Композиции и способы ингибирования экспрессии генов eg5 и vegf

КОМПОЗИЦИИ И СПОСОБЫ ИНГИБИРОВАНИЯ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ Eg5 И VEGF Изобретение относится к композициям, содержащим двухцепочечную рибонуклеиновую кислоту(дцРНК) в препарате SNALP, и к способам применения таких композиций для ингибирования экспрессии Eg5 и фактора роста эндотелия сосудов (VEGF), а также к способам применения указанных композиций для лечения патологических состояний, опосредуемых экспрессией Eg5 и Родственные заявки По настоящей заявке испрашивается приоритет предварительной заявки США 61/034019, поданной 5 марта 2008, предварительной заявки США 61/083367, поданной 24 июля 2008, предварительной заявки США 61/086381, поданной 5 августа 2008, предварительной заявки США 61/112,079, поданной 6 ноября 2008, предварительной заявки США 61/150664, поданной 6 февраля 2009, описание которых включено в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме. Область, к которой относится изобретение Изобретение относится к композициям, содержащим двухцепочечную рибонуклеиновую кислоту(дцРНК), и к их применению в опосредовании интерференции РНК для ингибирования экспрессии комбинации генов, например гена Eg5 и гена фактора роста эндотелия сосудов (VEGF), включенных в составSNALP, а также к применению таких композиций для лечения патологических состояний, опосредованных экспрессией Eg5 и VEGF, таких как рак. Предшествующий уровень техники Поддержание клеточных популяций в организме регулируется такими клеточными процессами, как деление клеток и запрограммированная клеточная гибель. В нормальных клетках клеточные события,связанные с началом и завершением каждого из этих процессов, являются в высокой степени регулируемыми. При пролиферативном заболевании, таком как рак, один или оба этих процесса могут нарушаться. Так, например, в раковых клетках может происходить нарушение регуляции (контоля контрольных точек) цикла деления клеток либо в результате сверхэкспрессии позитивного регулятора, либо в результате утраты негативного регулятора, вероятно, вследствие мутации. Альтернативно, раковые клетки могут терять способность к запрограммированной гибели вследствие сверхэкспрессии негативного регулятора. Следовательно, необходимо разработать новые химиотерапевтические лекарственные средства, которые позволяли бы восстанавливать процессы "проверки" контрольных точек и запрограммированной гибели раковых клеток. Одним из подходов в лечении рака у человека является нацеливание на белок, который играет существенную роль в клеточном цикле. Для перехода клеточного цикла из одной фазы в другую должны осуществляться некоторые необходимые события. В клеточном цикле существуют контрольные точки,которые обеспечивают правильный порядок наступления определенных событий и фаз. Одной из таких контрольных точек является контрольная точка веретена, которая находится на стадии метафазы метоза. Небольшие молекулы, которые нацелены на белки, обладающие значимыми функциями при митозе, могут запускать контрольные точки веретена и останавливать клеточный цикл на стадии митоза. Из таких небольших молекул, которые останавливают клеточный цикл на стадии митоза, молекулы, которые обладают стабильной противоопухолевой активностью, также индуцируют апоптоз, то есть, морфологические изменения, связанные с запрограммированной гибелью клеток. Так, например, эффективная химиотерапия, используемая для лечения рака, может быть одним из средств, индуцирующих "проверку" контрольных точек и запрограммированную клеточную гибель. К сожалению, существует очень мало соединений, способных регулировать такие процессы внутри клетки. Большинство соединений, которые,как известно, вызывают остановку митоза и апоптоза, действуют как тубулин-связывающие агенты. Эти соединения изменяют динамическую нестабильность микротрубочек и косвенно влияют на функцию/структуру митотического веретена, что приводит к остановке митоза. Поскольку большинство из этих соединений специфически нацелены на тубулиновый белок, который является компонентом всех микротрубочек, то они могут также влиять на один или несколько из многочисленных нормальных клеточных процессов, в которых определенную роль играют микротрубочки. Следовательно, существует необходимость в получении средств, которые будут обладать большей специфичностью нацеливания на белки, связанные с пролиферацией клеток.Eg5 представляет собой один из нескольких кинезин-подобных транспортных белков, которые локализованы в митотическом веретене и которые, как известно, необходимы для образования и/или функционирования биполярного митотического веретена. Недавно сообщалось о небольшой молекуле, которая нарушает биполярность митотического веретена (см. публикацию Mayer, Т. U. et. al. 1999. Science 286(5441) 971-4, которая вводится в настоящее описание посредством ссылки). Более конкретно, небольшая молекула индуцирует образование патологического митотического веретена, в котором моноастральный массив микротрубочек образуется от центральной пары центросом и в котором хромосомы присоединены к дистальным концам микротрубочек. Небольшая молекула была названа "монастролом",поскольку она напоминает моноастральный массив. Такой фенотип моноастрального массива ранее наблюдался в митотических клетках, в которых транспортный белок Eg5 подвергается иммунному истощению. Такой характерный фенотип моноастрального массива облегчает идентификацию монастрола, как потенциального ингибитора Eg5. Действительно, было также показано, что моноастрол ингибирует подвижность микротрубочек, запускаемую транспортным белком Eg5 в in vitro анализе. Ингибитор Eg5, а именно монастрол, не оказывает какого-либо заметного воздействия на двигательную активность родственного кинезина или на двигательную активность, ответственную за перемещение аппарата Гольджи внутри клетки. Клетки, обнаруживающие фенотип моноастрального массива, благодаря иммунному истощению Eg5 или ингибированию Eg5 монастролом, прекращают свой цикл на М-фазе. Однако останов-1 019531 ка митоза, индуцированная либо иммунным истощением, либо ингибированием Eg5, представляет собой переходный процесс (Kapoor, Т. М., 2000. J Cell Biol 150(5) 975-80). Фенотип моноастрального массива и остановка клеточного цикла на стадии митоза, индуцируемые монастролом, являются обратимыми. Клетки восстанавливаются с образованием нормального биполярного митотического веретена, после чего происходит завершение митоза, дальнейшее прохождение клеточного цикла и нормальная пролиферация клетки. Эти данные позволяют предположить, что ингибитор Eg5, который индуцирует временную остановку митоза, не может быть эффективным для лечения заболевания, связанного с пролиферацией раковых клеток. Тем не менее, обнаружение того факта, что монастрол индуцирует остановку митоза,представляет особый интерес, а поэтому необходимо проводить дополнительные исследования и идентификацию соединений, которые могут быть использованы для модуляции транспортного белка Eg5 таким образом, чтобы такая модуляция была эффективной для лечения рака у человека. Также необходимо провести исследования на возможность применения таких соединений в комбинации с другими противоопухолевыми средствами.VEGF (также известный как фактор сосудистой проницаемости, VPF) представляет собой многофункциональный цитокин, который стимулирует ангиогенез, пролиферацию эпителиальных клеток и выживание эндотелиальных клеток. VEGF может продуцироваться тканями широкого ряда, а его сверхэкспрессия или нарушение его экспрессии может приводить к развитию ряда расстройств, включая раковые заболевания и заболевания сетчатки, такие как возрастная дегенерация желтого пятна и другие ангиогенные расстройства. Недавно было обнаружено, что двухцепочечные молекулы РНК (дцРНК) блокируют экспрессию генов по высококонсервативному регуляторному механизму, известному как интерференция РНК(РНКи). В WO 99/32619 (Fire et al.) описано применение дцРНК длиной по меньшей мере в 25 нуклеотидов для ингибирования экспрессии генов в С. elegans. Было также показано, что дцРНК разрушает РНКмишень у других организмов, включая растения (см., например, WO 99/53050, Waterhouse et al.; и WO 99/61631, Heifetz et al.), Drosophila (дрозофилы) (см., например, Yang, D., et al., Curr. Biol. (2000) 10:11911200) и млекопитающих (см. WO 00/44895, Limmer; и DE 101 00 586.5, Kreutzer et al) . В настоящее время, такой природный механизм положен в основу для разработки нового класса фармацевтических средств, которые могут быть использованы для лечения расстройств, вызываемых нарушением регуляции гена или нежелательной регуляцией гена. Описание сущности изобретения Описаны композиции, имеющие две двухцепочечные рибонуклеиновые кислоты (дцРНК), ингибирующие экспрессию гена члена семейства человеческих кинезинов 11 (Eg5/KSP) и гена человеческогоVEGF в клетке. дцРНК приготавливают в виде стабильных липидных частиц, содержащих нуклеиновую кислоту (SNALP). Кроме того, описан способ применения такой композиции для снижения уровня экспрессии Eg5/KSP и/или VEGF в клетке, а также способ лечения заболевания, например рака печени, с использованием композиций согласно изобретению. В соответствии с этим в настоящей заявке описана композиция, имеющая первую двухцепочечную рибонуклеиновую кислоту (дцРНК), ингибирующую экспрессию гена члена семейства человеческих кинезинов 11 (Eg5/KSP), в клетке, и вторую дцРНК, ингибирующую экспрессию человеческого VEGF в клетке, где указанная первая и указанная вторая дцРНК получены в виде стабильных липидных частиц,содержащих нуклеиновую кислоту (SNALP); и где указанная первая дцРНК состоит из первой смысловой цепи; и первой антисмысловой цепи, причем указанная первая смысловая цепь имеет первую последовательность, а указанная первая антисмысловая цепь имеет вторую последовательность, комплементарную по меньшей мере 15 смежным нуклеотидам SEQ ID NO:1311 (5'-UCGAGAAUCUAAACUAACU3'), где указанная первая последовательность комплементарна указанной второй последовательности и где указанная первая дцРНК имеет длину 15-30 пар оснований, а указанная вторая дцРНК состоит из второй смысловой цепи и второй антисмысловой цепи, где указанная смысловая цепь имеет третью последовательность, а указанная вторая антисмысловая цепь имеет четвертую последовательность, комплементарную по меньшей мере 15 смежным нуклеотидам SEQ ID NO:1538 (5'-GCACAUAGGAGAGAUGAGCUU-3'), где указанная третья последовательность комплементарна указанной четвертой последовательности и где каждая цепь имеет длину 15-30 пар оснований. В некоторых вариантах изобретения первая антисмысловая цепь имеет вторую последовательность,комплементарную SEQ ID NO:1311 (5'-UCGAGAAUCUAAACUAACU-3'), а вторая антисмысловая цепь имеет четвертую последовательность, комплементарную SEQ ID NO:1538 (5'-GCACAUAGGAGAGAUGAGCUU-3'). В других вариантах изобретения, первая дцРНК состоит из смысловой цепи, состоящей из SEQ ID NO:1534 (5'-UCGAGAAUCUAAACUAACUTT-3') и антисмысловой цепи, состоящей из SEQID NO:1535 (5'-AGUUAGUUUAGAUUCUCGATT-3'), а вторая дцРНК состоит из смысловой цепи, состоящей из SEQ ID NO:1536 (5'-GCACAUAGGAGAGAUGAGCUU-3'), и антисмысловой цепи, состоящей из SEQ ID NO:1537 (5'-AAGCUCAUCUCUCCUAUGUGCUG-3'). В других вариантах изобретения каждая цепь модифицирована так, что она включает 2'-О-метилрибонуклеотид, обозначенный строчными буквами "с" или "и", и фосфортиоат, обозначенный строчной буквой "s": причем первая дцРНК состоит из смысловой цепи, состоящей из SEQ ID NO:1240 (5'-ucGAGAAucuAAAcuAAcuTsT-3') и анти-2 019531 смысловой цепи, состоящей из SEQ ID NO:1241 (5'-AGUuAGUUuAGAUUCUCGATsT); а вторая дцРНК состоит из смысловой цепи, состоящей из SEQ ID NO:1242 (5'-GcAcAuAGGAGAGAuGAGCUsU-3') и антисмысловой цепи, состоящей из SEQ ID NO:1243 (5'-AAGCUcAUCUCUCCuAuGuGCusG-3'). В некоторых вариантах изобретения, первая дцРНК содержит два выступающих конца, а вторая дцРНК содержит один выступающий конец у 3'-конца антисмысловой цепи и тупой конец у 5'-конца антисмысловой цепи. Первая и вторая дцРНК может иметь по меньшей мере один модифицированный нуклеотид. Так,например, каждая дцРНК может иметь по меньшей мере один модифицированный нуклеотид, выбранный из группы, состоящей из модифицированного 2'-O-метилом нуклеотида, нуклеотида, имеющего 5'фосфортиоатную группу, и концевого нуклеотида, связанного с холестериловым производным или с бисдециламидной группой додекановой кислоты. Модифицированный нуклеотид может быть выбран из группы, состоящей из нуклеотида, модифицированного 2'-дезокси-2'-фтором, 2'-дезоксимодифицированного нуклеотида, блокированного нуклеотида, неосновного нуклеотида, 2'-аминомодифицированного нуклеотида, 2'-алкилмодифицированного нуклеотида, морфолинонуклеотида, фосфорамидата и нуклеотида, имеющего неприродное основание. В некоторых вариантах изобретения первая и вторая дцРНК содержат по меньшей мере один рибонуклеотид, модифицированный 2'-О-метилом, и по меньшей мере один нуклеотид, имеющий 5'-фосфортиоатную группу. Каждая цепь каждой дцРНК может иметь длину, например, в 19-23 основания или, альтернативно,21-23 основания. В одном из вариантов изобретения, каждая цепь первой дцРНК имеет длину в 21 основание, и смысловая цепь второй дцРНК имеет длину в 21 основание, а антисмысловая цепь второй дцРНК имеет длину в 23 основания. В некоторых вариантах изобретения первая и вторая дцРНК присутствуют в эквимолярном отношении. Как описано в настоящей заявке, дцРНК получают в виде SNALP. В некоторых вариантах изобретения, композиция SNALP включает DLinDMA, холестерин, DPPC и PEG2000-C-DMA. Так, например,SNALP может иметь компоненты в количествах, указанных в таблице 17. Композиция согласно изобретению может быть использована для снижения уровня экспрессии Eg5 и/или VEGF. В некоторых вариантах изобретения композиция согласно изобретению, после ее контактирования с клетками, экспрессирующими Eg5, ингибирует экспрессию Eg5 по меньшей мере на 40, 50, 60,70, 80 или по меньшей мере на 90%. В других вариантах изобретения, композиция согласно изобретению, после ее контактирования с клетками, экспрессирующими VEGF, ингибирует экспрессию VEGF по меньшей мере на 40, 50, 60, 70, 80 или по меньшей мере на 90%. Введение композиции в клетку может обеспечивать экспрессию Eg5 и VEGF в указанной клетке. Композиции по пп.1-17 вводят в наномолярной концентрации. Введение композиции согласно изобретению в клетки может приводить, например, к повышению уровня образования моноастера в клетке. Введение этой композиции млекопитающему может вызывать по меньшей мере один эффект, выбранный из группы, состоящей из предупреждения роста опухоли,снижения роста опухоли или увеличения продолжительности жизни указанного млекопитающего. Этот эффект может быть определен с помощью по меньшей мере одного анализа, выбранного из группы, состоящей из определения массы тела, определения массы органа, визуального наблюдения, анализа мРНК,анализа AFP сыворотки и монитринга выживаемости. В настоящее изобретение включены композиции,обладающие таким действием при их введении в наномолярной (нМ) концентрации. В другом варианте изобретения композиция согласно изобретению включает сорафениб. В настоящее изобретение также включены способы применения композиций согласно изобретению. В одном из своих вариантов, настоящее изобретение относится к способам ингибирования экспрессии Eg5/KSP и VEGF в клетке путем введения любых композиций согласно изобретению в клетки. В других своих вариантах настоящее изобретение относится к способам предупреждения роста опухоли,снижения роста опухоли или увеличения продолжительности жизни млекопитающего, нуждающегося в лечении рака, путем введения данной композиции указанному млекопитающему. В некоторых вариантах изобретения указанное млекопитающее страдает раком печени, например, указанным млекопитающим является человек, страдающий раком печени. Указанный способ может включать дополнительную стадию введения сорафениба. Краткое описание графического материала На фиг. 1 представлен график, иллюстрирующий процентное соотношение массы печени к массе тела после введения SNALP-киРНК мышам с моделью Нер 3 В. На фиг. 2 А-2D представлены графики, иллюстрирующие влияние SNALP-киРНК на массу тела мышей с моделью Нер 3 В. На фиг. 3 представлен график, иллюстрирующий влияние SNALP-киРНК на массу тела мышей с моделью Нер 3 В. На фиг. 4 представлен график, иллюстрирующий массу тела необработанных контрольных животных. На фиг. 5 представлен график, иллюстрирующий влияние контрольных киРНК люциферазы-SNALP на массу тела мышей с моделью Нер 3 В. На фиг. 6 представлен график, иллюстрирующий влияние киРНК VSP-SNALP на массу тела мышей с моделью Нер 3 В. На фиг. 7 А представлен график, иллюстрирующий влияние SNALP-киРНК на уровни человеческого GAPDH, нормализованные по уровням мышиного GAPDH у мышей с моделью Нер 3 В. На фиг. 7 В представлен график, иллюстрирующий влияние SNALP-киРНК на уровни AFP в сыворотке, измеренные с помощью ELISA сыворотки у мышей с моделью Нер 3 В. На фиг. 8 представлен график, иллюстрирующий влияние SNALP-киРНК на уровни человеческогоGAPDH, нормализованные по уровням мышиного GAPDH у мышей с моделью Нер 3 В. На фиг. 9 представлен график, иллюстрирующий влияние SNALP-киРНК на уровни человеческогоKSP, нормализованные по уровням человеческого GAPDH у мышей с моделью Нер 3 В. На фиг. 10 представлен график, иллюстрирующий влияние SNALP-киРНК на уровни человеческогоVEGF, нормализованные по уровням человеческого GAPDH у мышей с моделью Нер 3 В. На фиг. 11 А представлен график, иллюстрирующий влияние SNALP-киРНК на уровни мышиногоVEGF, нормализованные по уровням человеческого GAPDH у мышей с моделью Нер 3 В. На фиг. 11 В представлена серия графиков, иллюстрирующих влияние SNALP-киРНК на уровни человеческого GAPDH и уровни AFP в сыворотке у мышей с моделью Нер 3 В. На фиг. 12 А-12 С представлены графики, иллюстрирующие влияние SNALP-киРНК на уровни опухолевых KSP, VEGF и GAPDH у мышей с моделью Нер 3 В. На фиг. 13 А и 13 В представлены графики, иллюстрирующие влияние SNALP-киРНК на выживаемость мышей с опухолями печени. Обработку начинали через 18 дней (фиг. 13 А) и через 26 дней (фиг. 13 В) после посева опухолевых клеток. На фиг. 14 представлен график, иллюстрирующий влияние SNALP-киРНК на уровни альфафетопротеина в сыворотке (AFP). На фиг. 15 А и 15 В представлены изображения НЕ-окрашенных срезов у животных с опухолями(через три недели после имплантации клеток Нер 3 В), которым было введено 2 мг/кг SNALP-VSP (А) или 2 мг/кг SNALP-Luc (В). Через двадцать четыре часа доли печени, несущие опухоль, подвергали гистологическому анализу. Стрелками показаны моноастеры. На фиг. 16 представлена блок-схема, иллюстрирующая способ приготовления ALN-VSPDS01. На фиг. 17 представлено фотографическое изображение ALN-VSP02, полученное на электронном просвечивающем криомикроскопе (крио-ТЕМ). На фиг. 18 представлена блок-схема, иллюстрирующая способ приготовления ALN-VSP02. На фиг. 19 представлен график, иллюстрирующий влияние на выживаемость после введения киРНК в виде препарата SNALP и сорафениба. Подробное описание изобретения Настоящее изобретение относится к композициям и к способам, которые могут быть применены для ингибирования экспрессии гена Eg5 и гена VEGF в клетках или у млекопитающих с использованием дцРНК. дцРНК предпочтительно упаковывают в виде стабильных частиц нуклеиновой кислоты(SNALP). Настоящее изобретение также относится к композициям и к способам, используемым для лечения патологических