Рекомбинантный флавивирус и его применение
Номер патента: 15907
Опубликовано: 30.12.2011
Авторы: Пугачев Константин В., Монат Томас П., Гуйраху Фаршад, Лю Цзянь, Каталан Джон А.
Формула / Реферат
1. Рекомбинантный флавивирус для применения в профилактике или лечении флавивирусной инфекции, содержащий мутацию в трансмембранном домене мембранного белка, которая представляет собой замену одной или нескольких аминокислот, выбранных из группы, состоящей из аминокислот, соответствующих аминокислотам в положениях 60, 61, 62, 63, 64, 65 и 66 мембранного белка вируса японского энцефалита или вируса Западного Нила.
2. Флавивирус по п.1, где мутация ослабляет флавивирус относительно соответствующего флавивируса, не имеющего мутации.
3. Флавивирус по п.2, где мутация уменьшает висцеротропизм/виремию флавивируса.
4. Флавивирус по п.1, где мутация приводит к увеличенной стабильности флавивируса относительно соответствующего флавивируса, не имеющего мутации.
5. Флавивирус по п.1, где мутация приводит к увеличенной репликации флавивируса в клетках относительно соответствующего флавивируса, не имеющего мутации.
6. Флавивирус по п.1, где флавивирус является химерным флавивирусом.
7. Флавивирус по п.6, где химерный флавивирус содержит первый флавивирус, в котором белки мембраны и оболочки заменены белками мембраны и/или оболочки второго флавивируса.
8. Флавивирус по п.7, где первый флавивирус является вирусом желтой лихорадки.
9. Флавивирус по п.8, где вирус желтой лихорадки является YF 17D.
10. Флавивирус по п.7, где второй флавивирус является вирусом японского энцефалита.
11. Флавивирус по п.7, где второй флавивирус является вирусом Западного Нила.
12. Флавивирус по п.7, где второй флавивирус выбран из группы, состоящей из вируса денге, вируса энцефалита Сент-Луиса, вируса энцефалита долины Мюррей и вируса клещевого энцефалита.
13. Флавивирус по п.12, где вирус денге является денге-1, денге-2, денге-3 или денге-4 вирусом.
14. Флавивирус по п.7, где химерный флавивирус содержит вирус желтой лихорадки, в котором белки мембраны и оболочки заменены белками мембраны и оболочки вируса японского энцефалита.
15. Флавивирус по пп.1, 7 или 14, где мутация является заменой аминокислоты, соответствующей аминокислоте 60 мембранного белка вируса японского энцефалита.
16. Флавивирус по п.15, где мутация приводит к замене аргинина цистеином в указанном положении 60 мембранного белка.
17. Флавивирус по пп.1, 7 или 14, где мутация является заменой аминокислоты, соответствующей аминокислоте 66 мембранного белка вируса Западного Нила.
18. Флавивирус по п.17, где мутация приводит к замене лейцина пролином в положении 66 мембранного белка.
19. Флавивирус по пп.1, 7 или 14, где флавивирус дополнительно содержит мутацию в эктодомене мембранного белка флавивируса, причем мутация затрагивает аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из 1-5 аминокислот эктодомена, и представляет собой замену или делецию.
20. Флавивирус по п.19, где указанная мутация является заменой аминокислоты 5.
21. Флавивирус по п.20, где указанная мутация является заменой глутамина пролином.
22. Флавивирус по пп.1, 7 или 14, где флавивирус дополнительно содержит одну или несколько мутаций белка оболочки в остатках, соответствующих аминокислотам белка оболочки вируса Западного Нила, выбранным из группы, состоящей из аминокислот 107, 138, 176, 177, 224, 264, 280, 316 и 440.
23. Флавивирус по п.22, где флавивирус содержит мутации белка оболочки в остатках, соответствующих аминокислотам 107, 316 и 440 белка оболочки вируса Западного Нила.
24. Флавивирус по п.22, где флавивирус содержит мутации в остатках, соответствующих положению 66 мембранного белка и положениям 107, 316 и 440 белка оболочки вируса Западного Нила.
25. Флавивирус по пп.1, 7 или 14, где флавивирус дополнительно содержит мутацию в гидрофобном кармане шарнирной области в аминокислотном положении, соответствующем аминокислоте 204 белка оболочки вируса денге-1.
26. Флавивирус по пп.1, 7 или 14, где флавивирус дополнительно содержит мутацию в гидрофобном кармане шарнирной области в положениях, соответствующих аминокислотам 48-61, 127-131 и 196-283 белка оболочки вируса желтой лихорадки.
27. Флавивирус по пп.1, 7 или 14, дополнительно содержащий ослабляющую мутацию в 3'-нетранслируемой области флавивируса.
28. Флавивирус по пп.1, 7 или 14, дополнительно содержащий ослабляющую мутацию в капсидном белке флавивируса.
29. Вакцинная композиция, содержащая флавивирус по пп.1, 7, 14, 15 или 16 и фармацевтически приемлемый носитель или разбавитель.
30. Способ индукции иммунного ответа на флавивирус у пациента, предусматривающий введение пациенту вакцинной композиции по п.29.
31. Способ по п.30, где пациент не имеет, но подвержен риску развития инфекции, вызываемой флавивирусом.
32. Способ по п.30, где пациент инфицирован флавивирусом.
33. Способ получения рекомбинантного флавивируса по п.1, предусматривающий введение мутации в трансмембранный домен мембранного белка флавивируса, где мутация представляет собой замену одной или нескольких аминокислот, выбранных из группы, состоящей из аминокислот, соответствующих аминокислотам в положениях 60, 61, 62, 63, 64, 65 и 66 мембранного белка вируса японского энцефалита или вируса Западного Нила.
34. Способ по п.33, где мутация ослабляет флавивирус относительно соответствующего флавивируса, не имеющего мутации.
35. Способ по п.33, где мутация приводит к увеличенной стабильности флавивируса относительно соответствующего флавивируса, не имеющего мутации.
36. Способ по п.33, где мутация приводит к увеличенной репликации флавивируса в клетках относительно соответствующего флавивируса, не имеющего мутации.
37. Способ по п.33, где флавивирус является химерным флавивирусом.
38. Молекула нуклеиновой кислоты, соответствующая геному флавивируса по п.1 или комплементарная ему.
39. Способ получения флавивируса по пп.1, 7 или 14, включающий введение молекулы нуклеиновой кислоты, соответствующей геному флавивируса по п.38, в клетки, и выделения флавивируса, продуцируемого клетками, из клеток или их супернатанта.
40. Способ по п.39, где клетки являются клетками Vero.
41. Способ по п.39, где клетки культивируют в бессывороточной среде.
42. Способ по п.30, где указанная вакцинная композиция содержит флавивирус по п.15.
43. Способ по п.30, где указанная вакцинная композиция содержит флавивирус по п.16.
Текст
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ЕВРАЗИЙСКОМУ ПАТЕНТУ Дата публикации и выдачи патента Изобретение предоставляет аттенуированные флавивирусные вакцины, такие как вакцина против вируса японского энцефалита и вируса Западного Нила, а также способы изготовления и применения этих вакцин.(71)(73) Заявитель и патентовладелец: САНОФИ ПАСТЕР БАЙОЛОДЖИКС КО. (US) 015907 Область изобретения Это изобретение относится к вакцинам против вируса японского энцефалита и вируса Западного Нила. Предпосылки изобретения Род Flavivirus семейства Flaviviridae включает приблизительно 70 вирусов, преимущественно арбовирусы, многие из которых, такие как вирусы желтой лихорадки (YF), лихорадки денге (DEN), японского энцефалита (JE) и клещевого энцефалита (ТВЕ), являются основными патогенами человека (Burke andMonath, Fields Virology, 4th Ed.: 1043-1126, 2001). Например, японский энцефалит занимает первое место среди вирусных энцефалитов в Азии, где каждый год регистрируется от 30 до 50 тысяч случаев заболевания. В качестве еще одного примера, с того времени, как первые случаи были выявлены в районе НьюЙорка в 1999 году, вирус Западного Нила продолжает быстро распространяться по территории Северной Америки. Высоким является риск миграции вируса в Южную Америку, а также эпидемии в неразвитых странах. Необходимы эффективные способы предотвращения инфекций, вызываемых этими вирусами,причем вакцинация является наиболее экономически целесообразной мерой. Флавивирусная частица содержит нуклеокапсид, состоящий из вирусной РНК и капсидного белка С. Нуклеокапсид окружен "оболочкой", содержащей гликопротеин Е оболочки (50-60 кД) и малый мембранный белок М (7-8 кД). Трансляция геномной РНК приводит к белковому предшественнику, который расщепляется клеточными и вирусными протеазами до вирусных белков в следующем порядке: С,prM/M, E, NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, 2K, NS4B и NS5, где белки от С до Е являются структурными составляющими вириона, а от NS1 до NS5 являются неструктурными белками и необходимы для репликации (Lindenbach and Rice, Fields Virology, 4th Ed.: 991-1041, 2001). Белок prM (25 кД) является внутриклеточным предшественником для М. Незрелые вирионы, содержащие prM, продуцируются посредством отпочкования в просвет эндоплазматического ретикулума (ER) и переносятся на клеточную поверхность с помощью экзоцитоза. Расщепление prM происходит сразу после отщепления везикул от аппарата Гольджи. Зрелый вирус вне клетки содержит в основном белок М, хотя небольшая фракция нерасщепленного белка prM также может присутствовать. Белок Е является главным функциональным и антигенным составляющим поверхности вириона. Молекулярная структура эктодомена белка Е, который образует гомодимеры на поверхности зрелых вирусных частиц при нейтральном рН, была определена посредством криоэлектронной микроскопии (Reyet al., Nature. 375:291-298, 1995) и совпала с картой электронной плотности вируса (Kuhn et al., Cell 108:717-725, 2002). В ходе инфекции белок Е действует как белок слияния класса II (Modis et al., Nature. 427:313-319, 2004). После связывания вируса с клеточным рецептором и интернализации кислый рН в получающихся эндосомах вызывает диссоциацию димеров таким образом, что ранее скрытая гидрофобная петля слияния каждого мономера экспонируется наружу. Одновременно, петли встраиваются в клеточную (эндосомальную) мембрану, и мономеры перегруппировываются в удлиненные тримеры. Дальнейший рефолдинг тримеров приводит мембраны клетки и вируса к сближению и форсирует их слияние,высвобождая содержание вирусной частицы в цитоплазму. Предыдущие исследования показали, что некоторые замены в белке Е вирусов DEN и JE, отобранные в результате нескольких пассажей в мозге мышей, культивированных клетках мартышки и клетках москитов, были найдены в определенных регионах трехмерной структуры белка и, как сообщалось, являются ассоциированными с изменениями в функции слияния вирусов. Исследования показали, что порог рН при слиянии для некоторых аттенуированных(ослабленных) вакцин уменьшен на 0,6-1 единицы рН по сравнению с соответствующим родительским вирусным изолятом. Некоторые замены в шести остатках белка Е вируса DEN (остатки 54, 191, 202, 266,268 и 277) картированы в регионе домена II. Этот регион, как предполагают, является центром для опосредованного низким значением рН изменения конформации, требующегося для экспозиции на поверхности консервативной гидрофобной cd петли слияния (Lee et al., Virology. 232:281-290, 1997). Нет доказательств, что малый (зрелый) белок М играет роль в событиях, приводящих к интернализации вируса из эндосом или имеет какую-либо существенную функцию, в то время как известно, что его внутриклеточный предшественник prM важен для морфогенеза и транспортировки размножившихся вирусных частиц. Белок prM также способствует правильному сворачиванию (фолдингу) белка Е (Lorenz etal., J. Virol. 76:5480-5491, 2002) и защищает димеры белка Е от несвоевременных конформационных перестановок при прохождении новых частиц через кислые секреторные компартменты по направлению к клеточной мембране (Guirakhoo et al., J. Gen. Virol. 72:1323-1329, 1991; Guirakhoo et al., Virology. 191:921-931, 1992). Для создания живых аттенуированных вакцинных кандидатов против важных с медицинской точки зрения флавивирусов использовалась технология ChimeriVax. В ней использовался вакцинный вирусYF 17D в качестве вектора, в котором гены prM-E заменены на prM-Е гены из гетерологичного флавивируса, такого как вирусы JE, денге, Западного Нила или энцефалита Сент-Луиса (Monath et al., Vaccine. 17:1869-1882, 1999; Monath et al., Curr. Drug Targets - Inf. Disorders 1:37-50, 2001; Monath et al., Vaccine. 20:1004-1018, 2002; Guirakhoo et al., Virology. 257:363-372, 1999; Guirakhoo et al., J. Virol. 75:7290-7304,2001; Guirakhoo et al., Virology. 298:146-159, 2002; Pugachev et al., Int. J. Parasitol. 33:567-582, 2003;Guirakhoo et al., J. Virol. 78:4761-4775, 2004). Ранее вакцинный вирус ChimeriVax-JE, содержащий геныprM-Е из вируса SA-14-14-2 (живой аттенуированной вакцины, применяемой в Китае), был размножен до высоких титров в клетках Vero, культивируемых на среде с добавленной бычьей эмбриональной сывороткой (FBS) (Monath et al., Biologicals. 33:131-144, 2005). Вакцина была успешно протестирована в доклинических и в фазах I и II клинических испытаний (Monath et al., Vaccine. 20:1004-1018, 2002; Monath etal., J. Infect. Dis. 188:1213-1230, 2003). Аналогичным образом была успешно проведена фаза I клинических испытаний для вакцины-кандидата ChimeriVax-WN, которая содержит последовательность prM-Е из вируса Западного Нила (штамм NY99) с тремя специфическими аминокислотными заменами, включенными в белок Е для увеличения аттенуирования (ослабления) (Arroyo et al., J. Virol. 78:12497-12507,2004). Краткое изложение сущности изобретения Изобретение предоставляет рекомбинантные флавивирусы, включающие одну или несколько мутаций мембранного (М) белка (например, замены, делеции или вставки), такие как мутации, которые аттенуируют (ослабляют) флавивирус (например, мутации, которые уменьшают висцеротропизм/виремию флавивируса), увеличивают генетическую стабильность флавивируса при размножении вируса в культуре клеток (например, производство в бессывороточных культурах) и/или увеличивают выходы вакцинного вируса. Флавивирусы изобретения могут быть химерными флавивирусами, такими как флавивирусы,включающие капсидные и неструктурные белки первого флавивируса (например, вируса желтой лихорадки, такого как YF 17D) и белки мембраны и/или оболочки второго флавивируса (например, вируса японского энцефалита, вируса Западного Нила, вируса лихорадки денге (денге-1, денге-2, денге-3 или денге-4 вируса), вируса энцефалита Сент-Луиса, вируса энцефалита долины Мюррей, вируса клещевого энцефалита, а также любого другого флавивируса, являющегося патогеном для человека или животных из YF, JE, DEN и ТВЕ серокомплексов). В флавивирусах согласно изобретению мутация (например, замена) может быть в трансмембранном домене или эктодомене белка М. Например, мутация может быть в области аминокислот 40-75 предсказанной мембранной спирали мембранного белка М флавивируса. В качестве примера мутацией может быть замена аминокислоты 60 мембранного белка флавивируса, такого как вирус японского энцефалита(например, аргинина на цистеин в белке М вируса японского энцефалита) или в соответствующей аминокислоте другого флавивируса. Определить, какая аминокислота в данном флавивирусе "соответствует" какой в другом флавивирусе можно, проведя стандартное выравнивание аминокислотных последовательностей, что хорошо известно специалистам в данной области. В качестве другого примера мутацией может быть замена аминокислоты 66 в мембранном белка флавивируса, такого как вирус Западного Нила(например, замена лейцина пролином в белке М вируса Западного Нила) или в соответствующей аминокислоте другого флавивируса. В других примерах мутированной является другая мембранная якорная аминокислота, например одна или несколько аминокислот, выбранных из группы, фланкирующей остаток М 66, включая положения 60, 61, 62, 63, 64, 65 и 66 вируса японского энцефалита или вируса Западного Нила (или соответствующие аминокислоты в других флавивирусах) или другие аминокислотные остатки трансмембранного домена. Также авторы изобретения впервые предоставляют данные, что эктодомен белка М имеет важное функциональное значение, так как замена глутамина на пролин в остатке М 5 увеличивала пороговое значение рН инфекции. Следовательно, можно ожидать, что аттенуирование флавивируса может быть достигнуто посредством аминокислотных замен или включением различных делеций или вставок вN-концевой эктодомен или поверхностную часть белка М, а не только в его С-концевой гидрофобный якорь. Таким образом, в других примерах вирусы согласно изобретению включают одну или несколько мутаций в эктодомене белка М (остатки 1-40), как описано здесь. Этот результат является достаточно неожиданным, принимая во внимание отсутствие какой-либо известной функции зрелого белка М флавивирусов. В дополнение к упомянутым выше мутациям мембранного белка в случае химерных флавивирусов,которые включают белки мембраны и оболочки вируса Западного Нила, вирусы согласно изобретению могут включать одну или несколько мутаций белка оболочки в аминокислотах, выбранных из группы,состоящей из аминокислот 107, 138, 176, 177, 224, 264, 280, 316 и 440. В других флавивирусах мутации могут присутствовать в аминокислотах, соответствующих этим аминокислотам. В качестве конкретного примера флавивирус может включать мутацию, соответствующую мутации(ям) в аминокислоте 66 белка М вируса Западного Нила и мутациям белка Е в аминокислотах, соответствующим аминокислотам 107,316 и 440 вируса Западного Нила. В дополнение к описанным выше мутациям флавивирусы согласно изобретению могут также включать одну или несколько мутаций в гидрофобном кармане шарнирной области белка оболочки, как описано где-либо еще здесь. Дополнительными мутациями, что могут быть включены в вирусы согласно изобретению, являются мутации в 3'-нетранслируемой области, капсидном белке или других областях белка оболочки, как описано далее ниже.