Обратная генетика с использованием неэндогенных промоторов pol i

ОБРАТНАЯ ГЕНЕТИКА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ НЕЭНДОГЕННЫХ ПРОМОТОРОВ pol I Экспрессия трансгена управляется в клетках-хозяевах с помощью промотора pol I, который не является эндогенным для организма из того же таксономического подразделения, из которого происходят клетки-хозяева. По патентной заявке на данное изобретение испрашивается приоритет временной патентной заявки США 61/216919, поданной 21 мая 2009 г., полное содержание которой включено в настоящее описание путем ссылки. Область техники, к которой относится изобретение Изобретение относится к области обратной генетики. Кроме того, оно относится к получению вакцин для защиты от различных вирусов. Уровень техники Обратная генетика позволяет проводить рекомбинантную экспрессию и манипуляции с вирусной РНК в культуре клеток. Она представляет собой мощный инструмент вирусологии и производства вакцин, поскольку позволяет быстро получать рекомбинантные вирусы (включая реассортанты) и/или их мутации. Способ включает трансфекцию клеток-хозяев одним или более экспрессирующимися конструктами, которые кодируют вирусный геном, и выделение вируса из клеток. Например, в ссылках [1] и[2] описан способ, в котором геномная РНК гриппа экспрессируется в клетках собаки с помощью промотора pol I собаки. Другие источники сообщают об экспрессии геномной РНК гриппа в клетках человека с помощью промотора pol I человека. Существенным недостатком способов из уровня техники является то, что промоторы pol I являются высоковидоспецифичными. Например, сообщалось, что промотор pol I человека активен только в клетках приматов [3] и, сходным образом, что экспрессия в клетках собаки требует промотора pol I собаки. Таким образом, в тех случаях, когда необходимо выращивать вирус в клеточной линии, для которой эндогенный промотор pol I не охарактеризован, необходимо использовать два различных типа клеток для выживания и роста вируса. Однако желательно устранить использование множества клеточных линий,поскольку это дает преимущество, например, в том, что может быть устранено давление отбора на конкурирующие культуры. Использование единственной клеточной линии для всех стадий получения вакцины также облегчает получение разрешения контролирующих органов. Таким образом, существует постоянная необходимость в данной области техники в создании альтернативных способов использования обратной генетики. Сущность предпочтительных вариантов осуществления Авторы изобретения с удивлением обнаружили, что существует возможность запуска экспрессии трансгена в клетках хозяина с помощью промотора pol I, который не является эндогенным для организма из того же таксономического подразделения, из которого происходят клетки-хозяева. В одном из вариантов осуществления изобретение относится к клеткам-хозяевам, содержащим один или более экспрессирующийся конструкт (конструктов), в которых экспрессия молекулы РНК из конструкта (конструктов) контролируется промотором pol I, который не является эндогенным для таксона,которому принадлежат клетки-хозяева. Эти клетки-хозяева могут быть использованы в системе экспрессии по изобретению. Изобретение также относится к способу экспрессии РНК в клетках хозяина, включающему следующие стадии:(ii) введение экспрессирующегося конструкта со стадии (i) в клетки-хозяева, где клетки-хозяева принадлежат другому таксономическому подразделению, чем первый организм. В следующем варианте осуществления изобретение относится к способу продуцирования рекомбинантного вируса, в котором вирус продуцируется с помощью клеток-хозяев по изобретению. Изобретение также относится к способу получения вируса (например, для составления в форме вакцины), включающему следующие стадии:(i) продуцирование рекомбинантного вируса с помощью клеток хозяина по изобретению;(ii) инфицирование культуры клеток-хозяев вирусом, полученным на стадии (i);(iii) культивирование культуры хозяина со стадии (ii), чтобы продуцировать вирус; и(iv) очистка вируса, полученного на стадии (iii). Чтобы обеспечить способ получения вакцины, способ может также включать дополнительную стадию (v) получения вакцины из вируса. В дополнение к неэндогенному промотору (промоторам) pol I, который интродуцирован, как обсуждено выше, клетки-хозяева включают эндогенные промоторы pol I. Неэндогенный промотор (промоторы) pol I управляет (управляют) экспрессией неэндогенной РНК, в частности вирусной РНК, в клетке. Изобретение, таким образом, предоставляет клетку, имеющую по меньшей мере один эндогенный промотор pol I, который контролирует экспрессию эндогенной рРНК, и по меньшей мере один неэндогенный промотор pol I, который контролирует экспрессию вирусной РНК или их комплекса. Изобретение также относится к конструкту для экспрессии ДНК, кодирующему как мРНК, кодирующую белок, так и вирусную РНК, в котором (i) частота использования кодона в ДНК, кодирующей белок мРНК, оптимизирована для клеток собаки и (ii) вирусная РНК находится под контролем промотораpol I приматов. Клетки собаки являются идеальными клетками MDCK, а идеальным промотором приматов является промотор pol I человека. Экспрессия мРНК, кодирующей белок, может находиться под кон-1 021009 тролем промотора pol II, оптимизированного для клеток собаки. Экспрессирующиеся конструкты. Авторы настоящего изобретения с удивлением обнаружили, что можно запустить экспрессию РНК в клетках с помощью промотора pol I из организма, который принадлежит к другому таксономическому подразделению, чем эти клетки. Таким образом, промотор pol I не является эндогенным для организма из того же таксономического подразделения, из которого происходят клетки. Термин "подразделение" относится к общепринятому таксономическому ранжированию, а примерами подразделений являются приматы, грызуны, хищные, сумчатые, китообразные и т.д. Человек и шимпанзе входят в одно и то же таксономическое подразделение (приматы), а человек и собака входят в разные подразделения (соответственно приматы и хищные). Таким образом, в первом аспекте изобретение относится к клеткам-хозяевам, содержащим один или более конструкт (конструктов), в которых экспрессия молекулы РНК из конструкта (конструктов) управляется промотором pol I, который не является эндогенным для таксономического подразделения клеткихозяина. В одном из вариантов осуществления клетки-хозяева являются клетками, не принадлежащими приматам, а промотор pol I является промотором pol I приматов. В конкретном варианте осуществления клетки-хозяева не являются клетками приматов, а промотором является промотор человека. В еще одном варианте осуществления клетки-хозяева не являются клетками человека, а промотор pol I является промотором pol I человека. В альтернативном варианте осуществления промотор pol I не является промотором pol I собаки, а клетки-хозяева являются клетками собаки. В предпочтительном варианте осуществления клетки-хозяева являются клетками собаки, а промотором является промотор pol I приматов. В еще одном предпочтительном варианте осуществления промотор pol I является промотором человека, а клетки-хозяева являются клетками собаки (такими как клетки MDCK). Этот вариант осуществления является предпочтительным, поскольку промотор pol I человека хорошо охарактеризован, а клетки собаки часто используются для получения вакцин. Экспрессирующиеся конструкты, используемые в клетках-хозяевах, могут быть конструктами, экспрессирующимися в одном или двух направлениях. Там, где клетки-хозяева экспрессируют более чем один трансген (с одного или разных экспрессирующихся конструктов), можно использовать однонаправленную и/или двунаправленную экспрессию. Конструкты двунаправленной экспрессии содержат по меньшей мере два промотора, которые управляют экспрессией в различных направлениях (т.е. как от 5' к 3', так и от 3' к 5') от одного и того же конструкта. По меньшей мере один из промоторов является неэндогенным промотором pol I, как обсуждено выше. Два промотора могут быть функционально связаны с различными цепями одной и той же двухцепочечной ДНК. Предпочтительно один из промоторов является неэндогенным промотором pol I и по меньшей мере один из других промоторов является промотором pol II. Это является выгодным, поскольку промотор pol I может быть использован для экспрессирования некэппированных кРНК, тогда как промотор pol II может быть использован для транскрипции мРНК, которые затем могут быть транслированы в белки, таким образом, позволяя одновременную экспрессию РНК и белка из одного и того же конструкта. Промотор pol II может быть эндогенным или неэндогенным. В тех случаях, когда используется более чем один экспрессирующийся конструкт в системе экспрессии, промоторы могут представлять собой смесь эндогенных и неэндогенных промоторов при условии, что по меньшей мере один из промоторов является неэндогенным промотором pol I, который может управлять экспрессией в клеткаххозяевах. Экспрессирующийся конструкт обычно включает последовательность, терминирующую транскрипцию РНК. Терминирующая последовательность может представлять собой эндогенную терминирующую последовательность или терминирующую последовательность, которая не является эндогенной для клетокхозяев. Подходящие терминирующие последовательности очевидны для специалистов в данной области техники и включают, но не ограничиваются ими, последовательность, терминирующую транскрипцию РНК-полимеразы I, последовательность, терминирующую транскрипцию РНК-полимеразы II, и рибозимы. Кроме того, экспрессирующиеся конструкты могут содержать один или более сигналов полиаденилирования мРНК, в частности, в конце гена, чья экспрессия контролируется промотором pol II. Система экспрессии может содержать по меньшей мере два, по меньшей мере три, по меньшей мере четыре, по меньшей мере пять, по меньшей мере шесть, по меньшей мере семь, по меньшей мере восемь,по меньшей мере девять, по меньшей мере десять, по меньшей мере одиннадцать, по меньшей мере двенадцать экспрессирующихся конструктов. Экспрессирующийся конструкт может представлять собой вектор, такой как плазмида, или другой эписомный конструкт. Такие векторы обычно содержат по меньшей мере одну бактериальную и/или эукариотическую точку начала репликации. Кроме того, вектор может содержать селектируемый маркер,который позволяет отбор в прокариотических и/или эукариотических клетках. Примерами таких селектируемых маркеров являются гены, несущие резистентность к антибиотикам, таким как ампициллин или канамицин. Вектор может также содержать один или более сайтов множественного клонирования для облегчения клонирования последовательности ДНК. В качестве альтернативы экспрессирующийся конструкт может представлять собой линейный экспрессирующийся конструкт. Такие линейные экспрессирующиеся конструкты обычно не содержат каких-либо амплифицирующих и/или селектируемых последовательностей. Однако линейные конструкты,содержащие такие амплифицирующие и/или селектируемые последовательности, также входят в объем настоящего изобретения. Пример способа, в котором используют такие линейные экспрессирующиеся конструкты для экспрессии вируса гриппа, описан в ссылке [4]. Экспрессирующиеся конструкты по изобретению могут быть образованы с использованием способов, известных в данной области техники. Такие способы были описаны, например, в ссылке [5]. В тех случаях, когда экспрессирующийся конструкт представляет собой линейный экспрессирующийся конструкт, можно линеаризовать его перед введением в клетки-хозяева, используя единственный сайт фермента рестрикции. В качестве альтернативы можно вырезать экспрессирующийся конструкт из вектора, используя по меньшей мере два сайта фермента рестрикции. Кроме того, также можно получить линейный экспрессирующийся конструкт путем его амплификации с использованием технологии амплификации нуклеиновой кислоты (например, с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР. Экспрессирующиеся конструкты по изобретению могут быть введены в клетки-хозяева с использованием любой технологии, известной специалистам в данной области техники. Например, экспрессирующиеся конструкты по изобретению могут быть введены в клетки-хозяева с использованием электропорации, DEAE-декстрана, преципитации фосфата кальция, липосом, микроинъекции или бомбардировки микрочастицами. Когда местом экспрессии являются клетки собаки, такие как клеточная линия MDCK, участки, кодирующие белок, могут быть оптимизированы для экспрессии в клетках собаки, например, с использованием промотора из гена дикого типа собаки или из вируса собаки и/или имеющего частоту использования кодона, более подходящую для клеток собаки, чем для клеток человека. Например, тогда как в генах человека UUC несколько предпочтителен в качестве кодона для фенилаланина (Phe) (54%), в клетках собаки это предпочтение более сильно (59%). Аналогично, тогда как предпочтительность для кодонов изолейцина (Ile) в клетках человека отсутствует, 53% кодонов собаки используют AUC для Ile. Вирусы собаки, такие как парвовирус собаки (вирус, содержащий ssDNA (одноцепочечную ДНК, оцДНК, могут также обеспечить направление оптимизации кодона, например 95% кодонов Phe в последовательностях парвовируса собаки представлены UUU (против 41% в геноме собаки), 68% кодонов Ile представлены(Pro) представлены ССА (против 25%), 87% кодонов тирозина (Tyr) представлены UAU (против 40%),87% кодонов гистидина (His) представлены CAU (против 39%), 92% кодонов глутамина (Gln) представлены САА (против 25%), 81% кодонов глутаминовой кислоты (Glu) представлены GAA (против 40%),94% кодонов цистеина (Cys) представлены UGU (против 42%), только 1% кодонов серина (Ser) представлены UCU (против 24%), ССС никогда не используется для кодирования Phe, a UAG никогда не используется как стоп-кодон. Таким образом, гены, кодирующие белки, могут быть созданы более похожими на гены, которые естественным образом уже оптимизированы для экспрессии в клетках собаки,облегчая, таким образом, экспрессию. Обратная генетика. Экспрессирующиеся конструкты и клетки-хозяева, описанные выше, особенно пригодны для продуцирования штаммов рекомбинантного вируса по технологиям обратной генетики. Эти технологии могут быть использованы для продуцирования широкого разнообразия РНК-содержащих вирусов, включающих вирусы, содержащие положительную цепь РНК [6, 7], вирусы, содержащие отрицательную цепь РНК [8, 9], и вирусы, содержащие двухцепочечную РНК [10]. Таким образом, еще в одном аспекте настоящее изобретение относится к способу продуцирования рекомбинантного вируса, в котором вирус продуцируется с использованием системы экспрессии, описанной выше. Известные системы обратной генетики задействуют экспрессию молекул ДНК, которые кодируют желаемые молекулы вирусной РНК (vPHK), с промотора pol I, бактериальных промоторов РНКполимеразы, промоторов полимеразы бактериофага и т.