Создание химических строительных блоков из растительной биомассы посредством избирательной деполимеризации

СОЗДАНИЕ ХИМИЧЕСКИХ СТРОИТЕЛЬНЫХ БЛОКОВ ИЗ РАСТИТЕЛЬНОЙ БИОМАССЫ ПОСРЕДСТВОМ ИЗБИРАТЕЛЬНОЙ ДЕПОЛИМЕРИЗАЦИИ Изобретение относится к способу ферментативной обработки необработанного полимерного сырья,включающему следующие стадии: а) предпочтительно отделение растворимых компонентов от необработанного полимерного сырья, b) обработку необработанного полимерного сырья ферментативной системой для высвобождения определенных растворимых мономерных или олигомерных строительных блоков из нерастворимого необработанного полимерного сырья и с) отделение определенных мономерных или олигомерных строительных блоков, полученных на стадии b), из остатков необработанного полимерного сырья. Предпочтительно ферментативная система, используемая на стадии b), обладает не более чем 50%,предпочтительно не более чем 20%, более предпочтительно не более чем 10%, более предпочтительно не более чем 5%, более предпочтительно не более чем 2%, более предпочтительно не более чем 1% других ферментативных активностей, помимо ферментативной активности, приводящей к высвобождению указанных определенных мономерных или олигомерных строительных блоков из необработанного полимерного сырья согласно стадии b). Дополнительные аспекты изобретения касаются применения"менее чистых" и, таким образом, менее дорогостоящих ферментативных систем на последующих стадиях ферментативной обработки и способов определения оптимальной последовательности стадий ферментативной обработки посредством анализа используемого необработанного полимерного сырья. 016528 Предпосылки данного изобретения Создание химических строительных блоков на биологической основе из возобновляемых ресурсов в последнее время привлекает повышенное внимание из-за глобального ограничения ископаемых нефтехимических ресурсов. Предпочтительное сырье для создания таких химических продуктов на биологической основе получают из возобновляемой растительной биомассы (Kamm et al., 2006). Современные процессы производства продуктов на биологической основе преимущественно используют субстраты из пищи и с кормового рынка, такие как масла, сахара и крахмалы. Самое первое поколение сырья обладает точно определенным химическим составом и низкой структурной сложностью. Дополнительно, такие субстраты могут быть получены с относительно высокой чистотой только с незначительным количеством сопровождающих загрязнителей. Тогда как их использование является как технологически, так и экономически привлекательным, их длительная широкомасштабная поставка является небезопасной, потому что использование первичного сырья в химических процессах на биологической основе находится в жестокой борьбе с их постоянно увеличивающейся глобальной потребностью в пищевой промышленности. Альтернативные субстраты указанного выше первичного сырья получают из дешевых субпродуктов лесного хозяйства и сельскохозяйственных отходов, состоящих из растительного материала, который не имеет применения в качестве источника пищи. Примеры такого обозначенного вторичного сырья для производства представляют собой остаточный растительный материал от фермерской деятельности, такой как солома зерновых и пшеничная солома, а также различные отходы, связанные с древесиной. Эта лигноцеллюлозная биомасса (LCB) отличается от первичного биологического сырья своим сложным химическим и структурным составом. Основные компоненты LCB представляют собой высокополимерные материалы, такие как целлюлоза (приблизительно 35-50% мас./мас.), гемицеллюлоза (приблизительно 20-35% мас./мас.) и лигнины (приблизительно 10-25% мас./мас.). Белки, жиры и другие соединения составляют второстепенные фракции в большинстве LCB исходных материалов (Sana, 2005), но могут быть представлены в больших количествах в особых сельскохозяйственных отходах, таких как остатки от производства масла. Так как LCB состоит из многих химически различных компонентов, ее нисходящая обработка является технически сложной, что, в свою очередь, ограничивает экономическую годность данных биопроцессов, основанных на LCB. Техническая проблема Для того чтобы создать ценные химические субстанции и строительные блоки с помощью экономически выгодных биопроцессов, основанных на LCB сырье, важным является не только (i) как восстановить и очистить большую часть ее различных химических составляющих, но и (ii) как получить их достаточно чистыми. В отличие от различных и высокополимерных объектов, которые составляют LCB,ее преимущественные продукты обработки являются низкомолекулярными. В основном, экономически привлекательные продукты могут быть созданы из всех компонентов LCB: глюкоза, полученная из целлюлозы, является универсальным исходным материалом для создания ценных химических промежуточных продуктов, таких как сорбит. Пентозные сахара, такие как ксилоза и арабиноза, полученные из фракций гемицеллюлозы LCB, являются исходными материалами для ценных низкопитательных и некалорийных заменителей сахара, таких как ксилит и арабинит. Белки из LCB могут быть гидролизованы для получения энантиомерно чистых L-аминокислот. Лигнины могут служить в качестве источника фенольных соединений, замещающих ароматические, полученные посредством нефтехимических процессов. Текущее технологическое ограничение для использования обработанного вторичного сырья в основном связано с его сложным химическим составом. Большинство современных процессов, использующих LCB, сконцентрированы на целлюлозной части субстрата. При использовании других компонентов, обычно их гидролизуют на неизбирательных стадиях процесса, таких как предварительная обработка серной кислотой, гидролизующей все гемицеллюлозы на одной стадии процесса. Продукты таких неизбирательных стадий способа, как правило, обладают низкой и, в некоторых случаях, отрицательной коммерческой ценностью. Функционирующий в настоящее время logen процесс для ферментативного получения биоэтанола использует обработку парами разбавленной кислоты при 200-250 С для того, чтобы сделать подвижной фракцию гемицеллюлозы из LCB, которая содержит смесь различных гексозных и пентозных сахаров. На отдельной ферментативной стадии нерастворимая фракция целлюлозы гидролизуется на гексозные(глюкозные) сахара. После разжижения фракций гемицеллюлозы и целлюлозы, нерастворимое сухое вещество лигнинов является физически отделенным от пульпы и сжигается для образования энергии для последующей обработки оставшихся фракций LCB. Объединенные фракции целлюлозы и гемицеллюлозы ферментируют вместе на отдельной стадии для образования биоэтанола. Полученный этанол последовательно получают из ферментационного бульона посредством дистилляции. Так как большинство коммерчески доступных организмов (т.е. пекарских дрожжей, Saccharomyces cerevisiae), используемых для процесса ферментации, не способны утилизировать пентозные сахара, при этом компоненты LCB,хотя и обладают большой коммерческой ценностью, когда они присутствуют в чистой форме, в процессе отбрасываются вместе с присутствующими остаточными отходами (Lawford and Rousseau, 2003). В последнее время были приняты попытки для создания пентозной фракции LCB, доступной для-1 016528 ферментативного превращения в биоэтанол. В такой исправленной схеме процесса, разжиженная фракция гемицеллюлозы отделяется от остальных компонентов LCB после стадии предварительной обработки. Хотя все остающиеся фракции LCB обрабатывают, как описано ранее, специально сконструированные микроорганизмы т.е. сконструированные штаммы Zymomonas mobilis) со способностью использовать пентозные (Lawford and Rousseau, 2003; Lynd et al., 2005), а также гексозные сахара, используют на стадии раздельной ферментации для эффективного превращения разжиженной и подготовленной гемицеллюлозы в биоэтанол. Полученную ферментационную пульпу подают в последовательный традиционный технологический поток для получения биоэтанола. Хотя производство биоэтанола из сложных пентозных смесей выглядит коммерчески ценным, избирательная переработка гексозы, пентозы, и лигнина в ценные продукты и химические строительные блоки является привлекательным альтернативным путем использования компонентов LCB. Одна проблема, свойственная для всех используемых в настоящее время способов предварительной обработки, состоит в одновременном и неизбирательном гидролизе и высвобождении различных химических строительных блоков, которые составляют компоненты LCB (Saha, 2005). В настоящее время коммерчески применяемые и экономически доступные способы предварительной обработки используют жесткие химические и физические способы обработки, которые могут включать комбинацию обработки кислотами или основаниями при повышенных температурах (Ramos et al., 2005). Полученные гидролизаты LCB содержат множество нежелательных побочных продуктов, полученных при химической модификации строительных блоков LCB. Присутствие таких загрязнителей обычно препятствует последующей ферментативной или каталитической обработке или цельноклеточной ферментации продуктов(Saha, 2005) и, следовательно, значительно снижает коммерческую ценность потоков продукции, полученной из LCB с помощью таких методов. Таким образом, техническая проблема, лежащая в основе настоящего изобретения, состоит в том,чтобы предоставить способ получения химических строительных блоков из возобновляемой растительной биомассы. В особенности, техническая проблема состоит в том, чтобы предоставить способ получения ценных химических строительных блоков из LCB, который избегает неудобств и недостатков известного уровня техники. Сущность изобретения Согласно первому аспекту, настоящее изобретение относится к способу ферментативной обработки необработанного полимерного сырья, включающему следующие стадии: (а) обработку необработанного полимерного сырья ферментативной системой для высвобождения определенных мономерных или олигомерных строительных блоков из необработанного полимерного сырья и (b) отделение определенных мономерных или олигомерных строительных блоков, полученных на стадии а) от остатков необработанного полимерного сырья. Согласно предпочтительному аспекту, стадии а) и b) выполняют в растворителе (жидкая среда). Предпочтительно, (необработанное) полимерное сырье обрабатывают в присутствии растворителя, в котором оно нерастворимо, т.е. в котором оно не находится в растворенной форме. Таким образом, (необработанное) полимерное сырье предпочтительно представляет собой нерастворимое необработанное полимерное сырье. Растворитель предпочтительно представляет собой водный растворитель. Далее предпочтительно, ферментативная стадия а) высвобождает растворимые мономерные или олигомерные строительные блоки из необработанного полимерного сырья, т.е. мономерные или олигомерные строительные блоки, которые растворимы в используемом растворителе и, таким образом, могут растворяться в нем. Согласно дополнительному предпочтительному аспекту, отделение растворимых (растворенных) определенных мономерных или олигомерных строительных блоков, полученных на стадии а), от остатков нерастворимого (не растворенного) необработанного или обработанного полимерного сырья (стадияb) достигается за счет жидкостного-твердотельного разделения. Можно использовать любой традиционный способ жидкостного-твердотельного разделения, включая методы фильтрации или центрифугирования. Согласно другому предпочтительному аспекту, изобретение содержит или отдельный объединенный способ, состоящий из стадии а) и стадии b) или серии последовательных стадий обработки, где стадию а) и стадию b) повторяют по меньшей мере один раз. На каждой стадии обработки растворимые мономерные или олигомерные продукты получены из нерастворимого необработанного или обработанного полимерного сырья посредством последующего добавления специальной ферментативной системы, с последующим отделением растворимых мономерных или олигомерных продуктов от нерастворимых остатков полимерного сырья. Можно использовать любой традиционный способ жидкостноготвердотельного разделения, включая методы фильтрации и центрифугирования. Согласно предпочтительному аспекту, определенный мономерный или олигомерный строительный блок(и), высвобождаемый из необработанного или обработанного полимерного сырья на каждой стадии обработки а), представляет собой один специфический "продукт", выбранный из левой колонки табл. 1,приведенной ниже. Другими словами, только один специфический мономерный или полимерный строительный блок высвобождается из необработанного или обработанного полимерного сырья на каждой-2 016528 стадии обработки а) с использованием ферментативной системы или комбинации ферментативных систем, имеющих такой же продукт. Примеры таких комбинаций ферментов перечислены в табл. 1. Согласно одному предпочтительному аспекту изобретения было обнаружено, что присутствие (значительных) количеств лигнина является полезным в способе настоящего изобретения. Таким образом,избирательность и, следовательно, чистота потоков продукции, полученной на стадии ферментативной обработки, может быть неожиданно увеличена за счет присутствия лигнина в полимерном сырье. Изменение наблюдаемой ферментативной избирательности может быть вызвано измененными поверхностными свойствами в присутствии лигнина, однако изобретение не ограничено только таким предположением теоретического механизма. Таким образом, согласно предпочтительному варианту осуществления, необработанное полимерное сырье содержит по меньшей мере 1 мас.% лигнина, предпочтительно, по меньшей мере 3 мас.% лигнина,более предпочтительно, по меньшей мере 5 мас.% лигнина. В частности, преимущественные результаты можно получить, если необработанное полимерное сырье содержит по меньшей мере 10 мас.% лигнина,предпочтительно, по меньшей мере 20 мас.% лигнина. Количество лигнина, присутствующего в сырье,может быть определено способами, известными специалистам в данной области. Согласно одному из вариантов осуществления содержание лигнина может быть вычислено в соответствии со способом, описанным A. Sluiter et al., в "Determination of Structural Carbohydrates и Lignin in Biomass", LAP, TechnicalReport NREL/TP-510-42618, January 2008. Согласно другому варианту осуществления, содержание лигнина может быть вычислено в соответствии со способом, описанным Hsu et al., в Journal of Animal Science, 1987. 65: pp. 244-255 для отмытого кислотой лигнина (ADL). В соответствии с вышеуказанной неожиданной находкой, согласно дополнительному предпочтительному аспекту изобретения, стадия лигнинолитической ферментативной обработки не выполняется в способе настоящего изобретения. Также, более предпочтительным является то, что содержание лигнина в полимерном сырье, вычисленное в виде мас.