-2 015907 Изобретение также предоставляет вакцинные композиции, которые включают флавивирусы, описанные выше или где-либо еще здесь, и фармацевтически приемлемые носители или разбавители, а также способы стимулирования иммунного ответа на флавивирусы у пациентов с помощью введения таких вакцинных композиций. Пациенты, подвергнутые лечению согласно этим способам, включают тех, кто не имеет, но подвержен риску развития флавивирусной инфекции, а также пациентов, которые инфицированы флавивирусом. Более того, изобретение включает применение флавивирусов, описанных здесь, в профилактических и терапевтических методах, описанных здесь, а также в производстве лекарственных средств для этих целей. Изобретение дополнительно предоставляет способы получения вакцин, включающих описанные здесь флавивирусы, которые предусматривают введение мутации в мембранный белок флавивируса, что приводит к уменьшенному висцеротропизму/виремии и/или увеличенной генетической стабильности/выходам. Более того, изобретение предоставляет молекулы нуклеиновой кислоты (РНК или ДНК),соответствующие геномам флавивирусов, описанных здесь (или комплементарные им последовательности), и способы применения таких молекул нуклеиновых кислот для изготовления вирусов согласно изобретению. Флавивирусы согласно изобретению являются предпочтительными, потому что, обладая уменьшенной вирулентностью (показанной, например, посредством уменьшенного висцеротропизма/виремии),они обеспечивают дополнительный уровень безопасности, по сравнению с их немутированными аналогами, при введении пациенту. Дополнительным преимуществом является то, что некоторые мутации,такие как мутация М-60 в ChimeriVax-JE, предотвращают накопление нежелательных мутаций при производстве вакцины, что в противном случае могло бы поставить под угрозу безопасность, и увеличивают промышленные выходы. Дополнительные преимущества этих вирусов обусловлены тем фактом,что они могут включать последовательности штамма YF 17D вируса желтой лихорадки (например, последовательности, кодирующие капсидные и неструктурные белки), который (i) безопасно использовался более 60 лет, в течение которых более 350 миллионов доз были введены людям, (ii) вызывает длительный иммунитет после одной дозы и (iii) вызывает быстрый иммунный ответ в течение нескольких дней после введения. В дополнение, вакцинные вирусы согласно изобретению вызывают действующую инфекцию у вакцинированных пациентов. Так как цитокинная среда и врожденный иммунный ответ иммунизированных индивидуумов являются похожими на те, что возникают при естественной инфекции, антигенная масса увеличивается в хозяине, правильно свернутые конформационные эпитопы эффективно процессируются, приобретенный иммунный ответ становится сильным и устанавливается иммунная память. Выгодные аспекты мутаций в белке М в отношении безопасности вакцины и производства в клеточной культуре являются новыми и неожиданными ввиду отсутствия какой-либо известной функции зрелого белка М флавивирусов. Другие свойства и преимущества изобретения будут очевидны из нижеследующего подробного описания, чертежей и формулы изобретения. Краткое описание чертежей Фиг. 1 А является схематическим изображением 3'-нетранслируемой области вируса желтой лихорадки, которое показывает домены внутри области (повторяющиеся последовательности (RS), консервативные последовательности CS2, CS1 и структуру типа шпилька-петля на 3'-конце), а также примеры мутаций, которые могут быть включены в вирусы изобретения (например, делеции dA, dB, dC, dD, d7,d14, CS2 d5, и CS2 d16). Фиг. 1B является схематическим изображением последовательности и опубликованной предсказанной вторичной структуры 3'-нетранслируемой области вируса желтой лихорадки 17D от середины 3-гоRS элемента до конца UTR (нетранслируемой области) (Proutski et al., J. Gen. Virol. 78:1543-1549, 1999). Фиг. 1 С является иллюстрацией к предсказанной оптимальной вторичной структуре 3'-нетранслируемой области (3'-UTR) вируса YF 17D, полученной с использованием Зукер (Zuker) алгоритма фолдинга (сворачивания) РНК. Фиг. 1D является иллюстрацией эффектов делеции 3'-UTR (показано для dC делеции с помощью метода Зукера) на оптимальной структуре вируса YF 17D (ср. с фиг. 1 С). Фиг. 2 А является схематическим изображением последовательности. капсидного белка вируса клещевого энцефалита, а также делеции в этом белке, опубликованные Kofler et al., J. Virol. 76:3534-3543,2002. Фиг. 2 В является схематическим изображением последовательности капсидного белка вирусаYF 17D. Указаны предсказанные с помощью компьютерного анализа области, имеющие -спиральную структуру (-спирали I-IV), а также гидрофобные области (сплошные линии) и делеции, встроенные в этот белок в определенных ChimeriVax-WN вирусах (например, делеции С 1 и С 2; в рамке). Фиг. 3 представляет собой график, показывающий рост указанных вирусов (WN01, WN02 Р 5,большие бляшки, маленькие бляшки и YF/17D) в клетках HepG2.-3 015907 Фиг. 4 представляет собой график, показывающий рост указанных вирусов (WN01, WN02 Р 5,большие бляшки, маленькие бляшки и YF/17D) в клетках THLE-3. Фиг. 5 представляет собой график, показывающий виремию у хомяков, индуцированную указанными вирусами (WN02 Р 5; смешанные бляшки), маленькие бляшки (PMS, P10) и большие бляшки (PMS,Р 10). Фиг. 6 является схематическим изображением пассажей образцов вируса SF ChimeriVax-JE (например, экспериментальных пассажей для изучения генетической стабильности). Фиг. 7 представляет собой график, показывающий кривые роста вирусов изобретения SFChimeriVax-JE (неклонированные Р 2, Р 3 MS (Е-107), Р 4 PS (Е-107), Р 5 g.s. (М-60) и Р 5 VB (Е-107 в указанных временных точках после инфекции, который показывает более высокие темпы роста в SF культуре образцов вирусов, содержащих М-60 [аргинин (R)цистеин (С)] и Е-107 [фенилаланин (F)лейцин (L)] мутанты по сравнению с немутированным вирусом (Р 2). Фиг. 8 А представляет собой график, показывающий инфекционности М-5 ChimeriVax-JE мутанта(клона Е) в сравнении с основной массой неклонированной вакцины Р 5 и клоном I (мутантом Е-107),немутантом (клоном А) и мутантом М-60 (клоном С) после обработки серией кислых значений рН. Важными являются появление подъема кривой и при каких рН вирусы теряют инфекционность, а не начальные титры в разведенных образцах (например, при рН 6,8). Фиг. 8 В является диаграммой выживания для вакцины ChimeriVax-JE (1,9 log10 БОЕ/на дозу, которая определена посредством обратного титрования прививочного материала) в сравнении с мутантом М 5 ChimeriVax-JE (1,4 1og10 БОЕ/на дозу, которая определена посредством обратного титрования прививочного материала) для 3-4-дневных мышей-сосунков, при интрацеребральном введении прививки. Фиг. 8 С является диаграммой выживания для М-5 мутанта ChimeriVax-JE вируса (1,4 log10 БОЕ/на дозу, которая определена посредством обратного титрования прививочного материала) в сравнении YF-VAX (0,9 log10 БОЕ/на дозу, которая определена посредством обратного титрования прививочного материала) для 3-4-дневных мышей-сосунков, при интрацеребральном введении прививки. Фиг. 8D показывает результаты непрямого метода измерения слияния, который позволяет сравнить Р 7 и Р 10 ChimeriVax-DEN1-4 вирусы. Выход вируса для каждого эксперимента определяли посредством стандартного метода бляшек. A, ChimeriVax-DEN1 PMS P7 (треугольники) и Р 10 (ромбы); В, ChimeriVax-DEN2 PMS Р 7 (треугольники) и Р 10 (ромбы); С, ChimeriVax-DEN3 PMS P7 (треугольники) и Р 10 (ромбы); D, ChimeriVax-DEN4 PMS P7 (треугольники) и Р 10 (ромбы). Фиг. 8 Е показывает результаты непрямого метода измерения слияния с ChimeriVax-DEN3, по сравнению с вакциной PMS (P7) с партией вакцины (Р 10) и вирусом Р 15. Выход вируса для каждого эксперимента определяли посредством стандартного метода бляшек. ChimeriVax-DEN3 PMS Р 7 (треугольники), Р 10 (ромбы) и Р 15 (квадраты). Фиг. 8F показывает структуру димера Е-белка из вируса денге-1 (аминокислоты с 1 по 394) вируса(А) Положение положительно заряженного остатка лизина (K) в положении 207 вируса Р 7 (PMS,204K) показано посредством объемных пустотелых молекулярных моделей (моделей Кори-ПаулингаКолтуна) (CPK) (представляет атомы в виде сфер с радиусом, равным ван-дер-ваальсовскому радиусу). Три структурных домена показаны черным (домен I), светло-серым (домен II) и темно-серым (домен III).(B) Увеличенное изображение отмеченного участка на вставке А.(C) Такой же участок, как на вставке В из модели Е-белка мутантного вируса DEN1 (Р 10, остаток аргинина в положении 204 (204R) показан черным). Выделенные аминокислоты во вставках В и С показаны в виде каркасной модели. Серым обозначен углерод; темно-серым - азот; черным - кислород; светло-серым - сера. Фиг. 9 А представляет собой график, показывающий эффективность проникновения мутантныхM-60 (клон С), Е 107 (клон I) и немутантных (клон А) вирусов ChimeriVax-JE в указанное время. Эти результаты указывают, что мутация M-60 облегчает проникновение в клетки SF Vero, видимое во временных точках 5 и 10 мин. Клетки SF Vero инфицировали соответствующими разведенными вирусами(клоны А, С и I в бессывороточной среде) в течение 5, 10, 20 и 60 мин и затем обрабатывали в течение 3 мин раствором 0,1 М глицина, 0,1 М NaCl, pH 3,0, чтобы инактивировать свободный (внеклеточный) вирус. Лунки промывали дважды раствором PBS и затем на монослой наслаивали метилцеллюлозу с последующим окрашиванием бляшек на 5-й день кристаллическим фиолетовым. Эффективность проникновения показана как процент наблюдаемого числа бляшек после обработки глицином, по сравнению с контрольными инфицированными лунками, которые обрабатывали PBS вместо глицина. Фиг. 9 В является схематическим изображением положения аминокислотных остатков Е-107, М-5 и М-60 в белках М и Е оболочки, иллюстрирующим гипотетический эффект остатка М-5 на слияние. Пунктирный участок на острие домена II Е белка, содержащий остаток Е-107, представляет пептид слияния (c-d петлю), который встраивается в клеточную мембрану (Rey et al., Nature. 375:291-298, 1995). Остаток М-5 находится на N-концевой части эктодомена белка М. Мономеры белка Е перестраиваются в тримерные комплексы, которые, складываясь, заставляют сливаться клеточные и вирусные мембраны(Modis et al., Nature. 427 (6972):313-319, 2004). Белок М может являться функциональным составляющим этих комплексов, например, облегчающим слияние вирусной мембраны с клеточной мембраной через взаимодействие с Е белком. Остаток М-60 находится между двумя С-концевыми трансмембранными участками белка М и может участвовать во взаимодействии клеточной и вирусной мембран во время слияния. Подробное описание изобретения Изобретение предоставляет вакцины и способы применения для профилактики и лечения флавивирусной инфекции (например, вирусов японского энцефалита (JE) или Западного Нила (WN. Способы согласно изобретению в общем включают вакцинирование субъектов живым аттенуированным химерным флавивирусом, состоящим из первого флавивируса (например, вируса желтой лихорадки), в котором один или несколько структурных белков (например, белки мембраны и/или оболочки) заменены ими же из второго флавивируса (например, вируса японского энцефалита (JE) и/или Западного Нила (WN); также см. ниже). Мембранные белки химер согласно изобретению включают одну или несколько мутаций, как описано более подробно ниже. Также, как описано ниже, структурные белки, такие как белки мембраны и/или оболочки других флавивирусов, могут быть использованы вместо них из вируса японского энцефалита или вируса Западного Нила в химерных вирусах согласно настоящему изобретению. Далее, мутации мембранных белков согласно изобретению могут также использоваться в интактных нехимерных флавивирусах (например, в любом из тех, что здесь перечислены), не включающих никакие замены структурных белков и, необязательно, с одной или несколькими дополнительными мутациями,такими как те, что описаны здесь. Конкретным примером химерного вируса, который может быть включен в вакцины согласно изобретению, является вакцинный штамм желтой лихорадки человека YF 17D (например, YF17D-204Berna Biotech, Bern, Switzerland); YF17D-204 France (X15067, X15062); YF17D-204, 234 US (Rice et al.,Science. 229:726-733, 1985, в котором белки мембраны и оболочки заменены белками мембраны и оболочки (включая мутацию белка М, такую как замена в положении M-60, как описано здесь) вируса японского энцефалита. В другом примере белки мембраны и оболочки YF 17D заменены на те же из вируса Западного Нила (включая мутацию белка М, такую как замена в положении М 66, как описано здесь). В других примерах другие флавивирусы, такие как вирус денге (серотипы 1, 2, 3 или 4), вирус энцефалита Сент-Луиса, вирус энцефалита долины Мюррей, вирус желтой лихорадки, включая штаммы YF 17D, или любые другие флавивирусы могут представлять белки мембраны и/или оболочки в таком химерном вирусе. Дополнительные флавивирусы, которые можно аттенуировать по изобретению, либо как интактные нехимерные вирусы, либо как источник белков мембраны и/или оболочки в химерах, включают другие передаваемые комарами флавивирусы, такие как вирусы Кунджин, энцефалита Росио и Ильеус; передаваемые клещами флавивирусы, такие как вирусы центрально-европейского энцефалита, сибирского энцефалита, российского весенне-летнего энцефалита, кьясанурской лесной болезни, омской геморрагической лихорадки, болезни Лупинга, Повассан, Негиши, Абсеттаров, Ханзалова, Апеу и Хипр; а также вирусы из рода Hepacivirus (например, вирус гепатита С). Другие штаммы вируса желтой лихорадки, например YF17DD (номер доступа в базе данных GenBank U17066), YF17D-213 (номер доступа в базе данных GenBank U17067; dos Santos et al., Virus Res. 35:35-41, 1995), и штаммы 17DD вируса желтой лихорадки, описанные Galler et al., Vaccines. 