Композиции и способы для ингибирования экспрессии транстиретина

КОМПОЗИЦИИ И СПОСОБЫ ДЛЯ ИНГИБИРОВАНИЯ ЭКСПРЕССИИ ТРАНСТИРЕТИНА Данное изобретение относится к двухцепочечной рибонуклеиновой кислоте (дцРНК), поражающей ген транстиретина (TTR), и способам применения этой дцРНК для ингибирования TTR. Область техники, к которой относится изобретение Это изобретение относится к двухцепочечной рибонуклеиновой кислоте (дцРНК), поражающей ген транстиретина (TTR), и к способам применения этой дцРНК для ингибирования экспрессии TTR. Перекрестная ссылка на родственные заявки Эта заявка заявляет приоритет Предварительной заявки США с порядковым номером 61/106956,поданной 20 октября 2008 г.; Предварительной заявки США с порядковым номером 61/156670, поданной 2 марта 2009 г.; Предварительной заявки США с порядковым номером 61/185545, поданной 9 июня 2009 г.; Предварительной заявки США с порядковым номером 61/242783, поданной 15 сентября 2009 г.; и Предварительной заявки США с порядковым номером 61/244794, поданной 22 сентября 2009 г., все из которых включены здесь посредством ссылки в их полном виде, для всех целей. Ссылка на список последовательностей Эта заявка включает в себя список последовательностей, представленный электронно в виде текстового файла, названного txt, созданного 2009, с размером байтов. Этот список последовательностей включен посредством ссылки. Уровень техники Транстиретин (TTR) является секретируемым связывающим тиреоидный гормон белком. TTR связывает и транспортирует ретинолсвязывающий белок (RBP)/Витамин А и сывороточный тироксин (Т 4) в плазме и цереброспинальной жидкости. Как TTR с нормальной последовательностью, так и TTR с вариантной последовательностью вызывают амилоидоз. TTR с нормальной последовательностью вызывает амилоидоз сердца у людей, которые являются пожилыми, и амилоидоз этого типа называют сенильным системным амилоидозом (SSA) (также называемым сенильным сердечным амилоидозом (SCA. SSA часто сопровождается микроскопическими отложениями во многих других органах. Мутации TTR ускоряют процесс образования TTRамилоида и являются наиболее важным фактором риска для развития клинически значимого TTRамилоидоза (также называемого ATTR (амилоидозом транстиретинового типа. Известно, что более 85 амилоидогенных вариантов TTR вызывают системный наследственный амилоидоз. Главным местом экспрессии TTR является печень. Другие существенные места экспрессии включают в себя сосудистое сплетение, сетчатку и поджелудочную железу.TTR-амилоидоз проявляется в различных формах. При более сильном поражении периферической нервной системы это заболевание называют наследственной амилоидной невропатией (FAP). Когда первично вовлечено сердце, но не нервная система, это заболевание называют наследственной амилоидной кардиомиопатией (FAC). Третий основной тип TTR-амилоидоза называют лептоменингеальным амилоидозом/амилоидозом ЦНС (центральной нервной системы). Было показано, что двухцепочечные молекулы РНК (дцРНК) блокируют экспрессию генов в высоко консервативном механизме, известном как интерференция РНК (RNAi). WO 99/32619 (Fire et al) описал применение дцРНК, состоящей по меньшей мере из 25 нуклеотидов, для ингибирования экспрессии генов в С. elegans. Было также показано, что дцРНК деградирует РНК-мишень в других организмах (см.,например, WO 99/53050, Waterhouse et al.; и WO 99/61631, Heifetz et al.), Drosophila (см., например, YangUS. 20070207974 описывает функциональные и гиперфункциональные siRNA. US. 20090082300 описывает антисмысловые молекулы, направленные против TTR. U.S. Pat. No. 7250496 описывает микроРНК, направленные против TTR. Сущность изобретения В одном варианте осуществления это изобретение обеспечивает двухцепочечную рибонуклеиновую кислоту (дцРНК) для ингибирования экспрессии транстиретина, причем указанная дцРНК содержит смысловую цепь и антисмысловую цепь, причем эта антисмысловая цепь содержит участок, комплементарный части мРНК, кодирующей транстиретин (TTR), где указанный участок комплементарности имеет длину менее 30 нуклеотидов и эта антисмысловая цепь содержит 15 или более смежных нуклеотидовSEQ ID NO:170, SEQ ID NO:450, SEQ ID NO:730 или SEQ ID NO:1010. В родственном варианте осуществления, эта смысловая цепь содержит 15 или более смежных нуклеотидов SEQ ID NO:169, SEQ IDNO:449, SEQ ID NO:729 или SEQ ID NO:1009. Еще в одном варианте осуществления, эта смысловая цепь состоит из SEQ ID NO:449, а антисмысловая цепь состоит из SEQ ID NO:450. В другом родственном варианте осуществления, эта смысловая цепь состоит из SEQ ID NO:729, а эта антисмысловая цепь состоит из SEQ ID NO:730. Еще в одном родственном варианте осуществления, смысловая цепь состоит из SEQID NO:1009, а антисмысловая цепь состоит из SEQ ID NO:1010. В другом родственном варианте осуществления, эта дцРНК содержит смысловую цепь, выбранную из таблиц 3 А, 3 В, 4, 6 А, 6 В, 7 и 16, и антисмысловую цепь, выбранную из таблиц 3 А, 3 В, 4, 6 А, 6 В, 7 и 16. В некоторых вариантах осуществления участок комплементарности между антисмысловой цепью этой дцРНК и мРНК, кодирующей транстиретин, имеет длину 19 нуклеотидов. В другом варианте осуществления, этот участок комплементарности состоит из SEQ ID NO:169. В других вариантах осуществления, каждая цепь дцРНК имеет длину 19, 20, 21, 22, 23 или 24 нуклеотидов. Еще в одном варианте осуществления каждая цепь имеет длину 21 нуклеотид. В некоторых вариантах осуществления дцРНК для ингибирования экспрессии транстиретина не расщепляет мРНК TTR между нуклеотидом аденином в положении 637 SEQ ID NO:1331 и нуклеотидом гуанином в положении 638 of SEQ ID NO:1331. В других вариантах осуществления, эта дцРНК расщепляет мРНК TTR между нуклеотидом гуанином в положении 636 SEQ ID NO:1331 и нуклеотидом аденином в положении 637 SEQ ID NO:1331. В некоторых вариантах осуществления эта дцРНК отжигается с мРНК TTR между нуклеотидом гуанином в положении 628 SEQ ID NO:1331 и нуклеотидом урацилом в положении 646 SEQ ID NO:1331. В других родственных вариантах осуществления это изобретение обеспечивает дцРНК, описанную выше, для ингибирования экспрессии транстиретина, причем эта дцРНК содержит по меньшей мере один или несколько модифицированных нуклеотидов. В родственных вариантах осуществления, по меньшей мере один модифицированный нуклеотид (или нуклеотиды) выбран (выбраны) из группы, состоящей из: 2'-О-метилмодифицированного нуклеотида, нуклеотида, содержащего 5'-фосфоротиоатную группу, и конечного нуклеотида, связанного с холестерил-производным или группой бисдециламида додекановой кислоты. В другом родственном варианте осуществления, модифицированный нуклеотид выбран из группы,состоящей из 2'-дезокси-2'-фтор-модифицированного нуклеотида,2'-дезоксимодифицированного нуклеотида, замкнутого нуклеотида, лишенного азотистого основания нуклеотида,2'-амино-модифицированного нуклеотида, 2'-алкил-модифицированного нуклеотида, морфолинонуклеотида, фосфорамидата и содержащего неприродное основание нуклеотида. В некоторых вариантах осуществления, эта дцРНК содержит по меньшей мере один 2'-метилмодифицированный нуклеотид. В других вариантах осуществления, вышеописанная дцРНК для ингибирования экспрессии транстиретина конъюгирована с лигандом или приготовлена в липидной готовой форме. В некоторых вариантах осуществления, эта липидная готовая форма может быть готовой LNP-формой, готовой LNP01 формой, готовой XTC-SNALP-формой или готовой SNALP-формой. В родственных вариантах осуществления, готовая XTC-SNALP-форма является следующей: использующей 2,2-дилинолеил-4 диметиламиноэтил-[1,3]-диоксолан (ХТС) с XTC/DPPC/холестерин/PEG-cDMA в соотношении 57,1/7,1/34,4/1,4 и отношение липид:siRNA приблизительно 7. В других родственных вариантах осуществления, смысловая цепь этой дцРНК состоит из SEQ ID NO:1009 и антисмысловая цепь состоит из SEQID NO:1010, и эта дцРНК приготовлена в готовой форме ХТС-SNALP следующим образом: с использованием 2,2-дилинолеил-4-диметиламиноэтил-[1,3]-диоксолана (ХТС) с XTC/DPPC/холестерин/PEGcDMA в соотношении 57,1/7,1/34,4/1,4 и отношения липид:siRNA приблизительно 7. Альтернативно,дцРНК, такая как дцРНК, описанные выше, может быть приготовлена в готовой LNP09-форме следующим образом: с использованием XTC/DSPC/Chol/PEG2000-C14 в соотношении 50/10/38,5/1,5 мол.% и отношения липид:siRNA приблизительно 11:1. В другой вариации, эту дцРНК готовят в готовой LNP11 форме следующим образом: с использованием MC3/DSPC/Chol/PEG2000-C14 в соотношении 50/10/38,5/1,5 мол.% и соотношения липид:siRNA приблизительно 11:1. В другом варианте осуществления, эта дцРНК приготовлена в готовой LNP09-форме или LNP11-форме и уменьшает уровни мРНК TTR приблизительно на 85-90% при дозе 0,3 мг/кг относительно группы ЗФР-контроля. Еще в одном варианте осуществления, эта дцРНК приготовлена в готовой LNP09-форме или готовой LNP11-форме и уменьшает уровни мРНК TTR при дозе 0,1 мг/кг относительно группы ЗФР-контроля. В еще одном варианте осуществления, эта дцРНК приготовлена в готовой LNP09-форме или готовой LNP11-форме и уменьшает уровни белка TTR, как измерено при помощи Вестерн-блоттинга. Еще в одном варианте осуществления, эта дцРНК приготовлена следующим образом: с использованием DlinDMA сDLinDMA/DPPC/холестерин/PEG2000-cDMA в соотношении 57,1/7,1/34,4/1,4 и отношения липид:siRNA приблизительно 7. В некоторых вариантах осуществления, это изобретение обеспечивает дцРНК, такую как описанные выше дцРНК, для ингибирования экспрессии транстиретина, где введение этой дцРНК в клетку приводит приблизительно к 95% ингибированию экспрессии мРНК TTR, как измерено ПЦР-анализом реального времени, где этой клеткой является клетка HepG2 или клетка Нер 3 В и где концентрация дцРНК равна 10 нМ. В родственных вариантах осуществления, введение этой дцРНК в клетку приводит приблизительно к 74% ингибированию экспрессии мРНК TTR, как измерено анализом разветвленной ДНК, где этой клеткой является клетка HepG2 или клетка HepG2 и где концентрация дцРНК равна 10 нМ. В других родственных вариантах осуществления, эта дцРНК имеет IC50 менее 10 пМ в клетке HepG2, где концентрация дцРНК равна 10 нМ. В других родственных вариантах осуществления, эта дцРНК имеет ED50 приблизительно 1 мг/кг. В других родственных вариантах осуществления, введение этой дцРНК уменьшает мРНК TTR приблизительно на 80% в печени собакоподобной обезьяны, где концентрация этой дцРНК равна 3 мг/кг. В других родственных вариантах осуществления, введение этой дцРНК не приводит к иммуностимулирующей активности в мононуклеарных клетках периферической крови (РВМС),как измерено при помощи ELISA-анализов на IFN- и TNF-. В других родственных вариантах осуществления, введение дцРНК уменьшает уровни мРНК TTR печени приблизительно на 97% или сывороточные уровни белка TTR приблизительно на 90%, при концентрации дцРНК 6 мг/кг. В других родственных вариантах осуществления, введение дцРНК уменьшает уровни мРНК TTR печени и/или сыворо-2 020312 точные уровни белка TTR до 22 дней, где концентрация дцРНК равна 6 или 3 мг/кг. В других родственных вариантах осуществления, эта дцРНК подавляет сывороточные уровни белка TTR до дня 14 после обработки при введении субъекту, нуждающемуся в этом, при 1 или 3 мг/кг. В других родственных вариантах осуществления, эта дцРНК уменьшает экспрессию TTR на 98,9% в клетке Нер 3 В при концентрации 0,1 нМ, как измерено ПЦР реального времени. В других родственных вариантах осуществления, эта дцРНК уменьшает экспрессию TTR на 99,4% в клетке Нер 3 В при концентрации 10 нМ, как измерено ПЦР реального времени. В других вариантах осуществления, это изобретение обеспечивает двухцепочечную рибонуклеиновую кислоту (дцРНК) для ингибирования экспрессии транстиретина (TTR), где указанная дцРНК содержит смысловую цепь и антисмысловую цепь, где эта антисмысловая цепь содержит участок, комплементарный части мРНК, кодирующей транстиретин (TTR), причем указанный участок комплементарности имеет длину менее 30 нуклеотидов, и где эта дцРНК содержит смысловую цепь, выбранную из таблиц 3 А, 3 В, 4, 6 А, 6 В, 7 и 16, и антисмысловую цепь, выбранную из таблиц 3 А, 3 В, 4, 6 А, 6 В, 7 и 16. В другом варианте осуществления это изобретение обеспечивает двухцепочечную рибонуклеиновую кислоту (дцРНК) для ингибирования экспрессии транстиретина (TTR), где указанная дцРНК содержит антисмысловую цепь, содержащую участок, комплементарный 15-30 нуклеотидам из нуклеотидов 618-648 SEQ ID NO:1331 и где указанная антисмысловая цепь спаривается с гуанином в положении 628SEQ ID NO:1331. В некоторых вариантах осуществления, это изобретение обеспечивает клетку, содержащую любую из дцРНК, описанных в разделе "Сущность изобретения" выше. В некоторых других вариантах осуществления, это изобретение обеспечивает вектор, содержащий нуклеотидную последовательность, которая кодирует по меньшей мере одну цепь любой из дцРНК, описанных в разделе "Сущность изобретения" выше. В некоторых вариантах осуществления, этот вектор находится в клетке. В других вариантах осуществления, это изобретение обеспечивает фармацевтическую композицию для ингибирования экспрессии гена TTR, содержащую дцРНК, описанную в разделе Сущность изобретения выше, и фармацевтически приемлемый носитель. В родственных вариантах осуществления, это изобретение обеспечивает фармацевтическую композицию для ингибирования экспрессии гена TTR,содержащую дцРНК и готовую SNALP-форму, где эта дцРНК содержит антисмысловую цепь, которая имеет длину менее 30 нуклеотидов и содержит 15 или более смежных нуклеотидов SEQ ID NO:170, SEQID NO:450, SEQ ID NO:730 или SEQ ID NO:1010, и где эта готовая SNALP-форма содержит DlinDMA,DPPC, холестерин и PEG2000-CDMA в соотношении 57,1/7,1/34,4/1,4 соответственно. Еще в одном варианте осуществления, это изобретение обеспечивает способ ингибирования экспрессии TTR, предусматривающий: (а) контактирование клетки с любой из дцРНК, описанных в разделе"Сущность изобретения" выше; (b) поддержание клетки, полученной в стадии (а), в течение времени,достаточного для деградации мРНК-транскрипта гена TTR, с ингибированием посредством этого экспрессии гена TTR в этой клетке. Еще в одном варианте осуществления, это изобретение обеспечивает способ лечения нарушения,опосредованного экспрессией TTR, предусматривающий введение человеку, нуждающемуся в таком лечении, терапевтически эффективного количества любой из дцРНК, описанных в разделе "Сущность изобретения" выше. В родственных вариантах осуществления, эту дцРНК вводят человеку при приблизительно 0,01, 0,1, 0,5, 1,0, 2,5 или 5,0 мг/кг. Еще в одном родственном варианте осуществления человек,получающий лечение, имеет транстиретиновый амилоидоз и/или нарушение печени. В родственном варианте осуществления этот человек дополнительно имеет трансплантат печени. Еще в одном варианте осуществления, введение дцРНК уменьшает мРНК TTR приблизительно на 80% в печени человека, когда концентрация дцРНК равна 3 мг/кг. Еще в одном родственном варианте осуществления, дцРНК не приводит к иммуностимулирующей активности в человеке, как измерено ELISA-анализами на IFN- и TNF. В другом родственном варианте осуществления, введение дцРНК уменьшает уровни мРНК TTR печени приблизительно на 97% или сывороточные уровни белка TTR приблизительно на 90%, когда концентрация дцРНК равна 6 мг/кг. В другом родственном варианте осуществления, введение дцРНК уменьшает уровни мРНК TTR печени и/или уровни белка TTR сыворотки до 22 дней, когда концентрация дцРНК равна 6 мг/кг или 3 мг/кг. Еще в одном родственном варианте осуществления, дцРНК готовят в готовойLNP09-форме следующим образом: с использованием XTC/DSPC/Chol/PEG2000-C14 в соотношении 50/10/38,5/1,5 мол.% и отношения липид:siRNA приблизительно 11:1. Еще в одном родственном варианте осуществления, дцРНК готовят в готовой LNP11-форме следующим образом: с использованиемMC3/DSPC/Chol/PEG2000-C14 в соотношении 50/10/38,5/1,5 мол.% и отношения липид:siRNA приблизительно 11:1. Еще в одном родственном варианте осуществления, эта дцРНК приготовлена в готовойLNP09-форме или готовой LNP11-форме и уменьшает уровни мРНК TTR приблизительно на 85-90% при дозе 0,3 мг/кг относительно группы ЗФР-контроля. Еще в одном родственном варианте осуществления,эта дцРНК приготовлена в готовой LNP09-форме или готовой LNP11-форме и уменьшает уровни белкаTTR зависимым от дозы образом относительно группы ЗФР-контроля, как измерено Вестернблоттингом. Еще в одном родственном варианте осуществления, введение дцРНК подавляет уровни бел-3 020312 ка TTR в сыворотке до дня 14 после обработки при введении человеку 1 мг/кг или 3 мг/кг. Еще в одном родственном варианте осуществления, эта дцРНК приготовлена в готовой SNALP-форме следующим образом: с использованием DlinDMA с соотношением DLinDMA/DPPC/холестерин/PEG2000-cDМА 57,1/7,1/34,4/1,4 и отношения липид:siRNA приблизительно 7. В другом варианте осуществления это изобретение обеспечивает применение дцРНК для лечения нарушения, опосредованного экспрессией TTR, предусматривающее введение человеку, нуждающемуся в таком лечении, терапевтически эффективного количества любой из дцРНК, описанных в разделе"Сущность изобретения" выше. В родственных вариантах осуществления эту дцРНК вводят человеку при приблизительно 0,01, 0,1, 0,5, 1,0, 2,5 или 5,0 мг/кг. В другом конкретном родственном варианте осуществления дцРНК вводят человеку при приблизительно 1,0 мг/кг. В другом родственном варианте осуществления, этот человек имеет транстиретиновый амилоидоз и/или нарушение печени. В другом варианте осуществления, этот человек дополнительно имеет трансплантат печени. В другом варианте осуществления это изобретение обеспечивает применение дцРНК в способе ингибирования экспрессии TTR в клетке, где этот способ предусматривает: (а) контактирование клетки с дцРНК, описанной в разделе "Сущность изобретения" выше; и (b) поддержание клетки, полученной в стадии (а) , в течение времени, достаточного для деградации мРНК-транскрипта гена TTR, с ингибированием посредством этого экспрессии гена TTR в этой клетке. Подробности одного или нескольких вариантов осуществления этого изобретения представлены в приведенном ниже описании. Другие признаки, цели и преимущества этого изобретения будут очевидными из описания и фигур и из формулы изобретения. Описание фигур Фиг. 1 является диаграммой уровней TNF- и IFN- в культивируемых РВМС человека после трансфекции siRNA TTR. Фиг. 2 А и 2 В являются кривыми доза-ответ для AD-1832 4 и AD-18328, соответственно, в клеткахHepG2. Фиг. 3 является кривой доза-ответ для AD-18246 в клетках HepG2. Фиг. 4 А и 4 В показывают ингибирование уровней мРНК печени и уровней белка плазмы, соответственно, в трансгенных мышах H12 9-mTTR-KO/iNOS-KO/hTTR посредством внутривенного болюсного введения TTR-dsRNA (AD-18324, AD-18328 и AD-18246), приготовленного в LNP01. Фиг. 