислоты, химически модифицированные нуклеиновые кислоты или их комбинации. См., например, Schmidt et al. (2004) Nucleic Acids Res.,32: 5757-5765, который описывает замкнутые нуклеотидные аптамеры. В предпочтительном варианте изобретения аптамер представляет собой РНК-аптамер. В особенно предпочтительном варианте изобретения аптамер получают транскрипцией в растении. Примеры аптамеров можно найти, например, в общедоступной базе данных аптамеров на сайте aptamer.icmb.utexas.edu (Lee et al. (2004) Nucleic Acids Res.,32(1): D95-100). Аптамеры можно создавать для данного лиганда различными методами, известными в уровне техники, включая in vitro селекцию или методы направленной эволюции. См., например, "SELEX" ("систематическая эволюция лигандов экспоненциальным обогащением"), метод, описанный Tuerk and GoldNature, 355: 850-852, селекцию бифункциональных РНК-аптамеров методом химерного SELEX, описанную Burke and Willis (1998), RNA, 4: 1165-1175, селекцию с применением лигандов, связанных с магнитными частицами, описанную Murphy et al. (2003) Nucleic Acids Res., 31:e110, автоматизированный SELEX, описанный Eulberg et al. (2005) Nucleic Acids Res., 33(4):e45, и метод типа SELEX для получения аптамеров к рекомбинантным молекулам, экспрессирующимся на клеточной поверхности, описанныйOhuchi et al. (2005) Nucleic Acid Symposium Series, 49: 351-352. Селекцию можно начинать, используя случайный пула РНК, используя частично структурированного пула РНК (см., например, Davis and Szostak (2002) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99: 11616-11621), или пул вырожденных РНК (см., например, Geigeret al. (1996) Nucleic Acids Res., 24: 1029-1036). Модели вторичной структуры, фолдинг и поведение при гибридизации для данной последовательности РНК можно предсказать, используя алгоритмы, например,описанные Zuker (2003) Nucleic Acids Res., 31: 3406-3415. Таким образом, аптамеры для данного лиганда можно создать de novo, используя подходящий отбор (селекцию). Один неограничивающий пример дизайна и селекции аптамеров подробно описан в Weill et al. (2004) Nucleic Acids Res., 32: 5045-5058, который описывает выделение различных АТФ-связывающих аптамеров и вторичную селекцию аптамеров,которые связывают кордицептин (3'-дезоксиаденозин). Другой неограничивающий пример дизайна аптамера дан в статье Huang and Szostak (2003) RNA, 9: 1456-1463, в которой описывается in vitro эволюция новых аптамеров с новыми специфичностями и новые вторичные структуры из исходного аптамера. Лиганды. Лиганды, применимые в данном изобретении, могут включать аминокислоты или их биосинтетические или катаболические интермедиаты, пептиды, белки, гликопротеины, липопротеины, углеводы, жирные кислоты и другие липиды, стероиды, терпеноиды, гормоны, нуклеиновые кислоты, ароматические соединения, алкалоиды, природные продукты или синтетические соединения (например, красители, фармацевтические вещества, антибиотики, гербициды), неорганические ионы и металлы, короче говоря, любые молекулы (или фрагменты молекулы), которые могут узнаваться и связываться вторичной структурой нуклеиновой кислоты по механизму, прежде всего, не основанному, на спаривании оснований по Уотсону-Крику. Таким образом, узнавание и связывание лиганда и аптамера аналогично узнаванию и связыванию антигена и антитела или эффектора биологического ответа и рецептора. Лиганды могут включать единичные молекулы (или часть (фрагмент) молекулы) или комбинацию двух или более молекул (или фрагментов молекул) и могут включать один или более макромолекулярных комплексов(например, полимеры, липидные бислои, липосомы, клеточные мембраны или другие клеточные структуры или поверхности клеток). См., например, статью Plummer et al. (2005) Nucleic Acids Res., 33: 56025610, в которой описывается селекция аптамеров, которые связываются со сложной поверхностью низкомолекулярных белков; Zhuang et al. (2002) J. Biol. Chem., 277: 13863-13872, где описывается ассоциация рецепторных белков средней кишки насекомых с липидными рафтами, которая влияет на связывание эндотоксинов Bacillus thuringiensis насекомых; и Homann and Goringer (1999) Nucleic Acids Res., 27: 20062014, где описаны аптамеры, которые связываются с живыми трипаносомами. Неограничивающие примеры специфических лигандов включают витамины, такие как коферментB12 и тиамин-пирофосфат, флавин-мононуклеотид, гуанин, аденозин, S-аденозилметионин, Sадонозилгомоцистеин, кофермент А, лизин, тирозин, дофамин, глюкозамин-6-фосфат, кофеин, теофиллин, антибиотики, такие как хлорамфеникол и неомицин, гербициды, такие как глифосат и дикамба, белки, включая вирусные оболочечные белки или оболочечные белки фага, эпидермальные или поверхностные белки пищеварительного тракта насекомых, и РНК, включая вирусную РНК, транспортные РНК(RdRP). Лиганды, пригодные для применения в данном изобретении, включают рецепторные белки щточной каймы средней кишки насекомых, которые узнаются эндотоксинами Bacillus thuringiensis насекомых. См., например, статьи Knight et al. (1995) J. Biol. Chem., 270: 17765- 17770, и Gill et al. (1995) J.Biol Chem., 270: 27277-27282, в которых описывается выделение, идентификация и клонирование примеров таких рецепторных белков; Gomez et al. (2001) J. Biol. Chem., 276: 28906-28912, и Daniel et al. (2002)Appl. Env. Microbiol, 68: 2106-2112, где описаны методы идентификации связывающих эпитопов таких рецепторных белков и методы изучения их аффинности связывания; Jurat-Fuentes and Adang (2001) Appl.Env. Microbiol, 67: 323-329, и Jurat-Fuentes et al. (2001), Appl. Env. Microbiol, 67: 872-879, где описываются анализы эндотоксин-рецепторного связывания, включающие измерение связывания везикул на мембране микроворсинок щточной каймы с эндотоксином либо методами мембранных блотов, либо методом поверхностного плазмонного резонанса. Другие примеры подходящих лигандов, с которыми связываются РНК-аптамеры по изобретению, включают стероидные рецепторы, такие как эстрогеновые ре- 23023885(см., например, Saez et al. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97: 14512-14517. Если лиганды представляют собой рецепторные молекулы или рецепторные комплексы, РНК-аптамеры по изобретению могут, необязательно, действовать как антагонисты или как агонисты. Один класс РНК-аптамеров, применимых в изобретении, представляет собой "термовыключатели" ("термопереключатели", thermoswitches), которые не связывают лиганд, но чувствительны к нагреванию, другими словами, конформация аптамера определяется температурой. См., например, Box 3 в работе Mandal and Breaker (2004) Nature Rev. Mol. Cell Biol.,5: 451-463. Аптамер можно описывать с помощью его состояния связывания, т.е. тем, связан ли (или не связан) аптамер с соответствующим лигандом. Сайт связывания (или трхмерный(е) домен или домены связывания) аптамеры можно описывать как занятые или незанятые лигандом. Аналогично, популяцию данного аптамера можно описывать частью популяции, которая связана или не связана с лигандом. Аффинность аптамера к его лиганду можно описывать с точки зрения скорости ассоциации (связывания) аптамера с лигандом и скорости диссоциации лиганда от аптамера, например, равновесной константой ассоциации(K) или соответствующей ей константой аффинности (Ka), что общеизвестно в уровне техники. Эти скорости можно определять методами, аналогичными общепринятым методам определения кинетики связывания лигандов и рецепторов или антигенов и антител, такими, но без ограничения, как анализы равновесного состояния, конкурентные анализы, поверхностный плазмонный резонанс и прогностические модели. Аффинность аптамера к лиганду может быть отобрана, например, в процессе in vitro развития аптамера или может быть дополнительно модифицирована с помощью изменений в первичной последовательности аптамера, где такие изменения можно проводить, руководствуясь расчтами энергии связывания или с помощью алгоритмов, например, описанных Zuker (2003) Nucleic Acids Res., 31: 3406-3415 или Bayer and Smolke (2005) Nature Biotechnol., 23: 337-343. Состояние связывания аптамера предпочтительно, по меньшей мере частично, определяет вторичную структуру (например, образование двухнитевых или однонитевых областей) и трхмерную конформацию аптамера. В вариантах изобретения, в которых транскрибируемая ДНК дополнительно включает ДНК, которая считывается в регуляторную РНК, способную регулировать экспрессию целевой последовательности,состояние связывания аптамера аллостерически влияет на конформацию регуляторной РНК и, следовательно, на способность регуляторной РНК регулировать экспрессию целевой последовательности. В одном предпочтительном варианте изобретения аптамер (считываемая РНК) фланкирован ДНК,которая транскрибируется в РНК, способную образовывать двухнитевую РНК (днРНК). В некоторых из этих вариантов изобретения днРНК процессирует по PHKi (siPHK или микро-РНК) механизму, при этом аптамер отщепляется от остального транскрипта. В других, особенно предпочтительных вариантах изобретения две области транскрибируемой РНК, фланкирующие аптамер, образуют между собой "стебель",по меньшей мере частично, двухнитевой РНК, причм аптамер служит в качестве "спейсера" или "петли" в структуре "стебель-петля"; предполагается, что такое расположение повышает стабильность или период полужизни транскрипта аналогично тому, что наблюдается для ДНК (см., например, Di Giusto andKing (2004) J. Biol. Chem., 279: 46483-46489). Трансгенные растения, содержащие в свом геноме ДНК,которая считывается в такие аптамеры, имеющие повышенную устойчивость, особенно желательны, например, там, где аптамер функционирует, ингибируя или убивая патоген или вредитель трансгенного растения. Регуляторная РНК. Во многих вариантах изобретения транскрибируемая ДНК дополнительно включает ДНК, с которой считывается регуляторная РНК, способная регулировать экспрессию целевой последовательности, причм регуляция целевой последовательности зависит от конформации регуляторной РНК, а на конформацию регуляторной РНК аллостерически влияет состояние связывания РНКаптамера. Такие комбинации аптамера с доменом регуляторной РНК общеизвестны как "рибопереключатели" (riboswitches). Регуляторная РНК обычно расположена в направлении 3' аптамера, но два домена могут перекрываться; см., например, Najafi-Shoushtary and Famulock (2005) RNA, 11: 1514-1520,где описывается рибозим со структурой "FB", который включает аптамерный домен и конкурентно регулируется флавин-мононуклеотидом и олигонуклеотидом. комплементарным аптамерному домену. В некоторых вариантах изобретения рекуляторная РНК функционально связана с целевой последовательностью и действует "в цис". В других вариантах изобретения регуляторная РНК не связана функционально с целевой последовательностью и действует "в транс". Можно выбрать любую целевую последовательность, включая одну или более целевых последовательностей, выбранных из гена, нативного для трансгенного растения по изобретению, трансгена в трансгенном растении и гена, нативного для вредителя или патогенна трансгенного растения. Целевая последовательность может включать последовательность, которая экспрессирует ген, представляющий интерес (например, РНК, кодирующую белок), или последовательность, которая подавляет ген, представляющий интерес (например, РНК, которая процессирует в siPHK или микро-РНК, которая, в свою очередь, подавляет ген, представляющий интерес). Целевая последовательность может являться транслируемой (кодирующей) последовательностью или может быть некодирующей последовательностью(такой как некодирующая регуляторная последовательность) или и той, и другой. Целевая последова- 24023885 тельность может включать по меньшей мере одну эукариотическую целевую последовательность, по меньшей мере одну неукариотическую целевую последовательность или и ту, и другую. Целевая последовательность может включать любую последовательность любого вида (включая, но без ограничения,не-эукариот, таких как бактерии, и вирусы; грибы; растения, включая однодольные и двудольные, такие как сельскохозяйственные растения, декоративные растения и