% от общего состава полимерного сырья, не снижалось в ходе стадий (а) и (b) или их повторения. Содержание лигнина может быть определено, как указано выше. Согласно особенно преимущественному аспекту изобретения, способ обработки настоящего изобретения содержит по меньшей мере одну стадию обработки ("предварительная стадия обработки"),предшествующую стадии а), для отделения (удаления) растворимых компонентов от необработанного или обработанного (нерастворимого) полимерного сырья. Таким образом, данную стадию выполняют перед ферментативной обработкой необработанного или обработанного полимерного сырья. Было обнаружено, что эффективность стадии(й) последующей ферментативной обработки может быть неожиданно увеличена посредством такой предварительной стадии(й) обработки для удаления растворимых компонентов из необработанного или обработанного полимерного сырья. Предпочтительные условия такой предварительной стадии(й) обработки дополнительно обсуждаются ниже. Согласно предпочтительному варианту осуществления, тот же самый или сходный растворитель(жидкая среда), используемый для следующей стадии ферментативной обработки а), используют на предварительной стадии(ях) обработки. Отдельную предварительную стадию(и) обработки для удаления растворимых компонентов предпочтительно выполняют при тех же и более предпочтительно при более высоких температурах, чем последующая стадия ферментативной обработки а), для увеличения эффективности экстрагирования. Даже более предпочтительно, экстрагирование растворением посредством предварительной стадии(й) обработки должно выполняться при более высоких температурах и давлениях (принцип автоклава), но при укороченном времени обработки, по сравнению со следующей стадией ферментативной обработки. Снова, необработанное или обработанное полимерное сырье предпочтительно нерастворимо в используемом растворителе, и компоненты, подлежащие растворению, растворимы в нем. Отделение растворимых компонентов от нерастворимого необработанного или обработанного полимерного сырья предпочтительно выполняют традиционными способами жидкостноготвердотельного разделения. Согласно другому варианту осуществления изобретения, отдельная предварительная стадия(и) обработки для удаления растворимых компонентов из (необработанного или обработанного) полимерного сырья перед стадией а) может быть повторена во множестве пошаговых циклов по меньшей мере из двух предварительных стадий обработки. В предпочтительном варианте осуществления указанные циклы осуществляют с изменением состава растворителей, температурных и временных профилей для увеличения эффективности экстрагирования растворением. Предварительная стадия(и) обработки может содержать одну или несколько предварительных стадий физико-химической обработки и/или одну или несколько стадий промывки, как определено в данном описании. В настоящем изобретении, согласно одному предпочтительному аспекту, было обнаружено, что отделение высвобожденного (растворимого) мономерного или олигомерного строительного блока(ов) от(нерастворимого) необработанного или обработанного полимерного сырья после определенной обработки ферментативной системой обеспечивает значительные преимущества относительно создания химически чистых прибыльных базовых химикатов и химических строительных блоков из сложных природных субстратов, таких как LCB, посредством использования стадий избирательной каталитической обработ-3 016528 ки. Такие стадии избирательной каталитической обработки высвобождают определенные химические мономерные или олигомерные компоненты из сложного полимерного сырья с низкими количествами других загрязнителей в продукте, полученном посредством стадии обработки. Предпочтительное техническое решение для обеспечения такой специфичности и избирательности в гидролизе LCB состоит в использовании избирательных ферментативных стадий. Базовые химикаты можно использовать в качестве заменителей исходных материалов в традиционных нефтехимических процессах, а также исходных материалов для новых путей химического и биохимического синтеза, и поэтому обладают высокой коммерческой ценностью. Дополнительные предпочтительные аспекты и варианты осуществления детально описаны ниже. Определения Термин "необработанное полимерное сырье" означает сложные смеси различных нерастворимых полимерных субстратов, таких как углеводы, полимерные липиды, полипептиды, полинуклеотиды и полимерные фенилпропаноиды в различных массовых соотношениях, которые обычно получают из растительного материала. В дополнение к таким нерастворимым полимерным субстратам необработанное полимерное сырье обычно содержит растворимые мономерные или олигомерные компоненты. Необработанное полимерное сырье включает в качестве неограничивающих примеров отходы лесного хозяйства,сельскохозяйственной и пищевой промышленности, а также городские отходы. Когда основными полимерами являются целлюлоза и лигнин, такое необработанное полимерное сырье называют "необработанное лигниноцеллюлозное сырье", или "лигноцеллюлозная биомасса", или "LCB". Необработанное лигниноцеллюлозное сырье из сельскохозяйственной деятельности содержит, но,не ограничиваясь ими, пшеничную солому, солому зерновых, навоз жвачных животных, тростниковыйbargass, свекловичную пульпу и травянистый материал, такой как просо прутьевидное, Sericea LespedezaSerala и траву Sorghum sudan. Сырье, поставляемое лесным хозяйством в виде отходов, содержит, но, не ограничиваясь ими, древесную кору, древесную щепку и ненужные лесоматериалы. Лигниноцеллюлозное сырье, полученное из пищевой промышленности, охватывает, но, не ограничиваясь ими, мякоть плодов, остатки целой агавы, остатки кофе и отходы маслобойки, такие как фильтр-прессная лепешка из семян рапса и производственные стоки. Необработанное сырье, полученное из пульпы и бумажной промышленности, включает в качестве неограничивающих примеров бумажную пульпу и стоки бумажной фабрики. Необработанное сырье, полученное из городских отходов, охватывает, но, не ограничиваясь ими, бумажные отходы, остатки овощей и остатки фруктов. Термин "обработанное полимерное сырье", как использовано в данном описании, означает (остатки) необработанное полимерное сырье после по меньшей мере одной стадии ферментативной обработки(стадия а). Термин "стадия промывки" означает любую предварительную стадию обработки необработанного или обработанного полимерного сырья с использованием по меньшей мере одного растворителя для того, чтобы экстрагировать растворимые компоненты из нерастворимого полимерного сырья без модификации или изменения структуры самого полимерного сырья. Термин "стадия физико-химической обработки" означает любую предварительную стадию обработки необработанного или обработанного полимерного сырья для того, чтобы экстрагировать растворимые компоненты из нерастворимого полимерного сырья, включая модификацию или изменение структуры самого полимерного сырья. Термин "полимерный субстрат" означает субстанции, состоящие или из особенного мономерного компонента или из ограниченного разнообразия определенных мономерных компонентов, ковалентно связанных вместе в линейную или частично разветвленную молекулярную структуру. Нерастворимая фракция необработанного лигниноцеллюлозного сырья содержит значительные количества таких полимерных субстратов, например целлюлозы, кеилана, маннана и галактана. Дополнительно, оно также содержит полимерные субстраты, такие как лигнин, арабиноксилан, глюкороноксилан, глюкоманнан и ксилоглюкан. Термин "ферментативные системы" означает белково-подобные объекты, которые способны каталитически превращать полимерные или олигомерные субстраты в меньшие олигомерные или мономерные компоненты (строительные блоки). В дополнение к использованию одного фермента для образования мономерных или олигомерных продуктов из полимерного субстрата, термин ферментативная система также включает смеси, содержащие более чем один фермент, который образует определенный мономерный или олигомерный продукт из полимерного сырья посредством синергического или параллельного действия. Таким образом, термины "ферментативная система" и "смеси ферментов" используют в данном описании взаимозаменяемо, и оба могут содержать один или несколько ферментов или ферментов активности, соответственно. Термин "мономерные или олигомерные строительные блоки" означает мономерные или олигомерные продукты, которые высвобождены из необработанного полимерного сырья с использованием ферментативной системы. "Олигомерный" будет включать соединения с двумя или более мономерными блоками. Термин "ферментативная активность" фермента относится к каталитической активности фермента в-4 016528 соответствующих условиях, при которых фермент служит в качестве белкового катализатора, который превращает специфические полимерные или искусственные субстраты в специфические олигомерные или мономерные продукты. Термин "загрязняющая ферментативная активность" описывает ферментативные активности используемой ферментативной системы, которые ведут к олигомерным или мономерным продуктам, отличным от желаемого олигомерного или мономерного продукта(ов), которые образуются согласно запланированной (основной или первой) ферментативной активности ферментативной системы. Термин "искусственный субстрат" означает субстрат, в большинстве случаев низкой молекулярной массы, который после взаимодействия искусственного субстрата с ферментативной системой дает измеримые изменения в физико-химических свойствах искусственного субстрата, которые коррелируют с активностью выбранной ферментативной системы. Указанные физико-химические свойства и искусственные субстраты, дающие такие изменения в физико-химических свойствах после взаимодействия с ферментативной системой, известны специалистам в данной области и содержат, но без ограничений,изменения в спектрофотометрически измеряемых свойствах поглощения или флуоресцентного излучения, изменения в хроматографической подвижности, подлежащие определению посредством жидкостной или газовой хроматографии, и изменения молекулярной массы, подлежащие определению посредством масс-спектроскопии. Подходящие искусственные субстраты для ферментов, ферментативных систем и измеримых продуктов реакции перечислены ниже в табл. 2. Термин "высвобождать" означает превращение нерастворимого полимерного субстрата в растворимый мономерный или олигомерный продукт посредством физического, химического или каталитического процесса, такого как гидролиз, окислительная или восстановительная деполимеризация. Подробное описание изобретения Основное Согласно первому аспекту, изобретение содержит отдельный объединенный способ или серию последовательных стадий обработки для получения базовых химикатов или химических строительных блоков из необработанного полимерного сырья. На каждой стадии обработки растворимые мономерные или олигомерные продукты (строительные блоки) образуются из нерастворимого необработанного или обработанного полимерного сырья за счет взаимодействия необработанного или обработанного полимерного сырья со специфической ферментативной системой, которая предпочтительно в высокой степени свободна от ферментативных активностей, образующих продукты реакции, отличные от планируемых (мономерный или полимерный строительный блок), с последующим отделением растворимого мономерного или олигомерного строительного блока(ов) от нерастворимого необработанного или обработанного полимерного сырья. Согласно предпочтительному варианту осуществления, способ включает отделение растворимых компонентов от (нерастворимого) полимерного сырья, такого как LCB, перед или в комбинации с отдельным объединенным способом или перед и в комбинации с одной или несколькими стадиями серии последовательных (ферментативных) стадий обработки, как определено в предыдущем параграфе. Согласно другому предпочтительному варианту осуществления изобретения, первоначальное отделение растворимых компонентов от (нерастворимого) необработанного полимерного сырья перед стадиями ферментативной обработки содержит по меньшей мере одну предварительную стадию физикохимической обработки с последующим жидкостным-твердотельным разделением. Указанная стадия(и) физико-химической обработки может включать в качестве неограничивающих примеров инкубирование необработанного полимерного сырья с растворителем при повышенной температуре и/или увеличенном давлении, и/или взаимодействие необработанного полимерного сырья с химикатами. Такие химикаты включают в качестве неограничивающих примеров разбавленные или концентрированные кислоты или основания. Предпочтительно, физико-химическую предварительную обработку выполняют при рН, равном 1-13 и более, предпочтительно при рН, равном или 2-5, или 8-11. Согласно дополнительному предпочтительному варианту осуществления, физико-химическая предварительная обработка объединена с одной или несколькими стадиями промывки, предпочтительно, для дополнительного снижения растворимых компонентов в необработанном полимерном сырье. Согласно предпочтительному варианту осуществления, предварительную стадию(и) обработки, какопределено в данном описании, выполняют при температуре в диапазоне от 20 до 210 С, предпочтительно 50-175 С. Диапазон давления для каждой отдельной предварительной стадии обработки может варьировать от 1 до 300 бар и предпочтительно будет варьировать от 1 до 100 бар. Предпочтительная длительность предварительной стадии(й) обработки зависит от состава необработанного или обработанного полимерного сырья и может находиться в диапазоне от нескольких секунд до 1 недели. Более предпочтительно, время обработки для каждой отдельной предварительной стадии обработки может не превышать 1 ч. Указанная стадия(и) промывки перед стадией(ями) ферментативной обработки содержит по меньшей мере одну стадию промывки по меньшей мере одним растворителем, предпочтительно, по меньшей мере одним водным растворителем. Наиболее предпочтительны, но без ограничений, вода и/или водные-5 016528 буферы. Предпочтительно, за стадией промывки следует жидкостное-твердотельное разделение. Согласно одному из вариантов осуществления стадия промывки выполняют при отсутствии фермента или катализатора. В предпочтительном варианте осуществления изобретения, жидкая среда, используемая для отдельной предварительной стадии(й) обработки, в частности, стадии(й) промывки, содержит меняющиеся концентрации неорганических солей и/или других химических компонентов, которые могут оказывать влияние на ионную силу, рН и/или гидрофобность среды, для увеличения экстрагирования растворимого материала, предпочтительно, до и после каждой стадии ферментативной обработки. Предпочтительно,жидкая среда, используемая для отдельной предварительной стадии обработки характеризуется рН, равным 1-13. Предпочтительно жидкая среда, используемая для отдельной предварительной стадии обработки, содержит неорганическую кислоту, основания и соли, такие как хлористый водород, серная кислота, аммиак, хлорид натрия, гидроксид натрия, сульфат аммония, фосфат натрия, ацетат натрия, цитрат натрия, тартрат натрия, сульфат натрия, и/или органические компоненты буфера, например, глицин, глицерин и/или Triton-X 100, для изменения гидрофобности. Предпочтительно, ионная сила жидкой среды,используемой для отдельной предварительной стадии обработки, находится в диапазоне от 0,1-10 М эквивалентов сульфата натрия (ионная сила I1,7-170). В другом предпочтительном варианте осуществления жидкая среда свободна от любых органических растворителей и/или соединений, которые не смешиваются с водой. В еще одном предпочтительном варианте осуществления изобретения, отдельная стадия(и) промывки применяется повторно к необработанному или обработанному полимерному сырью с меняющимися составами растворителя с использованием меняющихся профилей времени, температуры и давления для максимального увеличения экстрагирования особого растворимого компонента. В предпочтительном варианте осуществления изобретения по меньшей мере одна предварительная стадия физико-химической обработки перед ферментативной обработкой необработанного полимерного сырья разработана для (первичного) удаления лигнина, смолы и/или белково-подобных компонентов из необработанного полимерного сырья. Предпочтительно, используют жидкую среду с ионной силой (I),превышающей 1, и в другом предпочтительном варианте осуществления все последующие предварительные стадии(я) обработки, в частности стадии(я) промывки, выполняют с использованием жидкой среды с более низкой ионной силой, чем в начальной предварительной стадии физико-химической обработки. Способы отделения растворимых и нерастворимых компонентов известны специалистам в данной области и содержат такие стадии обработки, как осаждение, декантация, фильтрация, микрофильтрация,ультрафильтрация, центрифугирование, выпаривание летучих продуктов и экстрагирование органическими или неорганическими растворителями. Согласно предпочтительному варианту