д. Кроме того, в тех случаях, когда вирусу требуются определенные белки для образования вируса инфекции, системы также предоставляют такие белки, например, система также содержит молекулы ДНК, которые кодируют вирусные белки, так что экспрессия обоих типов ДНК приводит к сборке полного вируса инфекции. В тех случаях, когда обратную генетику используют для экспрессии vPHK, специалистам в данной области техники должно быть очевидно, что точное пространственное расположение элементов последовательности по отношению друг к другу является ключевым для того, чтобы полимераза инициировала репликацию. Именно поэтому важно, чтобы молекула ДНК, кодирующая вирусную РНК, правильно располагалась между промотором pol I и терминирующей последовательностью, однако такое позиционирование находится вполне в пределах возможностей специалистов, работающих с системами обратной генетики. В целом, обратная генетика пригодна для экспрессии любых вирусов, о которых известно, что для их жизненного цикла требуется продукция геномной РНК. Такие вирусы включают, но не ограничива-3 021009 ются ими, вирусы, содержащие положительную цепь РНК и отрицательную цепь РНК, такие, как описано ниже. Предпочтительно вирусы являются ортомиксовирусами, например вирусом гриппа. Способы по изобретению также пригодны как для несегментированных, так и для сегментированных вирусов. В тех случаях, когда вирус представляет собой вирус, содержащий положительную цепь РНК, этого часто достаточно, чтобы трансфицировать клетку экспрессирующимся конструктом, содержащим вирусный геном. Например, трансфекция плазмид, содержащих геном вируса полиомиелита, приводит к восстановлению инфекционного вируса полиомиелита [6, 7]. Обратная генетика для вирусов, содержащих отрицательную цепь РНК, представляет больше затруднений, поскольку антисмысловая вирусная РНК обычно является неинфицирующей и требует РНК-полимеразы для завершения жизненного цикла. Таким образом, должна быть обеспечена вирусная полимераза либо в виде белка, либо в виде гена для экспрессии белка in situ. В тех случаях, когда вирусу для инфекционности требуется белок, обычно предпочтительными являются двунаправленные экспрессирующиеся конструкты, поскольку это уменьшает общее число экспрессирующихся конструктов, требующихся для клеток-хозяев. Таким образом, в способе по изобретению можно использовать по меньшей мере один двунаправленный экспрессирующийся конструкт, в котором ген или кДНК находятся между расположенным против хода транскрипции промотором pol II и неэндогенным прямым промотором pol I. Транскрипция гена или кДНК от промотора pol II образует кэппированную положительную вирусную мРНК, которая может быть транслирована в белок, тогда как транскрипция от неэндогенного промотора pol I дает отрицательную vPHK. Двунаправленный экспрессирующийся конструкт может представлять собой двунаправленный вектор экспрессии. Чтобы продуцировать рекомбинантный вирус, клетка должна экспрессировать все сегменты вирусного генома, которые необходимы для сборки вириона. ДНК, клонируемая в экспрессирующихся конструктах по изобретению, предпочтительно предоставляет все вирусные РНК и белки, но также возможно использование вируса-помощника для получения некоторых РНК и белков, хотя системы, которые не используют вирус-помощник, являются предпочтительными. В тех случаях, когда вирус представляет собой несегментированный вирус, это может быть достигнуто путем использования одиночного экспрессирующегося конструкта в способе по изобретению, хотя в объем изобретения входит и экспрессия вирусного генома несегментированных вирусов с использованием более чем одного экспрессирующегося конструкта. В тех случаях, когда вирус представляет собой сегментированный вирус, вирусный геном обычно экспрессируется с помощью более чем одного экспрессирующегося конструкта в способе по изобретению. Однако можно также представить себе комбинацию одного или более сегментов или даже всех сегментов вирусного генома на единственном экспрессирующемся конструкте. Способы по изобретению являются особенно подходящими для продукции штаммов реассортантных (химерных) вирусов. Технология позволяет использовать манипуляции с плазмидами in vitro для получения комбинаций сегментов вируса, чтобы облегчить манипуляции с кодирующими и некодирующими последовательностями в сегментах вируса, ввести мутации и т.д. Использование экспрессирующей системы для продукции реассортантных штаммов вируса является предпочтительным, поскольку это может существенно уменьшить время, необходимое для получения реассортантного посевного вируса,что особенно выгодно в ситуациях, когда быстрое получение вакцин требуется для противодействия эпидемии. Таким образом, предпочтительно, чтобы в способе по этому аспекту изобретения использовали один или более экспрессирующихся конструктов, которые экспрессируют вирусные гены по меньшей мере из двух различных штаммов дикого типа или производные от них. В некоторых вариантах осуществления включен также экспрессирующийся конструкт, что приводит к экспрессии вспомогательного (акцессорного) белка в клетках-хозяевах. Например, может быть полезным экспрессировать невирусную сериновую протеазу (например, трипсин) как часть системы обратной генетики. Когда экспрессирующиеся конструкты по изобретению используют для экспрессии сегментов вируса гриппа А, можно генерировать экспрессирующийся конструкт путем введения сегмента вируса гриппа А в экспрессирующийся конструкт, содержащий маркер отрицательного отбора (например, ccdB) и высоко консервативных сайтов терминации транскрипции гена вируса гриппа А [11]. Преимущество этого состоит в том, что не требуется сайтов рестрикции и что любой сегмент вируса гриппа А может быть клонирован при условии, что он имеет сайты терминации транскрипции, которые комплементарны сайтам терминации транскрипции гена на экспрессирующемся конструкте. Клетки. Настоящее изобретение может быть использовано с любыми эукариотическими или прокариотическими клетками, которые могут продуцировать вирус, представляющий интерес. В изобретении обычно используются клеточные линии, хотя, например, первичные клетки могут быть использованы в качестве альтернативы. Клетки обычно представляют собой клетки млекопитающих. Подходящие клетки млекопитающих включают, но не ограничиваются ими, клетки хомячка, крупного рогатого скота, приматов(включая человека и обезьян) и клетки собаки. Могут быть использованы клетки различных типов, такие как клетки почек, фибробласты, клетки сетчатки, клетки легких и т.д. Примерами подходящих клеток хомячка являются клеточные линии, имеющие наименования BHK21 или HKCC. Подходящими клетка-4 021009 ми обезьян являются, например, клетки африканской зелной мартышки, такие как клетки почек, такие как клеточная линия Vero [12-14]. Подходящими клетками собаки являются, например, клетки почек,такие как клеточные линии CLDK и MDCK. Другие подходящие клетки включают, но не ограничиваются ими, СНО; 293 Т; BHK; MRC 5;PER.C6 [15]; FRhL2; WI-38 и т.д. Подходящие клетки широко доступны, например, в американской коллекции типов клеточных культур (American Type Cell Culture (АТСС) collection) [16], в хранилище клетокCoriell Cell Repositories [17] или в европейской коллекции клеточных культур (European Collection of CellCultures (ECACC. Например, АТСС предоставляет множество различных клеток Vero под каталожными номерами CCL 81, CCL 81.2, CRL 1586 и CRL-1587, и она же предоставляет клетки MDCK под каталожным номером CCL 34. PER.C6 доступна в ЕСАСС под депозитарным номером 96022940. Предпочтительными клетками (особенно для выращивания вирусов гриппа) для использования в изобретении являются клетки MDCK [18-20], происходящие из почки собаки Madin Darby. Оригинальные клетки MDCK доступны в АТСС как CCL 34. Предпочтительно, чтобы использовались производные этих клеток или других клеток MDCK. Такие производные описаны, например, в ссылке [18], в которой описаны клетки MDCK, которые адаптированы для роста в суспензионной культуре ("MDCK 33016" или "33016-PF", депонированные как DSM АСС 2219; см. также ссылку [18]). Кроме того, в ссылке [21] описаны клетки, производные от MDCK, которые растут в суспензии в бессывороточной культуре ("В-702", депонированные как FERM ВР-7449). В некоторых вариантах осуществления используемая клеточная линия MDCK может быть онкогенной. Можно также использовать неонкогенные клетки MDCK. Например, в ссылке [22] описаны неонкогенные клетки MDCK, включающие"MDCK-SF103" (АТСС РТА-6503). В ссылке [23] описаны клетки MDCK с высокой восприимчивостью к инфекции, включающие клетки "MDCK.5F1" (АТСС CRL 12042). При осуществлении способов по изобретению возможно использование смеси более чем одного типа клеток. Однако предпочтительно, чтобы способы по изобретению осуществляли с единственным типом клеток, например с моноклональными клетками. Предпочтительно клетки, используемые в способах по изобретению, представляют собой единственную клеточную линию. Кроме того, те же самые клетки могут быть использованы для сохранения вируса и его дальнейшего размножения. Предпочтительно клетки культивируют в отсутствие сыворотки, чтобы устранить обычный источник загрязнений. Различные бессывороточные среды для эукариотических клеток известны специалистам в данной области техники (например, среда Iscove's, среда ultra CHO (BioWhittaker), EX-CELL (JRHBiosciences. Кроме того, может быть использована безбелковая среда (например, PF-CHO (JRH Biosciences. В ином случае клетки для репликации могут также быть культивированы в обычной среде, содержащей сыворотку (например, среда MEM или DMEM с 0,5-10% фетальной телячьей сыворотки). Клетки могут находиться в адгезионной культуре или в суспензии. Скрининг подходящих клеточных линий. Клетки, подходящие для использования в соответствии с настоящим изобретением, широко доступны. Кроме того, с использованием технологий, известных специалистам в данной области техники,можно отобрать другие клетки. Скрининг подходящих клеток может быть необходим, например, в тех случаях, когда идентифицирован новый промотор pol I и когда желательно найти клеточные линии, которые поддерживают экспрессию с новым промотором. Аналогично, в тех случаях, когда выделены новые клетки, может оказаться необходимым подтвердить, какие промоторы pol I могут управлять экспрессией в них. Подходящие технологии скрининга клеток известны специалистам в данной области техники. Например, репортерный ген может быть клонирован под контролем представляющего интерес промотораpol I, а конструкт может быть трансфицирован в клеточную линию, которая должна быть подвергнута скринингу. В таких экспериментах клетки, трансфицированные конструктом, который содержит репортерный ген, но в котором отсутствует последовательность промотора, могут быть использованы в качестве контроля. Таким образом, в тех случаях, когда экспрессия гена в тестируемом образце (например, в клетках, содержащих трансген под контролем представляющего интерес промотора pol I) существенно выше, чем экспрессия в контроле (например, в клетках, содержащих тот же трансген, как в тестируемом образце, но в которых трансген не содержит промотора, управляющего экспрессией трансгена), клеточная линия пригодна для использования с таким промотором по изобретению. Экспрессия трансгена может быть измерена, например, обратной транскрипцией РНК трансгена и проведением ПЦР в реальном времени с полученной кДНК. В качестве альтернативы также можно клонировать репортерный ген (например, GFP, YFP, luc и т.