16(9/10): 1024-1028, 1998, также могут быть использованы в качестве каркасных вирусов, в которые по изобретению могут быть встроены гетерологичные структурные белки. Из перечисленных выше вирусов каждый обладает некоторой предрасположенностью инфицировать внутренние органы. Висцеротропизм этих вирусов может вызвать дисфункции жизненно важных внутренних органов, такие как наблюдаемые, хотя и довольно нечасто, в побочных случаях болезни, ассоциированных с YF вакциной. Репликация вируса в этих органах может также вызвать виремию и, следовательно, способствовать проникновению в центральную нервную систему. Уменьшение висцеротропизма этих вирусов с помощью мутагенеза по настоящему изобретению может, таким образом, уменьшить способность этих вирусов вызывать неблагоприятное висцеротропное заболевание и/или проникать в мозг и вызывать энцефалит. Мутации по изобретению приводят к положительным эффектам на вирусах, которые могут включать, например, увеличенные аттенуирование, стабильность и/или репликацию. Мутации находятся в мембранном белке, например в трансмембранном участке или в эктодомене мембранного белка. Например, мутации могут быть в аминокислотах 60 или 66 мембранного белка и/или других аминокислотах внутри предсказанного трансмембранного домена (например, одной или нескольких из аминокислот 4075) или в N-концевом эктодомене белка М (например, мутации в М-5). В качестве конкретного примера аминокислота 60 мембранного белка (аргинин в вирусе японского энцефалита дикого типа) может быть заменена другой аминокислотой, такой как цистеин. Замена аргинина на цистеин в положении М-60 в-5 015907 вирусе ChimeriVax-JE существенно уменьшает виремию (висцеротропизм) вируса у человека в клинических испытаниях, в которых тестировали варианты вакцины с и без мутации М-60 (табл. 11 А и 11 В). В дополнение к цистеину, другие аминокислоты, такие как серин, треонин, глицин, метионин и т.п., могут замещать аминокислоту дикого типа в положении 60 мембранного белка. В еще одном примере аминокислота 66 мембранного белка (лейцин в вирусе Западного Нила дикого типа) может быть заменена другой аминокислотой, такой как пролин. В дополнение к пролину, другие гидрофобные аминокислоты,такие как изолейцин, метионин, или валин или низкомолекулярные аминокислоты, такие как аланин или глицин, могут замещать аминокислоту дикого типа в положении 66 мембранного белка. Эти мутации могут также присутствовать в соответствующих аминокислотах других флавивирусов, как описано здесь. В качестве других примеров замен, которые могут быть сделаны в последовательностях мембранного белка, могут быть замещены аминокислоты в положениях 61, 62, 63 и/или 64, по отдельности или в сочетании друг с другом, мутацией в положении 60, мутацией в положении 66 и/или другой(ими) мутацией(ями). Примеры замен в этих положениях в последовательности мембранного белка вируса Западного Нила включают: валин на аланин в положении 61, валин на глутаминовую кислоту или метионин в положении 62, фенилаланин на серин в положении 63 и валин на изолейцин в положении 64. Эти мутации могут также присутствовать в соответствующих аминокислотах других флавивирусов, как описано здесь. Примеры замен в этих или окружающих положениях в последовательности мембранного белка вируса JE включают любую из оставшихся 20 аминокислот с расчетом, что будет достигнут желаемый эффект на висцеротропизм и/или репликацию/стабильность в клеточной культуре при изготовлении. Другие примеры химерных и нехимерных флавивирусов включают любые аминокислотные замены, по отдельности или в сочетаниях, в N-концевом эктодомене М-белка, состоящего из остатков 1-40 белка, а также делеции(й) различных размеров (например, длиной 1, 2, 3, 4, 5 и т.д. аминокислот), введенных в эктодомен и/или трансмембранный домен М-белка. В дополнение к одной или нескольким мутациям мембранного белка, упомянутым выше, вирусы согласно изобретению также могут включать одну или несколько дополнительных мутаций. Например, в случае вируса Западного Нила такая дополнительная(ые) мутация(и) может находиться в районе положения 107 (например, L на F), 316 (например, А на V) или 440 (например, K на R) (или их комбинаций) белка оболочки вируса Западного Нила. Мутации могут, поэтому быть в одной или нескольких аминокислотах 102-112, 138 (например, Е на K), 176 (например, Y на V), 177 (например, Т на А), 244 (например, Е на G), 264 (например, Q на Н), 280 (например, K на М), 311-321 и/или 435-445 белка оболочки вируса Западного Нила. В качестве конкретного примера, используя последовательность штамма NY99flamingo 382-99 (номер доступа базы данных GenBank AF196835) вируса Западного Нила как основу,лизин в положении 107 может быть заменен фенилаланином, аланин в положении 316 может быть заменен валином и/или лизин в положении 440 может быть заменен аргинином. Примеры дополнительных комбинаций аминокислот, которые могут быть мутированы, включают нижеследующие: 176, 177, и 280; 176, 177, 244, 264, 280 и 138, 176, 177, и 280. Далее, эти мутации могут также присутствовать в соответствующих аминокислотах других флавивирусов, как описано здесь. Вакцина ChimeriVax-JE уже включает все вышеупомянутые мутации, специфичные дляSA-14-14-2, так как она содержит SA-14-14-2-специфичную оболочку вируса JE. Дополнительные аминокислотные замены в белке Е могут также быть выбраны и введены, основываясь на знании структуры/функции белка Е для дополнительного аттенуирования (например, как описано ниже). Эти мутации могут также присутствовать в соответствующих аминокислотах других флавивирусов, как описано здесь. В дополнение к вышеупомянутым аминокислотам замены могут быть произведены другими аминокислотами, такими как аминокислоты, которые дадут в результате консервативные замены аминокислот,упомянутых выше. Консервативные замены обычно включают замены внутри следующих групп: глицин,аланин, валин, изолейцин и лейцин; аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота, аспарагин и глутамин; серин и треонин; лизин и аргинин; фенилаланин и тирозин. Вирусы согласно изобретению (например, вирус японского энцефалита и вирус Западного Нила,химерные флавивирусы, включающие белки мембраны и оболочки из этих или других флавивирусов) могут также включать в дополнение к выше обсужденной(ым) мутации(ям) (например, мутациям мембранного белка) одну или несколько мутаций в шарнирном участке или гидрофобном кармане белка оболочки, поскольку показано, что подобные мутации приводят к уменьшенному висцеротропизму(Monath et al., J. Virol. 76:1932-1943, 2002; WO 03/103571 A2; WO 05/082020; Guirakhoo et al., J. Virol. 78(18):9998-10008, 2004). Полипептидная цепь белка оболочки укладывается в три отдельных домена: центральный домен (домен I), димеризующийся домен (домен II) и иммуноглобулин-подобный модульный домен (домен III). Шарнирный участок находится между доменами I и II и при воздействии кислого рН претерпевает конформационное изменение (отсюда название "шарнирный"), что приводит к образованию тримеров белка оболочки, вовлеченных в слияние вирусной и эндосомальной мембран после захвата вируса клеткой посредством рецепторно-опосредованного эндоцитоза. До изменения конформации белки присутствуют в виде димеров.-6 015907 Многие аминокислоты оболочки находятся в шарнирном участке, включая, например, аминокислоты 48-61, 127-131 и 196-283 вируса желтой лихорадки (Rey et al., Nature. 375:291-298, 1995). Любая из этих аминокислот или аминокислот из близкого окружения (и соответствующие аминокислоты в других белках оболочки флавивирусов) по изобретению могут быть мутированы и протестированы на аттенуирование. Особый интерес представляют аминокислоты внутри гидрофобного кармана шарнирного участка. В качестве конкретного примера было показано, что замещающая аминокислота 204 белка оболочки (K на R), которая находится в гидрофобном кармане шарнирного участка, в химерном флавивирусе,включающем последовательности белка оболочки денге-1, встроенные в векторный вирус желтой лихорадки, приводит к аттенуированию (Guirakhoo et al., J. Virol. 78:9998-10008, 2004). Эта замена приводит к изменению в структуре белка оболочки, такому, что межмолекулярные водородные связи между одним мономером оболочки и другим в белке дикого типа разрушаются и заменяются новыми внутримолекулярными взаимодействиями в мономерах. Это наблюдение привело к предположению, что являющееся результатом этой замены аттенуирование обусловлено этими новыми взаимодействиями с изменением структуры белка в предшествующую слиянию конформацию, по всей вероятности, посредством изменения порогового рН, который необходим для слияния вирусной мембраны с клеткой-хозяином, и предоставляет основу для конструирования дальнейших аттенуированных мутантов, в которых дополнительные замены используются для увеличения внутримолекулярных взаимодействий в гидрофобном кармане,приводящих к аттенуированию. Примеры таких мутаций/замен, которые могут быть сделаны в гидрофобном кармане и включены в вирусы согласно изобретению, включают замены в E202K, E204K, E252V,E253L, Е 257 Е, E258G и Е 261 Н (и соответствующие замены в других флавивирусах). Любые аминокислотные замены в соответствующем участке Е-белка JE и WN вирусов могут быть сконструированы и встроены, основываясь на знании структуры гомологичного белка. Ген Е содержит функциональные домены, внутри которых аминокислотные замены могут влиять на функции и, таким образом, уменьшать вирулентность, как описано авторами Hurrelbrink and McMinn(Adv. Virus Dis. 60:1-42, 2003). Функциональные участки белка Е, в которые можно встроить мутации,которые вместе с мембранными делециями/мутациями описаны в настоящем изобретении, могут давать в результате соответствующим образом аттенуированную вакцину, включают: а) предполагаемый участок связывания рецептора на внешней поверхности домена III; b) молекулярный шарнирный участок между доменами I и II, который определяет кислотно-зависимые конформационные изменения белка Е в эндосоме и уменьшает эффективность интернализации вируса; с) интерфейс белков prM и Е, участок Ебелка, который стыкуется с prM, с последующей перегруппировкой из димера в тример при воздействии кислого рН в эндосоме; d) окончание домена слияния домена II, которое вовлечено в слияние с эндосомальной мембраной при интернализации; и е) участок стебель-якорь, который функционально вовлечен в конформационные изменения белка Е при слиянии, индуцированном кислотностью. Дополнительные аттенуирующие мутации, которые могут быть включены с одной или несколькими мутациями мембранного белка в вирусы согласно изобретению изобретения, включают мутации в 3'-нетранслируемой области каркаса вируса желтой лихорадки. Организация 3'-UTR штамма вакцины вируса желтой лихорадки YF 17D, который является общим для всех вирусов ChimeriVax показана на фиг. 1 А. Она включает, начиная с 3'-конца, (i) 3'-концевую структуру шпилька-петля, которая согласно гипотезе действует как промотор для синтеза минус-цепи РНК и является консервативной для всех флавивирусов; (ii) два консервативных элемента последовательности, CS1 и CS2, которые обладают высокой степенью гомологии со всеми передаваемыми комарами флавивирусами; и (iii) уникальные для штаммов западно-африканской желтой лихорадки, включающих вакцинный вирус YF 17D, три копии повторяющегося элемента последовательности (RS), находящихся в 5'-части 3'-UTR (Chambers et al., Annu. Rev.Microbiol. 44:649-688, 1990). 3'-UTR также включает многочисленные структуры шпилька-петля, такие как в неконсервативном участке, расположенном в 3'-области от RS элементов, как указано на фиг. 1 В. Мутации в 3'-UTR, которые могут быть включены в вирусы согласно изобретению, обычно являются короткими, аттенуирующими делециями, например меньше 30 нуклеотидов (например, 1, 2, 3 и т.д. и до 29, например, 2-25, 3-20, 4-15, 5-10 или 6-8 нуклеотидов длиной); патентные заявки США 60/674546 и 60/674415). В некоторых примерах сконструированы короткие делеции 3'-UTR для дестабилизации вторичной структуры одной или нескольких шпилек в 3'-UTR. В дополнение к делециям мутации в таких структурах могут также включать замены, которые сходным образом приводят к дестабилизации структуры шпилек. В определенных примерах структуры шпилька-петля, являющиеся объектом мутаций, находятся в неконсервативных областях 3'-UTR или в консервативных областях, которые допускают такие мутации (например, в CS2). Например, мутации, дестабилизирующие шпильки, могут присутствовать в любой одной или нескольких предсказанных шпилечных структурах, показанных на фиг. 1 В, которая показывает четыре примера таких делеций (dA, dB, dC и dD). Поэтому в дополнение к этим конкретным примерам другие примеры мутаций 3'-UTR в вирусе желтой лихорадки включают мутации, содержащие, например, 1-2, 3-8, 4-7 или 5-6 нуклеотидов следующих последовательностей шпилек, которые показаны на фиг. 1 В, читаемых в направлении от 5' к 3': TGGAG, СТССА, GACAG, TTGTC,AGTTT, GGCTG, CAGCC, AACCTGG, TTCTGGG, СТАССАСС, GGTGGTAG, GGGGTCT, AGACCCT,AGTGG и TTGACG. Эти мутации могут также присутствовать в соответствующих аминокислотах дру-7 015907 гих флавивирусов, как описано здесь. В дополнение к мутациям, дестабилизирующим шпильки, другие короткие делеции в 3'-UTR могут также быть включены с одной или несколькими мембранными (и, возможно, другими) мутациями в вирусы согласно изобретению. Например, ранее описанная мутация 30 (Men et al., J. Virol. 70:3930-3937,1996; патент США 6184024 B1) или мутации, попадающие в эту последовательность, могут быть использованы. Таким образом, например, изобретение включает любые жизненно важные делеции длиной в 1, 2, 3 и т.д. и до 29 (например, 1-25, 2-20, 3-15, 4-14, 5-13, 6-12, 7-11, 8-10 или 9) нуклеотидов внутри этой области. В качестве конкретного примера вирусы изобретения могут включать делецию d7, в которой следующие нуклеотиды из этой области в YF 17D удалены: нуклеотиды 345-351 (AAGACGG; нумерация с 1-го нуклеотида 3'-UTR, после терминирующего кодона UGA вирусной ORF (открытой рамки считывания; фиг. 1 А). Мутации, включающие делецию, например 1, 2, 3, 4 или 5 дополнительных нуклеотидов с 3'- или 5'-конца этой последовательности, также включены в изобретение. В других примерах короткие делеции в консервативных последовательностях CS1 и CS2 включены в изобретение. Эти мутации могут включать делеции, например, 1-29, 2-25, 3-20, 4-15, 5-10 или 6-8 нуклеотидов этих последовательностей. В качестве двух конкретных примеров нуклеотиды 360-364 (GGTTA; CS2d5; фиг. 1 А) и/или нуклеотиды 360-375 (GGTTAGAGGAGACCCT; CS2dl6; фиг. 1 А) удалены из CS2 3'-UTR, специфичной для YF 17D. Мутации, включающие делецию, например, 1, 2, 3, 4 или 5 дополнительных нуклеотидов с 3'- или 5'-конца этой последовательности, также могут быть использованы. Для 3'-UTR других флавивирусов могут быть осуществлены похожие мутации, основанные на вторичной структуре 3'-UTR. Предсказания вторичной структуры 3'-UTR других флавивирусов опубликованы, например, для денге,Кунджин и клещевого энцефалита (см., например, Proutski et al., Virus Res. 64:107-123, 1999) и HCV (вирус гепатита С) (см., например, Kolykhalov et al., J. Virol. 70:3363-3371, 1996). Кроме того, многочисленные нуклеотидные последовательности 3'-UTR для многих штаммов флавивирусов, представляющих все четыре главных серокомплекса (YF, JE, денге и ТВЕ), доступны в базе данных GenBank. Последовательности дополнительных штаммов могут быть определены секвенированием вирусов. Вторичные структуры этих последовательностей могут быть легко предсказаны с использованием стандартного программного обеспечения (например, программ mfold и RNAfold), чтобы обнаружить потенциальные структуры шпилька-петля, которые могут служить объектами для мутагенеза. Следует отметить, что реальные вторичные структуры 3'-UTR флавивирусов, включая вирусYF 17D, неизвестны, поскольку не существует доступных методов экспериментально доказать их существование в составе целых вирусов, и, следовательно, опубликованные предсказания, например предсказание для YF 17D, сделанное автором Proutski и соавторами (фиг. 1 В), могут быть неправильными. Может быть предсказано образование множества альтернативных структур в относительно длинной молекуле РНК (Zuker et al., N.A.R. 19:2707-2714, 2001), и возможно, что различные структуры (в плюс и минус цепях) образуются и действуют на различных стадиях жизненного цикла вируса. На истинные структуры может влиять образование различных псевдоузлов (Olsthoorn et al., RNA 7:1370-1377, 2001) и дальних взаимодействий РНК, например циклизация РНК и другие взаимодействия (Alvarez et al., J. Virol. 79:6631-6643, 2005), а также возможные взаимодействия РНК с белками вируса и клетки-хозяина. Еще сильнее осложняя интерпретацию опубликованных результатов теоретических компьютерных предсказаний, часто используются ручные операции, такие как начальный фолдинг частичных последовательностей с последующим укладыванием первоначально предсказанных последовательностей в структуры более длинных РНК последовательностей, искусственное использование N во время этапов фолдинга и субъективный выбор предпочтительных структурных элементов (например, Mutebi et al., J. Virol. 