осуществления,предварительная стадия(и) обработки содержит обработку водными растворителями, органическими растворителями или любыми их комбинациями или смесями предпочтительно с этанолом или глицерином. Согласно предпочтительному варианту осуществления изобретения, ферментативную обработку выполняют в водной среде, определенные мономерные или олигомерные строительные блоки, высвобожденные из необработанного или обработанного полимерного сырья, растворимы в водной среде, и отделение согласно указанной выше стадии b) выполняют жидкостным-твердотельным разделением растворимых строительных блоков в водной среде от нерастворимого необработанного или обработанного полимерного сырья. Важные примеры полимерных субстратов, которые составляют большую часть компонентов полимерного сырья, их мономерные или олигомерные продукты деградации (строительные блоки) и ферментативные системы, полезные для создания чрезвычайно чистых продуктов из каждого из полимерных субстратов, содержащихся в необработанном или обработанном полимерном сырье, перечислены ниже в таблице 1. На стадиях обработки настоящего изобретения, химические строительные блоки полимерных субстратов, таких как гемицеллюлоза, целлюлоза, лигнины, глюканы, белки и липиды, высвобождаются посредством взаимодействия полимерного сырья со специфическими ферментативными системами. Ферментативное расщепление отдельных компонентов сырья в чрезвычайно чистые растворимые продукты основано на применении субстратспецифичных препаратов ферментов, которые, согласно предпочтительному варианту осуществления, в высокой степени свободны от активностей, которые высвобождают другие компоненты, отличные от планируемых продуктов на соответствующей стадии обработки. Определение состава необработанного полимерного сырья Молекулярный состав необработанного сырья, подлежащего использованию в описанных в данном описании способах, может быть определен методами, известными специалистам в данной области. Например, состав лигниноцеллюлозного материала может быть определен с использованием комбинации пиролиза, газовой хроматографии и масс-спектрометрии. Библиотека методов, описывающих вероятные аналитические методики определения компонентов LCB, перечислены на:-6 016528 Согласно одному из вариантов осуществления, стандартные методики, включающие некоторые физические и ферментативные реакционные стадии, могут быть использованы для эмпирического количественного определения компонентов полимерного сырья на основе полученных продуктов реакции. Реестр базы данных для обыкновенного сырья, содержащей соотношения масс для большей части классов обыкновенного сырья, может быть найден по ссылке на:http://www1.eere.energy.qov/biomass/feedstock databases.html. При иллюстрации анализа компонентов сырья, необработанное полимерное сырье сначала должно быть частично гидролизовано перед тем, как оно может быть подвергнуто дальнейшему анализу. Перед гидролизом сырья, образец необработанного сырья (1 г) должен быть помещен в тигель и сушиться при 50 С до тех пор, пока не будет достигнута постоянная масса. Сухую массу записывают до третьего десятичного знака для получения в печи сухой массы (ODW) образца. Для методики гидролиза, 1 г хорошо размолотого сырья (2 мкм) помещают в напорную трубу и добавляют 3 мл 72% об./об. серной кислоты. Напорную трубу устанавливают на водяную баню при 30 С и инкубируют в течение 1 ч. Используя мешалку, образец перемешивают каждые 5-10 мин без удаления образца с бани. Перемешивание является важным для того, чтобы гарантировать равномерное распределение кислоты в частицах. Кислоту разбавляют до 4% добавлением 84 мл дважды дистиллированной воды (д.д.) с использованием бюретки и образец смешивают переворачиванием трубы несколько раз,чтобы исключить фазовое разделение. Для того чтобы определить нерастворимую в кислоте лигниновую фракцию сырья, автоклавированный гидролизный раствор фильтруют в вакууме через предварительно взвешенный фильтровальный тигель. Фильтрат задерживается в фильтровальной колбе, и аликвоту 50 мл переносят в бутылку для хранения образца. Полученный образец будет использован в последующей методике для определения содержания лигнина и углеводов. Определение лигнина, растворимого в кислоте, должно выполняться в пределах шести часов гидролиза. Для определения лигнина, не растворимого в кислоте, д.д. воду добавляют для количественного переноса всех оставшихся нерастворимых частиц из напорной трубы в фильтровальный тигель. Нерастворимые частицы следует промыть минимум 50 мл д.д. воды и последовательно тигель и нерастворимые в кислоте остатки должны быть высушены при 105 С в течение 4 ч или до тех пор, пока не будет достигнута постоянная масс. После инкубирования образцы удаляют из печи и охлаждают в эксикаторе. Массу"w2" тигля и сухого остатка записывают до ближайшего 0,1 мг, прежде чем тигель и остаток помещают в муфельную печь при 575 С на 24 ч. Тигель осторожно удаляют из печи, переносят прямо в эксикатор и охлаждают в течение определенного количества времени, которое равно начальному времени охлаждения тигля. Тигель и золу взвешивают (масса "w3") и помещают обратно в печь до тех пор, пока не будет достигнута постоянная масса. Масса "w2", скорректированная на оставшуюся золу ("w3"), равна массе нерастворимого в кислоте лигнина, содержащегося в необработанном сырье. В отличие от сложных измерений, требующихся для получения количества нерастворимого в кислоте лигнина, количество растворимого в кислоте лигнина может быть легко определено спектрофотометрически. Сначала фоновые измерения проводят для водной 4% об./об. серной кислоты на соответствующем спектрофотометре. Используя начальную гидролизную жидкость, измеряют поглощение при 320 нм и при максимальном поглощении фильтрата гидролизата, которое обычно составляет около 198 нм. По мере необходимости образец растворяют, чтобы привести к диапазону поглощения 0,7-1,0 А единиц. Поглощение образца до третьего десятичного знака используют для вычисления количества растворимого в кислоте лигнина (ASL), присутствующего в образце согласно нижеприведенному расчету:,ODW = сухая масса высушенного в печи образца необработанного сырья;UVabs = среднее UV-vis поглощение для образца при 320 нм; Объемфильтрат = объем фильтрата гидролизата; Е = коэффициент экстинкции раствора гидролизата биомассы при максимальном поглощении образца (численные значения коэффициентов экстинкции для большого количества необработанного полимерного сырья можно найти по адресу;http: /www1.eere.energy.gov/bioinass/analytical procedures .html samples). Раствор гидролизата образца также можно использовать для определения структурных углеводов,содержащихся в гемицеллюлозной фракции сырья с использованием методики, основанной на ВЭЖХ. Такое определение сначала требует отдельной калибровочной смеси для D-целлобиозы, глюкозы,ксилозы, галактозы, арабинозы и маннозы. Концентрации, приготовленные для стандарта каждого сахара, должны находиться в диапазоне между 0,1-4 мг/мл. Для каждого набора калибровочных стандартов должен быть приготовлен независимый подтверждающий калибровочный стандарт (CVS), попадающий в середину подтвержденного диапазона калибровочной кривой (т.е. 2,5 мг/мл). CVS должен быть проанализирован ВЭЖХ после каждой серии калибровок и через постоянные интервалы на всем протяжении-7 016528 последовательности анализа, охватывая группы образцов. CVS используют для подтверждения качества и стабильности калибровочных кривых каждой серии. 20 мл гидролизного раствора, полученного на начальной стадии после гидролиза образца, переносят в 50 мл коническую колбу Эрленмейера. Для нейтрализации образца добавляют карбонат кальция до рН 5-6 и после отстаивания раствора супернатант может быть декантирован. После отстаивания раствор будет обладать приблизительно нейтральным рН. Сахарные калибровочные CVS стандарты и образцы теперь готовы для ВЭЖХ анализа с использованием сахарной колонки Shodex SP0810 (Phenomenex) или Aminex HPX-87P (BioRad), оборудованной соответствующей защитной колонкой. Вливаемый объем образца должен быть от 10 до 50 мкл в зависимости от концентрации и ограничений обнаружителя. Образцы элюируют д.д. водой при скорости потока 0,6 мл/мин и температуре колонки 80 С. Лучше всего элюирование образца может наблюдаться при использовании определения показателя преломления. Перед анализом хроматограммы должны быть объединены и содержание отдельных сахаров должно быть определено по отношению к соответствующим кривым стандартов для каждого сахаридного компонента. Ферментативные системы В вариантах осуществления, описываемых в данном описании, специфичности используемых смесей ферментов являются индивидуальными для получения чистых мономерных потоков продукции (определенный мономерный или полимерный строительный блок(и, полученных из различных классов полимерных субстратов. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения ферментативные системы,применяемые к определенному необработанному или обработанному полимерному сырью, могут содержать не более 50% других ферментативных активностей, которые могут приводить к продуктам, отличным от предпочтительного продукта, из обозначенного полимерного сырья. В более предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения смеси ферментативных систем, применяемых к необработанному или обработанному полимерному сырью, могут содержать не более чем (или менее чем) 20%, предпочтительно не более чем (или менее чем) 10%, более предпочтительно не более чем (или менее чем) 5%, более предпочтительно не более чем (или менее чем) 2%,наиболее предпочтительно не более чем (или менее чем) 1% других ферментативных активностей, которые могут приводить к продуктам, отличным от предпочтительного продукта из обозначенного полимерного сырья. Процентное содержание других ферментативных активностей может быть в плановом порядке определено с использованием стандартных способов определения соответствующей ферментативной активности. Таким образом, "главная" ферментативная активность, присутствующая в ферментативной системе, приводит к высвобождению желаемого определенного мономерного или полимерного строительного блока из необработанного или обработанного полимерного сырья, количество которого должно составлять по меньшей мере 50%, предпочтительно по меньшей мере 80%, более предпочтительно по меньшей мере 90%, более предпочтительно по меньшей мере 95%, более предпочтительно по меньшей мере 98%, более предпочтительно по меньшей мере 99% всех ферментативных активностей, присутствующих в ферментативной системе. Ферментативные активности могут быть определены согласно стандартным способам, известным специалисту в данной области и как описано в данном описании. Согласно одному предпочтительному варианту осуществления вышеуказанные процентные содержания могут быть легко определены посредством обработки необработанного полимерного сырья ферментативной системой согласно вышеуказанной стадии а) и анализа высвобожденных растворимых мономерных или олигомерных строительных блоков после жидкостного-твердотельного отделения от нерастворимого необработанного полимерного сырья согласно стадии b). Таким образом, если высвобожденные мономерные или олигомерные строительные блоки содержат более чем 50 мол.% желаемого специфического строительного блока (основываясь на общем содержании твердого вещества), считают, что другие ферментативные активности, присутствующие в ферментативной системе, составляют менее чем 50%. Аналогично, если высвобожденные мономерные или олигомерные строительные блоки содержат более чем 80, 90, 95, 98 или 99 мол.% желаемого специфического строительного блока, считается, что другие ферментативные активности, присутствующие в ферментативной системе, составляют менее чем 20, 10, 5, 2 или 1 мол.%, соответственно. Соответственно, в данном случае полагают, что "главная" ферментативная активность, присутствующая в ферментативной системе и ведущая к высвобождению желаемого определенного мономерного или олигомерного строительного блока из необработанного полимерного сырья, составляет по меньшей мере 50%, предпочтительно по меньшей мере 80%, более предпочтительно по меньшей мере 90%, более предпочтительно по меньшей мере 95%, более предпочтительно по меньшей мере 98%, более предпочтительно по меньшей мере 99% от всех ферментативных активностей, присутствующих в ферментативной системе. Согласно дополнительному варианту осуществления "мол.%" заменен на "мас.%" в указанном выше определении процентного содержания ферментатив-8 016528 ной активности (активностей). Согласно одному из вариантов осуществления, ферментативные активности могут быть определены путем измерения скорости превращения выбранного полимерного субстрата, как определено выше. В альтернативном варианте осуществления ферментативные активности, присутствующие в ферментативной системе, могут быть определены посредством использования искусственных субстратов. В зависимости от простоты и надежности используемых способов определения, можно измерить или превращение самого субстрата, или альтернативно, образование специфического продукта в результате ферментативно катализируемой реакции. В особых случаях каталитические промежуточные продукты самого фермента (т.е. оксидоредуктазы) могут быть определены спектрофотометрически. Тестирование составленных смесей ферментов на ферментативные активности известно специалистам в данной области. Библиотека подходящих тестов для специфических ферментативных активностей приведена по ссылке на:http://www.sigmaaldrich.com/Area of Interest/Biochemicals/Enzym e Explorer/Key Resources/Assay Library/Assays by Enzyme Name.htm1. Примеры специфических тестов на определение ферментативных активностей конкретных классов ферментов перечислены ниже. В особом случае, как эндо-, так и экзоцеллюлазная активность может быть измерена в 0,5 мл 50 мМ реакционного буфера MES (рН 6), содержащего 10 мМ CaCl2, 4 мМ п-нитрофенил-бета-D-целлобиозида и 200 мкл раствора для разбавления фермента. Реакцию следует инкубировать при 50 С в течение 30 мин. Глициновый буфер (100 мМ, рН 4) добавляют для остановки реакции. Затем ферментативная активность может быть определена посредством измерения количества высвобождаемого п-нитрофенола спектрофотометрически при 430 нм. Значения поглощения п-нитрофенола переводят в микромоли нитрофенола с использованием стандартной кривой, связывающей микромоли нитрофенола с поглощением. Одна единица целлюлазной активности представляет собой количество фермента, требующееся для высвобождения 1 мкмоль п-нитрофенола/мин в условиях анализа (Wood, T.M. и Bhat, К., 1988). В другом особом случае, арабинофуранозидазная активность может быть определена в 1 мл 50 мМ фосфата натрия (рН 7), содержащем 4-100 мкМ 4-нитрофенил-альфа-L-арабинофуранозида (pNP-Araf) и раствор для разбавления фермента (4 нМ-8 мкМ). Реакцию можно инкубировать при 37 С и количество высвобожденного 4-нитрофенола измеряют при 400 нм. Ферментативная активность может быть вычислена с использованием коэффициента экстинкции 10500 М-1 см-1 4-нитрофенола при 400 нм (Taylor et al., 2006). В другом особом случае ксилозидазная активность может быть определена с использованием онитрофенол-замещенного бета-D-ксилопиранозида (ONP-бета-D-ксилопиранозид) в качестве субстрата(Chen et al., 1986). Основной раствор субстрата (10 мМ) приготавливают в 100 мМ цитратном буфере (рН 5). Раствор для разбавления фермента, подлежащего тестированию, приготавливают в д.