неодомашненные, или дикие, растения; беспозвоночных, таких как членистоногие, кольчатые черви, нематоды и моллюски; и позвоночных, таких как земноводные, рыбы, птицы, домашние или дикие млекопитающие и даже человек). Подходящие целевые последовательности подробнее описаны в качестве "целевых генов" под заголовком "Целевые гены". В вариантах изобретения, относящихся к рибопереключателям, включающим аптамер и регуляторную РНК, рибопереключатели регулируют экспрессию целевой последовательности по соответствующему механизму. Один нелимитирующий механизм представляет собой транскрипционную регуляцию с помощью лигандзависимого образования характерного "стебля" терминатора (за структурой удлиннный стебель-петля обычно следует отрезок из 6 или более остатков U), который обусловливает прерывание транскрипции РНК-полимеразой, например, до образования полноразмерной мРНК. В "offрибопереключателях" (рибовыключателях") при недостатке лиганда несвязанный аптамерный домен содействует образованию "антитерминаторного стебля", который предупреждает образование характерного стебля терминатора и, следовательно, способствует тому, чтобы происходила транскрипция; поэтому состоянием по умолчанию является состояние "on" (включение) (т.е. транскрипция протекает нормально), и следует добавить лиганд для того, чтобы выключить "рибопереключатель". В "on" рибопереключателях (riboswitches), которые используют этот механизм, аптамерный домен должен быть в связанной (занятой лигандом) конформации, способствующей образованию "антитерминаторного стебля" и разрешающей транскрипцию. Другим механизмом является регуляция трансляции, в которой связывание лиганда вызывает структурные изменения в полноразмерных мРНК и, тем самым, позволяет рибосомам связываться (или предупреждает связывание рибосом) с сайтом связывания рибосом (RBS); образование стебля "анти-анти-RBS" и стебля "анти-RBS" также является взаимно исключающим. В "on" рибопереключателях (riboswitches), которые используют этот механизм, отсутствие лиганда способствует образованию анти-анти-RBS и, следовательно, структурно "свободной" RBS, с которой может связываться рибосома. Также возможна комбинация как транскрипционной, так и трансляционной регуляции. Подробно механизмы регуляции обсуждаются в Mandel and Breaker (2004) Nature Rev. Mol. Cell Biol., 5: 451-463. В некоторых вариантах изобретения регуляторные РНК включают рибозим, например саморасщепляющийся рибозим, рибозим со структурой "головка молотка" или рибозим со структурой "шпильки". Некоторые варианты изобретения, относящиеся к регуляторной РНК, включают последовательность РНК, которая комплементарна или практически комплементарна целевой последовательности. Одним неограничивающим примером является пример, в котором регуляторная РНК включает антисмысловой сегмент, комплементарный или практически комплементарный целевой последовательности. См., например, Bayer and Smolke (2005) Nature Biotechnol, 23: 337-343, где регуляторная РНК включает как антисмысловой сегмент, комплементарный целевой последовательности, так и смысловой сегмент, комплементарный антисмысловому сегменту, причм антисмысловой сегмент и смысловой сегмент способны гибридизоваться друг с другом с образованием внутримолекулярной двухнитевой РНК. В некоторых вариантах изобретения регуляция целевой последовательности включает спаривание оснований регуляторной РНК и целевой последовательности по Уотсону-Крику (например, в вариантах изобретения с транс- действием, см., например, Bayer and Smolke (2005) Nature Biotechnol., 23: 337-343). В частности, в таких вариантах с трансдействием подходящие целевые последовательности включают целевые гены, описанные под заголовком "Целевые гены". Представляющая интерес целевая последовательность может стать более специфической мишенью, если создать регуляторную РНК, включающую области, практически неидентичные нецелевой последовательности. Нецелевые последовательности могут включать любой ген, экспрессия которого предпочтительно не модифицируется, либо в растении,транскрибирующем конструкцию рекомбинатной ДНК, либо в организмах, которые могут контактировать с РНК, считываемой с конструкции рекомбинантной ДНК. Нецелевая последовательность может включать любую последовательность из любого вида (включая, но без ограничения, неэукариоты, такие как бактерии, и вирусы; грибы; растения, включая однодольные и двудольные, такие как сельскохозяйственные растения, декоративные растения и неодомашненные, или дикие, растения; беспозвоночные,такие как членистоногие, кольчатые черви, нематоды и моллюски; и позвоночные, такие как земноводные, рыбы, птицы, домашние или дикие млекопитающие и даже человек). В одном варианте изобретения предусматривается трансгенное растение, имеющее в свом геноме конструкцию рекомбинантной ДНК, включающую транскрибируемую ДНК, содержащую ДНК, с которой считывается РНКК-аптамер, способный связываться с лигандом, причм конструкция сообщает химически индуцируемую или супрессируемую мужскую стерильность или фертильность гибридизации. В предпочтительных примерах используется рибопереключатель (riboswitch), содержащий аптамер, который связывает лиганд, представляющий собой уже зарегистрированное (запатентованное) соединение,например, улучшенный гербицид. В неограничивающем примере трансгенное растение, содержащее (ук- 25023885 рывающее) ген мужской стерильности под контролем промотора, специфического к особям мужского пола, и "off" рибопереключатель глифосата, проявляет мужскую стерильность, если не наносится глифосат. Напротив, трансгенное растение, "укрывающее" ген мужской стерильности под контролем промотора, специфического к особям мужского пола, и "on" рибопереключатель глифосата, проявляет мужскую стерильность только при нанесении глифосата. Одним из применений по изобретению является создание активируемой лигандом устойчивой к гербициду системы для сохранения идентичности генов ("генный замок"), а также для сохранения устойчивого к гербициду самосевного контроля. В одном варианте изобретения