78:9652-9665, 2004). С этой целью авторы провели фолдинг РНК последовательности 3'-нетранслируемой области YF 17D, используя широко применимый алгоритм Зукера (Zuker) для предсказаний. Предсказанная оптимальная структура показана на фиг. 1 С, которая отличается от структуры,предсказанной группой Proutsky, показанной на фиг. 1 В. Важно, что небольшие делеции dA, dB, dC, dD,d7 и d14 обычно дестабилизируют предсказанные оптимальные (фиг. 1 С) и субоптимальные структуры нативного YF 17D. Пример одной такой измененной оптимальной структуры (для мутанта dC) показан на фиг. 1D. В отличие от этого, делеции CS2d5 и CS2d16 (фиг. 1 А и 1 В) заметно не меняют оптимальную нативную структуру, указывая на то, что эти делеции могут аттенуировать вирус (аттенуирование было показано на модели хомяков для ChimeriVax-WN) посредством преимущественного изменения последовательности CS2 per se, чем структуры 3'-UTR, или в качестве альтернативы, посредством изменения некоторых субоптимальных структур. Поэтому, даже хотя некоторые делеции были разработаны, основываясь на предсказании структуры, сделанном Proutski (фиг. 1B), их реальный эффект может происходить в результате дестабилизации структурных элементов, отличных от предсказанных шпилек-петель на фиг. 1 В. Дополнительные мутации, которые можно включить с мутациями мембранного белка (и возможно другими) в вирусы согласно изобретению, являются короткими делеционными (например, делециями 1,2, 3 или 4 аминокислот) мутациями в капсидном белке. Примеры таких мутаций, предоставленные в ссылке на капсидный белок YF 17D, включают жизненно важные делеции, влияющие на спираль I белка(см. фиг. 2 А). Конкретным примером такой мутации является мутация С 2, которая включает делецию аминокислот PSR из спирали I (фиг. 2 А). Другие короткие мутации в этой области (а также соответствующие мутации в последовательностях других флавивирусов) могут быть протестированы на жизнеспособность и аттенуирование и могут также быть использованы в изобретении. Последовательности капсидных белков других флавивирусов опубликованы, например, для вирусов ТВЕ, WN, Кунджин, JE и денге (например, Pletnev et al., Virology. 174:250-263, 1990). Ниже следуют конкретные примеры химерных флавивирусов, которые помещены в Американскую коллекцию культур (American Type Culture Collection (ATCC в городе Манасас, штат Вирджиния, США по условиям Будапештского соглашения с официальной датой депонирования 6 января 1998 года, которые могут быть использованы для производства вирусов изобретения: химерный вирус желтой лихорадки 17D/денге типа 2 (YF/DEN-2; номер доступа в ATCC - ATCC VR-2593) и химерный вирус желтой лихорадки 17D/японского энцефалита SA-14-14-2 (YF/JE A1.3; номер доступа в ATCC - ATCC VR-2594). Детали получения химерных вирусов, которые могут быть использованы в изобретении, предоставлены,например, в патенте США 6696281 В 1; международных патентных заявках PCT/US98/03894(WO 98/37911) и PCT/US00/32821 (WO 01/39802) и Chambers et al., J. Virol. 73:3095-3101, 1999, а также предоставлены ниже. Эти методы могут быть модифицированы для применения в настоящем изобретении посредством включения этапа введения одной или нескольких мутаций, как описано здесь, во встроенные последовательности (например, в мембранные белки или другие последовательности вируса японского энцефалита или вируса Западного Нила). Методы, которые могут быть использованы для получения вирусов в изобретении, также описаны в патентной заявке PCT/US03/01319 (WO 03/060088 А 2; также см. ниже). Мутации могут быть получены в вирусах согласно изобретению с использованием стандартных методов, таких как сайт-направленный мутагенез. Одним примером типа мутаций, присутствующих в изобретении, являются замены, но другие типы мутаций, такие как делеции и вставки, также могут быть использованы. В дополнение, как было упомянуто выше, мутации могут присутствовать по отдельности или в контексте одной или нескольких дополнительных мутаций, либо внутри самого мембранного белка, либо в любой комбинации последовательностей, например 3'-UTR, капсида или оболочки. Вирусы (включая химеры) согласно настоящему изобретению могут быть получены с использованием стандартных методов в данной области. Например, молекула РНК, соответствующая геному вируса, может быть введена в первичные клетки, куриные эмбрионы или диплоидные клеточные линии, из которых (или супернатантов которых) можно выделить размноженный вирус. Другие методы, которые могут быть использованы для получения вирусов, используют гетероплоидные клетки, такие как клеткиVero (Yasumura et al., Nihon Rinsho. 21:1201-1215, 1963). В этом методе молекулу нуклеиновой кислоты(например, молекулу РНК), соответствующую геному вируса, вводят в гетероплоидные клетки, вирус собирают из среды, в которой культивируют клетки, и собранный вирус обрабатывают нуклеазой (например, эндонуклеазой, которая разрушает и ДНК, и РНК, такой как Benzonase; патент США 5173418). В случае Benzonase можно использовать 15 единиц/мл и охлаждать кондиционированную среду при 2-8 С в течение 16 ч или более, чтобы расщепить нуклеиновые кислоты. Обработанный нуклеазой вирус затем концентрируют (например, посредством ультрафильтрации, используя фильтр,имеющий предел разделения 500 кД (например, Pellicon-2 Miniunltraf ilter cassette, диафильтруют против среды МЕМЕ без фенола красного или FBS, добавляют лактозу по рецептуре и фильтруют в стерильный контейнер. Детали этого метода предоставлены в патенте WO 03/060088 А 2. Более того, клетки,используемые для выращивания вирусов изобретения, можно растить на бессывороточной среде, как описано ниже. Вирусы согласно изобретению можно вводить в качестве первичных профилактических агентов лицам, подверженным риску инфекции, или можно использовать как вторичные агенты для лечения инфицированных пациентов. Поскольку вирусы являются аттенуированными, то они особенно хорошо подходят для назначения лицам в "группе риска", таким как пожилые люди, дети или ВИЧинфицированные. Вакцины могут использоваться в ветеринарии, например при вакцинации лошадей против инфекции, вызываемой вирусом Западного Нила, или при вакцинации домашних животных (например, кошек, собак и птиц), домашнего скота (например, овец, крупного рогатого скота, свиней, птиц и коз) и ценных животных, таких как редкие птицы. Более того, вакцины по изобретению могут включать вирус, такой как химерный вирус, включающий определенную мутацию (например, мутацию М 5,M-60 и/или М 66) в смеси с вирусами без таких мутаций. Разработка рецептурных форм для вирусов по изобретению может быть осуществлена с использованием стандартных методов в данной области. Многочисленные фармацевтически приемлемые растворы для использования в препаратах вакцин являются хорошо известными и легко могут быть адаптированы для применения в настоящем изобретении специалистом в этой области (см., например, Remington'sPharmaceutical Sciences (18th edition), ed. A. Gennaro, 1990, Mack Publishing Co., Easton, PA). В двух конкретных примерах вирусы введены в рецептуру в минимальной среде Игла с солями Эрла (МЕМЕ), содержащей 7,5% лактозы и 2,5% человеческого сывороточного альбумина, или в МЕМЕ, содержащей 10%-9 015907 сорбита. Однако вирусы можно просто растворить в физиологически приемлемом растворе, таком как стерильный физраствор или стерильный забуференный физраствор. В другом примере вирусы могут быть применены и введены в рецептуру, например, таким же образом, как и вакцина против вируса желтой лихорадки 17D, например как очищенная суспензия тканей инфицированных куриных эмбрионов или жидкость, собранная из клеточных культур, инфицированных химерным вирусом желтой лихорадки. Вакцины по изобретению могут быть введены с использованием способов, известных в медицине, и соответствующие количества вакцин для введения могут быть легко определены специалистами в данной области. Определить, что является соответствующим количеством вируса для введения, можно посредством учета факторов, таких как размеры и общее состояние здоровья субъекта, которому вводят вирус. Например, вирусы по изобретению могут быть в составе лекарственных форм в виде стерильных водных растворов, содержащих между 102 и 108, например от 103 до 107 или 104 до 106 инфекционных единиц (например, бляшкообразующих единиц или доз инфекции клеточной культуры) в объеме дозы от 0,1 до 1 мл, для введения, например, внутримышечно, подкожно или внутрикожно. В дополнение, поскольку флавивирусы способны инфицировать человека через ткани слизистых, таких как ткани полости рта ("Tick-borne Encephalitis", Gresikova et al., In The Arboviruses, Ecology and Epidemiology, Monath (ed.),CRC Press, Boca Raton, Florida, 1988, Volume IV, 177-203), также можно вводить вирусы через слизистые(например, оральным путем). Более того, вакцины по изобретению могут быть введены в единичной дозе или, необязательно, введение может включать введение первичной дозы, с одной или несколькими повторными дозами, которые вводятся, например, 2-6 месяцев спустя, как определено специалистами в данной области. Необязательно, адъюванты, известные специалистам в этой области, могут быть применены для введения вирусов изобретения. Адъюванты, которые могут быть использованы для увеличения иммуногенности вирусов изобретения, включают, например, липосомные составы, синтетические адъюванты, такие как (например, QS21) дипептид мурамила, монофосфорил-липид А или полифосфазин. Хотя обычно эти адъюванты используют для усиления иммунных ответов на инактивированные вакцины, они также могут быть использованы с живыми вакцинами. В случае вируса, вводимого в организм через слизистую, например, оральным путем, слизистые адъюванты, такие как термолабильный токсин из Е.coli (LT) или мутантные производныеLT, могут быть использованы как адъюванты. В дополнение, гены, кодирующие цитокины, которые имеют адъювантное действие, могут быть встроены в вирусы. Поэтому гены, кодирующие цитокины, такие как GM-CSF, IL-2, IL-12, IL-13 или IL-5, могут быть встроены вместе с чужеродными антигенными генами для получения вакцины, которая приводит к усиленным иммунным ответам, или для модулирования иммунитета, направленного более определенно на клеточный, гуморальный или барьерный (на слизистых) ответ. Дополнительные адъюванты, которые могут, необязательно, быть использованы в изобретении, включают модуляторы толл-подобных рецепторов (TLR). В случае вирусов денге и/или химерных флавивирусов, включающих белки мембраны и оболочки вируса денге, оптимальная вакцинация против которых может включать выработку иммунитета против всех четырех серотипов денге, вирусы по изобретению могут быть использованы в составе тетравалентных вакцин. Один или все вирусы, использованные в таких тетравалентных составах, могут включать одну или несколько мутаций, которые уменьшают висцеротропизм, как описано здесь. Вирусы можно смешивать для образования тетравалентных препаратов на любом этапе приготовления или можно вводить последовательно. В случае тетравалентной вакцины можно использовать эквивалентные количества каждого вируса. В качестве альтернативы, количества каждого из различных вирусов, присутствующих в вводимых вакцинах, могут варьировать (WO 03/101397 А 2). Изобретение также включает молекулы нуклеиновых кислот (например, РНК или ДНК (например,кДНК, которые соответствуют геномам вирусов по изобретению, как описано здесь, или их комплементарные последовательности. Эти молекулы нуклеиновых кислот могут быть использованы, например, в способах производства вирусов по изобретению. В таких способах молекула нуклеиновой кислоты, соответствующая геному вируса, вводится в клетки, в которых вирус может быть получен и реплицирован(например, первичные клетки, куриные эмбрионы, диплоидные клеточные линии или гетероплоидные клеточные линии (например, клетки Vero, и из которых (или супернатантов которых) размножившийся вирус может быть очищен. Эти способы могут в дальнейшем включать этапы очистки вируса, известные в этой области. Как упомянуто выше, детали получения химерных вирусов, которые могут быть использованы в изобретении, предоставлены в патенте США 6696281 В 1; международных заявках PCT/US98/03894(WO 98/37911) и PCT/US00/32821 (WO 01/39802) и Chambers et al., J. Virol. 73:3095-3101, 1999. Подробности создания химерных флавивирусов, включающих белки оболочки и предшественника мембранного вируса японского энцефалита (или вируса Западного Нила) и капсидные и неструктурные белки вируса желтой лихорадки, предоставлены ниже. Специалист в данной области может легко адаптировать эти способы для применения в создании химер, включающих мутации, описанные здесь, а также химер,включающих другие последовательности оболочки и предшественника мембранного белка.- 10015907 Коротко, получение химеры YF/JE может включать следующее. Геномные последовательности YF размножают в двух плазмидах (YF5'3'IV и YFM5.2), которые кодируют последовательности YF от нуклеотидов 1-2276 и 8279-10861 (YF5'3'IV) и от 1373-8704 (YFM5.2) (Rice et al., The New Biologist. 1:285296, 1989). Полноразмерные кДНК матрицы генерируют с помощью лигирования соответствующих рестрикционных фрагментов, полученных из этих плазмид. Последовательности YF внутри плазмидYF5'3'IV и YFM5.2 затем замещаются соответствующими последовательностями JE от начала белка prM(нуклеотид 478, аминокислота 128) через сайт рестрикции E/NS1 (нуклеотид 2452, аминокислота 817). Клоны аутентичных генов структурных белков JE были генерированы из SA-14-14-2 штамма JE(живой, аттенуированный вакцинный штамм JE; JE вирус SA-14-14-2 доступен из Центров по контролю заболеваний в Форте Коллинз, штат Колорадо и Йельского Отдела Исследований Арбовирусов, в Йельском Университете, Нью-Хэвен, штат Коннектикут, которые являются центрами хранения для арбовирусов, определенными ВОЗ для Соединенных Штатов). Вирус JE SA-14-14-2 был получен на уровне пассирования PDK-5 (пять пассажей в клетках PDK (первичные клетки почки собаки и пассированы в клетках LLC-MK2 для получения достаточных количеств вируса для клонирования кДНК. Используемая стратегия включает клонированные структурные области в двух отрезках, которые перекрываются в сайте NheI (нуклеотид 1125 в вирусе JE), которые затем могут быть использованы для лигирования in vivo. РНК экстрагировали из монослоев инфицированных клеток LLC-MK2 и проводили синтез первой цепи отрицательной смысловой кДНК с использованием обратной транскриптазы и отрицательным смысловым праймером (нуклеотидная последовательность 2456-71 вируса японского энцефалита), содержащим внутренние рестрикционные сайты XbaI и NarI для клонирования сначала в плазмиду pBluescript IIKS (+) и далее в YFM5.2 (NarI) соответственно. После синтеза первой цепи кДНК следовала амплификация с помощью ПЦР последовательности вируса японского энцефалита от нуклеотидов 1108-2471, с использованием того же отрицательного смыслового праймера и положительного смыслового праймера(нуклеотидная последовательность 1108-1130 вируса JE), содержащего внутренние XbaI и NsiI сайты рестрикции для клонирования в pBluescript и YFM5.2 (NarI) соответственно. Последовательности JE были подтверждены расщеплением ферментами рестрикции и определением нуклеотидной последовательности. Нуклеотидная последовательность от 1 до 1130 нуклеотида вируса японского энцефалита была получена ПЦР-амплификацией отрицательной цепи кДНК вируса японского энцефалита с использованием отрицательного смыслового праймера, соответствующего 1116-1130 нуклеотидам вируса японскогоэнцефалита, и положительного смыслового праймера, соответствующего 1-18 нуклеотидам вируса японского энцефалита, содержащих сайт рестрикции EcoRI. Фрагменты ПЦР клонировали в pBluescript и нуклеотидные последовательности вируса японского энцефалита подтверждали секвенированием. Вместе это представляет клонирование последовательности вируса японского энцефалита