д. воде. Реакция содержит равные молярные количества субстрата и раствора фермента в 200 мМ боратном буфере при 25 С и рН 9,8. Для определения ферментативной активности высвобождение о-нитрофенола регистрируют спектрофотометрически при длине волны 410 нм. Ферментативная активность в единицах/мг фермента пропорциональна высвобожденному количеству о-нитрофенола и может быть вычислена, как описано для активности целлюлазы. В другом особом случае, лакказную активность определяют с использованием окислительного теста с гваяколом. Готовят свежий основной раствор 10 мМ в 50 мМ цитратном буфере(рН 4,3, 40 С). Реакцию проводят в 2 мл 50 мМ цитратного буфера с использованием 10 мкл основного раствора для разбавления фермента (1-3 нМ) и различных количеств субстрата (5-20 мкл). Затем скорость окисления гваякола измеряют спектрофотометрически при 465 нм. Скорость окисления гваякола может быть определена с использованием коэффициента экстинкции 5200 М-1 см-1 для продуктов окисления гваякола (Smirnov etal. 2001). В другом особом случае, активность марганцевой пероксидазы (MnP) может быть измерена в 50 мМ тартратном буфере (рН 3, 25 С) посредством добавления 100 мкМ H2O2 к реакционной смеси, содержащей 0,5 мкМ/мл MnP и 5-200 мкМ Mn2+. За образованием Mn3+ наблюдают спектрофотометрически при 238 на (Kmaitisuji et al., 2005). Для определения того, содержит ли пригодная конкретная ферментативная система (перечисленная в табл. 1) для производства желаемого продукта, нежелательные активности из любой другой ферментативной системы (перечисленной в табл. 1), образующей другой нежелательный продукт из того же или другого полимерного субстрата, можно провести тестирование на данную активность с использованием специфического полимерного субстрата или искусственного субстрата, как описано выше, посредством использования любых способов, как описано выше. Например, если предполагают, что конкретная ферментативная система, содержащая целлюлазы,как указано в табл. 1, содержит нежелательную ксилозидазную активность (как указано в табл. 1), основная целлюлазная активность может быть протестирована сначала с использованием искусственного целлюлозного субстрата и определением количества глюкозы, высвобожденной после добавления определенного количества ферментативной системы за единицу времени. Когда целлюлазная активность пре-9 016528 парата будет определена, тот же самый препарат фермента можно протестировать на ксилозидазную активность посредством приведения ферментативной системы в контакт с искусственным ксилановым субстратом, с последующим измерением количества ксилозы, высвобожденной определенным количеством фермента в единицу времени. Посредством измерения относительных скоростей превращения для определенного периода времени как с целлюлазным, так и с ксилозидазным субстратами с использованием определенного количества фермента, могут быть вычислены специфические активности для каждого класса субстратов. Пригодные субстраты для определения любой ферментативной активности, как указано в таблице 1, приведены в табл. 2. В альтернативном варианте осуществления подход для определения того, содержит ли ферментативная система любые независимые загрязняющие ферментативные активности, состоит в разделении компонентов указанного препарата способами, такими как электрофорез или хроматография. Отдельные компоненты препарата могут быть обнаружены с использованием специальных способов, таких как колориметрическое окрашивание или обнаружение компонентов по оптической плотности или других способов, известных специалистам в данной области. Относительный % распределения белково-подобных компонентов может быть определен с использованием количественных способов, таких как денситометрия, или любых других эквивалентных способов, известных специалистам в данной области, в комбинации с соответствующими математическими вычислениями. Определение последовательности Перед отдельными или серийными стадиями ферментативной обработки требуется высвободить определенные мономерные или олигомерные продукты (строительные блоки) из необработанного или обработанного полимерного сырья, растворимые компоненты необработанного полимерного сырья,предпочтительно, отделяют посредством одной или многих предварительных стадий(и) обработки. В предпочтительном варианте осуществления изобретения предварительная стадия(и) обработки для отделения растворимых компонентов необработанного или обработанного полимерного сырья перед ферментативной обработкой представляет собой комбинацию по меньшей мере одной предварительной стадии физико-химической обработки и одной или нескольких стадий промывки. Согласно другому предпочтительному варианту осуществления изобретения, стадию(и) промывки для отделения растворимых компонентов от необработанного или обработанного полимерного сырья перед ферментативной обработкой предпочтительно выполняют с гидрофильным растворителем(лями), предпочтительно водным растворителем(лями), таким как вода. Как указано выше, было обнаружено, что стадия(и) промывки и предварительная стадия(и) физико-химической обработки увеличивают эффективность последующей стадии(й) ферментативной обработки. Согласно дополнительному предпочтительному варианту осуществления, предварительную стадию физико-химической обработки применяют только перед первой стадией ферментативной обработки (стадия а) необработанного полимерного сырья. Такая предварительная стадия физико-химической обработки может быть объединена по меньшей мере с одной стадией промывки перед первой стадией ферментативной обработки (стадия а) необработанного полимерного сырья. Более того, предпочтительно, стадии предварительной обработки обработанного полимерного сырья содержат по меньшей мере только одну стадию промывки без дополнительных предварительных стадий физико-химической обработки. Стадии физико-химической предварительной обработки для полимерного сырья могут включать,но без ограничения, экстрагирование горячей водой, низкотемпературный паровой взрыв, кислотный паровой взрыв, аммиачный паровой взрыв и обработку ультразвуком. Их можно использовать для физического изменения необработанных полимерных субстратов для того, чтобы увеличить поверхностную доступность растительных волокон и снизить кристалличность целлюлозной фракции (Puls et al., 1985;Ramos et al., 2005; Kinley et al., 2005). Предпочтительно указанные выше стадии предварительной обработки изменяют физические свойства структуры необработанного полимерного субстрата таким образом, что субстрат становится более доступным для последующих ферментативных стадий, но или высвобождает ограниченные количества своих химических строительных блоков, или не высвобождает их вообще. Кроме того, их можно использовать для дополнительного удаления растворимых субстанций, содержащихся в необработанном полимерном сырье, перед приведением необработанного полимерного сырья во взаимодействие с ферментативной системой для предотвращения загрязнения продуктов данной стадии ферментативной обработки растворимыми субстанциями, содержащимися в сырье. Когда две или более стадии способа используются последовательно, последовательность таких стадий способа и, таким образом, последовательность добавления смеси ферментов, как описано в таблице 1, зависит от специфического состава используемого необработанного полимерного сырья. Последовательность стадий способа и ферментативных систем выбирают таким образом, чтобы минимизировать дозировки и стоимость ферментативных катализаторов, а также время контактирования сырья, ведущее к высвобождению желаемых продуктов. Дополнительно, выбранная последовательность стадий должна оптимизировать чистоту, а также рентабельность мономерных или олигомерных продуктов реакции, высвобождаемых из полимерного субстрата. Следовательно, последовательность стадий способа зависит от- 10016528 сырья и продуктов. Согласно одному предпочтительному варианту осуществления изобретения, фермент или ферментативную систему, используемую на первой стадии ферментативной обработки а), выбирают из группы,состоящей из ферментов или ферментативных систем, высвобождающих глюкозу, согласно табл. 1, и определенный растворимый мономерный или олигомерный строительный блок представляет собой глюкозу, и фермент или ферментативную систему, используемую на второй стадии ферментативной обработки а), выбирают из группы, состоящей из ферментов и ферментативных систем, высвобождающих ксилозу, согласно табл. 1, и соответствующие определенный растворимый мономерный или олигомерный строительный блок представляет собой ксилозу. Согласно другому предпочтительному варианту осуществления изобретения, фермент или ферментативную систему, используемую на первой стадии ферментативной обработки а), выбирают из группы,состоящей из ферментов и ферментативных систем, высвобождающих ксилозу, согласно табл. 1, и определенный растворимый мономерный или олигомерный строительный блок представляет собой ксилозу,и фермент или ферментативную систему, используемую на второй стадии ферментативной обработки а),выбирают из группы, состоящей из ферментов или ферментативных систем, высвобождающих глюкозу,согласно табл. 1, и соответствующий определенный растворимый мономерный или олигомерный строительный блок представляет собой глюкозу. Согласно одному предпочтительному варианту осуществления специфическая последовательность ферментативных обработок, необходимых для расщепления конкретного сырья на составляющие блоки,может быть определена эмпирически, даже если состав сырья неизвестен. Следовательно, возможно расщеплять необработанное полимерное сырье на раздельных стадиях обработки с множеством смесей ферментов различных продуктов, как указано в табл. 1. Для каждой из стадий обработки чистоту и состав полученного потока продукции измеряют с использованием аналитических методов, известных специалисту в данной области, содержащих, но без ограничения, спектроскопические и хроматографические методы, как описано выше для анализа состава сырья и для определения ферментативной активности. Используя результаты данных измерений, можно выбрать кинетически благоприятную смесь ферментов, приводящую к самым чистым потокам продукции в качестве основой стадии обработки сырья. После повторения промывки нерастворимых остатков, полученных в результате указанной отдельной ферментативной обработки, остатки снова обрабатывают другим множеством смесей ферментов, за исключением смеси ферментов, выбранных для основной обработки. Для всех таких ферментативных обработок состав полученного продукта определяют способами, как описано выше. Смесь ферментов, приводящих к самому чистому потоку продукции, выбирают в качестве вторичной стадии обработки конкретного сырья. Остающийся нерастворимый материал, полученный при второй обработке, снова тщательно промывают и снова тестируют с оставшимися ферментативными системами, как описано выше. Этот процесс аналитического определения и выбора самых чистых потоков продукции, полученных из каждой из оставшихся смесей ферментов таблицы 1, предпочтительно повторяют до тех пор, пока сырье или не будет расщеплено полностью, или нерастворимые остатки сырья, остающиеся после повторения ферментативных обработок, не будут представлять значительной экономической выгоды для оператора,по сравнению со стоимостью возможной дополнительной обработки. Согласно одному предпочтительному аспекту изобретения, ферментативную систему, дающую самую высокую чистоту определенных растворимых мономерных или олигомерных строительных блоков после обработки необработанного полимерного сырья ферментативной системой, и отделение определенных растворимых мономерных или олигомерных строительных блоков от остатков необработанного полимерного сырья (обработанного полимерного сырья) выбирают для первой стадии ферментативной обработки согласно стадии а). Согласно дополнительному предпочтительному аспекту изобретения, вторая ферментативная система, выбранная для второй стадии ферментативной обработки согласно стадии а), представляет собой ферментативную систему, которая дает самую высокую чистоту определенных растворимых мономерных или олигомерных строительных блоков после обработки обработанного полимерного сырья (полученного в виде остатков от предыдущей стадии ферментативной обработки) ферментативной системой и отделения определенных растворимых мономерных или олигомерных строительных блоков от необработанного полимерного сырья. Согласно еще одному дополнительному предпочтительному аспекту изобретения, любые последующие стадии ферментативной обработки выполняют в порядке снижения чистоты определенных растворимых мономерных или олигомерных строительных блоков, полученных после обработки обработанного полимерного сырья (полученного на предыдущей стадии ферментативной обработки) соответствующей ферментативной системой и отделения определенных растворимых мономерных или олигомерных строительных блоков от обработанного полимерного сырья. В другом варианте состав сырья определяют посредством указанных выше аналитических методик перед выбором последовательности вариантов ферментативной обработки. Таким образом, согласно предпочтительному варианту осуществления изобретения, используемые ферментативные системы и последовательность их использования определяют посредством первичного анализа необработанного- 11016528 полимерного сырья. Один такой предпочтительный вариант осуществления изобретения направлен на способ, в частности, определения ферментативных систем, подлежащих использованию, и их последовательности, где,предпочтительно, после отделение растворимых компонентов от необработанного полимерного субстрата, как описано выше, нерастворимое необработанное полимерное сырье(a) сначала обрабатывают в раздельных ферментативных обработках каждой из множества ферментативных систем (смесей), таких, как перечислено в табл. 1 (предпочтительно выбранной из тех, что высвобождают растворимые мономерные или олигомерные сахаридные строительные блоки из полимерного сырья);(b) для каждой ферментативной обработки, определенные мономерные или олигомерные строительные блоки, высвобожденные из необработанного полимерного сырья, анализируют на чистоту определенных мономерных или олигомерных строительных блоков, предпочтительно, после жидкостноготвердотельного отделения (растворимых) определенных мономерных или олигомерных строительных блоков от (нерастворимого) необработанного полимерного сырья;(c) ферментативную систему, дающую самую высокую чистоту, выбирают для первой стадии ферментативной обработки согласно стадии а) по п.1;(d) необязательно, последовательность стадий а)-с) повторяют с остатками необработанного или обработанного полимерного сырья для определения ферментативной системы, которую нужно использовать на последующей стадии ферментативной обработки. В альтернативном варианте осуществления после отделения растворимых компонентов от необработанного или обработанного полимерного сырья, как описано выше, избирательные смеси ферментов,как указано в табл. 1, применяют к целевым компонентам сырья, имеющим самое большое массовое отношение в составе сырья. После ферментативной обработки, чистоту полученного потока продукции определяют, как описано выше, для аналитического определения компонентов сырья. Согласно предпочтительному варианту осуществления желательно, чтобы чистота составляла более чем 75 мас.%, предпочтительно более чем 90 мас.%, более предпочтительно более чем 95 мас.%, более предпочтительно более чем 99 мас.