Мультимер для иммуностимуляции

Изобретение относится к мультимерной некодирующей нуклеотидной молекуле для модуляции активности иммунной системы человека или животного, способу е получения и к вакцине, которая содержит мультимерную некодирующую нуклеотидную молекулу. Данное изобретение относится к мультимерной некодирующей нуклеотидной молекуле для модуляции активности иммунной системы человека или животного, способу е получения и к вакцине, которая содержит мультимерную некодирующую нуклеотидную молекулу. Хотя адаптивный иммунный ответ в результате селекции лимфоцитов, специфических к соответствующему патогену, и их клональной экспансии и дифференцировки в эффекторные клетки вырабатывается лишь с задержкой (3-5 дней), но затем он предоставляет длительную защиту от соответствующего патогена за счт формирования "иммунологической памяти", клетки естественной иммунной системы узнают патогены по патоген-ассоциированным молекулярным паттернам (РАМР) с помощью рецепторов, кодированных в зародышевых клетках, и сразу же отвечают. Реакции, различные для разных типов клеток, включают секрецию цитокинов (например, IL-1, IL-6, TNF-) и хемокинов (например, IL8/CXCL8, MIP-1/, MCP-1), активацию эффекторных механизмов (фагоцитоз, респираторный секрет,высвобождение бактерицидных веществ или литической гранулы), экспрессию костимулирующих молекул (CD80, CD86), а также повышенную экспрессию молекул МНС (главного комплекса гистосовместимости). С одной стороны, это рекрутирует и активирует эффекторные клетки, способные элиминировать проникший патоген, а с другой стороны, клетки адаптивной иммунной системы получают сигналы, необходимые для их активации. Для выработки повышенного иммунного ответа используют CpG олигонуклеотиды (CpG ODN) как новый класс иммуномодуляторов. Такие неметилированные CG мотивы встречаются в бактериальной ДНК и являются "сигналом опасности" для иммунной системы. Будучи "патоген-ассоциированными молекулярными паттернами" (РАМР), они вызывают, главным образом, неспецифическую активацию естественной иммунной системы (Krieg, Nat. Med 2003, 9: 831-835).CpG ODN индуцируют TH1-усиленный иммунный ответ через цитокины интерлейкин-12, интерферон- и фактор некроза опухолей . Иммуностимулирующие нуклеотидные последовательности (ISS), несущие вышеуказанные CpGODN, имеют в длину только несколько оснований и не функционируют через посредство экспрессии кодированных ими белков.ISS представляют собой нуклеотидные молекулы, замкнутые ковалентными связями. Они состоят из олигонуклеотидов, основания которых могут претерпевать частичное спаривание с самими собой, и одной или двух петель, которые содержат 30 оснований и нескольких CG мотивов, и ниже в данном описании именуются молекулы носителя (молекулярные носители). Мощная стимуляция клеточного иммунного ответа содействует усилению влияния на регуляторные циклы, которые в отсутствие воздействия вызывали бы иммунную активность, недостаточную для пациента. Модификация CpG ODN при содействии включающего фосфоротиоатные звенья скелета, используемая при стабилизации "CpG DNA" ("ДНК CpG"), имеет ряд недостатков, включая, в частности, наблюдаемую токсичность [Heikenwalder 2004, Levin 1999], а также неспецифическое связывание с белками [Brown 1994]. По этой причине был создан новый класс соединений (Европейский патент ЕР 1196178). Эти молекулы ДНК, имеющие две самокомплементарные области на 5'- и 3'-концах с перекрываниями палиндромов ("перевертышей", инвертированных повторов), так что лигирование двух молекул ДНК дат ковалентно замкнутую молекулу. Эти молекулы ДНК с CG мотивами в некомплементарной области показывает активность, аналогичную активности CpG ODN (повышенная экспрессия поверхностных молекулCD80, CD40, МНС на В клетках и секреция IL-6, IFN-, IFN-, IL-12, TNF- в РВМС), но по сравнению сCpG ODN с фосфоротиоатным скелетом имеют несколько отличный паттерн экспрессии и значительно более низкую токсичность в организме мышей. Однако эта иммуностимулирующая ДНК из предыдущего уровня техники имеет ряд недостатков в том, что касается модуляции активности иммунной системы человека или животных. Не всегда возможно модулировать, в особенности запускать, инициировать,активность иммунной системы человека или животного на заданном уровне. С учтом вышеуказанного положения предыдущего уровня техники задачей (целью) настоящего изобретения является создание подходящих иммуностимулирующих молекул ДНК, способных инициировать повышенный иммунный ответ, способа их получения, а также вакцин, содержащих указанные иммуностимулирующие молекулы ДНК. В контексте настоящего изобретения иммуностимуляция означает, что медиаторные и эффекторные клетки иммунной системы, а именно в особенности известные в настоящее время тимоциты, В клетки и так называемые NK (природные клетки-киллеры) клетки, макрофаги и моноциты, а также дендритные клетки и их предшественники, так же, как популяции клеток, при предположении функций в иммунной системе, функции которых ещ неясны, стимулируются таким образом, что наблюдается пролиферация,миграция, дифференцировка или активность за счт использования нуклеотидных молекул. Иммуномодуляция означает, что помимо общей стимуляции в описанном выше значении наблюдается также влияние иммунной реакции на тип или характер либо за счт участия иммунной реакции в процессе возникновения или созревания, либо за счт изменения характера ранее известной реакции. Настоящее изобретение решает эту задачу путм создания мультимерной молекулы некодирующей нуклеиновой кислоты. Мультимерную молекулу можно получать методом, включающим следующие стадии: получение 5'-фосфорилированной последовательности олигодезоксирибонуклеиновой кислоты в воде,лиофилизация до получения сухого остатка с последующим ресуспендированием в буферном растворе,добавление Т 4 ДНК лигазы, при этом образуется реакционная смесь,инкубация реакционной смеси при 37 С в течение по меньшей мере 30 мин. Самое удивительное, что в результате последовательности вышеуказанных стадий получают мультимерную молекулу, которая более подходит для применения с целью модуляции активности иммунной системы человека или животных, чем молекулы предыдущего уровня техники. Мультимерная молекула в значении по настоящему изобретению является практически молекулой дезоксирибонуклеиновой кислоты, причм указанная нуклеотидная молекула предпочтительно имеет в длину по меньшей мере 100 нуклеотидов, более предпочтительно 200, особенно предпочтительно более 300. В то время как в Европейском патенте ЕР 1196178 раскрываются молекулы, которые с учтом их структуры типа стебельпетля можно называть мономерами, способ по изобретению предусматривает молекулы, в которых несколько таких мономерных структур стебель-петля объединяются в мультимерные или олигомерные структуры. Удивительно то, что полученные соединения (результаты сборки) эффективно модулируют иммунную систему. Поразительно, что сами по себе (per se) простые и обычные стадии лабораторных методов, указанные выше, приводят в результате к образованию эффективных структур. По сравнению со структурами в соответствии с Европейским патентом ЕР 1196178 мультимерные молекулы по данному изобретению представляют собой более высокомолекулярные комплексы. В предпочтительном варианте изобретения олигомерное или мультимерное соединение (результат сборки), а именно молекула по данному изобретению, характеризуется тем, что последовательность олигодезоксирибонуклеиновой кислоты содержит следующие последовательности: а) GTTCCTGGAG ACGTTCTTAG GAACGTTCTC CTTGACGTTG GAGAGAAC, или б) ACCTTCCTTG TACTAACGTT GCCTCAAGGA AGGTTGATCT TCATAACGTT GCCTAGATCA,или в) представляет собой олигодезоксирибонуклеотидную последовательность, имеющую последовательность оснований AACG TTCTTCGGGG CGTT,г) указанная олигодезоксирибонуклеотидная последовательность имеет в длину 40-1600 нуклеотидов. Мультимерные соединения (результаты сборки) в значении по настоящему изобретению, которые включают предпочтительные последовательности, особенно пригодны для стимуляции активности иммунной системы домашних животных и людей. В предпочтительном варианте изобретения последовательность оснований по признаку в) включена в последовательность CCTAGGGGTT АССАССТТСА TTGGAAAACG TTCTTCGGGG CGTTCTTAGGTGGTAACC. Поразительно, что присутствие вышеприведнной последовательности имеет следствием особенно высокий эффект молекулы, причм этот эффект в значении по изобретению следует понимать как активацию иммунной системы. В другом предпочтительном варианте изобретения предусматривается, что молекула содержит частично однонитевую, ковалентно замкнутую цепь дезоксирибонуклеозидных остатков. Именно частично однонитевая ковалентно замкнутая цепь дезоксирибонуклеозидных остатков в сборной олигомерной или полимерной структуре молекулы ответственна за пролонгированную высокую активность молекулы в организме-мишени, в который она включена. В другом предпочтительном варианте изобретения предусматривается, что молекула содержит последовательность оснований N1N2CGN3N4, где N1N2 обозначает какой-либо член из группы GT, GG, GA,AT и АА, N3N4 обозначает какой-либо член из группы СТ или ТТ, а С обозначает дезоксицитозин, G обозначает дезоксигуанозин, А обозначает дезоксиденозин и Т обозначает дезокситимидин. В особенно предпочтительном варианте изобретения предусматривается, что последовательность оснований N1N2CGN3N4 расположена в однонитевой области замкнутой цепи дезоксирибонуклеозидных остатков. В частности, эти предпочтительные молекулы, которые проявляют самую высокую эффективность при стимулировании иммунной системы. Данное изобретение относится также к молекуле по изобретению, связанной ковалентными связями с рядом заместителей, причм указанные заместители предпочтительно являются пептидами, белками,сахаридами, антигенными структурами, молекулами ДНК и/или РНК. Изобретение также относится к комбинированному агенту, содержащему по меньшей мере одну молекулу по изобретению и один химиотерапевтический агент. Как ни удивительно, невероятно высокий уровень стимуляции иммунной системы молекулой по изобретению можно даже повысить, если агент по изобретению объединить с хорошо известным химиотерапевтическим агентом и комбинированный агент используют против опухолей. Комбинированный агент в значении по изобретению можно также приготовить в виде набора, в котором агент по изобретению и химиотерапевтический агент из предыдущего уровня техники присутствуют по отдельности. Так, в предпочтительных вариантах изобретения по меньшей мере два компонента из набора можно вводить одновременно или в разное время. Например,введение комбинированного агента по изобретению может активировать иммунную систему таким образом, что введнный затем химиотерапевтический агент может проявить особенно высокую активность. Очевидно, можно также сначала вводить в организм человека или животного химиотерапевтический агент, а спустя некоторое время можно ввести молекулу по изобретению. В случае определнных опухолей предпочтительно одновременное введение молекулы по изобретению и химиотерапевтического агента. В предпочтительном варианте изобретения химиотерапевтический агент выбирают из группы,включающей антитела, алкилирующие агенты, платиновые аналоги, интеркалирующие агенты, антибиотики, ингибиторы митоза, таксаны, ингибиторы топоизомераз, антиметаболиты и/или L-аспарагиназу,гидроксикарбамид (гидроксимочевину), митотан и/или аманитины. В предпочтительном варианте изобретения алкилирующие агенты выбирают из группы, включающей производные азотного мустина, в особенности циклофосфамид, ифосфамид, трофосфамид, мельфалан и/или хлорамбуцил, алкилсульфонаты, в особенности бусульфан и/или треосульфан нитрозомочевины, в особенности кармустин, ломустин, нимустин, эстрамустин и/или стрептозотоцин, прокарбазин и дакарбазин, темозоломид и/или тиотеп. Алкилирующие агенты оказывают особенно сильное действие на опухоли, тем самым ингибируя их рост. В предпочтительном варианте изобретения платиновые аналоги выбирают из группы, включающей цисплатин, карбоплатин и/или оксалиплатин. В другом предпочтительном варианте изобретения предусматривается, что интеркалирующие агенты выбирают из группы, включающей антрациклины, в особенности доксорубицин (адриамицин), даунорубицин, эпирубицин и/или идарубицин, митоксантрон, амсакрин и/или доксофлуридин. В другом предпочтительном варианте изобретения предусматривается, что антибиотики выбирают из группы, включающей блеомицин, актиномицин D (дактиномицин) и/или митомицин. В другом предпочтительном варианте изобретения, возможно, удобнее выбирать ингибиторы митоза из группы, включающей алкалоиды