д.) в антисмысловом направлении под контролем промотора pol I. Транскрипт с такого конструкта может быть затем транскрибирован в мРНК вирусной полимеразой и затем транслирован в белок. Таким образом, любые клетки, которые экспрессируют репортерный ген, могут быть легко идентифицированы по присутствию продукта репортерного гена. Также можно адаптировать клетки, в которых чужеродный pol I не может нормально управлять экспрессией, чтобы получить клетки, в которых промотор pol I может управлять экспрессией. Этого можно добиться, например создавая клеткам условия для роста, которые обычно не являются подходя-5 021009 щими для них. Например, клеточная линия, которая обычно растет только как адгезионная, может искусственно содержаться в суспензии, и клетки, которые продолжают расти в таких условиях, могут размножаться дальше. В качестве альтернативы можно адгезионно культивировать клетки, которые обычно растут в суспензии, например, используя пластиковые культуральные сосуды с высокой связывающей способностью или добавляя в культуру сыворотку. Аналогично, можно выращивать клетки, которым обычно необходима сыворотка для своего роста, в бессывороточных условиях или, наоборот, воздействовать сывороткой на клетки, которые адаптированы к бессывороточному росту. Затем отобранные клетки могут быть испытаны на активность промотора pol I, как описано выше. Другие подходящие параметры роста, которые могут быть изменены таким образом, очевидны для специалистов в данной области техники и включают, но не ограничиваются ими, температуру, рН, рО 2, концентрацию сыворотки и т.д. Кроме того, клетки могут быть подвергнуты физической или химической обработке, например ультрафиолетовым облучением или химическими мутагенами. Аналогичным образом, можно проверить на новые свойства клетки, которые были просто пассированы в нормальных условиях культивирования. Например, в ссылке [18] описан способ, в котором клетки MDCK (обычно адгезионные) были адаптированы к росту в суспензии в бессывороточных условиях. Исходные клетки культивировали в бессывороточной среде в роллерных бутылках в условиях, которые обычно используют для культивирования клеток, которые растут в суспензии. После нескольких пассажей в этих селективных условиях было получено несколько клеточных линий, которые могли расти в суспензии в бессывороточной среде. Одним из примеров является клеточная линия 33016 (депонированная как DSM АСС 2219). Авторы изобретения продемонстрировали, что промотор pol I человека может управлять экспрессией репортерного гена в этих клетках MDCK. Промоторы РНК-полимеразы I. В большинстве способов обратной генетики используют экспрессию векторов, которые содержат промотор РНК-полимеразы I (РНК pol I) для управления транскрипцией вирусной геномной РНК. Промотор pol I дает транскрипт с немодифицированными 5'- и 3'-концами, которые необходимы для полной инфекционности многих вирусов, например гриппа. Природные промоторы pol I состоят из двух частей, имея два отдельных участка: основной коровый промотор и вышележащий элемент промотора (UPE). Хотя такая обычная организация является общей для промоторов pol I большинства видов, однако конкретные последовательности промоторов широко варьируют. Коровый промотор окружает стартовую точку транскрипции, простираясь от приблизительно-45 до +20, и важен для инициации транскрипции. Коровый промотор, как правило, обогащен GC. Хотя коровый промотор сам по себе важен для инициации транскрипции, эффективность промотора сильно повышается элементом UPE. UPE обычно простирается от приблизительно -180 до -107 и также обогащен GC. Активность промотора может быть дополнительно усилена в присутствии дистальных энхансероподобных последовательностей, которые действуют, стабилизируя преинициирующий комплекс. Последовательность промотора pol I была идентифицирована в различных видах, включая человека, собаку и курицу. В изобретении используют промотор pol I, который является неэндогенным для организма из таксономического подразделения, к которому принадлежат клетки-хозяева. Термины "эндогенный" и "неэндогенный", таким образом, используются в отношении клеток-хозяев и промотора pol I,который присутствует в экспрессирующемся конструкте. Межвидовая вариация последовательности промоторов pol I означает, что легко определить, является ли конкретный промотор pol I эндогенным или неэндогенным для клетки. Таким образом, в изобретении можно использовать промотор pol I человека, собаки или курицы для экспрессии РНК в клетках-хозяевах, которые не происходят из того же таксономического подразделения, что и промотор pol I (например, промотор pol I приматов в клеткаххозяевах собаки). Сравнение последовательностей либо in silico, либо в эксперименте может быть использовано для подтверждения того, из какого организма происходит конкретный промотор pol I, например, на фиг. 10 показано выравнивание промоторов pol собаки и человека до сайта начала транскрипции с идентичностью последовательностей 60%. Экспрессирующиеся конструкты по изобретению включают по меньшей мере один коровый промотор; предпочтительно они также включают по меньшей мере один UPE, и они также могут включать один или более энхансерных элементов. Также возможно использование фрагментов природных промоторов при условии, что эти фрагменты могут инициировать транскрипцию. Например, на фиг. 3 показаны последовательность полноразмерного промотора pol I собаки (SEQ ID NO:3) и различные фрагменты,которые достаточны для управления экспрессией трансгена (см. также фиг. 4 и SEQ ID NO:4 и 5). Кроме того, на фиг. 2 показаны последовательность промотора pol I человека (SEQ ID NO:1) и его фрагменты,которые сами по себе достаточны для экспрессии трансгена в клетках-хозяевах (см. также фиг. 5 иSEQ ID NO:2). Промотор pol I человека, который может быть использован по изобретению, может содержать последовательность SEQ ID NO:1 или SEQ ID NO:2 или их варианты. В тех случаях, когда по изобретению используют промотор собаки, он может содержать последовательность SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4 или Промотор pol I может содержать (i) последовательность, имеющую по меньшей мере р% идентичности последовательности по отношению к любой из последовательностей SEQ ID NO:1-5, и/или(ii) фрагмент любой из последовательностей SEQ ID NO:1-5 при условии, что промотор способен инициировать и управлять транскрипцией функционально связанной последовательности, кодирующей РНК в клетках-хозяевах, представляющих интерес. Значение р может составлять 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98,99% или более. Фрагмент может сам по себе быть достаточной длины, чтобы управлять экспрессией (например, SEQ ID NO:4 представляет собой фрагмент SEQ ID NO:3), или фрагмент может быть присоединен к другим последовательностям, и эта комбинация будет управлять экспрессией. Способность таких промоторов pol I управлять экспрессией в клетках-хозяевах, представляющих интерес, может быть легко оценена, например, с использованием описанного выше анализа с помощью антисмыслового репортерного гена под контролем промотора. Получение вируса. В другом аспекте изобретение относится к способу получения вируса для производства вакцины,включающему следующие стадии:(ii) инфицирование культуры клеток-хозяев вирусом, полученным на стадии (i);(iv) очистка вируса, полученного на стадии (iii); и (необязательно)(v) составление вакцины из вируса. Когда клетки используются как культура-хозяин по этому аспекту изобретения, известно, что условия клеточной культуры (например, температура, клеточная плотность, значение рН и т.д.) вариабельны в широком диапазоне в зависимости от клеточной линии и используемого вируса и могут быть адаптированы к требованиям данной заявки. Нижеследующая информация, следовательно, просто представляет основные положения. Как упоминалось выше, клетки предпочтительно культивируют в бессывороточной или безбелковой среде. Размножение клеток может быть проведено в соответствии со способами, известными специалистам в данной области техники. Например, клетки можно культивировать в перфузионной системе с использованием обычных способов ее поддержания, таких как центрифугирование или фильтрация. Кроме того, перед инфицированием клетки могут быть размножены по изобретению в подпитываемой системе. В контексте изобретения культуральная система определяется как подпитываемая система, в которой клетки исходно культивируются в периодической системе, а истощение питательных веществ (или части питательных веществ) в среде компенсируется путем контролируемой подачи концентрированных питательных веществ. Может быть полезным устанавливать значение рН среды в ходе размножения клеток перед инфицированием на уровне от 6,6 до 7,8, а особенно от значений 7,2 до 7,3. Культивирование клеток предпочтительно происходит при температуре от 30 до 40 С. На стадии (iii) клетки предпочтительно культивируются при температуре от 30 до 36 С, или от 32 до 34 С, или при 33 С. Это особенно предпочтительно, когда способ по изобретению используют для продуцирования вируса гриппа, поскольку показано, что инкубация инфицированных клеток в таком температурном диапазоне приводит к продукции вируса, который приводит к повышенной эффективности при составлении из него вакцины [24]. Парциальное давление кислорода может быть установлено в ходе культивирования перед инфицированием предпочтительно на уровне от 25 до 95% и особенно от 35 до 60%. Значения парциального давления кислорода, установленное в контексте изобретения, основано на насыщении воздуха. Инфицирование клеток происходит при плотности клеток предпочтительно приблизительно 8-25105 клеток/мл в периодической системе или предпочтительно приблизительно 5-20106 клеток/мл в перфузионной системе. Клетки могут быть инфицированы дозой вируса (величина MOI, "множественность заражения"; соответствует количеству вирусных единиц на клетку в момент инфицирования) от 10-8 до 10, предпочтительно от 0,0001 до 0,5. Вирус может быть выращен на клетках в адгезионной культуре или в суспензии. Могут быть использованы культуры на микроносителях. В некоторых вариантах осуществления клетки могут быть,таким образом, адаптированы для роста в суспензии. Способы по изобретению также включают сбор и выделение вирусов или белков, производимых с их использованием. В ходе выделения вирусов или белков клетки выделяют из культуральной среды стандартными способами, такими как сепарация, фильтрация или ультрафильтрация. Вирусы или белки затем концентрируют способами, достаточно известными специалистам в данной области техники, такими как градиентное центрифугирование, фильтрация, преципитация, хроматография и т.