5 является диаграммой, суммирующей измерения уровней мРНК TTR в печени приматов (не человека) после 15-минутной внутривенной инфузии TTR-dsRNA (AD-18324 и AD-18328), приготовленных в SNALP. Фиг. 6 А и 6 В показывают ингибирование мРНК V30M-TTR печени человека и уровней белка в сыворотке, соответственно, в трансгенных мышах посредством внутривенного болюсного введенияSNALP-18328. Средние величины групп определяли, нормализовали относительно группы ЗФР-контроля и затем строили диаграмму. Стержни ошибок представляют стандартные отклонения. Процентное уменьшение средней величины группы, относительно ЗФР, показано для групп SNALP-1955 и SNALP18328. ( р 0,001, однофакторный дисперсионный анализ (ANOVA) с апостериорным (post-hoc) критерием Дунна. Фиг. 7 А и 7 В показывают продолжительность уменьшения мРНК V30M-TTR печени человека, соответственно, в трансгенных мышах на протяжении 22 дней после однократного внутривенного болюсного введения SNALP-18328. Определяли средние величины групп. Уровни мРНК TTR/GAPDH нормализовали относительно уровней дня 0 и строили диаграмму. Рассчитывали процентное уменьшение нормализованных уровней мРНК TTR относительно SNALP-1955 для каждой временной точки, и они показаны для групп SNALP-18328. ( р 0,001, однофакторный дисперсионный анализ (ANOVA) с апостериорным (post-hoc) критерием Дунна. Фиг. 8 показывает временной ход уровней белка TTR в сыворотке в приматах (не человеке) на протяжении 14 дней после однократной 15-минутной инфузии SNALP-18328. Фиг. 9 показывает уменьшение TTR-иммунореактивности в различных тканях мышей с нокаутомV30M TTR/HSF-1 человека после внутривенного болюсного введения SNALP-18328. E, пищевод; S, желудок; I1, кишечник/двенадцатиперстная кишка; I4, кишечник/ободочная кишка; N, нерв; D, дорсальные ганглии блуждающего нерва. Фиг. 10 показывает измерения мРНК TTR и уровни белка в сыворотке, соответственно, в печени приматов (не человека) после 15-минутной внутривенной инфузии XTC-SNALP-18328. Фиг. 11 А и 11 В показывают измерения мРНК TTR и уровней белка в сыворотке, соответственно, в печени приматов (не человека) после 15-минутной внутривенной инфузии LNP09-18328 или LNP1118328. Фиг. 11 с показывает временной ход уровней белка TTR в сыворотке на протяжении 28 дней после 15-минутной внутривенной инфузии 0,3 мг/кг LNP09-18328, в сравнении с группой ЗФР-контроля. Фиг. 12 показывает последовательность мРНК TTR человека (Ref. Seq. NM000371.3, SEQ IDNO:1331). Фиг. 13 А и 13 В являются последовательностями мРНК TTR человека и крысы, соответственно. Фиг. 13 А является последовательностью мРНК TTR человека (Ref. Seq. NM000371.2, SEQ ID NO: 1329). Фиг. 13 В является мРНК TTR крысы (Ref. Seq. NM012681.1, SEQ ID NO:1330). Фиг. 14 показывает сопоставление нуклеотидов NM000371.3, NM000371.2 и AD-18328. Фиг. 15 иллюстрирует симптомы и мутации в TTR, ассоциированные с наследственной амилоидной невропатией, наследственной амилоидной кардиомиопатией и амилоидозом ЦНС. Фиг. 16 показывает уменьшение уровней мРНК TTR в печени с использованием SNALP-18534 с различными продолжительностями инфузии. Группам животных (n=4/группа) вводили 1 мг/кг SNALP18534 посредством 15-минутной или 1-, 2- или 3-часовой инфузии. Спустя сорок восемь часов, крыс эвтанизировали и печени извлекали. Измеряли уровни мРНК TTR и GAPDH из лизатов печени с использованием Quantigene bDNA-анализа. Для каждого животного рассчитывали отношение уровней мРНК TTR к мРНК GAPDH. Определяли средние величины групп и нормализовали их относительно группы ЗФР-контроля и затем строили диаграммы. Стержни ошибок представляют стандартные отклонения. ( р 0,001, однофакторный дисперсионный анализ (ANOVA) с апостериорным (post-hoc) критерием Бонферрони, относительно ЗФР). Фиг. 17 показывает измерения уровней мРНК TTR в печени крыс после 15-минутной внутривенной инфузии LNP07-18534 или LNP08-18534. Фиг. 18 показывает in vivo ингибирование эндогенных уровней мРНК TTR в печенях крыс SpragueDawley после 15-минутной IV-инфузии LNP09-18534 или LNP11-18534. Группам животных (n=4/группа) вводили внутривенно 0,01, 0,03, 0,1 или 0,3 мг/кг LNP09-18534, LNP11-18534; или ЗФР посредством 15 минутной инфузии. Спустя сорок восемь часов крыс эвтанизировали и печени извлекали. Измеряли уровни мРНК TTR и GAPDH из лизатов биопсии печени с использованием Quantigene bDNA-анализа. Для каждого животного рассчитывали отношение уровней мРНК TTR к мРНК GAPDH. Определяли средние величины групп и нормализовали их относительно группы ЗФР-контроля и затем строили диаграммы. Стержни ошибок представляют стандартные отклонения. Подробное описание изобретения Это изобретение обеспечивает дцРНК (dsRNA) и способы применения этих дцРНК для ингибирования экспрессии гена TTR в клетке или млекопитающем, где эта дцРНК поражает (деградирует) генTTR. Это изобретение обеспечивает также композиции и способы для лечения патологических состояний и заболеваний, таких как TTR-амилоидоз, в млекопитающем, вызываемых экспрессией гена TTR. дцРНК управляет последовательность-специфической деградацией мРНК посредством процесса, известного как интерференция РНК (RNAi). дцРНК (dsRNA) описанных здесь композиций включают в себя цепь РНК (антисмысловую цепь),имеющую участок, который имеет длину 30 нуклеотидов, обычно длину 19-24 нуклеотидов, и является по существу комплементарным по меньшей мере части мРНК-транскрипта гена TTR. Применение этих дцРНК делает возможной нацеленную деградацию мРНК генов, которые предположительно участвуют в патологиях, ассоциированных с экспрессией TTR в млекопитающих. Очень низкие дозы дцРНК TTR, в частности, могут специфически и эффективно опосредовать RNAi, приводя к значимому ингибированию экспрессии гена TTR. С использованием анализов на основе клеток авторы этого изобретения продемонстрировали, что дцРНК, поражающие TTR, могут специфически и эффективно опосредовать RNAi, приводя к значимому ингибированию экспрессии гена TTR. Таким образом, способы и композиции, включающие в себя эти дцРНК, применимы для лечения патологических процессов, которые могут опосредоваться даун-регуляцией (понижающей регуляцией) TTR, например, в лечении нарушения печени илиTTR-амилоидоза, например FAP. Способы и композиции, содержащие дцРНК TTR, применимы для лечения патологических процессов, опосредуемых экспрессией TTR, таких как TTR-амилоидоз. В одном варианте осуществления способ лечения нарушения, опосредуемого экспрессией TTR, предусматривает введение человеку, нуждающемуся в таком лечении, терапевтически эффективного количества дцРНК, поражающей (ген) TTR. В одном варианте осуществления дцРНК вводят этому человеку при приблизительно 0,01, 0,1, 0,5, 1,0, 2,2,5, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 или 25 мг/кг. Следующее подробное описание описывает, как можно готовить и применять композиции, содержащие дцРНК, для ингибирования экспрессии гена TTR, а также композиции и способы для лечения заболеваний и нарушений, вызываемых экспрессией этого гена. Фармацевтические композиции, описанные в этом изобретении, включают в себя дцРНК, имеющую антисмысловую цепь, содержащую участок комплементарности, который имеет длину менее 30 нуклеотидов, обычно длину 19-24 нуклеотидов, и является, по существу, комплементарным по меньшей мере части РНК-транскрипта гена TTR, вместе с фармацевтически приемлемым носителем. Композиции, представленные в этом изобретении, включают в себя также дцРНК, имеющую антисмысловую цепь, имеющую участок комплементарности, который имеет длину менее 30 нуклеотидов, обычно длину 19-24 нуклеотидов, и является, по существу, комплементарным по меньшей мере части РНК-транскрипта гена TTR. Смысловая цепь дцРНК может включать в себя 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 или более смежных нуклеотидов SEQ ID NO:169, SEQ ID NO:449, SEQ ID NO:729 или SEQ ID NO:1009. Антисмысловая цепь дцРНК может включать в себя 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 или более смежных нуклеотидов SEQ ID NO:170,SEQ ID NO:450, SEQ ID NO:730 или SEQ ID NO:1010. В одном варианте осуществления, смысловая цепь дцРНК может состоять из SEQ ID NO:449 или ее фрагментов и антисмысловая цепь может состоять изSEQ ID NO:450 или ее фрагментов. В одном варианте осуществления, смысловая цепь дцРНК может состоять из SEQ ID NO:729 или ее фрагментов и антисмысловая цепь может состоять из SEQ ID NO:730 или ее фрагментов. В одном варианте осуществления, смысловая цепь дцРНК может состоять из SEQ IDNO:1009 или ее фрагментов и антисмысловая цепь может состоять из SEQ ID NO:1010 или ее фрагментов. В одном варианте осуществления, дцРНК может включать в себя по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7,8, 9, 10 или более модифицированных нуклеотидов. В одном варианте осуществления, модифицированный нуклеотид может включать в себя 2'-O-метилмодифицированный нуклеотид, нуклеотид, содержащий 5'-фосфоротиоатную группу и/или концевой нуклеотид, связанный с холестерилпроизводным или группой бисдециламида додекановой кислоты. В одном варианте осуществления, модифицированный нуклеотид может включать в себя 2'-дезокси-2'-фтормодифицированный нуклеотид, 2'дезоксимодифицированный нуклеотид, замкнутый нуклеотид, лишенный азотистого основания нуклеотид, 2'-аминомодифицированный нуклеотид, 2'-алкилмодифицированный нуклеотид, морфолинонуклеотид, фосфорамидат и/или содержащий неприродное основание нуклеотид. В одном варианте осуществления, участок комплементарности дцРНК имеет длину по меньшей мере 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 или более нуклеотидов. В одном варианте осуществления участок комплементарности дцРНК имеет длину по меньшей мере 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20,21 или более смежных нуклеотидов SEQ ID NO:169. В одном варианте осуществления, каждая цепь дцРНК имеет длину 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23,24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 или более нуклеотидов. В одном варианте осуществления, дцРНК включает в себя смысловую цепь или ее состоящий из 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 нуклеотидов или 21 нуклеотида фрагмент, выбранный из табл. 3 А, 3 В, 4, 6 А, 6 В, 7 и 16, и антисмысловую цепь или ее состоящий из 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 нуклеотидов или 21 нуклеотида фрагмент, выбранный из табл. 3 А, 3 В, 4, 6 А, 6 В, 7 и 16. В одном варианте осуществления, введение дцРНК в клетку приводит приблизительно к 40, 45, 50,55, 60, 65, 70, 75, 80, 90, 95% или большему ингибированию экспрессии мРНК TTR, как измерено при помощи ПЦР-анализа реального времени. В одном варианте осуществления, введение дцРНК в клетку приводит приблизительно к 40-45%, 45-50%, 50-55%, 55-60%, 60-65%, 65-70%, 70-75%, 75-80%, 80-85%,85-90%, 90-95% или большему ингибированию экспрессии мРНК TTR, как измерено при помощи ПЦРанализа реального времени. В одном варианте осуществления, введение дцРНК в клетку приводит приблизительно к 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 90, 95% или большему ингибированию экспрессии мРНКTTR, как измерено при помощи анализа разветвленной ДНК. В одном варианте осуществления введение дцРНК в клетку приводит приблизительно к 40-45%, 45-50%, 50-55%, 55-60%, 60-65%, 65-70%, 70-75%,75-80, 80-85%, 85-90%, 90-95% или большему ингибированию экспрессии мРНК TTR, как измерено при помощи анализа разветвленной ДНК. В одном варианте осуществления, дцРНК имеет IC50 менее 0,01, 0,1, 1, 5, 10, 100 или 1000 пМ. В одном варианте осуществления, дцРНК имеет ED50 приблизительно 0,01, 0,1, 1, 5 или 10 мг/кг. В одном варианте осуществления, дцРНК может уменьшать мРНК TTR приблизительно на 40, 45,50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 90, 95% или более в собакоподобных обезьянах. В одном варианте осуществления, введение дцРНК уменьшает уровни мРНК TTR печени приблизительно на 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70,75, 80, 90, 95% или более или уровни белка TTR сыворотки приблизительно на 40%, 45%, 50%, 55%,60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 90%, 95% или более. В одном варианте осуществления, введение дцРНК уменьшает уровни мРНК TTR печени и/или уровни белка TTR сыворотки до 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11,12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 или более дней. В одном варианте осуществления, дцРНК приготовлена в готовой LNP-форме и уменьшает уровни мРНК TTR приблизительно на 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 90%, 95% или более при дозе 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9 или 1 мг/кг, относительно группы ЗФР-контроля. В одном варианте осуществления, дцРНК приготовлена в готовой LNP-форме и уменьшает уровни белка TTR приблизительно на 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 90, 95% или более относительно группы ЗФР-контроля, как измерено при помощи Вестерн-блоттинга. В одном варианте осуществления, дцРНК подавляет уровни белка TTR в сыворотке до дня 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 или 25 после лечения при введении субъекту, нуждающемуся в этом, при 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12,13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 или 25 мг/кг. Таким образом, в некоторых аспектах, в этом изобретении представлены фармацевтические композиции, содержащие дцРНК TTR и фармацевтически приемлемый носитель, способы применения этих композиций для ингибирования гена TTR и способы применения этих фармацевтических композиций для лечения заболеваний, вызываемых экспрессией гена TTR.I. Определения Для удобства, ниже обеспечено значение определенных терминов и фраз, используемых в этом описании, примерах и прилагаемой формуле изобретения. Если имеется явное разногласие между применением термина в других частях этого описания и его определением, даваемым в этом разделе, должно превалировать определение, приведенное в этом разделе."G", "С", "А" и "U" обычно обозначают, каждый, нуклеотид, который содержит гуанин, цитозин,аденин и урацил в качестве основания, соответственно. "Т" и "dT" используются здесь взаимозаменяемо и относятся к дезоксирибонуклеотиду, в котором нуклеооснованием является тимин, например, дезоксириботимин. Однако должно быть понятно, что термин "рибонуклеотид" или "нуклеотид" или "дезоксирибонуклеотид" может также относиться к модифицированному нуклеотиду, как более детально описано ниже, или суррогатной замененной части молекулы. Квалифицированному в данной области специалисту хорошо известно, что гуанин, цитозин, аденин и урацил могут быть заменены другими частями молекул по существу без изменения свойств спаривания оснований олигонуклеотида, содержащего нуклеотид, несущий такую замененную часть. Например, без ограничения, нуклеотид, содержащий инозин в качестве его основания, может участвовать в спаривании оснований с нуклеотидами, содержащими аденин, цитозин или урацил. Таким образом, нуклеотиды, содержащие урацил, гуанин или аденин, могут быть заменены в нуклеотидных последовательностях этого изобретения нуклеотидом, содержащим, например, инозин. Последовательности, содержащие такие замененные части, являются вариантами этого изобретения. В данном контексте, термин "транстиретин" ("TTR") относится к гену в клетке. TTR известен также как ATTR, HsT2651, PALB, пре(д)альбумин, ТВРА и транстиретин (пре(д)альбумин, амилоидоз типа I). Последовательность мРНК-транскрипта TTR человека может быть найдена в NM000371. Последовательность мРНК TTR мыши может быть найдена в NM013697.2 и последовательность мРНК TTR крысы может быть найдена в NM012681.1. В данном контексте, "последовательность-мишень" относится к смежной части нуклеотидной последовательности молекулы мРНК, образованной во время транскрипции гена TTR, в том числе мРНК,которая является продуктом процессинга РНК первичного продукта транскрипции. В данном контексте, термин "цепь, содержащая последовательность", относится к олигонуклеотиду, содержащему цепь нуклеотидов, которая описывается последовательностью, ссылающейся на использование стандартной номенклатуры нуклеотидов. В данном контексте, если нет другого указания, термин "комплементарная", при использовании для описания первой нуклеотидной последовательности относительно второй нуклеотидной последовательности, относится к способности олигонуклеотида или полинуклеотида, содержащего первую нуклеотидную последовательность, гибридизоваться и образовывать дуплексную структуру при определенных условиях с олигонуклеотидом или полинуклеотидом, содержащим вторую нуклеотидную последовательность, как будет понятно квалифицированному в данной области лицу. Такие условия могут быть, например, строгими условиями, где строгие условия могут включать в себя: 400 мМ NaCl, 40 мМ PIPES рН 6,4, 1 мМ ЭДТА, 50 или 70 С в течение 12-16 ч с последующим промыванием. Могут использоваться другие условия, например, физиологически релевантные условия, которые могут встречаться внутри организма. Квалифицированный в данной области специалист будет способен определить набор условий,наиболее подходящих для тестирования комплементарности двух последовательностей в соответствии с конечным применением гибридизуемых нуклеотидов. Этот тест включает в себя спаривание оснований олигонуклеотида или полинуклеотида, содержащего первую нуклеотидную последовательность, с олигонуклеотидом или полинуклеотидом, содержащим вторую нуклеотидную последовательность, на протяжении полной длины этой первой и второй нуклеотидной последовательности. Такие последовательности могут называться здесь "полностью комплементарными" относительно друг друга. Однако, когда первую последовательность называют здесь"по существу комплементарной" относительно второй последовательности, эти две последовательности могут быть полностью комплементарными, или они могут образовывать одну или несколько, но обычно не более 4, 3 или 2 ошибочно спаренных пар оснований после гибридизации, с сохранением способности гибридизоваться при условиях, наиболее релевантных относительно их конечного применения. Однако,когда два олигонуклеотида конструируют для образования, после гибридизации, одного или нескольких одноцепочечных выступов, такие выступы не должны рассматриваться как ошибочные спаривания в связи с определением комплементарности. Например, дцРНК, содержащая один олигонуклеотид с длиной 21 нуклеотида и другой олигонуклеотид с длиной 23 нуклеотида, причем этот более длинный олигонуклеотид содержит последовательность из 21 нуклеотида, которая полностью комплементарна более короткой последовательности, может все еще называться "полностью комплементарной" для описанных здесь целей."