Vinca rosea, в особенности винорелбин, винкристин (онковин),винбластин и/или виндезин. В другом, особенно предпочтительном варианте изобретения таксаны выбирают из группы, включающей паклитаксел и/или доцетаксел. Кроме того, может быть предпочтительным выбирать ингибиторы топоизомераз из группы, включающей ингибиторы топоизомеразы I, в особенности камптотецин, топотекан и/или иринотекан, и/или ингибиторы топоизомеразы II, в особенности этопозид, тенипозид. Предпочтительно также, чтобы антиметаболиты в отдельном варианте изобретения выбирались из группы, включающей антагонисты фолиевой кислоты, в особенности метотрексат, аналоги пиримидина,в особенности 5-фторурацил, капецитабин, цитозин арабинозид (цитарабин) и/или гемцитабин, аналоги пурина, в особенности 6-тиогуанин, пентостатин, азатиоприн, 6-меркаптопурин, флударабин и/или кладрибин. Изобретение также относится к набору, содержащему соединение ("молекулу") по изобретению и химиотерапевтический агент необязательно вместе с информацией относительно смешивания (объединения) содержимого набора. Как указано выше, изобретение относится также к фармацевтическому агенту, содержащему соединение (молекулу) по изобретению, или комбинированному агенту, необязательно совместно с фармацевтически приемлемым носителем. Кроме того, изобретение относится к применению указанной молекулы (соединения), комбинированного агента или фармацевтического агента для получения агента для модуляции иммунной системы человека или животного или для модуляции активности такой иммунной системы. Под модуляцией иммунной системы человека или животного понимают любое воздействие на иммунную систему, которое приводит в результате к ингибирующему действию иммунной системы на опухоли или раковые заболевания. Можно понимать, что модуляция активности иммунной системы является синонимом или описывает активности иммунной системы, общеизвестные специалистам в данной области техники, которые направлены против опухолей и, как ни удивительно, усиливаются агентами по изобретению. Более конкретно, модуляция представляет собой стимуляцию или усиление эффектов, вызываемых иммунной системой, или самой иммунной системы. Так, в предпочтительном варианте изобретения агенты по изобретению можно использовать для стимуляции Т-клеточно-опосредованного иммунного ответа, но также и независимого от Т-клеток иммунного ответа. В предпочтительном варианте изобретения этот процесс может включать пролиферацию В клеток или активацию В клеток. В особенно предпочтительном варианте изобретения модуляция активности иммунной системы вызывает стимуляцию таким образом, что цитокины секретируются или повышается уровень их секреции. Возможно, особенно предпочтительно использовать соединение (молекулу) по изобретению или комби-3 017860 нированный агент по изобретению в качестве адъюванта при терапевтической или профилактической вакцинации. Особенно эффективно агенты по изобретению можно использовать при лечении нарушений роста клеток, и в предпочтительном варианте изобретения нарушение роста клеток представляет собой опухолевое заболевание. В предпочтительном варианте опухолевое заболевание представляет собой заболевание, выбранное из группы, содержащей опухоли уха, носа, горла, включая опухоли внутри носа,опухоли назального синуса, носоглотки, на губах, в полости рта, опухоли мезофаринкса (ротоглотки),гортани, гипофаринкса (подглоточника), уха, слюнных желез, и параганглиомы, опухоли лгких, включающие немелкоклеточные карциномы бронхов, мелкоклеточные карциномы бронхов, опухоли средостения, опухоли желудочно-кишечного тракта, включающие опухоли пищевода, желудка, поджелудочной железы, печени, желчного пузыря и желчных протоков, тонкого кишечника, колоректальные карциномы и анальные карциномы, опухоли мочеполовой системы, включая опухоли почек, мочеточника, мочевого пузыря, простаты, уретры, пениса и яичек, гинекологические опухоли, включая опухоли шейки матки, влагалища, вульвы, рак матки, злокачественную трофобластическую опухоль, карциному яичника, опухоли маточной трубы (фаллопиевой трубы), опухоли брюшной полости, карциному молочной железы, опухоли эндокринных органов, включая опухоли щитовидной железы, паращитовидной железы,коры надпочечника, эндокринные опухоли поджелудочной железы, карциноидные опухоли и карциноидный синдром, множественные эндокринные неоплазии, саркомы костных и мягких тканей, мезотелиомы, кожные опухоли, меланомы, включая кожные и внутриглазные меланомы, опухоли центральной нервной системы, опухоли детского возраста, включая ретинобластому, опухоль Вильмса, нейрофиброматоз, нейробластому, семейство опухолей типа саркомы Юинга, рабдомиосаркому, лимфомы, включая неходжкинские лимфомы, кожные Т-клеточные лимфомы, первичные лимфомы центральной нервной системы, болезнь Ходжкина, лейкозы, включая острые лейкозы, хронический миелоидный и лимфатический лейкозы, опухоли плазматических клеток, синдромы миелодисплазии, паранеопластические синдромы, метастазы с неизвестной первичной опухолью (синдром CUP), перитонеальный карциноматоз,злокачественное заболевание, связанное с иммуносупрессией, включая злокачественное заболевание,обусловленное СПИДом, такое как саркома Капоши, обусловленные СПИДом лимфомы центральной нервной системы, обусловленная СПИДом болезнь Ходжкина и обусловленные СПИДом анальногенитальные опухоли, злокачественное заболевание, обусловленное трансплантацией, метастазирующие опухоли, включая метастазы в мозг, метастазы в лгкие, метастазы в печень, метастазы в кости, метастазы в перикард и в плевру, и злокачественные асциты. Не предполагая ввести ограничение, изобретение более подробно объясняется далее со ссылкой на примеры. Оборудование, материалы и растворы, необходимые для отдельных методов, представлены при описании соответствующего метода. Нижеприведнные таблицы включают список оборудования и материалов, которые были использованы, и не относятся к конкретному методу, и химические реагенты и растворы, необходимые для приготовления растворов. Используемые оборудование, материалы, химические вещества и растворы Используемые ODSN и dSLIM, селекция последовательностей с применением программы "mfold". Многие из последовательностей, используемые для создания модельных молекул с целью исследования структуры dSLIM (ДНК-иммуномодуляторов на основе фосфородиэфиров), конструируют с применением программы "mfold", доступной в Интернете (http://www.bioinfo.rpi.edu/applications/mfold). Она представляет собой программу, применяемую для прогнозирования вторичной структуры нуклеотидов на основании термодинамических данных [Zuker, 2003]. Последовательности ДНК протяжнностью 58 нуклеотидов, называемые ниже в данном описании ODN, применяемые для синтеза dSLIM, вводят в виде линейной ДНК в программу "DNA mfold", используя стандартные настройки и следующие параметры: температура 37 С, концентрация ионов 150 мМ Na+ и 0,5 мМ Mg2+, коррекция олигомера. Последовательность dSLIM-30L1 используют в качестве основы для модельных молекул для исследования образования G структур. Сначала последние модифицируют таким образом, чтобы в них отсутствовали последовательные гуаниновые остатки, но при этом сохранялось GC соотношение комплементарной области(называемой далее в данном описании "стебель"). Последовательность некомплементарной области (называемой далее в данном описании "петля") модифицируют таким образом, чтобы предпочтительно не было возможно образование пар оснований по Уотсону-Крику и чтобы совсем отсутствовали последовательные остатки гуанина. В результате модификации петли CG мотивы, находящиеся в этой области,модифицируют по сравнению с 30L1. Модельные ODN, конструированные таким образом, далее в данном описании именуются KG. GL ODN соответствует KG с поли(G) последовательностью в петле, которая, в отличие от последовательности в 30L1, не находится внутри CG мотивов. MS ODN соответствует исходной молекуле 30L1, но содержит дополнительный остаток гуанина в стебле. GS, GLS и ML ODN включают комбинации стебля и петли вышеописанных ODN. Молекулы no30L1 и noGL, с заменой CG на TG в каждой, используют в качестве молекул для контроля зависимости наблюдаемого эффекта CG мотивов. Молекулу dSLIM-60L1 используют в качестве модельной молекулы "димерной" dSLIM-30L1,которая могла бы образовываться в результате конкатемеризации. Она состоит из двух частично комлементарных, но не самокомплементарных, ODN (60L1forw и 60L1rev), которые, после гибридизации, содержат 5'-выступ, к которым могут лигироваться другой ODN (30L1-AGGG) с соответствующим 3'выступом и самокомплементарные 5'- и 3'-области. Последовательности петель вышеуказанных 3 ODN соответствуют последовательностям петель 30L1. Фракции dSLIM-30L1, полученные разделением большого количества dSLIM-30L1 в непрерывном градиенте NaCl методом ВЭЖХ, поставляет Melanie Rothe (Mologen AG).(исключения: М 362, 2006), растворяют в Н 2 О с концентрацией 3 г/л после очистки методом ВЭЖХ. Используемые ODN (фосфоротиоат: маленькие буквы) Благодаря ориентации своих сайтов связывания с четырьмя Н мостиками гуанин способен образовывать циклический квартет оснований с 8 Н мостиками (G квартет) за счт образования пар гуанингуанин. Поэтому последовательность ДНК, содержащая несколько последовательных гуаниновых нуклеотидов, способна образовывать тетрамерную спиральную структуру, в которой гуаниновые основания проявляют высокую степень планарности со специфическим стэкинг-взаимодействием. В зависимости от положения, числа и распределения гуаниновых нуклеотидов в последовательности возможно образование различных G структур, которые можно разделить на три группы: G2' ДНК (бимолекулярные параллельные или антипараллельные тетраплексы), G4' ДНК (мономолекулярные антипараллельные тетраплексы) или G4 ДНК (тетрамолекулярные параллельные тетраплексы). G4 ДНК способна образовывать самособирающиеся наноструктуры, четырхцепочечные ДНК, называемые "G wires". Помимо нескольких свободных гуаниновых остатков и их расположения и спаривания соседних оснований по УотсонуКрику, образование и стабильность G, последняя иногда бывает очень высокой, зависит от температуры,концентрации ДНК и присутствия различных катионов (например, Na+, K+, Mg2+, Ca2+). Например, структуры G4 структуры идентифицированы в последовательностях теломеров, сайтах переключения (свичсайтах) иммуноглобулиновых генов и в ДНК ВИЧ [Sen 1992, Marsh 1994, 1995]. Далее, получены различные мономерные и мультимерные молекулы, содержащие комбинации различных последовательностей петли и стебля. Каждый раз используют три последовательности петли и три последовательности стебля, включающие длинные, короткие поли(G) мотивы или не включающие эти мотивы, тем самым влияя на способность образования G структур. Стабильные G структуры могут образовываться в соответствующих условиях в коротких ODN (12-мер) только с четырьмя последовательными гуаниновыми основаниями. В более длинных ODN необходимы более длинные мотивы, так как возможность образования стабильных G структур позитивно коррелирует с относительным содержанием гуаниновых оснований в целой последовательности [Sen, 1992]. В случае молекул, содержащих длинные поли(G) мотивы, наблюдается повышенное образование мультимерных молекул. Также профили элюции этих молекул отличаются от профилей элюции молекул,не содержащих длинных поли(G) мотивов тем, что появляется два пика, причм пик при большем объме элюции соответствует распределению ДНК, обнаруживаемому в верхней части агарозного геля. Наиболее заметное изменение наблюдается для GL, молекулы, у которой поли(G) мотивы локализованы на петле. В этом случае два отчтливо разделнных пика можно различить в профиле элюции, где пик с большим объмом элюции имеет более высокую интенсивность, чем пик с меньшим объмом элюции. Для GL количество ДНК, диффузно распределнной в геле выше полосы мономера, сравнительно велико, распространяясь при распределении до кармана геля. Эти наблюдения позволяют сделать вывод, что в мультимерных комплексах присутствует относительно большое количество ДНК. Распределение пиков в профиле ВЭЖХ элюции и распределение ДНК после электрофореза в агарозном геле аналогичны в конструкциях, содержащих поли(G) мотивы в стебле (GS, MS). В их профиле элюции наблюдается маленький второй пик при больших объмах элюции и малозаметное однородное распределение ДНК выше полосы мономера в агарозном геле. Что касается паттерна (характера, рисунка) пика (ВЭЖХ) и распределения ДНК (агарозный гель), характер перемещения (миграции) в ВЭЖХ и агарозном геле, наблюдаемый для молекул с поли(G) мотивами в петле и в стебле (GLS), является промежуточным между GL и