от нуклеотидов 1-2471 (аминокислоты 1-792). Чтобы встроить С-конец белка оболочки вируса JE в сайт расщепления E/NS1 вируса YF, в плазмиду YFM5.2 был встроен уникальный сайт рестрикции NarI с помощью олигонуклеотид-направленного мутагенеза последовательности сигналазы в сайте расщепления E/NS1 (нуклеотиды 2447-2452, аминокислоты 816-817 в вирусе YF) для создания YFM5.2 (NarI). Транскрипты, полученные с матриц, включающих эти изменения, были проверены на инфекционность и в результате показали специфическую инфекционность, сходную с родительскими матрицами (приблизительно 100 бляшкообразующих единиц/на 250 нг транскрипта). Последовательность нуклеотидов с 1108 по 2471 вируса японского энцефалита была субклонирована из нескольких независимых клонов pBluescript/JE, полученных с помощью ПЦР, в YFM5.2 (NarI), используя уникальные сайты рестрикции NsiI и NarI. Клоны YF5'3'IV/JE, содержащие 5'-нетранслируемую область вируса желтой лихорадки (нуклеотиды 1-118), примыкающую к области prM-Е вируса японского энцефалита, были получены с помощью ПЦР-амплификации. Для получения последовательностей, содержащих соединение капсидного белка вируса желтой лихорадки и белка prM вируса японского энцефалита, использовали отрицательный смысловой химерный праймер, перекрывающий эту область, с положительным смысловым праймером, соответствующим 6625-6639 нуклеотидам плазмиды YF5'3'IV, для генерации фрагментов ПЦР, которые затем использовали как отрицательные смысловые ПЦР праймеры вместе с положительным смысловым праймером, комплементарным последовательности вектора pBluescript, находящимся в 5'-области от сайта рестрикцииEcoRI, для амплификации последовательности вируса японского энцефалита (кодированной в обратной ориентации в векторе pBluescript) от нуклеотида 477 (N-конец белка prM) через сайт рестрикции NheI у 1125 нуклеотида. Получившиеся фрагменты ПЦР были встроены в плазмиду YF5'3'IV с использованием сайтов рестрикции NotI и EcoRI. Эта конструкция содержит промотор SP6, предваряющий 5'-нетранслируемую область вируса желтой лихорадки, с последовательностью за ней: YF (С) JE (prM-Е),и содержит сайт рестрикции NheI (нуклеотид 1125 вируса JE), требующийся для лигирования in vitro. Чтобы использовать сайт NheI внутри последовательности белка оболочки вируса JE в качестве 5'-сайта лигирования in vitro, лишний сайт NheI (нуклеотид 5459) в плазмиде YFM5.2 был удален. Это было выполнено посредством молчащей мутации в нуклеотиде 5461 последовательности вируса YF (T на С; аланин, аминокислота 1820). Этот сайт был включен в плазмиду YFM5.2 с помощью лигирования подходящих рестрикционных фрагментов и введен в YFM5.2 (NarI)/JE путем обмена фрагментаNsiI/NarI, кодирующего химерную последовательность YF/JE. Для создания уникального 3'-рестрикционного сайта для лигирования in vitro, был искусственно создан сайт BspEI в 3'-направлении от сайта AatII, в норме используемого для получения полноразмерных матриц YF5'3'IV и YFM5.2 (множественные сайты AatII присутствуют в структурной последовательности вируса JE, препятствуя использованию этого сайта для лигирования in vitro.) Сайт BspEI был создан посредством молчащей мутации нуклеотида 8581 вируса YF (А на С; серин, аминокислота 2860) и был введен в вектор YFM5.2 посредством обмена подходящих рестрикционных фрагментов. Уникальный сайт был встроен в YFM5.2/JE с помощью обмена фрагмента XbaI/SphI и в плазмиды YF5'3'IV/JE(prM-Е) с помощью трехфрагментного лигирования подходящих рестрикционных фрагментов из этих родительских плазмид и из производного YFM5.2 (BspEI), убирающего последовательность вируса YF между сайтами EcoRI у нуклеотидов 1 и 6912. кДНК из клона штамма Накаяма (Nakajama), который был подробно охарактеризован в экспрессионных экспериментах и также использован в конструировании химерных флавивирусов, благодаря своей способности вызывать защитный иммунитет (см., например, McIda et al., Virology. 158:348-360, 1987; штамм Накаяма вируса JE доступен из Центров по контролю заболеваний в Форте Коллинз, штат Колорадо и Йельского Отдела Исследований Арбовирусов, в Йельском Университете, Нью-Хэвен, штат Коннектикут). кДНК вируса Накаяма была встроена в химерные плазмиды вирусов YF/JE с использованием доступных сайтов рестрикции (HindIII в PvuII и BmpI в MunI) для замены всего участка prM-Е в двухплазмидной системе, за исключением единственной аминокислоты, серина, в положении 49, которая была оставлена неизменной для того, чтобы использовать сайт NheI для лигирования in vitro. Методы для получения полноразмерных матриц кДНК представляют собой в основном такие, как описаны Rice et al. (The New Biologist. 1:285-96, 1989). В случае химерных матриц плазмиды YF5'3'IV/JE(prM-Е) и YFM5.2/JE расщепляли по сайтам NheI/BspEI и проводили лигирования in vitro, используя 300 нг очищенных фрагментов в присутствии ДНК лигазы фага Т 4. Продукты лигирования линеаризовали с помощью XhoI для снятия РНК-полимеразы с матрицы. Транскрипты с промотора SP6 синтезировали, используя 50 мг очищенной матрицы, их количество определяли по включению 3H-UTP и целостность РНК подтверждали электрофорезом в неденатурирующем агарозном геле. При использовании этого метода выход продукта варьировал от 5 до 10 нг РНК на реакцию, основная масса которой представляла собой полноразмерный транскрипт. Трансфекцию РНК-транскриптов в присутствии катионных липосом проводили, как описано Rice et al. (см. выше) для вируса YF 17D, чтобы получить химерные вирусы. В случае химерных флавивирусов, включающих последовательности вируса Западного Нила и вируса желтой лихорадки, также может быть использована двухплазмидная система, описанная здесь. В одном примере гены белков prM и Е вируса Западного Нила (WN) были клонированы из изолята 383-99 вируса Западного Нила из фламинго, номер доступа 7AF196835 в базе данных GenBank. кДНК вирусного белка prM была получена с помощью метода RT-PCR (ОТ-ПЦР) (с использованием набора XL-PCR, от компании Perkin Elmer). 5'-конец гена белка prM вируса WN был клонирован точно в 3'-конец гена белка капсида вируса YF 17D с помощью перекрывающей-удлиняющей ПЦР с использованием полимеразыPwo (компании Roche); 3'-конец гена белка Е был также клонирован точно в 5'-конец кодирующей последовательности YF N-S1 с помощью перекрывающей-удлиняющей ПЦР. Для создания уникальных сайтов рестрикции Bsp EI и Eag I в последовательность prM и Е были введены молчащие мутации. Расщепление двух плазмид этими ферментами давало фрагменты ДНК, которые очищали через гель и лигировали in vitro для получения полноразмерной химерной кДНК. кДНК линеаризовали эндонуклеазой рестрикции XhoI, чтобы облегчить транскрипцию in vitro с помощью полимеразы SP6 (компанииEpicentre). РНК продукт вводили в эукариотические клеточные линии, пермиссивные для трансляции вирусной РНК и репликации вируса. Как и с химерой вирусов YF/JE, описанной выше, мутации изобретения могут быть введены в химеры вирусов YF/WN, как описано здесь, с использованием стандартных методов. Другие химеры флавивирусов могут быть сконструированы с помощью похожей стратегии, используя естественные или введенные сайты рестрикции и, например, олигонуклеотидные праймеры, как показано в табл. 14. Изобретение основано частично на экспериментальных данных, описанных в следующих примерах.- 12015907 Примеры Пример 1. ChimeriVax-WN. Экспериментальные результаты. Предпосылки и краткое изложение. Химерный вирус желтой лихорадки-Западного Нила (YF-WN) ChimeriVax-WN был получен посредством встраивания генов предшественника мембранного белка (prM) и белка оболочки (Е) вирусаWN (штамм NY99) в каркас вируса YF 17D. Вирус был получен в клетках Vero в бессывороточной среде(на 5 пассаже, Р 5), установлена его безопасность, иммуногенность и эффективность в доклинических моделях и вирус был испытан в фазе I клинических испытаний на людях. Дополнительное аттенуирование вакцинного вируса (Р 5) обусловлено тремя мутациями, специфичными для SA-14-14-2 в белке Е (остатки 107, 316 и 440). Вакцинный вирус был менее нейровирулентным, чем YF-VAX, при тестировании на мышах и мартышках, привитых интрацеребрально, и защищенных мышах, хомяках и мартышках после однократной прививки (Arroyo et al., J. Virol. 78:12497-12507, 2004; Tesh et al., Emer. Infect. Dis. 8:1392-1397, 2002). Вакцинный вирус содержал смешанную популяцию вирусов (проявляющих фенотипы маленьких (S) и больших (L) бляшек), которые различались единственным аминокислотным остатком в М-белке в положении 66 (М 66). Эта мутация не влияла на нейровирулентность вируса у 8-дневных мышей-сосунков (Arroyo et al., J. Virol. 78:12497-12507, 2004). В настоящем изобретении авторы описывают открытие того, что мутация М 66 уменьшает виремию в хозяине и поэтому может быть использована для улучшения безопасности существующей вакцины (ChimeriVax-WN02, Р 5, смешанная популяция родительских и мутантных вирусов) или варианта вируса с фенотипом больших бляшек (немутантного). Нуклеотидная гетерогенность (50%) Т и С (СТА/ССА) наблюдалась в консенсусной последовательности вакцинного вируса ChimeriVax-Западного Нила на Р 5, полученного из клеток Vero на бессывороточной среде. Эта мутация привела бы к присутствию вирусов, содержащих или аминокислоту пролин (мутантные), или лейцин (родительские дикого типа) в мембранном (М) белке в положении 66(здесь обозначено как мутация М 66). Последовательности ChimeriVax-WN02 и вариантаChimeriVax-WN02 М 66 предоставлены в прилагаемых последовательностях в приложении, которое также включает выравнивание аминокислотных последовательностей этих белков. Белок М вируса Западного Нила содержит 75 аминокислот. Была предсказана его структура и проведено ее сравнение со структурами белков М вирусов японского энцефалита штамм SA14 (ААА 67174),Кунджин (ААР 78942), энцефалита долины Мюррей (САА 27184), энцефалита Сент-Луиса штаммMSI (AAP44973), и штамм CORAN (AAP44972) посредством подачи последовательности на веб-сайт http://www.predictprotein.org. Во всех предсказанных структурах первые 40 аминокислот белка М (SLTVQTHGESTLANKKGAWMDSTKATRYLVKTESWILRN) по предсказанию не являются мембранным участком,а оставшиеся 35 аминокислот(PGYALVAAVIGWMLGSNTMQRVVFVVLLLLVAPAYS) по предсказанию находятся внутри вирусного мембранного участка. В дополнение, белок содержит 9-10 заряженных аминокислот (3-4 кислых, Е илиD) и 6 основных (R или K) в составе первых 40 аминокислотных остатков, в то время как в положении 60 присутствует только одна заряженная аминокислота (основная) во всех 5 флавивирусах (вирусе Западного Нила, энцефалита Сент-Луиса, энцефалита долины Мюррей, японского энцефалита и Кунджин), описанных здесь. Поэтому, может быть, остаток M-60 играет жизненно важную роль в биологии вируса через взаимодействие с окружающими его аминокислотами. Морфология бляшек вакцинного вируса на пятом пассаже (Р 5) выявила смешанную популяцию двух фенотипов - с маленькими и большими бляшками. Секвенирование вирусов на стадиях перепассирования Р 2, Р 3, Р 4 и Р 5 выявило, что мутант впервые появляется на стадии Р 4 (10% от всей популяции) и достигает 50% на пятом пассаже. Секвенирование изолятов из маленьких и больших бляшек показало,что мутация ответственна за смену размеров бляшек с большого на маленький. Оба варианта (с маленькими и большими бляшками) существенно не отличались по своей нейровирулентности у 8-дневных мышей-сосунков (р=0,0001). Предэталонные посевные (PMS, P10) стоки вирусов L и S были получены в клетках Vero из вирусовChimeriVax-WN02 (P5) в "чистых лабораторных условиях" посредством 3-кратной очистки из бляшки в бляшку и 2-кратной амплификации вируса. Секвенирование вирусов Р 10 S и L выявило единичную аминокислотную разницу в положении М 66 (S вирус содержал пролин в положении М 66, a L вирус содержал лейцин в этом положении). Мутация М 66, похоже, была стабильной в условиях крупномасштабного производства вируса. Когда вирус с маленькими бляшками (Р 10, PMS) вводили подкожно хомячкам, он вызывал очень низкий уровень виремии по сравнению с вакцинным вирусом (Р 5) или вариантом вируса с крупными бляшками (Р 10, PMS). В сыворотке мартышек и людей, привитых вирусомChimeriVax-WN P5 (содержащим 50:50 S и L варианты бляшек), большинство вирусов обладало L фенотипом бляшек. В дополнение, было показано, что маленькие бляшки дают меньший титр, чем большие бляшки при выращивании в клеточных линиях гепатомы человека. Эти данные указывают на то, что вирус с маленькими бляшками (ChimeriVax-WN02 с мутацией М 66) может вызывать более низкий уровень виремии у человека, чем ChimeriVax-WN02 (без мутации М 66), и поэтому мог бы представлять- 13015907 собой подходящую (безопасную) вакцину-кандидат против WN для лиц в "группе риска", таких как пожилые люди, дети или ВИЧ-инфицированные. Дополнительные мутации в М области были найдены с помощью секвенирования изолятов из индивидуальных бляшек после крупномасштабных производственных пассажей PMS с маленькими бляшками из пассажей Р 10 до Р 12 (например, М 62, М 63 и М 64) или мартышек, привитых вакциной ChimeriVax-WN02 (например, M-60, М 61 и М 63). Эти мутации также могут быть использованы при конструировании вирусов изобретения. Получение PMS вирусов с S и L бляшками в клетках Vero. Материал вакцины ChimeriVax-WN02 (P5) выращивали в клетках Vero, адаптированных к бессывороточной среде; были выбраны 10 бляшек, идентифицированных как "маленькие" (S), и 10 бляшек,идентифицированных как "большие" (L). Затем каждый изолят пассировали в клетках Vero, адаптированных к бессывороточной среде, и одна бляшка была выбрана из каждого изолята. Процедура была проведена еще один раз, в сумме дав 3 повтора очистки бляшек. Очищенные изоляты бляшек (Р 8) амплифицировали в колбах Т 25 см 2, содержащих клетки Vero, адаптированные к бессывороточной среде (и выращенных на бессывороточной среде (SF, и затем собирали и хранили при -80 С. Изоляты затем секвенировали, чтобы найти кандидата для PMS, свободного от побочных мутаций. Были найдены два изолята, свободные от проявляющихся (не молчащих) мутаций: один изолят был подтвержден как имеющий маленькие бляшки (М 66 пролин) (табл. 1), и другой содержал последовательность дикого типа (М 66 лейцин) (табл. 2). Эти два изолята затем выращивали в больших колбах, брали аликвоты и отдавали на проверку качества как PMS (P10) вирусы с фенотипами больших (LP) и маленьких (SP) бляшек. Генетическая стабильность SP вирусов, полученных в больших масштабах. С целью определить, является ли фенотип маленьких бляшек стабильным при процессе крупномасштабного производства, PMS вирус с маленькими бляшками пассировали дважды в биореакторе посредством инфицирования клеток Vero и выращивания в условиях бессывороточной среды для получения вируса Р 12. Вирус Р 12 собирали и заражали клетки в 6-луночных плашках. Большинство бляшек были маленького размера. 