последовательность ДНК, кодирующая "on" рибопереключатель встраивается в кассету экспрессии, содержащую целевую последовательность "СР 4", селективный маркер, придающий резистентность к глифосату, epsps-ср 4 (5 енолпирувилшикимат-3-фосфатсинтаза из Agrobacterium tumefaciens штамма СР 4), для экспрессии СР 4 в трансгенных растениях в зависимости от условий. Трансгенные растения, "укрывающие" регулируемую рибопереключателем СР 4 кассету, экспрессируют СР 4 только в присутствии лиганда, который наносится(например, с помощью спрея для листьев) на растение в виде специализированного (патентованного) препарата глифосата, содержащего лиганд. После нанесения обладающий гербицидным действием препарат глифосата активирует транскрипцию/трансляцию СР 4 и придат трансгенному растению резистентность к глифосату. Трансгенные растения чувствительны к аналогам препаратов глифосата (дженерикам), которые не содержат лиганд. Аналогично, этот подход можно применять к любым другим комбинациям гена устойчивости к гербициду/гербицида, например к комбинации дикамба-разрушающая оксигеназа/дикамба или к комбинации: ген устойчивости к антибиотику/антибиотик. В другом варианте изобретения целевая последовательность представляет собой ген, эндогенный для данного вида, такого как данное растение (такое, но без ограничения, как важные с точки зрения сельского хозяйства или промышленности растения, включая однодольные и двудольные), а нецелевая последовательность может представлять собой, например, ген нецелевого вида, такого как растение другого вида или ген вируса, гриба, бактерии, беспозвоночного или позвоночного, даже человека. Одним неограничивающим примером является пример, в котором желательно создать либо аптамер, либо регуляторную РНК, либо и то, и другое, чтобы модифицировать экспрессию целевой последовательности,которая представляет собой ген, эндогенный для единственного вида (например, для западного кукурузного жука, Diabrotica virgifera virgifera LeConte), но не модифицировать экспрессию нецелевой последовательности, такой как последовательности генов родственного, даже близкородственного вида (таких,например, как северный кукурузный жук, Diabrotica barberi Smith и Lawrence или блошка одиннадцатиточечная - "южный кукурузный жук", Diabrotica undecipunctata). В других вариантах изобретения (например, где целесообразно модифицировать экспрессию целевой последовательности в нескольких видах) может потребоваться создать аптамер, или регуляторную РНК, или и то, и другое для модификации экспрессии общей для нескольких видов целевой последовательности, экспрессию которой следует модифицировать. Так, можно выбирать аптамер или регуляторную РНК или и то, и другое, специфические к одному таксону (например, специфические к роду, семейству или даже большему таксону, такому как тип, например, членистоногих), но не к другим токсонам(например, к растениям, или позвоночным, или млекопитающим). В одном неограничивающем примере данного варианта изобретения регуляторную РНК можно выбирать таким образом, чтобы нацеливаться на патогенные грибы (например, Fusarium spp.), но не нацеливаться на последовательность какого-либо гена полезных грибов (например, полезных почвенных микоризных грибов). В другом неограничивающем примере данного варианта изобретения аптамер, или регуляторную РНК, или и то, и другое можно выбирать таким образом, чтобы они были специфичны ко всем членам рода Diabrotica. Например, можно так выбрать регуляторную РНК, включающую нацеленный на Diabrotica элемент супрессии генов (например, антисмысловую РНК, двухнитевую РНК, микро-РНК или тандемные РНК повторы), чтобы она не была нацелена на какую-либо последовательность полезных жуков(например, хищных коровок, общеизвестных как божьи коровки) или полезных млекопитающих других видов. Степень специфичности регуляторной РНК, включающей элемент супрессии генов (например, антисмысловую РНК, двухнитевую РНК, микро-РНК или тандемные РНК повторы), необходимая для супрессии целевой последовательности, зависит от различных факторов. Например, если элемент супрессии гена включает двухнитевую РНК (днРНК), факторы могут включать размер меньших днРНК фрагментов, которые, как ожидается, образуются под действием Dicer, и относительную значимость уменьшения возможности (потенциала) днРНК подавлять нецелевые гены. Например, когда предполагается,что фрагменты днРНК будут иметь размер 21 пара оснований, особенно предпочтительный вариант изобретения может включать последовательность регуляторной РНК, способную образовывать днРНК и кодировать области, практически неидентичные нецелевой последовательности, такие как области внутри которых в каждом соседнем фрагменте, включающем по меньшей мере 21 нуклеотид, соответствие наблюдается меньше чем для 21 (например, меньше чем для 21, или меньше чем для 20, или меньше чем для 19, или меньше чем для 18, или меньше чем для 17) из 21 соседнего нуклеотида нецелевой последовательности. В другом варианте изобретения области, практически неидентичные нецелевой генной по- 26023885 следовательности, включают области, внутри которых в каждом соседнем фрагменте, включающем по меньшей мере 19 нуклеотидов, соответствие наблюдается меньше чем нецелевого 19 (например, меньше чем нецелевого 19, или меньше чем нецелевого 18, или меньше чем нецелевого 17, или меньше чем нецелевого 16) из 19 соседних нуклеотидов последовательности нецелевого гена. В некоторых вариантах изобретения может быть целесообразным создать аптамер, регуляторную РНК или и то, и другое, включающие области, предсказанные как области, при использовании которых не образуются нежелательные полипептиды, например, скринингом аптамера, регуляторной РНК, или и того, и другого, на последовательности, которые могут кодировать известные нежелательные полипептиды, или их близкие гомологи. Нежелательные полипептиды включают, но без ограничения, полипептиды, гомологичные известным аллергенным полипептидам, и полипептиды, гомологичные известным полипептидным токсинам. Общедоступные