GS и MS. В профиле элюции наблюдаются два отдельных пика равной высоты, а количество ДНК, распределнной в верхней области геля, заметно выше, чем для молекул с поли(G) мотивами в стебле (GS иMS), но ниже, чем для GL. Следовательно, образованию мультимерных молекул особенно способствует расположение поли(G) мотивов в петле, как в случае с GL. Причиной этого является отсутствие конкуренции между образованием пары оснований по Уотсону-Крику и образованием G структур в однонитевой петле. Это необходимое условие также выполняется в GLS молекуле. Однако, в этом случае, поли(G) мотивы, как возможные партнры по взаимодействию, присутствуют как в стебле, так и в петле. Поэтому возможно образование внутримолекулярных G2 структур, а именно образующихся в значительной степени независимо от концентрации. В результате они составляют конкуренцию межмолекулярному образованию G структур, так что образование более высокомолекулярных комплексов уменьшается в случаеGLS по сравнению с GL. Самая низкая тенденция к образованию более высокомолекулярных комплексов наблюдается в молекулах с поли(G) мотивами в стебле, хотя поли(G) мотивы в этом случае длиннее, чем в GL. При равных количествах исходного вышеописанные характеристики не наблюдаются в мономерной молекуле 30L1, которая подобно GLS, имеет поли(G) мотивы в стебле и петле. Причиной этого является, с одной стороны, то, что поли(G) мотивы в этой молекуле короче, чем в мультимерных молекулах. С другой стороны, прогнозирование структуры с помощью программы "ДНК mfold" показывает повы-6 017860 шенную тенденцию к образованию пар оснований по Уотсону-Крику в петле, так что вероятность образования G структуры должна дополнительно уменьшаться. Однако как и мультимерные молекулы с длинными поли(G) мотивами, фракция F4, полученная из большого количества 30L1 при разделении методом ВЭЖХ, также показывает вышеописанное диффузное распределение ДНК в верхнем участке геля и остальной ДНК в карманах геля при электрофорезе в полиакриламидном геле (см. фиг. 3.1.9). Очевидно содержание высокомолекулярных комплексов G структур в 30L1 так мало, что их обнаружение возможно только, когда используют большие количества исходного. Напротив, доля ДНК в кармане не полностью исчезает в случае GL и GLS, которые имеют поли(G) мотивы в петле, и можно распознать паттерн дополнительной полосы. Вероятно, е образуют димеры или тетрамеры или не распавшиеся ODN, оставшиеся в агрегатах, которые перешли в раствор из агрегатов при денатурации и вс ещ связаны друг с другом за счт гуанин-гуанинового взаимодействия. Найденные экспериментально свойства показывают, что мультимерные молекулы с длинными поли(G) мотивами на самом деле образуются G структурами. Помимо появления однородного распределения ДНК в верхнем участке геля, указанные свойства включают появление регулярных полос после денатурации, как это наблюдается для GL и GLS в полиакриламидном геле. В отличие от полосы в верхней трети геля, которую выделяют из 30L1, полосы, наблюдаемые дляKL и ML, более не распознаются после денатурации (см. фиг. 3.1.6). Следовательно, это полосы димеров,которые образуются за счт взаимодействия пар оснований между двумя мономерными молекулами, и, в результате, могут легко разделяться с помощью термической денатурации. Предпочтительный их вид вKG и ML может определяться их общей последовательностью петли, которая содействует взаимодействию двух молекул. ВЭЖХ фракционирование большого количества 30L1 молекулы (соединения) дат 4 фракции, которые проявляют совершенно различный характер миграции (перемещения) в геле. Концентрация единичных фракций позволяет их растворять по отдельности, так что становятся видимыми несколько полос, не распознаваемых в геле. Характер миграции первой фракции соответствует характеру миграции, наблюдаемому для двух мономерных конформаций, характер миграции второй фракции соответствует характеру миграции, наблюдаемому для постоянной смеси обеих конформаций, где открытая конформация преобладает после денатурации этой фракции, и характер миграции третьей фракции в основном соответствует характеру миграции димерной молекулы, описанной выше. Имеющая чтко различаемые части ДНК, которые остались в кармане геля, четвртая фракция аналогична MS по своему характеру миграции. Сдвиг полосы, соответствующей димеру для 30L1 и фракции 3 30L1 в среде культуры клеток, по сравнению с величиной пробега в геле, наблюдаемой в воде, удивителен. Сравнение с гелем, окрашенным Кумасси голубым, показывает, что соответствующая полоса в среде выходит на том же уровне, что и более низкая полоса белка. Следовательно, можно предположить, что сдвиг полосы вызван связыванием димерной молекулы с белками. Характер миграции (пробега) полос, соответствующих конформациям мономера, слабо меняется при добавлении среды, только в случае GL наблюдается увеличение полосы, соответствующей "открытой" конформации. После инкубации при 37 С в течение пяти часов ранее наблюдавшееся диффузное распределение было видно в KG и 30L1, где интенсивность полосы, соответствующей "открытой" конформации, понижается для KG. В выбранных условиях открытая конформация немного предпочтительнее по сравнению с водным раствором. Через 27 ч инкубации в среде наблюдаемые интенсивности ДНК для ML и GL резко уменьшаются, и даже в случае KG наблюдается только низшая полоса с пониженной интенсивностью, тогда как в случае 30L1 наблюдается минимальное уменьшение интенсивности. Одним возможным объяснением этого является тот факт, что открытые конформации легче расщепляются, чем двухнитевые (двухцепочечные) конформации. Следовало изучить иммуностимулирующий эффект различных мономерных и мультимерных молекул путм определения концентраций IFN-, IFN- и IL-6 в супернатантах РВМС донорской человеческой крови после стимуляции этими молекулами. Тест-система, используемая для определения активности молекул с применением РВМС донорской человеческой крови, представляет собой в высшей степени сложную систему, в которой различные клетки могут влиять друг на друга за счт взаимодействия и/или секреции цитокинов, так что отнесение наблюдаемого ответа к конкретному типу клеток или реакционному пути едва ли возможно. Кроме того,имеются большие различия между результатами для отдельных доноров, поэтому необходимо большее число независимых тестов. Преимущество этой тест-системы состоит в том, что она ближе всего подходит к in vivo ситуации среди всех возможных общепринятых in vitro систем. Тесты показывают, что обнаружение активации используемых клеток представляет собой процесс,на который довольно сильное влияние оказывают условия культивирования клеток, так как IL-8/CXCL8 секретируются также в ответ на факторы, вызывающие стресс. В частности, это становится очевидным благодаря результатам, полученным на клетках, у которых среду не заменяли перед стимуляцией (см. фиг. 3.3.1) и где высокая концентрация IL-8/CXCL8 детектируется даже в нестимулированных клетках. Определяемое отношение концентрации хемокинов, измеряемой в нестимулированных клетках, к кон-7 017860 центрации хемокинов, измеряемой в стимулированных клетках, составляет 1.3 и, следовательно, является очень низким по сравнению с клетками, у которых заменяли среду. В последнем случае отношение равно 2.3. Следовательно, чтобы получить возможно более информативные результаты, в данном тесте особенно важно культивировать клетки практически в отсутствие клеточного стресса. По-видимому,клеточный стресс является причиной того, что результаты, полученные на клетках, стимулированных через 24 ч после засевания, являются не такими чткими, как результаты, полученные на клетках, выращенных до монослоя. Пассирование клеток и связанные с ним методы культивирования клеток вызывают сильный клеточный стресс. Как ясно из результатов испытания, относящегося к зависимости от времени стимуляции (см. фиг. 3.3.2), разницу в количестве секретированных цитокинов между нестимулированными и стимулированными клетками можно обнаружить только через 6 ч. Количество IL-8/CXCL8 увеличивается за время между 6 и 24 ч, тогда как увеличение за время от 24 до 48 ч очень мало. Активности молекул в тест-системе изучают в двух тестах, в которых наблюдается различия между отдельными используемыми молекулами (см. фиг. 3.3.3). Наивысшая секреция IL-8/CXCL8 в тесах индуцируется стимуляцией с помощью GL, эта стимуляция несколько выше, чем стимуляция, вызванная ODN 2006. Количество IL-8/CXCL8 после стимуляции с помощью KG и 30L1 немного ниже, причм KG проявляет несколько более высокую активность по сравнению с 30L1. Экспериментально определнная разница в активности этих различных мономерных и мультимерных молекул, возможно, вызвана наблюдаемыми структурными различиями. Так, можно показать, что KG и GL, по сравнению с 30L1, имеют тенденцию к открытой конформации области петли сCG мотивами, так что предпочтительной является их однонитевая форма. Как определил Rutz et al. методом поверхностного плазмонного резонанса, однонитевая ДНК связывается с TLR9 с более высокой аффинностью, чем двухнитевая ДНК [Rutz, 2004], что может быть причиной несколько более высокой активности KG и GL, по сравнению с 30L1. Однако CG мотивы различны даже в 30L1 и KG/GL, так что различная активность может быть вызвана различной аффинностью к рецептору различных CG мотивов.GL, молекула с наивысшей эффективностью, образующая агрегаты, проявляет наивысшую активность среди тестированных молекул в обоих тестах, что, вероятно, объясняется более прочным перекрстным связыванием (сшиванием) рецепторов с помощью высокомолекулярных комплексов. Однако повышенная активность GL в тестах на РВМС не наблюдается. С другой стороны, возможно, в иммуномодулирующую активность мономерных и мультимерных молекул вносят вклад рецепторы с другим паттерном распознавания, нежели наблюдаемый, находящиеся в более сложных системах РВМС, которые узнают другие структурные особенности (признаки) молекул. Так, например, возможно, что узнавание протекает также через рецепторы, специфические к другим нуклеотидам, такие как TLR8 или TLR7, вызывая при этом согласованный или модулирующий эффект. В заключение можно сказать, что конкретно присутствие поли(G) мотивов в петле мономерных молекул способствует образованию мультимерных комплексов. Кроме того, эти комплексы обладают высокой устойчивостью к термической денатурации. Для определения разницы между иммуномодулирующими эффектами различных конструкций последние используют в опытах по стимуляции РМВС. Результаты показывают, что мультимерные молекулы обладают особенно высокой активностью. Определение концентрации ДНК. Концентрацию ODN и мономерных молекул ДНК определяют, измеряя величину поглощения при 260 нм (A260). Именно ароматическое кольцо нуклеотидных оснований отвечает за поглощение при 260 нм, при этом отдельные основания имеют различные молярные коэффициенты поглощения(АGТС). В результате взаимодействий хромофор-хромофор поглощение двухнитевых нуклеиновых кислот ниже, чем однонитевых нуклеиновых кислот (гипохромный эффект). Для определения концентрации соответствующий объм раствора определяемой ДНК сначала разводят ТЕ буфером в пробирке (сосуде) Эппендорфа до конечного объма 300 мкл (ODN 1:200, dSLIM 1:100). Раствор ДНК переносят затем в кварцевую кювету и на фотометре определяют поглощение при 260 нм относительно ТЕ буфера. Концентрацию рассчитывают исходя из полученной величины поглощения по следующему уравнению: с (мкг/мл) = А 260 фактор разведенияфактор конверсии. Фактор конверсии является приблизительной величиной и предположительно равен 50 мкг/мл для двухнитевой ДНК и 33 мкг/мл для однонитевой ДНК. Вследствие участия двухнитевых областей в ODN и мономерных ДНК молекулах, применяют стандартизированный фактор конверсии 50 мкг/мл. Каждый раз делают двойные определения с раздельными разведениями, из них рассчитывают среднее значение. Получение мономерных молекул ДНК Для получения мономерных молекул ДНК используют стерильные (одноразовые) материалы и свежие буферные растворы или буферные растворы, очищенные стерильной фильтрацией после хранения при -20 С, с тем чтобы избежать загрязнения бактериями, так как на результаты стимуляции могут повлиять малые количества эндотоксинов. Первой стадией при получении мономерных молекул ДНК является лигирование двух ODN с помощью Т 4 ДНК лигазы. Т 4 ДНК лигаза катализирует образование фосфодиэфирной связи между 5'фосфатным и 3'-ОН концами в двухнитевой ДНК или РНК по тупым или липким концам. Кроме того,она может восстанавливать (репарация) однонитевые разрывы в двухнитевых ДНК, РНК или гибридах ДНК-РНК. Лигирование двух ODN происходит между 5'-фосфатным