состояний и заболеваний, таких как рак печени у млекопитающих, вызываемый экспрессией гена Eg5 и генов VEGF. дцРНК регулирует последовательность-специфическое расщепление мРНК по механизму, известному как интерференция РНК (РНКи). Ниже подробно описан способ получения и применения композиций, содержащих дцРНК, для ингибирования экспрессии гена Eg5 и генов VEGF, соответственно, а также описаны композиции и способы, используемые для лечения заболеваний и расстройств, вызываемых экспрессией этих генов, например, таких заболеваний, как рак. Фармацевтические композиции согласно изобретению включают дцРНК, имеющую антисмысловую цепь, содержащую область комплементарности длиной менее чем 30 нуклеотидов, а обычно 19-24 нуклеотида, и в основном, комплементарную по меньшей мере части РНКтранскрипта гена Eg5, в комбинации с фармацевтически приемлемым носителем. Композиции согласно изобретению также включают дцРНК, имеющую антисмысловую цепь, содержащую область комплементарности длиной менее чем 30 нуклеотидов, а обычно 19-24 нуклеотида, и в основном, комплементарную по меньшей мере части РНК-транскрипта гена VEGF. В соответствии с этим в некоторых своих аспектах, настоящее изобретение относится к фармацевтическим композициям, содержащим дцРНК Eg5 и VEGF, и фармацевтически приемлемый носитель; к способам применения указанных композиций для ингибирования экспрессии гена Eg5 и гена VEGF, соответственно, и к способам применения указанных фармацевтических композиций для лечения заболеваний, вызываемых экспрессией генов Eg5 и VEGF.I. Определения. Для удобства значения некоторых терминов и выражений, используемых в описании изобретения, в примерах и в прилагаемой формуле изобретения, приводятся ниже. В случае возникновения явных разногласий между определениями терминов, имеющимися в других частях описания настоящего изобретения, и их определениями в этом разделе, предпочтение следует отдать определению, представленному в этом разделе. Каждый из "G", "С", "А" и "U", по существу, означает нуклеотид, содержащий гуанин, цитозин,аденин и урацил в качестве основания, соответственно. "Т" и "dT" являются взаимозаменяемыми и означают дезоксирибонуклеотиды, где указанным нуклеооснованием является тимин, например, дезоксириботимин. Однако следует отметить, что термин "рибонуклеотид" или "нуклеотид" может также означать модифицированный нуклеотид, подробно описанный ниже, или его суррогатную замену. Специалистам в данной области хорошо известно, что гуанин, цитозин, аденин и урацил могут быть заменены другими молекулами без какого-либо значительного изменения свойств олигонуклеотида, содержащего нуклеотид, несущий такую молекулу-заместитель, в отношении спаривания оснований. Так, например, в качестве неограничивающего примера можно отметить, что нуклеотид, содержащий основание инозин, может спариваться с нуклеотидами, содержащими аденин, цитозин или урацил. Следовательно, в нуклеотидных последовательностях согласно изобретению, нуклеотиды, содержащие урацил, гуанин или аденин, могут быть заменены нуклеотидом, содержащим, например, инозин. В другом примере, в олигонуклеотиде, аденин и цитозин могут быть заменены гуанином и урацилом, соответственно, с образованием пары оснований G-U с неоднозначным спариванием с мРНК-мишенью. Последовательности, содержащие такие замененные части, являются вариантами настоящего изобретения. Используемый в настоящем описании термин "Eg5" означает член семейства человеческих кинезинов 11, также известный как KIF11, Eg5, HKSP, KSP, KNSL1 или TRIP5. Последовательность Eg5 можно найти в базе данных NCBI GeneID:3832, HGNC ID: HGNC:6388 и RefSeq ID number:NM004523. Термины "Eg5", "KSP" и "Eg5/KSP" являются взаимозаменяемыми. Используемый в настоящем описании термин VEGF, также известный как фактор сосудистой проницаемости, представляет собой ангиогенный фактор роста. VEGF является гомодимерным гликопротеином размером 45 кДа, который существует по меньшей мере в трех различных изоформах. ИзоформыVEGF экспрессируются в эндотелиальных клетках. Ген VEGF содержит 8 экзонов, экспрессирующих изоформу белка из 189 аминокислот. В изоформе из 165 аминокислот отсутствуют остатки, кодируемые экзоном 6, а в изоформе из 121 аминокислоты отсутствуют остатки, кодируемые экзонами 6 и 7. VEGF 145 представляет собой изоформу, которая, как предполагается, содержит 145 аминокислот, и в которой отсутствует экзон 7. VEGF может действовать на эндотелиальные клетки посредством связывания с эндотелиальным рецептором тирозинкиназы, таким как FIt-1 (VEGFR-1) или KDR/flk-1 (VEGFR-2).VEGFR-2 экспрессируется в эндотелиальных клетках и участвует в дифференцировке и в васкулогенезе эндотелиальных клеток. Третий рецептор, VEGFR-3, участвует в лимфогенезе. Различные изоформы обладают различными биологическими активностями и имеют различные клинические применения. Так, например, VEGF 145 индуцирует ангиогенез, и подобно VEGF 189 (но неVEGF 165) VEGF 145 эффективно связывается с внеклеточным матриксом по механизму, не зависящему от механизма действия сульфатов гепарина, связанных с внеклеточным матриксом. VEGF обладает активностью митогена эндотелиальных клеток и хемоатрактанта in vitro и индуцирует сосудистую проницаемость и ангиогенез in vivo. VEGF секретируется раковыми клетками широкого ряда и стимулирует рост опухоли посредством индуцирования развития опухолеассоциированной сосудистой системы. Было показано, что ингибирование функции VEGF приводит к ограничению роста первичных экспериментальных опухолей, а также к уменьшению случаев возникновения метастазов у мышей с ослабленным иммунитетом. Различные дцРНК, направленные на VEGF, описаны в одновременно рассматриваемых заявках США рег.11/078073 и 11/340080, которые во всей своей полноте вводятся в настоящее описание посредством ссылки. Используемый в настоящем описании термин "последовательность-мишень" означает непрерывную область нуклеотидной последовательности молекулы мРНК, образованную в процессе транскрипции гена Eg5/KSP и/или VEGF, включая мРНК, которая является продуктом процессинга РНК первичного продукта транскрипции. Используемый в настоящем описании термин "цепь, содержащая последовательность" означает олигонуклеотид, содержащий цепь нуклеотидов, представляющую собой последовательность, описанную с применением стандартной номенклатуры нуклеотидов. Если это не оговорено особо, используемый в настоящем описании термин "комплементарный",употребляемый для описания первой нуклеотидной последовательности по отношению ко второй нуклеотидной последовательности, относится к способности олигонуклеотида или полинуклеотида, содержащего первую нуклеотидную последовательность, гибридизоваться с олигонуклеотидом или полинуклеотидом, содержащим вторую нуклеотидную последовательность, и образовывать с ними дуплексную структуру в определенных условиях, известных специалистам. Такими условиями могут быть, например,жесткие условия, при которых используются 400 мМ NaCl, 40 мМ PIPES, pH 6,4, 1 мМ EDTA, 50 С или 70 С в течение 12-16 ч с последующей промывкой. Могут быть применены и другие условия, такие как физиологически релевантные условия, которые могут наблюдаться внутри организма. Специалист в данной области может также самостоятельно определить набор условий, наиболее подходящих для тестирования комплементарности двух последовательностей в зависимости от конечной цели применения гибридизованных нуклеотидов. Такая гибридизация включает спаривание оснований олигонуклеотида или полинуклеотида, содержащего первую нуклеотидную последовательность, с основаниями олигонуклеотида или полинуклеотида, содержащего вторую нуклеотидную последовательность, по всей длине первой и второй нуклеотидной последовательности. Такие последовательности могут называться "полностью комплементарными" друг к другу. Однако, если первая последовательность является "по существу комплементарной" второй описанной в настоящем описании последовательности, то эти две последовательности могут быть полностью комплементарными, либо они могут образовывать одну или две, но обычно не более чем 4, 3 или 2 пары оснований, ошибочно спаренных после их гибридизации с сохранением способности гибридизоваться в условиях, наиболее подходящих для достижения нужной цели. Однако если два олигонуклеотида сконструированы так, что они, после гибридизации, образуют один или несколько одноцепочечных выступающих конца, то такие выступающие концы не должны рассматриваться как ошибочное спаривание при определении комплементарности. Так, например, дцРНК, содержащая один олигонуклеотид длиной в 21 нуклеотид и другой олигонуклеотид длиной в 23 нуклеотида, где более длинный олигонуклеотид содержит последовательность из 21 нуклеотида, которая полность комплементарна более короткому олигонуклеотиду, может также называться "полностью комплементарной", в зависимости от целей настоящего изобретения. Используемые в настоящем описании "комплементарные" последовательности могут также включать, или полностью состоять из них, пары оснований, не являющиеся парами Уотсона-Крика, и/или пары оснований, образованные неприродными и модифицированными нуклеотидами, если это удовлетворяет вышеуказанным требованиям в отношении их способности к гибридизации. Такими парами оснований, не являющимися парами оснований Уотсона-Крика, могут быть, но не ограничиваются ими, парыG:U, спаривающиеся по теории нестрогого соответствия, или пары оснований Хугстейна. Используемые в настоящем описании термины "комплементарный", "полностью комплементарный" и "по существу, комплементарный" могут относиться к "правильному" спариванию оснований между смысловой цепью и антисмысловой цепью дцРНК или между антисмысловой цепью дцРНК и последовательностью-мишенью, как будет очевидно из описания их применения. Используемый в настоящем описании термин "полинуклеотид, который, по существу, комплементарен по меньшей мере части" матричной РНК (мРНК) означает полинуклеотид, который, по существу,комплементарен непрерывной части представляющей интерес мРНК (например, кодирующей Eg5/KSP и/или VEGF), включая 5'-UTR, открытую рамку считывания (ОРС) или 3'-UTR. Так, например, полинуклеотид комплементарен по меньшей мере части мРНК Eg5, если указанная последовательность по существу комплементарна непрерывной части мРНК, кодирующей Eg5. Используемые в настоящем описании термины "двухцепочечная РНК" или "дцРНК" означают дуплексную структуру, содержащую две антипараллельные и по существу комплементарные, как определено выше, цепи нуклеиновой кислоты. Две цепи, образующие дуплексную структуру, могут представлять собой различные части одной более крупной молекулы РНК, либо они могут представлять собой отдельные молекулы РНК. Если две цепи представляют собой часть одной более крупной молекулы, а поэтому они соединены непрерывной цепью нуклеотидов между 3'-концом одной цепи и 5'-концом соответствующей другой цепи, образующей дуплексную структуру, то такая соединяющая РНК-цепь называется"шпилечной петлей". Если две цепи ковалентно связаны между 3'-концом одной цепи и 5'-концом соответствующей другой цепи, образующей дуплексную структуру, каким-либо другим способом, а не посредством непрерывной цепи нуклеотидов, то такая соединяющая структура называется "линкером". Цепи РНК могут иметь одинаковое или различное число нуклеотидов. Максимальным числом пар оснований является число нуклеотидов в самой короткой цепи дцРНК минус какие-либо выступающие концы,присутствующие в дуплексе. дцРНК, помимо дуплексной структуры, может содержать один или несколько нуклеотидных выступающих концов. По существу, большинство нуклеотидов каждой цепи представляют собой рибонуклеотиды, но, как подробно описано в настоящей заявке, каждая цепь или обе цепи могут также включать по меньшей мере один нуклеотид, не являющийся рибонуклеотидом,например дезоксирибонуклеотид и/или модифицированный нуклеотид. Кроме того, термин "дцРНК",используемый в описании настоящей заявки, может включать химические модификации рибонуклеотидов, включая значительные модификации во множестве нуклеотидов и модификации всех типов, описанные в настоящей заявке или известные специалистам. Любые такие модификации, используемые в молекуле типа киРНК, входят в объем термина "дцРНК", используемого в описании настоящей заявки и в формуле изобретения. Используемый в настоящем описании термин "выступающий концевой нуклеотид" означает неспаренный нуклеотид или нуклеотиды, которые выступают из дуплексной структуры дцРНК, если 3'-конец первой цепи дцРНК выступает за пределы 5'-конца другой цепи или наоборот. Термины "тупой" или "тупой конец" означают, что на конце дцРНК отсутствуют неспаренные нуклеотиды, то есть отсутствует выступающий нуклеотид. "Затупленная по концам" дцРНК представляет собой дцРНК, которая является двухцепочечной по всей длине, то есть на любом конце данной молекулы отсутствует выступающий нуклеотид. В некоторых вариантах изобретения, дцРНК может иметь выступающий нуклеотид на одном конце дуплекса и тупой конец на другом конце. Термин "антисмысловая цепь" означает цепь дцРНК, которая включает область, по существу комплементарную последовательности-мишени. Используемый в настоящем описании термин "область комплементарности" означает область на антисмысловой цепи, которая, по существу, комплементарна последовательности, например, последовательности-мишени, определенной в настоящей заявке. Если область комплементарности не является полностью комплементарной последовательности-мишени, то во внутренних или в концевых областях молекулы может иметь место ошибочное спаривание. По существу, наиболее толерантные ошибочные спаривания наблюдаются в концевых областях, например, в 6, 5,4, 3 или 2 нуклеотидах у 5'- и/или 3'-конца. Используемый в настоящем описании термин "смысловая цепь" означает цепь дцРНК, которая включает область, по существу, комплементарную области антисмысловой цепи. Используемый в настоящем описании термин "SNALP" означает стабильную частицу "липиднуклеиновая кислота". SNALP представляет собой везикулу из липидов, покрывающих внутреннюю часть с небольшим количеством воды, включающую нуклеиновую кислоту, такую как иРНК-агент или плазмида, из которой транскрибируется такой иРНК-агент. Термин "введение в клетку", если он относится к дцРНК, означает облегчение поглощения или абсорбции в клетке, как известно специалистам в данной области. Абсорбция или поглощение дцРНК может происходить без участия диффузионных или активных клеточных процессов или с участием вспомогательных агентов, либо она может быть достигнута с применением оборудования. Значение этого термина не ограничивается клетками in vitro, и дцРНК может быть также "введена в клетку", где указанной клеткой является часть живого организма. В таком случае, введение в клетку может включать доставку в организм. Так, например, для in vivo доставки, дцРНК может быть введена путем инъекции в участок ткани, либо она может быть введена системно. In vitro введение в клетку включает методы, известные специалистам, такие как электропорация и липофекция. Используемые в настоящем описании термины "сайленсинг", "ингибирование экспрессии", "снижение уровня экспрессии", "подавление экспрессии" и т.п., если они относятся к гену Eg5 и/или VEGF, означают по меньшей мере частичное подавление экспрессии гена Eg5, заключающееся в снижении количества мРНК Eg5 и/или мРНК VEGF, которое может быть выделено из первой клетки или группы клеток, в которых транскрибируется ген Eg5 и/или ген VEGF, и которые были обработаны так, чтобы ингибировалась экспрессия гена Eg5 и/или VEGF, по сравнению с указанными мРНК, выделенными из второй клетки или группы клеток, в основном, идентичных первой клетке или группы клеток, которые не были обработаны таким способом (контрольные клетки). Степень ингибирования обычно выражается уравнением: Альтернативно, степень ингибирования может быть выражена как снижение величины параметра,функционально связанного с экспрессией гена Eg5 и/или VEGF, например, количества белка, кодируемого геном Eg5 и/или VEGF, продуцируемым в клетке, или числа клеток, имеющих определенный фенотип,например, подвергающихся апоптозу. В принципе, сайленсинг гена-мишени может быть определен в любой клетке, экспрессирующей данную мишень, либо конститутивно, либо методами геномной инженерии, либо с помощью любого подходящего анализа. Однако, если для того, чтобы определить, может ли данная дцРНК в определенной степени ингибировать экспрессию гена Eg5, а значит, может ли она входить в объем настоящего изобретения, необходимо использовать стандарт, и в качестве такого стандарта может служить анализ, описанный ниже в примерах. Так, например, в некоторых случаях, экспрессию гена Eg5 (или гена VEGF) подвергают ингибированию по меньшей мере примерно на 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 или 50% путем введения двухцепочечного олигонуклеотида согласно изобретению. В некоторых вариантах изобретения, ген Eg5 и/илиVEGF подвергают ингибированию по меньшей мере примерно на 60, 70 или 80% путем введения двухцепочечного олигонуклеотида согласно изобретению. В других вариантах изобретения ген Eg5 и/илиVEGF ингибируется по меньшей мере примерно на 85, 90 или 95% путем введения двухцепочечного олигонуклеотида согласно изобретению. В таблицах и примерах, приведенных ниже, указаны величины для ингибирования экспрессии с использованием различных молекул дцРНК Eg5 и/или VEGF в различных концентрациях. Термины "лечить", "лечение" и т.п., используемые в настоящем описании в связи с экспрессией Eg5(или экспрессией VEGF), означают ослабление или снижения уровня патологических процессов, опосредуемых экспрессией Eg5 и/или VEGF. В контексте описания настоящего изобретения, термины "лечить","лечение" и т.