последовательности, кодирующие такие нежелательные теоретически аллергенные пептиды, находятся в базе данных аллергенов исследовательской программы по пищевым аллергенам и ресурсам (FARRP) (на сайте allergenonline.com) или в базах данных "Биотехнологические сведения о пищевой безопасности" (Biotechnology Information for Food Safety) (на сайтеwww.iit.edu/sgendel/fa.htm) (см. также, например, Gendel (1998) Adv. Food Nutr. Res., 42: 63-92). Нежелательные последовательности могут также включать, например, полипептидные последовательности, аннотированные как известные токсины или как возможные или известные аллергены и содержащиеся в находящихся в открытом доступе базах данных, таких как GenBank, EMBL, SwissProt и другие, которые можно искать с помощью системы ввода Entrez (www.ncbi.nih.gov/Entrez). Неограничивающие примеры нежелательных, потенциально аллергенных пептидных последовательностей включают соевый белок глицинии, олеозин и агглютинин в арахисе, глютенины в пшенице, казеин, лактальбумин и лактоглобулин в коровьем молоке и тропомиозин в различных моллюсках и ракообразных (allergenonline.com). Неограничивающие примеры нежелательных, потенциально токсических пептидов включают столбнячный токсин tetA Clostridium tetani, диарейные токсины Staphylococcus aureus, и яды, такие как конотоксины изConus spp. и нейротоксины в земноводных и рептилиях (www.ncbi.nih.gov/Entrez). В одном неограничивающем примере можно проводить скрининг предполагаемых аптамера, регуляторной РНК, или и того, и другого с целью выяснить транскрибируемые последовательности, кодирующие полипептиды с абсолютной гомологией с известным аллергеном или токсином в пределах 8 соседних аминокислот, или с идентичностью по меньшей мере 35% в пределах по меньшей мере 80 аминокислот; такой скрининг (контроль, просеивание) можно осуществлять во всех возможных рамках считывания в обоих направлениях, в потенциальных открытых рамках считывания, которые начинаются сATG, или во всех возможных рамках считывания вне зависимости от того, начинаются они с ATG или нет. Если наблюдается "попадание" ("hit") или совпадение, т.е. если идентифицируется последовательность, которая кодирует потенциальный полипептид с абсолютной гомологией с известным аллергеном или токсином на протяжении (в пределах) 8 соседних аминокислот (или с идентичностью по меньшей мере 35% в пределах по меньшей мере 80 аминокислот), последовательности ДНК, соответствующие совпадению, можно обойти, избегнуть, их можно исключить или модифицировать при выборе последовательностей, которые следует использовать в аптамере, регуляторной РНК или в обоих. Обход, исключение или модификацию нежелательной последовательности можно осуществить любым методом, известным специалистам в данной области техники. В некоторых случаях в результате получают новые последовательности, которые, как полагают, не существуют в природе. Например,обойти некоторые последовательности (избегнуть их) можно, соединяя вместе "чистые" последовательности в новые "химерные" последовательности для применения в элементе супрессии генов. Если регуляторная РНК включает двухнитевую РНК (днРНК) для сайленсинга целевого гена, заявители признают, что в некоторых случаях сайленсинга генов, опосредуемых днРНК, при отсутствии абсолютного соответствия последовательностей днРНК возможен эффективный сайленсинг генов. Например, было показано, что несоответствия (ошибочные нуклеотиды) близ центра комплементарного сайта микро-РНК оказывают более сильное влияние микро-РНК на сайленсинг гена, чем далее (более дистально) локализованные несоответствия (несоответствующие, ошибочные нуклеотиды). См., например, фиг. 4 в Mallory et al. (2004) EMBO J., 23: 3356-3364. В другом примере сообщалось, что как положение несоответствующих (ошибочных) пар оснований, так и идентичность нуклеотидов, образующих ошибочное спаривание, влияют на способность данной siPHK заставить молчать целевую последовательность, и что ошибочные спаривания аденозин-цитозин, помимо неоднозначно соответствующей (гипотеза "качелей") пары оснований G:U, вполне допускались (см. Du et al. (2005) Nucleic Acids Res., 33: 1671-1677). Таким образом, регуляторная РНК, которая включает двухнитевую РНК, не обязательно должна всегда быть на 100% идентична заданной целевой последовательности, но обычно предпочтительно степень идентичности последовательности с последовательностью заданного целевого гена должна быть значительной, а именно составлять примерно 95%, примерно 90%, примерно 85% или примерно 80%. Специалист в данной области техники сможет понять всю важность с учтом скрининга на области, предсказанные как области, более высокоспецифические к первой целевой последовательности,или предсказанные как области, которые не образуют нежелательные полипептиды,связанную с важностью других критериев, таких как, но без ограничения, процент идентичности последовательности с за- 27023885 данной первой целевой последовательностью, или предсказанная эффективность данной последовательности в сайленсинге гена. Например, может быть целесообразно, чтобы данная регуляторная РНК, которая включает двухнитевую РНК, для сайленсинга гена была активна в нескольких видах, и тогда специалист в данной области техники может определить, что важнее включить в регуляторную РНК области,специфические для нескольких представляющих интерес видов, и менее важно проводить скрининг на области, предсказанные как области с более высокой эффективностью сайленсинга гена, или на области,предсказанные как области, генерирующие нежелательные полипептиды. Во многих вариантах изобретения клетка трансгенного растения содержит в свом геноме рекомбинантную ДНК, включающую транскрибируемую ДНК, в том числе (а) ДНК, с которой считывается РНКаптамер, способный связываться с лигандом, и (б) ДНК, с которой считывается регуляторная РНК, способная регулировать экспрессию целевой последовательности, причм регуляция зависит от конформации регуляторной РНК, а на конформацию указанной регуляторной РНК аллостерически влияет состояние