д., а затем очищают. По изобретению также предпочтительно, чтобы вирусы инактивировались в ходе очистки или после очистки. Инактивация вируса может происходить, например, с помощью -пропиолактона или формальдегида в любой момент процесса очистки. Вирусы, выделенные на стадии (i), могут также быть выращены в яйцах на стадии (ii). В современном стандартном способе выращивания вируса гриппа для вакцин используют содержащие зародыши куриные яйца SPF, а вирус очищают от содержимого яйца (аллантоисной жидкости). Также можно пассировать вирус через яйцо, а затем размножить в клеточной культуре. Вирусы. Способы по изобретению могут использоваться с любым вирусом, который может быть экспрессирован в клетке с помощью обратной генетики. Такие вирусы могут быть сегментированными или несегментированными. Кроме того, вирус может быть вирусом, содержащим положительную цепь РНК, или вирусом, содержащим отрицательную цепь РНК. В других вариантах осуществления вирус также может быть вирусом, содержащим двухцепочечную вирусную РНК. В тех случаях, когда вирус представляет собой вирус, содержащий отрицательную цепь РНК, вирус может принадлежать семейству, выбранному из группы, состоящей из Paramyxoviridae, Pneumovirinae,Rhabdoviridae, Filoviridae, Bornaviridae, Orthomyxoviridae, Bunyaviridae или Arenaviridae. Кроме того, вирус может быть вирусом из рода, выбранного из группы, состоящей из Paramyxovirus, Orthomyxovirus,Respirovirus, Morbillivirus, Rubulavirus, Henipavirus, Avulavirus, Pneumovirus, Metapneumovirus,Vesiculovirus, Lyssavirus, Ephemerovirus, Cytorhabdovirus, Nucleorhabdovirus, Novirhabdovirus,Marburgvirus, Ebolavirus, Bornavirus, Influenzavirus A, Influenzavirus B, Influenzavirus C, Thogotovirus,Isavirus, Orthobunyavirus, Hantavirus, Nairovirus, Phlebovirus, Tospovirus, Arenavirus, Ophiovirus, Tenuivirus или Deltavirus. В конкретных вариантах осуществления вирус, содержащий отрицательную цепь РНК, выбран из группы, состоящей из вируса Сендай, вируса кори, вируса эпидемического паротита (свинки), вируса Хендра, вируса псевдочумы птиц, респираторно-синцитиального вируса человека, птичьего легочного вируса, вируса везикулярного стоматита (лихорадка Индианы), вируса бешенства (рабиес), рабдовируса коров, вируса некротического пожелтения салата-латука, вируса желтой карликовости картофеля, вируса инфекционного некроза гемопоэтической ткани лососевых, вируса марбургской геморрагической лихорадки, заирского вируса Эбола, вируса болезни Борна, вируса гриппа, вируса Тогото, вируса инфекционной анемии лососевых, вируса Буньямвера, вируса Хантаан (корейской геморрагической лихорадки),вируса Дугбе, вируса лихорадки долины Рифт, вируса бронзовости томата, вируса лимфатического хориоменингита, вируса псорозиса цитрусовых, вируса полосатости риса и вируса гепатита дельта (гепатита D). В предпочтительных вариантах осуществления вирус представляет собой вирус гриппа (см. ниже). В тех случаях, когда вирус является вирусом, содержащим положительную цепь РНК, вирус может быть из семейства, выбранного из группы, состоящей из Arteriviridae, Coronaviridae, Picornaviridae иRoniviridae. Кроме того, вирус может быть из рода, выбранного из группы, состоящей из Arterivirius,Coronavirus, Enterovirus, Torovirus, Okavirus, Rhinovirus, Hepatovirus, Cardiovirus, Aphthovirus,Parechovirus, Erbovirus, Kobuvirus и Teschovirus. В конкретных вариантах осуществления вирус выбран из группы, состоящей из вируса атипичной пневмонии (SARS), вируса полиомиелита, энтеровируса А человека (HEV-A), энтеровируса В человека (HEV-В), энтеровируса С человека, энтеровируса D человека, гепатита А и риновирусов А и В человека. В тех случаях, когда вирус является вирусом, содержащим двухцепочечную РНК, вирус может быть из семейства, выбранного из группы, состоящей из Birnaviridae, Cystoviridae, Hypoviridae, Partitiviridae,Reoviridae и Totiviridae. Кроме того, вирус может быть вирусом из рода, выбранного их группы, состоящей из Aquabirnavirus, Avibirnavirus, Entomobirnavirus, Cystovirus, Partitivirus, Alphacryptovirus,Betacryptovirus, Aquareovirus, Coltivirus, Cypovirus, Fijivirus, Idnoreovirus, Mycoreovirus, Orbivirus,Orthoreovirus, Oryzavirus, Phytoreovirus, Rotavirus и Seadornavirus. Настоящее изобретение является особенно подходящим для вирусов, которые претерпевают быструю мутацию и в которых рекомбинантный подход позволяет более быстрое выделение вируса, который затем дополнительно размножается для получения подходящих вакцин. Поэтому в предпочтительном варианте вирус представляет собой вирус гриппа. Вирусы гриппа. Вирусы гриппа являются особенно подходящими для использования в способах по изобретению,особенно вирусы гриппа А и вирусы гриппа В, поскольку обратная генетика для этого вируса хорошо охарактеризована. Вирусы гриппа являются сегментированными вирусами с отрицательной цепью РНК. Вирусы гриппа А и В имеют восемь сегментов, тогда как вирус гриппа С имеет семь сегментов. Вирусу требуются по меньшей мере четыре вирусных белка (РВ 1, РВ 2, РА и нуклеопротеин) для инициации репликации и транскрипции. Обратная генетика для вирусов гриппа А и В может использоваться с 12 плазмидами для экспрессии четырех необходимых белков и всех восьми сегментов генома. Чтобы уменьшить количество конструктов, однако, множество кассет транскрипции РНК-полимеразы I (для синтеза вирусной РНК) может быть включено в единственную плазмиду (например, последовательности, кодирующие 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 или все 8 сегментов vPHK гриппа) и множество участков, кодирующих белки с промоторами РНКполимеразы II на другой плазмиде (например, последовательности, кодирующие транскрипты 1, 2, 3, 4,5, б, 7 или 8 мРНК гриппа) [25]. Также можно включить один или более сегментов vPHK гриппа под контролем промотора pol I и один или более участков, кодирующих белки гриппа под контролем другого промотора, в частности промотора pol II, на той же плазмиде. Как описано выше, это предпочтительно делать с использованием двунаправленных плазмид. Предпочтительные аспекты способа по ссылке [25] включают (а) участки, кодирующие мРНК PB1, PB2 и РА в единственной плазмиде; и (b) все 8 кодирующих сегментов vPHK в единственной плазмиде. Включение сегментов нейраминидазы (NA) и гемагглютинина (HA) в одну плазмиду, а шесть других сегментов в другую плазмиду является особенно предпочтительным, поскольку новообразованные штаммы вируса гриппа обычно имеют мутации в сегментах NA и/или HA. Следовательно, в этом варианте осуществления только вектор, содержащий последовательности HA и NA, должен быть заменен. Предпочтительные системы экспрессии для вирусов гриппа А кодируют сегменты генома из множества различных штаммов дикого типа. Система может кодировать 1 или более (например, 1, 2, 3, 4, 5 или 6) сегментов генома из штамма PR/8/34 (A/Puerto Rico/8/34), но обычно он/они не включают сегментPR/8/34 HA и обычно не включают сегмент PR/8/34 NA. Таким образом, система может кодировать по меньшей мере один из сегментов NP, M, NS, PA, PB1 и/или РВ 2 (возможно все шесть) из PR/8/34. Другие пригодные системы экспрессии вирусов гриппа А могут кодировать 1 или более (например,1, 2, 3, 4, 5 или 6) сегментов генома из вируса гриппа АА/6/60 (A/Ann Arbor/6/60), но обычно он/они не включают сегмент АА/6/60 HA и обычно не включают сегмент АА/6/60 NA. Таким образом, система может кодировать по меньшей мере один из сегментов NP, M, NS, PA, PB1 и/или РВ 2 (возможно все шесть) из АА/6/60. Система может кодировать 1 или более сегментов генома из штамма A/California/4/09, например сегмент HA и/или сегмент NA. Таким образом, например, сегмент гена HA может кодировать гемагглютинин HI, который более близко связан с SEQ ID NO:6, чем с SEQ ID NO:7 (т.е. имеет более высокую степень идентичности по сравнению с SEQ ID NO:6, чем с SEQ ID NO:7, при использовании тех же самых алгоритма и параметров). SEQ ID NO:6 и 7 идентичны на 80%. Аналогично, ген NA может кодировать нейраминидазу N1, которая более близко связана с SEQ ID NO:8, чем с SEQ ID NO:9. SEQ ID NO:8 и 9 идентичны на 82%. Системы экспрессии вирусов гриппа В могут кодировать сегменты генома, происходящие из множества различных штаммов дикого типа. Система может кодировать 1 или более (например, 1, 2, 3, 4, 5 или 6) сегментов генома из вируса гриппа АА/1/66 (B/Ann Arbor/1/66), но обычно он/они не включают сегмент АА/1/66 HA и обычно не включают сегмент АА/1/66 NA. Таким образом, система может кодировать по меньшей мере один из сегментов NP, M, NS, PA, PB1 и/или РВ 2 из АА/1/66. Вирусные сегменты и последовательности из штаммов A/PR/8/34, АА/6/60, АА/1/66, A/Chile/1/83 иA/California/04/09 широко доступны. Их последовательности доступны в публичных базах данных, например GI:89779337, GI:89779334, GI:89779332, GI:89779320, GI:89779327, GI:89779325, GI:89779322,GI:89779329. Система обратной генетики для вируса гриппа может включать экспрессирующийся конструкт, который приводит к экспрессии вспомогательного (акцессорного) белка в клетках-хозяевах. Например,может быть полезным экспрессировать невирусную сериновую протеазу (например, трипсин). Вакцина. В способе по третьему аспекту изобретения используют вирус, продуцированный по способу производства вакцин. Вакцины (в частности, к вирусу гриппа) в целом основаны либо на живом вирусе, либо на инактивированном вирусе. Инактивированные вакцины могут быть основаны на полных вирионах, "расщепленных" вирионах или на очищенных поверхностных антигенах. Антигены также могут быть представлены в форме виросом. Изобретение может быть использовано для получения любого типа вакцин. В тех случаях, когда используют инактивированный вирус, вакцина может содержать полный вирион, расщепленный вирион или очищенные поверхностные антигены (для гриппа, включая гемагглютинин и, обычно, также включая нейраминидазу). Химические средства для инактивации вируса включают обработку эффективным количеством одного или более следующих агентов: детергентов, формальдегида, -пропиолактона, метиленового синего, псоралена, карбоксифуллерена (С 60), двухатомного этиламина, ацетилэтиленимина или их комбинаций. Нехимические способы инактивации вирусов известны в данной области техники, такие как, например, ультрафиолетовое излучение или гамма-излучение. Вирионы могут быть собраны из жидкостей, содержащих вирус, например, аллантоисной жидкости или супернатанта клеточной культуры различными способами. Например, процесс очистки может задействовать зональное центрифугирование в растворе с линейным градиентом сахарозы, который включает детергент для разрушения вирионов. Антигены могут быть затем очищены после разбавления, если оно необходимо, путем диафильтрации. Расщепленные вирионы получают обработкой очищенных вирионов детергентами (например, этиловым эфиром, полисорбатом 80, дезоксихолатом, три-N-бутилфосфатом, Triton X-100, Triton N101,бромидом цетилтриметиламмония, Tergitol NP9 и т.д.) для получения субвирионных препаратов, включая "Tween-эфирный" процесс расщепления. Способы расщепления вирусов гриппа, например, хорошо известны в данной области техники, см., например, ссылки [26-31] и т.д. Расщепление вируса обычно проводят путем разрушения или фрагментации целого вируса, инфекционного или неинфекционного,разрушающими концентрациями расщепляющего агента. Разрушение приводит к полной или частичной солюбилизации вирусных белков, нарушающей целостность вируса. Предпочтительными расщепляющими агентами являются неионные и ионные (например, катионные) поверхностно-активные вещества,например алкилгликозиды, алкилтиогликозиды, ацилированные сахара, сульфобетаины, бетаины, полиоксиэтиленалкиловые эфиры, N,N-диалкилглюкамиды, Hecameg, алкилфеноксиполиэтоксиэтанолы, NP9,четвертичные аммонийные соединения, саркозил, СТАВ (бромиды цетилтриметиламмония),три-N-бутилфосфат, Cetavlon, соли миристилтриметиламмония, липофектин, липофектамин и DOT-MA,октил- или нонилфеноксиполиоксиэтанолы (например, поверхностно-активные вещества Triton, такие как Triton X-100 или Triton N101), сложные эфиры полиоксиэтиленсорбитана (поверхностно-активные вещества Tween), полиоксиэтиленовые эфиры, полиоксиэтиленовые сложные эфиры и т.д. В одной из пригодных процедур расщепления используют последовательные эффекты дезоксихолата натрия и формальдегида, и расщепление может иметь место в ходе первичной очистки вириона (например, в растворе с градиентом плотности сахарозы). Таким образом, процесс расщепления может включать осветление вирион-содержащего материала (чтобы удалить невирионный материал), концентрирование собранных вирионов (например, с использованием способа адсорбции, такого как адсорбция CaHPO4), разделение целых вирионов и невирионного материала, расщепление вирионов с использованием расщепляющего агента на стадии центрифугирования в градиенте плотности (например, с использованием градиента сахарозы, которая содержит расщепляющий агент, такой как дезоксихолат натрия), а затем фильтрацию(например, ультрафильтрацию) для удаления нежелательных материалов. Может быть полезным ресуспендировать расщепленные вирионы в изотоническом растворе хлорида натрия, забуференном фосфатом натрия. Примерами расщепленных вакцин против гриппа являются продукты BEGRIVAC,FLUARIX, FLUZONE и FLUSHIELD. Способ по изобретению может быть также использован для получения живых вакцин. Такие вакцины обычно получают путем очистки вирионов из жидкостей, содержащих вирионы. Например, жидкости могут быть осветлены центрифугированием и стабилизированы буфером (например, содержащим сахарозу, фосфат калия и глутамат натрия). В настоящее время доступны различные формы вакцины против вируса гриппа (например, см. главы 17 и 18 ссылки [32]). Живые вирусные вакцины включают продуктMedImmune's FLUMIST (трехвалентная живая вирусная вакцина). Вакцины из очищенных поверхностных антигенов вируса гриппа содержат поверхностные антигены гемагглютинина и обычно также нейраминидазы. Процессы получения этих белков в очищенной форме хорошо известны в данной области техники. Продукты FLUVIRIN, AGRIPPAL иINFLUVAC представляют собой вакцины из субъединиц гриппа. Еще одной формой инактивированного антигена является виросома [33] (не содержащие нуклеиновой кислоты вирусоподобные липосомные частицы). Виросомы могут быть получены путем солюбилизации вируса детергентом с последующим удалением нуклеокапсида и восстановлением мембраны, содержащей вирусные гликопротеины. Альтернативный способ получения виросом включает добавление гликопротеинов мембраны вирусов к избыточному количеству фосфолипидов с получением липосом с вирусными белками в их мембране. Вирус может быть аттенуирован. Вирус может быть термочувствительным. Вирус может быть адаптирован к холоду. Эти три черты особенно полезны при использовании живого вируса в качестве антигена.HA является главным иммуногеном в современных инактивированных вакцинах против гриппа, и дозы вакцины стандартизованы по отношению к уровню HA, обычно измеренному путем простой одномерной радиальной иммунодиффузии (SRID). Существующие вакцины обычно содержат приблизительно 15 мкг HA на штамм, хотя могут быть использованы более низкие дозы, например, для детей или в ситуации пандемии, или при использовании адъюванта. Использовали дробные дозы, такие как 1/2 (например, 7,5 мкг HA на штамм), 1/4 и 1/8, как и более высокие дозы (например, дозы 3 или 9 [34, 35]). Таким образом, вакцины могут содержать от 0,1 до 150 мкг HA на штамм гриппа, предпочтительно от 0,1 до 50 мкг, например 0,1-20 мкг, 0,1-15 мкг, 0,1-10 мкг, 0,1-7,5 мкг, 0,5-5 мкг и т.