выступом одного ODN и 3'-концом другого ODN, при этом образуется кольцевая молекула. Аналогично, в результате этой реакции образуются мультимерные молекулы ДНК по изобретению. Исходное количество ODN для получения нужных молекул составляет 500-1000 мкг. Для лигирования ODN применяют в концентрации 0,55 г/л в 1 лигазном буфере. С этой целью их разводят водой для промывки (Aqua rinse) и добавляют соответствующее количество 10 лигазного буфера. После тщательного перемешивания добавляют такое количество Т 4 ДНК лигазы, чтобы получить отношение 0,01U/мкг ДНК. Партию для лигирования инкубируют на водяной бане при 37 С в течение 15-24 ч. Для разрушения нелигированных ODN используют расщепление с помощью Т 4. Т 7 ДНКполимераза представляет собой зависящую от матрицы ДНК полимеразу, которая катализирует синтез ДНК в направлении 5'-3', но также обладает 3'-5' экзонуклеазной активностью на одно- и двухнитевой ДНК, тем самым является пригодной для расщепления нелигированных ODN. Перед осуществлением Т 7 расщепления проверяют избыток лигирования. С этой целью 0,3 мкгODN, партию после лигирования и расщепление тестируемой Т 7 каждый раз разделяют на 3% агарозном геле (см. 2.4.1). Для тестирования Т 7 расщепления используют избыток Т 7 ДНК полимеразы в отношении 10 U/1,1 мкг ДНК в объме 21 мкл. Реакцию проводят в течение 1 ч при 37 С и заканчивают, нагревая до 70 С в течение 10 мин. Для расщепления Т 7 партию после лигирования разводят Aqua rinse и соответствующим количеством 10 лигазного буфера, так, чтобы концентрация ДНК составляла 0,3 г/л в 1 лигазном буфере. Добавляют количество Т 7 ДНК полимеразы, необходимое для того, чтобы соблюдалось отношение 0,03U/мкг ДНК. Эту загрузку инкубируют на водяной бане при 37 С в течение 15-24 ч. За ходом реакции следят, отбирая 0,3 мкг лигированной партии наряду с 0,3 и 0,9 мкг партии Т 7 расщепления на 3% агарозном геле. Очистка молекул (соединений) по изобретению. Очистку осуществляют анионообменной хроматографией. Метод основан на том, что в пористой матрице (неподвижная фаза) имеются положительно заряженные группы, которые взаимодействуют с отрицательно заряженными фосфатными группами нуклеиновых кислот при рН выше 2, так что последние связываются с неподвижной фазой. Сила взаимодействия зависит от величины рН, ионной силы подвижной фазы и отрицательных зарядов, имеющихся в молекуле. Незаряженные молекулы либо не взаимодействуют с неподвижной фазой, либо это взаимодействие отсутствует, и они быстро элюируются подвижной фазой с низкой ионной силой. При повышении ионной силы подвижной фазы молекулы, связанные с неподвижной фазой, вытесняются с колонки. В результате более сильного взаимодействия с неподвижной фазой нуклеотиды большего размера элюируются с колонки позже, чем нуклеотиды меньшего размера [Lottspeich, 19984 Mlhardt, 2003]. Для очистки в качестве неподвижной фазы используют ДМАЕ-фрактогель, полимерная смола с диметиламиноэтильными группами. Для разделения применяют NaCl в ступенчатом градиенте (0, 50, 100% 1 М NaCl). Перед началом процесса очистки все впускные и выпускные отверстия ВЭЖХ установки, в нерабочем состоянии заполненные 20% этанолом, сначала промывают Aqua rinse и заполняют колонку. С этой целью в колонку помещают 1,6-1,8 мл ДМАЕ, заполняют водой до крав и встряхивают колонку, чтобы гарантировать равномерное распределение. Затем колонку соединяют с ВЭЖХ устройством так, чтобы не было пузырьков воздуха. Колонку промывают при скорости потока 1 мл/мин до тех пор, пока не осядет содержимое колонки. Закрепляют верхний поршень на матрице таким образом, чтобы не проходили пузырьки, и вытесняют из колонки избыточную воду. Колонку снова связывают с ВЭЖХ хроматографом(устройством) и промывают при скорости потока 1 мл/мин, а возможное образовавшееся мртвое пространство между матрицей и поршнем удаляют, повторяя последнюю стадию. Собранную, подготовленную таким образом колонку, так же, как и ВЭЖХ хроматограф, последовательно уравновешивают буфером Т 20 при скорости потока 1 мл/мин. Равновесие в колонке устанавливают, используя примерно 10 кратный объм насадки (матрицы, носителя) в колонке, и проверяют с помощью полосок рНиндикаторной бумаги. Гамильтоновским шприцем загружаемые партии инъецируют в ВЭЖХхроматограф с помощью петли для образца объмом 2 мл. ВЭЖХ-хроматограф контролируют, используя протокол с программой, созданной для осуществления автоматического фракционирования. Однако в некоторых случаях выходящие побочные пики фракционируют вручную. Перед нанесением образца колонку уравновешивают двумя объмами колонки (CV), а затем, пропуская через колонку 5 CV Т 20 буфера, элюируют несвязанные молекулы (белки, нуклеотиды) с последующей элюцией слабо связанных молекул (ATP, ODN), используя 7 CV 50% T20N1000 буфера, и элюцией dSLIM, используя 7 CV 100%T20N1000 буфера. Скорость потока составляет 1 мл/мин. Затем колонку снова уравновешивают с помощью 10 CV T20 буфера перед нанесением следующего образца, а впускные и выпускные отверстия ВЭЖХ-хроматографа вручную промывают буфером. Соединения (молекулы), очищенные методом ВЭЖХ, концентрируют, применяя осаждение этанолом, и обессоливают. В присутствии одновалентных катионов нуклеиновые кислоты в спирте образуют нерастворимый осадок, который можно отделить центрифугированием. Значительную часть соосажднной соли можно удалить, промывая 70% этанолом, так как, в отличие от нуклеиновых кислот, соль в нм растворяется. Для увеличения выхода при работе с меньшими количествами нуклеиновых кислот, менее склонных к осаждению, можно их осаждать при низкой температуре и/или добавлять ионы Mg2+. Если это не помешает последующему применению, можно также добавлять носители, такие как тРНК или гликоген, которые повышают относительную концентрацию нуклеиновых кислот [Lottspeich, 1998; Mlhardt, 2003]. Для осаждения соответствующие фракции после очистки методом ВЭЖХ переносят в центрифужные пробирки Corex и добавляют 1/100 об. 1 М MgCl2, 1/10 об. 3 М раствора ацетата натрия и 2,5 об. 96% этанола. Загруженные партии смешивают и осаждают при 20 С в течение 2-24 ч. Партии последовательно центрифугируют при 10000 об/мин (11000 g) и 4 С в течение 30 мин, супернатант удаляют, промывают, добавляя 5 мл 70% этанола, и центрифугируют ещ в течение 10-30 мин при 10000 об/мин (11000 g) и 4 С. Супернатант удаляют, а осадок ДНК сушат на воздухе до тех пор, пока не исчезнет запах спирта. ДНК растворяют в 100-350 мкл Aqua rinse и переносят в стерильную реакционную пробирку (сосуд) на 1,5 мл. Объм для ресуспендирования определяют в зависимости от количества ДНК, используемой при приготовлении, таким образом, чтобы при выходе 50% концентрация составляла 1 г/л. Электрофорез на агарозном геле Электрофорез в геле является подходящим методом разделения и определения характеристик нуклеиновых кислот. Нуклеиновые кислоты, будучи заряжены отрицательно в широком диапазоне значений рН, подвергаются воздействию электрического поля в матрице, агарозной или полиакриламидной, и движутся к аноду. Скорость их движения (миграции) меняется в зависимости от их размера. Поведение нуклеиновых кислот (примерно, вплоть до 10 КБ (килобаз) в процессе электрофореза можно описать на основе двух теорий при их совместном применении. Ogstron скрининг основан на предположении, что нуклеиновые кислоты принимают сферическую форму и сталкиваются с гелеобразной матрицей тем чаще, чем больше объм (окружность) частицы, таким образом, движение более объмных молекул замедляется сильнее, чем малых. Согласно этой теории молекулы, диаметр которых больше диаметра пор геля,не должны мигрировать в геле. Теория рептационного движения предполагает, что нуклеиновые кислоты теряют свою сферическую форму в геле и движутся через гель, подобно змее, одним концом вперд, при таком движении более длинным молекулам требуется больше времени, чем коротким. Ввиду влияния размера на скорость движения нуклеиновых кислот, образование вторичных структур влияет на характер движения в геле. Так, например, характер движения плазмидной ДНК меняется в соответствии с е конформацией. Скорость миграции (движения) повышается от открытой (форма I) через линейную (формаIII), суперспиральную (форма II) к денатурированной (спиральной, скрученной) плазмидной ДНК. Для линейной двухнитевой (двухтяжевой) ДНК (форма III) в широком диапазоне существует корреляция между log10, длиной (в п.о.) и относительным путм миграции в геле, так что можно относительно точно определить размер исходя из стандартов длины. Детекцию нуклеиновых кислот в гелях можно осуществлять, используя этидия бромид, который ввиду его плоскостной (планарной) структуры включается в ДНК, так что возможно возбуждение флуоресценции под действием света в УФ-области (254-366 нм), излучение которой наблюдается в оранжевокрасной области (590 нм) [Lottspeich, 1998]. Агароза представляет собой полисахарид, который выделяют из морских водорослей, при охлаждении в водном растворе (1% (вес/об. он образует гели с относительно большими порами (около 150 нм). Объм пор обратно пропорционален концентрации агарозы. Агарозные гели пригодны для разделения нуклеиновых кислот 0,1-25 КБ в длину. Преимущество агарозных гелей заключается в их относительно широком диапазоне разделения и в том, что с ними легко работать. Однако разделение малых ДНК фрагментов происходит очень медленно. Подходящим для разделения меньших ДНК фрагментов является Sieve Agarose, дериватизированная форма агарозы [Lottspeich, 1998; Mhlhardt, 2003]. Для разделения ODN и молекул по изобретению используют 3% агарозный гель в буфере 1 ТАЕ с 0,125 мкг/мл этидия бромида. Используя систему BioRad, наносят гели на пластины для горизонтального гель-электрофореза (40 мл для малого количества геля с 8 карманами, 100 мл для большого количества геля с 20 карманами). Образцы для анализа наносят в 1 тест-буфере наряду со стандартами соответствующей длины (см. 2.4.3). Электрофорез проводят в буфере 1 ТАЕ при 120 V (В) в течение 30 мин. Гели фотографируют с помощью оборудования для гель-документирования. Электрофорез в чистом полиакриламидном геле (PAGE). Полиакриламидные гели получают радикальной сополимеризацией мономеров акриламида с применением N,N'-метиленбисакриламида в качестве отвердителя (сшивающего агента). Размер пор гелей находится в примерном диапазоне около 3-6 нм и зависит от общей концентрации акриламида (% Т =m акриламида + m бисакриламида (вес/об. и степени сшивания (% С = m бисакриламида/ m акриламида+m бисакриламида). Он снижается при повышении Т при постоянной С и достигает минимума при 5% С при постоянной Т. Полиакриламидные гели обладают очень хорошей разрешающей способностью, в особенности в отношении малых ДНК фрагментов ( 1 КБ). Однако диапазон разделения значительно ниже по сравнению с агарозным гелем. Диапазон разделения можно увеличить, если использовать градиентные гели. Более высокая разрешающая способность полиакриламидных гелей позволяет разделять различные конформации ДНК,которые, вследствие их разных форм, проявляют различный характер миграции (движения), на который может влиять температура и концентрация ионов. Найдено, что гели с 8% Т, 2,6% С являются оптимальными для разделения молекул, а гели с 12% Т,5% С в 1 ТВЕ - для разделения ODN. Горизонтальные гели наносят за день до электрофореза (15 мл/гельмал., 25 мл/гельбольш.) и хранят в холодильнике в течение ночи. Перед нанесением образца проводят преэлектрофорез гелей при 70 В (170 Вбольш.) до тех пор, пока не перестанет изменяться сила тока (10-11 мА). Образцы наносят в 1 тест-буфере вместе со стандартами соответствующей длины (см. 2.4.3) без добавления красителей. Для контроля за ходом электрофореза на отдельную дорожку наносят 1 красителя для загрузки. Электрофорез проводят в 1 ТВЕ при постоянной разнице потенциалов 70 В (170 Вбольш.) (9 В/см) и комнатной температуре и заканчивают, как только бромфенол голубой достигает нижнего конца геля (около 2 ч). По окончании электрофореза гели окрашивают в растворе этидия бромида в течение 10-15 мин и делают снимки с помощью оборудования для гель-документирования. При избыточном окрашивании фона гели отмывают в деминерализованной воде в течение 10-30 мин. Термическая денатурация и ренатурация для отнесения полос. Так как мономерные ДНК молекулы являются кольцевыми ДНК молекулами, у которых, подобно плазмидной ДНК, наблюдается сложный характер миграции в геле, отнесение полос в геле к конкретной конформации или конкретному размеру является непростым делом. Тот факт, что две различные конформации в отличие от молекул различного размера могут обратимо взаимно превращаться друг в друга,можно использовать