Комплементарные" последовательности в данном контексте могут также включать в себя, или быть полностью образованы из них, пары оснований не Уотсона-Крика и/или пары оснований, образованные из неприродных и модифицированных нуклеотидов, пока удовлетворяются вышеуказанные требования в отношении их способности гибридизоваться. Такие пары оснований не Уотсона-Крика включают в себя, но не ограничиваются ими, спаривание G:U Уоббла или спаривание оснований по Хугстину. Термины "комплементарные", "полностью комплементарные" и "по существу комплементарные" могут использоваться в данном контексте в отношении спаривания оснований между смысловой цепью и антисмысловой цепью dsRNA, или между антисмысловой цепью дцРНК и последовательностьюмишенью, как будет понятно из контекста их применения. В данном контексте, полинуклеотид, который является "по существу комплементарным по меньшей мере части" мессенджер РНК (мРНК), обозначает полинуклеотид, который является по существу комплементарным смежной (непрерываемой) части представляющей интерес мРНК (например, мРНК,кодирующей TTR), включающей в себя 5'-UTR, открытую рамку считывания (ORF), или 3'-UTR. Например, полинуклеотид является комплементарным по меньшей мере части мРНК TTR, если эта последовательность является, по существу, комплементарной непрерываемой части мРНК, кодирующей TTR. Термин "двухцепочечная РНК" или "дцРНК" относится в данном контексте к комплексу молекул рибонуклеиноых кислот, имеющему дуплексную структуру, содержащую две антипараллельных и по существу комплементарных, как определено выше, цепи нуклеиновых кислот. Обычно большинство нуклеотидов каждой цепи являются рибонуклеотидами, но, как описано подробно здесь, каждая цепь или обе цепи могут также включать в себя по меньшей мере один не-рибонуклеотид, например дезоксирибонуклеотид, и/или модифицированный нуклеотид. Кроме того, в контексте этого описания, "дцРНК" может включать в себя химические модификации во множественных нуклеотидах, включающие в себя существенные модификации во многих нуклеотидах, и включающие в себя все типы модификаций, описанные здесь или известные в данной области. Любые такие модификации, используемые в молекуле типа siRNA, охватываются термином "дцРНК" для целей этого описания и формулы изобретения. Две цепи, образующие дуплексную структуру, могут быть различными частями одной большей молекулы РНК, или они могут быть отдельными молекулами РНК. Когда эти две цепи являются частью одной большей молекулы, и, следовательно, соединены непрерываемой цепью нуклеотидов между 3'концом одной цепи и 5'-концом соответствующей другой цепи с образованием дуплексной структуры,эту соединяющую РНК-цепь называют "шпилечной петлей". Когда эти две цепи соединены ковалентно другим способом, чем непрерываемая цепь нуклеотидов, между 3'-концом одной цепи и 5'-концом соответствующей другой цепи с образованием дуплексной структуры, эту соединяющую структуру называют"линкером". Эти цепи РНК могут иметь одинаковое или разное число нуклеотидов. Максимальное число пар оснований равно числу нуклеотидов в самой короткой цепи дцРНК минус любые выступы, которые присутствуют в этом дуплексе. Наряду с этой дуплексной структурой, дцРНК может содержать один или несколько нуклеотидных выступов. Термин "siRNA" здесь также относится к дцРНК, описанной выше. В данном контексте термин "нуклеотидный выступ" относится к неспаренному нуклеотиду или неспаренным нуклеотидам, которые выступают из дуплексной структуры дцРНК, когда 3'-конец одной цепи этой дцРНК простирается за пределы 5'-конца другой цепи, или наоборот. "Тупой" или "тупой конец" обозначает, что на конце этой дцРНК не имеются неспаренные нуклеотиды, т.е. ни на одном конце этой молекулы нет нуклеотидного выступа. Термин "антисмысловая цепь" относится к цепи дцРНК, которая включает в себя участок, который является по существу комплементарным последовательности-мишени. В данном контексте, термин "участок комплементарности" относится к участку на антисмысловой цепи, который является, по существу,комплементарным последовательности, например последовательности-мишени, определенной здесь. Когда этот участок комплементарности является не полностью комплементарным этой последовательности-мишени, эти ошибочные спаривания являются наиболее приемлемыми в концевых участках и, если присутствуют, находятся обычно в концевом участке или в концевых участках, например, в пределах 6,5, 4, 3 или 2 нуклеотидов 5'- и/или 3'-конца. Термин "смысловая цепь" относится в данном контексте к цепи дцРНК, которая включает в себя участок, который является, по существу, комплементарным участку антисмысловой цепи. В данном контексте термин "SNALP" относится к стабильной частице нуклеиновая кислота-липид.SNALP представляет пузырек из липидов, покрывающий уменьшенное водное пространство, содержащее нуклеиновую кислоту, такую как дцРНК или плазмиду, из которой транскрибируется дцРНК.SNALP описаны, например, в Публикациях заявок на патент США с номерами 200602 40093,20070135372 и USSN 61/045228, поданными 15 апреля 2008 г. Эти заявки включены здесь посредством ссылки."Введение в клетку" в контексте с дцРНК обозначает облегчение поглощения или абсорбции в эту клетку, как понятно квалифицированным в данной области специалистам. Абсорбция или поглощение дцРНК может осуществляться без посторонней помощи диффузионными или активными клеточными процессами, или при помощи вспомогательных агентов или устройств. Значение этого термина не ограничивается клетками in vitro; дцРНК может также быть "введенной в клетку", где эта клетка является частью живого организма. В таком случае, введение в эту клетку будет включать в себя доставку этому организму. Например, для доставки in vivo дцРНК может быть инъецирована в участок ткани или введена системно. Введение in vitro в клетку включает в себя способы, известные в данной области, такие как электропорация и липофекция. Дополнительные подходы описаны здесь или известны в данной области. Термины "сайленсинг", "ингибирование экспрессии", "даун-регуляция (понижающая регуляция) экспрессии", "супрессия экспрессии" и т.п., когда они относятся к гену TTR, относятся здесь, по меньшей мере, к частичной супрессии экспрессии гена TTR, которая проявляется уменьшением количества мРНК,которое может быть выделено из первой клетки или группы клеток, в которых транскрибируется генTTR и которые были обработаны таким образом, что ген TTR является ингибированным, в сравнении со второй клеткой или группой клеток, по существу идентичных первой клетке или группе клеток, но которые не были обработаны таким образом (контрольных клеток). Степень ингибирования обычно выражают в виде Альтернативно, степень ингибирования может выражаться в виде уменьшения параметра, который функционально связан с экспрессией гена TTR, например в виде количества белка, кодируемого геномTTR, который секретируется клеткой, или количества клеток, проявляющих определенный фенотип, например апоптоз. В принципе сайленсинг гена TTR может быть определен в любой клетке, экспрессирующей эту мишень, или конститутивно, или генной инженерией, или любым подходящим анализом. Однако, при необходимости ссылки для определения, ингибирует ли конкретная дцРНК экспрессию генаTTR в определенной степени и, следовательно, может быть включена в это изобретение, анализы, обеспеченные в примерах ниже, будут обеспечивать такую ссылку. Например, в некоторых случаях,экспрессия гена TTR подавляется по меньшей мере приблизительно на 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 или 50% введением двухцепочечного олигонуклеотида, описанного в этом изобретении. В некоторых вариантах осуществления, ген TTR подавляется по меньшей мере приблизительно на 60, 70 или 80% введением двухцепочечного олигонуклеотида, описанного в этом изобретении. В некоторых вариантах осуществления ген TTR подавляется по меньшей мере приблизительно на 85, 90 или 95% введением двухцепочечного олигонуклеотида, описанного в этом изобретении. При использовании здесь в контексте экспрессии TTR, термины "лечить", "лечение" и т.п. относятся к облегчению или ослаблению патологических процессов, опосредуемых экспрессией TTR. В контексте данного изобретения, когда речь идет о любом из состояний, цитируемых здесь ниже (других, чем патологические процессы, опосредуемые экспрессией TTR), термины "лечить", "лечение" и т.п. обозначают облегчение или ослабление по меньшей мере одного симптома, ассоциированного с таким состоянием, или замедление или обращение прогрессирования такого состояния, например, замедление прогрессирования TTR-амилоидоза, такого как FAP. Симптомы TTR-амилоидоза включают в себя сенсорную невропатию (например, парестезию, гипестезию в дистальных участках конечностей), вегетативную невропатию (например, желудочно-кишечную дисфункцию, такую как язва желудка, или ортостатическую гипотензию), моторную невропатию, припадки, деменцию, миелопатию, полиневропатию, синдром канала запястья, вегетативную недостаточность, кардиомиопатию, помутнения стекловидного тела, почечную недостаточность, нефропатию, существенно пониженный mBMI (модифицированный индекс массы тела), дисфункцию черепных нервов и дистрофию корнеальной решетки. В данном контексте, фразы "терапевтически эффективное количество" и "профилактически эффективное количество" относятся к количеству, которое обеспечивает терапевтическую пользу в лечении,предупреждении или излечивании патологических процессов, опосредуемых экспрессией TTR, или хорошо видимого симптома патологических процессов, опосредуемых экспрессией TTR. Конкретное количество, которое является терапевтически эффективным, может быть легко определено медицинским работником с обычной квалификацией в данной области и может варьироваться в зависимости от факторов, известных в данной области, таких как, например, тип патологических процессов, опосредуемых экспрессией TTR, история болезни и возраст пациента, стадия патологических процессов, опосредуемых экспрессией TTR, и введение других антипатологических агентов процессов, опосредуемых экспрессиейTTR. В данном контексте, "фармацевтическая композиция" содержит фармакологически эффективное количество дцРНК и фармацевтически приемлемый носитель. В данном контексте, термины "фармакологически эффективное количество", "терапевтически эффективное количество" или просто "эффективное количество" относятся к количеству РНК, эффективному для получения предполагаемого фармакологического, терапевтического или превентивного результата. Например, если конкретное клиническое лечение считается эффективным, когда имеется по меньшей мере 25% уменьшение в измеримом параметре, ассоциированном с заболеванием или нарушением, терапевтически эффективное количество лекарственного средства для лечения этого заболевания или нарушения является количеством, необходимым для осуществления по меньшей мере 25% уменьшения в этом параметре. Например, терапевтически эффективное количество дцРНК, поражающей TTR, может уменьшать уровни TTR в сыворотке по меньшей мере на 25%. В другом примере, терапевтически эффективное количество дцРНК, поражающейTTR, может улучшать функцию печени или почечную функцию по меньшей мере на 25%. Термин "фармацевтически приемлемый носитель" относится к носителю для введения терапевтического агента. Такие носители включают в себя, но не ограничиваются ими, солевой раствор, забуференный раствор, декстрозу, воду, глицерин, этанол и их комбинации. Этот термин специфически исключает среду культуры клеток. Для лекарственных средств, вводимых перорально, фармацевтически приемле-9 020312 мые носители включают в себя, но не ограничиваются ими, фармацевтически приемлемые эксципиенты,такие как инертные разбавители, дезинтегрирующие агенты, связывающие агенты, смазывающие агенты,подслащивающие агенты, ароматизирующие агенты, красящие агенты и консерванты. Подходящие инертные разбавители включают в себя карбонат натрия и кальция, фосфат натрия и кальция, и лактозу,тогда как кукурузный крахмал и альгиновая кислота являются подходящими дезинтегрирующими агентами. Связывающие агенты могут включать в себя крахмал и желатин, тогда как смазывающими агентами, если они присутствуют, будут обычно стеарат магния, стеариновая кислота или тальк. Если желательно, таблетки могут быть покрыты материалом, таким как глицерилмоностеарат или глицерилдистеарат, для задержки абсорбции в желудочно-кишечном тракте. В данном контексте "трансформированной клеткой" является клетка, в которую был введен вектор,из которого может быть экспрессирована молекула дцРНК.II. Двухцепочечная рибонуклеиновая кислота Как описано более подробно здесь, это изобретение обеспечивает молекулы двухцепочечной рибонуклеиновой кислоты (дцРНК) для ингибирования экспрессии гена TTR в клетке или млекопитающем,например, в человеке, имеющем TTR-амилоидоз, где эта молекула дцРНК включает в себя антисмысловую цепь, имеющую участок комплементарности, который является комплементарным по меньшей мере части мРНК, образуемой в экспрессии гена TTR, и где этот участок комплементарности имеет длину менее 30 нуклеотидов, обычно длину 19-24 нуклеотидов, и где указанная дцРНК, после контакта с клеткой,экспрессирующей указанный ген TTR, ингибирует экспрессию указанного гена TTR по меньшей мере на 30%, как анализировано, например, при помощи ПЦР или способа на основе разветвленной ДНК(bDNA), или способа на основе белка, такого как Вестерн-блоттинг. Экспрессия гена TTR может уменьшаться по меньшей мере на 30% при измерении с использованием анализа, описанного в примерах ниже. Например, экспрессия гена TTR в культуре клеток, таких как клетки НерЗВ, может анализироваться измерением уровней мРНК TTR, например, с использованием bDNA- или TaqMan-анализа, или измерением уровней белка, например, с использованием ELISA-анализа. дцРНК этого изобретения может дополнительно включать в себя один или несколько одноцепочечных нуклеотидных выступов. дцРНК может быть синтезирована стандартными способами, известными в данной области, дополнительно обсуждаемыми ниже, например, с использованием автоматического ДНК-синтезатора, такого как ДНК-синтезаторы, коммерчески доступные, например, из Biosearch, Applied Biosystems, Inc. Эта дцРНК включает в себя две цепи РНК, которые являются достаточно комплементарными, чтобы гибридизоваться с образованием дуплексной структуры. Одна цепь этой дцРНК (антисмысловая цепь) включает в себя участок комплементарности, который является, по существу, комплементарным, и обычно полностью комплементарным, последовательности-мишени, полученной из последовательности мРНК, образованной во время экспрессии гена TTR, другая цепь (смысловая цепь) включает в себя участок, который является комплементарным этой антисмысловой цепи, так что эти две цепи гибридизуются и образуют дуплексную структуру при объединении при подходящих условиях. Обычно эта дуплексная структура имеет длину между 15 и 30, или между 25 и 30, или между 18 и 25, или между 19 и 24, или между 19 и 21, или 19, 20 пар оснований или 21 пару оснований. В одном варианте осуществления дуплекс имеет длину 19 пар оснований. В другом варианте осуществления дуплекс имеет длину 21 пару оснований. При использовании двух разных siRNA в комбинации, длины этого дуплекса могут быть одинаковыми или могут различаться. Каждая цепь дцРНК эти имеет обычно длину между 15 и 30 или между 18 и 25, или 18, 19, 20, 21,22, 23, 24 или 25 нуклеотидов. В других вариантах осуществления каждая цепь имеет длину 25-30 нуклеотидов. Каждая цепь этого дуплекса может иметь одну и ту же длину или эти цепи могут иметь разную длину. При использовании двух различных siRNA в комбинации, длины каждой цепи каждой siRNA могут быть одинаковыми или могут различаться. дцРНК этого изобретения может включать в себя один или несколько одноцепочечных выступов из одного или нескольких нуклеотидов. В одном варианте осуществления по меньшей мере один конец этой дцРНК имеет одноцепочечный нуклеотидный выступ из 1-4, обычно 1 или 2 нуклеотидов. В другом варианте осуществления, антисмысловая цепь дцРНК имеет содержащие 1-10 нуклеотидов выступы за 3'концом и 5'-концом смысловой цепи. В других вариантах осуществления, смысловая цепь этой дцРНК имеет содержащие 1-10 нуклеотидов выступы за 3'-концом и 5'-концом антисмысловой цепи. дцРНК, имеющая содержащий по меньшей мере один нуклеотид выступ, может иметь неожиданно лучшие ингибирующие свойства, чем ее имеющая тупые концы копия. В некоторых вариантах осуществления, присутствие только одного выступа нуклеотидов усиливает активность интерференции этой дцРНК, без влияния на ее общую стабильность. Было показано, что дцРНК, имеющая только один выступ, была особенно стабильной и эффективной in vivo, a также в различных клетках, средах для культуры клеток, крови и сыворотке. Обычно одноцепочечный выступ локализован на 3'-конце антисмысловой цепи или, альтернативно, на 3'-конце смысловой цепи. Эта дцРНК может также иметь тупой конец,обычно расположенный на 5'-конце антисмысловой цепи. Такая дцРНК может иметь улучшенную стабильность и улучшенную ингибирующую активность, что позволяет введение в низких дозах, т.