п., если они относятся к любому другому состоянию, описанному ниже (не являющемуся патологическим процессом, опосредуемым экспрессией Eg5 и/или VEGF), означают ослабление или снижение тяжести по меньшей мере одного симптома данного состояния, либо замедление прогрессирования или реверсии прогрессирования такого состояния, например, замедление и снижение степени прогрессирования карциномы печени. Используемые в настоящем описании термины "терапевтически эффективное количество" и "про-7 019531 филактически эффективное количество" означают количество, которое дает терапевтический эффект при лечении, предупреждении или терапии патологических состояний, опосредуемых экспрессией Eg5 и/илиVEGF или ярко выраженных симптомов патологических процессов, опосредуемых экспрессией Eg5 и/или VEGF. Конкретное количество, которое является терапевтически эффективным, может быть легко определено практическим врачом и может варьироваться в зависимости от факторов, известных специалистам, таких как, например, тип патологического процесса, опосредуемого экспрессией Eg5 и/илиVEGF, история болезни и возраст пациента, стадия патологических процессов, опосредуемых экспрессией Eg5 и/или VEGF, и введение других средств, направленных против патологических процессов, опосредуемых агентами, экспрессирующими Eg5 и/или VEGF. Используемый в настоящем описании термин "фармацевтическая композиция" включает фармакологически эффективное количество дцРНК и фармацевтически приемлемый носитель. Используемые в настоящем описании термины "фармакологически эффективное количество", "терапевтически эффективное количество" или просто "эффективное количество" означают количество РНК, эффективное для достижения нужного фармакологического, терапевтического или профилактического эффекта. Так, например, если данное лечение заболевания рассматривается как эффективное, то есть, если наблюдается по меньшей мере 25% снижение измеряемого параметра, связанного с таким заболеванием или расстройством, то терапевтически эффективным количеством лекарственного средства для лечения такого заболевания или расстройства, является количество, необходимое для достижения по меньшей мере 25% снижения величины такого параметра. Термин "терапевтически приемлемый носитель" означает носитель, используемый для введения терапевтического средства. Как более подробно описано ниже, такими носителями являются, но не ограничиваются ими, физиологический раствор, забуференный физиологический раствор, декстроза, вода,глицерин, этанол и их комбинации. Этот термин, в частности, исключает среду для культивирования клеток. Для перорально вводимых лекарственных средств, фармацевтически приемлемыми носителями являются, но не ограничиваются ими, фармацевтически приемлемые наполнители, такие как инертные разбавители, дезинтегрирующие агенты, связывающие агенты, замасливатели, подсластители, ароматизаторы, красители и консерванты. Подходящими инертными разбавителями являются карбонат натрия и кальция, фосфат натрия и кальция, и лактоза, а подходящими дезинтегрирующими агентами являются кукурузный крахмал и альгиновая кислота. Связывающими агентами могут быть крахмал и желатин, а замасливателем, если он присутствует, обычно может быть стеарат магния, стеариновая кислота или тальк. Таблетки, если это необходимо, могут быть покрыты таким веществом, как глицерилмоностеарат или глицерилдистеарат, для замедления абсорбции в желудочно-кишечном тракте. Используемой в настоящем описании "трансформированной клеткой" является клетка, в которую был введен вектор, из которого может экспрессироваться молекула дцРНК.II. Двухцепочечная рибонуклеиновая кислота (дцРНК). Как более подробно описано ниже, настоящее изобретение относится к двухцепочечным молекулам рибонуклеиновой кислоты (дцРНК), ингибирующим экспрессию гена Eg5 и/или VEGF в клетке или у млекопитающего, где указанная дцРНК содержит антисмысловую цепь, включающую область комплементарности, которая комплементарна по меньшей мере части мРНК, образующейся при экспрессии генаEg5 и/или VEGF, и где область комплементарности имеет длину менее чем 30 нуклеотидов, а обычно 1924 нуклеотида, и где указанная дцРНК, после ее контактирования с клеткой, экспрессирующей указанный ген Eg5 и/или VEGF, ингибирует экспрессию указанного гена Eg5 и/или VEGF. дцРНК может быть синтезирована стандартными методами, известными специалистам и подробно обсуждаемыми ниже, например, на автоматическом синтезаторе ДНК, таком как коммерчески доступный синтезатор, поставляемый, например, фирмой Biosearch, Applied Biosystems, Inc. дцРНК содержит две цепи, которые являются достаточно комплементарными для их гибридизации с образованием дуплексной структуры. Одна цепь дцРНК (антисмысловая цепь) содержит область комплементарности, которая по существу комплементарна, а в основном, полностью комплементарна последовательности-мишени и которая происходит от последовательности мРНК, образующейся в процессе экспрессии гена Eg5 и/или VEGF, a другая цепь (смысловая цепь) содержит область, комплементарную антисмысловой цепи, в результате чего эти две цепи, при их объединении в подходящих условиях, могут гибридизоваться друг с другом и образовывать дуплексную структуру. Вообще говоря, дуплексная структура имеет длину в 15-30, более предпочтительно 18-25, еще более предпочтительно 19-24, а наиболее предпочтительно 19-21 пар оснований. В других вариантах изобретения дуплексная структура имеет длину в 25-30 пар оснований. В одном из вариантов изобретения, дуплексная структура имеет длину в 19 пар оснований. В других вариантах изобретения, дуплексная структура имеет длину в 21 пару оснований. Если используется комбинация двух различных киРНК, то указанные дуплексные структуры могут иметь одинаковые или различные длины. Так, например, композиция может включать первую дцРНК, нацеленную на Eg5 и имеющую длину дуплексной структуры в 19 пар оснований, и вторую дцРНК, нацеленную на VEGF и имеющую длину дуплексной структуры в 21 пару оснований. Аналогичным образом, область комплементарности с последовательностью-мишенью составляет 15-30, более предпочтительно 18-25, еще более предпочтительно 19-24, а наиболее предпочтительно 1921 пар оснований. В других вариантах изобретения область комплементарности имеет длину в 25-30 пар оснований. В одном из вариантов изобретения, область комплементарности имеет длину в 19 нуклеотидов. В других вариантах изобретения, область комплементарности имеет длину в 21 нуклеотид. Если используется комбинация из двух различных киРНК, то указанные области комплементарности могут быть идентичными или различными. Так, например, композиция может включать первую дцРНК, нацеленную наEg5 и имеющую область комплементарности в 19 нуклеотидов, и вторую дцРНК, нацеленную на VEGF и имеющую область комплементарности в 21 нуклеотид. Каждая цепь дцРНК согласно изобретению обычно имеет длину в 15-30 или 18-25, или 18, 19, 20,21, 22, 23 или 24 нуклеотидов. В других вариантах изобретения, каждая цепь имеет длину в 25-30 пар оснований. Цепи дуплексной структуры могут иметь одинаковые или различные длины. Если используется комбинация двух различных киРНК, то длины каждой цепи каждой киРНК могут быть идентичными или различными. Так, например, композиция может включать первую дцРНК, нацеленную на Eg5 и имеющую смысловую цепь в 21 нуклеотид и антисмысловую цепь в 21 нуклеотид, и вторую дцРНК, нацеленную на VEGF и имеющую смысловую цепь в 21 нуклеотид и антисмысловую цепь в 23 нуклеотида. дцРНК согласно изобретению может включать одну или несколько одноцепочечных выступающих концов из одного или нескольких нуклеотидов. В одном из вариантов изобретения, по меньшей мере один конец дцРНК имеет выступающий одноцепочечный конец из 1-4, а обычно из 1 или 2 нуклеотидов. В другом варианте изобретения, антисмысловая цепь дцРНК имеет выступающие концы из 1-10 нуклеотидов, каждый из которых находится у 3'- или 5'-конца смысловой цепи. В других вариантах изобретения, смысловая цепь дцРНК имеет выступающие концы из 1-10 нуклеотидов, каждый из которых находится у 3'- или 5'-конца антисмысловой цепи. дцРНК, имеющие по меньшей мере один выступающий конец, неожиданно обнаруживают значительно более высокие ингибирующие свойства, чем их аналоги с затупленными концами. В некоторых вариантах изобретения лишь один выступающий нуклеотидный конец значительно усиливает интерферирующую активность дцРНК, не оказывая при этом какого-либо влияния на общую стабильность молекулы. дцРНК, имеющая лишь один выступающий конец, является особенно активной и эффективной invivo, а также в ряде клеток, в средах клеточных культур, в крови и в сыворотке. Обычно одноцепочечный конец находится у 3'-конца антисмысловой цепи или, альтернативно, у 3'-конца смысловой цепи. дцРНК может также иметь тупой конец, который обычно находится у 5'-конца антисмысловой цепи. Такие дцРНК могут обладать улучшенной стабильностью и ингибирующей активностью, что позволяет вводить их в низких дозах, то есть, в дозах менее чем 5 мг/кг массы тела реципиента в день. Обычно антисмысловая цепь дцРНК имеет нуклеотидный выступающий конец у 3'-конца и тупой конец у 5'-конца. В другом варианте изобретения один или несколько нуклеотидов в выступающем конце заменены нуклеозид-тиофосфатом. Как подробно описано в настоящей заявке, композиция согласно изобретению включает первую дцРНК, нацеленную на Eg5, и вторую дцРНК, нацеленную на VEGF. Первая и вторая дцРНК могут иметь выступающий конец с одной и той же архитектурой, либо архитектура выступающих концов этих дцРНК может отличаться. В одном из вариантов изобретения, первая дцРНК, нацеленная на Eg5, включает выступающий конец из 2 нуклеотидов у 3'-конца каждой цепи, а вторая дцРНК, нацеленная наVEGF, включает выступающий конец из 2 нуклеотидов у 3'-конца антисмысловой цепи и тупой конец у 5'-конца антисмысловой цепи (например, у 3'-конца смысловой цепи). В одном из вариантов изобретения геном Eg5, доставляемым дцРНК согласно изобретению, является человеческий ген Eg5. В одном из вариантов изобретения антисмысловая цепь дцРНК, нацеленная наEg5, содержит по меньшей мере 15 смежных нуклеотидов одной из антисмысловых последовательностей, представленных в табл. 1-3. В конкретных вариантах изобретения первая последовательность дцРНК имеет одну цепь, выбранную из смысловых цепей, представленных в табл. 1-3, а вторая последовательность выбрана из группы, состоящей из антисмысловых последовательностей, представленных в табл. 1-3. Альтернативные антисмысловые агенты, нацеленные на какую-либо последовательностьмишень, представленные в табл. 1-3, могут быть легко определены с использованием последовательности-мишени и фланкирующей последовательности Eg5. В некоторых вариантах изобретения дцРНК, нацеленная на Eg5, содержит по меньшей мере две нуклеотидных последовательности, выбранные из группы последовательностей, представленных в табл. 1-3. Одна из двух последовательностей комплементарна другой последовательности, причем одна из этих последовательностей, в основном, комплементарна последовательности мРНК, образующейся при экспрессии гена Eg5. Сама дцРНК содержит два олигонуклеотида, где один олигонуклеотид описан как смысловая цепь в табл. 1-3, а второй олигонуклеотид описан как антисмысловая цепь в табл. 1-3. В вариантах с использованием второй дцРНК, нацеленной на VEGF, такие агенты проиллюстрированы в примерах, в табл. 4 а и 4b, и в одновременно рассматриваемых заявках США с рег.11/078073 и 11/340080, которые вводятся в настоящее описание посредством ссылки. В одном из вариантов изобретения дцРН, нацеленная на VEGF, имеет антисмысловую цепь, комплементарную по меньшей мере 15 смежным нуклеотидам последовательностей-мишеней VEGF, описанных в табл. 4 а. В других вариантах изобретения дцРНК, нацеленная на VEGF, содержит одну из антисмысловых последовательностей, представленных в табл. 4b, или содержит один из дуплексов (смысловую и антисмысловую цепи), представленных в табл. 4b. Специалисту в данной области хорошо известно, что дцРНК, содержащие дуплексную структуру в 20-23 пар оснований, а конкретно в 21 пару оснований, считаются особенно эффективными в индуцировании интерференции РНК (Elbashir et al., EMBO 2001, 20:6877-6888). Однако другие дцРНК, имеющие более короткие или более длинные цепи, также являются эффективными. В вариантах, описанных выше,дцРНК согласно изобретению, благодаря природе их нуклеотидных последовательностей, описанных в табл. 1-3, могут содержать по меньшей мере одну цепь длиной минимум в 21 нуклеотид. Разумно предположить, что более короткие дцРНК, содержащие одну из последовательностей, представленных в табл. 1-3 минус лишь несколько нуклеотидов на одном или на обоих концах, могут быть такими же эффективными, как и дцРНК, описанные выше. Следовательно, дцРНК, содержащие неполную последовательность по меньшей мере из 15, 16, 17, 18, 19, 20 или более смежных нуклеотидов от одной из последовательностей, представленных в табл. 1-3, и отличающиеся по своей способности ингибировать экспрессию гена Eg5 в описанном в настоящем описании FACS-анализе, где указанная способность составляет не более чем 5, 10, 15, 20, 25 или 30% от способности полноразмерной дцРНК ингибировать указанную экспрессию, входят в объем настоящего изобретения. Другие дцРНК, которые расщепляются в последовательности-мишени, представленной в табл. 1-3, могут быть легко получены с использованием имеющейся последовательности Eg5 и последовательности-мишени. Дополнительная дцРНК, нацеленная наVEGF, может быть сконструирована аналогичным образом с использованием последовательностей, описанных в таблицах 4 а и 4b, а также в примерах и в одновременно рассматриваемых заявках США рег.: 11/078073 и 11/340080, которые вводятся в настоящее описание посредством ссылки. Кроме того, РНКи-агенты, представленные в табл. 1-3, позволяют идентифицировать сайт в мРНКEg5, который является восприимчивым к РНКи-расщеплению. Настоящее изобретение также включает РНКи-агенты, например, дцРНК, нацеленную на последовательность, доставляемую одним из агентов согласно изобретению. Считается, что используемый второй РНКи-агент нацелен на последовательность первого РНКи-агента, если второй РНКи-агент расщепляет транскрипт в любом месте в мРНК, комплементарной антисмысловой цепи первого РНКи-агента. Такой второй агент обычно состоит по меньшей мере из 15 смежных нуклеотидов, происходящих от одной из последовательностей, представленных в таблицах 1-3 и связанных с дополнительными нуклеотидными последовательностями, взятыми из области, смежной с выбранной последовательностью в гене Eg5. Так, например, последние 15 нуклеотидов вSEQ ID NO:1, объединенные с последующими 6 нуклеотидами от гена-мишени Eg5, образуют одноцепочечный агент из 21 нуклеотида, который состоит из одной из последовательностей, представленных в таблицах 1-3. Дополнительные РНКи-агенты, например, дцРНК, нацеленные на VEGF, могут быть сконструированы аналогичным образом с использованием последовательностей, описанных в таблицах 4 а и 4b, а также в примерах и в одновременно рассматриваемых заявках США рег. : 11/078073 и 11/340080, которые вводятся в настоящее описание посредством ссылки. дцРНК согласно изобретению может содержать одно или несколько несоответствий с последовательностью-мишенью. В предпочтительном варианте изобретения дцРНК согласно изобретению содержит не более 3 несоответствий. Если антисмысловая цепь дцРНК содержит несоответствия с последовательностью-мишенью, то предпочтительно, чтобы область несоответствий не находилась в центре области комплементарности. Если антисмысловая цепь дцРНК содержит несоответствия с последовательностью-мишенью, то предпочтительно, чтобы такое несоответствие ограничивалось 5 нуклеотидами у любого конца цепи, например, 5, 4, 3 или 2 нуклеотидами или 1 нуклеотидом у 5'- или 3'-конца области комплементарности. Так, например, для цепи дцРНК из 23 нуклеотидов, комплементарных области генаEg5, дцРНК обычно не содержит каких-либо несоответствий в центральной области из 13 нуклеотидов. Способы, описанные в настоящем изобретении, могут быть применены для того, чтобы определить, является ли дцРНК, содержащая несоответствия с последовательностью-мишенью, эффективной в ингибировании экспрессии гена Eg5. Очевидно, что эффективность дцРНК с несоответствиями с точки зрения ингибирования экспрессии гена Eg5 имеет очень важное значение, особенно, если известно, что область комплементарности гена Eg5 имеет полиморфную последовательность, которая варьируется в различных популяциях. Модификации В другом варианте изобретения дцРНК химически модифицируют так, чтобы она обладала повышенной стабильностью. Нуклеиновые кислоты согласно изобретению могут быть синтезированы и/или модифицированы методами, хорошо известными специалистам, такими как методы, описанные в публикации "Current protocols in nucleic acid chemistry", Beaucage, S.L. et al. (Edrs.), John WileySons, Inc.,New York, NY, USA, которая вводится в настоящее описание посредством ссылки. Конкретными примерами предпочтительных соединений дцРНК, используемых в настоящем изобретении, являются дцРНК,содержащие модифицированные остовы или не содержащие природных межнуклеозидных связей. Как определено в описании настоящей заявки, дцРНК, имеющими модифицированные остовы, являются дцРНК, которые сохраняют атом фосфора в своем остове, и дцРНК, которые не имеют атома фосфора в своем остове. В соответствии с описанием настоящей заявки и как иногда указывается в литературе, модифицированные дцРНК, которые не имеют атома фосфора в своем межнуклеозидном остове, могут также рассматриваться как олигонуклеозиды. Предпочтительными дцРНК с модифицированными остовами являются, например, фосфортиоаты,хиральные фосфортиоаты, фосфордитиоаты, фосфотриэфиры, аминоалкилфосфотриэфиры, метилфосфонаты и другие алкилфосфонаты, включая 3'-алкиленфосфонаты и хиральные фосфонаты, фосфинаты,фосфорамидаты, включая 3'-аминофосфорамидат и аминоалкилфосфорамидаты, тионофосфорамидаты,тионоалкилфосфонаты, тионоалкилфосфотриэфиры и боранофосфаты, имеющие нормальные 3'-5'-связи,2'-5'-связанные аналоги этих соединений, и соединения, имеющие противоположную полярность, где смежные пары нуклеозидных звеньев являются связанными в ориентации 3' - 5'5'-3' или 2'-5'5'-2'. К таким соединениям также относятся различные соли, смешанные соли и формы свободной кислоты. Репрезентативными патентами США, в которых описано получение вышеуказанных фосфорсодержащих связей, являются, но не ограничиваются ими, патенты США 3687808; 4469863; 4476301; 5023243; 5177195; 5188897; 5264423; 5276019; 5278302; 5286717; 5321131; 5399676; 5405939; 5453496; 5455233; 5466677; 5476925; 5519126; 5536821; 5541316; 5550111; 5563253; 5571799; 5587361 и 5625050, каждый из которых вводится в настоящее описание посредством ссылки. Предпочтительные дцРНК с модифицированными остовами, которые не включают атом фосфора,имеют остовы, образованные короткоцепочечными алкильными или циклоалкильными межнуклеозидными связями, смешанными гетероатомами и алкильными или циклоалкильными межнуклеозидными связями, или одной или несколькими короткоцепочечными гетероатомными или гетероциклическими межнуклеозидными связями. Такими остовами являются остовы, имеющие морфолино-связи (частично образованные сахарной частью нуклеозида); силоксановые остовы; сульфидные, сульфоксидные и сульфоновые остовы; формацетильные и тиоформацетильные остовы; метиленформацетильные и тиоформацетильные остовы; алкенсодержащие остовы; сульфаматные остовы; метиленимино- и метиленгидразино-остовы; сульфонатные и сульфонамидные остовы; амидные остовы и другие остовы, имеющие смешанные части компонетов N, О, S и СН 2. Репрезентативными патентами США, в которых описано получение вышеуказанных олигонуклеозидов, являются, но не ограничиваются ими, патенты США 5034506; 5166315; 5185444; 5214134; 5216141; 5235033; 564562; 5264564; 5405938; 5434257; 5466677; 5470967; 5489677; 5541307; 5561225; 5596086; 5602240; 5608046; 5610289; 5618704; 5623070; 5663312; 5633360; 5677437; и 5677439, каждый из которых вводится в настоящее описание посредством ссылки. В других предпочтительных дцРНК-миметиках сахарная и межнуклеозидная связи, то есть, остов,состоящий из нуклеотидных звеньев, заменены новыми группами. Основные звенья сохраняют для гибридизации с соответствующим соединением-мишенью нуклеиновой кислоты. Было показано, что одно такое олигомерное соединение, дцРНК-миметик, обладает превосходными гибридизующими свойствами и называется пептид-содержащей нуклеиновой кислотой (PNA). В соединениях PNA, сахарный остов дцРНК заменен амид-содержащим остовом, а в частности, аминоэтилглициновым остовом. Нуклеооснования сохраняются и прямо или опосредовано связываются с азаатомами азота амидной части остова. Репрезентативными патентами США, в которых описано получение соединений PNA, являются, но не ограничиваются ими, патенты США 5539082, 5714331 и 5719262, каждый из которых вводится в настоящее описание посредством ссылки. Дополнительное описание соединений PNA можно найти в публикации Nielsen et al., Science, 1991, 254, 1497-1500. Наиболее предпочтительными вариантами настоящего изобретения являются дцРНК с фосфортиоатными остовами и олигонуклеозиды с гетероатомными остовами, а в частности, -СН 2-NH-CH2-, -CH2-N(CH3) -N (СН 