% от общего содержания твердого вещества (предпочтительно растворимой фракции),состоящего из определенных мономерных или олигомерных строительных блоков. Если ферментативное расщепление компонента сырья с наибольшей массой приводит к чистому потоку продукции (как определено выше), такую обработку можно применять в качестве основной стадии для обработки сырья. Промывка полученной нерастворимой пульпы и последующее жидкостноетвердотельное отделение макрочастиц от супернатанта будет подготовкой для следующих стадий обработки. Оставшиеся нерастворимые частицы, полученные при основной обработке сырья, будут обработаны специфическими ферментативными системами, такими как ферментативные системы, перечисленные в таблице 1, которые нацелены на компоненты сырья, имеющие второе наибольшее массовое отношение в составе сырья. Полученный поток продукции снова должен быть анализирован посредством указанных аналитических способов для установления чистоты продукта перед тем, как выбранную ферментативную обработку можно будет считать вторым вариантом обработки сырья. Затем нерастворимые остатки, полученные при второй ферментативной обработке, могут быть промыты и обработаны, как описано выше. Через повторяющиеся обработки специфическими ферментативными системами, перечисленными в табл. 1, которые всегда нацелены на полимерный субстрат, состоящий из компонента с самым большим массовым отношением в оставшемся нерастворимом остатке сырья, полученного на предыдущих циклах ферментативной обработки, сырье может быть последовательно расщеплено на составляющие его блок. Дополнительный предпочтительный аспект изобретения направлен на способ, в частности, определения ферментативных систем, которые нужно использовать, и их последовательности, где, предпочтительно, после отделения растворимых компонентов от необработанного полимерного сырья, как описано выше, нерастворимое необработанное полимерное сырье(а) сначала обрабатывают в раздельных ферментативных обработках каждой из множества ферментативных систем (смесей), таких как указано в табл. 1 (предпочтительно выбранных из ферментативных систем, высвобождающих растворимые мономерные или олигомерные сахаридные строительные блоки из полимерного сырья) для определения мономерных или олигомерных строительных блоков, имеющих наибольшее массовое отношение в необработанном полимерном сырье;(b) определенные мономерные или олигомерные строительные блоки, имеющие наибольшее массовое отношение в необработанном полимерном сырье, анализируют на чистоту, предпочтительно, после отделения от необработанного полимерного сырья;(c) если определенная чистота составляет более чем 75 мас.%, предпочтительно более чем 90 мас.%,более предпочтительно более чем 95 мас.%, более предпочтительно более чем 99 мас.% от общего содержания твердого вещества, состоящего из определенных мономерных или олигомерных строительных блоков, соответствующую ферментативную систему выбирают для первой стадии ферментативной обработки согласно стадии а) по п.1;(d) если чистота, определенная согласно стадии b), ниже требуемой согласно стадии с), определен- 12016528 ные мономерные или олигомерные строительные блоки, имеющие следующее наибольшее массовое отношение в необработанном полимерном сырье, анализируют на чистоту, предпочтительно после жидкостного-твердотельного отделения от (нерастворимого) необработанного полимерного сырья, соответственно, до тех пор, пока чистота не будет удовлетворять требованиям согласно стадии с), и соответствующую ферментативную систему выбирают для первой стадии ферментативной обработки согласно стадии а) по п.1;(e) необязательно последовательность стадий a)-d) повторяют с остатками необработанного или обработанного полимерного сырья для определения ферментативной системы, которую нужно использовать на последующей стадии ферментативной обработки. Еще один дополнительный предпочтительный аспект изобретения направлен на способ, в частности, определения ферментативных систем, которые нужно использовать, и их последовательности, где необработанное полимерное сырье(a) сначала обрабатывают в раздельных ферментативных обработках каждым из множества ферментов или ферментативных систем (смесей), например, перечисленных в табл. 1 (предпочтительно, выбранных из ферментов и ферментативных систем, высвобождающих растворимые мономерные или олигомерные сахаридные строительные блоки из полимерного сырья), для определения ферментативной обработки, которая ведет к самому высокому выходу мономерных или олигомерных строительных блоков, содержащихся в необработанном полимерном сырье;(b) выбирают такие ферментативные обработки, которые дают определенный мономерный или олигомерный продукт с чистотой более чем 75 мас.%, предпочтительно более чем 90 мас/%, более предпочтительно более чем 95 мас.%, более предпочтительно более чем 99 мас.% от общего содержания твердого вещества (предпочтительно после отделения от нерастворимого необработанного или обработанного полимерного сырья);(c) среди оставшихся ферментативных обработок определяют обработку с самым высоким выходом мономерного или олигомерного продукта;(d) необязательно последовательность стадий а)-с) повторяют с остатками необработанного или обработанного полимерного сырья для определения ферментативной системы, которую нужно использовать на последующей стадии ферментативной обработки. Согласно дополнительному предпочтительному аспекту изобретения, ферментативные системы,используемые на стадии ферментативной обработки, используют в последовательности в соответствии с последовательностью, доступной согласно указанным выше способам определения ферментативных систем, которые нужно использовать. Согласно другому предпочтительному аспекту изобретения, ферментативные системы, для которых определение благоприятной последовательности применения обсуждалось выше, содержат или состоят из ферментов, высвобождающих растворимые мономерные или олигомерные сахаридные строительные блоки из (необработанного) полимерного сырья. Согласно дополнительному предпочтительному варианту осуществления изобретения, соответствующие ферменты и ферментативные системы представляют собой ферменты и ферментативные системы, обладающие (основной) активностью, направленной на расщепление олиго- или полисахаридов и/или высвобождение растворимых мономерных или олигомерных сахаридных строительных блоков из необработанного или обработанного полимерного сырья. Согласно одному из вариантов осуществления для определения выхода или чистоты определенных растворимых мономерных или олигомерных строительных блоков (продукта), полученного в конкретной ферментативной обработке с последующим отделением определенных растворимых мономерных или олигомерных строительных блоков от (остатков нерастворимого) необработанного или обработанного полимерного сырья после инкубирования с ферментом, гидролизную суспензию (с ферментом и полимерным сырьем) центрифугируют при 10000 g в течение 15 мин. Супернатант (содержащий определенные растворимые мономерные или олигомерные строительные блоки) обрабатывают, как описано в данном описании ниже в примерах, и подвергают HPAE-PAD анализу (Dionex, Ca., USA, б) для определения сахара и уроновой кислоты в его составе. Как указано выше, согласно предпочтительному аспекту изобретения, используемые ферментативные системы, по существу, не должны содержать или содержат в малой степени загрязняющие ферментативные активности, которые высвобождают из необработанного или обработанного полимерного сырья мономерные иди олигомерные строительные блоки, отличные от запланированных. Таким образом, согласно предпочтительному варианту осуществления, ферментативная система,используемая на определенной стадии ферментативной обработки, обладает не более чем 50%, предпочтительно не более чем 20%, более предпочтительно не более чем 10%, более предпочтительно не более чем 5%, более предпочтительно не более чем 2%, более предпочтительно не более чем 1% загрязняющих(других) ферментативных активностей, которые не были использованы на предыдущей стадии ферментативной обработки, использующей различные ферментативные системы, или которые могут служить причиной высвобождения других определенных мономерных или олигомерных строительных блоков,которые не были высвобождены на предыдущих стадиях ферментативной обработки, или, согласно одному дополнительному варианту осуществления, которые только могут служить причиной высвобожде- 13016528 ния продуктов из полимерных субстратов, которые изначально по существу отсутствовали в полимерном сырье. Процентное содержание других или загрязняющих ферментативных активностей в ферментативной системе может быть вычислено, как изложено выше. "По существу, отсутствовали в", согласно предпочтительному варианту осуществления, означает менее чем 20 мас.%, предпочтительно менее чем 10 мас.%, предпочтительно менее чем 5 мас.%, предпочтительно менее чем 2 мас.%, предпочтительно менее чем 1 мас.% от общего полимерного сырья. Однако согласно преимущественному и предпочтительному варианту осуществления изобретения ферментативная система, используемая на конкретной стадии ферментативной обработки, обладает в качестве загрязняющих ферментативных активностей одной или несколькими такими ферментативными активностями, которые использовались на предыдущей стадии ферментативной обработки, использующей различные ферментативные системы, или, согласно дополнительному варианту осуществления,ферментативные системы, которые только могут служить причиной высвобождения других мономерных или олигомерных строительных блоков из полимерных субстратов, которые изначально, по существу,отсутствовали в необработанном или обработанном полимерном сырье. Другими словами, было обнаружено, что когда конкретный мономерный или олигомерный строительный блок был предварительно высвобожден из необработанного или обработанного полимерного сырья на предыдущей стадии ферментативной обработки (или не присутствовал в необработанном полимерном сырье сначала), не существенно,что ферментативная система, используемая на последующей стадии, по существу, свободна от соответствующей ферментативной активности, используемой в качестве основной активности на любой предыдущей стадии ферментативной обработки. Одно преимущество данного варианта осуществления состоит в том, что менее чистые и, таким образом, менее дорогостоящие ферментативные системы можно использовать на второй и последующих стадиях ферментативной обработки. В конкретном случае такого способа ферментативное превращение ксилана в ксилозу выполняют в одну стадию обработки после ферментативной обработки целлюлозы, с последующим удалением продукта глюкозы на предыдущей стадии обработки. Таким образом, смеси ферментов, обозначенные в таблице 1, для превращения ксилана в ксилозу также могут содержать любые загрязняющие ферментативные активности, которые специфичны для обработки целлюлозы. Дополнительно, согласно дополнительному предпочтительному варианту осуществления изобретения, ферментативные системы, используемые для обработки конкретного компонента необработанного или обработанного полимерного сырья могут содержать загрязняющие (другие) ферментативные активности, если они действуют на специфические промежуточные продукты реакции, вытекающие из предшествующих ферментативных реакций, и если финальные конечные продукты идентичны. Другими словами, дополнительный предпочтительный вариант осуществления изобретения направлен на способ, в котором ферментативная система, используемая на конкретной стадии ферментативной обработки, обладает основной ферментативной активностью (как описано выше) и содержит по меньшей мере одну дополнительную ферментативную активность, которая приводит к такому же определенному мономерному или олигомерному строительному блоку(ам) из необработанного или обработанного полимерного сырья,что и основная ферментативная активность ферментативной системы, в частности, из разных полимерных субстратов, присутствующих в необработанном или обработанном полимерном сырье. В конкретном случае необработанный полимерный субстрат содержит как целлюлозу, так и крахмал (амилозу), и представляющий интерес продукт на соответствующей стадии обработки представляет собой глюкозу. Затем может допускаться загрязнение смеси ферментов, обозначенных в табл. 1, для превращения целлюлозы (целлюлазные активности), с сопровождающими побочными активностями для превращения крахмала (амилазные активности), как обозначено в табл. 1. Поэтому ферментативная система не должна содержать другие ферментативные активности, превышающие определенную пропорцию, за исключением амилазных активностей. В данном случае, исходный продукт для различных ферментативных реакций может быть различным, но продуктом в каждом случае является глюкоза. Согласно одному предпочтительному варианту осуществления, сырье представляет собой целлюлоза-ксилан-обогащенное сырье, и фермент или ферментативную систему, используемую на первой стадии ферментативной обработки а), выбирают из группы, состоящей из ферментов или ферментативных систем, высвобождающих глюкозу, согласно табл. 1, и определенный растворимый мономерный или олигомерный строительный блок представляет собой глюкозу, и фермент или ферментативную систему, используемую на второй стадии ферментативной обработки а), выбирают из группы, состоящей из ферментов и ферментативных систем, высвобождающих ксилозу, согласно табл. 1, и определенный растворимый мономерный или олигомерный строительный блок представляет собой ксилозу. Более того, в данном варианте осуществления, предпочтительно, фермент или ферментативную систему, используемую на первой стадии а), выбирают из группы: бета-глюкозидазы из A. niger или из Т. reesei; целлобиогидролазы I-II из Т. reseei; эндо-бета-1-4-D-глюканаза I-V из Т. reseei, и фермент или ферментативную систему,используемую на второй стадии а), выбирают из группы: эндоксиланазы из A. niger или Т. reesei или С.thermocellum; ксилозидазы из A. niger или Т. reesei. Согласно другому предпочтительному варианту осуществления сырье представляет собой целлюлоза-ксилан-обогащенное сырье, и фермент или ферментативную систему, используемую на первой ста- 14016528 дии ферментативной обработки а), выбирают из группы, состоящей из ферментов и ферментативных систем, высвобождающих ксилозу, согласно табл. 1, и определенный растворимый мономерный или олигомерный строительный блок представляет собой ксилозу, и фермент или ферментативную систему, используемую на второй стадии ферментативной обработки а), выбирают из группы, состоящей из ферментов или ферментативных систем, высвобождающих глюкозу, согласно табл.1, и определенный растворимый мономерный или олигомерный строительный блок представляет собой глюкозу. Более того, в данном варианте осуществления, предпочтительно, фермент или ферментативную систему, используемую на первой стадии а), выбирают из группы: эндоксиланазы из A. niger или Т. reesei или С. thermocellum; ксилозидазы из A. niger или Т. reesei, и фермент или ферментативную систему, используемую на второй стадии а), выбирают из группы: бета-глюкозидазы из A. niger или из Т. reesei; целлобиогидролазы I-II из Т. reseei; эндо-бета-1-4-D-глюканазы I-V из Т. reseei. Согласно другому предпочтительному варианту осуществления сырье представляет собой арабинан-пектин-обогащенное сырье, и фермент или ферментативную систему, используемую на первой стадии ферментативной обработки а), выбирают из группы, состоящей из ферментов или ферментативных систем, высвобождающих арабинозу, согласно табл.1, и определенный растворимый мономерный или олигомерный строительный блок представляет собой арабинозу, и фермент или ферментативную систему, используемую на второй стадии ферментативной обработки а), выбирают из группы, состоящей из ферментов или ферментативных систем, высвобождающих уроновую кислоту, согласно табл. 1, и определенный растворимый мономерный или олигомерный строительный блок представляет собой уроновую кислоту. Более того, в данном варианте осуществления, предпочтительно, фермент или ферментативную систему, используемую на первой стадии а), выбирают из группы: эндоарабиназы из A. niger; арабинофукозидазы из A. niger, и фермент или ферментативную систему, используемую на второй стадии а),выбирают из группы: пектиназы (пектатлиаза, полигалактоуреназа) из A. aculeatus, A. niger или С. japonicus. Согласно другому предпочтительному варианту осуществления, сырье представляет собой