е. менее 5 мг/кг массы тела реципиента в день. Обычно, антисмысловая цепь дцРНК имеет выступ нуклеотидов на 3'-конце, а 5'-конец является тупым. В другом варианте осуществления один или несколько нуклеотидов в этом выступе заменены нуклеозидтиофосфатом. В одном варианте осуществления геном TTR является ген TTR человека. В конкретных вариантах осуществления смысловая цепь этой дцРНК является одной из смысловых последовательностей из табл. 3 А, 3 В, 4, 6 А, 6 В или 7, и антисмысловая цепь является одной из антисмысловых последовательностей таблиц 3 А, 3 В, 4, 6 А, 6 В или 7. Альтернативные антисмысловые агенты, которые действуют в другом месте в последовательности-мишени, обеспеченной в табл. 3 А, 3 В, 4, 6 А, 6 В или 7, могут быть легко определены с использованием последовательности-мишени и фланкирующей последовательности TTR. Квалифицированному в данной области специалисту хорошо известно, что дцРНК, имеющая дуплексную структуру из 20-23, но особенно из 21 пар оснований, приветствовались в качестве особенно эффективных в индуцировании интерференции РНК (Elbashir et al., EMBO 2001, 20:6877-6888). Однако другие авторы нашли, что более короткие или более длинные дцРНК могут быть также эффективными. В вышеописанных вариантах осуществления, благодаря природе олигонуклеотидных последовательностей,обеспеченных в табл. 3 А, 3 В, 4, 6 А, 6 В и 7, дцРНК, описанные в этом изобретении, могут включать в себя по меньшей мере одну цепь с описанной здесь длиной. Не без оснований можно ожидать, что более короткие дцРНК, имеющие одну из последовательностей табл. 3 А, 3 В, 4, 6 А, 6 В или 7, минус только несколько нуклеотидов на одном или на обоих концах, могут быть сходным образом эффективными в сравнении с вышеописанными дцРНК. Таким образом, данное изобретение рассматривает также дцРНК,имеющие частичную последовательность по меньшей мере 15, 16, 17, 18, 19, 20 или более смежных (непрерываемых) нуклеотидов из одной из последовательностей табл. 3, 4, 6 или 7, и отличающиеся по их способности ингибировать экспрессию гена TTR в анализе, описанном здесь ниже, не более, чем на 5, 10,15, 20, 25 или 30% ингибирования от дцРНК, содержащей полную последовательность. Кроме того,дцРНК, которая расщепляет в желаемой последовательности-мишени TTR, может быть легко получена с использованием соответствующей антисмысловой последовательности TTR и комплементарной смысловой последовательности. Кроме того, дцРНК, обеспеченные в табл. 3 А, 3 В, 4, 6 А, 6 В или 7, идентифицируют сайт в TTR, который является чувствительным к расщеплению, основанному на RNAi. Вследствие этого данное изобретение дополнительно описывает дцРНК, которые поражают в пределах последовательности, являющейся мишенью одного из агентов данного изобретения. В данном контексте считается, что вторая дцРНК наносит удар в пределах последовательности первой дцРНК, если эта вторая дцРНК расщепляет мРНК в любом месте в пределах мРНК, которая является комплементарной антисмысловой цепи первой дцРНК. Такая вторая дцРНК будет обычно состоять по меньшей мере из 15 смежных нуклеотидов из одной из последовательностей, обеспеченных в таблицах 3 А, 3 В, 4, 6 А, 6 В или 7, связанных с дополнительными нуклеотидными последовательностями, взятыми из участка, смежного с выбранной последовательностью в гене TTR. дцРНК, описанная в этом изобретении, может содержать одно или несколько ошибочных спариваний с последовательностью-мишенью. В одном варианте осуществления, дцРНК, описанная в этом изобретении, содержит не более 3 ошибочных спариваний. Если антисмысловая цепь этой дцРНК содержит ошибочные спаривания с последовательностью-мишенью, предпочтительно, чтобы зона ошибочного спаривания не была расположена в центре участка комплементарности. Если антисмысловая цепь этой дцРНК содержит ошибочные спаривания с последовательностью-мишенью, предпочтительно, чтобы это ошибочное спаривание было ограничено 5 нуклеотидами от любого конца, например, 5, 4, 3, 2 или 1 нуклеотидами из любого 5'- или 3'-конца участка комплементарности. Например, для цепи дцРНК из 23 нуклеотидов, которая является комплементарной участку гена TTR, эта дцРНК не содержит никакого ошибочного спаривания в пределах 13 центральных нуклеотидов. Способы, описанные в этом изобретении, могут быть использованы для определения, является ли дцРНК, содержащая ошибочное спаривание с последовательностью-мишенью, эффективной в ингибировании экспрессии гена TTR. Рассмотрение эффективности дцРНК с ошибочными спариваниями в ингибировании экспрессии TTR является важным, особенно, если известно, что этот конкретный участок комплементарности в гене TTR имеет полиморфную вариацию последовательности в этой популяции. Модификации Еще в одном варианте осуществления дцРНК модифицируют химически для увеличения стабильности. Нуклеиновые кислоты, описанные в этом изобретении, могут быть синтезированы и/или модифицированы способами, хорошо установившимися в данной области, такими как описанные в "Current protocols in nucleic acid chemistry," Beaucage, S. L. et al. (Eds.) A John WileySons, Inc., New York, NY, USA,которые включены здесь посредством ссылки. Конкретные примеры соединений дцРНК, применимых в этом изобретении, включают в себя дцРНК, содержащие модифицированные скелеты молекул или не природно-встречающиеся межнуклеозидные связи. Как определено в этом описании, дцРНК, имеющие модифицированные скелеты молекул, включают в себя дцРНК, которые сохраняют атом фосфора в этом скелете и которые не имеют атома фосфора в этом скелете. Для целей этого описания, и, как иногда указывается в данной области, модифицированные дцРНК, которые не имеют атома фосфора в их межнук- 11020312 леозидном скелете, могут также рассматриваться как олигонуклеозиды. Модифицированные молекулярные скелеты дцРНК включают в себя, например, фосфоротиоаты,хиральные фосфоротиоаты, фосфородитиоаты, фосфоротриэфиры, аминоалкилфосфотриэфиры, метил- и другой алкилфосфонаты, включающие в себя 3'-алкиленфосфонаты и хиральные фосфонаты, фосфинаты,фосфорамидаты, включающие в себя 3'-аминофосфорамидат и аминоалкилфосфорамидаты, тионофосфорамидаты, тионоалкилфосфонаты, тионоалкилфосфотриэфиры и боранофосфаты, имеющие нормальные 3'-5'-связи, их 2'-5'-связанные аналоги, и имеющие обращенную полярность, при которой смежные пары нуклеозидных звеньев связаны 3'-5' - 5'-3' или 2'-5' - 5'-2'. В изобретение включены также смешанные соли и формы свободных кислот. Репрезентативные Патенты США, которые описывают получение вышеуказанных фосфорсодержащих связей, включают в себя, но не ограничиваются ими, Патенты США с номерами 3687808; 4469863; 4476301; 5023243; 5177195; 5188897; 5264423; 5276019; 5278302; 5286717; 5321131; 5399676; 5405939; 5453496; 5455233; 5466677; 5476925; 5519126; 5536821; 5541316; 5550111; 5563253; 5571799; 5587361 и 5625050, каждый из которых включен здесь посредством ссылки. Модифицированные скелеты дцРНК, которые не содержат атома фосфора, имеют скелеты, которые образованы алкильными (с короткой цепью) или циклоалкильными межнуклеозидными связями, смешанными гетероатомами и алкильными или циклоалкильными межнуклеозидными связями или одной или несколькими имеющими короткие цепи гетероатомными или гетероциклическими межнуклеозидными связями. Они включают в себя скелеты, имеющие морфолиносвязи (образованные частично из сахарной части нуклеозида); силоксановые скелеты; сульфидные, сульфоксидные и сульфоновые скелеты; формацетил- и тиоформацетил-скелеты; метиленформацетил- и тиоформацетил-скелеты; алкенсодержащие скелеты; сульфаматные скелеты; метиленимино- и метиленгидразиноскелеты; сульфонатные и сульфонамидные скелеты; амидные скелеты и другие, имеющие смешанные части N-, О-, S- и СН 2 компонентов. Репрезентативные патенты США, которые описывают получение вышеуказанных олигонуклеозидов, включают в себя, но не ограничиваются ими, Патенты США с номерами 5034506; 5166315; 5185444; 5,214,134; 5216141; 5235033; 564562; 5264564; 5405938; 5434257; 5466677; 5470967; 5489677; 5541307; 5561225; 5596086; 5602240; 5608046; 5610289; 5618704; 5623070; 5663312; 5633360; 5677437 и 5677439,каждый из которых включен здесь посредством ссылки. В других подходящих миметиках дцРНК как сахар, так и межнуклеозидная связь, т.е. скелет, нуклеотидных звеньев заменены новыми группами. Звенья оснований сохраняются для гибридизации с подходящим соединением-мишенью нуклеиновой кислоты. Одно такое олигомерное соединение, миметик дцРНК, который, как было показано, имеет превосходные свойства гибридизации, называют пептиднуклеиновой кислотой (ПНК). В соединениях ПНК, сахарный скелет дцРНК заменен амидсодержащим скелетом, в частности, аминоэтилглициновым скелетом. Нуклеооснования сохраняются и связываются прямо или опосредованно с атомами азогруппы амидной части этого скелета. Репрезентативные Патенты США, которые описывают получение соединений ПНК, включают в себя, но не ограничиваются ими, Патенты США с номерами 5539082; 5714331 и 5719262, каждый из которых включен здесь посредством ссылки. Дополнительное описание соединений ПНК может быть найдено в Nielsen et al., Science, 1991, 254, 1497-1500. Другими вариантами этого изобретения являются дцРНК с фосфоротиоатными скелетами и олигонуклеозидами с гетероатомными скелетами, и, в частности, -CH2-NH-CH2-, -CH2-N (CH3) -O-СН 2[известными как метилен-(метиламино-) или MMI-скелет], -СН 2-O-N(CH3)-CH2-, -CH2-N(CH3)-N(CH3)CH2- и -N (СН 3)-СН 2-СН 2- [где природный фосфодиэфирный скелет представлен как -O-Р-O-СН 2-] цитируемого выше патента США 5489677, и амидные скелеты цитируемого выше патента США 5602240. Предпочтительными также являются дцРНК, имеющие структуры морфолиноскелета, цитируемого выше патента США 5034506. Модифицированные дцРНК могут также содержать одну или несколько замененных сахарных частей. Предпочтительные дцРНК содержат одну из следующих групп в 2'-положении: ОН; F; O-, S-или Nалкил; О-, S- или N-алкенил; О-, S- или N-алкинил; или O-алкил-О-алкил, где эти алкил, алкенил и алкинил могут быть замещенными или незамещенными C1-С 10-алкилом или С 2-С 10 алкенилом или-алкинилом. Особенно предпочтительными являются O[(CH2)nO]mCH3, O(CH2)nOCH3, O(CH2)nNH2,O(CH2)nCH3, O(CH2)nONH2, и О(СН 2)nON[(СН 2)nCH3)]2, где n и m являются 1 - приблизительно 10. Другие предпочтительные дцРНК содержат одну из следующих групп в 2'-положении: низший C1-С 10-алкил,замещенный низший алкил, алкарил, аралкил, О-алкарил или О-аралкил, SH, SCH3, OCN, Cl, Br, CN, CF3,OCF3, SOCH3, SO2CH3, ONO2, NO2, N3, NH2, гетероциклоалкил, гетероциклоалкарил, аминоалкиламино,полиалкиламино, замещенный силил, РНК-расщепляющую группу, репортерную группу, интеркалят,группу для улучшения фармакокинетических свойств дцРНК или группу для улучшения фармакодинамических свойств дцРНК и другие заместители, имеющие сходные свойства. Одна предпочтительная модификация включает в себя 2'-метоксиэтокси (2'-О-СН 2 СН 2 ОСН 3, также известную как 2'-О-(2 метоксиэтил) или 2'-МОЕ) (Martin et al., Helv. Chim. Acta, 1995, 78, 486-504), т.е., алкоксиалкоксигруппу. Одна дополнительная предпочтительная модификация включает в себя 2'-диметиламинооксиэтокси, т.е.,- 12020312 группу О(СН 2)2ON(СН 3)2, также известную как 2'-DMAOE, описанную здесь в примерах ниже, и 2'диметиламиноэтоксиэтокси (также известную в данной области как 2'-О-диметиламиноэтоксиэтил или 2'-DMAEOE), т.е., 2'-O-СН 2-O-CH2-N(CH2)2, также описанную здесь в примерах ниже. Другие предпочтительные модификации включают в себя 2'-метокси (2'-OCH3), 2'-аминопропокси(2'-OCH2CH2CH2NH2) и 2'-фтор (2'-F). Сходные модификации могут быть также произведены в других положениях на дцРНК, в частности 3'-положении сахара на 3'-концевом нуклеотиде или в 2'-5'-связанных дцРНК и 5'-положении 5'-концевого нуклеотида. дцРНК могут также иметь сахарные миметики, такие как циклобутильные группы вместо пентофуранозильного сахара. Репрезентативные патенты США, которые описывают получение таких модифицированных сахарных структур, включают в себя, но не ограничиваются ими, патенты США с номерами 4981957; 5118800; 5319080; 5359044; 5393878; 5446137; 5466786; 5514785; 5519134; 5567811; 5576427; 5591722; 5597909; 5610300; 5627053; 5639873; 5646265; 5658873; 5670633 и 5700920, некоторые из которых находятся в общем владении с данной заявкой и каждый из которых включен здесь посредством ссылки в его полном объеме. дцРНК могут также включать в себя модификации и замены нуклеооснования (часто называемого в данной области просто "основанием"). В данном контексте, "немодифицированные" или "природные" нуклеооснования включают в себя пуриновые основания аденин (А) и гуанин (G) и пиримидиновые основания тимин (Т), цитозин (С) и урацил (U). Модифицированные нуклеооснования включают в себя другие синтетические и природные нуклеооснования, такие как 5-метилцитозин (5-me-С), 5 гидроксиметилцитозин, ксантин, гипоксантин, 2-аминоаденин, 6-метилпроизводное и другие алкилпроизводные аденина и гуанина, 2-пропилпроизводное и другие алкилпроизводные аденина и гуанина, 2 тиоурацил, 2-тиотимин и 2-тиоцитозин, 5-галогенурацил и -цитозин, 5-пропинилурацил и -цитозин, 6 азоурацил, -цитозин и -тимин, 5-урацил (псевдоурацил), 4-тиоурацил, 8-галоген-, 8-амино-, 8-тиол-, 8 тиоалкил-, 8-гидроксил- и другие 8-замещенные аденины и гуанины, 5-галоген-, в частности, 5-бром-, 5 трифторметил- и другие 5-замещенные урацилы и цитозины, 7-метилгуанин и 7-метиладенин, 8 азагуанин и 8-азааденин, 7-деазагуанин и 7-деазааденин и 3-деазагуанин и 3-деазааденин. Дополнительные нуклеооснования включают в себя нуклеооснования, описанные в Патенте США 3687808, нуклеооснования, описанные в Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering, pages 858-859,Kroschwitz J. L., ed. John WileySons, 1990, нуклеооснования, описанные Englisch et al, AngewandteChemie, International Edition, 1991, 30, 613, и нуклеооснования, описанные Sanghvi Y S., Chapter 15, DsRNA Research and Applications, pages 289-302, Crooke S. T. and Lebleu В., Ed., CRC Press, 1993. Некоторые из этих нуклеооснований являются особенно применимыми для увеличения аффинности связывания олигомерных соединений, описанных в этом изобретении. Они включают в себя 5-замещенные пиримидины, 6-азапиримидины и N-2, N-6 и O-6 замещенные пурины, включающие в себя 2 аминопропиладенин, 5-пропинилурацил и 5-пропинилцитозин. Было показано, что замены 5 метилцитозином увеличивают стабильность дуплекса нуклеиновых кислот на 0,6-1,2 С. (Sanghvi, Y. S.,Crooke, S. Т. and Lebleu, В., Eds., DsRNA Research and Applications, CRC Press, Boca Raton, 1993, pp. 276278) и являются примерами замен оснований, даже более предпочтительными при объединении с 2'-Ометоксиэтильными модификациями сахара. Репрезентативные Патенты США, которые описывают получение некоторых из вышеуказанных модифицированных нуклеооснований, а также других модифицированных нуклеооснований, включают в себя, но не ограничиваются ими, вышеупомянутый патент США 3687808, а также патенты США с номерами 4845205; 513030; 5134066; 5175273; 5367066; 5432272; 5457187; 5459255; 5484908; 5502177; 5525711; 5552540; 5587469; 5594121, 5596091; 5614617 и 5681941, каждый из которых включен здесь посредством ссылки и патент США 5750692, также включенный здесь посредством ссылки. Конъюгаты Другая модификация дцРНК этого изобретения включает в себя химическое связывание с дцРНК одной или нескольких частиц или конъюгатов, которые усиливают их активность, клеточное распределение или клеточное поглощение дцРНК. Такие частицы включают в себя, но не ограничиваются ими,липидные частицы, такие как частица холестерина (Letsinger et al., Proc. Natl. Acid. Sci. USA, 1989, 86: 6553-6556), холевую кислоту (Manoharan et al, Biorg. Med. Chem. Let., 1994, 4:1053-1060), простой тиоэфир, например, гексил-S-тритилтиол (Manoharan et al., Ann. N.Y. Acad. Sci., 1992, 660:306-309; Manoharan et al., Biorg. Med. Chem. Let., 1993, 3:2765-2770), тиохолестерин (Oberhauser et al., Nucl. Acids Res.,1992, 20:533-538), алифатическую цепь, например, додекандиол или ундецильные остатки (SaisonBehmoaras et al, EMBO J, 1991, 10:1111-1118; Kabanov et al., FEBS Lett., 1990, 259:327-330; Svinarchuk etal, Biochimie, 1993, 75:49-54), фосфолипид, например, дигексадецил-rac-глицерин или 1,2-ди-Огексадецил-rac-глицеро-3-Н-фосфонат триэтиламмония (Manoharan et al, Tetrahedron Lett., 1995, 36:36513654; Shea et al, Nucl. Acids Res., 1990, 18:3777-3783), цепь полиамина или полиэтиленгликоля (Manoharan et al, NucleosidesNucleotides, 1995, 14:969-973) или адамантануксусную кислоту (Manoharan et al.,Tetrahedron Lett., 1995, 36:3651-3654), пальмитильную группу (Mishra et al., Biochim. Biophys. Acta, 1995,1264:229-237) или октадециламин или гексиламино-карбонилоксихолинстериновую группу (Crooke et al.,J. Pharmacol. Exp. Ther., 1996, 277:923-937). Репрезентативные патенты США, которые описывают получение таких конъюгатов дцРНК, вклю- 13020312 чают в себя, но не ограничиваются ими, патенты США с номерами 4828979; 4948882; 5218105; 5525465; 5541313; 5545730; 5552538; 5578717, 5580731; 5591584; 5109124; 5118802; 5138045; 5414077; 5486603; 5512439; 5578718; 5608046; 4587044; 4605735; 4667025; 4762779; 4789737; 4824941; 4835263; 4876335; 4904582; 4958013; 5082830; 5112963; 5214136; 5082830; 5112963; 5214136; 5245022; 5254469; 5258506; 5262536; 5272250; 5292873; 5317098; 5371241, 5391723; 5416203, 5451463; 5510475; 5512667; 5514785; 5565552; 5567810; 5574142; 5,585,481; 5587371; 5595726; 5597696; 5599923; 5599928 и 5688941, каждый из которых включен здесь посредством ссылки. Необязательно, чтобы все положения в конкретном соединении были однородно модифицированы,и фактически более одной из вышеупомянутых модификаций могут быть включены в отдельном соединении или даже в отдельном нуклеозиде в дцРНК. Данное изобретение включает в себя также дцНКсоединения, которые являются химерными соединениями. "Химерные" дцРНК-соединения, или "химеры", являются в контексте этого изобретения дцРНК-соединениями, в частности, дцРНК, которые содержат два или более химически различных участков, каждый из которых построен по меньшей мере из одного мономерного звена, т.