3) -СН 2- и -N (СН 3)-СН 2-СН 2- [где природный фосфодиэфирный остов представлен -O-Р-OСН 2-], описанные в вышеупомянутом патенте США 5489677, и амидные остовы, описанные в вышеупомянутом патенте США 5602240. Предпочтительными также являются дцРНК, имеющие структуры с морфолиновыми остовами, описанные в вышеупомянутом патенте США 5034506. Модифицированные дцРНК могут также содержать одну или несколько замещенных сахарных молекул. Предпочтительные дцРНК содержат одну из нижеследующих групп в 2'-положении: ОН; F; O-, Sили N-алкил; О-, S- или N-алкенил; O-, S- или N-алкинил; или О-алкил-О-алкил, где указанные алкил,алкенил и алкинил могут представлять собой замещенные или незамещенный C1-С 10-алкил или С 2-С 10 алкенил и -алкинил. Особенно предпочтительными являются O[(CH2)nO]mCH3, O(CH2)nOCH3,O(CH2)nNH2, O(CH2)nCH3, O(CH2)nONH2 и О (CH2)nON[(CH2)nCH3)]2 где n и m равны значению от 1 до примерно 10. Другие предпочтительные дцРНК включают одну из нижеследующих групп в 2'положении: низший C1-10 алкил, замещенный низший алкил, алкарил, аралкил, О-алкарил или O-аралкил,SH, SCH3, OCN, Cl, Br, CN, CF3, OCF3, SOCH3, SO2CH3, ONO2, NO2, N3, NH2, гетероциклоалкил, гетероциклоалкарил, аминоалкиламино, полиалкиламино, замещенный силил, РНК-расщепляющую группу,репортерную группу, интеркалятор, группу, улучшающую фармакокинетические свойства дцРНК, или группу, улучшающую фармакодинамические свойства дцРНК, и другие заместители, обладающие анало- 11019531 гичными свойствами. Предпочтительная модификация включает 2'-метоксиэтокси (2'-O-СН 2 СН 2 ОСН 3, также известный как 2'-О-(2-метоксиэтил) или 2'-МОЕ) (Martin et al. , Helv. Chim. Acta, 1995, 78, 486-504), то есть, алкоксиалкоксигруппу. Другая предпочтительная модификация включает 2'-диметиламинооксиэтокси, то есть группу О(СН 2)2ON(СН 3)2, также известную как 2'-DMAOE, описанную ниже в примерах и 2'диметиламиноэтоксиэтокси (также известную специалистам как 2'-О-диметиламиноэтоксиэтил или 2'DMAEOE), то есть, 2'-O-CH2-O-CH2-N (СН 2)2, также описанную в нижеследующих примерах. Другие предпочтительные модификации включают 2'-метокси (2'-ОСН 3), 2'-аминопропокси (2'OCH2CH2CH2NH2) и 2'-фтор (2'-F). Аналогичные модификации могут быть также введены в другие положения на дцРНК, а в частности в 3'-положение сахара на 3'-концевом нуклеотиде или в 2'-5'-связанных дцРНК и в 5'-положении 5'-концевого нуклеотида. дцРНК могут также иметь вместо пентофуранозильного сахара сахарные миметики, такие как циклобутильные группы. Репрезентативными патентами США, в которых описано получение таких модифицированных сахарных структур, являются но не ограничиваются ими, патенты США 4981957; 5118800; 5319080; 5359044; 5393878; 5446137; 5466786; 5514785; 5519134; 5567811; 5576427; 5591722; 5597909; 5610300; 5627053; 5639873; 5646265; 5658873; 5670633; и 5700920, некоторые из которых находятся в совместной собственности авторов настоящего изобретения, и каждый из них во всей своей полноте вводится в настоящее описание посредством ссылки. дцРНК может также включать модификации или замены нуклеооснований (часто называемые специалистами просто "основанием"). Используемые в настоящем описании термины "немодифицированные" или "природные" нуклеооснования включают пуриновые основания, такие как аденин (А) и гуанин(G) , и пиримидиновые основания, такие как тимин (Т), цитозин (С) и урацил (U). Модифицированными нукоеоснованиями являются другие синтетические и природные нуклеооснования, такие как 5-метилцитозин (5-me-C), 5-гидроксиметилцитозин, ксантин, гипоксантин, 2-аминоаденин, б-метильные и другие алкильные производные аденина и гуанина, 2-пропильные и другие алкильные производные аденина и гуанина, 2-тиоурацил, 2-тиотимин и 2-тиоцитозин, 5-галогенурацил и цитозин, 5-пропинилурацил и цитозин, б-азоурацил, цитозин и тимин, 5-урацил(псевдоурацил), 4-тиоурацил, 8-галоген-, 8-амино-, 8 тиол-, 8-тиоалкил-, 8-гидолксил- и другие 8-замещенные аденины и гуанины, 5-галоген-, а в частности, 5 бром-, 5-трифторметил- и другие 5-замещенные урацилы и цитозины, 7-метилгуанин и 7-метиладенин, 8 азагуанин и 8-азааденин, 7-деазагуанин и 7-деазааденин и 3-деазагуанин и 3-деазааденин. Другими нуклеооснованиями являются нуклеооснования, описанные в патенте США 3687808, нуклеооснования,описанные в публикации The Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering, pages 858-859,Kroschwitz, J. L, ed. John WileySons, 1990, нуклеооснования, описанные в публикации Englisch et al.,Angewandte Chemie, International Edition, 1991, 30, 613, и нуклеооснования, описанные в публикацииSanghvi, Y S., Chapter 15, DsRNA Research and Applications, pages 289-302, Crooke, S. T. and Lebleu, В.,Ed., CRC Press, 1993. Некоторые из этих нуклеооснований являются особенно подходящими с точки зрения повышения аффинности связывания олигомерных соединений согласно изобретению. Такими нуклеооснованиями являются 5-замещенные пиримидины, 6-азапиримидины и N-2-, N-6- и 0-6-замещенные пурины, включая 2-аминопропиладенин, 5-припинилурацил и 5-пропинилцитозин. Было показано, что замены 5-метилцитозина способствуют повышению стабильности дуплекса нуклеиновой кислоты при 0,6-1,2 С. (Sanghvi, Y. S., Crooke, S. Т. and Lebleu, В., Eds., DsRNA Research and Applications, CRC Press,Boca Raton, 1993, pp. 276-278), и в настоящее время являются предпочтительными заменами оснований, а более конкретно, в комбинации с 2'-О-метоксиэтильными сахарными модификациями. Репрезентативными патентами США, в которых описано получение некоторых вышеуказанных модифицированных нуклеооснований, а также других модифицированных нуклеооснований, являются, но не ограничиваются ими, вышеупомянутый патент США 3687808, а также патенты США 4845205; 513030; 5134066; 5175273; 5367066; 5432272; 5457187; 5459255; 5484908; 5502177; 5525711; 5552540; 5587469; 5594121; 5596091; 5614617 и 5681941, каждый из которых вводится в настоящее описание посредством ссылки, и патент США 5750692, который также вводится в настоящее описание посредством ссылки. Конъюгаты Другая модификация дцРНК согласно изобретению включает химическое связывание дцРНК с одной или несколькими молекулами или конъюгатами, усиливающими активность дцРНК, ее распределение в клетке или ее поглощение клеткой. Такими молекулами являются, но не ограничиваются ими, липидные молекулы, такие как молекула холестерина (Letsinger et al., Proc. Natl. Acid. Sci. USA, 199, 86,6553-6556), холевая кислота (Manoharan et al., Biorg. Med. Chem. Let, 1994 4 1053-1060), тиоэфир, например, берил-S-тритилтиол (Manoharan et al., Ann. N.Y. Acad. Sci., 1992, 660, 306- 309; Manoharan et al., Biorg. Med. Chem. Let, 1993, 3, 2765-2770), тиохолестерин (Oberhauser et al., Nucl. Acids Res., 1992, 20, 533538), алифатическая цепь, например, додекандиоловые или ундецильные остатки (Saison-Behmoaras et al.,EMBO J, 1991, 10, 1111-1118; Kabanov et al., FEBS Lett., 1990, 259, 327-330; Svinarchuk et al., Biochimie,1993, 75, 49-54), фосфолипид, например, 1,2-ди-О-гексадецил-рац.-глицеро-3-Н-фосфонат ди-гексадецилрац.-глицерина или триэтиламмония (Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36, 3651-3654; Shea et al.,- 12019531Nucl. Acids Res., 1990, 18, 3777-3783), полиаминовая или полиэтиленгликолевая цепь (Manoharan et al.,NucleosidesNucleotides, 1995, 14, 969-973) или адамантануксусная кислота (Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36, 3651-3654), пальмитильная группа (Mishra et al. , Biochim. Biophys. Acta, 1995, 1264,229-237) или молекула октадециламина или гексиламинокарбонилоксихолестерина (Crooke et al., J.Pharmacol. Exp. Ther., 1996, 277, 923-937). Репрезентативными патентами США, в которых описано получение таких конъюгатов дцРНК, являются, но не ограничиваются ими, патенты США 4828979; 4948882; 5218105; 5525465; 5541313; 5545730; 5552538; 5578717, 5580731; 5591584; 5109124; 5118802; 5138045; 5414077; 5486603; 5512439; 5578718; 5608046; 4587044; 4605735; 4667025; 4762779; 4789737; 4824941; 4835263; 4876335; 4904582; 4958013; 5082830; 5112963; 5214136; 5082830; 5112963; 5214136; 5245022; 5254469; 5258506; 5262536; 5272250; 5292873; 5317098; 5371241, 5391723; 5416203, 5451463; 5510475; 5512667; 5514785; 5565552; 5567810; 5574142; 5585481; 5587371; 5595726; 5597696; 5599923; 5599928 и 5688941, каждый из которых вводится в настоящее описание посредством ссылки. Данное соединение необязательно должно быть одинаково модифицировано во всех положениях, и фактически, в одно соединение или даже в один нуклеозид в дцРНК может быть введена более чем одна из вышеупомянутых модификаций. Настоящее изобретение также включает соединения дцРНК, которые представляют собой химерные соединения. В контексте настоящего изобретения, "химерными" соединениями дцРНК или "химерами" являются соединения дцРНК, а в частности, дцРНК, содержащие две или более химически отличающихся областей, каждая из которых состоит по меньшей мере из одного мономерного звена, то есть, нуклеотида, в случае соединения дцРНК. Эти дцРНК обычно содержат по меньшей мере одну область, где дцРНК модифицирована таким образом, что она обладает повышенной резистентностью к расщеплению нуклеазой, повышенным поглощением клеткой и/или повышенной аффинностью связывания с нуклеиновой кислотой-мишенью. Дополнительная область дцРНК может служить в качестве субстрата для ферментов, способных расщеплять гибриды РНК:ДНК или РНК:РНК. Так, например, РНКазой Н является клеточная эндонуклеаза, которая расщепляет цепь РНК дуплекса РНК:ДНК. Поэтому активация РНКазы Н приводит к расщеплению РНК-мишени и тем самым к значительному повышению эффективности ингибирования экспрессии гена посредством дцРНК. В соответствии с этим,сравнимые результаты часто могут быть получены с использованием более коротких дцРНК, если используются химерные дцРНК, по сравнению с фосфортиоатдезокси- дцРНК, гибридизующимися с той же самой областью-мишенью. Расщепление РНК-мишени может быть детектировано рутинным методом проведения гель-электрофореза, а если это необходимо, то методами гибридизации нуклеиновых кислот,известными специалистами. В некоторых случаях, дцРНК может быть модифицирована нелигандной группой. Различные нелигандные молекулы были конъюгированы с дцРНК в целях повышения ее активности, уровня распределения в клетках или поглощения клеткой, и процедуры осуществления таких реакций конъюгирования описаны в научной литературе. Такими нелигандными молекулами являются липидные группы, такие как холестерин (Letsinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1989, 86:6553), холевая кислота (Manoharan et(Oberhauser et al., Nucl. Acids Res., 1992, 20:533), алифатическая цепь, например, додекандиоловые или ундецильные остатки (Saison-Behmoaras et al., EMBO J, 1991, 10:111; Kabanov et al., FEBS Lett., 1990,259:327; Svinarchuk et al., Biochimie, 1993, 75:49), фосфолипид, например, 1,2-ди-О-гексадецил-рац.глицеро-3-Н-фосфонат ди-гексадецил-рац.-глицерина или триэтиламмония (Manoharan et al., TetrahedronLett., 1995, 36:3651; Shea et al., Nucl. Acids Res., 1990, 18:3777), полиаминовая или полиэтиленгликолевая цепь (Manoharan et al. , NucleosidesNucleotides, 1995, 14:969) или адамантануксусная кислота (Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36:3651), пальмитильная группа (Mishra et al., Biochim. Biophys. Acta,1995, 1264:229) или молекула октадециламина или гексиламинокарбонилоксихолестерина (Crooke et al.,J. Pharmacol. Exp. Ther., 1996, 277:923). Репрезентативные патенты США, в которых описано получение таких конъюгатов дцРНК, перечислены выше. Типичные протоколы конъюгирования включают синтез дцРНК, несущих аминолинкер в одном или нескольких положениях последовательности. Затем аминогруппу подвергают реакции с молекулой, конъюгированной с использованием соответствующих связывающих или активирующих реагентов. Реакция конъюгирования может быть осуществлена либо с дцРНК, еще связанной с твердым носителем, либо после отщепления дцРНК в жидкой фазе. Очистку дцРНК-конъюгата обычно осуществляют с помощью ВЭЖХ, в результате чего получают чистый конъюгат. В некоторых случаях лиганд может быть мультифункциональным и/или дцРНК может быть конъюгирована с более чем одним лигандом. Так, например, дцРНК может быть конъюгирована с одним лигандом в целях улучшения поглощения и со вторым лигандом в целях улучшения высвобождения. РНКи-агенты, кодируемые вектором В другом аспекте изобретения Eg5- и VEGF-специфичные молекулы дцРНК, экспрессируемые из транскрипционных единиц, встраивают в ДНК- или РНК-векторы (см., например, Couture, A, et al., TIG.(1996), 12:5-10; Skillern, A., et al., Международная публикация заявки РСТWO 00/22113, Conrad, Ме- 13019531 ждународная публикация заявки РСТWO 00/22114, и Conrad, патент США 6054299). Эти трансгены могут быть введены в виде линейной конструкции, кольцевой плазмиды или вирусного вектора, которые могут быть включены и унаследованы в виде трансгена, интегрированного в геном хозяина. Этот трансген может быть также сконструирован так, чтобы он наследовался как внехромосомная плазмида(Gassmann, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1995) 92:1292). Отдельные цепи дцРНК могут транскрибироваться промоторами на двух отдельных экспрессионных векторах и могут котрансфецироваться в клетку-мишень. Альтернативно, каждая отдельная цепь дцРНК может транскрибироваться промоторами, которые расположены на одной и той же экспрессионной плазмиде. В предпочтительном варианте изобретения дцРНК экспрессируется как инвертированный повтор, присоединенный посредством линкерной полинуклеотидной последовательности таким образом,что дцРНК имеет структуру в виде стебля и петли. Векторами, экспрессирующими рекомбинантную дцРНК, обычно являются плазмидные ДНК или вирусные векторы. Вирусные векторы, экспрессирующие дцРНК, могут быть сконструированы на основе вирусов, которыми являются, но не ограничиваются ими, аденоассоциированный вирус (см., например,Muzyczka, et al., Curr. Topics Micro. Immunol. (1992) 158:97-129); аденовирус (см., например, Berkner, etal., BioTechniques (1998) 6:616), Rosenfeld et al (1991, Science 252:431-434), и Rosenfeld et al. (1992), Cell 68: 143-155; или альфавирус, а также другие вирусы, известные специалистам. Для введения различных генов в клетки многих различных типов, включая эпителиальные клетки, in vitro и/или in vivo, были использованы ретровирусы (см., например, Eglitis, et al., Science (1985) 230: 1395-1398; Danos and Mulligan,Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1998) 85:6460-6464; Wilson et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:30143018; Armentano et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:61416145; Huber et al., 1991, Proc. Natl. Acad.Sci. USA 88:8039-8043; Ferry et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:8377-8381; Chowdhury et al., 1991,Science 254: 1802-1805; van Beusechem. et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:7640-19; Kay et al., 1992,Human Gene Therapy 3:641-647; Dai et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10892-10895; Hwu et al.,1993, J. Immunol. 150:4104-4115; патент США 4868116; патент США 4980286; заявку РСТ WO 89/07136; заявку РСТ WO 89/02468; заявку РСТ WO 89/05345; и заявку РСТ WO 92/07573) . Рекомбинантные ретровирусные векторы, способные к трансдукции и экспрессии генов, встроенных в геном клетки, могут быть продуцированы путем трансфекции рекомбинантного ретровирусного генома в подходящие упаковывающие клеточные линии, такие как РА 317 и Psi-CRIP (Comette et al., 1991, HumanGene Therapy 2:5-10; Cone et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6349). Рекомбинантные аденовирусные векторы могут быть использованы для инфицирования клеток и тканей широкого ряда у восприимчивых хозяев (например, у крыс, хомячков, собак и шимпанзе) (Hsu et al., 1992, J. Infectious Disease,166:769), и также имеют то преимущество, что для инфицирования этими вирусами не требуется митотически активных клеток. Для экспрессии молекул(ы) дцРНК могут быть использованы любые вирусные векторы, в которые могут быть встроены кодирующие последовательности указанной молекулы и которые происходят, например, от аденовируса (AV); аденоассоциированного вируса (AAV); ретровирусов (например, лентивирусов (LV), рабдовирусов, вируса мышиного лейкоза); герпесвируса и т.п. Тропизм вирусных векторов может быть модифицирован псевдотипированием векторов с оболочечными белками или с другими поверхностными антигенами, происходящими от других вирусов, или путем замены различных вирусных капсидных белков, если это необходимо. Так, например, лентивирусные векторы согласно изобретению могут быть псевдотипированы поверхностными белками, происходящими от вируса везикулярного стоматита (VSV), вируса бешенства,вируса Эбола, вируса Мокола и т.п. AAV-векторы согласно изобретению могут быть получены для нацеливания на различные клетки путем конструирования векторов, экспрессирующих различные серотипы капсидных белков. Так, например, AAV-вектор, экспрессирующий капсид серотипа 2 на геноме серотипа 2, был обозначен AAV 2/2. Этот капсидный ген серотипа 2 в векторе AAV 2/2 может быть заменен капсидным геном серотипа 5 с получением вектора AAV 2/5. Методы конструирования AAV-векторов, экспрессирующих капсидные белки различных серотипов, известны специалистам в данной области, см.,например, публикацию Rabinowitz J E et al. (2002), J. Virol. 76:791-801, которая во всей своей полноте вводится в настоящее описание посредством ссылки. Выбор рекомбинантных вирусных векторов, подходящих для использования в настоящем изобретении, методы встраивания последовательностей нуклеиновой кислоты для экспрессии дцРНК в векторе и методы доставки вирусного вектора в представляющие интерес клетки известны специалистам в данной области. См., например, публикации Dornburg R (1995), Gene Therap. 2: 301-310; Eglitis M. A. (1988),Biotechniques 6: 608-614; Miller A. D. (1990), Hum Gene Therap. 1: 5-14; Anderson W. F. (1998), Nature 392: 25-30; и Rubinson D. A. et al., Nat. Genet. 33: 401-406, которые во всей своей полноте вводятся в настоящее описание посредством ссылки. Предпочтительными вирусными векторами являются векторы, происходящие от AV и AAV. В особенно предпочтительном варианте изобретения, дцРНК согласно изобретению экспрессируется в виде двух отдельных комплементарных одноцепочечных молекул РНК из рекомбинантного AAV-вектора,имеющего, например, промоторы РНК U6 или HI, или промотор цитомегаловируса (CMV). Подходящий AV-вектор, экспрессирующий дцРНК согласно изобретению, метод конструирования рекомбинантного AV-вектора и метод доставки этого вектора в клетки-мишени описаны в публикацииAAV-векторы, подходящие для экспрессии дцРНК, методы конструирования рекомбинантного AVвектора и методы доставки этих векторов в клетки-мишени описаны в публикациях Samulski R et al.(1987), J. Virol. 61: 3096-3101; Fisher K J et al. (1996), J. Virol, 70: 520-532; Samulski R et al. (1989), J. Virol. 