в дифференцировке. Различные конформации имеют различную степень компактности (уплотнения) и, следовательно,характер их миграции в геле должен различаться, причм компактные формы ДНК часто проявляют более высокую подвижность в геле по сравнению с более объмными открытыми формами ДНК. Компактные формы превращаются в открытые формы при разрыве водородных мостиков. Для того чтобы сделать отнесения полос в полиакриламидном геле, молекулы термически денатурируют, нагревая при 95 С в течение 10 мин. Денатурированные образцы сразу же помещают на лд,чтобы предупредить ренатурацию. Для этой цели получают мастер-микс, который включает соответствующую молекулу dSLIM в концентрации 0,05 г/л в 1 ТЕ буфере. Партию делят пополам и 1 из половин партии нагревают, а другую половину оставляют при комнатной температуре. К образцам для нанесения на гель, взятым из этих партий, добавляют соответствующее количество 5 буфера для образцов и разделяют на чистом 8% полиакриламидном геле. Для наблюдения за ренатурацией оставшуюся партию денатурированного продукта делят ещ раз и затем инкубируют в течения 3 дней при 4 и 37 С соответственно. Оставшуюся неденатурированную партию хранят при 4 С и аналогично делят через 3 дня, одну часть денатурируют как описано выше, а другую часть хранят при комнатной температуре. К этим партиям прибавляют соответствующее количество 5 буфера для образцов и разделяют на чистом 8% полиакриламидном геле. Инкубация в среде для клеточных культур. Активность молекул проверяют in vitro на клетках РМВС и НЕК 293. Соединения (молекулы) растворяют скорее в белоксодержащей среде для клеточных культур, нежели в буфере, и инкубируют при температуре 37 С. Следовательно, целью является изучить влияние этих модифицированных параметров на структуру и стабильность молекул и ODN. Важным фактором, который может различными способами влиять на активность молекул ДНК, является неспецифическое связывание с белками. Связывание с белками меняет характер миграции ДНК при электрофорезе в неденатурирующем полиакриламидном геле (нативный (чистый) PAGE), так что можно распознать сдвиг полосы ДНК в присутствии белка. В большинстве случаев электрофоретическая подвижность комплекса ДНК-белок снижается по сравнению с ДНК; в случае ДНК миниколец электрофоретическая подвижность также может повышаться, если степень сжатия повышается за счт связывания с белком [Toulm, 1995]. С целью изучения молекул и ODN, применяемых в тестах по стимуляции с точки зрения их поведения в условиях, в которых проводят тесты по стимуляции, растворы ODN и молекул разводят средой до концентрации 1 мкМ и инкубируют в течение 5 ч или 24 ч при 37 С на нагревательном столике или после добавления соответствующего количества 5 буфера для образцов, непосредственно разделяют на полиакриламидном геле. Для сравнения наносят растворы ODN и молекул с соответствующим разведением в Н 2 О. Чтобы проверить, что наблюдаемые изменения вызваны присутствием белков, партии,включающие ODN и молекулы по изобретению, разводят до концентрации 1 мкМ в среде, к которой до- 11017860 бавлена FCS (эмбриональная (фетальная) телячья сыворотка). Для того чтобы сравнить пройденные в геле расстояния (дистанции) для полос ДНК и белков, что позволило бы сделать выводы относительно возможного связывания с белком, в гелях обнаруживают как ДНК, так и белки. Дополнительную детекцию белков проводят после детекции нуклеиновых кислот. Гели фиксируют в течение 30 мин в растворе для фиксации, а затем окрашивают в течение 30-60 мин в растворе Кумасси бриллиантового голубого. Избыток красителя удаляют инкубацией в растворе для обесцвечивания в течение ночи и делают снимки гелей с помощью оборудования для гель-документирования. Применяемые стандарты длины ДНК. Что касается стандартов длины, каждый раз наносится количество/мм ширины кармана, рекомендуемое производителем, в 1 буфере для образцов. Используют следующие стандарты:GeneRuler 100 bp DNA Ladder Plus (100 п.о. ДНК-лэддер) (MBI Fermentas),GeneRuler 50 bp DNA Ladder Plus (50 п.о. ДНК-лэддер) (MBI Fermentas),10 п.о. ДНК-лэддер (Invitrogen),25 п.о. ДНК-лэддер (Invitrogen). Культура клеток. Все операции с культурой клеток осуществляют в стерильных условиях, применяя стерильные материалы одноразового пользования. Условия в инкубаторе: 37 С, 5% СО 2, влажность 90%. Изучение иммуномодулирующего эффекта молекул в РВМС. Для изучения иммуномодулирующего эффекта мультимерных молекул методом ELISA определяют секрецию цитокинов лимфоцитами и моноцитами, выделенными из донорской человеческой крови. Исходным материалом для выделения лимфоцитов и моноцитов, также называемых мононуклеарными клетками (мононуклеарами) периферической крови (РВМС) = фракции мононуклеарных клеток периферической крови, является концентрат лейкоцитов, также называемый лейкоцитарной плнкой,который получают центрифугированием цельной крови, его поставляет DRK-Blutspendedienst BerlinWannsee. Используя центрифугирование в градиенте плотности Ficoll-Hypaque, можно отделить РВМС от других компонентов лейкоцитного концентрата (плазмы, тромбоцитов, эритроцитов, гранулоцитов). Среда для разделения Ficoll-Hypaque представляет собой раствор, включающий смесь Фиколла 400,сильно разветвлнного полимера мономеров сахарозы, сшитых с помощью эпихлоргидрина и диатризоата натрия (Hypaque) с плотностью 1,077 г/мл. Используя изопикническое центрифугирование среды для разделения с расположенным наверху слоем разведнного лейкоцитного концентрата, можно разделять компоненты по их плотности, получая при этом фракции, представленные на фиг. 2.5.1 [Luttmann, 2004]. Для выделения РВМС каждый лейкоцитный концентрат переносят в стерильный флакон на 250 мл и разводят 1:2 в PBS. Каждый раз 15 мл раствора Ficoll-Hypaque помещают в четыре центрифужные пробирки на 50 мл, осторожно, пипеткой на 10 мл сверху наливают слой, примерно 30 мл, смеси кровь-PBS и центрифугируют при 800 g в течение 20 мин, делая перерывы (общее время около 50 мин). Содержащую РВМС поверхность раздела осторожно отсасывают пипеткой на 5 мл и переносят в центрифужные пробирки на 50 мл, содержащие 20 мл холодного PBS. Для удаления примесей эритроцитов, Ficoll/Hypaque и тромбоцитов затем клетки отмывают в несколько стадий. В то время как все стадии вплоть до выделения РВМС проводят при комнатной температуре с тем, чтобы избежать агрегации тромбоцитов, стадии отмывки осуществляют при 4 С с целью предупреждения адгезии моноцитов к используемым материалам из пластика и, следовательно, их потери. На первой стадии отмывки клетки центрифугируют при 400 g в течение 8 мин при 4 С. Супернатант отсасывают, а клеточный осадок ресуспендируют в 5 мл холодного PBS и доводят до 45 мл холодным PBS. Последующие стадии отмывки проводят таким же образом, но центрифугируют при 300 g в течение 5 мин. Стадии отмывки повторяют до тех пор, пока супернатант не станет прозрачным, а осадок не станет жлтым (примерно 5-6 раз). Каждый раз клетки далее ресуспендируют в 5 мл холодной среды, объединяют и объм доводят до 30 мл,добавляя холодную среду. Число клеток определяют с помощью автоматического счтчика клеток с размером исключения 8 мкм и холодной средой доводят до концентрации 4106 клеток/мл. 600 мкл выделенных ранее РВМС с концентрацией 4106 клеток/мл помещают в каждую лунку 24 луночных планшетов для клеточных культур. Затем добавляют соответствующий объм испытуемых молекул (соединений) таким образом, чтобы концентрация в партии была равна 1 мкМ. Клетки инкубируют в течение 2 дней (42-48 ч) в инкубаторе. Суспензию клеток переносят в реакционную пробирку(сосуд) Эппендорфа и центрифугируют на микроцентрифуге Biofuge при 3000 об/мин в течение 4 мин. Полученный таким образом бесклеточный супернатант переносят в новую реакционную пробирку и либо непосредственно используют для определения концентрации цитокинов методом ELISA, либо оставляют храниться при -70 С. Культивирование клеток НЕК 293. Клетки выращивают во флаконах для клеточных культур 162 см. Их засевают при плотности 1,31,9105 клеток/см 2. После инкубации в инкубаторе в течение 2-3 дней клетки делят 1:3. С этой целью среду отсасывают, клетки отмывают с помощью 10 мл PBS, а затем инкубируют при комнатной темпера- 12017860 туре в течение 3-5 мин с последующим отделением при добавлении 5 мл раствора трипсин/EDTA. Реакцию прекращают, добавляя 5 мл среды. Клетки ресуспендируют и добавляют другую порцию - 5 мл среды. Каждый раз 5 мл клеточной суспензии либо оставляют в культуральном флаконе, либо переносят в новый флакон и добавляют 45 мл среды. Периодически перед отсасыванием среды некоторые клетки отделяют от дна флакона. В этом случае клетки переносят в стерильную центрифужную пробирку и центрифугируют при 300 г в течение 4 мин. Затем среду отсасывают и клетки ресуспендируют в 5 мл раствора трипсин/EDTA, добавляют 10 мл среды и переносят в новый культуральный флакон, как описано выше. Стимуляция клеток НЕК 293. Для проведения теста клетки HEK293-TLR9 и НЕК 293 null с концентрацией 0,6-1106 клеток/мл каждый раз засевают в объме 400 мкл в 24-луночные культуральные планшеты и культивируют в течение 1-5 дней. Число клеток определяют с помощью счтчика клеток с размером исключения 8 мкм и доводят до нужной концентрации. При продолжительном культивировании среду заменяют через 48 ч. С этой целью среду осторожно отсасывают и каждый раз к клеткам осторожно добавляют 400 мкл свежей среды. Также в некоторых партиях среду меняют непосредственно перед добавлением стимуляторов. Стимуляцию проводят, добавляя соответствующий объм ODN/молекул таким образом, чтобы достичь конечной концентрации 2,5 и 1 мкМ соответственно. LPS (липополисахариды) используют в концентрации 0,5 мкг/мл. Затем клетки различное время (6-48 ч) инкубируют в инкубаторе. Наконец, среду переносят в реакционные пробирки (сосуды) на 1,5 мл, центрифугируют на микроцентрифуге Biofuge при 1400 об/мин для осаждения предположительно включнных клеток, а супернатанты используют для определения концентрации IL-8 методом ELISA. Детектирование цитокинов/хемокинов методом ELISA. Для изучения иммуномодулирующего действия dSLIM на РВМС определяют индукцию IL-6, IFNи IFN-.IL-6 представляет собой многофункциональный цитокин, который секретируется различными активированными лимфоцитами и моноцитами и помимо индукции белков острой фазы в гепатоцитах оказывает промотирующее действие на рост, дифференцировку и фагоцитоз лимфоцитов [Kirchner, 1994].IFN-, который имеет несколько подтипов, относится к семейству интерферонов типа I, проявляющих, главным образом, антивирусный эффект. Большие количества IFN секретируются pDC после активации TLR7, 8 или 9 [Perry, 2005], см. также раздел 1.3.2.IFN- секретируется преимущественно NK и Т-клетками, но также моноцитами, дендритными клетками и В-клетками. Только интерферон типа II, в отличие от интерферонов типа I, проявляет скорее иммуномодулирующий, нежели антивирусный эффект. Помимо роли, которую он играет в дифференцировке, IFN- является наиболее важным эффекторным цитокином TH1-направленного иммунного ответа. Секрецию IL8/CXCL8 используют для детекции активации TLR9 в трансформированных НЕК 293 клетках. IL-8 представляет собой СХС хемокин, секретируемый лейкоцитами, но также фибробластами,эндотелиальными и эпителиальными клетками. Индукция IL8/CXCL8 протекает, например, через IL-1 иTNF-, но также через PRR и внешние факторы (факторы окружающей среды), такие как гипоксия. Экспрессию IL8/CXCL8 регулируют, регулируя транскрипцию за счт совместной активации NF- и АР-1 и уровня мРНК стабильности. Помимо его действия в качестве активатора нейтрофилов, IL8/CXCL8 оказывает хемотаксическое действие на различные лейкоциты и участвует в процессе трансмиграции лейкоцитов в тканях [Mukaida, 2003]. Для обнаружения цитокинов в супернатантах клеточных культур клеток РВМС и НЕК 293 используют твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA) в виде метода "сэндвич-ELISA". Он представляет собой количественный иммуноанализ, в котором антитела, специфические к детектируемому белку,иммобилизуют на поверхности микротитрационного планшета с помощью адсорбции. Связывание антигена с соответствующим антителом, точно так же иммобилизует первый, а другие компоненты можно удалить отмывкой. Связывание антигена и антитела является равновесной реакцией, так что количество связанного антитела зависит от концентрации. Обнаружение антигена осуществляют, используя второе специфическое биотинилированное антитело, которое, в свою очередь, связывается с конъюгированным со стрептавидином ферментом, применяемым для обнаружения. В анализе по данному описанию фермент представляет