е. нуклеотида, в случае дцРНК-соединения. Эти дцРНК обычно содержат по меньшей мере один участок, в котором эта дцРНК является модифицированной для придания этой дцРНК устойчивости к нуклеазной деградации, увеличенного клеточного поглощения и/или увеличенной аффинности связывания в отношении нуклеиновой кислоты-мишени. Дополнительный участок этой дцРНК может служить в качестве субстрата для ферментов, способных расщеплять гибриды РНК-ДНК или РНК-РНК. В качестве примера, РНКаза Н является клеточной эндонуклеазой, которая расщепляет РНК-цепь дуплекса РНК-ДНК. Таким образом, активация РНКазы Н приводит к расщеплению РНКмишени, увеличивая посредством этого в значительной степени эффективность ингибирования дцРНК экспрессии генов. В результате, сравнимые результаты могут быть часто получены с более короткими дцРНК при использовании химерных дцРНК, в сравнении с фосфоротиоатными деокси-дцРНК, гибридизующимися с тем же самым участком-мишенью. Расщепление РНК-мишени может быть детектировано рутинным образом при помощи гельэлектрофореза и, если необходимо, ассоциированными способами гибридизации, известными в данной области. Сайт расщепления на мРНК-мишени дцРНК может быть определен с использованием способов,обычно известных специалисту с обычной квалификацией в данной области, например, способ 5'-RACE,описанный в статье Soutschek et al., Nature; 2004, vol. 432, pp. 173-178 (которая включена здесь посредством ссылки для всех целей). В одном варианте осуществления, с использованием способа 5'-RACE, описанного Soutschek et al., было определено, что ALN-18328 расщепляет мРНК TTR между нуклеотидом гуанином в положении 636 SEQ ID NO:1331 (NM000371.3) и нуклеотидом аденином в положении 637SEQ ID NO:1331. В одном варианте осуществления было определено, что ALN-18328 действительно расщепляет мРНК TTR между нуклеотидом аденином в положении 637 SEQ ID NO:1331 и нуклеотидом гуанином в положении 638 SEQ ID NO:1331. В некоторых случаях, дцРНК может быть модифицирована не являющейся лигандом группой. Некоторое число не-лигандных молекул конъюгировали с дцРНК для усиления активности, клеточного распределения и клеточного поглощения этой дцРНК, и процедуры для выполнения таких конъюгаций доступны в научной литературе. Такие не-лигандные части молекулы включали в себя липидные частицы, такие как холестерин (Letsinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1989, 86:6553), холевую кислотуLet., 1993, 3:2765), тиохолестерин (Oberhauser et al., Nucl. Acids Res., 1992, 20:533), алифатическую цепь,например, додекандиол или ундецильные остатки (Saison-Behmoaras et al., EMBO J, 1991, 10:1111-1118;Kabanov et al, FEBS Lett., 1990, 259:327-330; Svinarchuk et al., Biochimie, 1993, 75:49-54), фосфолипид,например, дигексадецил-rac-глицерин или 1,2-ди-О-гексадецил-rac-глицеро-3-Н-фосфонат триэтиламмония (Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36:3651-3654; Shea et al., Nucl. Acids Res., 1990, 18:37773783), цепь полиамина или полиэтиленгликоля (Manoharan et al, NucleosidesNucleotides, 1995, 14:969973) или адамантануксусную кислоту (Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36:3651-3654), пальмитильную группу (Mishra et al., Biochim. Biophys. Acta, 1995, 1264:229-237) или октадециламин или гексиламинокарбонилоксихолестериновую группу (Crooke et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 1996, 277:923-937). Репрезентативные Патенты США, которые описывают получение таких конъюгатов дцРНК, были перечислены выше. Типичные протоколы конъюгации включают в себя синтез дцРНК, несущих аминолинкер в одном или нескольких положениях этой последовательности. Затем эта аминогруппа реагирует с молекулой, конъюгированной с использованием подходящих реагентов связывания или активации. Эта реакция конъюгации может проводиться или с дцРНК, все еще связанной с твердой подложкой, или после отщепления этой дцРНК в фазу раствора. Очистка этого дцРНК-конъюгата при помощи ВЖХ обычно дает чистый конъюгат. Кодируемые вектором дцРНК В другом аспекте, молекулы дцРНК TTR экспрессируются из транскрипционных единиц, инсертированных в ДНК- или РНК-векторы (см., например, Couture A. et al., TIG. (1996), 12:5-10; Skillern, A., et и Conrad, U.S. Pat. No. 6,054,299). Эти трансгены могут быть введены в виде линейной конструкции,кольцевой плазмиды или вирусного вектора, которые могут быть включены и унаследованы в виде трансгена, интегрированного в геном хозяина. Этот трансген может быть также сконструирован таким образом, что он может наследоваться в виде внехромосомной плазмиды. (Gassmann, et al, Proc. Natl.Acad. Sci. USA (1995) 92:1292). Отдельные цепи дцРНК могут транскрибироваться промоторами на двух отдельных экспрессионных (экспрессирующих) векторах и котрансфицироваться в клетку-мишень. Альтернативно, каждая отдельная цепь дцРНК может быть экспрессирована промоторами, оба из которых расположены на одной и той же экспрессионной плазмиде. В одном варианте осуществления, дцРНК экспрессируется в виде инвертированного повтора, присоединенного линкерной полинуклеотидной последовательностью, так что эта дцРНК имеет структуру стебля и петли. Рекомбинантные экспрессионные векторы дцРНК являются обычно ДНК-плазмидами или вирусными векторами. Экспрессирующие дцРНК вирусные векторы могут быть сконструированы на основе аденоассоциированного вируса (но не только) (в отношении обзора см. Muzyczka et al., Curr. TopicsMicro. Immunol. (1992) 158:97-129; аденовируса (см., например, for example, Berkner, et al., BioTechniques (1998) 6:616), Rosenfeld et al. (1991, Science 252:431-434) и Rosenfeld et al. (1992), Cell 68:143-155; или альфавируса, а также других вирусов, известных в данной области. Ретровирусы использовали для введения различных генов во многие различные типы клеток, в том числе эпителиальных клеток, in vitro и/или in vivo (см., например, Eglitis, et al., Science (1985) 230: 1395-1398; Danos and Mulligan, Proc. Natl.Immunol. 150:4104-4115; Патент США 4868116; Патент США 4980286; РСТ Заявка WO 89/07136; РСТ Заявка WO 89/02468; РСТ Заявка WO 89/05345 и РСТ Заявка WO 92/07573). Рекомбинантные аденовирусные векторы, способные трансдуцировать и экспрессировать гены, инсертированные в геном клетки, могут быть получены трансфекцией рекомбинантного ретровирусного генома в подходящие упаковывающие клеточные линии, такие как РА 317 и Psi-CRIP (Comette et al., 1991, Human Gene Therapy 2:510; Cone et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6349). Рекомбинантные аденовирусные векторы могут быть использованы для инфицирования большого разнообразия клеток и тканей в восприимчивых хозяевах (например, крысе, хомячке, собаке и шимпанзе) (Hsu et al., 1992, J. Infectious Disease, 166:769), a также имеют преимущество, заключающееся в том, что для инфицирования не требуются митотически активные клетки. Может быть использован любой вирусный вектор, способный акцептировать кодирующие последовательности для молекулы (молекул) дцРНК, подлежащие экспрессии, например, векторы, произведенные из аденовируса (AV); аденоассоциированного вируса (AAV); ретровируса (например, лентивирусов(LV), рабдовирусов, вируса мышиного лейкоза); герпес-вируса и т.п. Тропизм вирусных векторов может быть модифицирован псевдотипированием (упаковкой) этих векторов белками оболочки или другими поверхностными антигенами из других вирусов или заменой различных белков вирусного капсида, соответственно. Например, лентивирусные векторы, описанные в этом изобретении, могут быть псевдотипированы поверхностными белками из вируса везикулярного стоматита (VSV), вируса бешенства, вируса Эбола,вируса Мокола и т.п. AAV-векторы, описанные в этом изобретении, могут быть нацелены на различные клетки-мишени конструированием векторов для экспрессии различных серотипов капсидных белков. Например, ААМ-вектор, экспрессирующий капсид серотипа 2 на геноме серотипа 2, назван AAV 2/2. Этот ген капсида серотипа 2 в векторе AAV 2/2 может быть заменен геном капсида серотипа 5 с получением вектора AAV 2/5. Способы конструирования векторов AAV, которые экспрессируют различные серотипы капсидных белков, находятся в пределах квалификации в данной области; см., например, статью Rabinowitz J E et al. (2002), J Virol 76:791-801, все описание которой включено здесь посредством ссылки. Селекция (отбор) рекомбинантных вирусных векторов, подходящих для применения в этом изобретении, способы для инсертирования последовательностей нуклеиновых кислот для экспрессии дцРНК в вектор и способы доставки вирусного вектора в представляющие интерес клетки находятся в рамках квалификации в данной области. См., например, Dornburg R (1995), Gene Therap. 2: 301-310; Eglitis M A(1988), Biotechniques 6: 608-614; Miller A D (1990), Hum Gene Therap. 1: 5-14; Anderson W F (1998), Nature 392: 25-30 и Rubinson D A et al., Nat. Genet. 33: 401-406, полные описания которых включены здесь посредством ссылки. Вирусные векторы могут быть получены из AV и AAV. В одном варианте осуществления дцРНК,описанная в этом изобретении, экспрессируется в виде двух отдельных, комплементарных одноцепочечных молекул РНК из рекомбинантного AAV-вектора, имеющего, например, промоторы РНК U6 или HI или промотор цитомегаловируса (CMV). Подходящий AV-вектор для экспрессии дцРНК, описанной в этом изобретении, способ конструирования рекомбинантного AV-вектора и способ доставки этого вектора в клетки-мишени описаны в XiaH et al. (2002), Nat. Biotech. 20: 1006-1010. Подходящие AAV-векторы для экспрессии дцРНК, описанной в этом изобретении, способы конструирования рекомбинантного AAV-вектора и способ доставки этого вектора в клетки-мишени описаны вal. (1989), J. Virol. 63: 3822-3826; Патенте США 5,252,479; Патенте США 5139941; Международной заявке на патентWO 94/13788 и Международной заявке на патентWO 93/24641, полные описания которых включены здесь посредством ссылки. Промотор, запускающий экспрессию дцРНК либо в ДНК-плазмиде, либо в вирусном векторе, описанных в этом изобретении, может быть эукариотическим промотором РНК-полимеразы I (например,промотором рибосомной РНК), РНК-полимеразы II (например, ранним промотором CMV или промотором актина или промотором Ul snRNA) или обычно промотором РНК-полимеразы III (например, промотором РНК U6 snRNA или 7SK РНК) или прокариотическим промотором; например, промотор Т 7, обеспечиваемый экспрессионной плазмидой, кодирует также РНК-полимеразу Т 7, необходимую для транскрипции от промотора Т 7 . Этот промотор может также управлять экспрессией трансгена в поджелудочную железу (см., например, регуляторную последовательность инсулина для поджелудочной железы(Bucchini et al., 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:2511-2515. Кроме того, экспрессия трансгена может точно регулироваться, например, с использованием индуцируемой регуляторной последовательности и экспрессионных систем, таких как регуляторная последовательность, которая чувствительна к некоторым физиологическим регуляторам, например, уровням циркуляции глюкозы или гормонам (Docherty et al., 1994, FASEB J. 8:20-24). Такие индуцируемые экспрессионные системы, подходящие для регуляции экспрессии трансгенов в клетках или в млекопитающих, включают в себя регуляцию экдизоном, эстрогеном, прогестероном, тетрациклином, химическими индукторами димеризации и изопропил-бета-D1-тиогалактопиранозидом (EPTG). Специалист с квалиификацией в данной области будет способен выбрать подходящую регуляторную/промоторную последовательность на основе предполагаемого применения трансгена дцРНК. Обычно, рекомбинантные векторы, способные экспрессировать молекулы дцРНК, доставляются,как описано ниже, и продолжают существовать в клетках-мишенях. Альтернативно, могут быть использованы вирусные векторы, которые обеспечивают транзиторную экспрессию молекул дцРНК. Такие векторы могут вводиться повторно в случае необходимости. После экспрессии, эти дцРНК связываются с РНК-мишенью и модулируют ее функцию или экспрессию. Доставка дцРНК-экспрессирующих векторов может быть системной, например, внутривенным или внутримышечным введением, введением в клеткимишени, эксплантируемые из пациента, с последующим повторным введением в этого пациента, или любым другим способом, который позволяет введение в желаемую клетку-мишень. Экспрессирующие дцРНК ДНК-плазмиды обычно трансфицируют в клетки-мишени в виде комплекса с катионоактивными липидными носителями (например, олигофектамином) или носителями на основе некатионоактивного липида (например, Transit-TKO). Множественные липидные трансфекции для дцРНК-опосредованных нокдаунов, поражающих различные участки единственного гена TTR или множественных генов TTR, на протяжении периода одной недели или более также рассматриваются этим изобретением. Успешное введение векторов в клеткихозяева может подвергаться мониторингу с использованием различных известных способов. Например,транзиторная трансфекция может сигнализироваться репортером, таким как флуоресцентный маркер,такой как зеленый флуоресцентный белок (GFP). Стабильная трансфекция клеток ех vivo может обеспечиваться с использованием маркеров, которые обеспечивает трансфицированная клетка, с устойчивостью к конкретным факторам окружающей среды (например, антибиотикам и лекарственным средствам),такой как устойчивость к гигромицину В.TTR-специфические молекулы дцРНК могут быть также инсертированы в векторы и использованы в качестве векторов генной терапии для пациентов-людей. Векторы генной терапии могут доставляться субъекту, например, внутривенной инъекцией, локальным введением (см. Патент США 5328470) или стереотаксической инъекцией (см., например, Chen et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:3054-3057). Фармацевтический препарат вектора генной терапии может включать в себя вектор генной терапии в приемлемом растворителе или может включать в себя матрикс медленного высвобождения, в который заделан носитель доставки гена. Альтернативно, когда вектор доставки полного гена может быть получен интактным из рекомбинантных клеток, например, ретровирусных клеток, этот фармацевтический препарат может включать в себя одну или несколько клеток, которые продуцируют эту систему доставки генов.III. Фармацевтические композиции, содержащие дцРНК В одном варианте осуществления это изобретение обеспечивает фармацевтические композиции,содержащие дцРНК, описанные здесь, и фармацевтически приемлемый носитель. Фармацевтическая композиция, содержащая дцРНК, применима для лечения заболевания или нарушения, ассоциированного с экспрессией или активностью гена TTR, например, патологических процессов, опосредованных экс- 16020312 прессией TTR. Такие фармацевтические композиции готовят на основе способа доставки. Одним примером являются композиции, которые готовят для системного введения посредством парентеральной доставки, например, внутривенной (IV) доставки. Другим примером являются композиции, которые готовят для прямой доставки в паренхиму головного мозга, например, инфузией в головной мозг, например, непрерывной нагнетательной инфузией. Описанные здесь фармацевтические композиции вводят в дозах, достаточных для ингибирования экспрессии генов TTR. Обычно, подходящая доза дцРНК будет находиться в диапазоне 0,01-200,0 мг на кг массы тела реципиента в день, обычно в диапазоне 1-50 мг на кг массы тела в день. Например, дцРНК может вводиться при 0,0059, 0,01, 0,0295, 0,05, 0,0590, 0,163, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,543, 0,590, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 1,1, 1,2,1,3, 1,4, 1,5, 1,628, 2, 3, 5,0, 10, 20, 30, 40 или 50 мг/кг на однократную дозу. В одном варианте осуществления, эта доза находится между 0,01 и 0,2 мг/кг. Например, дцРНК может вводиться в дозе 0,01, 0,02, 0,3, 0,04, 0,05, 0,06, 0,07, 0,08, 0,09, 0,10, 0,11, 0,12, 0,13, 0,14, 0,15, 0,16,0,17, 0,18, 0,19 или 0,20 мг/кг. В одном варианте осуществления, эта доза находится в диапазоне 0,005-1,628 мг/кг. Например,дцРНК может вводиться в дозе 0,0059, 0,0295, 0,0590, 0,163, 0,543, 0,5900 или 1,628 мг/кг. В одном варианте осуществления, эта доза находится в диапазоне 0,2-1,5 мг/кг. Например, дцРНК может вводиться в дозе 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4 или 1,5 мг/кг. Эта фармацевтическая композиция может вводиться один раз в день или дцРНК может вводиться в виде двух, трех или более субдоз при подходящих интервалах на протяжении дня или даже с использованием непрерывной инфузии или доставки с использованием формы пролонгированного высвобождения. В этом случае дцРНК, содержащаяся в каждой субдозе, должна быть соответственно в меньшем количестве для достижения общей суточной дозы. Единица дозы может быть также компаундирована для доставки на протяжении нескольких дней, например, с использованием общепринятой формы пролонгированного высвобождения, которая обеспечивает поддерживаемое высвобождение дцРНК на протяжении периода нескольких дней. Готовые формы пролонгированного высвобождения хорошо известны в данной области и особенно применимы для доставки агентов в конкретном месте, так чтобы их можно было использовать с агентами данного изобретения. В этом варианте осуществления унифицированная лекарственная форма содержит соответствующее множество суточных доз. Действие однократной дозы на уровни TTR является продолжительным, так что последующие дозы вводят с интервалами не более 3, 4 или 5 дней, или с интервалами не более 1, 2, 3 или 4 недель или с интервалами не более 5, 6, 7, 8, 9 или 10 недель. Квалифицированному в данной области специалисту будет понятно, что некоторые факторы могут влиять на дозу и тайминг, необходимые для эффективного лечения субъекта, включающие в себя, но не ограничивающиеся ими, тяжесть заболевания или нарушения, предшествующее лечение, общее здоровье и/или возраст субъекта и другие присутствующие заболевания. Кроме того, лечение субъекта терапевтически эффективным количеством композиции может включать в себя однократный курс лечения или ряд курсов лечения. Оценивания эффективных доз и времени полужизни in vivo для отдельных дцРНК, рассматриваемых данным изобретением, могут быть выполнены с использованием общепринятых методологий или на основе тестирования in vivo с применением подходящей модели животного, как описано здесь в другом месте. Успехи в области генетики мышей позволили создать ряд мышиных моделей для исследования различных заболеваний человека, таких как патологические процессы, опосредуемые экспрессией TTR, а также для определения терапевтически эффективной дозы. Подходящей мышиной моделью является,например, мышь, содержащая плазмиду, экспрессирующую TTR человека. Другой подходящей мышиной моделью является трансгенная мышь, несущая трансген, который экспрессирует TTR человека. Данные, полученные из анализов культур клеток и исследований на животных, могут быть использованы в приготовлении диапазона доз для применения в людях. Доза композиций, описанных в этом изобретении, обычно находится в диапазоне циркулирующих концентраций, которые включают в себяED50 с малой токсичностью или с отсутствием токсичности. Доза может варьироваться в этом диапазоне в зависимости от используемой лекарственной формы и используемого способа введения. Для любого соединения, используемого в описанных в данном изобретении способах, терапевтически эффективная доза может быть приближенно определена сначала из анализов культуры клеток. Доза может быть приготовлена с использованием моделей животных для получения диапазона циркулирующей в плазме концентрации этого соединения или, при необходимости, полипептидного продукта последовательностимишени (например, получением уменьшенной концентрации этого полипептида), который включает в себя IC50 (т.