63: 3822-3826; в патенте США 5252479; в патенте США 5139941; в Международной патентной заявкеWO 94/13788; и в международной патентной заявкеWO 93/24641, которые во всей своей полноте вводятся в настоящее описание посредством ссылки. Промотором, запускающим экспрессию дцРНК в ДНК-плазмиде или в вирусном векторе согласно изобретению, может быть промотор эукариотической РНК-полимеразы I (например, промотор рибосомной РНК) , промотор РНК-полимеразы II (например, ранний промотор CMV или промотор актина или промотор мяРНК U1) или, обычно, промотор РНК-полимеразы III (например, промотор мяРНК U6 или РНК 7SK), или прокариотический промотор, например, промотор Т 7, при условии, что экспрессионная плазмида также кодирует РНК-полимеразу Т 7, необходимую для ее транскрипции из промотора Т 7. Промотор может также направлять экспрессию трансгена в поджелудочную железу (см., например, регуляторную последовательность инсулина для поджелудочной железы (Bucchini et al., 1986, Proc. Natl.Acad. Sci. USA 83:2511-2515. Кроме того, экспрессия трансгена может точно регулироваться, например, с использованием индуцибельной регуляторной последовательности и экспрессионных систем, таких как регуляторная последовательность, которая является восприимчивой к некоторым физиологическим регуляторам, например,к регуляторам уровней глюкозы в кровотоке, или к гормонам (Docherty et al., 1994, FASEB J. 8:20-24). Такими индуцибельными экспрессионными системами, подходящими для регуляции экспрессии трансгена в клетках или у млекопитающих, являются системы регуляции экдизоном, эстрогеном, прогестероном, тетрациклином, химическими индукторами димеризации и изопропил-бета-D1-тиогалактопиранозидом (EPTG). Специалист в данной области может самостоятельно выбрать соответствующую регуляторную/промоторную последовательность в зависимости от предполагаемой цели применения дцРНКтрансгена. Вообще говоря, рекомбинантные векторы, способные экспрессировать молекулы дцРНК, могут быть доставлены, как описано ниже, и сохраняются в клетках-мишениях. Альтернативно, могут быть использованы вирусные векторы, обеспечивающие временную экспрессию молекул дцРНК. Такие векторы, если это необходимо, могут быть введены повторно. После экспрессии, дцРНК связываются с РНК-мишенью и модулируют ее функцию или экспрессию. Доставка дцРНК-экспрессирующих векторов может быть системной, например, она может быть осуществлена путем внутривенного или внутримышечного введения, путем введения в клетки-мишени, взятые у пациента с последующим их повторным введением пациенту, или любыми другими средствами, подходящими для введения в нужную клеткумишень. ДНК-плазмиды, экспрессирующие дцРНК, обычно трансфецируют в клетки-мишени в виде комплекса с катионными липидными носителями (например, с олигофектамином) или с некатионными липидными носителями (например, с Transit-TKO). Множественные липидные трансфекции, осуществляемые для дцРНК-опосредуемого разрушения различных областей-мишеней одного гена EG5 (или генаVEGF) или множества генов Eg5 (или генов VEGF) в течение периода времени в одну неделю или более,также входят в объем настоящего изобретения. Мониторинг успешного введения векторов согласно изобретению в клетки-хозяева может быть проведен различными известными методами. Так, например,временная трансфекция может быть обнаружена с помощью репортера, такого как флуоресцентный маркер, например, белок, флуоресцирующий в зеленом диапазоне спектра (GFP). Стабильная трансфекция клеток ex vivo может обеспечиваться с использованием маркеров, сообщающих трансфецированным клеткам резистентность к конкретным факторам окружающей среды (например, к антибиотикам и лекарственным средствам), например, резистентность к гигромицину В.Eg5-специфичные молекулы дцРНК и VEGF-специфичные молекулы дцРНК могут быть также встроены в векторы и использованы в качестве векторов для генотерапии человека. Векторы для генотерапии могут быть доставлены индивидууму, например, путем внутривенной инъекции, местного введения (см. патент США 5328470) или стереотактической инъекции (см., например, Chen et al. (1994) Proc.Natl. Acad. Sci. USA 91:3054-3057). Фармацевтический препарат на основе вектора для генотерапии может включать вектор для генотерапии в подходящем разбавителе, либо он может включать матрицу пролонгированного высвобождения, в которую загружают носитель для доставки гена. Альтернативно, если вектор для доставки полноразмерного гена может быть продуцирован в интактном виде из рекомбинантных клеток, например ретровирусные векторы, то такой фармацевтический препарат может включать одну или несколько клеток, продуцирующих систему доставки генов. Фармацевтические композиции, содержащие дцРНК В одном из своих вариантов настоящее изобретение относится к фармацевтическим композициям,содержащим дцРНК, описанную в настоящей заявке, и фармацевтически приемлемый носитель, а также к способам введения указанных композиций. Фармацевтическая композиция, содержащая дцРНК, может быть использована для лечения заболевания или расстройства, связанного с экспрессией или активностью гена Eg5/KSP и/или VEGF, например, патологических состояний, опосредуемых экспрессией Eg5/KSP и/или VEGF, например, рака печени. Состав таких фармацевтических композиций зависит от способа доставки. Дозы Фармацевтические композиции согласно изобретению вводят в дозах, достаточных для ингибирования экспрессии генов EG5/KSP и/или VEGF. В общих чертах, подходящая доза дцРНК может составлять в пределах от 0,01 до 200,0 мг на килограмм массы тела реципиента в день, а обычно в пределах от 1 до 50 мг на килограмм массы тела в день. Так, например, дцРНК может быть введена в количестве 0,01,0,05, 0,5, 1, 1,5, 2, 3, 5,0, 10, 20, 30, 40 или 50 мг/кг на одну дозу. Фармацевтическая композиция может быть введена один раз в день, либо дцРНК может быть введена в виде двух, трех или более субдоз через соответствующие периоды времени в течение одного дня. Действие одной дозы на уровни EG5/KSP и/или VEGF является продолжительным, то есть, таким, чтобы последующие дозы были введены с интервалами не более чем 7 дней или не более чем 1, 2, 3 или 4 недели. В некоторых вариантах изобретения дцРНК вводят путем непрерывного вливания или доставки с помощью препарата пролонгированного высвобождения. В этом случае для получения общей ежедневной дозы дцРНК, содержащаяся в каждой субдозе, должна быть соответственно меньше. Унифицированная лекарственная форма может быть также приготовлена для доставки в течение нескольких дней, например, с использованием стандартного препарата пролонгированного высвобождения, который обеспечивает пролонгированное высвобождение дцРНК в течение нескольких дней. Препараты пролонгированного высвобождения хорошо известны специалистам и являются особенно подходящими для доставки агентов в конкретный участок, например, они могут быть использованы в комбинации с агентами согласно изобретению. В этом варианте изобретения унифицированная лекарственная форма содержит соответствующее множество суточных доз. Специалисту в данной области известно, что доза и время, необходимые для эффективного лечения индивидуума, могут зависеть от некоторых факторов, включая, но не ограничиваясь ими, тяжесть заболевания или расстройства, ранее проводимое лечение, общее состояние здоровья и/или возраст индивидуума и наличие других заболеваний. Кроме того, лечение индивидуума терапевтически эффективным количеством композиции может включать один курс лечениея или серию курсов лечения. Оценка эффективных лекарственных форм и времени полужизни in vivo для отдельных дцРНК, входящих в объем настоящего изобретения, может быть осуществлена стандартными методами или на основе in vivo тестирования с использованием соответствующего животного-модели, как описано в настоящей заявке. Успехи в области генетики мышей заключаются в создании ряда мышей-моделей для исследования различных заболеваний человека, таких как патологические состояния, опосредуемые экспрессиейEG5/KSP и/или VEGF. Такие модели используют для in vivo тестирования дцРНК, а также для определения терапевтически эффективной дозы. Подходящей мышиной моделью является, например, мышь, содержащая плазмиду, экспрессирующую человеческий EG5/KSP и/или VEGF. Другой подходящей мышиной моделью является трансгенная мышь, несущая трансген, экспрессирующий человеческийEG5/KSP и/или VEGF. Токсичность и терапевтическая эффективность таких соединений может быть определена стандартными фармацевтическими методами в клеточных культурах или у экспериментальных животных, например, для вычисления LD50 (дозы, которая является летальной для 50% пациентов) и ED50 (дозы, которая является терапевтически эффективной у 50% пациентов). Дозозависимое отношение между токсическим и терапевтическим эффектами называется терапевтический индексом, и этот индекс может быть выражен как отношение LD50/ED50. Предпочтительными являются соединения, имеющие высокий терапевтический индекс. Данные, полученные в анализах клеточных культур и в исследованиях на животных, могут быть использованы в целях приготовления различных лекарственных форм для введения человеку. Дозы композиций согласно изобретению получают, в основном, в пределах циркулирующих концентраций, которые включают концентрации ED50, продуцирующие минимальную токсичность или вообще не продуцирующие токсичности. Доза может варьироваться в указанном интервале и зависит от используемой лекарственной формы и используемого способа введения. Для любого соединения, используемого в способах согласно изобретению, терапевтически эффективная доза может быть вычислена с помощью анализов клеточной культуры. Доза может быть приготовлена для животного-модели так, чтобы она обеспечивала достижение соответствующего интервала концентраций данного соединения или, если это необходимо, полипептидного продукта последовательности-мишени (например, достижение пониженных концентраций полипептида), где указанный интервал включает IC50 (то есть, концентрацию тестируемого соединения, которая обеспечивает полумаксимальное ингибирование симптомов заболевания), определенную в клеточной культуре. Такая информация может быть использована для более точного определения подходящих доз для человека. Уровни в плазме могут быть определены, например, с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии. Помимо введения дцРНК, обсуждаемого выше, дцРНК согласно изобретению может быть введена в комбинации с другими известными агентами, которые являются эффективными для лечения патологических состояний, опосредуемых экспрессией гена-мишени. В любом случае лечащий врач может самостоятельно скорректировать количество и время введения дцРНК исходя из результатов, полученных стандартными способами определения эффективности, известными специалистам или описанными в настоящей заявке. Введение Фармацевтические композиции согласно изобретению могут быть введены различными способами в зависимости от того, является ли желательным местное или системное введение, и от обрабатываемого участка. Ввведение может местным; внутрилегочным, например, путем ингаляции или инсуффляции порошков или аэрозолей, включая ингаляцию с помощью аэрозольного ингалятора; интратрахеальным; интраназальным; эпидермальным; трансдермальным, субдермальным, а также пероральным или парентеральным, например, подкожным. Обычно при лечении млекопитающего с гиперлипидемией, молекулы дцРНК вводят системно, а именно, парентерально. Парентеральное введение включает внутривенную, внутриартериальную, подкожную, внутрибрюшинную или внутримышечную инъекцию или инфузию; или интракраниальное введение, например, интрапаренхимальное, интратекальное или интравентрикулярное введение. Так, например, дцРНК, конъюгированные или неконъюгированные, или приготовленные в присутствии или в отсутствие липосом, могут быть введены пациенту внутривенно. Так, например, молекула дцРНК может быть введена в виде композиий, таких как стерильные и нестерильные водные растворы, безводные растворы в стандартных растворителях, таких как спирты, или растворы в жидких или твердых масляных основах. Такие растворы могут также содержать буферы, разбавители и другие подходящие добавки. Для парентерального, интратекального или интравентрикулярного введения, молекулы дцРНК могут быть включены в композиции, такие как стерильные водные растворы, которые также могут содержать буферы, разбавители и другие подходящие добавки (например, усилители пенетрации, соединения-носители и другие фармацевтически приемлемые носители). Такие композиции подробно описаны в настоящей заявке. дцРНК может быть доставлена для нацеливания на конкретную ткань, такую как печень (например,гепатоциты печени). Композиции Фармацевтические композиции согласно изобретению, которые обычно присутствуют в виде унифицированной лекарственной формы, могут быть получены стандартными методами, хорошо известными специалистам в области фармацевтической промышленности. Такие методы включают стадию смешивания активных ингредиентов с фармацевтическим(ими) носителем(ями) или наполнителем(ями). В общих чертах, композиции получают путем однородного и тщательного смешивания активных ингредиентов с жидкими носителями или тонкодисперсными твердыми носителями или с теми и другими носителями, с последующим формованием продукта, если это необходимо. Композиции согласно изобретению могут быть приготовлены в виде любых из множества возможных лекарственных форм, таких как, но не ограничивающихся ими, таблетки, капсулы, гелевые капсулы,жидкие сиропы, мягкие гели, суппозитории и клизмы. Композиции согласно изобретению могут быть также приготовлены в виде суспензий в водных, безводных или смешанных средах. Водные суспензии могут также содержать вещества, повышающие вязкость суспензии, включая, например, натрийсодержащую карбоксиметилцеллюлозу, сорбит и/или декстран. Суспензия может также содержать стабилизаторы. Фармацевтическими композициями согласно изобретению являются, но не ограничиваются ими,растворы, эмульсии и препараты, содержащие липисомы. Такие композиции могут быть составлены из ряда компонентов, которыми являются, но не ограничиваются ими, преформованные жидкости, самоэмульгирующиеся твердые вещества и самоэмульгирующиеся полутвердые вещества. Один из аспектов изобретения включает композиции, которые доставляются в печень для лечения заболеваний печени,таких как гиперлипидемия. Кроме того, дцРНК, нацеленная на ген EG5/KSP и/или VEGF, может быть включена в композиции,содержащие дцРНК, которая была смешана, инкапсулирована, конъюгирована или как-либо иначе ассоциирована с другими молекулами, молекулярными структурами или смесями нуклеиновых кислот. Так,например, композиция, содержащая один или несколько дцРНК-агентов, нацеленных на ген Eg5/KSP и/или VEGF, может содержать другие терапевтические средства, например другие противораковые терапевтические средства или одно или несколько соединений дцРНК, нацеленных на гены, не являющиеся генами EG5/KSP и/или VEGF. Композиции для перорального, парентерального и местного введения и биологические композиции Композициями и препаратами для перорального введения являются порошки или гранулы, микрочастицы, наночастицы, суспензии или растворы в водной или безводной среде, капсулы, гелевые капсулы, саше, таблетки или минитаблетки. При желании могут быть использованы загустители, ароматизаторы, разбавители, эмульгаторы, стимуляторы диспергирования или связующие агенты. В некоторых вариантах изобретения композициями для перорального введения являются композиции, в которых дцРНК согласно изобретению вводят в комбинации с одним или несколькими усилителями пенетрации, поверхностно-активными веществами и хелатообразующими агентами. Подходящими поверхностно-активными веществами являются жирные кислоты и/или их сложные эфиры или соли, а также желчные кислоты и/или их соли. Подходящими желчными кислотами/солями желчных кислот являются хенодезоксихолевая кислота (CDCA) и урсодезоксихенодезоксихолевая кислота (UDCA), холевая кислота, дегидрохолевая кислота, дезоксихолевая кислота, глюхолевая кислота, глихолевая кислота, гликодезоксихолевая кислота, таурохолевая кислота, тауродезоксихолевая кислота, тауро-24,25-дигидрофузидат натрия и гликодигидрофузидат натрия. Подходящими жирными кислотами являются арахидоновая кислота, ундекановая кислота, олеиновая кислота, лауриновая кислота, каприловая кислота, каприновая кислота, миристиновая кислота, пальмитиновая кислота, стеариновая кислота, линолевая кислота, линоленовая кислота,дикапрат, трикапрат, моноолеин, дилаурин, глицерил-1-монокапрат, 1-додецилазациклогептан-2-он,ацилкарнитин, ацилхолин или моноглицерид, диглицерид или их фармацевтически приемлемая соль (например, натриевая соль). В некоторых вариантах изобретения используются комбинации усилителей пенетрации, например, жирных кислот/солей в комбинации с желчными кислотами/солями. Одной из репрезентативных комбинаций является натриевая соль лауриновой кислоты, каприновой кислоты иUDCA. Другими усилителями пенетрации являются полиоксиэтилен-9-лауриловый эфир, полиоксиэтилен-20-цетиловый эфир. дцРНК согласно изобретению могут быть доставлены перорально, в гранулированной форме, включая распыленные осушенные частицы, или комплексы, образующие микро- или наночастицы. Агентами, образующими комплексы с дцРНК, являются полиаминокислоты; полиимины; полиакрилаты; полиалкилакрилаты, полиоксетаны, пролиалкилцианоакрилаты; катионные желатины,альбумины, крахмалы, акрилаты, полиэтиленгликоли (ПЭГ) и крахмалы; полиалкилцианоакрилаты; DEAE-дериватизированные полимины, поллуланы, целлюлозы и крахмалы. Подходящими агентами, образующими комплексы, являются хитозан, N-триметилхитозан, поли-L-лизин, полигистидин, полиорнитин,полиспермины, протамин, поливинилпиридин, политиодиэтиламинометилэтилен Р (TDAE), полиаминостирол (например, п-амино), поли(метилцианоакрилат), поли(этилцианоакрилат), поли(бутилцианоакрилат), поли(изобутилцианоакрилат), поли(изогексилцианоакрилат), DEAE-метакрилат, DEAE-гексилакрилат, DEAE-акриламид, DEAE-альбумин и DEAE-декстран, полиметилакрилат, полигексилакрилат,поли(D,L-молочная кислота), сополимер DL-молочной и гликолевой кислоты (PLGA), альгинат и полиэтиленгликоль (ПЭГ). Композиции дцРНК для перорального введения и их получение подробно описаны в патенте США 6887906, в публикации патента США 20030027780 и в патенте США 6747014,которые вводятся в настоящее описание посредством ссылки. Композиции и препараты для парентерального введения, интрапаренхимального введения (в головной мозг), интратекального введения, интравентрикулярного введения или введения в печень могут включать стерильные водные растворы, которые могут также содержать буферы, разбавители и другие подходящие добавки, такие как, но не ограничивающиеся ими, усилители пенетрации, соединенияносители и другие фармацевтически приемлемые носители или наполнители. Фармацевтические композиции и препараты для местного введения могут включать чрезкожные пластыри, мази, лосьоны, кремы, гели, капли, суппозитории, спреи, жидкости и порошки. При необходимости или при желании могут быть использованы стандартные фармацевтические носители, водные, порошкообразные или масляные основы, загустители и т.