д. Конкретные дозы содержат, например, приблизительно 45, приблизительно 30, приблизительно 15, приблизительно 10,приблизительно 7,5, приблизительно 5, приблизительно 3,8, приблизительно 3,75, приблизительно 1,9,приблизительно 1,5 и т.д. на штамм. Для живых вакцин дозировку измеряют по медианной инфицирующей дозе клеточной культуры(TCID50), а не по содержанию HA, и TCID50 обычно составляет от 106 до 108 (предпочтительно 106,5-107,5) на штамм. Штаммы гриппа, использованные в изобретении, могут иметь природный HA, как обнаружено в вирусе дикого типа, или модифицированный HA. Например, известно, что необходимо модифицироватьHA, чтобы удалить детерминанты (например, гиперосновные участки вокруг участка протеолитического расщепления HA1/HA2), которые обеспечивают то, что вирус проявляет высокую патогенность у различных видов птиц. Использование обратной генетики облегчает такие модификации. Штаммы вируса гриппа для использования в вакцинах меняются время от времени. В межпандемические периоды вакцины обычно включают два штамма гриппа A (H1N1 и H3N2) и один штамм гриппа В, и трехвалентные вакцины являются обычными. В изобретении можно также использовать пандемические вирусные штаммы (т.е. штаммы, к которым реципиенты вакцины и общая человеческая популяция являются иммунологически интактными, в частности вирус гриппа А), такие как штаммы подтипов Н 2,Н 5, Н 7 или Н 9, а гриппозные вакцины к пандемическим штаммам могут быть одновалентными или могут быть основаны на нормальной трехвалентной вакцине, дополненной пандемическим штаммом. В зависимости от сезона и природы антигена, включенного в вакцину, однако, изобретение может защищать от одного или более подтипов HA: H1, Н 2, Н 3, Н 4, Н 5, Н 6, Н 7, Н 8, Н 9, Н 10, Н 11, Н 12, Н 13, Н 14,Н 15 или Н 16. Изобретение может защищать от одного или более подтипов NA: N1, N2, N3, N4, N5, N6,N7, N8 или N9 вируса гриппа А. Будучи подходящими для иммунизации против межпандемических штаммов, композиции по изобретению особенно пригодны для иммунизации против пандемических или потенциально пандемических штаммов. Характеристиками штамма гриппа, которые дают ему способность вызывать пандемическую вспышку, являются то, что он (а) содержит новый гемагглютинин по сравнению с гемагглютининами штаммов вируса человека, циркулирующих в данный момент, т.е. такой, который не наблюдался в популяции человека в течение десятилетия (например, Н 2) или ранее вообще не обнаруживался в человеческой популяции (например, Н 5, Н 6 или Н 9, которые, как правило, были обнаружены только в популяциях птиц), так что популяция человека будет иммунологически интактна к гемагглютинину штамма;(b) способен к горизонтальному распространению в человеческой популяции и (с) является патогенным для человека. Вирус, содержащий гемагглютинин типа Н 5, является предпочтительным для иммунизации против пандемического гриппа, такого как штамм H5N1. Другие возможные штаммы включаютH5N3, H9N2, H2N2, H7N1 и H7N7 и любые другие развивающиеся потенциально пандемические штаммы. Изобретение особенно пригодно для защиты от потенциально пандемических штаммов вируса, который может распространиться или распространился на человека из популяции животных, не являющейся популяцией человека, например, штамм гриппа H1N1 свиного происхождения. Изобретение подходит для вакцинации людей, а также животных, не являющихся человеком. Другие штаммы, чьи антигены могут быть с пользой включены в композиции, представляют собой штаммы, которые резистентны к антивирусной терапии (например, резистентны к озельтамивиру [36] и/или занамивиру), включая резистентные пандемические штаммы [37]. Композиции по изобретению могут включать антиген (антигены) из одного или более (например, 1,2, 3, 4 или более) штаммов вируса гриппа, включая вирус гриппа А и/или вирус гриппа В. В тех случаях,когда вакцина включает более чем один штамм гриппа, различные штаммы обычно выращивают раздельно и смешивают после сбора вирусов и получения антигенов. Таким образом, способ по изобретению может включать стадию смешивания антигенов более чем из одного штамма гриппа. Трехвалентная вакцина является обычной, включающей антигены из двух штаммов вируса гриппа А и один штамм вируса гриппа В. Применима также четырехвалентная вакцина [38], включающая антигены из двух штаммов вируса гриппа А и двух штаммов вируса гриппа В или трех штаммов вируса гриппа А и одного штамма вируса гриппа В. Фармацевтические композиции. Композиции вакцины, полученные по изобретению, являются фармацевтически приемлемыми. Они обычно включают компоненты в дополнение к антигенам, например они обычно включают один или более фармацевтический носитель (носители) и/или эксципиент (эксципиенты). Как описано ниже, также могут быть включены адъюванты. Подробное обсуждение таких компонентов доступно в ссылке [39]. Композиции вакцины, как правило, будут в водной форме. Однако некоторые вакцины могут быть в сухой форме, например в форме инъецируемых твердых веществ или высушенных или полимеризованных препаратов на пластыре. Композиции вакцины могут включать консерванты, такие как тимеросал или 2-феноксиэтанол. Однако предпочтительно, чтобы вакцина была, по существу, свободна от содержащего ртуть материала (т.е. содержала менее чем 5 мкг/мл), например была свободна от тимеросала [30, 40]. Вакцины, не содержащие ртуть, более предпочтительны. Сукцинат -токоферола может быть включен в качестве альтернативы ртутьсодержащим соединениям [30]. Бесконсервантные вакцины являются особенно предпочтительными. Для контроля тоничности предпочтительно включение физиологической соли, такой как соль натрия. Хлорид натрия (NaCl), являющийся предпочтительным, может присутствовать в количестве от 1 до 20 мг/мл. Другие соли, которые могут присутствовать, включают хлорид калия, дигидрофосфат калия,безводный динатрий фосфат, хлорид магния, хлорид кальция и т.д. Композиции вакцины, как правило, имеют осмоляльность 200-400 мОсм/кг, предпочтительно 240360 мОсм/кг и более предпочтительно 290-310 мОсм/кг. Ранее сообщалось, что осмоляльность не оказывает влияния на болевые ощущения, вызываемые вакцинацией [41], но поддержание осмоляльности в этом диапазоне, тем не менее, является предпочтительным. Композиции вакцины могут включать один или более буферов. Обычные буферы включают фосфатный буфер; Трис-буфер; боратный буфер; сукцинатный буфер; гистидиновый буфер (особенно с добавлением гидрата окиси алюминия) или цитратный буфер. Буферы обычно добавляют в диапазоне 5-20 мМ. Значение рН композиции вакцины обычно составляет от 5,0 до 8,1, более предпочтительно от 6,0 до 8,0, например от 6,5 до 7,5 или от 7,0 до 7,8. Способ по изобретению может, следовательно, включать стадию установления рН большого количества вакцины перед упаковкой. Композиция вакцины является предпочтительно стерильной. Композиция вакцины является предпочтительно апирогенной, например содержит 1 EU (эндотоксиновая единица, стандартное измерение) на дозу и предпочтительно 0,1 EU на дозу. Композиция вакцины предпочтительно не содержит глютена. Композиции вакцины по изобретению могут включать детергент, например поверхностно-активное вещество, сложный эфир полиоксиэтиленсорбитана (известный как "Tweens"), октоксинол (такой как октоксинол-9 (Triton X-100) или трет-октилфеноксиполиэтоксиэтанол), бромид цетилтриметиламмония("СТАВ") или дезоксихолат натрия, особенно для вакцин на основе расщепленных или поверхностных антигенов. Детергент может быть представлен только в следовых количествах. Таким образом, вакцина может включать менее чем 1 мг/мл каждого из октоксинола-10 и полисорбата 80. Другими остаточными компонентами в следовых количествах могут быть антибиотики (например, неомицин, канамицин, полимиксин В). Композиция вакцины может включать материал для разовой иммунизации или может включать материал для множественной иммунизации (т.е. "многодозовый" набор). Включение консервантов в многодозовые наборы является предпочтительным. В качестве альтернативы (или дополнительно) к включению консервантов в многодозовые композиции, композиции могут содержаться в контейнерах, имеющих асептический адаптер для изъятия материала. Вакцины гриппа обычно вводят в дозе объемом приблизительно 0,5 мл, хотя детям может быть введена половинная доза (т.е. приблизительно 0,25 мл). Композиции и наборы предпочтительно хранят при температуре от 2 до 8 С. Их не следует замораживать. В идеале, их нужно содержать не на прямом свету. ДНК клеток-хозяев. В тех случаях, когда вирус выделен и/или выращивается в клеточной линии, обычной практикой является минимизирование количества остаточной ДНК клеточной линии в конечной вакцине, чтобы минимизировать любую онкогенную активность ДНК. Таким образом, композиция вакцины, полученной по изобретению, предпочтительно содержит менее чем 10 нг (предпочтительно менее чем 1 нг и более предпочтительно менее чем 100 пг) ДНК остаточных клеток-хозяев на дозу, хотя следовые количества ДНК клеток-хозяев могут присутствовать. Предпочтительно, чтобы средняя длина любой ДНК остаточных клеток-хозяев составляла менее чем 500 bp (п.н.), например менее чем 400 п.н., менее чем 300 п.н., менее чем 200 п.н., менее чем 100 п.н. и т.д. Контаминирующая ДНК может быть удалена в ходе получения вакцины с использованием стандартных методов очистки, например, хроматографии и т.п. Удаление ДНК остаточных клеток-хозяев может быть улучшено путем обработки нуклеазой, например, с помощью ДНКазы. Обычный способ уменьшения контаминации ДНК клеток-хозяев описан в ссылках [42 и 43], и в него входит двухстадийная обработка, сначала с помощью ДНКазы (например, бензоназы), которая может быть использована в процессе роста вируса, а затем с помощью катионного детергента (например, СТАВ), который может быть использован в процессе разрушения вириона. Обработка алкилирующим агентом, таким как-пропиолактон, также может быть использована для удаления ДНК клеток-хозяев и преимущественно может быть использована для инактивации вирионов [44]. Адъюванты. Композиции по изобретению могут предпочтительно включать адъювант, функция которого состоит в усилении иммунных ответов (гуморального и/или клеточного), вызываемого у пациента, получающего композицию. Предпочтительные адъюванты содержат эмульсию масла в воде. Известны различные такие адъюванты, и они обычно включают по меньшей мере один вид масла и по меньшей мере одно поверхностно-активное вещество, причем масло (масла) и поверхностно-активное вещество (вещества) являются биодеградируемыми (метаболизируемыми) и биологически совместимыми. Капли масла в эмульсии обычно имеют диаметр менее чем 5 мкм и в идеале имеют субмикронный диаметр, причем такие малые размеры достигаются с помощью микрофлюидайзера для получения стабильных эмульсий. Капли размером менее чем 220 нм предпочтительны, поскольку их можно подвергать стерилизации фильтрованием. Эмульсия может содержать масла, такие как масла животного (например, рыбы) или растительного происхождения. Источники растительных масел включают орехи, семена и зерна. Арахисовое масло,соевое масло, кокосовое масло и оливковое масло, обычно наиболее доступные, являются примерами ореховых масел. Может быть использовано масло жожоба, например, полученное из бобов жожоба. Масла из семян включают сафлоровое масло, масло из семян хлопчатника, подсолнечное масло, масло кунжутного семени и им подобные. В зерновой группе кукурузное масло является наиболее легко доступным, но масла из зерна злаковых, таких как пшеница, овес, рожь, рис, полевичка абиссинская (тэфф),- 12021009 тритикале и им подобные, также могут быть использованы. Сложные эфиры жирных кислот с 6-10 атомами углерода и глицерина, а также 1,2-пропандиол, хотя они и не встречаются в природе в маслах семян, могут быть получены путем гидролиза, разделения и этерификации подходящих материалов исходя из масел орехов и семян. Жиры и масла из молока млекопитающих могут метаболизироваться и могут,следовательно, использоваться в практике по изобретению. Методы разделения, очистки, гидролиза сложных эфиров с образованием карбоновых кислот и другие средства, необходимые для получения чистых масел из животных источников, хорошо известны в данной области техники. Большинство рыб содержит метаболизируемые масла, которые