20 наибольших доступных бляшек были выбраны, амплифицированы на клетках О-Vero (один пассаж) и участок prME транскрибировали/амплифицировали с помощью набора TitanOne-Tube RT-PCR (компании Roche). кДНК фрагменты, содержащие М участок, секвенировали и подтверждали морфологию изолятов посредством иммуно-окрашивания с использованием моноклональных антител, специфичных к вирусу Западного Нила. 13 из 20 бляшек содержали только М 66 (генетический маркер, ответственный за SP морфологию), и 5 изолятов содержали другие мутации в дополнение к М 66. Изолят 4 содержал М 63 (фенотип LP), и изолят 16 содержал смешанную популяцию дикого типа и М 66. Эти данные показали, что, несмотря на то, что некоторые бляшки казались большого размера, они содержали М 66 мутацию и после амплификации оказались маленького размера. Только одна бляшка( 4) из 20 оказалась большого размера, по-видимому из-за мутации в положении М 63 из L в Р. Бляшка 16, по-видимому, продуцирует смешанную популяцию вирусов с большими и маленькими размерами бляшек, содержащих аминокислоты в положении М 66 как дикого типа (L), так и мутантную (Р) (табл. 3). Рост вариантов вирусов ChimeriVax-WN в клетках печени. Клеточные линии гепатомы человека HepG2 и THLE-3 инфицировали вирусами ChimeriVaxWN01 (белок prME дикого типа), ChimeriVax-WN02 Р 5 (содержит мутации Е 107, Е 313, Е 316, Е 440,М 66 смешанные аминокислоты L/P, смешанные S и L бляшки), ChimeriVax-WN LP (Е 107, Е 313, Е 316 и Е 440, WNL (вирус Западного Нила, большие бляшки и ChimeriVax-WN SP (фенотип маленьких бляшек) (Е 107, Е 313, Е 316, Е 440 и М 66 Р, WNS (вирус Западного Нила, маленькие бляшки при множественности инфицирования 0,005. Супернатанты собирали ежедневно и титровали с использованием стандартного метода двойной заливки агарозы с нейтральным красным. В клетках HepG2 (фиг. 3) наиболее быстрый рост (7106 БОЕ/мл) наблюдался на 5-й день у вирусаWN01 (белок prME дикого типа), за ним следовал он же с фенотипом больших бляшек LP(2,7106 БОЕ/мл) на 5-й день. Рост вируса вакцины YF-VAX достигал пика на 3-й день(1,17106 БОЕ/мл), за ним следовал смешанный вакцинный вирус WN02 (6,4105 БОЕ/мл) на 4-й день. Самый низкий рост был у вируса с фенотипом маленьких бляшек SP (пик титра на 4-й день был 6,1105 БОЕ/мл), который содержал единственную аминокислотную замену (L на Р) в положении М 66. В клетках THLE-3 (фиг. 4) наблюдалась такая же картина, как и в клетках HepG2, за исключением того, что титр YF-VAX был слегка выше, чем у вируса LP. Наиболее высокий титр снова наблюдался у вирусаWN01 (1,3105 БОЕ/мл, день 4), за ним следовали он же с фенотипом больших бляшек LP(5,7104 БОЕ/мл, день 7), YF-VAX (8,8104 БОЕ/мл, день 4) и смешанный Р 5 вирус (1,8104 БОЕ/мл,день 4). Самый низкий титр опять наблюдался у SP вируса (9,2103 БОЕ/мл, день 4). Индукцию цитопатических эффектов (СРЕ) отмечали ежедневно для каждого вируса (табл. 4). СРЕ для вирусов WN01 и LP впервые был замечен на 5-й день и завершился (100%) 2 дня спустя, в то время как вирусы SP или со смешанной популяцией бляшек индуцировали СРЕ в более ранней временной точке (день 3) и полностью разрушили клеточный монослой на один день раньше (день 6), чем WN01 илиLP. Индукция СРЕ для YF-VAX впервые наблюдалась на 3-й день и монослой был полностью разрушен на 6-й день после инокуляции вируса. Индукция СРЕ в клетках HepG2 может быть обусловлена- 14015907 апоптотической активностью белка М, что было показано для вирусов денге дикого типа (Catteau et al., J.Gen. Virol. 84:2781-2793, 2003). Эти данные показали, что вариант вируса с маленькими бляшками растет с более низким титром, чем варианты смешанного типа или с большими бляшками, указывая на то, что мутация М 66 может делать вирус менее гепатотропным для человека. Отсутствие детекции вирусов ChimeriVax-WN, SP после прививки мартышек смешанным (SP и LP вирусы) Р 5 вакцинным вирусом. Всего 8 интактных яванских макаков, у которых отсутствовали антитела на флавивирусы, такие как вирусы WN, JE и YF (как было определено посредством теста уменьшения бляшек нейтрализующим антителом (PRNT, были привиты подкожно или ChimeriVax-WN02 (P5) (n=4) или YF-VAX (n=4). Целью этого исследования была оценка виремии, биораспространения и возможной токсичности вакцины ChimeriVax-WN02 в течение 3-дневного периода наблюдений. Доза прививки была 1,25105 БОЕ/0,5 мл и 5,5104 БОЕ/мл для ChimeriVax-WN02 и YF-VAX соответственно. Забор крови у животных осуществлялся ежедневно, умерщвляли животных на 4-й день. Кровь использовали для определения уровня виремии с использованием стандартного метода бляшек на клетках Vero, в то время как собранные ткани были или мгновенно заморожены для анализа вирусов, или сохранены для гистопатологической оценки. Виремию оценивали на сыворотке мартышек, собранной начиная с 1-го дня (перед прививкой) до 4-го дня (перед умерщвлением). Метод проводили или с использованием двойного наслоения агарозы и окраски нейтральным красным (для выделения и секвенирования индивидуальных бляшек), или наслоением метилцеллюлозы и окраской кристаллическим фиолетовым (для измерения уровня виремии), как описано (Monath et al., J. Virol. 74(4): 1742-1751, 2000). Интенсивность и длительность виремии у мартышек, привитых ChimeriVax-WN02, была выше, чем у тех, что были привиты YF-VAX (табл. 5). Наиболее высокий титр виремии для YF-VAX был 200 БОЕ/мл (животное MF21157, 4-й день). Наиболее высокий титр виремии для вируса ChimeriVax-WN P5 был 1000 БОЕ/мл (животное MF21191F, 4-й день). У всех животных (4/4), привитых ChimeriVax-WN02, наблюдалась виремия в течение 3 дней после прививки, тогда как виремия наблюдалась только у 2/4 животных, привитых YF-VAX (в течение только 2 дней) (табл. 5). Поскольку животные, привитые вирусом ChimeriVax-WN02, получали смесь SP и LP вирусов,было необходимо выделить различные SP и LP вирусы из сыворотки, чтобы определить вирусный вариант (маленьких бляшек или больших), ответственный за высокий уровень виремии. Сыворотку всех четырех мартышек, полученную со 2- до 4-го дня после прививки, разбавили 1:2 и 1:10 и использовали для инокуляции в дупликатах лунок 6-луночных плашек с посеянными клетками Vero. После наслоения второго слоя агарозы с нейтральным красным выбрали отдельные бляшки (4 маленьких и 3 больших) и непосредственно секвенировали, чтобы идентифицировать присутствие М 66 мутантного вируса (табл. 6). Ни одна из выделенных бляшек не содержала мутацию М 66 (замену лейцина на пролин), указывая на то,что М 66 мутантный вирус не ответственен за высокий уровень виремии, который был обнаружен в этих животных. Интересно, 3 другие мутации были обнаружены в М области (M-60, М 61 и М 63). Возможно,что или эти вирусные варианты существовали в низких количествах в вакцинном вирусе ChimeriVaxWN02 (которые не могли быть обнаружены консенсусным секвенированием) или они были генерированы in vivo (в мартышках) посредством мутаций в геноме вирусного варианта LP. Виремия и ответы на нейтрализующие антитела в хомячках, привитых вирусами ChimeriVax-WNSP (PMS, P10), LP (PMS, P10) или смешанными (Р 5, SP и LP). В ходе исследований животные, использованные в этом исследовании, содержались в микросепараторах с соблюдением норм второго уровня биобезопасности, и обращение с животными проводилось по правилам обращения с лабораторными животными, одобренными комитетом по использованию и уходу за лабораторными животными (IACUC). Три вируса ChimeriVax-WN02 (SP, PMS, P10; LP, PMS, Р 10 и смесь SP и LP вакцинных вирусов, Р 5) использовали для инфицирования 7-недельных самок золотистого сирийского хомячка (Mesocricetus auratus) из Harlan Sprague-Dawley. Каждый вирус вводили инъекцией группе из 15 хомячков подкожно в паховую область. Инфекционная доза была 105 БОЕ, и объем инокулята составлял 100 мкл. В качестве инъекционного контроля дополнительной группе из 5 животных аналогичным образом была сделана инъекция 100 мкл раствора для вируса. У всех животных, за исключением контрольной группы, забирали образцы крови из ретроорбитального синуса, начиная с дня инфекции вирусом (день 0) и каждый следующий день до 5-го дня после инфекции. Животных анестезировали парами изофлуорана перед забором крови и прививкой. Вирусные концентрации в тестируемых образцах определяли посредством прямой инфекции в лунках 0,1 мл разведенной 1:10 образца сыворотки в дупликатах культуры клеток Vero, выращенных в 12-луночных плашках (фиг. 5). Как показано на фиг. 5, более высокий титр (3-значные значения БОЕ в среднем) пиковой виремии наблюдался в образцах сыворотки, собранных от хомячков, инфицированных LP вирусом, в то время как очень низкий уровень (БОЕ 10) виремии наблюдался в образцах крови хомячков, привитых SP вирусом. Когда пропорция SP вируса была увеличена (до 50%, как для вируса со смешанным фенотипом бляшек) в прививочном материале, титр пиковой виремии понизился до приблизительно половины от уровня,- 15015907 индуцируемого LP вирусом. Дополнительно, время пика виремии было отложено по крайней мере от 1 до 4 дней после инфекции. Эти данные продемонстрировали, что варианты с большими и маленькими бляшками, выделенные из одного и того же родительского вируса ChimeriVax-WN02, имеют различные биологические свойства. LP вирус реплицируется до более высокого уровня титра с большей скоростью по сравнению с SP вирусом в хомячках. В дополнение, смешивание вируса SP с LP (вирус Р 5), по-видимому, препятствует некоторым свойствам вируса LP. Это было показано в экспериментах по инфицированию хомячков, в которых присутствие вируса в крови было снижено до более низкого уровня и кинетика репликации вируса была замедлена у хомячков, инфицированных смешанным вирусом. В сумме, мутация в положении М 66 (L на Р), присутствующая в SP варианте вируса, существенно уменьшает его виремию у хомячков. Пример 2. ChimeriVax-JE и ChimeriVax-DEN1-4 вирусы. Предпосылки и краткое изложение. В исследовании, описанном ниже, авторы получили и охарактеризовали новый ChimeriVax-JE вирусный посевной материал, используя клетки Vero, выращенные на бессывороточной (SF) среде, с целью устранить любые сомнения по поводу возможного загрязнения вакцины прионными агентами передающейся бычьей энцефалопатии. В ходе размножения в бессывороточной среде неклонированный вирус накапливает мутации, не наблюдаемые прежде в культуре, содержащей сыворотку, которые, повидимому, являются адаптацией к росту в бессывороточных условиях, повышающей скорость репликации вируса. Эти мутации случаются в Е или М белках (мутации Е-107 с заменой F на L или М-60 с R на С) и предполагают функциональную важность М белка в процессе вирусной репликации, которая становится заметной при росте вируса в бессывороточных условиях (см. аминокислоту R в положении 60 белка М, показанную в примере 1 (ChimeriVax-WN). Были определены эффекты мутаций в М (M-60, М 5 вChimeriVax-JE) или Е белках (Е-107 в ChimeriVax-JE, E202/204 в ChimeriVax-DEN1 и -DEN3 и Е 251 в ChimeriVax-DEN2) на биологические свойства вакцины. Все эти химерные вирусы уже протестированы в клинических испытаниях. Материалы и методы. Клетки и среды. Клетки Vero исходно получены из Американской Коллекции Культур (АТСС; Manassas, VA; CCL 81; клетки почки африканской зеленой мартышки). Эти клетки были адаптированы к росту на бессывороточной среде и получены от компании Baxter в городе Орт в Австрии (Orth, Austria) на 133 пассаже и затем были использованы непосредственно для посева в матрасы или посеяны, начиная из культуры банка клеток на пассаже 136. Во всех экспериментах уровень пассажей клеток Vero не превышал пассаж 149. Клетки и вирусы растили при 36 С в 7,5% CO2. Клетки размножали в бессывороточных условиях. Варианты ChimeriVax-JE. Вирус инициировали (пассаж Р 1) посредством электропорации клеток Vero, адаптированных к бессывороточной среде, с теми же in vitro РНК-транскриптами (хранящимися при -80 С), что использовались ранее для получения на небессывороточной среде вакцины-кандидата ChimeriVax-JE, прошедшей доклинические и клинические испытания (Monath et al., Vaccine. 20:1004-1018, 2002), и получали, как описано ранее (Chambers et al., J. Virol. 73:3095-3101, 1999). Амплификационные пассажи обычно проводили при множественности инфекции 0,001 БОЕ/клетку и размноженные вирусы собирали на 3-4 день после инфицирования (когда СРЕ был 10%), осветляли низкоскоростным центрифугированием, добавляли сорбит до 10% и хранили при -80 С. Клонированные варианты получали в клетках Vero компанииBaxter посредством трех последовательных очисток вируса из бляшек, используя стандартный метод наслоения агара с нейтральным красным в присутствии гамма-облученной FBS (компании HyClone; FBS использовали, поскольку клетки не образовывали бляшки под агаром, приготовленным на бессывороточной среде) с последующей амплификацией в бессывороточных условиях. Метод бляшек для определения вирусных титров в указанных образцах проводили, используя однократное наслоение метилцеллюлозы с визуализацией бляшек с помощью кристаллического фиолетового на 5 день после инфекции. Вирусы ChimeriVax-DEN. Вакцинные вирусы ChimeriVax-DEN1-4 получали посредством электропорации клеток Vero РНКтранскриптами, полученными из вирусной кДНК. Размноженный вирус подвергали трем раундам очистки бляшек для получения предэталонных посевных вирусов (PMS) на пассаже 7 (Р 7). Три дальнейших пассажа проводили, используя текущие "Правила организации производства и контроля качества лекарственных средств" США (cGMP) для получения партии вакцины (вирусы Р 10). Некоторые мутации появились в Е генах химер после множественных пассажей в клетках Vero (Guirakhoo et al., J. Virol. 78:47614775, 2004). Одна из этих мутаций (Е 204 в ChimeriVax-DEN1) существенно уменьшала висцеротропизм вируса в приматах, не являющихся человеком (Guirakhoo et al., J. Virol. 78:9998-10008, 2004). Консенсусное секвенирование. Консенсусное секвенирование проводили, как было описано ранее (Pugachev et al., Vaccine. 20:996999, 2003). Кратко, РНК вирионов, экстрагированную реагентом TRIZOL LS (компании LifeTechnologies-Gibco BRL), амплифицировали в пяти перекрывающихся ДНК ампликонах длиной- 16015907 2-3 т.п.о. с использованием набора Titan One-Tube RT-PCR (компании Roche). Ампликоны секвенировали, используя набор олигонуклеотидных праймеров, специфичных к вирусам JE и YF, как в положительной, так и в отрицательной ориентациях и набор для секвенирования CEQ Dye Terminator CycleSequencing (компании Beckman). Продукты реакции секвенирования разделяли на автоматическом секвенаторе CEQ2000XL (компании Beckman Coulter). Данные выравнивались и анализировались с помощью программного обеспечения Sequencher 4.1.4 (компании GeneCodes). Гетерогенность нуклеотидов регистрировалась, когда наблюдался гетерогенный сигнал в хроматограммах, представляющих реакции секвенирования обеих плюс- и минус-цепей. Для некоторых вирусов секвенировали только первый из пяти кДНК ампликонов (фрагмент I), который включал структурные гены. Нейровирулентность в мышах-сосунках. Уход и содержание мышей проводились в соответствии с руководством Национального Института Здоровья по гуманному обращению с лабораторными животными. Беременных аутбредных самок мышей IRC покупали у компании Taconic Farms (Germantown, NY). Новорожденные мыши были отобраны и смешаны в новые группы за 6 дней до прививки. Группы 8-дневных мышей-сосунков прививали образцами по 0,02 мл указанного вируса интрацеребрально (IC). Последовательные разведения 1:10 вирусов, используемые для прививки, были сделаны в минимальной среде Игла, содержащей 10% бычью эмбриональную сыворотку (МЕМ-10% FBS). Неразведенный прививочный материал был обратно титрован и были посчитаны точные дозы каждого разведения. Смертность регистрировали на протяжении 21 дня. Контрольным вирусом YF 17D являлся YF-VAX (компании Aventis Pasteur, Swiftwater, PA), восстановленный из продажного флакона вакцины. Испытания на безопасность и эффективность на обезьянах. Эксперимент 1. Профиль нейровирулентности/токсичности стоков эталонного вирусного банка (MVB; P11) и производственного вирусного банка нового клона С (M-60) вакцины ChimeriVax-JE по сравнению с контролем YF-VAX (вакцинный вирус YF 17D) был исследован согласно стандарту GLP ("Правила организации лаборатории") на яванских макаках. 33 экспериментально-интактных, флавивируссероотрицательных яванских макаков (как определено тестом HAI) были включены в группы воздействия, как показано в табл. 9. Все мартышки получили дозу вируса посредством интрацеребральной инъекции в 1 день, наблюдались 30 дней и затем были умерщвлены и проведено вскрытие. Обезьян оценивали по клиническим признакам (дважды в день) и изменениям в потреблении пищи (ежедневно), весу тела(еженедельно) и клиническим патологическим показателям. Клинические баллы выставлялись в соответствии с клинической оценкой баллов, основанной на требованиях Всемирной Организации Здравоохранения (ВОЗ (WHO для вакцины против желтой лихорадки (WHO, Technical Report Series, No. 872,1998). Образцы крови забирали перед прививкой в 1-й день и затем на 3, 5, 7, 15 и 31 день для клинического патологического анализа (биохимия крови и гематологические параметры). Дополнительные образцы крови были забраны в 1 день (до дозы) и на 2-11 дни для количественного определения виремии и на 1 день (до дозы) и 31 день для анализа титра нейтрализующих антител. Полное вскрытие проводили на. 31 день и ткани собирали для хранения. Ткани подготавливали для гистопатологического анализа печени, селезенки, сердца, почек и надпочечников. Гистопатология мозга и спинного мозга проводилась в соответствии с методикой, описанной Levenbook et al. (J. Biol. Stand. 