е. концентрацию тест-соединения, которая дает полумаксимальное ингибирование симптомов), определенную в культуре клеток. Такая информация может быть использована для более точного определения доз, применимых в людях. Могут быть измерены уровни в плазме, например, с использованием высокоэффективной жидкостной хроматографии. Описанные в этом изобретении дцРНК могут вводиться в комбинации с другими известными агентами, эффективными в лечении патологических процессов, опосредуемых экспрессией гена-мишени. В любом случае, осуществляющий введение врач может корректировать количество и тайминг введения дцРНК на основании результатов, наблюдаемых с использованием стандартных измерений эффективности, известных в данной области или описанных здесь. Введение Данное изобретение включает в себя также фармацевтические композиции и готовые формы, которые включают в себя дцРНК-соединения, описанные в этом изобретении. Фармацевтические композиции данного изобретения могут вводиться различными способами в зависимости от того, является ли желательным местное или системное лечение, и от подлежащей обработке зоны. Введение может быть локальным, легочным, например с использованием ингаляции или инсуффляции порошков или аэрозолей,в том числе при помощи распылителя; интратрахеальным, интраназальным, эпидермальным и трансдермальным, пероральным или парентеральным. Парентеральное введение включает в себя внутривенную,внутриартериальную, подкожную, внутрибрюшинную или внутримышечную инъекцию или инфузию; или интракраниальное, например, внутрипаренхимное, внутриоболочечное или внутрижелудочковое введение. Эти дцРНК могут доставляться таким образом, чтобы поражать конкретную ткань, такую как печень (например, гепатоциты печени). Данное изобретение включает в себя фармацевтические композиции, которые могут доставляться инъекцией непосредственно в головной мозг. Эта инъекция может выполняться стереотаксической инъекцией в конкретный участок головного мозга (например, черное вещество, кору, гиппокамп, полосатое тело или бледный шар), или дцРНК может доставляться во множественные участки центральной нервной системы (например, во множественные участки головного мозга и/или в спинной мозг). дцРНК могут также доставляться в диффузные участки головного мозга (например, диффузной доставкой в кору головного мозга). В одном варианте осуществления дцРНК, поражающая TTR, может доставляться посредством канюли или другого устройства доставки, имеющего один конец, имплантированный в ткань, например,головной мозг, например, черное вещество, кору, гиппокамп, полосатое тело, мозолистое тело или бледный шар головного мозга. Эта канюля может быть соединена с резервуаром композиции дцРНК. Поток или доставка может быть опосредована насосом, например, осмотическим насосом или мининасосом,таким как насос Alzet (Durect, Cupertino, CA). В одном варианте осуществления эти насос и резервуар имплантированы в зоне, удаленной от этой ткани, например, в брюшной полости, и доставка осуществляется посредством канала, идущего от насоса или резервуара к участку высвобождения. Инфузия композиции дцРНК в головной мозг может осуществляться на протяжении нескольких часов или в течение нескольких дней, например, в течение 1, 2, 3, 5 или 7 дней или более. Устройства для доставки в головной мозг описаны, например, в Патентах США с номерами 6093180 и 5814014. Фармацевтические композиции и готовые формы для локального введения могут включать в себя трансдермальные пластыри, мази, лосьоны, кремы, гели, капли, суппозитории, спреи, жидкости и порошки. Могут быть необходимыми или желательными общепринятые фармацевтические носители, водные, порошкообразные или масляные основы, загущающие агенты и т.п. Могут быть также применимы имеющие покрытия презервативы, перчатки и т.п. Подходящие локальные готовые формы включают в себя формы, в которых дцРНК, описанные в этом изобретении, находятся в смеси с агентом локальной доставки, таким как липиды, липосомы, жирные кислоты, эфиры жирных кислот, стероиды, хелатообразующие агенты и поверхностно-активные вещества. Подходящие липиды и липосомы включают в себя нейтральные (например, диолеоилфосфатидилэтаноламин DOPE, димиристоилфосфатидилхолин DMPC,дистеароилфосфатидилхолин), отрицательные (например, димиристоилфосфатидилглицерин DMPG) и катионоактивные (например, диолеилтетраметиламинопропил DOTAP и диолеоилфосфатидилэтаноламин D0TMA). дцРНК, описанные в этом изобретении, могут быть инкапсулированы в липосомах или могут образовывать комплексы с ними, в частности с катионоактивными липосомами. Альтернативно,дцРНК могут образовывать комплексы с липидами, в частности, с катионоактивными липидами. Подходящие жирные кислоты и эфиры включают в себя, но не ограничиваются ими, арахидоновую кислоту,олеиновую кислоту, эйкозановую кислоту, лауриновую кислоту, каприловую кислоту, каприновую кислоту, миристиновую кислоту, пальмитиновую кислоту, стеариновую кислоту, линолевую кислоту, дикапрат, трикапрат, моноолеин, дилаурин, глицерил-1-монокапрат, 1-додецилазациклогептан-2-он, акрилкарнитин, ацилхолин или C1-10-алкиловый эфир (например, изопропилмиристат IPM), моноглицерат, диглицерид или их фармацевтически приемлемая соль. Готовые формы для локального введения описаны подробно в Патенте США 6747014, который включен здесь посредством ссылки. Липосомные готовые формы Имеются многие организованные структуры поверхностно-активных веществ, наряду с микроэмульсиями, которые были исследованы и использованы для приготовления лекарственных средств. Они включают в себя монослои, мицеллы, бислои и пузырьки (везикулы). Везикулы, такие как липосомы,привлекают большой интерес вследствие их специфичности и длительности действия, которые они предоставляют с точки зрения доставки лекарственных средств. В контексте данного изобретения термин"липосома" обозначает везикулу (пузырек), состоящий из амфифильных липидов, аранжированных в сферический бислой или бислои. Липосомы являются однослойными или многослойными пузырьками (везикулами), которые имеют мембрану, образованную из липофильного материала и водной внутренней части. Эта водная часть содержит подлежащую доставке композицию. Катионоактивные липосомы имеют то преимущество, что они способны сливаться с клеточной стенкой. Некатионоактивные липосомы, хотя они и неспособны эффективно сливаться с клеточной стенкой, поглощаются макрофагами in vivo. Для прохождения интактной кожи млекопитающего, липидные пузырьки должны проходить через ряд тонких пор, каждая из которых имеет диаметр менее 50 нм, под влиянием подходящего трансдермального градиента. Таким образом, желательно использовать липосому, которая является высокодеформируемой и способна проходить через эти тонкие поры. Следующие преимущества липосом включают в себя следующее: липосомы, полученные из природных фосфолипидов, являются биосовместимыми и биодеградируемыми; липосомы могут включать в себя широкий диапазон водорастворимых и растворимых в липидах лекарственных средств; липосомы могут защищать инкапсулированные лекарственные средства в их внутренних компартментах от метаболизма и деградации (Rosoff, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988,Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., vol. 1, p. 2 45). Важными условиями в приготовлении липосомных готовых форм являются заряд липидной поверхности, размер пузырьков и водный объем липосом. Липосомы применимы для транспорта и доставки активных ингредиентов к участку действия. Поскольку липосомная мембрана является структурно сходной с биологическими мембранами, при нанесении липосом на ткань, липосомы начинают сливаться с клеточными мембранами, и по мере прогрессирования слияния липосомы и клетки, содержимое липосомы опустошается в эту клетку, где может действовать активный агент. Липосомные готовые формы были центром интенсивного исследования в качестве способа доставки для многих лекарственных средств. Существует растущее доказательство того, что для локального применения липосомы предоставляют несколько преимуществ над другими готовыми формами. Такие преимущества включают в себя уменьшенные побочные действия, связанные с высокой системной абсорбцией вводимого лекарственного средства, увеличенное накапливание введенного лекарственного средства в желаемой мишени и способность к введению большого разнообразия лекарственных средств,как гидрофильных, так и гидрофобных, в кожу. Несколько сообщений подробно описали способность липосом к доставке агентов, в том числе ДНК с высокой молекулярной массой, в кожу. В кожу вводили соединения, включающие в себя аналгезирующие вещества, антитела, гормоны и ДНК с высокой молекулярной массой. Большинство применений приводили к достижению верхнего эпидермиса. Липосомы подразделяются на два широких класса. Катионоактивные липосомы являются положительно заряженными липосомами, которые взаимодействуют с отрицательно заряженными молекулами ДНК с образованием стабильного комплекса. Положительно заряженный комплекс ДНК/липосома связывается с отрицательно заряженной клеточной поверхностью и интернализуется в эндосоме. Вследствие кислого рН в этой эндосоме эти липосомы разрываются с высвобождением их содержимого в цитоплазму клетки (Wang et al., Biochem. Biophys. Res.Commun., 1987, 147, 980-985). Липосомы, которые являются рН-чувствительными или отрицательно заряженными, захватывают скорее ДНК, чем комплекс с ней. Поскольку как ДНК, так и липид являются сходным образом заряженными, происходит скорее отталкивание, чем образование комплекса. Тем не менее, некоторая часть ДНК захватывается в водной внутренней части этих липосом. рН-чувствительные липосомы использовали для доставки ДНК, кодирующей ген тимидинкиназы к монослоям клеток в культуре. Экспрессию этого экзогенного гена детектировали в клетках-мишенях (Zhou et al., Journal of Controlled Release, 1992, 19, 269274). Основной тип липосомной композиции включает в себя фосфолипиды, другие чем природно производимый фосфатидилхолин. Нейтральные липосомные композиции могут быть, например, образованы из димиристоилфосфатидилхолина (DMPC) или дипальмитоилфосфатидилхолина (DPPC). Анионогенные липосомные композиции обычно образуются из димиристоилфосфатидилглицерина, тогда как анионогенные вызывающие слияние (фузогенные) липосомы образуются прежде всего из диолеоилфосфатидилэтанолходина (DOPE). Другой тип липосомной композиции образуется из фосфатидилхолина (PC),такого как, например, PC сои и PC яйца. Другой тип образуется из смесей фосфолипида и/или фосфатидилхолина и/или холестерина. Несколько исследований оценивали локальную доставку липосомных готовых форм лекарственных средств в кожу. Нанесение липосом, содержащих интерферон, на кожу морской свинки приводила к уменьшению кожных язв, вызываемых герпес-вирусом, тогда как доставка интерферона посредством другого способа (например, в виде раствора или в виде эмульсии) была неэффективной (Weiner et al.,Journal of Drug Targeting, 1992, 2, 405-410). Кроме того, дополнительное исследование тестировало эффективность интерферона, вводимого в виде части липосомной готовой формы, относительно введения интерферона с использованием водной системы, и был сделан вывод, что эта липосомная готовая форма была лучшей, чем водное введение (du Plessis et al., Antiviral Research, 1992, 18, 259-265). Неионные липосомные системы также испытывались для определения их применимости в доставке лекарственных средств в кожу, в частности, системы, содержащие неионогенное поверхностно-активное вещество и холестерин. Неионогенные липосомные готовые формы, содержащие Novasome I (глицерилдилаурат/холестерин/простой стеариловый эфир полиоксиэтилена-10) и Novasome II (глицерилдистеарат/холестерин простой стеариловый эфир полиоксиэтилена-10) использовали для доставки циклоспорина-А в дерму кожи мыши. Результаты показали, что такие неионные липосомные системы были эффективны в облегчении депонирования циклоспорина-А в различных слоях кожи (Hu et al. S.T.P.Pharma.ScL, 1994, 4, 6, 466). Липосомы включают в себя также "стерически стабилизированные" липосомы, этот термин относится в данном контексте к липосомам, содержащим один или несколько специализированных липидов,которые при включении в липосомы, приводят к увеличенным периодам полужизни в кровотоке относительно липосом, лишенных таких специализированных липидов. Примерами стерически стабилизированных липосом являются липосомы, в которых часть образующей пузырьки липидной части липосомы(А) содержит один или несколько гликолипидов, таких как моносиалоганглиозид GM1, или (В) дериватизована одним или несколькими гидрофильными полимерами, такими как полиэтиленгликоль (ПЭГ). Хотя и без связывания с какой-либо конкретной теорией, в данной области считается, что по меньшей мере для стерически стабилизированных липосом, содержащих ганглиозиды, сфингомиелин или ПЭГдериватизованные липиды, увеличенный период полужизни в кровотоке этих стерически стабилизированных липосом происходит вследствие уменьшенного поглощения в клетки ретикулоэндотелиальной системы (RES) (Allen et al., FEBS Letters, 1987, 223, 42; Wu et al, Cancer Research, 1993, 53, 3765). В данной области известны различные липосомы, содержащие один или несколько гликолипидов.GM1, сульфата галактоцереброзида и фосфатидилинозита улучшать периоды полужизни липосом в крови. Эти открытия были изложены Gabizon et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1988, 85, 6949). Патент США 4837028 и WO 88/04924, оба, выданные Allen et al., описывают липосомы, содержащие (1) сфингомиелин и (2) ганглиозид GM1 или сульфатный эфир галактоцереброзида. Патент США 5543152 (Webb et al.) описывает липосомы,содержащие сфингомиелин. Липосомы,содержащие 1,2-snдимиристоилфосфатидилхолин, описаны в WO 97/13499 (Lim et al.). Многие липосомы, содержащие липиды, дериватизованные одним или несколькими гидрофильными полимерами, и способы их получения известны в данной области. Sunamoto et al. (Bull. Chem. Soc.Jpn., 1980, 53, 2778) описывали липосомы, содержащие неионогенное поверхностно-активное вещество,2C1215G, которое содержит ПЭГ-часть. Ilium et al. (FEBS Lett., 1984, 167, 79) отмечал, что гидрофильное покрытие частиц из полистирола полимерными гликолями приводит к значимо увеличенным периодам полужизни в крови. Синтетические фосфолипиды, модифицированные присоединением карбоксильных групп полиалкиленгликолей (например, ПЭГ), описаны Sears (Патенты США с номерами 4,426,330 and 4,534,899). Klibanov et al. (FEBS Lett., 1990, 2 68, 235) описывал эксперименты, демонстрирующие, что липосомы, содержащие фосфатилилэтаноламин (РЕ), дериватизованный ПЭГ или ПЭГ-стеаратом, имели значимые увеличения периодов полужизни в кровотоке. Blume et al. (Biochimica et Biophysica Acta, 1990,1029, 91) распространили такие наблюдения на другие ПЭГ-дериватизованные фосфолипиды, например,DSPE-PEG, образованный из объединения дистеароилфосфатидилэтаноламина (DSPE) и ПЭГ. Липосомы, имеющие ковалентно связанные ПЭГ-части на их наружной поверхности, описаны в Европейском патентеЕР 0 445 131 В 1 и WO 90/04384, выданном Fisher. Липосомные композиции, содержащие 1-20 мол.% РЕ, дериватизованные ПЭГ, и способы их применения, описаны Woodle et al. (Патенты США с номерами 5013556 и 5356633) и Martin et al. (Патент США с номером 5213804 и Европейский патентЕР 0 496 813 В 1). Липосомы, содержащие ряд других конъюгатов липид-полимер, описаны в WO 91/05545 и Патенте США 5225212 (оба, выданные Martin et al) и в WO 94/20073 (Zalipsky et al.). Липосомы, содержащие ПЭГ-модифицированные церамид-липиды, описаны в WO 96/10391 (Choi et al) . Патент США 5540935 (Miyazaki et al.) и Патент США 5556948 (Tagawa et al.) описывают ПЭГсодержащие липосомы, которые могут быть дополнительно дериватизованы функциональными частями на их поверхностях. В данной области известен ряд липосом, содержащих нуклеиновые кислоты. WO 96/40062, выданный Thierry et al., описывает способы инкапсулирования высокомолекулярных нуклеиновых кислот в липосомах. Патент США 52 64221, выданный Tagawa et al., описывает белок-связанные липосомы и доказывает, что содержимое таких липосом может включать в себя дцРНК. Патент США 5665710,выданный Rahman et al., описывает некоторые способы инкапсулирования олигодезоксинуклеотидов в липосомах. WO 97/04787, выданный Love et al., описывает липосомы, содержащие дцРНК, нацеленные на ген raf. Трансферсомы являются еще одним типом липосом и представляют собой высокодеформируемые липидные агрегаты, которые являются привлекательными кандидатами для носителей доставки лекарственных средств. Трансферсомы могут быть описаны как липидные капельки, которые являются настоль- 20020312 ко высокодеформируемыми, что они способны легко проникать через поры, которые являются меньшими, чем эта капелька. Трансферсомы являются адаптируемыми к среде, в которой их используют, например, они являются самооптимизирующимися (адаптивными к форме пор в коже), саморепарирующимися, часто достигающими их мишени без фрагментации и часто самозагружающимися. Для получения трансферсом можно добавлять активаторы краев поверхности, обычно поверхностно-активные вещества,к стандартной липосомной композиции. Трансферсомы использовали для доставки сывороточного альбумина в кожу. Было показано, что опосредуемая трансферсомами доставка сывороточного альбумина является эффективной в виде подкожной инъекции раствора, содержащего сывороточный альбумин. Сурфактанты (поверхностно активные вещества) находят широкое применение в таких готовых формах, как эмульсии (в том числе микроэмульсии) и липосомы. Наиболее обычным способом классификации и ранжирования свойств многих различных типов поверхностно-активных веществ как природных, так и синтетических, является применение гидрофильного/липофильного баланса (HLB). Природа гидрофильной группы (также известной как "головка") обеспечивает наиболее полезное свойство для классификации различных поверхностно-активных веществ, используемых в готовых формах (Rieger, inPharmaceutical Dosage Forms, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., 1988, p. 285). Если молекула поверхностно-активного вещества является неионизированной, она классифицируется как неионогенное поверхностно-активное вещество. Неионогенные поверхностно-активные вещества находят широкое применение в фармацевтических и косметических продуктах и применимы в широком диапазоне величин рН. Обычно их величины HLB находятся в диапазоне 2-18 в зависимости от их структуры. Неионогенные поверхностно-активные вещества включают в себя неионогенные сложные эфиры, такие как сложные эфиры этиленгликоля, эфиры пропиленгликоля, глицериловые эфиры, полиглицериловые эфиры, эфиры сорбитана, эфиры сахарозы и этоксилированные сложные эфиры. Неионогенные алканоламиды и простые эфиры, такие как этоксилаты жирных спиртов, пропоксилированные спирты и этоксилированные/пропоксилированные блоксополимеры, также включены в этот класс. Полиоксиэтиленовые поверхностно-активные вещества являются наиболее популярными членами класса неионогенных поверхностно-активных веществ. Если молекула поверхностно-активного вещества несет отрицательный заряд при ее растворении или диспергировании в воде, это поверхностно-активное вещество классифицируется как анионогенное поверхностно-активное вещество. Анионогенные поверхностно-активные вещества включают в себя карбоксилаты, такие как мыла, ациллактилаты, ациламиды аминокислот, эфиры серной кислоты, такие как алкилсульфаты и этоксилированные алкилсульфаты, сульфонаты, такие как алкилбензолсульфонаты,ацилизетионаты, ацилтаураты и сульфосукцинаты, и фосфаты. Наиболее важными членами класса анионогенных поверхностно-активных веществ являются алкилсульфаты и мыла. Если молекула поверхностно-активного вещества несет положительный заряд при ее растворении или диспергировании в воде, это поверхностно-активное вещество классифицируется как катионогенное поверхностно-активное вещество. Катионогенные поверхностно-активные вещества включают в себя соли четвертичного аммония и этоксилированные амины. Соли четвертичного аммония являются наиболее используемыми членами этого класса. Если молекула поверхностно-активного вещества способна нести или положительный, или отрицательный заряд, это поверхностно-активное вещество классифицируется как амфотерное поверхностноактивное вещество. Амфотерные поверхностно-активные вещества включают в себя производные акриловой кислоты, замещенные алкиламиды, N-алкилбетаины и фосфатиды. Применение поверхностно-активных веществ в лекарственных продуктах, готовых формах и в эмульсиях обсуждается в обзоре (Rieger, in Pharmaceutical Dosage Forms, Marcel Dekker, Inc., New York,N.Y., 1988, p. 285). Частицы нуклеиновая кислота-липид В одном варианте осуществления, описанная в этом изобретении дцРНК TTR полностью инкапсулирована в липидной готовой форме, например, с образованием SPLP, pSPLP, SNALP или другой частицы нуклеиновая кислота-липид. В данном контексте, термин "SNALP" относится к стабильной частице нуклеиновая кислота-липид, включающей в себя SPLP. В данном контексте термин "SPLP" относится к частице нуклеиновая кислота-липид, содержащей плазмидную ДНК, инкапсулированную в липидном пузырьке. SNALP и SPLP обычно содержат катионоактивный липид, некатионоактивный липид и липид,который препятствует агрегации этой частицы (например, конъюгата ПЭГ-липид). SNALP и SPLP чрезвычайно полезны для системных применений, так как они проявляют увеличенные периоды полужизни в кровотоке после внутривенной (i.v.) инъекции и накапливаются в дистальных участках (например, в местах, физически отделенных от места введения). SPLP включают в себя "pSPLP," которые включают в себя инкапсулированный комплекс конденсирующий агент-нуклеиновая кислота, представленный в публикации РСТWO 00/03683. Частицы данного изобретения обычно имеют средний диаметр приблизительно 50-150 нм, более часто приблизительно 60-130 нм, более часто приблизительно 70-110 нм, наиболее часто приблизительно 70-90 нм, и являются, по существу, нетоксичными. Кроме того, когда эти нуклеиновые кислоты присутствуют в частицах нуклеиновая кислота-липид данного изобретения, являются устойчивыми в водном растворе к деградации нуклеазой. Частицы нуклеиновая кислота-липид и спосо- 21020312 бы их получения описаны, например, в патентах США с номерами 5976567; 5981501; 6534484; 6586410; 6815432 и публикации РСТWO 96/40964. В одном варианте осуществления отношение липид-лекарственное средство (отношение масса/масса) (например, отношение липида к дцРНК) находится в диапазоне от приблизительно 1:1 до приблизительно 50:1, от приблизительно 1:1 до приблизительно 25:1, от приблизительно 3:1 до приблизительно 15:1, от приблизительно 4:1 до приблизительно 10:1, от приблизительно 5:1 до приблизительно 9:1 или от приблизительно 6:1 до приблизительно 9:1. Катионоактивным липидом может быть, например, N,N-диолеил-N,N-диметиламмонийхлоридG1) или их смесь. Этот катионоактивный липид может содержать от приблизительно 20 мол.