собой пероксидазу хрена (HRP). Действительное измеряемое количество представляет собой количество (концентрацию) хромогенного субстрата, реагирующего при участии фермента за определнный промежуток времени. Субстратом, используемым в данном описании в качестве субстрата,используют ТМВ (3,3',5,5'-тетраметилбензидин), который окисляется в присутствии Н 2 О 2, поглощая свет с длиной волны 370 нм (синий). Реакцию прекращают, добавляя H2SO4, при этом длина волны поглощения становится 450 нм (жлтый) [Luttmann, 2004]. Применяя стандартные серийные разведения известной концентрации определяемого цитокина, можно таким образом определить неизвестные концентрации цитокинов в супернатантах клеточных культур. Необходимые пары антител, растворы стандартов, ферментов и субстратов получают от фирмыRD Systems в виде наборов. Оборудование и материалы для проведения эксперимента представлены вIL-6 и IFN-. Обнаружение IL-6 и IFN- в супернатантах культур клеток РВМС осуществляют, используя наборыDuoSet ELISA Development System от RD Systems в соответствии с прилагаемыми инструкциями. Для этой цели "иммобилизуемое антитело" разводят в PBS до концентрации 4 мкг/мл (IFN-) и 2 мкг/мл (IL6) соответственно и каждый раз 100 мкл помещают в лунки микротитрационного планшета. Планшет инкубируют при комнатной температуре в течение ночи, затем отмывают 3 раза буфером для отмывки,добавляют в каждую лунку по 300 мкл блокирующего буфера и инкубируют в течение 1-2 ч для насыщения свободных сайтов связывания. Планшет отмывают 3 раза отмывочным буфером и каждый раз затем 100 мкл образцов и стандартов помещают на планшет. Супернатанты применяют в разведении 1:2 в буфере для реагентов для детекции IL-6 и без разведения для детекции IFN-. Стандартные серийные разведения IL-6 содержат следующие концентрации: 12,5; 25; 50; 100; 200; 350; 700 пг/мл. Стандартные серийные разведения LFN- содержат следующие концентрации: 12,5; 25; 50; 100; 250; 500; 1000 пг/мл. В каждом случае определения делают в двойном повторе. Время инкубации составляет 2 ч. После трхкратной отмывки отмывочным буфером каждый раз 100 мкл "антитела для детекции" в концентрации 100 нг/мл (IL-6) и 200 нг/мл (IFN-) соответственно в буфере для реагента помещают на планшет. После инкубации в течение 2 ч планшет отмывают 3 раза отмывочным буфером и в каждую лунку помещают по 100 мкл конъюгата стрептавидин-HRP в разведении 1:200 в буфере для реагента. Время инкубации составляет 20 мин. После последней стадии трхкратной промывки каждый раз в планшеты добавляют 100 мкл раствора субстрата ("окрашивающего реагента" А и В в соотношении 1:1) и инкубируют в течение 20 мин в темноте. Реакцию заканчивают, добавляя 50 мкл 1 М H2SO4, а поглощение в каждой отдельной лунке определяют при 450 нм на ридере для микропланшет. Оценку осуществляют с помощью программы SoftMax Pro 2,6. Стандартную кривую рассчитывают по 4-параметрической модели.IFN-. Детекцию IFN- в супернатантах культур клеток РВМС осуществляют, используя набор Human Interferon- (человеческий интерферон-) ELISA от Biosource в соответствии с прилагаемыми инструкциями. В микротитрационные стрипы, входящие в состав набора, уже содержащие антитела и блокированные, добавляют 100 мкл стандартов и образцов и инкубируют в течение 1 ч при RT. Супернатанты используют в разведении 1:2 в буфере для разведения, и стандартные серийные разведения содержат следующие концентрации: 156; 312; 625; 1250; 2500; 5000 пг/мл. После стадии отмывки в каждую лунку добавляют 100 мкл концентрата антитела D в буфере для разведения С и инкубируют в течение 1 ч при комнатной температуре. Планшеты отмывают 3 раза и в каждый планшет добавляют 100 мкл HRP в разбавителе HRP и инкубируют в течение 1 ч. Раствор удаляют, отмывают 4 раза и в каждую лунку пипеткой добавляют по 100 мкл раствора субстрата G. Их инкубируют в темноте в течение 20 мин и реакцию заканчивают, добавляя 100 мкл стоп-раствора Н. Поглощение при 450 нм на ридере для микропланшет. Оценку осуществляют с помощью программы SoftMax Pro 2,6. Стандартную кривую рассчитывают по двухточечной модели.IL-8/CXCL8. Детекцию IL-8/CXCL8 в супернатантах культур клеток НЕК 293 проводят, используя набор DuoSetELISA Development System от RD Systems в соответствии с прилагаемыми инструкциями аналогично детекции, описанной для IL-6 и IFN-. Стандартные серийные разведения содержат следующие концентрации: 31,25; 62,5; 125; 250; 500; 1000; 2000 пг/мл. Супернатанты используют без разведения. Антитела применяют в следующих концентрациях: иммобилизуемое антитело 4 мкг/мл, антитело для детекции 20 нг/мл. Получение и описание мультимерных молекул ДНК. Для изучения влияния структурных особенностей, в частности, таких, которые способствуют образованию G структур, методами по изобретению получают комбинации мономерных молекул ДНК с поли(G) мотивами в различных областях, эти методы, помимо лиофилизации, соответствуют методам получения мономеров. Для этой цели каждый раз объединяют три различных последовательности для стебля (S) и петли (L), которые, с одной стороны, отличаются числом и локализацией гуаниновых оснований, но также вторичной структурой петли, предсказанной с помощью программы "DNA mfold". Отдельные последовательности и их структурные особенности представлены в нижеприведнной таблице. На следующей диаграмме дан общий обзор используемых комбинаций и их обозначение, используемое ниже в данном описании. Таблица 3.2 Обозначение (номенклатура) молекул с различными комбинациями петля/стебель Как показано выше, полимерные молекулы dSLIM, которые в значении по изобретению можно также называть мультимерными молекулами или олигомерными молекулами, очень подходят для индукции усиленного иммунного ответа в организме. Усиленный иммунный ответ позволяет успешно использовать агенты в сочетании с химиотерапевтическими агентами. В сравнении с аддитивным эффектом двух агентов комбинация химиотерапевтических агентов и агентов по изобретению вызывает синергический эффект при лечении опухолей. Благодаря комбинации с агентом по изобретению, который можно получать с применением описанных выше стадий процесса (см. основной пункт "Формулы изобретения"), все эффекты дополнительных химиотерапевтических или цитостатических агентов усиливаются. Хотя мономерные формы молекул dSLIM уже объединяли с химиотерапевтическими или цитостатическими агентами, эффект, достигаемый при объединении мультимерной или полимерной формыdSLIM с цитостатическими агентами, совершенно удивителен. При применении комбинированного агента, содержащего мономерную форму dSLIM, и цитостатических агентов на практике было найдено, что можно улучшить только конкретные свойства цитостатических агентов, но не их общие свойства, как в случае полимерной формы. Также поразительно, что активация иммунной системы полимерной/мультимерной формой dSLIM выше, так что при лечении опухолей можно достичь значительно лучшего общего результата по сравнению с результатом, полученным при применении мономерной формы цитотоксических агентов. Так, в частности, образование метастаз предупреждается при введении в организм мультимерных молекул dSLIM, когда вместе с этими агентами вводят цитостатические агенты/химиотерапевтические агенты. Под объединением (комбинированием) по данному изобретению понимают одновременное, а также разнеснное во времени, введение обоих агентов. На фиг. 3.1.1. приводятся в качестве примера две различные вторичные структуры молекул dSLIM 30L1 (такие как MS) и KG (такие как ML, GS, GL, GLS) для последовательностей трх петель, рассчитанные с помощью программы "DNA mfold". В отличие от 30L1, для KG не предсказывается никакого спаривания оснований в петле в выбранных условиях. Получение различных мономерных и мультимерных молекул. На фиг. 3.1.2 показаны результаты разделения партий лигирования по 0,3 мкг и теста Т 7 расщепления различных dSLIM молекул наряду с 30L1 ODN в 3% агарозном геле. На всех дорожках, на которых происходило разделение различных молекул, можно видеть полосу немного ниже уровня, на котором находится фрагмент маркера 100 п.о., эта полоса соответствует мономерной молекуле. На дорожке, содержащей 30L1 ODN, видна полоса ниже полосы мономерных молекул. В случае молекул, содержащихL3 (GL, GLS), в верхней области геля до карманов можно видеть размытое изображение распределения ДНК, которое заметно сильнее для GL и слабее для GLS в партии Т 7 расщепления, нежели в партии лигирования. В случае молекул, содержащих длинные поли(G) мотивы (GL, GS, GLS, MS), полосы в геле относительно размыты по сравнению с другими молекулами (30L1, KG, ML). На дорожках, на которые нанесены пробы Т 7 расщепления, интенсивности флуоресценции, особенно в верхней области геля, ниже по сравнению с дорожками с нанеснными на них пробами лигирования. На фиг. 3.1.3 представлены хроматограммы последующей ВЭЖХ-очистки различных молекул. На каждой графически представлено поглощение при 260 нм (синяя линия) в зависимости от объма, прошедшего через колонку после инжекции разделяемого образца (пунктирная розовая линия). Зелной линией показан градиент NaCl буфера 0, 50 и 100% 1 М NaCl буфера (T20N1000). Первый пик с максимумом при 2,5 мл и 0% T20N1000 (F2) соответствует несвязанным молекулам, второй пик с максимумом при 8 мл и 50% T20N1000 (F3) соответствует молекулам с низкой аффинностью к неподвижной фазе (несмотря на нанесение в 12-кратном количестве по сравнению с фракцией F4, ни в каких фракциях совсем не обнаружено ДНК). Третий пик с максимумом при 14 мл и 100% T20N1000 (F4) соответствует мономерным молекулам. Фиг. 3.1.3 - ВЭЖХ-хроматограммы очистки различных мономерных и мультимерных соединенийa) 30L1, b) ML, с) KG, d) MS, e) GS, f) GLS, g) GL, колонка: 1 мл DMAE; применяемое количество: 700 мкг; скорость потока: 1 мл/мин; буфер А: 20 мМ трис (Tris), pH 7; буфер В: 20 мМ трис, 1 M NaCl,pH 7; градиент: 0, 50, 100 буфер В. При сравнении хроматограм различных молекул чтко видно, что F4 является единственным пиком для молекул, не содержащих поли(G) мотивов, а именно, ни S3, ни L3 (30L1, ML, KG). Напротив, имеется плечо в F4 для тех молекул, которые содержат S3. В случае молекул, содержащих L3 (GL, GLS), максимум имеет два пика с разной интенсивностью распределения в GL и GLS. В случае GLS оба парциальных максимума имеют примерно одинаковую интенсивность, тогда как для GL парциальный максимум,наблюдаемый при большем объме, имеет более высокую интенсивность, чем максимум при меньшем объме. "Побочные" ("боковые") максимумы или плечи фракционируют отдельно вручную. Фракции обозначают F1 и F2 в соответствии с хронологическим порядком их элюции. Вышеописанные фракции dSLIM, полученные в результате разделения методом ВЭЖХ, после осаждения этанолом, а именно конечные продукты, наносят на агарозный гель, представленный на фиг. 3.1.4. На всех дорожках полосу, соответствующую мономерным молекулам, можно видеть чуть ниже пробега маркера фрагмента 100 п.о. В случае ML и KG можно распознать вторую, более слабую полосу чуть выше этой полосы (маркера фрагмента 100 п.о.) с более высокой интенсивностью в случае ML. GL,MS и GLS проявляют несколько более высокую подвижность (мобильность) в геле, чем остальные молекулы. В случае молекул, не содержащих длинных поли(G) мотивов (30L1, KG, MS), выше полосы dSLIM можно рассмотреть непрерывное распределение интенсивности вплоть до уровня примерно 200 п.о. Кроме того, для KG и ML можно увидеть слабую полосу маркера фрагмента 200 п.о. Фиг. 3.1.4 - различные мономерные и мультимерные соединения (молекулы) после осаждения этанолом. 3% агарозный гель, нанеснное количество 0,3 мкг, маркер 100 п.о. 0,5 мкг (100 п.о., 30L1, 30L1,KG, ML, GL-F1, GL-F2, MS-F1, MS-F2, GS-F1, GS-F2, GLS-F1, GLS-F2, 100 п.о.) В случае молекул, для которых наблюдается многопиковое (многовершинное) распределение и максимумы фракционируют методом ВЭЖХ-очистки, каждая фракция 1 в основном соответствует полосе мономера, тогда как на дорожках с нанеснной на них фракцией 2 наблюдается в основном распределение интенсивности в широком диапазоне выше полосы мономера. В данной работе для MS и GS наблюдается одинаковое распределение интенсивности, начиная примерно от полосы мономера и до длины пробега, соответствующего 500 п.о. С другой стороны, в случае GL это распределение начинается выше 200 п.о., продолжаясь до кармана геля. Однако для GLS можно наблюдать распределение ДНК по всей дорожке, начиная от полосы мономера. Фиг. 3.1.6 - термическая денатурация различных мономерных и мультимерных молекул. Нативный (чистый) PAGE, 8% гель (2,6% С), наносимое количество (нагрузка) 0,25 мкг, маркер 25 п.о. 0,3 мкг (25 п.