15:305, 1987) и включенной в требования ВОЗ для вакцины против желтой лихорадки (ВОЗ, 1998). Эксперимент 2. Этот эксперимент был проведен для сравнения виремии, иммунного ответа и безопасности вакциныChimeriVax-JE [оригинальной неклонированной вакцины Р 5, полученной ранее в клетках LS5 Vero в присутствии FBS (BB-IND 9167, Serial 000), не содержащей мутаций, за исключением замены L на F в положении Е 491 в гидрофобном хвосте белка Е] и очищенного основного препарата (Р 13) нового клона С (мутанта M-60) вакцины ChimeriVax-JE в течение 30-дневного периода после однократного подкожного введения яванским макакам по стандартам GLP. 18 экспериментально-интактных, флавивируссероотрицательных (по тесту HAI) яванских макаков были включены в группы воздействия, как показано в табл. 10. Все мартышки получили однократную дозу вакцины в день 1 подкожно в одно место на передней конечности. Обезьян оценивали по клиническим признакам токсичности (дважды в день), изменению веса тела (еженедельно) и биохимии крови, гематологическим и коагуляционным параметрам. Образцы крови собирали в 1-й день (до прививки) и на 4, 7, 15 и 31 день для анализа биохимических,гематологических и коагуляционных параметров крови. Дополнительные образцы крови забирали на 1 день (до прививки) и 2-11 дни для количественного анализа виремии и в 1 день (до прививки) и 31 день для анализа титра антител против вируса японского энцефалита.- 17015907 Пороговое значение рН инактивации вируса (непрямой метод измерения слияния). Одним из последствий воздействия кислых значений рН на флавивирусы (в отсутствие клеточных мембран) является индукция необратимых конформационных изменений в белке Е и инактивация вируса(потеря активности). В присутствии клеточных мембран эти конформационные изменения необходимы для слияния вирусной мембраны с клеточными мембранами, приводящего к выходу вирусного генома в клетку-хозяина. Пороговое значение рН для слияния вирусов, передаваемых комарами, таких как вирусы Западного Нила, денге, желтой лихорадки и японского энцефалита, может быть измерено с помощью метода слияния изнутри (FFWI), с использованием комариной клеточной линии С 6/36 (Guirakhoo et al.,Virology. 169(1):90-99, 1989). Однако авторы были не в состоянии продемонстрировать какой-либо эффект FFWI для всех вирусов ChimeriVax, возможно, из-за отсутствия достаточного роста этих вирусов в комарах и комариных клеточных линиях (Johnson et al., Am. J. Trop. Med. Hyg. 70(1):89-97, 2004). Поэтому авторы попытались измерить потерю вирусной активности после воздействия различных значений рН методом, обозначенным здесь как "непрямой метод измерения слияния". Этот метод определяет непрямым образом пороговое значение рН, при котором происходит слияние вирусных мембран с клеточными мембранами. Слияние проводили при значениях рН, равных 7,0, 6,8, 6,6, 6,4, 6,2, 6,0, 5,8, 5,6, 5,4 и 5,0, используя 1X среду MEM с добавленными 2 мМ L-глутамином, 2,7% бикарбонатом натрия, 10% HI (инактивированной) FBS и 1% раствором антибиотика/фунгицида [(100 МЕ/мл пенициллина, 0,1 мг/мл стрептомицина, 0,25 мкг/мл амфотерицина (компании Sigma)], доведенную до нужного значения рН с помощью MES(компании Sigma). Разводили аликвоту каждого вируса в концентрации 1104 БОЕ/мл (10-1 разведение) в среде с каждым значением рН. После 10 мин воздействия при каждом значении рН в каждую пробирку добавляли 50% HI (инактивированной нагревом) FBS и рН каждого раствора нейтрализовали бикарбонатом натрия. Объем 100 мкл каждого вируса при каждом значении рН использовали для инфицирования монослоев клеток Vero (посеянных с плотностью 9105 клеток/на лунку в 6-луночные плашки) для определения титра. Инфекцию проводили в дупликатах, чтобы получить 50 БОЕ/мл; в каждой плашке оставляли две неинфицированные лунки клеток, которые служили как отрицательный контроль. Образцы при значениях рН 7,0 и 6,8 были взяты в качестве референсных значений. Титры анализировали с помощью стандартного метода бляшек. В этом методе клетки Vero инфицировали последовательными разведениями вирусов (от 10-1 до 10-6) в параллельных лунках. После инфекции на монослои клеток Vero наслаивали 1X среду MEM (компании Sigma) с добавленными 2 мМ L-глутамином, 2,7% бикарбонатом натрия,5% HI FBS и 1% раствором антибиотика/фунгицида [(100 МЕ/мл пенициллина, 0,1 мг/мл стрептомицина,0,25 мкг/мл амфотерицина (компании Sigma)] и 44% 0,6% агарозы (компании Sigma). Клетки инкубировали 4 дня при 37 С, 5% CO2 и затем наслаивали второй слой, содержащий 1X среду MEM с добавленными 2 мМ L-глутамином, 2,6% бикарбонатом натрия, 2% HI FBS и 1% раствором антибиотика/фунгицида и 44% 0,6% агарозы и 3% раствора нейтрального красного (компании Sigma). Бляшки подсчитывали через 24 ч после добавления второго слоя для определения титра вируса, определяемого как бляшкообразующие единицы (БОЕ) на 1 мл. Метод измерения проникновения вируса по Vlaycheva et al. (J. Virol. 76:6172-6184, 2002). Для демонстрации, что мутация M-60 (и мутация Е-107) способствует проникновению в клетки SFVero, клетки SF Vero были инфицированы клонами А, С и I вирусов, соответствующим образом разведенными в бессывороточной среде, в течение 5, 10, 20 и 60 мин и затем обработаны в течение 3 мин раствором 0,1 М глицина, 0,1 М NaCl, рН 3,0, для инактивации внеклеточного вируса. Клетки промывали дважды PBS и затем на монослои наслаивали метилцеллюлозу с последующим окрашиванием бляшек на 5-й день кристаллическим фиолетовым. Эффективность проникновения подсчитывали как процент наблюдаемого количества бляшек после обработки глицином по сравнению с контрольными инфицированными лунками, которые обрабатывались PBS вместо глицина. Клинические испытания вакцины ChimeriVax-JE. Было проведено клиническое исследование (протокол Н-040-003). Вакцина, вводимая здоровым взрослым мужчинам и женщинам, имела нативную последовательность в положении M-60 (аргинин). Здоровые взрослые субъекты/группа получили подкожно дозу калиброванных доз вакциныChimeriVax-JE и были включены различные контрольные группы. Из группы, приходящейся на одну дозу, тестировали 11 из 33 субъектов. Виремию измеряли ежедневно с помощью метода бляшек на монослоях клеток Vero. Той же лабораторией и таким же методом определяли уровень виремии в обоих испытаниях. Оценка безопасности включала регистрирование негативных событий, температуры тела, врачебный осмотр и лабораторные тесты (включающие измерение уровня виремии). Виремия наблюдалась у большинства субъектов, получающих ChimeriVax-JE. Второе исследование (протокол Н-040-007) проводили на здоровых мужчинах и женщинах, в группах которых 31 или 32 субъектов получали ступенчатую дозу подкожно (3, 4 или 5 log10 БОЕ) вакциныChimeriVax-JE, содержащей цистеиновую мутацию в положении M-60. Ряд доз был похожим на тот,что использовался в предыдущем исследовании на субъектах, которые получили 2,8, 3,8 и 4,8 log10 БОЕ.- 18015907 Результаты. Адаптивные мутации в неклонированном вирусе SF ChimeriVax-JE и получение клонированных вариантов. Диаграмма образцов вирусов, полученных в этом исследовании, показана на фиг. 6. Начальный неклонированный образец второго пассажа (Р 2) (кандидат в предэталонный посевной материал; PMS) был получен в SF культуре путем трансфекции клеток in vitro транскриптами РНК, которые использовались для получения вакцины в среде, содержащей FBS, для предыдущих исследований (Monath et al., Vaccine. 20:1004-1018, 2002) с последующим дополнительным пассажем для амплификации. Был секвенирован полный геном этого вируса и показано, что он не содержит никаких обнаруживаемых мутаций (табл. 7)(необходимо заметить, что подход консенсусного секвенирования не обнаруживает минорные субпопуляции; лимит обнаружения мутаций равен 10%). Маломасштабные пассажи, начиная с этого вируса Р 2 до уровня Р 10, проводили в матрасиках Т 25 для анализа их генетической стабильности (g.s.) в течение длительного размножения в культуре SF (фиг. 6; пассажи g.s.). Полные геномные последовательности пассажей g.s. P5 и g.s. P10 имели одну нуклеотидную замену с С на Т в нуклеотиде 935, приводящую к замене аминокислоты R на С в остатке M-60 (табл. 7). Впервые эту мутацию детектировали как гетерогенность на пассаже g.s. P4, но не на g.s. Р 3. Несмотря на результаты маломасштабного генетического анализа, при проведении трех крупномасштабных производственных SF пассажей из неклонированного Р 2 PMS в роллерных колбах для получения возможного неклонированного эталонного посевного материала (Р 3) и производственного посевного материала (Р 4) и затем в биореакторах емкостью 100 л, для получения основного объема вакцины (Р 5) накапливалась другая мутация, замена аминокислоты F на L в остатке Е-107 из-за замены Т на С в нуклеотиде 1301, наблюдаемая как 50% гетерогенность (табл. 7). Это была неприемлемая мутация, потому что она являлась реверсией последовательности SA-14-14-2 к дикому типу последовательности JE в критическом аттенуирующем основании (Arroyo et al., J. Virol. 75:934-942, 2001) и, следовательно, могла потенциально поставить под угрозу безопасность вакцины. Исходя из соображений, упомянутых ниже, клонированных кандидатов в PMS затем генерировали путем очистки через бляшки, чтобы стабилизировать SF вакцину и предотвратить накопление нежелательных мутаций, таких как Е-107. Очистка через бляшки удаляет случайные мутации в неклонированном вирусе, введенные путем транскрипции in vitro, характеризующейся низкой точностью синтеза РНК,по сравнению с вирусным синтезом РНК YF 17D-специфичной РНК-полимеразой (Pugachev et al., J.Virol. 78:1032-1038, 2004). Начинающийся с неклонированного Р 2 PMS вируса, биологический клон на пассаже 7, клон А вируса, который не имел никаких аминокислотных замен, был получен посредством трех последовательных очисток через бляшку с последующими двумя амплификационными пассажами в бессывороточной среде и был назван немутантный Р 7 клон A PMS. Его геном содержал две молчащие нуклеотидные замены в нуклеотидах 6952 и 7147 (табл. 7). Эти замены являлись приемлемыми, потому что они не меняли аминокислотную последовательность вирусных белков и были расположены вне cisдействующих элементов РНК, необходимых для вирусной репликации. Клон С Р 10 вируса, содержащий мутацию M-60 (названный вариант М-60 Р 10 клон С PMS), был получен аналогичным образом, начиная с вируса Р 5 g.s. (фиг. 6). В дополнение к желаемой мутации М-60 он только содержал молчащую нуклеотидную замену в нуклеотиде 3616 (табл. 7). Дополнительно, со степенью чистоты для лабораторных исследований клон I и клон Е вирусов были позднее также выделены из неклонированного Р 5 вакцинного основного вируса путем однократной очистки через бляшку (выбирая большую бляшку) и одного амплификационного пассажа в клетках Vero. Клон I содержал единственную аминокислотную замену в остатке Е-107, которая являлась реверсией к дикому типу из аминокислоты F в аминокислоту L. Таким образом, клон I представляет чистую популяцию Е-107 ревертанта. Клон Е содержал единственную аминокислотную мутацию в N-конце белка М, замену аминокислот Q на Р в остатке М-5. Чтобы убедиться в генетической стабильности клонированных вариантов PMS, в бессывороточной культуре провели относительно крупномасштабные g.s. пассажи, имитирующие производственные этапыF, были проведены в биореакторе объемом 5 или 15 л, в котором выращивали клетки Vero на микроносителях шариках Cytodex I). Секвенировали только область prM-Е (фрагмент I кДНК) для SSS и SSF образцов (полученных путем трех стационарных пассажей или двух стационарных плюс один ферментерный пассажей соответственно) для обоих кандидатов и FFF образца варианта М-60. Ни один из этих g.s. образцов не имел обнаруживаемых мутаций в белках prM и Е вирусов, кроме мутации М-60 в клоне С. Не было следов мутации Е-107 (табл. 7). Это указывало на то, что приемлемый уровень генетической стабильности был достигнут благодаря очистке бляшек. Высокая генетическая стабильность варианта М-60 была впоследствии подтверждена в течение изготовления новых эталонного (Р 11) и производственного(Р 12) вирусных посевных материалов, полученных в "клеточных фабриках", и конечной основной массой вакцины (Р 13), полученной в 50-литровом биореакторе, которые все сохраняли мутацию М-60, но не имели никаких других обнаруживаемых изменений в их полных геномах с помощью консенсусного секвенирования.- 19015907 Влияние мутаций М-60 и E-107 на рост вирусов в клетках SF Vero. Для сравнения кинетики роста немутантного, мутантного М-60 и мутантного Е-107 вирусов в культуре SF клетки инфицировали при множественности инфекции 0,001 БОЕ/мл (подтвержденной обратным титрованием) неклонированным Р 2 PMS, образцом неклонированного Р 5 g.s. (М-60 мутант) или неклонированным Р 5 вакцинным вариантом основного стока (содержащим мутацию Е-107), а также вирусами неклонированного Р 3 эталонного посевного материала и Р 4 производственного посевного материала,также содержащими пропорцию мутации Е-107. Ежедневно собирали и титровали методом бляшек аликвоту среды, содержащей вирусы. Как показано на фиг. 7, вирус М-60 рос быстрее, чем немутантный Р 2 вирус, и давал существенно (более чем в 10 раз) более высокие титры на 3- и 4-й дни после инфекции. Мутация Е-107 также увеличивала репликацию вируса, аналогично мутации М-60. Таким образом, как М-60, так и Е-107 мутации ясно давали преимущество в росте в SF культуре. В поддержку этого заключения ежедневные образцы из S, SSS и SSF g.s. пассажей как немутантного клона А, так и мутантного клона С вирусов (см. фиг. 6) собирали и титровали для анализа кинетики роста с результатом, что мутант М-60 всегда продуцировал до 10 раз более высокие пиковые титры (близко к 8 log10 БОЕ/мл) в сравнении с немутантом. Дополнительно, это заключение было подтверждено сравнением кривых роста клонов А,С и I вирусов в маломасштабной SF культуре, так как клоны С (М-60) и I (Е-107) неизменно росли с более высокими титрами, чем клон А (не мутант). Влияние мутаций М-60 и Е-107 на нейровирулентность вакцины ChimeriVax-JE у мышейсосунков. Тесты на нейровирулентность на мышах применялись, чтобы убедиться, что нейровирулентность вакцинных кандидатов ChimeriVax не превышает нейровирулентность вектора YF 17D. Вакцина YF 17D является летальной для мышей всех возрастов при интрацеребральном введении. В отличие от этой вакцины, вакцины ChimeriVax являются гораздо более ослабленными. Так, взрослые мыши обычно не являются столь чувствительными для детекции незначительной разницы в нейровирулентности, например, из-за единственной аминокислотной замены, для этой цели можно использовать более чувствительную модель на мышах-сосунках, используя метод анализа времени жизни (Guirakhoo et al., Virology. 257:363-372, 1999; Guirakhoo et al., Virology. 298:146-159, 2002; Monath et al., J. Virol. 