могут быть легко восстановлены. Например, рыбий жир (из печени трески), жиры печени акулы и китовый жир, такой как спермацет, являются примерами нескольких жиров рыб, которые могут быть использованы в описании. Множество жиров с разветвленными цепями синтезированы биохимически в 5-углеродные изопреновые звенья и, как правило, обозначаются как терпеноиды. Жир печени акулы содержит разветвленные, ненасыщенные терпеноиды, известные как сквален, 2,6,10,15,19,23-гексаметил-2,6,10,14,18,22-тетракозагексаен, который особенно предпочтителен согласно изобретению. Сквалан, насыщенный аналог сквалена, также является предпочтительным жиром. Жиры из рыб, включая сквален и сквалан, легко доступны из коммерческих источников или могут быть получены способами, известными в данной области техники. Другим предпочтительным жиром является -токоферол (см. ниже). Могут быть использованы смеси жиров. Поверхностно-активные вещества могут быть классифицированы по их гидрофильнолипофильному балансу ("HLB"). Предпочтительные поверхностно-активные вещества по изобретению имеют HLB по меньшей мере 10, предпочтительно по меньшей мере 15 и более предпочтительно по меньшей мере 16. Изобретение может быть использовано с поверхностно-активными веществами, включающими, но не огранивающимися ими: поверхностно-активные вещества на основе сложных эфиров полиоксиэтиленсорбитана (обычно обозначаемые как Tweens), особенно полисорбат 20 и полисорбат 80; сополимеры этиленоксида (ЕО), пропиленоксида (РО) и/или бутиленоксида (ВО), выпускаемые под товарным наименованием DOWFAX, такие как линейные блок-сополимеры ЕО/РО; октоксинолы, которые могут варьировать по числу повторов групп этокси(окси-1,2-этандиил), причем октоксинол-9 (Triton X-100 или трет-октилфеноксиполиэтоксиэтанол) представляет особый интерес;(октилфенокси)полиэтоксиэтанол (IGEPAL CA-630/NP-40); фосфолипиды, такие как фосфатидилхолин (лецитин); нонилфенолэтоксилаты, такие как серия Tergitol NP; жирные эфиры полиоксиэтилена, происходящие из лаурил-, цетил-, стеарил- и олеиловых спиртов(известных как поверхностно-активные вещества Brij), такие как монолауриловый эфир триэтиленгликоля (Brij 30); и сложные эфиры сорбитана (обычно известные как SPAN), такие как триолеат сорбитана (Span 85) и монолаурат сорбитана. Неионные поверхностно-активные вещества являются предпочтительными. Предпочтительными поверхностно-активными веществами для включения в эмульсию являются Tween 80 (моноолеат полиоксиэтиленсорбитан), Span 85 (триолеат сорбитана), лецитин и Triton X-100. Могут быть использованы смеси поверхностно-активных веществ, например смеси Tween 80/Span 85. Комбинация сложного эфира полиоксиэтиленсорбитана, такого как моноолеат полиоксиэтиленсорбитана (Tween 80) и октоксинола, такого как трет-октилфеноксиполиэтоксиэтанол (Triton X-100), также является подходящей. Другая пригодная комбинация содержит лаурет 9 плюс сложный эфир полиоксиэтиленсорбитана и/или октоксинол. Предпочтительные количества поверхностно-активных веществ составляют (мас.%): сложные эфиры полиоксиэтиленсорбитана (такие как Tween 80) - 0,01-1,0, в частности приблизительно 0,1; октил- или нонилфеноксиполиоксиэтанолы (такие как Triton X-100 или другие детергенты серииTriton) - 0,001-0,1, в частности 0,005-0,02; полиоксиэтиленовые эфиры (такие как лаурет 9) - 0,1-20, предпочтительно 0,1-10% и, в частности,0,1-1 или приблизительно 0,5. В тех случаях, когда вакцина содержит расщепленный вирус, предпочтительно, чтобы она содержала свободное поверхностно-активное вещество в водной фазе. Это является преимуществом в том, что свободное поверхностно-активное вещество может вызвать "расщепляющий эффект" на антиген, тем самым разрушая любые нерасщепленные вирионы и/или агрегаты вирионов, которые в противном случае могут присутствовать. Это может усилить безопасность вакцин из расщепленных вирусов [45]. Предпочтительные эмульсии имеют средний размер капель 1 мкм, например 750 нм, 500 нм,400 нм, 300 нм, 250 нм, 220 нм, 200 нм или менее. Эти размеры капель могут быть легко достигнуты с использованием таких технологий, как микрофлюидизация. Конкретные адъюванты эмульсии жира в воде, пригодные по изобретению, включают, но не ограничиваются ими. Субмикронная эмульсия сквалена, Tween 80 и Span 85. Композиция эмульсии по объему может составлять приблизительно 5% сквалена, приблизительно 0,5% полисорбата 80 и приблизительно 0,5%Span 85. По массе эти соотношения приобретают вид: 4,3% сквалена, 0,5% полисорбата 80 и 0,48% Span 85. Эти адъюванты известны как "MF59" [46-48], как описано более подробно в главе 10 ссылки [49] и главе 12 ссылки [50]. Эмульсия MF59 предпочтительно может включать ионы цитрата, например 10 мМ буфера цитрата натрия. Эмульсия сквалена, DLтокоферола и полисорбата 80 (Tween 80). Эмульсия может включать забуференный фосфатом физиологический раствор (PBS). Она также может включать Span 85 (например, 1%) и/или лецитин. Такие эмульсии могут иметь от 2 до 10% сквалена, от 2 до 10% токоферола и от 0,3 до 3% Tween 80, и массовое соотношение сквален:токоферол предпочтительно составляет 1, поскольку это обеспечивает более стабильную эмульсию. Сквален иTween 80 могут присутствовать в объемном соотношении приблизительно 5:2 или в массовом соотношении приблизительно 11:5. Одна из таких эмульсий может быть получена растворением Tween 80 в PBS с получением 2% раствора, затем смешиванием 90 мл такого раствора со смесью 5 г DLтокоферола и 5 мл сквалена, с последующей микрофлюидизацией смеси. Полученная эмульсия может иметь субмикронные капли жира, например, со средним диаметром от 100 до 250 нм, предпочтительно приблизительно 180 нм. Эмульсия может также включать 3-де-О-ацилированный монофосфориллипид A (3d-MPL). Другая пригодная эмульсия такого типа может содержать на дозу для человека 0,5-10 мг сквалена,0,5-11 мг токоферола и 0,1-4 мг полисорбата 80 [51]. Эмульсия сквалена, токоферола и детергента Triton (например, Triton X-100). Эмульсия может также включать 3d-MPL (см. ниже). Эмульсия может содержать фосфатный буфер. Эмульсия, содержащая полисорбат (например, полисорбат 80), детергент Triton (например, TritonX-100) и токоферол (например, -токоферолсукцинат). Эмульсия может включать эти три компонента в массовом соотношении приблизительно 75:11:10 (например, 750 мкг/мл полисорбата 80, 110 мкг/млTriton X-100 и 100 мкг/мл -токоферолсукцината), и эти концентрации включают вклад этих компонентов, вносимый с антигенами. Эмульсия может также включать сквален. Эмульсия может также включать 3d-MPL (см. ниже). Водная фаза может содержать фосфатный буфер. Эмульсия сквалена, полисорбата 80 и полоксамера 401 ("Pluronic L121"). Эмульсия может быть составлена в забуференном фосфатом физиологическом растворе, рН 7,4. Эта эмульсия является подходящим носителем для мурамил-дипептидов и использована с треонил-MDP в адъюванте "SAF-1" [52](0,05-1% Thr-MDP, 5% сквалана, 2,5% Pluronic L121 и 0,2% полисорбата 80). Она может быть также использована без Thr-MDP, как в адъюванте "AF" [53] (5% сквалана, 1,25% Pluronic L121 и 0,2% полисорбата 80). Микрофлюидизация предпочтительна. Эмульсия, содержащая сквален, водный растворитель, алкиловый эфир полиоксиэтилена в качестве гидрофильного неионного поверхностно-активного вещества (например, цетостеариловый эфир полиоксиэтилена (12 и гидрофобное неионное поверхностно-активное вещество (например, сложный эфир сорбитана или сложный эфир mannide, такой как монолеат сорбитана или "Span 80"). Эмульсия является предпочтительно термообратимой и/или имеет по меньшей мере 90% капель жира (по объему) с размером менее чем 200 нм [54]. Эмульсия может также включать одно или более из: альдитола; криозащитного агента (например, сахара, такого как додецилмальтозид и/или сахароза) и/или алкилполигликозида. Эмульсия может включать агонист TLR4 [55]. Такие эмульсии могут быть лиофилизированы. Эмульсия сквалена, полоксамера 105 и Abil-Care [56]. Конечная концентрация (по массе) этих компонентов в содержащих адъювант вакцинах составляет 5% сквалена, 4% полоксамера 105 (pluronicpolyol) и 2% Abil-Care 85 (Bis-PEG/PPG-16/16 PEG/PPG-16/16 диметикон; каприловый/каприновый триглицерид). Эмульсия, содержащая 0,5-50% жира, 0,1-10% фосфолипида и 0,05-5% неионного поверхностноактивного вещества. Как описано в ссылке [57], предпочтительными фосфолипидными компонентами являются фосфатидилхолин, фосфатидилэтаноламин, фосфатидилсерин, фосфатидилинозитол, фосфатидилглицерин, фосфатидная кислота, сфингомиелин и кардиолипин. Субмикронные размеры капель являются предпочтительными. Субмикронная эмульсия жира в воде из неметаболизируемого жира (такого как легкое минеральное масло) и по меньшей мере одного поверхностно-активного вещества (такого как лецитин, Tween 80 илиSpan 80). Могут быть включены дополнительные вещества, такие как сапонин QuilA, холестерин, сапонин-липофильный конъюгат (такой как GPI-0100, описанный в ссылке [58], полученный добавлением алифатического амина к дезацилсапонину через карбоксильную группу глюкуроновой кислоты), бромид диметилдиоктадециламмония и/или N,N-диоктадецил-N,N-бис-(2-гидроксиэтил)пропандиамин. Эмульсия, в которой сапонин (например, QuilA или QS21) и стерин (например, холестерин) собраны в спиральные мицеллы [59]. Эмульсия, содержащая минеральное масло, неионный липофильный этоксилированный жирный спирт и неионное гидрофильное поверхностно-активное вещество (например, этоксилированный жирный спирт и/или блок-сополимер полиоксиэтилен-полиоксипропилен) [60]. Эмульсия, содержащая минеральное масло, неионный гидрофильный этоксилированный жирный спирт и неионное липофильное поверхностно-активное вещество (например, этоксилированный жирный спирт и/или блок-сополимер полиоксиэтилен-полиоксипропилен) [60]. В некоторых вариантах осуществления эмульсия может быть смешана с антигеном непосредственно во время введения, и, таким образом, адъювант и антиген можно содержать раздельно в расфасованной или распространяемой вакцине, готовой к конечному образованию во время применения. В других вариантах осуществления эмульсию смешивают с антигеном в процессе производства, и, таким образом,композицию расфасовывают в жидкой форме с адъювантом. Антиген обычно находится в водной форме,так что вакцину окончательно получают смешиванием двух жидкостей. Объемное соотношение двух жидкостей при смешивании может варьировать (например, от 5:1 до 1:5), но обычно составляет приблизительно 1:1. Там, где концентрации компонентов даны в приведенных выше описаниях конкретных эмульсий, эти концентрации обычно относятся к неразбавленной композиции, и концентрация после смешивания с раствором антигена будет, таким образом, снижаться. Фасовка композиций вакцины. Подходящие контейнеры для композиций по изобретению (или наборов компонентов) включают флаконы, шприцы (например, одноразовые шприцы), назальные спреи и т.д. Такие контейнеры должны быть стерильными. В тех случаях, когда композиция/компонент помещены во флакон, флакон предпочтительно изготовлен из стекла или пластмассы. Флакон предпочтительно стерилизуют перед добавлением в него композиции. Чтобы устранить проблемы с пациентами, чувствительными к латексу, флаконы предпочтительно укупоривают пробками, не содержащими латекса, и отсутствие латекса во всех фасовочных материалах предпочтительно. Флакон может включать единичную дозу вакцины или может включать более чем одну дозу ("многодозовый флакон"), например 10 доз. Предпочтительные флаконы изготавливают из бесцветного стекла. Флакон может иметь оголовник (например, люэровский наконечник), адаптированный так, что заполненный шприц может быть вставлен в оголовник, содержимое шприца может быть введено во флакон (например, чтобы растворить в нем лиофилизированный материал), а содержимое флакона может быть перемещено обратно в шприц. После удаления шприца из флакона может быть присоединена игла и композиция введена пациенту. Оголовник предпочтительно располагается внутри предохранительного колпачка или крышки, так чтобы предохранительный колпачок или крышку необходимо было удалить, перед тем как получить доступ к оголовнику. Флакон может иметь оголовник, который позволяет асептическое удаление его содержимого, особенно в случае многодозовых флаконов. Когда компонент расфасован в шприц, шприц может иметь присоединенную к нему иглу. Если игла не присоединена, то отдельная игла может поставляться со шприцем для сборки и использования. Такая игла может иметь защитный чехол. Безопасные иглы являются предпочтительными. Обычными являются иглы 1 дюйм 23-й калибр, 1-дюйм 25-й калибр и 5/8 дюйма 25-й калибр. Шприцы могут быть снабжены отрывной самоклеящейся этикеткой, на которой могут быть напечатаны номер партии, сезон гриппа и дата истечения срока годности содержимого, чтобы облегчить ведение записей. Поршень шприца предпочтительно имеет упор, чтобы предотвратить случайный выход поршня из шприца при наборе в него содержимого. Шприцы могут иметь оголовник из латексной резины и/или поршень. Одноразовые шприцы содержат разовую дозу вакцины. Шприц обычно имеет на наконечнике оголовник, чтобы предохранять наконечник до момента присоединения иглы, и оголовник предпочтительно выполняют из бутилкаучука. Если шприц и игла упакованы отдельно, тогда игла предпочтительно снабжена предохранителем из бутилкаучука. Предпочтительными шприцами являются шприцы, выпускаемые под товарным наименованием "Tip-Lok". Контейнеры могут быть маркированы так, чтобы показать объем половинной дозы, например, чтобы облегчить инъекцию детям. Например, шприц, содержащий дозу 0,5 мл, может иметь маркировку,показывающую объем 0,25 мл. В тех случаях, когда используют стеклянный контейнер (например, шприц или флакон), предпочтительно использовать контейнер, выполненный из боросиликатного стекла, а не известково-натриевого стекла. Набор или композиция могут быть упакованы (например, в одной и той же коробке), вместе с брошюрой, включающей подробные сведения о вакцине, например инструкции по введению, подробные данные об антигенах, содержащихся в вакцине и т.