% до приблизительно 50 мол.% или приблизительно 40 мол.% общего содержания липида, присутствующего в этой частице. В другом варианте осуществления соединение 2,2-дилинолеил-4-диметиламиноэтил-[1,3]диоксолан может быть использовано для получения наночастиц липид-siRNA. Синтез 2,2-дилинолеил-4 диметиламиноэтил-[1,3]-диоксолана описан в Предварительной заявке на патент США с номером 61/107,998, поданной 23 октября 2008 года, которая включена здесь посредством ссылки. В одном варианте осуществления, частица липид-siRNA включает в себя 40% 2,2-дилинолеил-4 диметиламиноэтил-[1,3]-диоксолан: 10% DSPC: 40% холестерин: 10% PEG-C-DOMG (мол.%) с размером частицы 63,020 нм и отношением 0,027 siRNA/липид. Некатионоактивный липид может быть анионоактивным липидом или нейтральным липидом,включающим в себя, но не ограничивающимся ими, дистеароилфосфатидилхолин (DSPC), диолеилфосфатидилхолин (DOPC), дипальмитоилфосфатидилхолин (DPPC), диолеоилфосфатидилглицерин (DOPG),дипальмитоил фосфатидилглицерин (DPPG), диолеоилфосфатидилэтаноламин (DOPE), пальмитоилолеоилфосфатидилхолин (РОРС), пальмитоилолеоилфосфатидилэтаноламин (POPE), диолеилфосфатидилэтанол-4-(N-малеимидометил)циклогексан-1-карбокислат диолеоилфосфатидилэтаноламина (DOPE-mal),дипальмитоилфосфатидилэтаноламин (DPPE), димиристоилфосфоэтаноламин (DMPE), дистеароилфосфатидилэтаноламин (DSPE), 16-О-монометил РЕ, 16-O-диметил РЕ, 18-1-транс РЕ, 1-стеароил-2-олеоилфосфатидилэтаноламин (SOPE), холестерин или их смесь. Этот некатионоактивный липид может составлять от приблизительно 5 до приблизительно 90 мол.%, приблизительно 10 мол.% или приблизительно 58 мол.%, если включен холестерин, общего содержания липида, присутствующего в этой частице. Конъюгированным липидом, который ингибирует агрегацию частиц, может быть, например, полиэтиленгликоль (PEG)-липид, в том числе, без ограничения, PEG-диацилглицерин (DAG), PEGдиалкилоксипропил (DAA), PEG-фосфолипид, PEG-церамид (Cer) или их смесь. Конъюгатом PEG-DAA может быть, например, PEG-дилаурилоксипропил (С 12), PEG-димиристилоксипропил (С 14), PEGдипальмитилоксипропил (C16) или PEG-дистеарилоксипропил (С 18). Конъюгированный липид, который предотвращает агрегацию частиц, может составлять от 0 до приблизительно 20 мол.% или приблизительно 2 мол.% общего содержания липида, присутствующего в этой частице. В некоторых вариантах осуществления частица нуклеиновая кислота-липид дополнительно включает в себя холестерин в количестве, например, приблизительно 10-60 мол.% или приблизительно 48 мол.% общего содержания липида в этой частице.(Sigma-Aldrich) и PEG-Церамид С 16 (Avanti Polar Lipids) могут быть использованы для приготовления наночастиц липид-siRNA (т.е., частиц LNP01). Исходные растворы каждого из них в этаноле могут быть получены следующим образом: ND98, 133 мг/мл; Холестерин, 25 мг/мл, PEG-Церамид С 16, 100 мг/мл. Затем эти исходные растворы ND98, Холестерина и PEG-Церамида С 16 могут быть объединены, напри- 22020312 мер, в молярном соотношении 42:48:10. Этот объединенный раствор липидов может быть смешан с водной siRNA (например, в ацетате натрия с рН 5), так что конечная концентрация этанола равна приблизительно 35-45% и конечная концентрация ацетата натрия равна приблизительно 100-300 мМ. Наночастицы липид-siRNA обычно образуются самопроизвольно после смешивания. В зависимости от желаемого распределения размеров частиц, полученная смесь наночастиц может быть экструдирована через поликарбонатную мембрану (например, с заданным пределом 100 нм) с использованием, например, термобаррельного экструдера, такого как Lipex Extruder (Northern Lipids, Inc). В некоторых случаях, эта стадия экструзии может быть опущена. Удаление этанола и одновременная замена буфера может выполняться,например, диализом или фильтрованием с тангенциальным потоком. Буфер может быть заменен, например, забуференным фосфатом солевым раствором (ЗФР) при приблизительно рН 7, например, приблизительно рН 6,9, приблизительно рН 7,0, приблизительно рН 7,1, приблизительно рН 7,2, приблизительно рН 7,3 или приблизительно рН 7,4. Готовые формы LNP01 описаны, например, в публикации Международной заявки на патентWO 2008/042973, включенной здесь посредством ссылки. Другие примерные готовые формы липид-siRNA являются следующими: Готовые формы LNP09 и ХТС-содержащие готовые формы описаны, например, в Предварительной заявке на патент США с порядковым номером 61/239686, поданной 2 сентября 2009 года, включенной здесь посредством ссылки. Готовые формы LNP11 МС 3-содержащие готовые формы описаны, например,в Предварительной заявке на патент США с порядковым номером 61/244834, поданной 22 сентября 2009 г., включенной здесь посредством ссылки. Готовые формы, полученные стандартным или не предусматривающим экструзию способом, могут быть охарактеризованы сходным образом. Например, готовые формы обычно характеризуют посредством визуального исследования. Они должны быть беловатыми полупрозрачными растворами, не содержащими агрегатов или осадка. Размер частиц и распределение размеров частиц могут быть измерены по светорассеянию с использованием, например, Malvern Zetasizer Nano ZS (Malvern, USA). Частицы должны иметь размер приблизительно 20-300 нм, например, 40-100 нм. Распределение размеров частиц должно быть унимодальным. Общую концентрацию siRNA в готовой форме, а также в захваченной фракции оценивают приближенно с использованием анализа вытеснения красителя. Проба приготовленной siRNA может инкубироваться с РНК-связывающим красителем, таким как Ribogreen (Molecular Probes) в присутствии или в отсутствие разрушающего готовую форму сурфактанта, например, 0,5% Тритона-Х 100. Тотальная siRNA в этой готовой форме может быть определена по сигналу из этой пробы, содержащей сурфактант, относительно калибровочной кривой. Захваченную фракцию определяют вычитанием содержания "свободной" siRNA (измеренного по этому сигналу в отсутствие сурфактанта) из содержания тотальной siRNA. Процент захваченной siRNA обычно равен 85%. Для готовой формы SNALP, размер частиц равен по меньшей мере 30 нм, по меньшей мере 40 нм, по меньшей мере 50 нм, по меньшей мере 60 нм, по меньшей мере 70 нм, по меньшей мере 80 нм, по меньшей мере 90 нм, по меньшей мере 100 нм,по меньшей мере 110 нм и по меньшей мере 120 нм. Подходящим диапазоном является обычно приблизительно по меньшей мере 50-110 нм, приблизительно по меньшей мере 60-100 нм или приблизительно по меньшей мере 80-90 нм. Композиции и готовые формы для перорального введения включают в себя порошки или гранулы,микрочастицы, наночастицы, суспензии или растворы в водных или неводных средах, капсулы, гелевые капсулы, подушечки, таблетки или минитаблетки. Могут быть желательными загустители, ароматизирующие агенты, разбавители, эмульгаторы, диспергирующие добавки или связывающие агенты. В некоторых вариантах осуществления, пероральными готовыми формами являются формы, в которых siRNA,описанные в этом изобретении, вводят вместе с одним или несколькими усилителями проникновения,поверхностно-активными веществами (сурфактантами) и хелаторами. Подходящие поверхностноактивные вещества включают в себя жирные кислоты и/или их эфиры и соли, желчные кислоты и/или из соли. Подходящие желчные кислоты/соли включают в себя хенодезоксихолевую кислоту(CDCA) и урсодезоксихенодезоксихолевую кислоту (UDCA), холевую кислоту, дегидрохолевую кислоту, дезоксихолевую кислоту, глюхолевую кислоту, глихолевую кислоту, гликодезоксихолевую кислоту, таурохолевую кислоту,тауродезоксихолевую кислоту,натрий-тауро-24,25-дигидрофузидат и натрийгликодигидрофузидат. Подходящие жирные кислоты включают в себя арахидоновую кислоту, ундекановую кислоту, олеиновую кислоту, лауриновую кислоту, каприловую кислоту, каприновую кислоту, миристиновую кисло- 24020312 ту, пальмитиновую кислоту, стеариновую кислоту, линолевую кислоту, линоленовую кислоту, дикапрат,трикапрат, моноолеин, дилаурин, глицерил-1-монокапрат, 1-додецилазациклогептан-2-он, ацилкарнитин,ацилхолин или моноглицерид, диглицерид или их фармацевтически приемлемую соль (например, соль натрия). В некоторых вариантах осуществления, используют комбинации усилителей проникновения,например, жирные кислоты/соли в комбинации с желчными кислотами/солями. Одной примерной комбинацией является натриевая соль лауриновой кислоты, каприновая кислота и UDCA. Дополнительные усилители проникновения включают в себя лауриловый эфир полиоксиэтилена-9, цетиловый эфир полиоксиэтилена-20. дцРНК, описанная в этом изобретении, может доставляться перорально, в гранулярной форме, включающей в себя распыленные высушенные частицы, или в комплексе для образования микроили наночастиц. Образующие комплексы дцРНК агенты включают в себя полиаминокислоты; полиимины; полиакрилаты; полиалкилакрилаты; полиоксетаны; полиалкилианоакрилаты; катионизированные желатины, альбумины, крахмалы, акрилаты, полиэтиленгликоли (ПЭГ) и крахмалы; полиалкилцианоакрилаты; ДЭАЭ-дериватизованные полиимины, пуллуланы, целлюлозы и крахмалы. Подходящие комплексообразующие агенты включают в себя хитозан, N-триметилхитозан, поли-L-лизин, полигистидин,полиорнитин, полиспермины, протамин, поливинилпиридин, политиодиэтиламинометилэтилен РP(TDAE), полиаминостирол (например, п-амино), поли(метилцианоакрилат), поли(этилцианоакрилат),поли(бутилцианоакрилат),поли(изобутилцианоакрилат),поли(изогексилцианоакрилат),ДЭАЭметакрилат, ДЭАЭ-гексилакрилат, ДЭАЭ-акриламид, ДЭАЭ-альбумин и ДЭАЭ-декстран, полиметилакрилат, полигексилакрилат, поли(D,L-молочную кислоту), поли(сополимер DL-молочной и гликолевой кислот (PLGA), альгинат и полиэтиленгликоль (PEG). Пероральные готовые формы для дцРНК и их приготовление описаны подробно в патенте США 6887906, публикации США 20030027780 и патенте США 6747014, каждый из которых включен здесь посредством ссылки. Композиции и готовые формы для парентерального, интрапаренхимного (в головной мозг), внутриоболочечного, внутрижелудочкового или внутрипеченочного введения могут включать в себя стерильные водные растворы, которые могут содержать буферы, разбавители и другие подходящие добавки,такие как, но не ограничивающиеся ими, усилители проникновения, соединения-носители и другие фармацевтически приемлемые носители или эксципиенты. Фармацевтические композиции данного изобретения включают в себя, но не ограничиваются ими,растворы, эмульсии и содержащие липосомы готовые формы. Эти композиции могут быть созданы из различных компонентов, которые включают в себя, но не ограничиваются ими, предварительно приготовленные жидкости, самоэмульгирующиеся твердые вещества и самоэмульгирующиеся полутвердые вещества. Особенно предпочтительными являются готовые формы, которые нацелены на печень, при лечении нарушений печени, таких как рак печени. Фармацевтические готовые формы данного изобретения, которые могут удобным образом предоставляться в стандартной лекарственной форме, могут быть приготовлены в соответствии с общепринятыми способами, хорошо известными в фармацевтической промышленности. Такие способы включают в себя стадию приведения в контакт активных ингредиентов с фармацевтическим носителем (фармацевтическими носителями) или эксципиентом (эксципиентами). Обычно эти готовые формы готовят однородным и тонким приведением в контакт активных ингредиентов с жидкими носителями или тонкоизмельченными твердыми носителями или и теми, и другими, с последующим формованием этого продукта,если необходимо. Композиции данного изобретения могут быть приготовлены в виде любой из многих лекарственных форм, таких как, но не ограничивающихся ими, таблетки, капсулы, гелевые капсулы, жидкие сиропы, мягкие гели, суппозитории и клизмы. Композиции данного изобретения могут быть также приготовлены в виде суспензий в водных, неводных или смешанных средах. Водные суспензии могут дополнительно содержать вещества, которые увеличивают вязкость этой суспензии, включающие в себя, например, натрий-карбоксиметилцеллюлозу, сорбит и/или декстран. Эта суспензия может также содержать стабилизаторы. Эмульсии Композиции данного изобретения могут быть получены и приготовлены в виде эмульсий. Эмульсии являются обычно гетерогенными системами одной жидкости, диспергированной в другой в форме капелек, обычно превышающих 0,1 мкм в диаметре (Idson, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman,Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., vol 1, p. 199; Rosoff, in PharmaceuticalDosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., Volume 1, p. 245; Block in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc.,New York, N.Y., vol. 2, p. 335; Higuchi et al., in Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co.,Easton, Pa., 1985, p. 301). Эмульсии являются часто двухфазными системами, содержащими две не смешивающиеся жидкие фазы, тонко смешанные и диспергированные друг с другом. Обычно, эмульсии могут быть или эмульсиями типа вода-в-масле (в/м) , или эмульсиями типа масло-в-воде (м/в). Когда водная фаза мелко разделена и диспергирована в виде мельчайших капелек в объемную масляную фазу, полученную композицию называют эмульсией вода-в-масле (в/м). Альтернативно, когда масляная фаза мелко разделена и диспергирована в виде мельчайших капелек в объемную водную фазу, полученную композицию называют эмульсией масло-в-воде (м/в). Эмульсии могут содержать дополнительные компоненты, наряду с диспергированными фазами, и активное лекарственное средство, которое может присутствовать в виде раствора или в водной фазе, или в масляной фазе, или может само быть отдельной фазой. Если необходимо, фармацевтические эксципиенты, такие как эмульгаторы, стабилизаторы, красители и антиоксиданты, могут также присутствовать в эмульсиях. Фармацевтические эмульсии могут быть также множественными эмульсиями, которые содержат более двух фаз, например, в случае эмульсий масло-в-воде-в-масле (м/в/м) и вода-в-масле-в-воде (в/м/в). Такие комплексные готовые формы часто обеспечивают определенные преимущества, которые не обеспечивают простые бинарные (двойные) эмульсии. Множественные эмульсии, в которых индивидуальные капельки масла м/в-эмульсии заключают в себя малые капельки воды, составляют в/м/в-эмульсию. Подобным образом, система капелек масла, заключенных в глобулы воды, стабилизированных в масляной непрерывной фазе, обеспечивают эмульсию м/в/м. Эмульсии характеризуются низкой термодинамической стабильностью или отсутствием термодинамической стабильности. Часто диспергированная или прерывистая фаза эмульсии хорошо диспергируется в наружную или непрерывную фазу и сохраняется в этой форме посредством эмульгаторов или вязкости этой готовой формы. Любая из этих фаз эмульсии может быть полутвердым или твердым веществом, как в случае основ и кремов мазей эмульсионного типа. Другие способы стабилизации эмульсий влекут за собой применение эмульгаторов, которые могут быть включены в любую фазу этой эмульсии. Другие средства стабилизации эмульсий влекут за собой применение эмульгаторов, которые могут быть включены в любую фазу этой эмульсии. Эмульгаторы могут быть в общих чертах классифицированы на четыре категории: синтетические сурфактанты (поверхностно-активные вещества), природно-встречающиеся эмульгаторы, абсорбционные основы и тонкоизмельченные твердые вещества. (Idson, in Pharmaceutical DosageForms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 199). Синтетические сурфактанты, также известные как поверхностно-активные вещества, нашли широкую применимость в приготовлении эмульсий и обсуждались в виде обзоров в литературе (Rieger, inDekker, Inc., New York, N.Y., 1988, vol. 1, p. 199). Сурфактанты являются обычно амфифильными и содержат гидрофильную и гидрофобную часть. Отношение гидрофильной природы к гидрофобной природе сурфактанта было названо гидрофильным/липофильным балансом (HLB), и оно является ценным инструментом в классификации и выборе сурфактантов в приготовлении готовых форм. Сурфактанты могут быть классифицированы в различные классы на основе природы гидрофильной группы: неионогенные, анионогенные, катионогенные и амфотерные (Rieger, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman,Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N. Y., vol. 