п. Подходящими препаратами для местного введения являются препараты, в которых дцРНК согласно изобретению представляют собой смесь с агентом для местной доставки, таким как липиды, липосомы, жирные кислоты, сложные эфиры жирных кислот, стероиды, хелатообразующие агенты и поверхностно-активные вещества. Подходящие липиды и липосомы являются нейтральными (например, диолеоилфосфатидилэтаноламин(DOPE), димиристоилфосфатидилхолин (DMPC), дистеаролфосфатидилхолин), отрицательно заряженными (например, димиристоилфосфатидилглицерин (DMPG) и катионными (например, диолеоилтетраметиламинопропил (DOTAP) и диолеоилфосфатидилэтаноламин (DOTMA). дцРНК согласно изобретению могут быть инкапсулированы в липосомы, либо они могут образовывать комплексы с этими липосомами, а в частности, с катионными липосомами. Альтернативно, дцРНК могут образовывать комплексы с липидами, а в частности, с катионными липидами. Подходящими жирными кислотами и их сложными эфирами являются, но не ограничиваются ими, арахидоновая кислота, олеиновая кислота, эйкозановая кислота, лауриновая кислота, каприловая кислота, каприновая кислота, миристиновая кислота,пальмитиновая кислота, стеариновая кислота, линолевая кислота, линоленовая кислота, дикапрат, трикапрат, моноолеин, дилаурин, глицерил-1-монокапрат, 1-додецилазациклогептан-2-он, ацилкарнитин,ацилхолин или C1-10 алкиловый эфир (например, изопропилмиристат (IPM), моноглицерид, диглицерид или их фармацевтически приемлемая соль. Препараты для местного введения подробно описаны в патенте США 6747014, который вводится в настоящее описание посредством ссылки. Кроме того, молекулы дцРНК могут быть введены млекопитающему биологическими или небиологическими средствами,описанными, например, в патенте США 6271359. Небиологическая доставка может быть осуществлена различными методами, включая, но не ограничиваясь ими, (1) введение молекулы дцРНК, описанной в настоящей заявке, в липосомы и (2) создание комплекса молекулы дцРНК с липидами или липосомами с образованием комплексов "нуклеиновая кислота - липид" или "нуклеиновая кислота - липосома". Липосома может состоять из катионных и нейтральных липидов, обычно используемых для трансфекции клеток in vitro. Катионные липиды могут образовывать комплекс (например, связанный с зарядом) с отрицательно заряженными нуклеиновыми кислотами с образованием липосом. Примерами катионных липосом являются, но не ограничиваются ими, липофектин, липофектамин, липофектат и DOTAP. Способы получения липосом хорошо известны специалистам. Композиции липосом могут быть получены,например, из фосфатидилхолина, димиристоилфосфатидилхолина, дипальмитоилфосфатидилхолина,димиристоилфосфатидилглицерина или диолеоилфосфатидилэтаноламина. Различные липофильные агенты являются коммерчески доступными, включая липофектин (Invitrogen/Life Technologies, Carlsbad, Calif.) и эффектин (Qiagen, Valencia, Calif.). Кроме того, методы системной доставки могут быть оптимизированы с использованием коммерчески доступных катионных липидов, таких как DDAB илиDOTAP, каждый из которых может быть смешан с нейтральным липидом, таким как DOPE или холестерин. В некоторых случаях могут быть использованы липосомы, описанные Templeton et al. (Nature Biotechnology, 15: 647-652 (1997. В других вариантах изобретения для доставки in vivo и ex vivo могут быть использованы поликатионы, такие как полиэтиленимин (Boletta et al., J. Am. Soc. Nephrol. 7: 1728(1996. Дополнительную информацию по использованию липосом для доставки нуклеиновых кислот можно найти в патенте США 6271359, в публикации заявки РСТ WO 96/40964 и в публикации Morrissey, D. et al. 2005. Nat. Biotechnol. 23(8): 1002-7. Биологическая доставка может быть осуществлена различными методами, включая, но не ограничиваясь ими, использование вирусных векторов. Так, например, вирусные векторы (например, аденовирусные и герпесвирусные векторы) могут быть использованы для доставки молекул дцРНК в клетки печени. Для введения одной или нескольких дцРНК, описанных в настоящей заявке, в один из множества различных вирусных векторов, сконструированных ранее для доставки нуклеиновой кислоты в клетки,могут быть применены стандартные методы молекулярной биологии. Полученные вирусные векторы могут быть использованы для доставки одной или нескольких дцРНК в клетки, например, путем инфицирования. Характеризация композиций дцРНК Композиции, полученные либо методом постадийного смешивания, либо неэкструзионным методом, могут быть охарактеризованы аналогичными способами. Так, например, такие композиции обычно характеризуют путем визуальной оценки. Они должны представлять собой беловатые прозрачные растворы, не содержащие агрегатов или осадка. Размер частиц и распределение липидных наночастиц по размеру могут быть оценены методом рассеяния света с использованием, например, аппарата MalvernZetasizer Nano ZS (Malvern, USA) . Размер частиц должен составлять примерно 20-300 нм, например, 40100 нм. Распределение частиц по размеру должно быть унимодальным. Общую концентрацию киРНК в препарате, а также связанной фракции, оценивают с помощью анализа на вытеснение красителя. Образец киРНК, приготовленной в виде препарата, может быть инкубирован с красителем, связывающимся с РНК, таким как Ribogreen (Molecular Probes), в присутствии или в отсутствии препаратразрушающего поверхностно-активного вещества, например, 0,5% тритон-Х 100. Общая киРНК в препарате может быть определена по сигналу образца, содержащего поверхностно-активное вещество, по отношению к стандартной кривой. Связанную фракцию определяют путем вычитания содержания "свободной" киРНК (измеренной по сигналу в отсутствии поверхностно-активного вещества) из общего содержания киРНК. Процент связанной киРНК обычно составляет 85%. Для препарата SNALP, размер частиц составляет по меньшей мере 30 нм, по меньшей мере 40 нм, по меньшей мере 50 нм, по меньшей мере 60 нм, по меньшей мере 70 нм, по меньшей мере 80 нм, по меньшей мере 90 нм, по меньшей мере 100 нм, по меньшей мере 110 нм и по меньшей мере 120 нм. Подходящий интервал обычно составляет примерно по меньшей мере от 50 нм до 110 нм, примерно по меньшей мере от 60 нм до 100 нм, или примерно по меньшей мере от 80 нм до 90 нм. Липосомные препараты Помимо микроэмульсий существует множество организованных структур поверхностно-активных веществ, которые были исследованы и использованы для приготовления лекарственных средств. Такими структурами являются монослои, мицеллы, бислои и везикулы. Везикулы, такие как липосомы, представляют особый интерес с точки зрения доставки лекарственных средств, что обусловлено их специфичностью и продолжительностью их действия. Термин "липосома", используемый в настоящем изобретении, означает везикулу, состоящую из амфифильных липидов, расположенных в виде сферического бислоя или сферических бислоев. Липосомами являются униламеллярные или мультиламеллярные везикулы, которые имеют мембраны, образованные из липофильного материала и водной внутренней части. Водная часть содержит доставляемую композицию. Катионные липосомы имеют то преимущество, что они обладают способностью прикрепляться к клеточной стенке. Некатионные липосомы, несмотря на то, что они не могут эффективно прикрепляться к клеточной стенке, все же поглощаются макрофагами in vivo. Для перехода через неповрежденную кожу млекопитающего, липидные везикулы должны проходить через серию тонких пор, каждая из которых имеет диаметр менее 50 нм, под влиянием подходящего чрезкожного градиента. Поэтому желательно использовать липосомы, которые являются в высокой степени деформируемыми и обладают способностью проходить через поры малого размера. Другие преимущества липосом заключаются в том, что липосомы, полученные из природных фосфолипидов, являются биологически совместимыми и биологически разлагаемыми; липосомы могут включать растворимые в воде и липидах лекарственные средства широкого ряда; липосомы могут защищать инкапсулированные лекарственные средства в своих внутренних компартментах от метаболизма и разложения (Rosoff, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, MarcelDekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 245). Важными факторами при получении липосомных препаратов являются заряд на поверхности липида, размер везикулы и водный объем липосом. Липосомы являются подходящими для переноса и доставки активных ингредиентов на участок их действия. Поскольку липосомная мембрана по своей структуре аналогична биологическим мембранам,то при нанесении липосом на ткань, они начинают поглощаться клеточными мембранами, и по мере прохождения липосом в клетки и их поглощения клетками, содержимое липосом высвобождается в клетку, в которой может действовать активное вещество. Липосомные препараты являются объектом интенсивных исследований как способ доставки многих лекарственных средств. В настоящее время появляется все больше данных, свидетельствующих о том,что для местного введения, липосомы, по сравнению с другими препаратами, имеют несколько преимуществ. Такими преимуществами являются меньшее число побочных эффектов, связанных с высоким уровнем системной абсорбции вводимого лекарственного средства, повышенная аккумуляция вводимого лекарственного средства в нужной мишени и возможность вводить в кожу лекарственные средства широкого ряда, как гидрофильные, так и гидрофобные лекарственные средства. В некоторых работах подробно описана способность липосом доставлять агенты, включая высокомолекулярную ДНК, в кожу. В кожу были введены различные соединения, включая аналгетики, антитела, гормоны и высокомолекулярные ДНК. В большинстве случаев, липосомы находят свое применение в нацеливании на верхний эпидермис. Липосомы подразделяются на два широких класса. Катионными липосомами являются положительно заряженные липосомы, которые взаимодействуют с отрицательно заряженными молекулами ДНК с образованием стабильного комплекса. Комплекс положительно заряженная ДНК/липосома связывается с отрицательно заряженной клеточной поверхностью и интернализуется в эндосоме. Липосомы, благодаря кислотному рН в эндосоме, разрушаются, что приводит к высвобождению их содержимого в цитоплазму клетки (Wang et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 1987, 147, 980-985). Липосомы, которые являются рН-чувствительными или отрицательно заряженными, захватывают ДНК, но не комплекс с ДНК. Поскольку ДНК и липид имеют одинаковые заряды, то происходит отталкивание этих заряженных молекул, и комплекс не образуется. Тем не менее, некоторые ДНК захватываются внутренним водным пространством этих липосом. рН-чувствительные липосомы были использованы для доставки ДНК, содержащей ген тимидинкиназы, в клеточные монослои в культуре. Экспрессия экзогенного гена была детектирована в клетках-мишенях (Zhou et al., Journal of Controlled Release, 1992,19, 269-274). Один из основных типов липосомных композиций включает фосфолипиды, не являющиеся природным фосфатидилхолином. Нейтральные липосомные композиции могут быть образованы, например, из димиристоилфосфатидилхолина (DMPC) или дипальмитоилфосфатидилхолина (DPPC). Анионные липосомные композиции обычно получают из димиристоилфосфатидилглицерина, а анионные фузогенные липосомы получают,главным образом, из диолеоилфосфатидилэтаноламина (DOPE). Липосомную композицию другого типа получают из фосфатидилхолина (PC), такого как, например, соевый PC и яичный PC. Липосомную композицию другого типа получают из смесей фосфолипида и/или фосфатидилхолина и/или холестерина. В нескольких исследованиях была проведена оценка местной доставки липосомных лекарственных препаратов на кожу. Нанесение липосом, содержащих интерферон, на кожу морских свинок приводило к уменьшению герпетических поражений кожи, а доставка интерферона другими средствами (например, в виде раствора или эмульсии) оказалась неэффективной (Weiner et al., Journal of Drug Targeting, 1992, 2,405-410) . Кроме того, в дополнительном исследовании была протестирована эффективность интерферона, вводимого как часть липосомного препарата, по сравнению с эффективностью введения интерферона с использованием водной системы, в результате чего был сделан вывод, что липосомный препарат по своим свойствам превосходит водный препарат (du Plessis et al., Antiviral Research, 1992, 18, 259-265). Неионные липосомные системы также были проанализированы в целях определения их способно- 20019531 сти к доставке лекарственных средств в кожу, а в частности, систем, содержащих неионогенное поверхностно-активное вещество и холестерин. Неионогенные липосомные препараты, содержащие Novasome I (глицерилдилаурат/холестерин/полиоксиэтилен-10-стеариловый эфир) и Novasome II (глицерилдистеарат/холестерин/полиоксиэтилен-10-стеариловый эфир), были использованы для доставки циклоспорина А в дерму мышиной кожи. Результаты показали, что такие неионные липосомные системы являются эффективными для облегчения осаждения циклоспорина-А в различных слоях кожи (Hu et al.S.T.P. Pharma. Sci., 1994, 4, 6, 466). Используемый в настоящем описании термин "липосомы" также включает "стерически стабилизированные" липосомы и означает липосомы, содержащие один или несколько специализированных липидов, которые, при их включении в липосомы, увеличивают время их жизни в кровотоке по сравнению с липосомами, в которых отсутствуют такие специализированные липиды. Примерами стерически стабилизированных липосом являются липосомы, в которых часть везикулообразующей липидной части липосомы (А) содержит один или несколько гликолипидов, таких как моносиалоганглиозид GMI, или (В) является дериватизированной одним или несколькими гидрофильными полимерами, такими как молекула полиэтиленгликоля (ПЭГ). Не ограничиваясь какой-либо конкретной теорией, следует лишь отметить,что по меньшей мере стерически стабилизированные липосомы, содержащие ганглиозиды, сфингомиелин или ПЭГ-дериватизированные липиды, имеют более продолжительное время полужизни в кровотоке, что обусловлено пониженным уровнем их поглощения клетками ретикулоэндотелиальной системы(RES) (Allen et al., FEBS Letters, 1987, 223, 42; Wu et al., Cancer Research, 1993, 53, 3765). Различные липосомы, содержащие один или несколько гликолипидов, известны специалистам. В публикации Papahadjopoulos et al. (Ann. N.Y. Acad. Sci., 1987, 507, 64) сообщалось о способности моносиалоганглиозида GM1, сульфата галактосереброзида и фосфатидилинозита увеличивать время полужизни липосом в крови. Полученные данные подробно объяснены Gabizon et al (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.,1988, 85, 6949). В патенте США 4837028 и в WO 88/04924, Allen et al. описаны липосомы, содержащие(1) сфингомиелин и (2) ганглиозид GM1 или сложный эфир сульфата галактоцереброзида. В патенте США 5543152 (Webb et al) описаны липосомы, содержащие сфингомиелин. Липосомы, содержащие 1,2-snдимиристоилфосфатидилхолин, описаны в WO 97/13499 (Lim et al). Многие липосомы, содержащие липиды, дериватизированные одним или несколькими гидрофильными полимерами, и методы их получения известны специалистам. В публикации Sunamoto et al. (Bull.Chem. Soc. Jpn., 1980, 53, 2778) описаны липосомы, содержащие неионогенный детергент, 2C1215G, который включает молекулу ПЭГ. В работе Ilium et al. (FEBS Lett., 1984, 167, 79) указывается, что гидрофильное покрытие полистироловых частиц полимерными гликолями обеспечивает значительное увеличение их полужизни в кровотоке. Синтетические фосфолипиды, модифицированные путем присоединения гидроксильных групп полиалкиленгликолей (например, ПЭГ), описаны в публикации Sears (патенты США 4426330 и 4534899). В публикации Klibanov et al. (FEBS Lett., 1990, 2 68, 235) описаны эксперименты, продемонстрировавшие, что липосомы, содержащие фосфатидилэтаноламин (РЕ), дериватизированный ПЭГ или ПЭГ-стеаратом, имеют значительно более продолжительное время полужизни в кровотоке. В публикации Blume et al. (Biochimica et Biophysica Acta, 1990, 1029, 91), такие наблюдения были зарегистрированы и в отношении других ПЭГ-дериватизированных фосфолипидов, например, DSPEPEG, образованных из комбинации дистеароилфосфатидилэтаноламина (DSPE) и ПЭГ. Липосомы, имеющие ковалентно связанные молекулы ПЭГ на внешней поверхности, описаны в Европейском патенте ЕР 0445131 В 1 и в заявке WO 90/04384, Fisher. Липосомные композиции, содержащие 1-20 мол.% ПЭГдериватизированного РЕ, и методы их применения описаны в публикациях Woodle et al. (патенты США 5013556 и 5356633) и Martin et al. (патент США 5213804 и Европейский патентЕР 0496813 В 1). Липосомы, содержащие ряд других конъюгатов "липид-полимер", описаны в заявке WO 91/05545et al.). В патенте США 5540935 (Miyazaki et al.) и в патенте США 5556948 (Tagawa et al.) описаны ПЭГ-содержащие липосомы, которые могут быть также дериватизированы функциональными группами на своей поверхности. Различные липосомы, содержащие нуклеиновые кислоты, известны специалистам. В заявке WO 96/40062, Thierry et al., описаны методы инкапсулирования высокомолекулярных нуклеиновых кислот в липосомах. В патенте США . 5264221, Tagawa et al., описаны липосомы, связанные с белком, и указывается, что содержимое таких липосом может включать дцРНК. В патенте США 5665710, Rahman etal. описаны некоторые методы инкапсулирования олигодезоксинуклеотидов в липосомах. В WO 97/04787, Love et al. описаны липосомы, содержащие дцРНК, нацеленные на ген raf. Еще одним типом липосом являются трансферсомы, и эти трансферсомы представляют собой в высокой степени деформируемые липидные агрегаты, которые являются привлекательными кандидатами в качестве носителей для доставки лекарственных средств. Трансферсомы могут быть описаны как липидные капельки, которые являются настолько сильно деформируемыми, что они легко могут проникать через поры, размер которых меньше размера капелек. Трансферсомы могут быть адаптированы к условиям окружающей среды, в которых они используются, например, они являются самооптимизирующими(адаптируются к форме пор в коже), саморепарирующимися, часто могут достигать своих мишеней бех фрагментирования, и в большинстве случаев, являются самозагружающимися. Для получения трансферсом к стандартной липосомной композиции могут быть добавлены вещества, увеличивающие поверхностное натяжение, обычно поверхностно-активные вещества. Трансферсомы были использованы для доставки сывороточного альбумина в кожу. Было показано, что опосредуемая трансферсомами доставка сывороточного альбумина является такой же эффективной, как и подкожная инъекция раствора, содержащего сывороточный альбумин. Поверхностно-активные вещества находят широкое применение в таких композициях, как эмульсии(включая микроэмульсии) и липосомы. Наиболее распространенным способом классификации и систематизации свойств поверхностно-активных веществ многих различных типов, как природных, так и синтетических, является применение гидрофильно-липофильного баланса (ГЛБ). Природа гидрофильной группы (также известной как "голова") позволяет проводить наиболее эффективную классификацию различных поверхностно-активных веществ, используемых в данных препаратах, по категориям (Rieger, inPharmaceutical Dosage Forms, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., 1988, p. 285). Если молекула поверхностно-активного вещества не является ионом, то такое вещество относится к классу неионных поверхностно-активных веществ. Неионные поверхностно-активные вещества находят широкое применение в фармацевтических и косметических продуктах и могут быть использованы для коррекции рН-величин в широком интервале. В основном, величины их ГЛБ варьируются в интервале от 2 до примерно 18, в зависимости от их структуры. Неионными поверхностно-активными веществами являются неионные сложные эфиры, такие как сложные эфиры этиленгликоля, сложные эфиры пропиленгликоля, глицериловые сложные эфиры, полиглицериловые сложные эфиры, сложные эфиры сорбитана, сложные эфиры сахарозы и этоксилированные сложные эфиры. В этот класс также входят неионные алканоламиды и эфиры, такие как этоксилаты жирных спиртов, пропоксилированные спирты и этоксилированные/пропоксилированные блокполимеры. Наиболее распространенными членами класса неионных поверхностно-активных веществ являются полиоксиэтиленовые поверхностно-активные вещества. Если молекула поверхностно-активного вещества имеет отрицательный заряд, при ее растворении или диспергировании в воде, то такое поверхностно-активное вещество относится к классу