о., без обработки, денатурация 95 С в течение 10 мин: 30L1, MS, ML, KG, GS, GL-F2,GLS-F2). На изображении геля на фиг. 3.1.6 показано действие термической денатурации различных молекул на характер их миграции в геле. Для этой цели партии делят и часть нагревают при 95 С в течение 10 мин, сразу же охлаждают льдом и наносят. Наблюдаемые полосы соответствуют полосам в геле, описанным в разделе 3.1.5, но в этом случае неразделнная ДНК наблюдается в кармане геля для MS, а такжеGS, а вторая полоса видна в случае MS, она находится на том же уровне, что и вторая полоса 30L1. GS иMS включают партию, отличную от партии в геле на фиг. 3.1.5, где боковые максимумы в ВЭЖХфракционировании не отбирают по отдельности. Сравнение полос в геле с денатурированным и неденатурированным dSLIM показывает, что интенсивность первой полосы у всех соединений (молекул) после нагревания понижается, а второй полосы повышается. Полоса на дорожках с ML и KG, наблюдаемая в верхней трети гели, после денатурации больше не видна. Также после денатурации нельзя больше видеть ДНК в карманах дорожек, на которые нанесены MS и GS. Аналогично, на дорожках с GL-F2 и GLS-F2 количество ДНК в кармане снижается, но, с другой стороны, выше второй полосы видно основное число равномерно расположенных полос. Для того чтобы исследовать, являются ли изменения, вызванные денатурацией, обратимыми, денатурированные образцы делят на части и инкубируют в течение 3 дней при 4 и 37 С соответственно. Партии необработанного dSLIM хранят при 4 С, аналогичным образом через 3 дня делят на части и каждый раз одну аликвоту нагревают при 95 С в течение 10 мин и сразу же помещают на лд. Результаты нативного PAGE (в чистом геле), применяемого для разделения партий, представлены на фиг. 3.1.7 и 3.1.8. На изображениях необработанных и денатурированных образцов видно, что у них такой же характер миграции в геле, что и на фиг. 3.1.6. По своему характеру миграции денатурированные образцы, инкубированные при 4 С, соответствуют образцам, денатурированным непосредственно перед нанесением. Характер миграции в геле образцов, инкубированных при 37 С, в значительной степени соответствует характеру миграции необработанных образцов. Однако интенсивность второй полосы для 30L1, MS и GS больше,чем для вышеуказанных образцов. Другое различие для GS и MS наблюдается в количестве ДНК, остающегося в кармане геля, которое очень мало по сравнению с необработанным образцом. Фракции димерных и мономерных молекул 30L1. Чтобы определить, действительно ли полоса, видимая в верхней трети, представляет собой полосу,соответствующую димеру, фракцию (F3), полученную из большого количества мономерного соединения(мономерных молекул) разделением методом ВЭЖХ и содержащую эту полосу, наносят на нативныйPAGE вместе с димерным соединением (димерной молекулой) 60L1. Фиг. 3.1.9 - сравнение фракции 3 с димерным соединением (молекулой) 60L1. Нативный PAGE (электрофорез в чистом геле), 8% гель (5% С), наносимое количество (нагрузка) 0,25 мкг, маркер 25 п.о. 0,3 мкг (25 п.о., F3, F3 95 С, 60L1, 60L1 95 С, фракция 1 (F1), фракция 2 (F2),фракция 3 (F3), фракция 4 (F4), выделенные при ВЭЖХ-очистке dSLIM 30L1, 60L1). Наблюдаемые полосы находятся на одном уровне. При нанесении на гель образцов в денатурированном виде полосы находятся на более высоком уровне в геле по сравнению с дорожкой, на которую нанесены необработанные образцы. Соответствующие полосы нативного PAGE представлены на фиг. 3.1.9 вместе с результатами разделения четырх различных фракций мономера 30L1, полученных при фракционировании методом ВЭЖХ. Среда для инкубации, связывание белка. Для изучения влияния условий в клеточной культуре, в особенности присутствия белков, на молекулы, используемые для стимуляции, последние инкубируют в среде культур клеток в течение 0,5 и 27 ч при 37 С и разделяют наряду с молекулами (соединениями), растворнными в воде, методом нативногоPAGE. После окрашивания ДНК белки в среде детектируют окрашиванием Кумасси бриллиантовым голубым. Результаты представлены на фиг. 3.1.10. и 3.1.11. Фиг. 3.1.10 - инкубация мономерных молекул в среде. Нативный PAGE, 8% гель (5% С), наносимое количество (нагрузка) 0,25 мкг, маркер 25 п.о. 0,3 мкг,маркер 50 п.о. 0,3 мкг (50 п.о., 27, 5, 0 ч среда, Н 2 О: 30L1, ML, F3, KG, 25 п.о.). Нативный PAGE, 8% гель (2,6% С), наносимое количество (нагрузка) 0,25 мкг, 25 п.о. 0,35 мкг (27,5, 0 ч среда, Н 2 О: GL25 п.о.). Окрашивание Кумасси бриллиантовым голубым, нативный (чистый) 8% PAGE (5% С), см. фиг. 3.1.11 а) (27 ч среда, 5 ч среда, 0 ч среда, Н 2 О: ML). На фиг. 3.1.10 а) и 3.1.10 b) показано окрашивание этидия бромидом геля PAGE с нанеснными на него соединениями (молекулами). На фиг. 3.1.10 с) представлен типичный пример геля, окрашенного Кумасси, применяемого для сравнения длин пробега. Сравнение полос, включающих различные партии,показывает, что у всех соединений (молекул) в среде появляется полоса в кармане геля, отсутствующая на дорожках с Н 2 О (за исключением GL). У полосы, появляющейся в верхней области геля в Н 2 О в случае 30L1 и фракции 3, наблюдается более короткая длина пробега в среде, она находится на уровне низшей полосы белка. Интенсивность полос как ДНК, так и белка снижается при увеличении времени инкубации. В случае GL интенсивность 2 полосы в среде повышается по сравнению с Н 2 О. Фиг. 3.1.11 - инкубация ODN M362 в среде. Нативный PAGE, 12% гель (5% С), наносимое количество (нагрузка) 0,25 мкг, маркер 25 п.о. 0,3 мкг (25 п.о., Н 2 О, 0 ч среда, 5 ч среда, 27 ч среда). Окрашивание Кумасси бриллиантовым голубым, нативный PAGE, 12% гель (5% С), на фиг. 3.1.12 а) (Н 2 О, 0, 5, 27 ч среда). На фиг. 3.1.11 показан нативный PAGE (электрофорез в чистом геле), в котором наносят контрольную молекулу М 362 с защитной фосфоротиоатной группой. Как чтко видно на чертеже, полоса ДНК,видимая в Н 2 О на нижнем крае геля, исчезает в среде. Напротив, можно видеть полосу в верхнем крае геля, соответствующую по длине (пути) пробега нижней полосе белка (фиг. 3.1.11 b), и полосу в кармане геля. В этом случае также можно наблюдать снижение интенсивности полос ДНК по мере увеличения времени инкубации. Чтобы проверить, что наблюдаемые изменения вызваны скорее присутствием белков, нежели других компонентов среды, для сравнения молекулы также разводят в среде без добавления FCS (фетальной(эмбриональной) телячьей сыворотки). На фиг. 3.1.12 представлены соответствующие дорожки геля дляdSLIM (KG) и М 362. Дорожки, на которых ODN и молекулы разделяются в среде в отсутствие FCS, соответствуют по своей интенсивности распределения дорожкам, на которые ODN и dSLIM наносят в виде раствора в воде. Напротив, ODN, растворнные в среде с FCS, и молекулы в нативном PAGE показывают характер миграции, который соответствует характеру миграции, описанному на фиг. 3.1.10 и 3.1.11 для тех дорожек, на которые нанесены мономерные молекулы и ODN, разведнные в среде. Иммуностимулирующий эффект: стимуляция РВМС. Иммуномодулирующий эффект различных молекул изучают на РВМС, выделенных из донорской человеческой крови. С этой целью РВМС инкубируют с соответствующей молекулой (соединением) или контрольной молекулой М 362 с конечной концентрацией 1 мкМ в течение 48 ч, а количество IL-6, IFNи IFN- в супернатантах клеточных культур определяют методом ELISA. Клетки, инкубируемые в отсутствие каких-либо добавок, используют в качестве контроля. Результаты, полученные методом ELISA при исследовании супернатантов РВМС 4 человекдоноров крови (доноры A-D), представлены в виде диаграмм на фиг. 3.2.1 а)-с). Величины соответствуют средним значениям, полученным в результате определений в двойном повторе, а "усы" показывают выведенное из них двойное стандартное отклонение. Величины, помеченные знаком , означают, что проведено дополнительное двойное определение стимуляции РВМС и эти указанные величины соответствуют средним значениям из четырх результатов, полученных методом ELISA. "Усы" показывают двойное стандартное отклонение для этих четырх значений. Фиг. 3.2.1 а)-с) - результаты ELISA IFN- (а), IFN- (b), IL-6 (с) РМВС. Супернатанты РВМС (2,4106 клеток на партию 600 мкл) от разных доноров А-D, стимуляция 48 ч с использованием 1 мкМ dSLIM/ODN M362, стадартный результат измерения ,культура клеток с определением в двойном повторе (двукратным), "усы": 2 стандартное отклонение от определения в двойном повторе ELISA ( культура клеток с определением в двойном повторе (двукратным) + определения в двойном повторе ELISA = 4 значения). Что касается диаграмм, особенностью, сразу бросающейся в глаза, являются очень значительные колебания концентрации цитокинов в супернатантах различных доноров, что затрудняет сравнение данных. Стандартные отклонения значений, дополнительно определяемых в культуре клеток в виде двойных определений (в двойном повторе), сравнимы со стандартными отклонениями, просто получаемыми из двойных определений (в двойном повторе) в ELISA, это показывает, что эти различия вызваны различием в клетках РВМС. В нестимулированных партиях от всех доноров либо совсем не обнаруживают цитокинов, либо обнаруживают очень низкие концентрации цитокинов. При определении концентрацийIL-6 и IFN- некоторые из определяемых величин находятся на верхнем пределе или вне стандартного интервала измерений, который составляет вплоть до 10000 мкг/мл для IFN-, вплоть до 3500 мкг/мл дляIL-6 для dSLIM и 7000 мкг/мл для М 362. Для более точного сравнения данных, полученных от разных доноров, полученные в результате величины цитокинов нормализуют. Для этой цели для каждого донора рассчитывают процентное содержание определяемых концентраций цитокинов в величине, определнной для М 362. Средние значения нормализованных таким образом данных от четырх доноров представлены на диаграммах на фиг. 3.2.2 а)-с). Величина каждого "уса" соответствует средней величине отклонения (девиации). Вследствие большой разницы между показаниями для отдельных доноров, "усы" очень велики. Однако с помощью диаграмм можно, по меньшей мере, оценить тенденцию для отдельных молекул. Фиг. 3.2.2 а)-с) - нормализованные средние значения результатов определения методом ELISA дляIFN- (a), IFN- (b), IL-6 (с). Результаты ELISA см. фиг. 3.2.1, нормализованные: количество цитокинов в % М 362 на донора,среднее значение для 4 доноров, "усы": средняя величина отклонения (девиации). Для IFN- расчетные значения для испытуемых молекул составляют между 40 и 80% относительно величин М 362, а значения для KG, ML и GLS-F2 находятся скорее в нижней, а для GL-F2 - в верхней области. Средние выраженные в процентах значения различные конструкций для IFN- приблизительно соответствуют значениям М 362, за исключением значений, рассчитанных для GL-F1, GLS-F1 и GL-F2, которые составляют только около 50% от значений М 362. Средние величины процентного содержания М 362 для IL-6 ниже 50% для 30L1, MS, GS, GL-F2 иGLS-F2, а в случае MS и GLS-F2 - конструкций с самой низкой концентрацией эндотоксина, получены также самые низкие значения. Значения для GL-F1 и GL-F2, где совсем не обнаружено эндотоксинов,немного выше 50% относительно М 362. Наивысшие значения IL-6, которые соответствуют значениям для М 362 или превышают 100%, обнаружены в клетках, стимулированных с помощью KG и ML. Также для двух конструкций определяют наивысшую концентрацию эндотоксинов. Фиг. 3.3.2 - результаты, полученные методом ELISA, время стимуляции IL-8 НЕК 293-TLR9. Супернатанты HEK293-TLR9: 400 мкл/партия (5106 клеток/мл); стимуляция 6, 24, 48 ч при использовании 2,5 мкл ODN 2006; 0,5 мкг/мл LPS; стимуляция через 3 дня после засевания клеток (среду заменяют через 48 ч и перед стимуляцией); "усы": 2 стандартное отклонение от двукратного определения методом ELISA. Отношения количеств хемокина в стимулированных/нестимулированных партиях из а); "усы": сумма относительных погрешностей двукратного определения методом ELISA. Измеряемые концентрации хемокина относительно низки. Однако повышение количества IL8/CXCL8 при увеличении времени стимуляции можно наблюдать во всех партиях, однако это повышение становится очень низким при увеличении времени от 24 до 48 ч. Также относительные значение дляLPS-стимулированных и нестимулированных клеток примерно равны по величине, а для клеток, стимулированных с помощью ODN 2006, увеличены примерно в 1,5 по сравнению с нестимулированными клетками. Не обнаружено никакой разницы в отношениях количеств IL-8/CXCL8 стимулированных/нестимулированных партий, определяемых в различные моменты времени (в различных временных точках), по этой причине дальнейшую стимуляцию проводят в течение 24 ч. Фиг. 3.3.4: Результаты ELISA для IL-8 HEK293 null различных мономерных молекул. Супернатанты НЕК 293 null: 400 мкл/партия (1106 клеток/мл); стимуляция в течение 24 ч с помощью 2 мкМ ODN 2006/dSLIM; 0,5 мкг/мл LPS; стимуляция через 4 дня после засевания клеток (среду заменяют через 48 ч и перед стимуляцией); "усы": 2 стандартное отклонение от двукратного определения методом ELISA. Отношения количеств хемокина в стимулированных/нестимулированных партиях из а); "усы": сумма относительных погрешностей двукратного определения методом ELISA. Ни в одной из инкубированных с указанными различными стимуляторами партий не наблюдается никакой значительной разницы в секреции IL-8/CXCL8 по сравнению с нестимулированной партией. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Мультимерная молекула для модулирования активности иммунной системы человека или животного, содержащая по меньшей мере две мономерные структуры стебель-петля, которые объединены в мультимерную молекулу с образованием G-структур, при этом молекула содержит последовательность оснований N1N2CGN3N4, где N1N2 обозначает какой-либо элемент из группы GT, GG, GA, AT или АА,N3N4 обозначает какой-либо элемент из группы СТ или ТТ, а С обозначает дезоксицитозин, G обозначает дезоксигуанозин, А обозначает дезоксиденозин и Т обозначает дезокситимидин. 2. Молекула по п.1, отличающаяся тем, что олигодезоксирибонуклеиновая кислота содержит следующие последовательности: а) GTTCCTGGAG ACGTTCTTAG GAACGTTCTC CTTGACGTTG GAGAGAAC, или б) ACCTTCCTTG TACTAACGTT GCCTCAAGGA AGGTTGATCT TCATAACGTT GCCTAGATCA,или в) олигодезоксирибонуклеотидную последовательность, имеющую последовательность основанийAACG TTCTTCGGGG CGTT, которая имеет в длину 40-1600 нуклеотидов. 3. Молекула по п.2, отличающаяся тем, что последовательность оснований по признаку в) включена в последовательность CCTAGGGGTT АССАССТТСА TTGGAAAACG TTCTTCGGGG CGTTCTTAGGTGGTAACC. 4. Молекула по любому из пп.1-3, отличающаяся тем, что содержит частично однонитевую, ковалентно замкнутую цепь дезоксирибонуклеозидных остатков. 5. Молекула по любому из пп.1-4, отличающаяся тем, что последовательность основанийN1N2CGN3N4 расположена в однонитевой области замкнутой цепи из дезоксирибонуклеозидных остатков. 6. Молекула по любому из пп.1-5, отличающаяся тем, что один или более заместителей связаны с молекулой ковалентными связями. 7. Молекула по п.6, отличающаяся тем, что заместитель выбирают из группы, включающей пептиды, белки, сахариды, антигенные структуры, молекулы ДНК и/или РНК. 8. Композиция, содержащая молекулу по любому из пп.1-7 и химиотерапевтический агент. 9. Композиция по п.8, отличающаяся тем, что химиотерапевтический агент выбирают из группы,включающей антитела, алкилирующие агенты, платиновые аналоги, интеркалирующие агенты, антибиотики, ингибиторы митоза, таксаны, ингибиторы топоизомераз, антиметаболиты и/или L-аспарагиназу,гидроксикарбамид (гидроксимочевину), митотан и/или аманитины. 10. Композиция по п.9, отличающаяся тем, что алкилирующие агенты выбирают из группы, включающей производные азотного мустина, в особенности циклофосфамид, ифосфамид, трофосфамид,мельфалан и/или хлорамбуцил, алкилсульфонаты, в особенности бусульфан и/или треосульфан, нитрозомочевины, в особенности кармустин, ломустин, нимустин, эстрамустин и/или стрептозотоцин, прокарбазин и дакарбазин, темозоломид и/или тиотепу. 11. Композиция по п.9, отличающаяся тем, что платиновые аналоги выбирают из группы, включающей цисплатин, карбоплатин и/или оксалиплатин. 12. Композиция по п.9, отличающаяся тем, что интеркалирующие агенты выбирают из группы,- 19017860 включающей антрациклины, в особенности доксорубицин (адриамицин), даунорубицин, эпирубицин и/или идарубицин, митоксантрон, амсакрин и/или доксофлуридин. 13. Композиция по п.9, отличающаяся тем, что антибиотики выбирают из группы, включающей блеомицин, актиномицин D (дактиномицин) и/или митомицин. 14. Композиция по п.9, отличающаяся тем, что ингибитор митоза выбирают из группы, включающей алкалоиды Vinca rosea (растения барвинок розовый), в особенности винорелбин, винкристин (онковин), винбластин и/или виндезин. 15. Композиция по п.9, отличающаяся тем, что таксаны выбирают из группы, включающей паклитаксел и/или доцетаксел. 16. Композиция по п.9, отличающаяся тем, что ингибиторы топоизомераз выбирают из группы,включающей ингибиторы топоизомеразы I, в особенности камптотецин, топотекан и/или иринотекан,и/или ингибиторы топоизомеразы II, в особенности этопозид, тенипозид. 17. Композиция по п.9, отличающаяся тем, что антиметаболиты выбирают из группы, включающей антагонист фолиевой кислоты, в особенности метотрексат, аналоги пиримидина, в особенности 5 фторурацил, капецитабин, цитозин арабинозид (цитарабин) и/или гемцитабин, аналоги пурина, в особенности 6-тиогуанин, пентостатин, азатиоприн, 6-меркаптопурин, флударабин и/или кладрибин. 18. Набор, содержащий молекулу по любому из пп.1-7 и/или композицию по любому из пп.8-17 и информацию относительно смешивания содержимого набора. 19. Применение молекулы по любому из пп.1-7 или композиции по любому из пп.8-17 в качестве лекарственного средства для модулирования активности иммунной системы человека или животного. 20. Фармацевтическая композиция, содержащая молекулу по любому из пп.1-7 и/или композицию по любому из пп.8-17, совместно с фармацевтически приемлемым носителем. 21. Применение молекулы по любому из пп.1-7, композиции по любому из пп.8-17, или фармацевтической композиции по п.20 для модуляции иммунной системы человека или животного или для модуляции активности такой иммунной системы. 22. Применение по п.21, отличающееся тем, что модуляция представляет собой стимуляцию или повышение активности иммунной системы. 23. Применение по п.22, отличающееся тем, что стимуляция включает Т-клеточно-опосредованный или независимый от Т-клеток иммунный ответ. 24. Применение по п.23, отличающееся тем, что иммунный ответ включает пролиферацию В-клеток и/или активацию В-клеток. 25. Применение по любому из пп.21-24, отличающееся тем, что стимуляция иммунной системы включает секрецию цитокинов. 26. Применение по любому из пп.21-25, отличающееся тем, что молекулу по любому из пп.1-7 и/или композицию по любому из пп.8-17 применяют в качестве адъювантов при терапевтической или профилактической вакцинации. 27. Применение молекулы по любому из пп.1-7, композиции по любому из пп.8-17 и/или фармацевтической композиции по п.20 для лечения нарушения роста клеток. 28. Применение по п.27, отличающееся тем, что нарушение роста клеток представляет собой опухолевое заболевание. 29. Применение по п.28, отличающееся тем, что опухолевое заболевание выбирают из группы, содержащей опухоли уха, носа, горла, включая опухоли внутри носа, опухоли назального синуса, носоглотки, на губах, в полости рта, опухоли мезофаринкса (ротоглотки), гортани, гипофаринкса (подглоточника), уха, слюнных желез, и параганглиомы, опухоли лгких, включая немелкоклеточные карциномы бронхов, мелкоклеточные карциномы бронхов, опухоли средостения, опухоли желудочно-кишечного тракта, включая опухоли пищевода, желудка, поджелудочной железы, печени, желчного пузыря и желчных протоков, тонкого кишечника, колоректальные карциномы и анальные карциномы, опухоли мочеполовой системы, включая опухоли почек, мочеточника, мочевого пузыря, простаты, уретры, пениса и яичек, гинекологические опухоли, включая опухоли шейки матки, влагалища, вульвы, рак матки, злокачественную трофобластическую опухоль, карциному яичника, опухоли маточной трубы (фаллопиевой трубы), опухоли брюшной полости, карциномы молочной железы, опухоли эндокринных органов, включая опухоли щитовидной железы, паращитовидной железы, коры надпочечника, эндокринные опухоли поджелудочной железы, карциноидные опухоли и карциноидный синдром, множественные эндокринные неоплазии, саркомы костных и мягких тканей, мезотелиомы, кожные опухоли, меланомы, включая кожные и внутриглазные меланомы, опухоли центральной нервной системы, опухоли детского возраста,включая ретинобластому, опухоль Вильмса, нейрофиброматоз, нейробластому, семейство опухолей типа саркомы Юинга, рабдомиосаркому, лимфомы, включая неходжкинские лимфомы, кожные Т-клеточные лимфомы, первичные лимфомы центральной нервной системы, болезнь Ходжкина, лейкозы, включая острые лейкозы, хронический миелоидный и лимфатический лейкозы, опухоли плазматических клеток,синдромы миелодисплазии, паранеопластические синдромы, метастазы с неизвестной первичной опухолью (синдром CUP), перитонеальный карциноматоз, злокачественное заболевание, связанное с иммуносупрессией, включая злокачественное заболевание, обусловленное СПИДом, такое как саркома Капоши,- 20017860 обусловленные СПИДом лимфомы центральной нервной системы, обусловленная СПИДом болезнь Ходжкина и обусловленные СПИДом анально-генитальные опухоли, злокачественное заболевание, обусловленное трансплантацией, метастазирующие опухоли, включая метастазы в мозг, метастазы в лгкие,метастазы в печень, метастазы в кости, метастазы в плевру и в перикард, и злокачественные асциты. Фиг. 2.5.1 Центрифугирование в градиенте плотности на фиколле (Ficoll-Hypaque) для выделения РМВС по [Lutmann 2004]. Фиг. 3.1.1 Вторичная структура, рассчитанная по программе "DNA mfold". Условия: 150 мМ NaCl, 0,5 мМ MgCl2 и 37 С a) 30L1, б) KG. Фиг. 3.1.3. Хроматограмма, полученная при очистке различных dSLIM методом ВЭЖХ. a) 30L1, b) ML, с) KG, d)MD, e) GS, f) GLS, g) GL, колонка: 1 мл DMAE. Наносимое количество (нагрузка): 700 мкг; скорость потока 1 мл/мин; буфер А: 20 мМ трис рН 7; буфер В: 20 мМ трис, 1 М NaCl, pH 7; градиент: 0, 50, 100% буфера Б,поглощение при 260 нм,NaCl-градиент,инжекция, F2-F4 фракционирование. Фиг. 3.1.6 Термическая денатурация различных dSLIM. Нативный PAGE 8% гель (2,6% С), нагрузка 0,25 мкг, маркер 25 п.о. 0,3 мкг (25 п.о., без обработки, денатурация 95 С, 10 мин: 30L1, MS, ML, KG, GS, GL-F2,GLS-F2). Фиг. 3.1.9 Сравнение фракции 3 с модельной молекулой димера 60L1. Фиг. 3.1.10 Инкубация dSLIM в среде. a) Нативный PAGE 8% гель (5% С), нагрузка 0,25 мкг, маркер 25 п.о. 0,3 мкг,маркер 50 п.о. 0,3 мкг (50 п.о., 27, 5, 0 час среда, H2O: 30L1, ML, F3, KG, 25 п.о.); b) нативный PAGE 8% гель (2,6% С), нагрузка 0,25 мкг, маркер 25 п.о. 0,35 мкг (27, 5, 0 час среда, Н 2 О: GL, 25 п.о.); c) фрагмент окрашенного Кумасси бриллиантовым голубым нативного 8% PAGE (5% С), из фиг. 3.1.11 а) (27, 5, 0 час среда, H2O: ML). Фиг. 3.1.12 Инкубация dSLIM и ODN M362 в среде с и без FCS. а) Нативный PAGE 4-20% гель, нагрузка М 362 0,05 мкг, маркер 25 п.о. 0,2 мкг (25 п.о., Н 2 О, среда без FCS (M-), среда с FCS (M+), 24 ч среда с FCS); b) фрагмент окрашенного Кумасси бриллиантовым голубым нативного PAGE 4-20% геля из фиг. 3.1.13 а)(25 п.о., Н 2 О, среда без FCS (M-), среда с FCS (M+), 24 ч среда с FCS); c) нативный PAGE 4-20% гель,нагрузка KG 0,12 мкг, маркер 25 п.о. 0,2 мкг (25 п.о., H2O, среда без FCS (M-), среда с FCS (M+), 24 ч среда с FCS); d) фрагмент окрашенного Кумасси бриллиантовым голубым нативного PAGE 4-20% геля из фиг. 3.1.13 с) (25 п.о., Н 2 О, среда без FCS (M-), среда с FCS (M+), 24 ч среда с FCS). Фиг. 3.2.1 а)-с) Результаты ELISA: IFN- (a), IFN- (b), IL-6 (c) PMBC. Выделенные РМВС (2,410 клеток на загрузку 600 мкл) разных доноров A-D, стимуляция 48 ч 1 мкМ dSLIM/ODN M362, область измерения стандарта, тест культуры клеток в двойном повторе, интервал ошибки ("усы"): 2 повторное отклонение из определения в двойном повторе ELISA (определение в двойном повторе (двукратное) культуры клеток + определение в двойном повторе ELISA = 4 значения). Фиг. 3.2.2 а)-с) Нормированные средние значения результатов определения методом ELISA для IFN- (a), IFN- (b), IL-6(с). Результаты ELISA, см. фиг. 3.2.1, нормализованные: количество цитокинов в % М 362 на донора,среднее значение для 4 доноров, "усы": средняя величина отклонения (девиации). Фиг. 3.32 а), b) Результаты, полученные методом ELISA, относительно продолжительности стимуляции IL-8 HEK293TLR-9. Фиг. 3.3.3 а)-d) Результаты, полученные методом ELISA, относительно продолжительности стимуляции IL-8 НЕК 293TLR-9 различными dSLIM. Фиг. 3.3.4 a), b) Результаты ELISA IL-8 HEK293-Null с различными конструкциями dSLIM. а) Выделенные HEK293-Null: 400 мкл/партия (1106 клеток/мл); стимуляция 24 ч с помощью 2 мкМ ODN 2006/dSLIM; 0,5 мкг/мл LPS; стимуляция через 4 дня после засевания клеток (замена среды через 48 ч и перед стимуляцией); пределы ошибок ("усы"): 2 стандартное отклонение из определения в двойном повторе ELISA; b) отношения количеств хемокина в стимулированных/нестимулированных партиях из а); "усы": сумма относительных погрешностей двукратного определения методом ELISA.