1, p. 285). Природно встречающиеся эмульгаторы, используемые в эмульсионных готовых формах, включают в себя ланолин, пчелиный воск, фосфатиды, лецитин и аравийскую камедь. Абсорбционные основы обладают гидрофильными свойствами, так что они могут впитывать воду с образованием в/м-эмульсий с сохранением все еще их полутвердой консистенции, например, в случае безводного ланолина и гидрофильного вазелина. Тонкоизмельченные твердые вещества также использовали в качестве хороших эмульгаторов, особенно в комбинации с сурфактантами и в вязких препаратах. Они включают в себя полярные неорганические твердые вещества, такие как гидроксиды тяжелых металлов, ненабухаемые глины, такие как бентонит, аттапульгит, гекторит, каолин, монтомориллонит, коллоидный силикат алюминия и коллоидный силикат магния-алюминия, пигменты и неполярные твердые вещества, такие как углерод или глицерилтристеарат. Большое разнообразие неэмульгирующих веществ также включают в эмульсионные готовые формы, и они вносят вклад в свойства эмульсий. Они включают в себя жиры, масла, воски и антиоксиданты(Block, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc.,New York, N.Y., vol. 1, p. 335; Idson, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.),1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., vol. 1, p. 199). Гидрофильные коллоиды или гидроколлоиды включают в себя природно-встречающиеся камеди и синтетические полимеры, такие как полисахариды (например, аравийская камедь, агар, альгиновая кислота, каррагенан, гуаровая камедь, камедь карайи и трагакантовая камедь), производные целлюлозы(например, карбоксиметилцеллюлозу и карбоксипропилцеллюлозу) и синтетические полимеры (например, карбомеры, простые эфиры целлюлозы и карбоксивиниловые полимеры). Они диспергируются или набухают в воде с образованием коллоидных растворов, которые стабилизируют эмульсии образованием сильных межфазных пленок вокруг капелек диспергированной фазы и увеличением вязкости наружной фазы. Поскольку эмульсии часто содержат ряд ингредиентов, таких как углеводы, белки, стеролы и фосфатиды, которые могут легко поддерживать рост микробов, эти готовые формы часто включают в себя консерванты. Обычно применяемыми консервантами, включаемыми в эмульсионные готовые формы,включают в себя метилпарабен, пропилпарабен, соли четвертичного азота, хлорид бензалкония, эфиры п- 26020312 гидроксибензойной кислоты и борную кислоту. Антиоксиданты также добавляют обычно в эмульсионные готовые формы для предотвращения ухудшения качества этой готовой формы. Используемыми антиоксидантами могут быть акцепторы свободных радикалов, такие как токоферолы, алкилгаллаты, бутилированный гидроксианизол, бутилированный гидрокситолуол, или восстанавливающие агенты, такие как аскорбиновая кислота и метабисульфит натрия, и синергисты антиоксидантов, такие как лимонная кислота, винная кислота и лецитин. Применение эмульсионных готовых форм посредством дерматологических, пероральных и парентеральных способов и способы их приготовления обсуждались в обзорах в литературе (Idson, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N. Y., vol. 1, p. 199). Эмульсионные готовые формы для пероральной доставки широко использовались вследствие их легкого приготовления, а также эффективности с точки зрения абсорбции и биодоступности (Rosoff,in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York,N.Y., vol. 1, p. 245; Idson, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., vol. 1, p. 199) . Слабительные вещества на основе минерального масла,растворимые в масле витамины и питательные препараты с высоким содержанием жира находятся среди веществ, которые обычно вводят перорально в виде м/в-эмульсий. В одном варианте осуществления данного изобретения, композиции дцРНК и нуклеиновых кислот готовят в виде микроэмульсий. Микроэмульсия может быть определена как система из воды, масла и амфифильного соединения, которая является единым оптически изотропным и термодинамически стабильным жидким раствором (Rosoff, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.),1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., vol. 1, p. 245). Обычно микроэмульсии являются системами,которые готовят сначала диспергированием масла в водном растворе сурфактанта с добавлением затем достаточного количества четвертого компонента, обычно спирта со средней длиной цепи, с получением прозрачной системы. Таким образом, микроэмульсии описывали также как термодинамически стабильные, изотропически прозрачные дисперсии двух несмешиваемых жидкостей, которые стабилизированы межфазными пленками поверхностно-активных молекул (Leung and Shah, in: Controlled Release of Drugs:Polymers and Aggregate Systems, Rosoff, M., Ed., 1989, VCH Publishers, New York, pages 185-215) . Микроэмульсии готовят обычно посредством объединения трех-пяти компонентов, которые включают в себя масло, воду, сурфактант и электролит. Является ли эта микроэмульсия эмульсией типа вода-в-масле(в/m) или типа масло-в-воде (м/в), зависит от свойств используемых масла и сурфактанта и от структуры и геометрической упаковки полярных головок и углеводородных хвостов молекулы сурфактанта (Schott,in Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1985, p. 271). Интенсивно исследовался феноменологический подход, использующий фазовые диаграммы (диаграммы фазового равновесия, или диаграммы состояния), которые предоставили квалифицированным в данной области специалистам всеобъемлющие сведения о том, как следует готовить микроэмульсии (Rosoff, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., NewYork, N.Y., vol. 1, p. 245; Block, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988,Marcel Dekker, Inc., New York, N. Y., vol. 1, p. 335). В сравнении с общепринятыми эмульсиями, микроэмульсии предоставляют преимущество солюбилизации водонерастворимых лекарственных средств в готовой форме термодинамических стабильных капелек, которые образуются спонтанно. Сурфактанты, используемые в приготовлении микроэмульсий, включают в себя, но не ограничиваются ими, ионогенные сурфактанты, неионогенные сурфактанты, Brij 96, олеиловые эфиры полиоксиэтилена, эфиры полиглицерина и жирных кислот, монолаурат тетраглицерина (ML310), моноолеат тетраглицерина (МО 310), моноолеат гексаглицерина (РО 310), пентаолеат гексаглицерина (РО 500), монокапрат декаглицерина (МСА 750), моноолеат декаглицерина (МО 750), секвиолеат декаглицерина(SO750), декаолеат декаглицерина (DAO750), отдельно или в комбинации с вторичными сурфактантами. Вторичный сурфактант, обычно спирт с короткой цепью, такой как этанол, 1-пропанол и 1-бутанол, служит для увеличения межфазной текучести проникновением в пленку сурфактанта и создания вследствие этого пустого пространства, генерируемого среди молекул сурфактанта. Однако микроэмульсии могут быть приготовлены без применения вторичных сурфактантов, и в данной области известны не содержащие спирта самоэмульгирующиеся микроэмульсионные системы. Водной фазой может быть обычно, но без ограничения ими, вода, водный раствор лекарственных средств, глицерин, PEG300, PEG4 00, полиглицерины, пропиленгликоли и производные этиленгликоля. Масляная фаза может включать в себя, но не ограничивается ими, такие вещества, как Captex 300, Captex 355, Capmul MCM, эфиры жирных кислот, моно-, ди- и триглицериды со средней цепью (С 8-С 12), полиоксиэтилированные глицериловые эфиры жирных кислот, жирные спирты, полигликолизированные глицериды, насыщенные полигликолизированные С 8-С 10 глицериды, растительные масла и силиконовое масло. Микроэмульсии представляют особый интерес с точки зрения солюбилизации лекарственных средств и увеличенной абсорбции лекарственных средств. Микроэмульсии на основе липидов (как м/в,так и в/м) были предложены для увеличения пероральной биодоступности лекарственных средств, в том числе пептидов (Constantinides et al., Pharmaceutical Research, 1994, 11, 1385-1390; Ritschel, Meth. Find.Exp. Clin. Pharmacol, 1993, 13, 205) . Микроэмульсии предоставляют преимущества улучшенной солюби- 27020312 лизации лекарственных средств, защиты лекарственного средства от ферментативного гидролиза, возможного усиления абсорбции лекарственных средств вследствие индуцируемых сурфактантом изменений в текучести и проницаемости мембран, легкости приготовления, легкости перорального введения в сравнении с твердыми лекарственными формами, улучшенной клинической эффективности и уменьшенной токсичности (Constantinides et al., Pharmaceutical Research, 1994, 11, 1385; Ho et al., J. Pharm. Sci,1996, 85, 138-143). Часто микроэмульсии могут образовываться спонтанно при сведении их компонентов вместе при комнатной температуре. Это может быть особенно выгодным при приготовлении термолабильных лекарственных средств, пептидов или дцРНК. Микроэмульсии были также эффективны в чрескожной доставке активных компонентов как в косметических, так и фармацевтических применениях. Ожидается, что микроэмульсионные композиции и готовые формы данного изобретения будут способствовать увеличенной системной абсорбции дцРНК и нуклеиновых кислот из желудочно-кишечного тракта, а также улучшать локальное клеточное поглощение дцРНК и нуклеиновых кислот. Микроэмульсии данного изобретения могут также содержать дополнительные компоненты и добавки, такие как моностеарат сорбитана (Grill 3), лабразол и усливающие проникновение агенты, для улучшения свойств готовой формы и усиления абсорбции дцРНК и нуклеиновых кислот данного изобретения. Усиливающие проникновение агенты, используемые в микроэмульсиях данного изобретения, могут быть классифицированы как принадлежащие к одной из пяти широких категорий: сурфактанты,жирные кислоты, желчные кислоты, хелатообразующие агенты и не-хелатообразующие неповерхностно-активные вещества (Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, p. 92). Каждый из этих классов обсуждался выше. Усиливающие проникновение агенты В одном варианте осуществления, данное изобретение использует различные усиливающие проникновение агенты для выполнения эффективной доставки нуклеиновых кислот, в частности дцРНК, в кожу животных. Большинство лекарственных средств присутствуют в растворе как в ионизированной,так и неионизированной формах. Однако, обычно только растворимые в липидах или липофильные лекарственные средства легко пересекают клеточные мембраны. Было обнаружено, что даже нелипофильные лекарственные средства могут пересекать клеточные мембраны, если мембрана, которая должна быть пересечена, обработана усиливающим проникновение агентом. Кроме содействия диффузии нелипофильных лекарственных средств через клеточные мембраны, усиливающие проникновение агенты усиливают также проникаемость липофильных лекарственных средств. Усиливающие проникновение агенты могут быть классифицированы как принадлежащие к одной из пяти широких категорий: сурфактанты, жирные кислоты, желчные кислоты, хелатообразующие агенты и не-хелатообразующие не-поверхностно-активные вещества (Lee et al., Critical Reviews in TherapeuticDrug Carrier Systems, 1991, p. 92). Каждый из этих классов усиливающих проникновение агентов описан ниже более подробно. Сурфактанты. В связи с данным изобретением сурфактанты (или "поверхностно-активные агенты") являются химическими частицами, которые при растворении в водном растворе уменьшают поверхностное натяжение этого раствора или межфазное натяжение между водным раствором и другой жидкостью, результатом чего является усиление абсорбции дцРНК через слизистую оболочку. Кроме желчных кислот и жирных кислот, эти усиливающие проникновение агенты включают в себя, например, лаурилсульфат натрия,лауриловый эфир полиоксиэтилена-9 и цетиловый эфир полиоксиэтилен-20 (Lee et al., Critical Reviews inet al., J. Pharm. Pharmacol, 1988, 40, 252). Жирные кислоты. Различные жирные кислоты и их производные, которые действуют как усиливающие проникновение агенты, включают в себя, например, олеиновую кислоту, лауриновую кислоту, каприновую кислоту(н-декановую кислоту), миристиновую кислоту, пальмитиновую кислоту, стеариновую кислоту, линолевую кислоту, линоленовую кислоту, дикапрат, трикапрат, моноолеин (1-моноолеоил-ras-глицерин), дилаурин, каприловую кислоту, арахидоновую кислоту, глицерол-1-монокапрат, 1-додецилазациклогептан 2-он, ацилкарнитины, ацилхолины, их C1-10-алкиловые эфиры (например, метиловый, изопропиловый и трет-бутиловый) и их моно- и диглицериды (т.е., олеат, лаурат, капрат, миристат, пальмитат, стеарат,линолеат и т.д.) (Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, p.92; Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1-33; El Hariri et al., J. Pharm. Pharmacol, 1992, 44,651-654). Соли желчных кислот. Физиологическая роль желчи включает в себя облегчение диспергирования и абсорбции липидов и жирорастворимых витаминов (Brunton, Chapter 38 in: GoodmanGilman's The Pharmacological Basis ofTherapeutics, 9th Ed., Hardman et al. Eds., McGraw-Hill, New York, 1996, pp. 934-935). Различные природные соли желчных кислот и их синтетические производные действуют в качестве усиливающих проникновение агентов. Таким образом, термин "соли желчных кислот" включает в себя любой из природновстречающихся компонентов желчи, а также их синтетические производные. Подходящие соли желчных кислот включают в себя, например, холевую кислоту (или ее фармацевтически приемлемую натриевую соль, холат натрия), дегидрохолевую кислоту (дегидрохолат натрия), дезоксихолевую кислоту (дезоксихолат натрия), глюхолевую кислоту (глюхолат натрия), гликохолевую кислоту (гликохолат натрия), гликодезоксихолевую кислоту (гликодезоксихолат натрия), таурохолевую кислоту (таурохолат натрия), тауродезоксихолевую кислоту (тауродезоксихолат натрия), хенодезоксихолевую кислоту (хенодезоксихолат натрия), урсодезоксихолевую кислоту (UDCA), тауро-24,25-дигидрофузидат натрия (STDHF), гликодигидрофузидат натрия и лауриловый эфир полиоксиэтилена-9 (РОЕ) (Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, page 92; Swinyard, Chapter 39 In: Remington's Pharmaceutical Sciences,18th Ed., Gennaro, ed., Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1990, pages 782-783; Muranishi, Critical Reviews inTherapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1-33; Yamamoto et al., J. Pharm. Exp. Ther., 1992, 263, 25; Yamashita et al., J. Pharm. Sci, 1990, 79, 579-583). Хелатообразующие агенты. Хелатообразующие агенты, при использовании в связи с данном изобретением, могут быть определены как соединения, которые удаляют ионы металлов из раствора образованием с ними комплексов, в результате чего усиливается абсорбция дцРНК через слизистую оболочку. Что касается их применения в качестве усиливающих проникновение агентов в данном изобретении, хелатообразующие агенты имеют дополнительное преимущество, служа в качестве ингибиторов ДНКазы, так как наиболее охарактеризованные ДНКазы требуют двухвалентного иона металла для катализа и, следовательно, ингибируются хелатообразующими агентами (Jarrett J. Chromatogr., 1993, 618, 315-339). Подходящие хелатообразующие агенты включают в себя, но не ограничиваются ими, динатрийэтилендиаминтетраацетат (EDTA),лимонную кислоту, салицилаты (например, салицилат натрия, 5-метоксисалицилат и гомованилат), Nацилпроизводные коллагена, лаурет-9 и N-аминоацилпроизводные бета-дикетонов (енамины) (Lee et al.,Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, page 92; Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1-33; Buur et al., J. Control ReL, 1990, 14, 43-51). Не-хелатообразующие не-сурфактанты. В данном контексте не-хелатообразующие не-сурфактанты, усиливающие проникновение соединения, могут быть определены как соединения, которые демонстрируют незначительную активность в качестве хелатообразующих агентов или в качестве сурфактантов, но тем не менее усиливают абсорбцию дцРНК через алиментарную слизистую оболочку (Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug CarrierSystems, 1990, 7, 1-33). Этот класс усиливающих проникновение агентов включает в себя, например, ненасыщенные циклические мочевины, производные 1-алкил- и 1-алкенилазациклоалканона (Lee et al.,Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, page 92); и нестероидные противовоспалительные агенты, такие как диклофенак-натрий, индометацин и фенилбутазон (Yamashita et al., J. Pharm. Pharmacol., 1987, 39, 621-626). Носители Некоторые композиции данного изобретения включают в себя также соединения-носители в готовой форме. В данном контексте, "соединение-носитель" или "носитель" могут относиться к нуклеиновой кислоте или ее аналогу, которые являются инертными (т.е. не имеют сами по себе биологической активности), но узнается в качестве нуклеиновой кислоты процессами in vivo, которые уменьшают биодоступность нуклеиновой кислоты, имеющей биологическую активность, например, деградацией этой биологически активной нуклеиновой кислоты или стимулированием ее удаления из кровотока. Совместное введение нуклеиновой кислоты и соединения-носителя, обычно с избытком последнего вещества, может приводить к существенному уменьшению количества нуклеиновой кислоты, улавливаемой в печени,почке или других резервуарах вне кровотока, предположительно вследствие конкуренции между соединением-носителем и нуклеиновой кислотой за общий рецептор. Например, улавливание частично фосфоротиоатной дцРНК в ткани печени может уменьшаться при совместном введении полиинозиновой кислоты, декстрансульфата, полицитидиновой кислоты или 4-ацетамидо-4'-изотиоцианостильбен-2,2'дисульфоновой кислоты (Miyao et al, DsRNA Res. Dev., 1995, 5, 115-121; Takakura et al., DsRNANucl.Acid Drug Dev., 1996, 6, 177-183. Эксципиенты В отличие от соединения-носителя "фармацевтический носитель" или "эксципиент" является фармацевтически приемлемым растворителем, суспендирующим агентом или любым другим фармакологически инертным носителем для доставки одной или нескольких нуклеиновых кислот животному. Этот эксципиент может быть жидкостью или твердым веществом, и его выбирают, имея в виду запланированный способ введения, таким образом, чтобы обеспечить желаемый объем, консистенцию и т.д., при объединении с нуклеиновой кислотой и другими компонентами конкретной фармацевтической композиции. Обычные фармацевтические носители включают в себя, но не ограничиваются ими, связывающие агенты(например, желатинированный кукурузный крахмал, поливинилпирролидон или гидроксипропилметилцеллюлозу и т.д.); наполнители (например, лактозу и другие сахара, микрокристаллическую целлюлозу,пектин, желатин, сульфат кальция, этилцеллюлозу, полиакрилаты или гидрофосфат кальция и т.д.); смазывающие вещества (например, стеарат магния, тальк, диоксид кремния, коллоидный диоксид кремния,стеариновую кислоту, стеараты металлов, гидрогенизированные растительные масла, кукурузный крах- 29