связывания указанного РНК-аптамера. В этих вариантах изобретения приводит в результате к специфическому изменению экспрессии целевой последовательности, которое может выражаться в повышении или понижении экспрессии, в зависимости от дизайна рекомбинантной ДНК. В одном варианте изобретения связывание лиганда с РНК-аптамером приводит к повышению экспрессии целевой последовательности по сравнению с экспрессией в отсутствие связывания. В другом варианте изобретения связывание лиганда с РНК-аптамером приводит к снижению экспрессии целевой последовательности по сравнению с экспрессией в отсутствие связывания. Некоторые варианты изобретения характеризуются "аутоиндуцибельностью" ("самоиндуцируемостью"). В одном таком варианте изобретения связывание лиганда с РНК-аптамером приводит к повышению экспрессии целевой последовательности по сравнению с экспрессией в отсутствие связывания, при этом повышение экспрессии влечт за собой уровень лиганда, достаточный для сохранения повышения экспрессии. В другом варианте изобретения связывание лиганда с РНК-аптамером приводит к понижению экспрессии целевой последовательности по сравнению с экспрессией в отсутствие связывания, при этом понижение экспрессии влечт за собой уровень лиганда, достаточный для сохранения понижения экспрессии. Таким образом, другим аспектом изобретения является способ модификации экспрессии представляющего интерес гена в растительной клетке, включающий транскрибирование в клетке трансгенного растения по изобретению, или в растении, или растении потомственного поколения, или семени, или другой растительной ткани, полученных из такой клетки трансгенного растения, рекомбинантной или гетерологичной ДНК, которая считывается в (а) РНК-аптамер, способный связываться с лигандом, и (б) регуляторную РНК, способную регулировать экспрессию целевой последовательности, при этом регуляция зависит от конформации регуляторной РНК, а на конформацию указанной регуляторной РНК аллостерически влияет состояние связывания указанного РНК-аптамера, а экспрессия представляющего интерес гена модифицируется по сравнению с экспрессией в отсутствие транскрипции конструкции рекомбинантной ДНК. Интроны. Термины "интрон" или "интронная последовательность" по данному описанию обычно обозначают некодирующую ДНК- последовательность природного гена, которая в конструкциях рекомбинантной ДНК по данному изобретению сохраняет свою нативную (естественную) способность подвергаться эксцизии (вырезаться) из пре-мРНК-транскриптов, например нативные интронные последовательности, ассоциированные с РНК-областями, кодирующими белки, причм нативные интроны подвергаются сплайсингу, способствуя тому, что экзоны собираются в зрелые мРНК до того, как РНК покинет ядро. Такой вырезаемый (подлежащий удалению, эксцизии) интрон имеет 5' сайт сплайсинга и 3' сайт сплайсинга. Интроны могут самосплайсирующиеся и несамосплайсирующиеся (т.е. требующие для сплайсинга ферменты или сплайсосомы) и могут подвергаться селекции на различную эффективность сплайсинга. Интроны, пригодные для применения в конструкциях по изобретению, могут представлять собой вирусные интроны (например, Yamada et al. (1994) Nucleic Acids Res., 22: 2532-2537), эукариотические интроны (включая интроны животных, грибов и растительные интроны), архебактериальные или бактериальные интроны (например, Belfort et al. (1995) J. Bacteriol, 177: 3897-3903) или любые природные или искусственные (см., например, Yoshimatsu and Nagawa (1989) Science, 244: 1346-1348) последовательности ДНК с интроноподобной функциональностью в растении, в котором должна считываться конструкция рекомбинантной ДНК по изобретению. Хотя в практике применения данного изобретения в качестве хозяина для включнной ДНК может использоваться практически любой интрон, особенно предпочтительными являются интроны, повышающие экспрессию в растении, или интроны, образованные из 5' нетранслируемой лидерной последовательности. Если конструкция рекомбинантной ДНК по изобретению применяется для трансформации растения, особенно предпочтительными могут быть интроны из растительных источников. Примеры особенно предпочтительных растительных интронов включают интрон актина 1 риса (I-Os-Act1) (Wanget al. (1992) Mol. Cell. Biol., 12: 3399- 3406; McElroy et al. (1990) Plant. Cell., 2: 163-171), интрон белка теплового шока кукурузы (I-Zm-hsp70) (U.S. Patents 5593874 and 5859347) и интрон алкогольдегидрогеназы кукурузы (I-Zm- adh1) (Callis et al. (1987) Genes Dev., 1: 1183-1200). Другие примеры интронов, пригод- 28023885 ных для применения в изобретении, включают 5' лидерную последовательность, или "омега" лидер вируса табачной мозаики (Gallie and Walbot (1992) Nucleic Acids Res., 20: 4631-4638), интрон Shrunken-1 (Sh1) (Vasil et al. (1989) Plant Physiol, 91: 1575-1579), интрон сахарозосинтазы кукурузы (Clancy and Hannah(2002) Plant Physiol, 130: 918-929), интрон белка теплового шока 18 (hspl8) intron (Silva et al. (1987) J.Cell. Biol., 105: 245) и интрон белка теплового шока протяжнностью 82 кДа (hsp82) (Semrau et al. (1989)J. Cell. Biol., 109, p. 39A, и Mettler et al. (May 1990) N.A.T.O. Advanced Studies Institute on Molecular Biology, Elmer, Bavaria). Элементы экспрессии генов. Конструкции рекомбинантной ДНК могут дополнительно включать элемент экспрессии генов. Любой ген или любые гены, представляющий(ие) интерес, может(могут) экспрессироваться при использовании элемента экспрессии генов, включающего кодирующую или некодирующую последовательность или и ту, и другую, и включать природные последовательности или искусственные или химерные последовательности или и те, и другие. Если элемент экспрессии генов кодирует белок, такие конструкции предпочтительно включают функциональный терминаторный элемент для содействия транскрипции и трансляции элемента экспрессии генов. В вариантах, включающих индуцибельно стерильные трансгенные растения, элемент экспрессии генов может включать или может дополнять матричную РНК, кодирующую белок толерантности к гербициду. В вариантах изобретения, в