анионных. Анионными поверхностно-активными веществами являются карбоксилаты, такие как мыла, ациллактилаты, ациламиды аминокислот, сложные эфиры серной кислоты, такие как алкилсульфаты, и этоксилированные алкилсульфаты, сульфонаты, такие как сульфонаты алкилбензола, ацилизетионаты, ацилтаураты, сульфосукцинаты и фосфаты. Наиболее важными членами класса анионных поверхностно-активных веществ являются алкилсульфаты и мыла. Если молекула поверхностно-активного вещества имеет положительный заряд, при ее растворении или диспергировании в воде, то такое поверхностно-активное вещество относится к классу катионных. Катионными поверхностно-активными веществами являются соли четвертичного аммония и этоксилированные амины. Наиболее часто используемыми членами этого класса являются соли четвертичного аммония. Если молекула поверхностно-активного вещества может иметь положительный или отрицательный заряд, то такое поверхностно-активное вещество относится к классу амфотерных. Амфотерными поверхностно-активными веществами является производное акриловой кислоты, замещенные алкиламиды, Nалкилбетаины и фосфатиды. В литературе имеются сообщения о применении поверхностно-активных веществ в лекарственных продуктах, композициях и эмульсиях (Rieger, in Pharmaceutical Dosage Forms, Marcel Dekker, Inc., NewSNALP В одном из вариантов изобретения дцРНК согласно изобретению полностью инкапсулирована в липидном препарате с образованием SPLP, pSPLP, SNALP или другой частицы, содержащей липиднуклеиновую кислоту. Используемый в настоящем описании термин "SNALP" означает стабильную частицу, содержащую нуклеиновую кислоту-липид, включая SPLP. Используемый в настоящем описании термин "SPLP" означает частицу нуклеиновой кислоты-липида, включающую плазмидную ДНК, инкапсулированную в липидной везикуле. SNALP и SPLP обычно содержат катионный липид, некатионный липид и липид, предупреждающий агрегацию частиц (например, конъюгат "ПЭГ-липид"). SNALP иSPLP являются исключительно ценными для системного введения, поскольку они имеют более продолжительное время жизни в кровотоке после внутривенной (i.v.) инъекции и аккумулируются в дистальных участках (например, в участках физически отделенных от участков введения). SPLP включают "pSPLP",которые содержат инкапсулированный комплекс "конденсирующий агент-нуклеиновая кислота", описанный в публикации заявки РСТWO 00/03683. Частицы согласно изобретению обычно имеют средний диаметр примерно 50-150 нм, более предпочтительно примерно 60-130 нм, еще более предпочтительно примерно 70-110 нм, а наиболее предпочтительно примерно 70-90 нм, и являются, по существу,нетоксичными. Кроме того, нуклеиновые кислоты, если они присутствуют в частицах "нуклеиновая кислота-липид" согласно изобретению, являются резистентными к расщеплению нуклеазой в водном рас- 22019531 творе. Частицы "нуклеиновая кислота - липид" и метод их получения описаны, например, в патентах США 5 97 65 67; 5981501; 6534484; 6586410; 6815432; и в публикации заявки РСТWO 96/40964. В одном из вариантов изобретения отношение липида к лекарственному средству (отношение мас./мас.) (например, отношение липида к дцРНК) составляет в пределах от примерно 1:1 до примерно 50:1, от примерно 1:1 до примерно 25:1, от примерно 3:1 до примерно 15:1, от примерно 4:1 до примерно 10:1, от примерно 5:1 до примерно 9:1 или от примерно 6:1 до примерно 9:1. Катионными липидами могут быть, например, хлорид N,N-диолеил-N,N-диметиламмония(DLin-TAP.C1), 1,2-дилинолеилокси-3-(N-метилпиперазино)пропан (DLin-MPZ) или 3-(N,N-дилинолеиламино)-1,2-пропандиол (DLinAP), 3-(N,N-диолеиламино)-1,2-пропандиол (DOAP), 1,2-дилинолеилоксо-3-(2-N,N-диметиламино)этоксипропан (DLin-EG-DMA), 2,2-дилинолеил-4-диметиламинометил-[1,3]диоксолан (DLin-K-DMA) или их аналоги или смеси. Катионный липид может составлять примерно 2050 мол.% или примерно 40 мол.% от общего липида, присутствующего в данной частице. В другом варианте изобретения соединение 2,2-дилинолеил-4-диметиламиноэтил-[1,3]-диоксан может быть использован для получения наночастиц, содержащих липид-киРНК. Синтез 2,2-дилинолеил 4-диметиламиноэтил-[1,3]-диоксана описан в предварительной заявке на патент США 61/107998, поданной 23 октября 2008, которая вводится в настоящее описание посредством ссылки. В одном из вариантов изобретения частица "липид-киРНК" включает 40% 2-дилинолеил-4 диметиламиноэтил-[1,3]-диоксана, 10% DSPC: 40% холестерина: 10% PEG-C-DOMG (мол.%) и имеет размер 63,020 нм и отношение киРНК/липид, составляющее 0,027. Некатионный липид может быть анионным липидом или нейтральным липидом, включая, но не ограничиваясь ими, дистеароилфосфатидилхолин (DSPC), диолеоилфосфатидилхолин (DOPC), дипальмитоилфосфатидилхолин (DPPC), диолеиоилфосфатидилглицерин (DOPG), дипальмитоилфосфатидилглицерин (DPPG), диолеоилфасфатидилэтаноламин (DOPE), пальмитоилолеоилфосфатидилхолин (РОРС),пальмитоилолеоилфосфатидилэтаноламин (POPE), 4-(N-малеимидометил)циклогексан-1-карбоксилат диолеоилфосфатидилэтаноламина (DOPE-mal), дипальмитоилфосфатидилэтаноламин (DPPE), димиристоилфосфоэтаноламин (DMPE), дистеароилфосфатидилэтаноламин (DSPE), 16-О-монометил-РЕ, 16-Oдиметил-РЕ, 18-1-транс-РЕ, 1-стеароил-2-олеоил-фосфатидилэтаноламин (SOPE), холестерин или их смеси. Некатионный липид может составлять примерно 5-90 мол.%, примерно 10 или 58 мол.%, если он включает холестерин от общего количества липида, присутствующего в данной частице. Конъюгированным липидом, который ингибирует агрегацию частиц, может быть, например, полиэтиленгликоль (ПЭГ)-липид включая, но не ограничиваясь ими, ПЭГ-диацилглицерин (DAG), ПЭГдиалкилоксипропил (DAA), ПЭГ-фосфолипид, ПЭГ-церамид (Cer), или их смеси. Конъюгатом ПЭГ-DAA может быть, например, ПЭГ-дилаурилоксипропил (Ci2), ПЭГ-димиристилоксипропил (Ci4), ПЭГдипальмитилоксипропил (Ci6) или ПЭГ-дистеарилоксипропил (Ci8). Конъюгированный липид, который предупреждает агрегацию частиц, может составлять примерно 0-20 мол.%, или примерно 2 мол.% от общего содержания липида, присутствующего в данной частице. В некоторых вариантах изобретения, частица "нуклеиновая кислота-липид" также включает холестерин, например, в количестве примерно 10-60 мол.% или примерно 48 мол.%, от общего содержания липида, присутствующего в данной частице.LNP01 В одном из вариантов изобретения липидоид ND98-4HCl (Mw 1487) (формула 1), холестерин (Sigma-Aldrich) и ПЭГ-церамид С 16 (Avanti Polar Lipids) могут быть использованы для получения наночастиц, состоящих из липида-киРНК (то есть, LNP01-частиц). Могут быть получены маточные растворы каждого из нижеследующих компонентов в этаноле: ND98, 133 мг/мл; холестерин, 25 мг/мл, ПЭГцерамид С 16, 100 мг/мл. Затем маточные растворы ND98, холестерина и ПЭГ-церамида С 16 могут быть объединены, например, в молярном отношении 42:48:10. Объединенный липидный раствор может быть смешан с водной киРНК (например, в ацетате натрия, рН 5) так, чтобы конечная концентрация этанола составляла примерно 35-45%, а конечная концентрация ацетата натрия составляла примерно 100-300 мМ. Наночастицы из липида-киРНК обычно образуются спонтанно после смешивания. В зависимости от нужного распределения частиц по размеру, полученная смесь из наночастиц может быть экструдирована через поликарбонатную мембрану (например, с отсечкой 100 нм) с использованием, например, экструдера с термоцилиндром, такого как экструдер Lipex (Northern Lipids, Inc). В некоторых случаях, стадию экструзии можно не проводить. Удаление этанола и одновременная замена буфера могут быть осуществ- 23019531 лены, например, путем диализа или фильтрации в тангенциальном потоке. Буфер может быть заменен,например, забуференным фосфатом физиологический раствором (PBS) примерно при рН 7, например,примерно при рН 6,9, примерно при рН 7,0, примерно при рН 7,1, примерно при рН 7,2, примерно при рН 7,3, или примерно при рН 7,4.LNP01-препараты описаны, например, в публикации международной заявкиWO 2008/042973,которая вводится в настоящее описание посредством ссылки. Эмульсии Композиции согласно изобретению могут быть получены и приготовлены в виде эмульсий. Эмульсиями обычно являются гетерогенные системы, состоящие из одной жидкости, диспергированной в другой жидкости в форме капелек, диаметр которых обычно превышает 0,1 мкм (Idson, in Pharmaceutical(Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 2, p. 335; Higuchi et al., in Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1985, p. 301). В большинстве случаев эмульсии представляют собой двухфазные системы, содержащие две несмешиваемые жидкие фазы, тщательно смешанные друг с другом и диспергированные друг в друге. Вообще говоря, эмульсии могут представлять собой эмульсии типа "вода в масле" (вода/масло) или "масло в воде" (масло/вода). Если водная фаза является тонкодисперсной и диспергированной виде небольших капелек в объемной масляной фазе, то полученная композиция называется эмульсией типа "вода в масле" (вода/масло). Альтернативно, если масляная фаза является тонкодисперсной и диспергированной в виде небольших капелек в объемной водной фазе, то полученная композиция называется эмульсией типа "масло в воде" (масло/вода). Эмульсии, помимо диспергированных фаз, могут содержать другие компоненты и активное лекарственное средство,которое может присутствовать в в виде раствора в водной фазе, в масляной фазе или как таковое в виде отдельной фазы. При необходимости в эмульсиях могут также присутствовать фармацевтические наполнители, такие как эмульгаторы, стабилизаторы, красители и антиоксиданты. Фармацевтическими эмульсиями могут быть также множество эмульсий, состоящих из более чем двух фаз, например, в случае эмульсий типа "масло в воде в масле" (масло/вода/масло) и "вода в масле в воде" (вода/масло/вода). Такие комплексные препараты часто имеют некоторые преимущества, которые отсутствуют у простых бинарных эмульсий. Множественные эмульсии, в которых отдельные масляные капельки эмульсий типа масло/вода включают небольшие капельки воды, представляют собой эмульсию типа вода/масло/вода. Аналогичным образом система масляных капелек, заключенных в сферические пузырьки воды, стабилизированные в масляной непрерывной фазе, образует эмульсию типа масло/вода/масло. Эмульсии характеризуются невысокой стабильностью или отсутствием термодинамической стабильности. В большинстве случаев дисперсная или дискретная фаза эмульсии является тонкодиспергированной во внешнюю или непрерывную фазу и поддерживается в этом состоянии с помощью эмульгаторов или благодаря вязкости препарата. Любые фазы эмульсии могут быть полутвердыми или твердыми, как и в случае основ мази и кремов эмульсионного типа. Другие способы стабилизации эмульсий требуют использования эмульгаторов, которые могут быть введены в любую фазу эмульсии. В широком смысле эмульгаторы могут быть классифицированы по четырем категориям: синтетические поверхностно-активные вещества, природные эмульгаторы, абсорбирующие основы и тонкодисперсные твердые вещества (Idson, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker,Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 199). Синтетические поверхностно-активные вещества, также известные как поверхностно-активные агенты, находят широкое применение в приготовлении эмульсий и описаны в литературе (Rieger, inDekker, Inc., New York, N.Y., 1988, volume 1, p. 199). Поверхностно-активные вещества обычно являются амфифильными и содержат гидрофильную и гидрофобную часть. Отношение гидрофильной части к гидрофобной части поверхностно-активного вещества называется гидрофильно-липофильным балансом(ГЛБ) и является важным фактором для определения категории и отбора поверхностно-активных веществ при получении препаратов. В зависимости от природы гидрофильной группы, поверхностноактивные вещества могут быть отнесены к различным классам: неионные, анионные, катионные и амфотерные (Rieger, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker,- 24019531Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 2 85). Природными эмульгаторами, используемыми в эмульсионных препаратах, являются ланолин, пчелиный воск, фосфатиды, лецитин и аравийская камедь. Абсорбционные основы обладают гидрофильными свойствами, которые позволяют им впитывать воду с образованием эмульсий типа вода/масло и с сохранением своей полутверддой консистенции, например, такие как безводный ланолин и гидрофильное вазелиновое масло. Тонкодисперсные твердые вещества, а в частности, в комбинации с поверхностно-активными веществами и в форме вязких препаратов, также являются хорошими эмульгаторами. Ими являются полярные неорганические твердые вещества, такие как гидроксиды тяжелых металлов, неразбухающие глины, такие как бентонит, аттапульгит, гекторит, каолин, монтмориллонит, коллоидный силикат алюминия и коллоидный силикат магния-алюминия, пигменты и неполярные твердые вещества,такие как уголь или глицерилтристеарат. В эмульсионные композиции также входят неэмультирующиеся вещества широкого ряда, которые улучшают свойства эмульсий. Такими веществами являются жиры, масла, воски, жирные кислоты, жирные спирты, сложные эфиры жирных кислот, увлажнители, гидрофильные коллоиды, консерванты и антиоксиданты (Block, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marceland Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 199). Гидрофильными коллоидами или гидроколлоидами являются природные смолы и синтетические полимеры, такие как полисахариды (например, аравийская камедь, агар, альгиновая кислота, каррагенан,гуаровая камедь, камедь карайи и трагакантовая камедь), производные целлюлозы (например, карбоксиметилцеллюлоза и карбоксипропилцеллюлоза) и синтетические полимеры (например, карбомеры, эфиры целлюлозы и карбоксивиниловые полимеры). Эти вещества диспергируются или набухают в воде, образуя коллоидные растворы, которые стабилизируют эмульсии благодаря образованию пленок с сильным поверхностным натяжением вокруг капелек в дисперсной фазе и благодаря повышению вязкости внешней фазы. Поскольку эмульсии часто содержат ряд ингредиентов, таких как углеводы, белки, стеролы и фосфатиды, которые могут легко поддерживать рост микробов, то в эти препараты часто включают консерванты. Обычно используемыми консервантами, включаемыми в эмульсионные препараты, являются метилпарабен, пропилпарабен, соли четвертичного аммония, хлорид бензалкония, сложные эфиры пгидроксибензойной кислоты и борная кислота. Для предупреждения разрушения препарата в эмульсионные препараты также обычно добавляют антиоксиданты. Используемыми антиоксидантами могут быть акцепторы свободных радикалов, такие как токоферолы, алкилгаллаты, бутилированный гидроксианизол, бутилированный гидрокситолуол, или восстановители, такие как аскорбиновая кислота и метабисульфит натрия, а также антиоксиданты синергического действия, такие как лимонная кислота, винная кислота и лецитин. Применение эмульсионных препаратов путем нанесения на кожу, перорального введения и парентерального введения, а также методы их приготовления описаны в литературе (Idson, in PharmaceuticalDosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 199) . Эмульсионные препараты для перорального введения очень широко применяются из-за простоты их приготовления, а также их эффективности в отношении абсорбции и биологической доступности (Rosoff, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., NewYork, N.Y., volume 1, p. 245; Idson, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.),1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 199) . Материалами, которые обычно вводят перорально в виде эмульсий типа масло/вода, являются слабительные на основе минеральных масел, растворимые в масле витамины и питательные препараты с высоким содержанием жира. В одном из вариантов настоящего изобретения композиции дцРНК и нуклеиновых кислот приготавливают в виде микроэмульсий. Микроэмульсия может быть определена как система, состоящая из воды, масла и амфифильного вещества, которые представляют собой единый оптически изотропный и термодинамически стабильный жидкий раствор (Rosoff, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 245). Обычно микроэмульсиями являются системы, которые получают сначала путем диспергирования масла в водном растворе поверхностно-активного вещества, с последующим добавлением подходящего количества четвертого компонента, в основном, спирта со средней длиной цепи, и получением прозрачной системы. Поэтому микроэмульсии также описаны как термодинамически стабильные, изотропно чистые дисперсии, состоящие из двух несмешиваемых жидкостей, которые стабилизированы межфазными пленками поверхностно-активных молекул (Leung and Shah, in: Controlled Release of Drugs: Polymers and Aggregate Systems, Rosoff, M., Ed., 1989, VCH Publishers, New York, pages 185-215). Микроэмульсии обычно получают путем объединения 3-5 компонентов, которыми являются масло, вода, поверхностно-активное вещество,вторичное поверхностно-активное вещество и электролит. Микроэмульсия любого типа, будь то эмульсия типа "вода в масле" (вода/масло) или "масло в воде" (масло/вода), зависит от свойств используемого масла и поверхностно-активного вещества, и от структуры и геометрической упаковки полярных "голов" и углеводородных "хвостов" молекул поверхностно-активного вещества (Schott, in Remington's Pharma- 25019531ceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1985, p. 271). Специалистами в данной области был тщательно изучен феноменологический подход с использованием диаграмм фазового равновесия и были получены исчерпывающие данные о механизме образования микроэмульсий (Rosoff, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988,Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 245; Block, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman,Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 335). По сравнению со стандартными эмульсиями микроэмульсии часто обладают тем преимуществом, что нерастворимые в воде лекарственные средства могут солюбилизироваться в препарате из термодинамически стабильных капелек, образующихся спонтанно. Поверхностно-активными веществами, используемыми в микроэмульсионных препаратах, являются, но не ограничиваются ими, ионные поверхностно-активные вещества, неионные поверхностноактивные вещества, Brij 96, полиоксиэтиленолеиловые эфиры, сложные эфиры полиглицерина и жирных кислот, монолаурат тетраглицерина (ML310), моноолеат тетраглицерина (МО 310), моноолеат гексаглицерина (РО 310), пентаолеат гексаглицерина (РО 500), монокапрат декаглицерина (МСА 750), моноолеат декаглицерина (МО 750), сесквиолеат декаглицерина (SO750), декаолеат декаглицерина (DAO750), взятые отдельно или в комбинации со вторичными поверхностно-активными веществами. Вторичное поверхностно-активное вещество, а обычно спирт с короткой цепью, такой как этанол, 1-пропанол и 1 бутанол, служит для повышения текучести на границе раздела фаз благодаря его проникновению в пленку поверхностно-активного вещества с последующим образованием пленки из неупорядоченных частиц вследствие наличия пустого пространства, образующегося между молекулами поверхностно-активного вещества. Однако микроэмульсии могут быть получены без использования вторичных поверхностноактивных веществ, и такие самоэмульгирующиеся микроэмульсионные системы, не содержащие спирта,известны специалистам. Водными фазами могут быть, но не ограничиваются ими, вода, водный раствор лекарственного средства, глицерин, ПЭГЗ 00, ПЭГ 400, полиглицерины, пропиленгликоли и производные этиленгликоля. Масляными фазами могут быть, но не