арабинан-пектин-целлюлоза-обогащенное сырье, и фермент или ферментативную систему, используемую на первой стадии ферментативной обработки а), выбирают из группы, состоящей из ферментов или ферментативных систем, высвобождающих арабинозу, согласно табл. 1, и определенный растворимый мономерный или олигомерный строительный блок представляет собой арабинозу, фермент или ферментативную систему, используемую на второй стадии ферментативной обработки а), выбирают из группы,состоящей из ферментов или ферментативных систем, высвобождающих глюкозу, согласно табл. 1, и определенный растворимый мономерный или олигомерный строительный блок представляет собой глюкозу, и фермент или ферментативную систему, используемую на третьей стадии ферментативной обработки а), выбирают из группы, состоящей из ферментов или ферментативных систем, высвобождающих уроновую кислоту, согласно табл. 1, и определенный растворимый мономерный или олигомерный строительный блок представляет собой уроновую кислоту. Более того, в данном варианте осуществления, предпочтительно, фермент или ферментативную систему, используемую на первой стадии а), выбирают из группы: эндоарабиназы из A. niger; арабинофукозидазы из A. niger, фермент или ферментативную систему, используемую на второй стадии а), выбирают из группы: бета-глюкозидазы из A. niger или из T. reesei; целлобиогидролазы I-II из Т. reseei; эндо-бета-1-4-D-глюканазы I-V из Т. reseei, и фермент или ферментативную систему, используемую на третьей стадии а), выбирают из группы: пектиназы (пектатлиаза, полигалактоуреназа) из A. aculeatus, A. niger или С. japonicus. Согласно другому предпочтительному варианту осуществления сырье представляет собой галактанпектин-обогащенное сырье, и где фермент или ферментативную систему, используемую на первой стадии ферментативной обработки а), выбирают из группы, состоящей из ферментов или ферментативных систем, высвобождающих галактозу, согласно табл. 1, и определенный растворимый мономерный или олигомерный строительный блок представляет собой галактозу, и где фермент или ферментативную систему, используемую на второй стадии ферментативной обработки а), выбирают из группы, состоящей из ферментов или ферментативных систем, высвобождающих уроновую кислоту, согласно табл.1, и определенный растворимый мономерный или олигомерный строительный блок представляет собой уроновую кислоту. Более того, в данном варианте осуществления, предпочтительно, фермент или ферментативную систему, используемую на первой стадии а), выбирают из группы: эндогалактоназы из A. niger или из С.thermocellum; бета-галактозидазы из A. niger или К. fragilis, и фермент или ферментативную систему,используемую на второй стадии а), выбирают из группы: пектиназы (пектатлиаза, полигалактоуреназа) из A. aculeatus, A. niger или С. japonicus. Согласно другому предпочтительному варианту осуществления сырье представляет собой маннанксилан-обогащенное сырье, и фермент или ферментативную систему, используемую на первой стадии ферментативной обработки а), выбирают из группы, состоящей из ферментов или ферментативных систем, высвобождающих маннозу, согласно табл. 1, и определенный растворимый мономерный или олигомерный строительный блок представляет собойма,ннозу, и фермент или ферментативную систему, используемую на второй стадии ферментативной обработки а), выбирают из группы, состоящей из ферментов и ферментативных систем, высвобождающих ксилозу, согласно табл. 1, и определенный раствори- 15016528 мый мономерный или олигомерный строительный блок представляет собой ксилозу. Более того, в данном варианте осуществления, предпочтительно, фермент или ферментативную систему, используемую на первой стадии а), выбирают из группы: эндо-маннаназы из A. niger, В. subtilis, Т. maritima или из Т.reesei; экзо-маннозидазы из С. fimi, и фермент или ферментативную систему, используемую на второй стадии а), выбирают из группы: эндоксиланазы из A. niger или T. reesei или С. thermocellum; ксилозидазы из A. niger или Т. reesei. Согласно другому предпочтительному варианту осуществления сырье представляет собой маннанцеллюлоза-обогащенное сырье, и фермент или ферментативную систему, используемую на первой стадии ферментативной обработки а), выбирают из группы, состоящей из ферментов или ферментативных систем, высвобождающих маннозу, согласно табл. 1, и определенный растворимый мономерный или олигомерный строительный блок представляет собой маннозу, и фермент или ферментативную систему,используемую на второй стадии ферментативной обработки а), выбирают из группы, состоящей из ферментов или ферментативных систем, высвобождающих глюкозу, согласно табл. 1, и определенный растворимый мономерный или олигомерный строительный блок представляет собой глюкозу. Более того, в данном варианте осуществления, предпочтительно, фермент или ферментативную систему, используемую на первой стадии а), выбирают из группы: эндо-маннаназы из A. niger, В. subtilis, Т. maritima или из Т. reesei; экзо-маннозидазы из С. fimi, и фермент или ферментативную систему, используемую на второй стадии а), выбирают из группы: бета-глюкозидазы из A. niger или из Т. reesei; целлобиогидролазы I-II из Т. reseei; эндо-бета-1-4-D-глюканазы I-V из Т. reseei. Ниже приведены дополнительные предпочтительные варианты осуществления изобретения, указывающие последовательность стадий ферментативной обработки в зависимости от природы или состава используемого необработанного полимерного сырья. 1. Для сырья, богатого ксиланом/целлюлозой (например, соломы), т.е. сырья с 10 мас.% ксилана,10 мас.% целлюлозы и 15 мас.% арабинана, предпочтительно используется следующая последовательность стадий ферментативной обработки: 1) деполимеризация/расщепление ксилана; 2) деполимеризация/расщепление целлюлозы. 2. Для сырья, богатого арабинаном/пектином (например, свеклы), т.е. сырья с 15 мас.% арабинана,10 мас.% пектина, 10 мас.% целлюлозы и 10 мас.% ксилана, предпочтительно используется следующая последовательность стадий ферментативной обработки: 1) деполимеризация/расщепление арабинана,2) деполимеризация/расщепление пектина. 3. Для сырья, богатого арабинаном/пектином/целлюлозой, т.е. сырья с 15 мас.% арабинана, 10 мас.% пектина, 10 мас.% целлюлозы и 10 мас.% ксилана, предпочтительно используется следующая последовательность стадий ферментативной обработки: 1) деполимеризация/расщепление арабинана,2) деполимеризация/расщепление целлюлозы,3) деполимеризация/расщепление пектина. 4. Для сырья, богатого арабинаном/ксиланом/пектином/целлюлозой, т.е. сырья с 15 мас.% арабинана,10 мас.% ксилана, 10 мас.% пектина и 10 мас.% целлюлозы, предпочтительно используется следующая последовательность стадий ферментативной обработки: 1) деполимеризация/расщепление арабинана,2) деполимеризация/расщепление ксилана,3) деполимеризация/расщепление целлюлозы,4) деполимеризация/расщепление пектина. 5. Для сырья, богатого галактаном/пектином (т.е. картофельный пектиновый галактан), т.е. сырья с 10 мас.% галактана, 10 мас.% пектина, 15 мас.% арабинана и 10 мас.% ксилана, предпочтительно используется следующая последовательность стадий ферментативной обработки: 1) деполимеризация/расщепление галактана,2) деполимеризация/расщепление пектина. 6. Для сырья, богатого маннаном/ксиланом, т.е. сырья с 15 мас.% маннана,10 мас.% ксилана,15 мас.% арабинана и 10% целлюлозы предпочтительно используется следующая последовательность стадий ферментативной обработки: 1) деполимеризация/расщепление ксилана; 2) деполимеризация/расщепление маннана. 7. Для сырья, богатого маннаном/ксиланом/арабинаном (например, кожуры кофейных зерен), т.е. сырья с 15 мас.% маннана, 10 мас.% ксилана, 15 мас.% арабинана и 10 мас.% целлюлоза, предпочтительно используется следующая последовательность стадий ферментативной обработки: 1) арабинан,2) деполимеризация/расщепление ксилана,3) деполимеризация/расщепление маннана. 8. Для сырья, богатого галактаном (например, лиственничного арабиногалактана; гуарового галак- 16016528 томаннана), т.е. сырья с 10 мас.% галактана, 10 мас.% пектина и 10 мас.% ксилана, предпочтительно используется следующая последовательность стадий ферментативной обработки: 1) деполимеризация/расщепление галактана,2) ксилан или арабинан в зависимости от состава сырья,3) деполимеризация/расщепление маннана. 9. Для сырья, богатого маннаном/целлюлозой (например Konjak глюкоманнана), т.е. сырья с 15 мас.% маннана, 10 мас.% целлюлозы, 10 мас.% ксилана, 10 мас.% галактана и 15 мас.% арабинана,предпочтительно используется следующая последовательность стадий ферментативной обработки: 1) деполимеризация/расщепление маннана,2) деполимеризация/расщепление целлюлозы. В предпочтительном случае указанные применяемые смеси ферментов должны быть, по существу,чисты от специфических ферментативных активностей, которые будут приводить к загрязнению получаемого потока продукции. В другом конкретном случае, где глюкоза представляет собой целевой продукт, и необработанное полимерное сырье содержит целлюлозу в качестве полимерных субстратов (например, пшеничная солома), используют смесь ферментов целлюлаз. Пригодные смеси ферментов перечислены в табл. 1. Такие смеси целлюлаз можно использовать в комбинации с бета-гликозидазами, гликогидролазами и альфаили бета-амилазами, как указано в табл. 1, для превращения целлюлозной фракции необработанного полимерного сырья в мономерные глюкозные блоки. Для того чтобы получить чистый поток продукции глюкозы, смесь ферментов, применяемая к целлюлозной фракции, должна быть чиста от любых гемицеллюлазных активностей, которые охватывают, но не ограничиваясь ими, ферментативные активности арабинофуранозидазы, арабиназы, галактозидазы, маннаназы, маннанозидазы, ксиланазы и ксилозидазы. В данном ферментативном процессе полимерная целлюлоза будет превращена в растворимые глюкозные блоки, которые могут быть физически отделены от нерастворимого сырья, как описано выше. Оставшийся нерастворимый материал может быть обработан для дальнейшего производства различных пентозных сахаров из гемицеллюлозной фракции. В другом конкретном случае, где арабиноза и ксилоза представляют собой целевые продукты, и необработанное полимерное сырье содержит полимерные субстраты, содержащие гетерогенные гемицеллюлозные полимеры, такие как арабиноксилан, сначала используют смесь ферментов, перечисленных в таблице 1, для превращения и мобилизации разветвленных арабинозных блоков. Затем растворимые арабинозные блоки отделяют от оставшегося нерастворимого сырья перед использованием второй смеси ферментов, перечисленных в табл. 1, для мобилизации ксилозных блоков, содержащихся в ксилановых полимерах. Затем растворимые ксилозные блоки также отделяют от оставшегося нерастворимого сырья. Ферментативные стадии способа могут быть объединены с одной или несколькими стадиями предварительной обработки. На такой стадии(ях) предварительной обработки можно неизбирательно экстрагировать компоненты с низкой коммерческой ценностью, которые иначе будут загрязнять ценные потоки продукции из процесса. Таким образом, согласно одному из вариантов осуществления, одну или несколько стадий предварительной обработки используют для экстрагирования или иного удаления определенных компонентов. Альтернативно, можно использовать одну или несколько избирательных стадий предварительной обработки, что обеспечит сравнимую избирательность для ферментативных стадий способа при растворении отдельных химических компонентов необработанных полимерных субстратов. Таким образом, согласно одному из вариантов осуществления, одну или несколько стадий предварительной обработки используют для увеличения избирательности последующих стадий ферментативной обработки. Примеры таких стадий способа будут представлять собой растворение фракции лигнина из LCB в органических растворителях, таких как этанол или глицерин (Itoh et al., 2003; Demirbas, A., 1998). Такая отдельная предварительная стадия обработки и условия известны специалисту в данной области. При дополнительной альтернативе, указанные неизбирательные стадии предварительной обработки применяют к нерастворимым остаткам, которые были очищены от загрязнителей на предыдущих избирательных стадиях способа. Пример такой стадии обработки представляет собой полный гидролиз белковой фракции посредством обработки кислотой после избирательного растворения гемицеллюлозной, целлюлозной и лигниновой фракции из LCB посредством вышеуказанных избирательных стадий способа. Другой частный пример для варианта осуществления изобретения приведен на чертеже. Таким образом, на чертеже показана технологическая цепочка для последовательной ферментативной обработкиLCB. На данной иллюстрации обработки субстрата, богатого целлюлозой, гемицеллюлозой и лигнинами,и с низкими количествами белков и липидов, такого как пшеничная солома, солома зерновых или мягкая древесина, растворение различных центозных компонентов, содержащихся в гемицеллюлозной фракции достигается за счет последовательной обработки ферментами ксиланазой, арабиназой и маннаназой, которые специфически высвобождают ксилозные, арабинозные и маннозные сахара, соответственно. Подходящие ферменты и условия для обеспечения оптимальных условий процесса для ферментов известны специалисту в данной области. Растворимую фракцию удаляют после каждой стадии обработки, и нерастворимые частицы контактируют с последующим ферментом. После обработки пентозной фракции, до- 17016528 бавляют сходную стадию обработки для превращения целлюлозы в глюкозу с использованием смеси экзо- и эндоцеллюлаз, необязательно в комбинации с целлобиазой или бета-глюкозидазой для высвобождения глюкозы и целлобиозы из целлюлозной фракции субстрата LCB. Полученные растворимые продукты реакции удаляют из реакционной смеси с супернатантом. Сходным образом, лигниновую фракцию, остающуюся в нерастворимой фазе, превращают в ее различные фенольные строительные блоки с использованием специфических ферментативных систем, таких как лакказы и лигнинпероксидазы. Затем фенольные и олигофенольные соединения экстрагируют из реакционной смеси с супернатантом или экстракцией растворителем. Условия процесса для выполнения данной стадии обработки известны специалисту в данной области. Каждый из отдельных продуктов, образующихся в результате ферментативного превращения гемицеллюлозы, целлюлозы, лигнина или других компонентов LCB, могут быть выделены после каждого последующего цикла применения фермента (см. чертеж). Полученные, по существу, чистые химические строительные блоки фенольных, пентозных или гексозных сахаров затем могут быть дополнительно переработаны в ценные коммерческие продукты (см. чертеж). В основном, согласно одному из вариантов осуществления, определенные мономерные или олигомерные строительные блоки,высвобожденные из необработанного или обработанного полимерного сырья, очищают и необязательно дополнительно обрабатывают. На другой иллюстрации сельскохозяйственные отходы, богатые белком и липидами, такие как отходы от производства масла из рапсового семени, подсолнечника или оливок, могут быть последовательно подвергнуты контактированию с указанными выше гемицеллюлазами и целлюлазами, и необязательно пектиназами, с последующим контактированием остатков указанных стадий способа с неспецифичной протеазой. Такие неспецифичные протеазы известны специалисту в данной области и могут быть получены в большом масштабе. Обработка протеазой растворяет аминокислоты и пептиды из полимерного сырья. Впоследствии эти аминокислоты и пептиды могут быть использованы в виде смеси или разделены на отдельные субстанции методами, известными специалисту в данной области. В одном случае целевые продукты представляют собой арабинозу, ксилозу, глюкозу, олигофенилпропаноиды, монолигнолы, и/или монофенолы, и указанные продукты образуются путем превращения необработанной полимерной сырьевой пшеничной соломы в ее составные части посредством последовательного ферментативного превращения. На первичной стадии такого последовательного процесса хорошо перемолотую пшеничную солому(масса 1 кг, 0,2 мкм) с приблизительным содержанием влаги 5% мас./мас. помещают в стальной контейнер. Добавляют минимальное количество воды, равное 2 л, и смешивают с сырьем. Полученную суспензию оставляют намокать в течение 4 ч при комнатной температуре. Избыток жидкости удаляют, оставляя приблизительно 200 мл раствора. Контейнер герметизируют и нагревают в течение 1 ч до 121 С при давлении 10 бар в традиционной стерилизующей автоклавирующей системе (Puis et al., 1985; Harms, 1989;Foody et al., 1998). Давление в сосуде быстро стравливают и содержимому дают возможность остыть до комнатной температуры. В таких условиях степень полимеризации компонентов сырья снижена, но только минимальная фракция его компонентов высвобождается в растворимой форме. Полученную жидкую фазу (содержащая соли и незначительные количества различных растворимых компонентов) и нерастворимую фазу (содержащая нерастворимые полимерные субстраты, такие как целлюлоза, гемицеллюлоза и лигнин) разделяют фильтрованием, просеиванием или центрифугированием, и нерастворимую фазу дополнительно обрабатывают. На следующей стадии, для того чтобы мобилизовать арабинозные компоненты, содержащиеся в нерастворимой гемицеллюлозной фракции, используют смесь альфа-L-арабинофуранозидаз. Все приведенные ниже реакции осуществляют минимум при 400 С в течение 24 ч в 50 мМ фосфатном буфере, имеющем рН 5-7. 