которых конструкция рекомбинантной ДНК содержит интрон, конструкция может дополнительно включать элемент экспрессии генов для экспрессии по меньшей мере одного гена, представляющего интерес, причм элемент экспрессии генов прилегает к интрону. В других вариантах изобретения конструкция рекомбинантной ДНК включает интрон, в который встроен элемент супрессии гена и элемент экспрессии генов для экспрессии по меньшей мере одного представляющего интерес гена, причм элемент экспрессии генов также расположен внутри интрона; в таких случаях элемент экспрессии генов может быть функционально связан с функциональным терминаторным элементом, который сам по себе также находится внутри интрона. Представляющий интерес ген, который предстоит экспрессировать с помощью элемента экспрессии генов, может включать по меньшей мере один ген, выбранный из группы, состоящей из эукариотического целевого гена, неэукариотического целевого гена и ДНК последовательности предшественника микро-РНК. Представляющий интерес ген может включать единичный ген или множество генов (таких как множество копий единичного гена, множество аллелей единичного гена или множество генов, включающих гены различных видов). В одном варианте изобретения элемент экспрессии генов может включать пептидные последовательности, способные к аутогидролизу, например последовательности, расположенные между множественными последовательностями (дубликатами), кодирующими один или более полипептидов (см., например, 2 А и "2 Аподобные" саморасщепляющиеся последовательности различных видов, включая вирусы, трипаносомы и бактерии, раскрываемые Donnely et at. (2001), J. Gen. Virol., 82: 1027-1041). В другом варианте изобретения элемент экспрессии генов может включать рибосомные "skip" (пропуск) последовательности, например, расположенные между множеством последовательностей, кодирующих один или более полипептидов (см., например, рибосомные "skip" последовательности афтовируса ящура (FMDV) 2A, раскрываемые Donnely et al. (2001), 7. Gen. Virol., 82: 1013-1025). Представляющий интерес ген может включать любую кодирующую или некодирующую последовательность из любого вида (включая, но без ограничения, неэукариотов, таких как бактерии, и вирусы; грибы; растения, включая однодольные и двудольные, такие как сельскохозяйственные растения, декоративные растения и неодомашненные, или дикие, растения; беспозвоночные, такие как членистоногие,кольчатые черви, нематоды и моллюски; и позвоночные, такие как земноводные, рыбы, птицы, домашние или дикие млекопитающие и даже человек. Неограничивающие примеры некодирующей последовательности, которую надо экспрессировать при использовании элемента экспрессии генов, включают, но без ограничения, 5' нетранслируемые области, промоторы, энхансеры или другие некодирующие транскрипционные области, 3' нетранслируемые области, терминаторы, интроны, микро-РНК, ДНК последовательности предшественника микро-РНК, малые интерферирующие РНК, РНК компоненты рибосом или рибозимов, малые ядерные РНК и другие некодирующие РНК. Неограничивающие примеры представляющего интерес гена дополнительно включают, но без ограничения, транслируемую (кодирующую) последовательность, например гены, кодирующие факторы транскрипции, и гены, кодирующие ферменты, участвующие в биосинтезе или катаболизме соединений, представляющих интерес (таких как аминокислоты, жирные кислоты и другие липиды, сахара и другие углеводы, биологические полимеры, и вторичные метаболиты, включая алкалоиды, терпеноиды, поликетиды, нерибосомные пептиды, и вторичные метаболиты смешанного биосинтетического происхождения). Представляющий интерес ген может являться геном, нативным для растения, в котором надо транскрибировать конструкцию рекомбинантной ДНК по изобретению, или может являться ненативным геном. Представляющий интерес ген может представлять собой маркерный ген, например селективный маркерный ген, кодирующий устойчивость к антибиотикам, грибам или гербицидам, или маркерный ген, кодирующий легкодетектируемый признак(например, фитоинсинтаза или другие гены, сообщающие конкретный пигмент растению), или ген, кодирующий детектируемую молекулу, такую как флуоресцентный белок, люцифераза, или уникальную полипептидную или нуклеотидную метку ("тег", хвост), детектируемый методами обнаружения белков
МПК / Метки
МПК: A01H 5/00, C12N 15/90, C12N 15/87, C12N 15/82, A01H 1/00, C12N 15/63, A01H 5/10
Метки: трансгенные, днк, конструкция, растения, стерильности, трансгенном, стерильные, растении, рекомбинантной, способы, семян, получения, гибридных, индуцирования
Код ссылки
<a href="https://eas.patents.su/30-23885-konstrukciya-rekombinantnojj-dnk-dlya-inducirovaniya-sterilnosti-v-transgennom-rastenii-sterilnye-transgennye-rasteniya-i-sposoby-polucheniya-gibridnyh-semyan.html" rel="bookmark" title="База патентов Евразийского Союза">Конструкция рекомбинантной днк для индуцирования стерильности в трансгенном растении, стерильные трансгенные растения и способы получения гибридных семян</a>
Очищенная ксантозин-n7-метилтрансфераза из растения кофе, кодирующие ее нуклеиновые кислоты, трансгенные клетки растения кофе, трансгенные растения кофе и кофейные зерна, не содержащие кофеина, и способы уменьшения синтеза кофеина в клетках растения кофе
Номер патента: 3835
Опубликовано: 30.10.2003
Авторы: Неупане Каби Радж, Стайлис Джон И., Моисиади Истефо
Метки: клетках, растения, ксантозин-n7-метилтрансфераза, очищенная, клетки, кофеина, содержащие, кислоты, уменьшения, способы, кофе, синтеза, трансгенные, кофейные, зерна, кодирующие, нуклеиновые
Формула / Реферат:
1. Очищенная ксантозин-N7-метилтрансфераза из растения кофе Coffea arabica с выведенной аминокислотной последовательностью содержащая триптические фрагменты, имеющие аминокислотные последовательности (i) Ile Asn Tyr Ala Ser Gly Ala Ser Gly Ile Leu Asp Gln - Gly, или (ii) Ile Asn Tyr Ala Ser Gly Ala Ser Gly Ile Leu Asp Gln Thr, или (iii) Gln Tyr Val Pro Cys Tyr Phe (Thr/Asp) Phe Ile Asp (Asp) (Gln) Asp. 2. Выделенная последовательность кДНК,...