ограничиваются ими, такие материалы, как Captex 300, Captex 355, Capmul MCM, сложные эфиры жирных кислот, моно-, ди- и триглицериды со средней длиной цепи (C8-C12), полиоксиэтилированные глицериловые сложные эфиры жирных кислот, жирные спирты, полигликолевые глицериды, насыщенные полигликолевые С 8-С 10 глицериды, растительные масла и силиконовое масло. Микроэмульсии представляют особый интерес с точки зрения солюбилизации лекарственных средств и повышения абсорбции лекарственных средств. Было высказано предположение, что микроэмульсии на основе липидов (типа масло/вода и вода/масло) повышают биологическую доступность лекарственных средств, включая пептиды, при пероральном введении (Constantinides et al., PharmaceuticalResearch, 1994, 11, 1385-1390; Ritschel, Meth. Find. Exp. Clin. Pharmacol., 1993, 13, 205). Микроэмульсии имеют то преимущество, что они улучшают солюбилизацию лекарственных средств, защищают лекарственные средства от ферментативного гидролиза, способны усиливать абсорбцию лекарственных средств,обусловленную изменениями текучести и проницаемости мембраны, индуцированными поверхностноактивным веществом, облегчают приготовление препаратов и пероральное введение, по сравнению с твердыми лекарственными формами, повышают клиническую эффективность и снижают токсичность(Constantinides et al., Pharmaceutical Research, 1994, 11, 1385; Ho et al., J. Pharm. Sci., 1996, 85, 138-143). В большинстве случаев, микроэмульсии могут образовываться спонтанно при смешивании их компонентов при комнатной температуре. Это может быть особенно предпочтительным при получении термолабильных лекарственных средств, пептидов или дцРНК. Микроэмульсии часто являются эффективными для чрезкожной доставки активных компонентов при их применении в косметических и фармацевтических целях. Предполагается, что микроэмульсионные композиции и препарты согласно изобретению будут способствовать повышению системной абсорбции дцРНК и нуклеиновых кислот из желудочнокишечного тракта, а также повышению уровня локального поглощения дцРНК и нуклеиновых кислот клетками. Микроэмульсии согласно изобретению могут также содержать дополнительные компоненты и добавки, такие как сорбитанмоностеарат (Grill 3), лабразол и усилители пенетрации, которые улучшают свойства данного препарата и усиливают абсорбцию дцРНК и нуклеиновых кислот согласно изобретению. Усилители пенетрации, используемые в микроэмульсиях согласно изобретению, могут быть классифицированы как принадлежащие к одной из пяти широких категорий, то есть, поверхностно-активных веществ, жирных кислот, солей желчных кислот, хелатообразующих агентов и соединений, не являющихся поверхностно-активными веществами и не образующих хелатные комплексы (Lee et al., CriticalReviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, p. 92). Каждый из этих классов обсуждается выше. Усилители пенетрации В одном из своих вариантов настоящее изобретение относится к различным усилителям пенетрации, обеспечивающим эффективную доставку нуклеиновых кислот, а в частности, дцРНК, в кожу животных. Большинство лекарственных средств присутствует в растворе в ионизованной и неионизованной форме. Однако через клеточные мембраны легко могут проходить обычно только растворимые в липидах или липофильные лекарственные средства. Было обнаружено, что через клеточные мембраны могут про- 26019531 ходить даже нелипофильные лекарственные средства, если пересекаемая мембрана обработана усилителем пенетрации. Усилители пенетрации, помимо стимуляции диффузии нелипофильных лекарственных средств через клеточные мембраны, также усиливают проницаемость липофильных лекарственных средств. Усилители пенетрации могут быть классифицированы как принадлежащие к одной из пяти широких категорий, то есть поверхностно-активных веществ, жирных кислот, солей желчных кислот, хелатообразующих агентов и соединений, не являющихся поверхностно-активными веществами и не образующих хелатные комплексы (Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, p.92). Каждый из вышеупомянутых классов усилителей пенетрации более подробно описан ниже. Поверхностно-активные вещества. В соответствии с настоящим изобретением, поверхностно-активными веществами (или "поверхностно-активными агентами") являются химические молекулы, которые при их растворении в водном растворе снижают степень поверхностного натяжения раствора или натяжения на границе раздела фаз между водным раствором и другой жидкостью, что приводит к повышению уровня абсорбции дцРНК через слизистую. Такими усилителями пенетрации помимо солей желчных кислот и жирных кислот являются,например, лаурилсульфат натрия, полиоксиэтилен-9-лауриловый эфир и полиоксиэтилен-20-цетиловый эфир (Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, p.92); и перфторхимические эмульсии, такие как FC-43 (Takahashi et al., J. Pharm. Pharmacol., 1988, 40, 252). Жирные кислоты. Различными жирными кислотами и их производными, которые действуют как усилители пенетрации, являются, например, олеиновая кислота, лауриновая кислота, каприновая кислота (н-декановая кислота), миристиновая кислота, пальмитиновая кислота, стеариновая кислота, линолевая кислота, линоленовая кислота, дикапрат, трикапрат, моноолеин (1-моноолеоил-рац-глицерин), дилаурин, каприловая кислота, арахидоновая кислота, 1-монокапрат глицерина, 1-додецилазациклогептан-2-он, ацилкарнитины, ацилхолины, их C1-10 алкиловые эфиры (например, метиловый, изопропиловый и трет-бутиловый) и их моно- и диглицериды (то есть, олеат, лаурат, капрат, миристат, пальмитат, стеарат, линолеат и т.п.)Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1-33; El Hariri et al., J. Pharm. Pharmacol., 1992, 44, 651-654). Соли желчных кислот. Физиологическая роль желчи заключается в облегчении диспергирования и абсорбции витаминов,растворяющихся в липидах и жирах (Brunton, Chapter 38 in: GoodmanGilman's The PharmacologicalBasis of Therapeutics, 9th Ed., Hardman et al. Eds., McGraw-Hill, New York, 1996, pp. 934-935). Различные природные соли желчных кислот и их синтетические производные действуют как усилители пенетрации. Таким образом, термин "соли желчных кислот" включает любой из природных компонентов желчи, а также любое из их синтетических производных. Подходящими солями желчных кислот являются, например, холевая кислота (или ее фармацевтически приемлемая натриевая соль, холат натрия), дегидрохолевая кислота (дегидрохолат натрия), дезоксихолевая кислота (дезоксихолат натрия) , глюхолевая кислота (глюхолат натрия), глихолевая кислота (гликохолат натрия), гликодезоксихолевая кислота (гликодезоксихолат натрия), таурохолевая кислота (таурохолат натрия), тауродезоксихолевая кислота (тауродезоксихолат натрия), хенодезоксихолевая кислота (хенодезоксихолат натрия), урсодезоксихолевая кислота (UDCA), тауро-24,25-дигидрофузидат натрия (STDHF), гликодигидрофузидат натрия и полиоксиэтилен-9-лауриловый эфир (РОЕ) (Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, page 92; Swinyard, Chapter 39 In: Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed., Gennaro, ed., Mack PublishingCo., Easton, Pa., 1990, pages 782-783; Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990,7, 1-33; Yamamoto et al., J. Pharm. Exp. Ther., 1992, 263, 25; Yamashita et al., J. Pharm. Sci., 1990, 79, 579583). Хелатообразующие агенты. Хелатообразующие агенты, используемые в соответствии с настоящим изобретением, могут быть определены как соединения, удаляющие ионы металла из раствора посредством образования комплексов с этими ионами, что приводит к повышению уровня абсорбции дцРНК через слизистую. Хелатообразующие агенты, если они используются в качестве усилителей пенетрации согласно изобретению, имеют дополнительные преимущества, заключающиеся в том, что они служат в качестве ингибиторов ДНКазы,поскольку большинству охарактеризованных ДНК-нуклеаз для катализа требуются ионы двухвалентного металла, а поэтому такие ДНК-нуклеазы ингибируются хелатообразующими агентами (Jarrett, J. Chromatogr., 1993, 618, 315-339). Подходящими хелатообразующими агентами являются, но не ограничиваются ими, динатрийэтилендиаминтетраацетат (EDTA), лимонная кислота, салицилаты (например, салицилат натрия, 5-метоксисалицилат и гомованилат), N-ацильные производные коллагена, лаурет-9 и Nаминоацильные производные бета-дикетонов (енамины) (Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic DrugCarrier Systems, 1991, page 92; Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, 133; Buur et al., J. Control Rel. , 1990, 14, 43-51). Вещества, не являющиеся поверхностно-активными веществами и не образующие хелатных комплексов. Используемые в настоящем описании усилители пенетрации, не являющиеся поверхностноактивными веществами и не образующие хелатных комплексов, могут быть определены как соединения,которые обладают незначительной активностью в качестве хелатообразующих агентов или поверхностно-активных веществ, но при этом усиливают абсорбцию дцРНК через слизистую пищеварительного тракта (Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1-33). Усилителями пенетрации этого класса являются, например, ненасыщенные цислические мочевины, производные 1-алкил- и 1-алкенилазациклоалканона (Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, page 92); и нестероидные противовоспалительные средства, такие как диклофенак-натрий, индометацин и фенилбутазон (Yamashita et al., J. Pharm. Pharmacol., 1987, 39, 621-626). В фармацевтические и другие композиции согласно изобретению могут быть также добавлены агенты, усиливающие поглощение дцРНК на клеточном уровне. Так, например, также известно, что катионные липиды, такие как липофектин (Junichi et al., патент США 5705188), катионные производные глицерина и поликатионные молекулы, такие как полилизин (Lollo et al., заявка РСТ WO 97/30731), также усиливают поглощение дцРНК клетками. Для усиления пенетрации вводимых нуклеиновых кислот могут быть использованы и другие агенты, включая гликоли, такие как этиленгликоль и пропиленгликоль, пирролы, такие как 2-пиррол, азоны и терпены, такие как лимонен и ментон. Носители дцРНК согласно изобретению могут быть получены в фармацевтически приемлемом носителе или разбавителе. Термин "фармацевтически приемлемый носитель" (также называемый в настоящем описании "наполнителем") означает фармацевтически приемлемый растворитель, суспендирующий агент или любой другой фармацевтически инертный носитель. Фармацевтически приемлемые носители могут быть жидкими или твердыми и могут быть выбраны в соответствии со стандартными способами введения, так чтобы они обеспечивали желаемый объем, нужную консистенцию, соответствующий транспорт и другие химические свойства. Типичными фармацевтически приемлемыми носителями являются, например, но не ограничиваются ими, вода; физиологический раствор; связывающие агенты (например, поливинилпирролидон или гидроксипропилметилцеллюлоза); наполнители (например, лактоза и другие сахара, желатин или сульфат кальция); замасливатели (например, крахмал, полиэтиленгликоль или ацетат натрия); дезинтегрирующие агенты (например, крахмал или натрий-содержащий гликолят крахмала); и смачивающие агенты (например, лаурилсульфат натрия). Некоторые композиции согласно изобретению также включают соединения-носители. Используемые в настоящем описании термины "соединение-носитель" или "носитель" могут означать нуклеиновую кислоту или ее аналог, который является инертным (то есть, не обладает биологической активностью perse), но распознается как нуклеиновая кислота в in vivo процессах, которые снижают биологическую доступность нуклеиновой кислоты, обладающей биологической активностью, например, посредством разрушения биологически активной нуклеиновой кислоты или стимуляции ее удаления из кровотока. Совместное введение нуклеиновой кислоты и соединения-носителя, обычно с избытком последнего, может приводить к значительному снижению количества нуклеиновой кислоты, высвобождаемого в печень,почки или в другие объемные органы, не участвующие в кровообращении, что, вероятно, обусловлено конкуренцией соединения-носителя и нуклеиновой кислоты за связывание с их общим рецептором. Так,например, высвобождение частично фосфортиоатной дцРНК в ткань печени может быть уменьшено при совместном введении с полиинозиновой кислотой, сульфатом декстрана, полицитидиновой кислотой или 4-ацетамидоо-4'-изотиоциано-стильбен-2,2'-дисульфоновой кислотой (Miyao et al., DsRNA Res. Dev.,1995, 5, 115-121; Takakura et al., DsRNANucl. Acid Drug Dev., 1996, 6, 177-183). Наполнители В отличие от соединений-носителей, "фармацевтический носитель" или "наполнитель" представляет собой фармацевтически приемлемый растворитель, суспендирующий агент или любой другой фармакологически инертный носитель для доставки одной или нескольких нуклеиновых кислот животному. Наполнитель может быть жидким или твердым и может быть выбран в соответствии со стандартными способами введения так, чтобы он обеспечивал желаемый объем, нужную консистенцию и т.п. в комбинации с нуклеиновой кислотой и с другими компонентами данной фармацевтической композиции. Типичными фармацевтическими носителями являются, но не ограничиваются ими, связывающие агенты(например, кукурузный крахмал, набухающий в холодной воде, поливинилпирролидон или гидроксипропилметилцеллюлоза и т.п.), наполнители (например, лактоза и другие сахара, микрокристаллическая целлюлоза, пектин, желатин, сульфат кальция, этилцеллюлоза, полиакрилаты или гидрофосфат кальция и т.п.); замасливатели (например, стеарат магния, тальк, двуокись кремния, коллоидный диоксид кремния, стеариновая кислота, стеараты металлов, гидрогенизированные растительные масла, кукурузный крахмал, полиэтиленгликоли, бензоат натрия, ацетат натрия и т.п.); дезинтегрирующие агенты (например, крахмал, натрийсодержащий гликолят крахмала); и смачивающие агенты (например, лаурилсульфат натрия и т.п.). Для приготовления композиций согласно изобретению могут быть также использованы фармацевтически приемлемые органические или неорганические наполнители для непарентерального введения,которые не вступают в нежелательную реакцию с нуклеиновыми кислотами. Подходящими фармацевти- 28019531 чески приемлемыми носителями являются, но не ограничиваются ими, вода, солевые растворы, спирты,полиэтиленгликоли, желатин, лактоза, амилоза, стеарат магния, тальк, кремниевая кислота, вязкое вазелиновое масло, гидроксиметилцеллюлоза, поливинилпирролидон и т.п. Препараты для местного введения нуклеиновых кислот могут включать стерильные и нестерильные водные растворы, безводные растворы в стандартных растворителях, таких как спирты, или растворы нуклеиновых кислот в жидких или твердых масляных основах. Эти растворы могут также содержать буферы, разбавители и другие подходящие добавки. Могут быть также использованы фармацевтически приемлемые органические или неорганические наполнители, подходящие для непарентерального введения и не вступающие в нежелательные реакции с нуклеиновыми кислотами. Подходящими фармацевтически приемлемыми наполнителями являются, но не ограничиваются ими, вода, солевые растворы, спирты, полиэтиленгликоли, желатин, лактоза, амилоза, стеарат магния,тальк, кремниевая кислота, вязкое вазелиновое масло, гидроксиметилцеллюлоза, поливинилпирролидон и т.п. Другие компоненты Композиции согласно изобретению могут также содержать и другие вспомогательные компоненты,обычно присутствующие в фармацевтических композициях на их обычных установленных уровнях. Так,например, такие композиции могут содержать дополнительные совместимые фармацевтически активные вещества, такие как, например, противозудные средства, вяжущие средства, местные анестетики или противовоспалительные средства, либо они могут содержать дополнительные вещества, используемые при физическом приготовлении различных лекарственных форм композиций согласно изобретению, такие как красители, ароматизаторы, консерванты, антиоксиданты, агенты, придающие непрозрачность,загустители и стабилизаторы. Однако, такие вещества, при их добавлении, не должны оказывать какоелибо негативное воздействие на биологическую активность компонентов композиций согласно изобретению. Такие композиции могут быть стерилизованы и, при желании, они могут быть смешаны с добавками, такими как, например, замасливатели, консерванты, стабилизаторы, смачивающие агенты, эмульгаторы, соли, влияющие на осмотические давление, буферы, красители, отдушки и/или ароматические вещества и т.п., которые не оказывают какого-либо негативного воздействия на нуклеиновую(ые) кислоту(ы) данной композиции. Водные суспензии могут содержать вещества, повышающие вязкость суспензии, включая, например, натрий-содержащую карбоксиметилцеллюлозу, сорбит и/или декстран. Такая суспензия может также содержать стабилизаторы. Комбинированная терапия В одном из аспектов изобретения композиция согласно изобретению может быть использована в комбинированной терапии. Термин "комбинированная терапия" включает введение рассматриваемых соединений в комбинации с другими биологически активными ингредиентами (такими как, но не ограничивающимися ими, второе и другое противоопухолевое средство) и проведение нелекарственной терапии (такой как, но не ограничивающейся ими, хирургическая операция или лучевая терапия). Так, например, соединения согласно изобретению могут быть использованы в комбинации с другими фармацевтически активными соединениями, а предпочтительно, соединениями, усиливающими действие соединений согласно изобретению. Соединения согласно изобретению могут быть введены одновременно (в виде одного препарата или отдельных препаратов) или после проведения другой терапии лекарственными средствами. В общих чертах комбинирования терапия предусматривает введение двух или более лекарственных средств за один цикл или курс терапии. В одном из аспектов изобретения рассматриваемые соединения могут быть введены в комбинации с одним или несколькими отдельными средствами, которые модулируют протеинкиназы, участвующие в развитии различных патологических состояний. Примерами таких киназ могут быть, но не ограничиваются ими, серин/треонин-специфические киназы; киназы, специфичные к тирозиновому рецептору; и киназы, специфичные к нетирозиновому рецептору. Сериновыми/треониновыми киназами являются активированные митогеном протеинкиназы (МАРК), мейоз-специфичная киназа (МЕК), RAF и киназа Аврора. Примерами семейств киназных рецепторов являются рецептор эпидермального фактора роста(EGFR) (например, HER2/neu, HER3, HER4, ErbB, ErbB2, ErbB3, ErbB4, Xmrk, DER, Let23); рецептор фактора роста фибробластов (FGF) (например, FGF-R1, GFF-R2/BEK/CEK3, FGF-R3/CEK2, FGF-R4/TKF,KGF-R); рецептор фактора роста/рассеяния гепатоцитов (HGFR) (например, MET, RON, SEA, SEX); инсулиновый рецептор (например, IGFI-R); Eph (например, СЕК 5, СЕК 8, ЕВК, ЕСК, ЕЕК, ЕНК-1, ЕНК-2,ELK, EPH, ERK, HEK, MDK2, MDK5, SEK) ; AxI (например, Mer/Nyk, Rse); RET; и рецептор тромбоцитарного фактора роста (PDGFR) (например, PDGF-R, PDGbbbb-R, CSF1-R/FMS, SCF-R/C-KIT, VEGFR/FLT, NEK/FLK1, FLT3/FLK2/STK-1). Семейство рецепторов, не являющихся тирозинкиназными рецепторами, включает, но не ограничивается ими, BCR-ABL (например, p43abl, ARG); ВТК (например,ITK/EMT, TEC); CSK, FAK, FPS, JAK, SRC, BMX, FER, CDK и SYK. В другом аспекте изобретения рассматриваемые соединения могут быть введены в комбинации с одним или несколькими агентами, которые модулируют некиназные биологические мишени или процессы. Такими мишенями являются гистон-деацетилазы (HDAC), ДНК-метилтрансфераза (DNMT), белки