0,08-1 г GH51 альфа-L-арабинофуранозидазы из Clostridium thermocellum/кг сырья добавляют для гидролиза альфа-1,2/1,3-арабинофуранозиловых блоков арабинана и ксилана (Taylor et al., 2006). Впоследствии, 0,08-1 г GH43 альфа-L-арабинофуранозидазы из Humicola insolens/кт сырья добавляют для гидролиза альфа-1,5-арабинофуранозиловых единиц (Sorensen et al., 2006). Из-за специфичности смеси ферментов, полученная жидкая фаза содержит, в основном, арабинозу. Высвобожденные и растворимые арабинозные блоки отделяют от нерастворимой пульпы фильтрованием или центрифугированием. Оставшуюся нерастворимую фракцию сохраняют для дальнейшей обработки. На следующей стадии, для того чтобы превратить нерастворимые ксилановые компоненты в растворимые ксилозные блоки, используют смесь ксиланаз и ксилозидаз. Все реакции осуществляют минимум при 40 С в течение 24 ч в 50 мМ фосфатном буфере, имеющем рН 5-7, 0,08-1 г эндо-1,4-бетаксиланазы (GH10 или 11) из Humicola insolens/кг сырья и 0,08-1 г бета-ксилозидазу (GH3) из Trichodermareesei/кг сырья добавляют для высвобождения ксило-олигосахаридов и ксиланозных блоков, соответственно. Из-за специфичности смеси ферментов, полученная жидкая фаза в основном содержит ксилозу. Растворимую ксилозу отделяют от нерастворимых остатков сырья фильтрованием или центрифугированием. На следующей стадии, для того чтобы мобилизовать гексозные сахара, оставшиеся в гемицеллюлозной и целлюлозной фракциях, соответствующие нерастворимые частицы подвергают взаимодействию с оптимизированной смесью ферментов, содержащих эндо- и экзоцеллюлазы. Все реакции осущест- 18016528 вляют минимум при 50 С в течение 16 ч в 50 мМ буфере из ацетата натрия (рН 5-6). Смеси каждой 0,0051 г 1,4-бета-эндоглюканазы (Се 15 А, Се 17 В, Се 112 А, Се 161 А) и 1,4-бета-целлобиогидролазы (Се 17 А,Се 1 бА) из Trichoderma reesei/кг нерастворимого сырья добавляли для мобилизации гексозных сахаров(Irwin et al., 1993, Kim et al., 1998). Эффективность и кинетика превращения целлюлозы в мономерные сахарные блоки необязательно увеличиваются при добавлении 0,0005-0,01 г целлобиозадегидрогеназы изPhanerocaete chrysosporium в комбинации с 0,05-1 г ферроцианида и 0,0005-0,1 г бета-гликозидазы (10% масс. ферментативная смесь) из Aspergillus niger/кг сырья (Igarashi et al., 1998, Rosgaard et al., 2006). В силу специфичности смеси ферментов полученная жидкая фаза содержит в основном гексозы, преимущественно состоящие из глюкозы. Их дополнительно отделяют фильтрованием или центрифугированием от мелких макрочастиц из остатков сырья. На следующей стадии нерастворимые остатки лигнина после предыдущих ферментативных обработок превращают в их компоненты при последующем взаимодействии с лигнинпероксидазной и лакказной ферментативными системами. Реакции с лигнинпероксидазой осуществляют минимум при 50 мМ тартрата натрия (рН 3,5) и при максимальной температуре 32 С. Высокополимерные нерастворимые частицы лигнина окислительно расщепляют при взаимодействии с каждой 0,5-1 г лигнинпероксидазы (LIP) из Phanerocaete chrysosporium/кг сырья (Ward et al., 2003). Для предотвращения каталитической инактивации LIP (состав соединения III, Wariishi and Gold 1990) из-за присутствия избытка Н 2 О 2 в реакционной смеси, растворимую ферментативную H2O2-генерирующую систему используют для обеспечения контролируемых и непрерывных условий образования H2O2. Может быть использована Н 2 О 2-генерирующая мощность глиоксалевой оксидазы (GLOX) естественного вспомогательного фермента, работающего в синергизме с лигнинпероксидазами (Kersten 1990). Реакция с GLOX требует одинакового рН, ионной силы и температурного профиля, как описано для LIP. Образование H2O2 вызывают добавлением 0,05-1 гGLOX и 0,1-1 г субстрата для GLOX метилглиоксаля/кг сырья. Чтобы индуцировать и усилить окислительное расщепление полимерного лигнина с помощью LIP, добавляют окислительновосстановительный посредник вератриловый спирт (3,4-диметоксибензиловый спирт), что приводит к завершению реакции (Ferapontova et al., 2006). Более эффективное расщепление нерастворимого лигнина может быть достигнуто добавлением 2 г вератрилового спирта/кг сырья (Barr et al., 1993). Основные продукты реакции окислительного расщепления нерастворимого лигнина, катализируемого LIP, представляют собой олигофенилпропаноиды, тогда как монолигнолы являются только минорными компонентами смеси продуктов. Для увеличения количества монофенолов в смеси продуктов, дополнительно осуществляют взаимодействие смеси продуктов, полученных с помощью LIP, с лакказой (d'Acunzo et al., 2002). Реакцию проводят минимум при 40 С в течение 6 ч в 100 мМ фосфатном буфере, имеющем рН 5-6. 0,0004 г лакказы из Trametesversicolor и 0,0005 г 2,2,6,6-тетраметилпиперидин-1-илокси (TEMPO) добавляют в качестве окислительно-восстановительного посредника/кг сырья (Arias et al., 2003) для окисления олигофенолов до монофеноловых лигниновых блоков. В силу специфичности смеси ферментов, полученная жидкая фаза в основном содержит монофеноловые лигниновые блоки. Полученную смесь продуктов отделяют от оставшейся пульпы мембранным фильтрованием и простым центрифугированием. Следующие примеры показывают влияние последовательности стадий ферментативной обработки различного лигниноцеллюлозного сырья. В данном описании примеры предназначены для дополнительной иллюстрации изобретения, но в любом случае не должны рассматриваться в качестве ограничения объема изобретения. Получение субстрата Предварительно обработанная пшеничная солома: сухую пшеничную солому размалывали на мельнице до 120 мкм. Затем 2 г размолотой соломы суспендировали в 39,6 мл д. д. воды и 0,4 мл 12 н. H2SO4(1% об./об.). Суспензию автоклавировали при 135 С в течение 30 минут. Смесь охладили до кт и центрифугировали при 10000 g в течение 15 мин. Полученный супернатант отбрасывали. Оставшийся осадок обрабатывали тремя промежуточными циклами промывка/центрифугирование (10000 g/15 мин) с использованием 50 мМ буфера из ацетата натрия (рН 5). После стадии последнего центрифугирования твердое вещество ресуспендировали в 35 мл 50 мМ ацетата натрия (рН 5), что давало 5% мас./мас. (всего 40 г) основной раствор субстрата. Необработанная пшеничная солома, пульпа сахарной свеклы, ксилан из овса и спельты, ржаной арабиноксилан: сухие образцы пшеничной соломы (местные сельскохозяйственные продукты), пульпу сахарной свеклы (кормовая добавка для животных), ксилан из овса и спельты (Sigma, Weilheim, Germany, по каталогу: Х 0627) размалывали на мельнице до 120 мкм. Для получения отдельных основных растворов субстратов по 2 г каждого размолотого материала помещали в пробирку Flacon. Затем пробирку наполняли 50 мМ буфером из ацетата натрия (рН 5) до отметки 40 г, что давало 5% (мас./мас.) конечную суспензию субстрата. Ржаной арабиноксилан (Megazymes, Ireland,по каталогу: P-RAXY) был доставлен в виде мелкого белого порошка. Для получения основного раствора субстрата взвешивали 0,2 г и переносили в пробиркуFlacon (15 мл) . Затем пробирку наполняли 50 мМ буфером из ацетата натрия до отметки 4 г, что давало 5% (масс./масс.) конечный основной раствор.- 19016528 Получение ферментов Арабиназа (Ara, источник: A.niger, Кат.: E-EARAB), арабинофукозидаза (Arafus, источник: A.niger,Кат.:E-AFASE), целлобиогидролаза I (СВН I, источник: Trichoderma sp., Кат.: Е-CBHI), эндоDглюканаза (EGII, источник: Trichoderma sp., Кат.: E-CELTR), эндоманнаназа (Man, источник: A.niger,Кат: E-BMANN), ксиланаза (Xyl 1, источник: Т. viride; Кат. E-XYTRI), полигалактуроназа (Poly, источник: A.aculeatus, Кат. E-PGALUSP) были поставлены из Megazymes Inc., Ireland в виде сульфатаммониевых осадков (общий объем: 1 мл). Полученные препараты ферментов распечатывали и концентрировали с 45 мл буфера из ацетата натрия (50 мМ, рН 5) с использованием 50 мл устройств для центробежной ультрафильтрации Amicon (граница 10 кДа; Millipore, Maidstone, UK). Коммерческая смесь целлюлаз (Worth. Cel., Кат: Cel; 108 ЕД/мг DW) , содержащая целлобиогидролазную (СВН I и СВН II), эндоцеллюлазную (EG I, EG II), -гликозидазную (BGL) и эндоксиланазную активности, была поставлена из Worthington Biochemical Corp. (NJ., USA) в виде сухого белого порошка. Основные растворы препарата целлюлазы (0,5 мг/мл) дополняли 10 мл буфера из ацетата натрия, (50 мМ,рН 5). Пектиназа (Pec, активности: пектатлиазная, полигалактуроназная; Кат: Pectinex Ultra SP-L) из A.aculeatus и -глюкозидаза из A. niger (BGL, Кат: Novo 188) была поставлена в виде концентрированного раствора, готового для использования, из Novozymes, Denmark. Дополнительную эндоксиланазную активность (Xyl 2, ссылка на BLAST: AAZ56956/gi:71917054;http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez) из штамма YX Thermobifida fusca рекомбинантно экспрессировали в S.cerevisiae. Ферментативную активность получали из очищенного и концентрированного ферментационного бульона с использованием устройств для центробежной ультрафильтрации Amicon(Millipore, Maidstone, UK). Концентрации белка определяли способом Брэдфорда (Bradford, M., 1976). Получение гидролизного лигнина Пшеничную солому (300 г) предварительно обрабатывали с использованием традиционного способа парового взрыва (пар 25 бар/5 мин при внезапном сбросе давления) в присутствии 1% (мас./об.) 12 н.H2SO4. Полученную суспензию центрифугировали при 10000 g (15 мин) и супернатант декантировали. Оставшееся твердое вещество промывали/нейтрализовали три раза 40 мл буфера из ацетата натрия (50 мМ, рН 5), затем сушили в вакууме и затем размалывали на мельнице до 120 мкм, что давало мелкий порошок. Полученную 5% (мас./мас.) суспензию, 2 г порошка соломы смешивали с 35 мл буфера из ацетата натрия (50 мМ, рН 5), что давало общий объем 40 мл. 40 мл суспензии соломы смешивали с 4%(масс./масс. субстрата) целлюлазной смесью Worthington и 0,5% (мас./мас.) -гликозидазной активности из Aspergillus niger (Novo 188, Novozymes). Полученную смесь инкубировали при 45 С (250 об./мин) в течение 48 ч в роторном миксере Eppendorf. После начального инкубационного периода суспензию центрифугировали при 12000 g (15 мин) и полученный супернатант декантировали. Оставшееся твердое вещество дважды промыли д.д. водой при центрифугировании (12000 g/15 мин) и ресуспендировали в буфере из ацетата натрия (50 мМ, рН 5), что давало конечный объем 40 мл. Суспензию снова смешивали с 4% (мас./мас. субстрата) целлюлазной смесью Worthington и 0,5% (мас./мас.) -гликозидазы из Aspergillus niger (Novo 188, Novozymes), затем инкубировали ее в течение дополнительного 24-часового периода при 45 С. После второго инкубационного периода твердое вещество отделяли центрифугированием, как описано выше. Твердое вещество снова дважды промывали д.д. водой и затем центрифугировали (10000g/15 мин) для разделения жидкой и твердой фаз. Затем полученное твердое вещество сушили в вакууме в течение 24 ч, что приводило к гидролизу лигниновой фракции (374 мг), используемой для следующих экспериментальных партий. Для того чтобы убедиться, что полученный данным способом лигнин не сохранил остаточные сахара, 50 мг полученного твердого вещества подвергали полному гидролизу, катализируемому кислотой, согласно опубликованным NREL протоколам (5). Присутствие возможных компонентов сахаров проверяли с помощью анализа, основанного на высокоэффективной анионообменной хроматографии, объединенной с импульсным амперометрическим определением (HPAE-PAD) (Dionex,Са., USA, 6). Хотя данная методика является более чувствительной (1000 раз), чем стандартные ВЭЖХ протоколы, не было обнаружено остаточных сахаров в полученных в данном случае остатках гидролиза лигнина. Эксперименты с последовательным ферментативным гидролизом Все реакции проводили в конечном объеме 0,5 мл с буферной системой с ацетатом натрия (50 мМ,рН 5). Положительные контроли состояли из одной стадии ферментативного гидролиза для каждого субстрата (2,5% мас./об.=25 мг/мл) целлюлазной смеси Worthington (1% мас./мас. субстрата=0,25 мг/мл). Следующие последовательные реакции гидролиза различных субстратов проводили двумя независимыми стадиями. Начальная концентрация субстрата для первичной реакции гидролиза составляла 2,5% (мас./об.),тогда как общая концентрация фермента, составлявшая 1% (мас./мас. субстрата), сохранялась постоянной в каждой реакции. Распределение масс сахарных компонентов в отдельном субстрате наглядно приведено в таблице 1 А. Каждую ферментативную реакцию инкубировали при 45 С/250 об/мин в течение 48- 20016528 ч в роторном миксере Eppendorf. После первичного гидролиза, суспензию центрифугировали при 10000 g в течение 15 мин. Супернатант декантировали, фильтровали (0,2 мкм) и подвергали HPAE-PAD анализу(Dionex, Са., USA, 6) для определения сахаров и уроновой кислоты, входящих в его состав. Осадок, оставшийся после первичного гидролиза, ресуспендировали в 1 мл воды и центрифугировали (10000 g/15 мин). После центрифугирования промывные воды декантировали и осадок (объем 100 мл) использовали для экспериментов по вторичному гидролизу. Концентрация фермента, добавленного при постановке вторичного гидролиза, составляла 1% мас./мас. (0,25 мг/мл) по отношению к начальной концентрации субстрата. После добавления фермента, объем реакции дополняли 0,5 мл буфера из ацетата натрия. Для вторичной стадии гидролиза использовали ферментативные активности, отличные от тех,что использовали на стадии первичной реакции. Однако в случаях, когда используются промышленные смеси ферментов, может допускаться незначительная ферментативная активность, которая была эквивалентна реакции первичной стадия. После 48-часового инкубационного периода гидролизную суспензию центрифугировали при 10000 g в течение 15 мин. Супернатант обрабатывали, как описано выше, и подвергали HPAE-PAD анализу (Dionex, Са., USA, б) для определения сахаров и уроновой кислоты, входящих в его состав. Точные комбинации ферментов и субстратов, использованных для первичной и вторичной стадии гидролиза для каждого субстрата, приведены в таблице 2 А. Следующий список содержит концентрации/комбинации ферментов для отдельных реакций: 1) арабиназа (Ara: 0,2 мг/мл)+арабинофукозидаза (Arafus: 0,05 мг/мл),2) СВН I (0,175 мг/мл)+EG II (0,005)+BGL (0,025 мг/мл),3) маннаназа (Man: 0,25 мг/мл),4) полигалактуроназа (Поли: 0,25 мг/мл),5) пектиназа (Pec: 0,25 мг/мл),6) ксиланаза (Xyl 1 или Xyl 2: 0,25 мг/мл),7) ксиланаза (Xyl 1 или Xyl 2: 0,2 мг/мл)+-гликозидаза (BGL: 0,05 мг/мл),8) Worthington (0,25 мг/мл). Для реакций, осуществляемых с предварительно обработанными соломой и свекловичной пульпой,соответствующие ксиланазные стадии первичного или вторичного гидролиза осуществляют исключительно с Xy1 1, полученной из Trichoderma viride. Для сравнения все другие стадии ксиланазного гидролиза проводили только с Xy1 2, полученной из штамма YX Thermobifida fusca. Таблица 1 А. Распределение (мас.