Специфические для семян льна промоторы, способы их применения, трансгенные семена и растения льна
Номер патента: 6549
Опубликовано: 24.02.2006
Авторы: Молони Морис М., Сингх Суриндер, Чаудхари Сарита, Ван Роэйен Гейс
МПК: C12N 15/29, A01H 5/10, A01H 5/00...
Метки: семян, способы, семена, льна, растения, специфические, трансгенные, промоторы, применения
Формула / Реферат:
1. Способ обеспечения экспрессии представляющей интерес последовательности нуклеиновой кислоты в семенах льна, включающий: (a) получение химерной конструкции нуклеиновой кислоты, содержащей в 5'® 3'-направлении транскрипции в виде функционально связанных компонентов: (1) семяспецифический промотор, полученный из льна; и (2) указанную представляющую интерес последовательность нуклеиновой кислоты, причем указанная представляющая интерес...
Рекомбинантная двухцепочная последовательность днк для экспрессии сахарозофосфорилазы в растении, способ получения трансгенного растения с повышенной экспрессией сахарозофосфорилазы в различных частяхрастения и линия трансформированных клеток растения
Номер патента: 634
Опубликовано: 29.12.1999
Авторы: Велдон Марсиа Ли, Бэрри Джерард Фрэнсис, Девирд Ян Виллем, Кишор Джениш Мерти
МПК: C12N 15/82
Метки: двухцепочная, частяхрастения, экспрессии, растения, трансгенного, получения, экспрессией, клеток, днк, способ, различных, повышенной, растении, сахарозофосфорилазы, линия, трансформированных, последовательность, рекомбинантная
Формула / Реферат:
1. Рекомбинантная двухцепочечная последовательность ДНК для экспрессии сахарозофосфорилазы в растении, содержащая следующие конструктивные элементы: - промотор, активный в определенных клетках растений; - ген, кодирующий фермент сахарозофосфорилазу Streptococcus mutans, имеющий следующую последовательность нуклеотидов: (SEQ ID NO:5); и 3` - нетранслируемую область, обеспечивающую терминацию транскрипции гена сахарозофосфорилазы и...
Линия клеток растения сахарной свеклы и растение сахарной свеклы, устойчивые к имидазолиноновому гербициду, семена указанного растения, способы получения указанной клеточной линии и гибридных растенийсвеклы, устойчивых к данному гербициду, и применение указанного гербицида для борьбы с сорняками, растущими на полях с указанными растениями сахарной свеклы
Номер патента: 3296
Опубликовано: 24.04.2003
Авторы: Райт Терри Р., Пеннер Доналд
Метки: гербициду, полях, растения, линия, борьбы, семена, растениями, клеток, указанного, данному, гербицида, устойчивых, имидазолиноновому, гибридных, способы, линии, растение, свеклы, сахарной, растущими, указанной, устойчивые, получения, указанными, применение, растенийсвеклы, клеточной, сорняками
Формула / Реферат:
1. Линия клеток растения сахарной свеклы с мутированным геном ацетолактатсинтазы, в котором в положении 337 гуанин замещен на аденин, устойчивая к имидазолиноновому гербициду, способная регенерировать в растение сахарной свеклы, причем указанная устойчивость передается при общепринятом кроссбридинге регенерированных растений с растениями, чувствительными к данному гербициду. 2. Линия клеток по п.1, которая получена из чувствительных клеток...
Линия клеток растения сахарной свеклы и растение сахарной свеклы, устойчивые к имидазолиноновым и сульфонилмочевинным гербицидам, семена указанного растения, способы получения указанной клеточной линии и гибридных растений свеклы, устойчивых к данным гербицидам, и применение имидазолинонового гербицида для борьбы с сорняками, растущими на полях с указанными растениями сахарной свеклы
Номер патента: 3297
Опубликовано: 24.04.2003
Авторы: Пеннер Доналд, Райт Терри Р.
Метки: данным, линии, сорняками, свеклы, указанными, гербицида, растениями, применение, указанной, растения, гибридных, линия, семена, клеток, полях, растение, устойчивых, борьбы, гербицидам, сульфонилмочевинным, клеточной, указанного, устойчивые, получения, имидазолинонового, растений, имидазолиноновым, растущими, сахарной, способы
Формула / Реферат:
1. Линия клеток растения сахарной свеклы с мутированным геном ацетолактатсинтазы, в котором в положении 562 цитозин замещен на тимин и в положении 337 гуанин замещен на аденин, устойчивая к имидазолиноновым и сульфонилмочевинным гербицидам, способная регенерировать в растение сахарной свеклы, причем указанная устойчивость передается при общепринятом кроссбридинге регенерированных растений с растениями, чувствительными к данным гербицидам. 2....
Предыдущий патент: Содержащая желатин композиция для наружного применения и способы ее использования
Следующий патент: Селективные аналоги глюкагонподобного пептида-2 (glp-2)
Случайный патент: Индуктивный соединитель для систем передачи данных по электрическим силовым проводам