п. Инструкции могут также содержать предупреждения, например необходимо иметь наготове раствор адреналина на случай анафилактической реакции на вакцинацию и т.д. Способы лечения и введение вакцины. Изобретение относится к вакцине, полученной по изобретению. Эти композиции вакцины являются подходящими для введений человеку и животным пациентам, не являющимся человеком, таким как сви- 15021009 ньи, и изобретение относится к способу индукции у пациента иммунного ответа, включающему стадию введения пациенту композиции по изобретению. Изобретение также относится к композиции по изобретению для использования в качестве лекарственного средства и к применению композиции по изобретению для получения лекарственного средства для индукции иммунного ответа у пациента. Иммунный ответ, индуцированный такими способами и методами применениям, обычно включает антительный ответ, предпочтительно защитный антительный ответ. Способы индукции антительных ответов, возможности нейтрализации и защиты после вакцинации против вируса гриппа хорошо известны в данной области техники. Исследования на человеке показали, что титры антител к гемагглютинину вируса гриппа человека коррелируют с иммунитетом (образец сыворотки с титром ингибирования гемагглютинина приблизительно 30-40 дает около 50% иммунитета против инфекции гомологичным вирусом) [61]. Антительный ответ обычно измеряют по ингибированию гемагглютинина микронейтрализацией, простой радиальной иммунодиффузией (SRID) и/или простым радиальным гемолизом (SRH). Эти технологии анализов хорошо известны в данной области техники. Композиции по изобретению могут быть введены различными путями. Наиболее предпочтительным путем иммунизации является внутримышечная инъекция (например, в руку или ногу), а другие доступные пути включают подкожную инъекцию, интраназальное [62-64], пероральное [65], внутрикожное[66, 67], чрескожное, трансдермальное введения [68] и т.д. Вакцины, полученные по изобретению, могут быть использованы для лечения как детей, так и взрослых. Вакцины против гриппа в настоящее время рекомендованы для использования в иммунизации детей и взрослых начиная с возраста 6 месяцев. Таким образом, пациент-человек может иметь возраст менее чем 1 год, 1-5 лет, 5-15 лет, 15-55 лет или по меньшей мере 55 лет. Предпочтительными пациентами, получающими вакцину, являются люди старших возрастов (например, 50 лет, 60 лет и предпочтительно 65 лет), дети (например, 5 лет), госпитализированные пациенты, работники здравоохранения,персонал силовых структур, беременные женщины, хронические больные, лица, страдающие иммунодефицитом, лица, принимавшие противовирусные соединения (например, соединения озельтамивир или занамивир; см. ниже) в период 7 дней перед получением вакцины, лица с аллергиями на яичный белок и лица, направляющиеся за рубеж. Вакцины подходят не только для этих групп, однако, и могут быть использованы в популяции более широко. Против пандемических штаммов предпочтительно введение всем возрастным группам. Предпочтительные композиции по изобретению удовлетворяют 1-, 2- или 3-му критерию эффективности СРМР. Для взрослых (18-60 лет) эти критерии составляют:(3) повышение среднего геометрического значения титра (GMT) в 2,5 раза. Среди старших возрастов (60 лет) эти критерии составляют:(3) повышение GMT 2 раз. Эти критерии основаны на открытых исследованиях по меньшей мере 50 пациентов. Лечение может быть проведено по однодозовой или по многодозовой схеме. Множественные дозы могут быть использованы в схеме первичной иммунизации и/или в схеме бустер-иммунизации. В многодозовой схеме могут быть даны различные дозы теми же или иными путями, например первичная иммунизация парентерально и бустер-иммунизация через слизистые, первичная через слизистые и бустериммунизация парентерально и т.д. Введение более чем одной дозы (обычно две дозы) особенно полезно для иммунологически интактных пациентов, например для лиц, никогда не получавших ранее гриппозной вакцины, или для вакцинации против нового подтипа HA (как при пандемической вспышке). Множественные дозы обычно вводят с интервалом по меньшей мере в 1 неделю (например, приблизительно 2, приблизительно 3, приблизительно 4, приблизительно 6, приблизительно 8, приблизительно 10, приблизительно 12, приблизительно 16 недель и т.д.). Вакцины, полученные по изобретению, могут быть введены пациентам, по существу, в те же моменты времени, что и другие вакцины (например, процессе той же медицинской консультации или посещения медицинского или вакцинационного центра), например, по существу, в то же самое время, что и вакцина против кори, вакцина против паротита, вакцина против краснухи, вакцина против корипаротита-краснухи (MMR), вакцина против ветряной оспы, вакцина против кори-паротита-краснухиветряной оспы (MMRV), противодифтерийная вакцина, противостолбнячная вакцина, вакцина против коклюша, вакцина против коклюша-дифтерита-столбняка (DTP), конъюгатная вакцина H.influenzae типаb, инактивированная вакцина против полиомиелита, вакцина против вируса гепатита В, менингококковая конъюгатная вакцина (такая как четырехвалентная вакцина A-C-W135-Y), вакцина против респираторносинцитиального вируса, пневмококковая конъюгатная вакцина и т.д. Введение, по существу, в то же самое время, что и пневмококковая вакцина и/или менингококковая вакцина особенно полезно у пациентов старшего возраста. Аналогично, вакцины по изобретению могут быть введены пациентам, по существу, в то же самое время, что и противовирусные соединения (например, в процессе той же медицинской консультации или визита к медику), в частности противовирусные соединения, активные против вируса гриппа (например,озельтамивир и/или занамивир). Эти противовирусные препараты включают ингибиторы нейраминидазы, такие как (3R,4R,5S)-4-ацетиламино-5-амино-3-(1-этилпропокси)-1-циклогексен-1-карбоновая кислота или 5-(ацетиламино)-4-[(аминоиминометил)амино]-2,6-ангидро-3,4,5-тридезокси-D-глицеро-Dгалактонон-2-еноевая кислота, включая их сложные эфиры (например, этиловые сложные эфиры) и их соли (например, фосфатные соли). Предпочтительным противовирусным препаратом является(3R,4R,5S)-4-ацетиламино-5-амино-3-(1-этилпропокси)-1-циклогексен-1-карбоновая кислота, этиловый сложный эфир, фосфат (1:1), также известный как озельтамивир фосфат (TAMIFLU). Общие положения. Термин "содержащий" охватывает также "включающий", как и "состоящий из", например композиция, "содержащая" компонент X, может состоять исключительно из X или может включать что-то дополнительно, например X+Y. Слово "по существу (практически)" не исключает "полностью", например, композиция, которая "по существу (практически), свободна" от Y, может быть полностью свободна от Y. Там, где это необходимо,слово "по существу (практически)" может быть опущено в определении по изобретению. Термин "приблизительно" в связи с числовым значением х является неточным и означает, например, х 10%. Если это не оговорено специально, способ, включающий стадию смешивания двух или более компонентов, не требует конкретного порядка смешивания. Таким образом, компоненты могут быть смешаны в любом порядке. Если речь идет о трех компонентах, то два компонента могут быть объединены друг с другом, а затем эта комбинация может быть объединена с третьим компонентом и т.д. Когда в культуре клеток использовали материал от животного (и особенно от коров), он должен был быть получен из источника, который свободен от инфекционных губчатых энцефалопатии (TSE), и особенно от губчатой энцефалопатии крупного рогатого скота (BSE). В общем, предпочтительно культивировать клетки при полном отсутствии материалов животного происхождения. Когда соединение вводят в организм как часть композиции, тогда это соединение, в качестве альтернативы, может быть заменено подходящим пролекарством. Краткое описание чертежей Фиг. 1 иллюстрирует экспрессирующийся конструкт, который использовали для анализа активности промотора pol I с люциферазным репортером. Фиг. 2 показывает полноразмерную (FL) последовательность промотора pol I человека(SEQ ID NO:1). Последовательность pHW2000 промотора pol I человека (SEQ ID NO:2; "короткий" промотор pol I человека в полноразмерной последовательности показана подчеркнутым шрифтом. Стрелка показывает сайт старта транскрипции. Фиг. 3 показывает полноразмерную (FL) последовательность промотора pol I собаки (NW 878945;SEQ ID NO:3). Короткая (SHORT) последовательность промотора в полноразмерной последовательности промотора показана подчеркнутыми заглавными буквами (SEQ ID NO:5); средняя (MID) последовательность промотора в полноразмерной последовательности промотора показана подчеркнутыми заглавными буквами и жирными строчными буквами (SEQ ID NO:4). Фиг. 4 показывает активность промотора pol I собаки в клетках MDCK. Сплошные серые колонки показывают результаты с FL промотором pol I собаки, заштрихованные наискосок колонки показывают результаты с промотором MID собаки, а заполненные точками колонки показывают результаты с промотором pol I SHORT собаки. "А" обозначает LUC и вирусную полимеразу, "В" обозначает LUC и инфекцию (MOI=0,05), "С" обозначает LUC, a "D" означает отсутствие ДНК. По оси у указаны относительные световые единицы (RLU). Фиг. 5 показывает активность промотора pol I человека в клетках MDCK 33016. Сплошные серые колонки показывают результаты, полученные с промотором pol I человека, колонки, заштрихованные наискось, показывают результаты, полученные с FL промотором pol I собаки, колонки, заполненные точками, показывают результаты, полученные с MID промотором pol I собаки, а вертикально заштрихованные колонки показывают результаты, полученные с SHORT промотором pol I собаки. "А" обозначаетLUC и вирусную полимеразу, "В" обозначает LUC и инфекцию (MOI=0,05) и "С" обозначает LUC. По оси у указаны относительные световые единицы (RLU). Фиг. 6 показывает сравнение активности FL и SHORT промоторов pol I человека и полноразмерного промотора pol I собаки в клетках MDCK - клетках 33016. Сплошные серые колонки показывают результаты, полученные с полноразмерным промотором человека, заштрихованные колонки показывают результаты, полученные с полноразмерным промотором собаки, а заполненные точками колонки показывают результаты, полученные с коротким промотором pol I человека. А обозначает LUC + полимераза,В обозначает LUC + инфекция, а С показывает только LUC. По оси Y указаны относительные световые единицы (RLU). Фиг. 7 показывает активность промотора pol I человека (колонки заполненные точками) и промотора pol I собаки (колонки, заштрихованные наискось) в клетках MDCK 33016 (фиг. 7 А) и в клетках MDCK АТСС (фиг. 7 В). А обозначает LUC + полимераза, В обозначает LUC + инфекция, а С показывает толькоLUC. По оси у указаны относительные световые единицы (RLU). Фиг. 8 показывает вестерн-блот анализ белков M и NP в лизатах клеток после "спасения" вируса. Фиг. 9 показывает результаты анализа бляшкообразования с использованием супернатанта от клеток, инфицированных конструктами, полученными обратной генетикой. Фиг. 10 показывает выравнивание последовательностей ДНК промоторов pol I человека и собаки(SEQ ID NO:1 и 3 соответственно). Фиг. 11 А показывает уровни экспрессии репортерного трансгена под контролем промотора pol I(hPolI) человека или промотора polI (cPolI) собаки в клетках MDCK ATCC, MDCK 33016-PF и 293 Т. Черные колонки представляют результаты, полученные на клетках 293 Т, белые колонки показывают результаты, полученные на MDCK 33016-PF, и заштрихованные наискось колонки представляют результаты на клетках MDCK ATCC; на фиг. 11 В сравниваются эффективность трансфекции в клетках человека и собаки. По оси у на обоих графиках указаны относительные световые единицы (RLU). Фиг. 12 показывает "спасение" штамма гриппа A/Puerto Rico/8/34 обратной генетикой на основе промотора pol I человека в клетках MDCK ATCC, MDCK 33016-PF и 293 Т в присутствии (белые колонки) и в отсутствие (черные колонки) плазмиды-помощника TMPRSS2 и с добавлением (черные колонки) и без добавления (белые колонки) питающих клеток (12 В). По оси у представлен титр вируса (бляшкообразующая единица (БОЕ)/мл). Фиг. 13 показывает сравнение "спасения" штамма гриппа A/Puerto Rico/8/34 обратной генетикой,управляемой pol I человека или собаки в клетках MDCK 33016-PF. Черные колонки показывают результаты, полученные в отсутствие плазмиды-помощника TMPRSS2, а белые колонки показывают результат,полученный в присутствии плазмиды-помощника TMPRSS2. По оси у представлен титр вируса(БОЕ/мл). Краткое описание списка последовательностейSEQ ID NO:1 представляет собой полноразмерную (FL) последовательность промотора pol I человека.SEQ ID NO:2 представляет собой последовательность промотора pol I pHW2000 человека.SEQ ID NO:3 представляет собой полноразмерную (FL) последовательность промотора pol I собаки.SEQ ID NO:4 представляет собой последовательность MID промотора pol I собаки.SEQ ID NO:5 представляет собой последовательность SHORT промотора pol I собаки.SEQ ID NO:6 представляет собой последовательность HA из A/California/04/09.SEQ ID NO:7 представляет собой последовательность HA из A/Chile/1/1983.SEQ ID NO:8 представляет собой последовательность NA из A/California/04/09.SEQ ID NO:9 представляет собой последовательность NA из A/Chile/1/1983. Способы осуществления изобретения Промотор pol I человека активен в клетках человека, а также в клетках собаки. Чтобы определить активность промотора pol I в неэндогенных клетках-хозяевах, клетки MDCK трансфицировали экспрессирующимся конструктом, который позволяет экспрессию РНК люциферазы(luc) в антисмысловом направлении под контролем фрагмента промотора pol I человека величиной в 487 п.