%) компонентов субстрата, определенное после количественного кислотного гидролиза (1-4) При сравнении данных из табл. 2 А становится очевидно, что при выборе правильной комбинации ферментативных стадий, чистые потоки сахарной продукции, превышающие 80% (мас./мас.), могут быть получены при гидролизе лигниноцеллюлозных субстратов. Также очевидно, что последовательность ферментативных активностей, применяемых для специфического гидролиза субстрата, обладает сильным влиянием на состав и чистоту получаемых потоков продукции. В дополнительной серии экспериментов исследовали влияние присутствия лигнина в сырье на стадии ферментативной обработки: Избирательный ферментативный гидролиз в отсутствии/присутствии гидролизного лигнина.- 22016528 Все реакции проводили в конечном объеме 0,5 мл с буферной системой с ацетатом натрия (50 мМ,рН 5) в 1 мл пробирках Eppendorf. Суспензии, содержащие 2,5% (мас./об.) необработанной пшеничной соломы (25 мг/мл) или ржаного арабиноксилана (0,25 мг/мл), гидролизовали с помощью 1% (мас./мас. субстрата=0,25 мг/мл) или эндоарабиназы (Ara), или эндополигалактуроназы (Poly), или эндоксиланазы(Xyl 2). Каждую реакцию проводили или в отсутствие, или в присутствии 2,5% (25 мг/мл) дополнительного гидролизного лигнина. Поэтому отношение субстрата к лигнину в соответствующих реакциях было 1:1. Все реакции инкубировали в течение 48 ч при 45 С (250 об./мин) в роторном миксере Eppendorf. После инкубационного периода, образцы центрифугировали при 10000 g в течение 15 мин. Полученный супернатант удаляли пипетитированием для определения сахаров и уроновой кислоты, входящих в его состав, с использованием способа HPAE-PAD (6). Результаты, приведенные в табл. 3, сосредоточены только на изменениях в профилях гидролиза значительных мономерных сахарных компонентов. Ржаной арабиноксилан (эндогенное содержание лигнина 0,2% мас./мас.) и необработанная пшеничная солома (эндогенное содержание лигнина 17% мас./мас.) были выбраны в качестве субстратов для гидролиза для изучения эффектов добавления экзогенного лигнина, так как указанные субстраты значительно различаются по их эндогенному содержанию лигнина. В присутствии экзогенного лигнина гидролиз арабиноксилана и необработанной пшеницы эндоксиланазой 2 (Xyl 2) привел к значительному увеличению избирательности продукта. Для обоих субстратов побочная эндо-арабиназная активность Xyl 2 была снижена в присутствии лигнина. Ссылки 1) http://www.eere.energy.gov/biomass/progs/search2.cgi74669. 2) Michel, F. et al. (2006), J. of the Science of Food and Agriculture 42 (1), pp.77-85. 3) http://secure.megazyme.com/Dynamic.aspxcontrol=CSViewProductc atego rvName = Polvsaccharidesproductld=P-RAXY. 4) www.sigma.com. 5) http://www.nrel.gov/biomass/pdfs/42618.pdf. 6) http://www.dionex.com.cn/technic/Afiles/AN92.PDF. Литература ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Способ ферментативной обработки необработанного полимерного сырья, включающий следующие стадии:a) обработку нерастворимого необработанного полимерного сырья ферментативной системой для высвобождения растворимых мономерных или олигомерных строительных блоков из необработанного полимерного сырья;b) отделение растворимых мономерных или олигомерных строительных блоков, полученных на стадии а), от остатков нерастворимого необработанного полимерного сырья,где необработанное полимерное сырье содержит по меньшей мере 3 мас.% лигнина, где стадии а) иb) повторяют один или несколько раз с различными ферментативными системами для высвобождения из остатков необработанного полимерного сырья или обработанного полимерного сырья других растворимых мономерных или олигомерных строительных блоков и где не проводят лигнинолитическую стадию ферментативной обработки. 2. Способ по п.1, где необработанное полимерное сырье содержит по меньшей мере 5 мас.% лигнина, предпочтительно 10 мас.% лигнина, более предпочтительно по меньшей мере 20 мас.% лигнина. 3. Способ по любому из предшествующих пунктов, где стадии а) и b) или их повторения осуществляют таким образом, что содержание лигнина в полимерном сырье, вычисленное в виде мас.% от общего состава полимерного сырья, не снижается. 4. Способ по п.1 или 2, где перед стадией а) растворимые компоненты отделяют от необработанного полимерного сырья.- 27016528 5. Способ по п.4, где отделение растворимых компонентов от необработанного полимерного сырья выполняют с использованием одной или нескольких стадий(и) промывки и/или одной или нескольких стадий(и) физико-химической обработки. 6. Способ по любому из предшествующих пунктов, где на стадии а) используют ферментативную систему, обладающую не более чем 50%, предпочтительно не более чем 20%, более предпочтительно не более чем 10%, более предпочтительно не более чем 5%, более предпочтительно не более чем 2%, более предпочтительно не более чем 1% других ферментативных активностей, помимо ферментативной активности, приводящей к высвобождению указанных растворимых мономерных или олигомерных строительных блоков из нерастворимого необработанного полимерного сырья согласно стадии а). 7. Способ по п.1 или 2, где перед повторением стадии а) отделение растворимых компонентов от обработанного полимерного сырья выполняют с использованием одной или нескольких стадий предварительной обработки, предпочтительно одной или нескольких стадий промывки. 8. Способ по любому из предшествующих пунктов, где ферментативную обработку осуществляют в водной среде, причем указанные мономерные или олигомерные строительные блоки, высвобожденные из необработанного или обработанного полимерного сырья, растворимы в водной среде, и отделение согласно стадии b) осуществляют жидкостным-твердотельным отделением растворимых строительных блоков в водной среде от остатков нерастворимого необработанного или обработанного полимерного сырья. 9. Способ по любому из предшествующих пунктов, где мономерные или олигомерные строительные блоки согласно стадии а) выбирают из одного из группы, состоящей из глюкозы, ксилозы, арабинозы, галактозы, маннозы, аминокислот или фенольных соединений или других продуктов, перечисленных в табл. 1. 10. Способ по любому из предшествующих пунктов, где сырье представляет собой целлюлозаксилан-обогащенное сырье, и где фермент или ферментативную систему, используемую на первой стадии ферментативной обработки а), выбирают из группы ферментов или ферментативных систем, высвобождающих глюкозу, согласно табл. 1, и растворимый мономерный или олигомерный строительный блок представляет собой глюкозу, и где фермент или ферментативную систему, используемую на второй стадии ферментативной обработки а), выбирают из группы ферментов или ферментативных систем, высвобождающих ксилозу, согласно табл. 1, и растворимый мономерный или олигомерный строительный блок представляет собой ксилозу. 11. Способ по п.10, где фермент или ферментативную систему, используемую на первой стадии а),выбирают из группы: бета-глюкозидазы из A. niger или из Т. reesei; целлобиогидролазы I-II из Т. reesei; эндо-бета-1-4-D-глюканазы I-V из Т. reesei и где фермент или ферментативную систему, используемую на второй стадии а), выбирают из группы: эндоксиланазы из A. niger, или Т. reesei, или С. thermocellum; ксилозидазы из A. niger или Т. reesei. 12. Способ по любому из предшествующих пунктов, где сырье представляет собой целлюлозаксилан-обогащенное сырье, и где фермент или ферментативную систему, используемую на первой стадии ферментативной обработки а), выбирают из группы ферментов или ферментативных систем, высвобождающих ксилозу, согласно табл.1, и растворимый мономерный или олигомерный строительный блок представляет собой ксилозу, и где фермент или ферментативную систему, используемую на второй стадии ферментативной обработки а), выбирают из группы ферментов или ферментативных систем, высвобождающих глюкозу, согласно табл.1, и растворимый мономерный или олигомерный строительный блок представляет собой глюкозу. 13. Способ по п.12, где фермент или ферментативную систему, используемую на первой стадии а),выбирают из группы: эндоксиланазы из A. niger., или Т. reesei, или С. thermocellum; ксилозидазы из A.niger или Т. reesei и где фермент или ферментативную систему, используемую на второй стадии а), выбирают из группы: бета-глюкозидазы из A. niger или из Т. reesei; целлобиогидролазы I-II из Т. reesei; эндо-бета-1-4-D-глюканазы I-V из Т. reesei. 14. Способ по любому из предшествующих пунктов, где сырье представляет собой арабинанпектин-обогащенное сырье, и где фермент или ферментативную систему, используемую на первой стадии ферментативной обработки а), выбирают из группы ферментов или ферментативных систем, высвобождающих арабинозу, согласно табл. 1, и растворимый мономерный или олигомерный строительный блок представляет собой арабинозу, и где фермент или ферментативную систему, используемую на второй стадии ферментативной обработки а), выбирают из группы ферментов или ферментативных систем,высвобождающих уроновую кислоту, согласно табл. 1, и определенный растворимый мономерный или олигомерный строительный блок представляет собой уроновую кислоту. 15. Способ по п.14, где фермент или ферментативную систему, используемую на первой стадии а),выбирают из группы: эндоарабиназы из A. niger; арабинофукозидазы из A. niger и где фермент или ферментативную систему, используемую на второй стадии а), выбирают из группы: пектиназы (пектатлиаза,полигалактуроназа) из A. aculeatus, A. niger или С. japonicus. 16. Способ по любому из предшествующих пунктов, где сырье представляет собой арабинанпектин-целлюлоза-обогащенное сырье, и где фермент или ферментативную систему, используемую на- 28016528 первой стадии ферментативной обработки а), выбирают из группы ферментов или ферментативных систем, высвобождающих арабинозу, согласно табл. 1, и растворимый мономерный или олигомерный строительный блок представляет собой арабинозу, где фермент или ферментативную систему, используемую на второй стадии ферментативной обработки а), выбирают из группы ферментов или ферментативных систем, высвобождающих глюкозу, согласно табл. 1, и растворимый мономерный или олигомерный строительный блок представляет собой глюкозу, и где фермент или ферментативную систему, используемую на третьей стадии ферментативной обработки а), выбирают из группы ферментов или ферментативных систем, высвобождающих уроновую кислоту, согласно табл. 1, и растворимый мономерный или олигомерный строительный блок представляет собой уроновую кислоту. 17. Способ по п.16, где фермент или ферментативную систему, используемую на первой стадии а),выбирают из группы: эндоарабиназы из A. niger; арабинофукозидазы из A. niger, где фермент или ферментативную систему, используемую на второй стадии а), выбирают из группы: бета-глюкозидазы из A.niger или из Т. reesei; целлобиогидролазы I-II из T. reesei; эндо-бета-1-4-D-глюканазы I-V из Т. reesei и где фермент или ферментативную систему, используемую на третьей стадии а), выбирают из группы: пектиназы (пектатлиаза, полигалактуроназа) из A. aculeatus, A. niger или С. japonicus. 18. Способ по любому из предшествующих пунктов, где сырье представляет собой галактанпектин-обогащенное сырье, и где фермент или ферментативную систему, используемую на первой стадии ферментативной обработки а), выбирают из группы ферментов или ферментативных систем, высвобождающих галактозу, согласно табл. 1, и растворимый мономерный или олигомерный строительный блок представляет собой галактозу, и где фермент или ферментативную систему, используемую на второй стадии ферментативной обработки а), выбирают из группы ферментов или ферментативных систем,высвобождающих уроновую кислоту, согласно табл. 1, и растворимый мономерный или олигомерный строительный блок представляет собой уроновую кислоту. 19. Способ по п.18, где фермент или ферментативную систему, используемую на первой стадии а),выбирают из группы: эндогалактоназы из A. niger или из С. thermocellum; бета-галактозидазы из A. niger или K. fragilis и где фермент или ферментативную систему, используемую на второй стадии а), выбирают из группы: пектиназы (пектатлиаза, полигалактуроназа) из A. aculeatus, A. niger или С. japonicus. 20. Способ по любому из предшествующих пунктов, где сырье представляет собой маннан-ксиланобогащенное сырье, и где фермент или ферментативную систему, используемую на первой стадии ферментативной обработки а), выбирают из группы ферментов или ферментативных систем, высвобождающих маннозу, согласно табл. 1, и растворимый мономерный или олигомерный строительный блок представляет собой маннозу, и где фермент или ферментативную систему, используемую на второй стадии ферментативной обработки а), выбирают из группы ферментов или ферментативных систем, высвобождающих ксилозу, согласно табл. 1, и растворимый мономерный или олигомерный строительный блок представляет собой ксилозу. 21. Способ по п.20 где фермент или ферментативную систему, используемую на первой стадии а),выбирают из группы: эндоманнаназы из A. niger, B. subtilis, T. maritima или из Т. reesei; экзоманнозидазы из С. fimi, и где фермент или ферментативную систему, используемую на второй стадии а), выбирают из группы: эндоксиланазы из A. niger или Т. reesei или С. thermocellum; ксилозидазы из A. niger или Т.reesei. 22. Способ по любому из предшествующих пунктов, где сырье представляет собой маннанцеллюлоза-обогащенное сырье, и где фермент или ферментативную систему, используемую на первой стадии ферментативной обработки а), выбирают из группы ферментов или ферментативных систем, высвобождающих маннозу, согласно табл. 1, и растворимый мономерный или олигомерный строительный блок представляет собой маннозу, и где фермент или ферментативную систему, используемую на второй стадии ферментативной обработки а), выбирают из группы ферментов или ферментативных систем, высвобождающих глюкозу, согласно табл. 1, и растворимый мономерный или олигомерный строительный блок представляет собой глюкозу. 23. Способ по п.22, где фермент или ферментативную систему, используемую на первой стадии а),выбирают из группы: эндоманнаназы из A. niger, B. subtilis, T. maritima или из Т. reesei; экзоманнозидазы из С. fimi и где фермент или ферментативную систему, используемую на второй стадии а), выбирают из группы: бета-глюкозидазы из A. niger или из Т. reesei; целлобиогидролазы I-II из Т. reesei; эндо-бета-1-4D-глюканазы I-V из Т. reesei. 24. Способ по любому из предшествующих пунктов, где ферментативная система, используемая на конкретной стадии ферментативной обработки, обладает не более чем 50%, предпочтительно не более чем 20%, более предпочтительно не более чем 10%, более предпочтительно не более чем 5%, более предпочтительно не более чем 2%, более предпочтительно не более чем 1% загрязняющих ферментативных активностей, которые не были использованы на предыдущих стадиях ферментативной обработки,использующей другую ферментативную систему, или которые могут вызывать высвобождение других мономерных или олигомерных строительных блоков, которые не были высвобождены на предыдущей стадии ферментативной обработки, или которые только могут вызывать высвобождение продуктов из полимерных субстратов, которые изначально, по существу, отсутствовали в полимерном сырье.