н. или различных фрагментов промотора pol I собаки (как показано на фиг. 3). Экспрессирующаяся РНК может быть транскрибирована в мРНК вирусной полимеразой и затем транслирована в белок luc. Таким образом, клетки, экспрессирующие трансген, могут быть легко идентифицированы по определению активности люциферазы. Чтобы этот анализ был работоспособным, необходимо обеспечить вирусную полимеразу. Это может быть достигнуто котрансфекцией клетки экспрессирующимися конструктами, которые кодируют вирусную полимеразу, или, альтернативно, инфицированием трансфицированной клетки вирусом-помощником. Анализ проиллюстрирован на фиг. 1. Фиг. 11 А показывает, что промотор pol I человека способен управлять экспрессией трансгена в клетках MDCK ATCC, а также в клетках MDCK 33016-PF с такой же эффективностью, как промоторpol I собаки. Уровень экспрессии трансгена с промотором pol I человека в клетках MDCK ATCC даже выше, чем наблюдаемый в клетках 293 Т человека. Чтобы подтвердить, что эффективность трансфекции тестируемых типов клеток является сравнимой, они были трансфицированы конструктом, содержащим ген люциферазы под контролем промотора CMV. Уровень активности люциферазы измеряли. Результаты показаны на фиг. 11 В и подтверждают, что эффективность трансфекции на тестируемых клетках является сравнимой. Фиг. 4 показывает, что все тестируемые фрагменты промотора pol I собаки могут управлять экспрессией трансгена luc в клетках MDCK. Кроме того, фиг. 5 демонстрирует, что полноразмерный промотор pol I человека способен управлять экспрессией трансгена в клетках MDCK и даже более эффективен,чем промотор pol I собаки. Чтобы уточнить, какой участок промотора pol I человека необходим для управления экспрессией трансгена, эксперимент был повторен с фрагментом промотора pol I человека, как показано на фиг. 2("короткий" pol I). Было обнаружено, что, хотя полноразмерный промотор pol I более активен, полноразмерный, а также короткий промотор pol I человека активны на клетках MDCK (фиг. 6). Конструкты, содержащие последовательности промоторов pol I человека и собаки, были затем трансфицированы в MDCK из клеток АТСС и MDCK 33016 [18], чтобы определить, ограничена ли активность промотора pol I человека определенной клеточной линией. Как показано на фиг. 7, промоторpol I человека был способен управлять экспрессией трансгена в обоих типах клеток, но экспрессия была более эффективной в клетках MDCK 33016."Спасенный" вирус гриппа из клеток MDCK с помощью промотора pol 1 человека. Эффективность "спасения" вируса гриппа с использованием промотора pol I человека сравнивали в клетках MDCK и 293 Т. Геном вируса гриппа клонировали в векторы экспрессии pHW2000 [69]. Этот вектор содержит фрагмент промотора pol I человека, который, как было показано, активен в клеткахMDCK (см. фиг. 5). В частности, были использованы нижеследующие векторы: pHW-WSN РА(0,169 мкг/мкл); pHW-WSN NA (0,280 мкг/мкл) и pcDNA-TMPRSS (0,775 мкг/мкл; кодирующие сериновую протеазу). Гены, кодирующие белки, были проконтролированы промотором цитомегаловируса(CMV). Для "спасения" вируса клетки 293 Т высевали с плотностью 5106 клеток/лунку в 6-луночных чашках с 2 мл среды Игла, модифицированной по Дульбекко (DMEM), с 10% фетальной телячьей сыворотки(FCS). Клетки MDCK высевали при 0,3106 клеток/лунку в 6-луночной чашке с 2 мл среды. Клетки инкубировали в течение ночи при 37 С и трансфицировали, когда они достигали 50-80% конфлюэнтности. Клетки 293 Т и MDCK трансфицировали с использованием FuGENE 6 Transfection Reagent (Roche,Cat. 11988387001) и Lipofectamine LTX Plus Reagent (Invitrogen, Cat. 15338-100) соответственно. Клетки трансфицировали 1 мкг каждого вектора в соответствии с нижеследующими протоколами. ДляFuGENE 6 реагент (3 мкл FuGENE/мкг ДНК) разбавляли в 73 мкл бессывороточной среды (без антибиотиков), осторожно смешивали и инкубировали при комнатной температуре в течение 5 мин. После этого добавляли ДНК в каждый разбавленный FuGENE, осторожно смешивали и инкубировали при комнатной температуре в течение по меньшей мере 15 мин. Смесь ДНК/FuGENE добавляли по каплям к клеткам 293 Т без удаления среды роста и клетки инкубировали при 37 С в течение 24 ч. Для трансфекции с липофектамином реагент (25 мкл) разбавляли в 500 мкл бессывороточной среды и инкубировали при комнатной температуре в течение 5 мин. Добавляли ДНК и инкубировали смесь при комнатной температуре в течение 30 мин. После инкубации добавляли по каплям 500 мкл бессывороточной среды в реагент для трансфекции после того, как среда роста была удалена из клеток. Клетки затем инкубировали при 37 С в течение 24 ч. Через 24 ч после трансфекции среду заменяли. Через два дня после инфицирования супернатант от клеток собирали центрифугированием при 1000 об/мин в течение 5 мин. Вирус, собранный в супернатанте, использовали для анализа бляшкообразования. Кроме того, инфицированные клетки лизировали и использовали для вестерн-блоттинг анализа. Вестерн-блоттинг анализ. Клетки 293 Т и MDCK лизировали и проводили вестерн-блоттинг анализ в соответствии со стандартными протоколами. Антитела к белкам М и NP использовали для детектирования этих белков на мембране. Антитела к S6 использовали для контроля загрузки. Дорожки, помеченные "WSN", нагружали белками из "спасенного" вируса. Дорожки, обозначенные "М" и "NP", содержат рекомбинантные белки М и NP в качестве контроля. Поскольку эти рекомбинантные белки экспрессируются с разных генов, они мигрируют в геле несколько медленнее. Результаты анализа показаны на фиг. 8, на которой видно, что экспрессирующийся конструкт под контролем промотора pol I человека позволяет "спасение" вируса в клетках 293 Т, а также в клеткахMDCK. Анализ бляшкообразования. Неинфицированные клетки MDCK высевали с плотностью 6,25104 клеток/лунку в 48-луночном планшете в 500 мкл DMEM с 10% FCS. На следующий день клетки инфицировали вирусами в объеме 100-150 мкл в течение 2 ч при 37 С. Клетки посредством этого инфицировались различными разбавлениями вируса. Через 2 ч после инфицирования среду отсасывали и добавляли в каждую лунку по 500 мклDMEM с 10% FCS. Клетки инкубировали при 37 С до следующего дня. Через 24 ч после инфицирования среду отсасывали и клетки один раз отмывали PBS. В каждую лунку добавляли 500 мкл ледяного 80% ацетона в PBS, после чего инкубировали при 4 С в течение 30 мин. Ацетоновую смесь отсасывали и клетки один раз отмывали PBST (PBS + 0,1% Tween). В каждую лунку добавляли 500 мкл 2% BSA (бычьего сывороточного альбумина) в PBS, после чего инкубировали при комнатной температуре (КТ) в течение 30 мин. В блокирующий буфер добавляли 500 мкл разбавленного 1:6000 анти-NP, после чего инкубировали при КТ в течение 2 ч. Раствор антител отсасывали и клетки дважды отмывали PBST. Вторые антитела (анти-мышиные антитела козы) добавляли в разбавлении 1:2000 в 500 мкл блокирующего буфера и планшет инкубировали при КТ в течение 2 ч. Раствор ан- 19021009 тител отсасывали и клетки три раза отмывали PBST. В каждую лунку добавляли 500 мкл KPL True Blue и инкубировали в течение 10 мин. Реакцию останавливали отсасыванием True-Blue и однократной отмывкой dH2O. Воду отсасывали и клетки оставляли высыхать. Результаты анализа показаны на фиг. 9, которая ясно демонстрирует, что инфицирующий вирус получен из клеток 293 Т, а также из клеток MDCK."Спасение" вируса гриппа штамма A/Puerto Rico/8/34 с использованием системы обратной генетикиpol I человека было также протестировано на клетках MDCK АТСС, MDCK 33016-PF и 293 Т, как описано в ссылке 70. Были выполнены эксперименты, в которых вирус был "спасен" в присутствии и в отсутствие плазмиды-помощника TMPRSS2, которая кодирует сериновую протеазу. Кроме того, "спасение вируса" было выполнено с добавлением и без него питающих клеток через 24 ч после "спасения" вируса. Результаты показаны на фиг. 12 и демонстрируют, что эффективное "спасение" вируса может быть достигнуто в клетках MDCK при различных условиях с использованием промотора pol I человека. Чтобы установить, сравнима ли эффективность "спасения" вируса в MDCK 33016-PF с использованием промотора pol I человека со "спасением" с использованием промотора pol I собаки, клетки трансфицировали RG-системой pol I человека или RG-системой pol I собаки, как описано в ссылке 70. Были выполнены эксперименты в присутствии и в отсутствие плазмиды-помощника TMPRSS. Результаты(фиг. 13) демонстрируют, что штамм A/Puerto Rico/8/34 был "спасен", когда использовали систему pol I человека, с эффективностью, сравнимой с таковой системы pol I собаки. Следует понимать, что изобретение было описано только путем примеров, и модификации могут быть проведены, в то же время оставаясь в пределах объема и сущности изобретения. Ссылки ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Способ продуцирования рекомбинантного вируса, включающий стадию роста клеток-хозяев собаки, содержащих по меньшей мере один экспрессирующийся конструкт, кодирующий молекулу вирусной РНК, в которой экспрессия молекулы вирусной РНК из конструкта контролируется промотором pol I приматов в условиях, когда молекула вирусной РНК экспрессируется, чтобы продуцировать вирус. 2. Способ получения вируса, включающий следующие стадии:(i) продуцирование рекомбинантного вируса способом по п.1;(ii) инфицирование культуры-хозяина вирусом, полученным на стадии (i);(iii) культивирование хозяина со стадии (ii) для продуцирования дополнительного количества вируса и(iv) очистка вируса, полученного на стадии (iii). 3. Способ получения вакцины, включающий стадии (а) получения вируса способом по п.2 и (b) получения из вируса вакцины. 4. Способ по одному из пп.1-3, в котором промотор pol I представляет собой промотор pol I человека. 5. Способ по одному из пп.1-4, в котором клетки представляют собой клетки MDCK. 6. Способ по п.5, в котором клетки MDCK представляют собой клеточную линию MDCK 33016(DSM ACC2219). 7. Способ по одному из пп.1-6, в котором клетки включают по меньшей мере один двунаправленный экспрессирующийся конструкт. 8. Способ по одному из пп.1-7, в котором экспрессирующийся конструкт представляет собой вектор экспрессии или конструкт линейной экспрессии. 9. Способ по одному из пп.4-8, в котором промотор pol I человека содержит последовательностьSEQ ID NO:1 или SEQ ID NO:2. 10. Способ по одному из пп.1-9, в котором вирус представляет собой сегментированный вирус. 11. Способ по одному из пп.1-10, в котором вирус представляет собой несегментированный вирус. 12. Способ по одному из пп.1-11, в котором вирус представляет собой вирус, содержащий отрицательную цепь РНК. 13. Способ по п.12, в котором вирус представляет собой вирус гриппа. 14. Клетки-хозяева собаки, продуцирующие вирус, содержащие по меньшей мере один экспрессирующий конструкт, кодирующий молекулу вирусной РНК, причем экспрессия молекулы вирусной РНК из конструкта контролируется промотором pol I приматов. 15. Клетки собаки, продуцирующие вирус, имеющие по меньшей мере один эндогенный промотор(промоторы) pol I, который контролирует (которые контролируют) экспрессию эндогенной рРНК, и по меньшей мере один неэндогенный промотор (промоторы) pol I приматов, который контролирует (которые контролируют) экспрессию вирусной РНК или комплементарную ей.