76:1932-1943,2002). Восьмидневных мышей-сосунков прививали интрацеребрально последовательными разведениями клоном А Р 7 вируса, клоном С Р 10 вируса (мутация М-60), неклонированной Р 5 основной вакциной (мутация Е-107), а также ранее полученным содержащим FBS контрольным вирусом ChimeriVax-JE (P5 референсный стандартный вирус для контроля качества; без мутаций), положительным контролем YF 17D (YF-VAX) или разбавителем вакцины как отрицательным контролем. Смертность на протяжении 21 дня, медианные значения 50% смертельной дозы при интрацеребральном введении (LD50) и среднее время жизни (AST) мышей, которые умерли, показаны в табл. 8. Как ожидалось, YF-VAX была сильно нейровирулентной. Введение 2,4 log10 БОЕ вызывало 100% смертность с коротким временем AST, равным 8,8 дням. Оба клона, Р 7 немутантный и Р 10 М-60 мутантный, были также сильно ослаблены как иFBS-содержащая версия химеры, со значениями LD50 5 log10 БОЕ и более длинным AST. Следовательно, мутация М-60 не изменяла сильно аттенуированный фенотип вакцины в этой животной модели. Неклонированный Р 5 основной вакцинный вирус был существенно более вирулентным, по сравнению с клонами, с интрацеребральной LD50, равной 3,1 log10 БОЕ, но менее вирулентной в сравнении с YFVAX. Впоследствии производственные пассажи (эталонный посевной материал, производственный посевной материал и основная масса вакцины) клонированной вакцины М-60 были проверены в этом тесте при GLP условиях с похожими результатами. Это подтверждало высокую генетическую/фенотипическую стабильность, которая достигалась очисткой через бляшки и использованием мутации М-60. Анализ безопасности и эффективности на приматах, не являющихся человеком. Эксперимент 1. В этом эксперименте нейровирулентность эталонного вирусного банка (MVB) и производственного вирусного банка (PVB) клона С (мутант М-60) вакцины ChimeriVax-JE сравнивали после интрацеребрального введения яванским макакам, используя вирус YF-VAX в качестве контрольного (табл. 9). Не наблюдалось никаких связанных с вакциной клинических признаков или изменений. в потреблении пищи, весе тела или биохимии крови и гематологических параметрах., Лимфоидная гиперплазия,состоящая из увеличенного размера и числа лимфоидных узлов в селезенке, была замечена для 9 из 11, 4 из 11 и 8 из 11 мартышек из групп 1-3 соответственно. Хотя обнаруженная гиперплазия является обычным фоновым явлением у яванских макаков, частота случаев в группе была выше, чем норма для этих мартышек и рассматривалась как вторичное явление в ожидаемом иммунном ответе, индуцированном вакцинами. Стоит отметить, что похожие изменения происходили как в группах с введенными вакцинами ChimeriVax-JE, так и в референсной контрольной группе YF-VAX. [У некоторых мартышек из этих трех групп развивалась непродолжительная постпрививочная виремия, которая находилась в приемлемых границах, и все животные сероконвертировались к вирусам, используемым для прививки. На- 20015907 31-й день титры вирус-специфичных нейтрализующих антител против желтой лихорадки для мартышек,привитых YF-VAX, варьировали от 2,07 до 6,13 по методу LNI и ни одна из мартышек, привитыхYF-VAX, не имела антител, кросс-реактивных к вирусу JE по методу анализа PRNT50. Все мартышки,привитые вакциной ChimeriVax-JE MVB, имели титры нейтрализующих антител 320 (от 320 до 20480) и не имели антител, кросс-реактивных к вирусу YF по методу LNI. Все мартышки, привитые вакциной ChimeriVax-JE PVB, имели титры нейтрализующих антител 160 (от 160 до 20480) и не имели антител, кросс-реактивных к вирусу YF. Не было никаких видимых соотношений между величиной или длительностью обнаруживаемой виремии и величиной индуцированного титраJE-нейтрализующих антител]. Препараты ChimeriVax-JE MVB и PVB показали минимальную нейровирулентность в этом тесте. Наиболее полным измерением нейровирулентности в тесте нейровирулентности на обезьянах для флавивирусных вакцин является объединенная групповая средняя оценка патологических изменений, представляющая среднюю величину от оценок средней наблюдаемой зоны и средней дискриминаторной зоны. Наблюдаемой зоной у яванских макаков являются черное вещество и увеличение спинного мозга в шейном и люмбальном отделах и представляют участки центральной нервной системы (ЦНС), которые поражаются всеми флавивирусами. Дискриминаторными зонами являются бледный шар, скорлупа, переднее и среднее таламические ядра и латеральное таламическое ядро и представляют участки ЦНС, которые поражаются исключительно штаммами YF 17D (и, предположительно, другими флавивирусами),имеющими различные вирулентные свойства и которые отличают референсный штамм и штамм, имеющий увеличенную нейровирулентность. Объединенные средние оценки патологических изменений для мартышек, привитых препаратами ChimeriVax-JE MVB и PVB, были существенно ниже, чем дляYF-VAX референсной контрольной группы (р 0,05). Средние дискриминаторные центральные оценки для двух групп мартышек, привитых препаратами ChimeriVax-JE MVB и PVB, также были существенно ниже, чем для YF-VAX референсной контрольной группы (р 0,05) (табл. 9). Не было статистически достоверной разницы между средними значениями для 2 групп мартышек, которые получали вакцинные препараты ChimeriVax-JE, и оба препарата показывали сходную низкую нейровирулентность в тесте на нейровирулентность на обезьянах. Таким образом, результаты теста на нейровирулентность на обезьянах показывают, что новые(М-60, клон С) очищенные через бляшки MVB и PVB обладают удовлетворительными показателями безопасности. Испытуемые образцы показали отсутствие клинической токсичности и обладали существенно более низкими дискриминаторными и комбинированными оценками патологических характеристик при нейропатологическом освидетельствовании, чем референсный контроль (YF-VAX). Испытуемые образцы не отличались от референсного контроля (YF-VAX) в висцеротропизме, который измерялся количественным определением виремии. Эксперимент 2. Этот эксперимент проводили, чтобы сравнить виремию, иммунный ответ и безопасность исходной неклонированной Р 5 ChimeriVax-JE вакцины [полученной ранее в клетках Vero в присутствии FBS и не имеющей мутаций, кроме Е 491 замены L на F, находящейся в гидрофобном хвосте Е белка, которая,по-видимому, является благоприятной мутацией в плане биологического фенотипа, и она уже протестирована в клинических испытаниях (Monath et al., J. Infect. Dis. 188:1213-1230, 2003; Monath et al., Vaccine. 20:1004-1018, 2002)] и очищенного основного запаса вакцины (Р 13) нового клона С (мутант М-60)ChimeriVax-JE, следующих за однократным подкожным введением яванским макакам. ChimeriVaxJE детектировали в сыворотке 5 (100%) из 5 сероотрицательных мартышек, привитых исходной неклонированной Р 5 ChimeriVax-JE вакциной. Продолжительность виремии была 2-5 дней с титрами, варьирующими от 20 до 790 БОЕ/мл. Средний пик виремии (SD) был 244 (310) БОЕ/мл и среднее число дней виремии было 3,4 (1,34) (табл. 10). Вирус ChimeriVax-JE детектировали в сыворотке 4 (100%) из 4 сероотрицательных мартышек,привитых новым основным запасом Р 13 вакцины JE. Продолжительность виремии была 2-5 дней с титрами, варьирующими от 50 до 290 БОЕ/мл. Средний пик виремии (SD) был 160 (123) БОЕ/мл и среднее число дней виремии было 3,75 (1,26) (табл. 10). Ни средняя пиковая виремия, ни число дней виремии не отличались существенно между двумя привитыми группами (р-значения 0,6290 и 0,7016 соответственно; ANOVA). Все сероотрицательные мартышки сероконвертировались после прививки исходной Р 5 неклонированной ChimeriVax-JE вакциной или основным запасом Р 13 вакцины JE (табл. 10). На 31 день сыворотка 5 (100%) из 5 мартышек, привитых неклонированной Р 5 вакциной, имела титр антител, нейтрализующих JE, варьирующий с 640 до 5120 (геометрический средний титр = 1689). Сыворотка 4 (100%) из 4 мартышек, привитых основным запасом Р 13 вакцины ChimeriVax-JE, имела титр антител, нейтрализующих JE, варьирующий с 320 до 2560 (геометрический средний титр = 761). Титры антител не отличались существенно между привитыми группами (р=0,2986; ANOVA).- 21015907 Таким образом, новую вакцину М-60 сравнили с исходной неклонированной ChimeriVax-JE вакциной (нет мутаций, кроме Е 491) в отношении безопасности (виремия) и иммуногенности. Новая вакцина была немного менее висцеротропной (желательное свойство), но все еще высокоиммуногенной. Различия в величине виремии и иммуногенности не были статистически существенными. Влияние мутаций М-5, М-60 и Е-107 на пороговое значение рН вирусной инфективности. Вакцина ChimeriVax-JE была получена встраиванием генов белков prM и Е из штамма SA-14-14-2 вируса JE в каркас вируса YF 17D. Оболочка вируса SA-14-14-2 (присутствующая в ChimeriVax-JE) отличалась от его родительского вируса SA14 10 аминокислотами: Е 107 замена L на F, E138 Е на K, Е 176(Guirakhoo et al., Virology. 257:363-372, 1999). С помощью сайт-направленного мутагенеза было показано, что некоторые из этих остатков были вовлечены в аттенуирование вируса ChimeriVax-JE. Мутанты или ревертанты ChimeriVax-JE были выбраны, чтобы определить, меняют ли мутации пороговое значение рН для этих вирусов. Чтобы определить, является ли влияние мутаций М-60, Е-107 или М-5 на вирусную инфекционность рН-зависимым, был проведен стандартный метод анализа для определения порогового значения рН, как описано в "Материалах" и "Методах". Были протестированы следующие вирусы:(4) М-5 мутант Q на Р (клон Е, Р 6, содержащий все 10 мутаций Е-белка) (табл. 12). Немутантный клон А Р 7 вируса, М-60 мутантный клон С Р 10 вируса, М-5 мутантный клон Е и неклонированный Р 5 вирус, содержащие мутацию Е-107, обрабатывали рядом уменьшающихся рН с последующим титрованием остаточной вирусной инфективности. Инфекционность трех вирусов (клон А контрольный вирус, клон С - мутант M-60, и клон I - мутант Е-107) начинала падать одинаково после рН 6,0 и пропадала при рН 5,8 (пороговое значение рН 5,9), за исключением М-5 мутантного клона Е вируса. Мутант М-5 имел существенно более высокое пороговое значение рН (рН 6,3) по сравнению с другими вирусами (рН 5,9) (фиг. 8 А). Это впервые прямо свидетельствует, что эктодомен белка М является необходимым для процесса инфицирования клеток флавивирусом. Следовательно, N-конец М-белка может функционировать в процессе слияния, запускаемым низким значением рН в эндосомах, с последующей вирусной адсорбцией и интернализацией, который является функцией, прежде предписываемой только белку Е оболочки. Пороговое значение рН 5,9 для слияния ChimeriVax-JE вирусов ниже, чем значения рН, описанные для других флавивирусов дикого типа (wt) (Guirakhoo et al., J. Gen. Virol. 72:1323-1329, 1991) и может быть вовлечено в аттенуирование вируса. Эти данные показали, что мутация Е-107 в Е области ChimeriVax-JE не изменяла пороговое значение рН для слияния. В общем, низкое пороговое значение рН означает, что требуется, чтобы произошло более сильное протонирование особых аминокислот для конформационных изменений в Е-белке, которые необходимы для перехода из димера в тример. Похоже, что одна или несколько мутаций, свойственных штамму SA-14-14-2 (кроме мутации Е-107, которая находится внутри консервативного пептида слияния), являются ответственными за сохранение низкого порогового значения рН (рН 5,9) для слияния и, следовательно, аттенуированного фенотипа вируса для хозяина. По-видимому, мутация М-5 способна увеличивать этот порог с 5,9 до 6,3, который близок к таковому у флавивирусов дикого типа (Guirakhooet al., Virology. 169(1):90-99, 1989; Guirakhoo et al., J. Gen. Virol. 72:1323-1329, 1991). Увеличение порогового значения рН для слияния теоретически уменьшает аттенуированный фенотип вируса, потому что вирусы могут сливаться с клеткой при более высоких значениях рН с меньшей протонированием, требующимся для перехода в активную фазу слияния. Это, по-видимому, является правдой, так как вирус М-5, введенный интрацеребрально 3-4-дневным мышам-сосункам в количестве 1,4 log10 БОЕ, был существенно более вирулентным, чем контрольный вирус (вакцинный вирус ChimeriVax-JE без мутации М 5), введенный в количестве 1,7 log10 БОЕ (р=0,0056) (фиг. 8 В). Несмотря на это, М 5 мутантный вирус(в дозировке 1,4 log10 БОЕ) оставался существенно менее нейровирулентным, YF-VAX (в дозировке 0,9 log10 БОЕ) для 3-4-дневных мышей-сосунков (фиг. 8 С), указывая на то, что мутации SA-14-14-2 в белке оболочки вакцинного вируса все еще обеспечивают достаточный уровень аттенуирования для этого вируса. Мутации в других химерах, которые влияют на пороговое значение рН для слияния. Непрямой метод измерения слияния проводили, используя две группы вакцинных вирусовChimeriVax-DEN: ChimeriVax-DEN1-4 Р 7, не содержащие мутации в Е-белке, и GhimeriVax-DEN14 P10, которые содержали единичные мутации в Е-белке, за исключением ChimeriVax-DEN4 P10. Вирусы инкубировали со средой с различными значениями рН в течение 10 мин при комнатной температуре. Определяли титры после возврата значения рН к нейтральному, используя стандартный метод бляшек. Как показано в табл. 13, порог для инактивации вируса (слияния) был похожим для Р 7 и Р 10ChimeriVax-DEN1 P10 был на 0,4 единицы ниже, чем для ChimeriVax-DEN1 P7 (рН 6,0 против рН 6,4). Разница в пороговых значениях рН была менее резкая для ChimeriVax-DEN3 Р 10 вируса (рН 6,4 против рН 6,2). Максимальная инактивация вируса происходила при рН 6,2 для всех Р 7 ChimeriVax-DEN вирусов, за исключением ChimeriVax-DEN4, который был немного ниже (6,0). Судя по всему,ChimeriVax-DEN1 P10 требует существенно более низкого рН для полной инактивации (рН 5,6). ОбаChimeriVax-DEN1 и -DEN3 вирусы содержат аминокислотную замену в положении Е-204 из K в R(Е-белок DEN3 на 2 аминокислоты короче, чем в 3 других серотипах, поэтому остаток Е-202 в этом вирусе является гомологичным Е-204 в DEN1). Менее резкое различие в пороговых значениях слияния для химеры DEN3 может являться следствием наличия аминокислот дикого типа (K) и мутантной (R)(E204K/R) в Р 10 вирусном стоке, что было показано с помощью консенсусного секвенирования(K:R=50:50) (Pugachev et al., J. Virol. 78:1032-1038, 2004). Так как для химеры DEN2 Р 10 не было обнаружено изменений в пороговом значение рН, несмотря на мутацию Е 251, можно заключить, что мутация в этом остатке не вовлечена в процесс вирусного слияния (фиг. 8D). С целью определить, является ли наличие K/R гетерогенности в Р 10 ChimeriVax-DEN3 ответственным за несильное изменение порогового значения рН для слияния в нем, провели непрямой метод измерения слияния, используя Р 7 (нет мутации, Е 202K), Р 10 (50% мутации, Е 202 K/R) и Р 15 (полная мутация, E202R) вирусы. Как показано на фиг. 8 Е, пороговое значение рН для инактивации (слияния) ChimeriVax-DEN3P10 было равным 6,2, находящимся между значениями рН для ChimeriVax-DEN3 Р 7 (рН 6,4) иChimeriVax-DEN3 P15 (рН 6,0) вирусов. Так как мутация K на R в положении Е 202 была единственной обнаруженной аминокислотной заменой в Е-белке для этих химер, наиболее вероятно, что эта мутация ответственна за сдвиг порогового значения рН на 0,4 единицы для слияния Р 15 вируса. Как упоминалось выше, мутация Е 204 K на R, которая произошла при культивировании клеток при производстве вакцины, понижала пороговое значение рН для слияния на 0,4 единицы рН. Мутация Е 204K на R, по-видимому, формирует новые внутримолекулярные водородные связи и новый соляной мостик, которые могут иметь существенное влияние на диссоциацию Е-димеров. Структура ChimeriVaxDEN1 (PMS, P7) Е-белка была смоделирована на основе атомных координат 394 остатков эктодомена Е-белка DEN2 (штамм S1), определенных в присутствии детергента н-октилD-глюкозида (Modis et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100:6986-6991, 2003). K остаток в положении 204 был изменен на R, чтобы воспроизвести мутантный вирус, и моделирование было повторено, чтобы представить структуру Е-белка вируса ChimeriVax-DEN1 (VL, P10) (Guirakhoo et al., J. Virol. 78:9998-10008, 2004). Остаток K в положении 204 (204K) находится внутри короткой петли в гидрофобном кармане, составленном из остатков, которые, как было показано, влияют на нейровирулентность или пороговое значение рН для слияния (Lee et al., Virology. 232:281-290, 1997; Lindenbach et al., 2001. Flaviviridae: the viruses and theirreplication. Fields Virology, eds. Knipe D.M., and Howley P.M. [Lippincott Williams and Wilkins, Philadelphia], 1, 991-1004; Monath et al., J. Virol. 76:1932-1943, 2002). На фиг. 8F модель гомологии структуры Е-гомодимера вакцинного вируса (204R) сравнивалась с моделью PMS (204K) вируса. Боковые цепочки 204K и 261 Н одного из Е-мономеров, по-видимому, образовывали водородные связи с каркасными атомами остатков 252V и 253L соответственно на противоположном мономере. Предсказано, что в положении 204, R в Е-белке вакцинного вируса (VL, P10) переориентирует самого себя таким образом, что эти водородные связи теряются. Вместо этого, боковая цепь мутантного аргинина находится вблизи от 261 Н и 257 Е, приводя к образованию новых внутримолекулярных водородных связей между 204R и 261 Н и,возможно, новому солевому мостику между 204R и 257 Е. Так как pK гистидина приблизительно равен 6,0, что немного ниже порогового значения рН для слияния (рН 6,4), начальная гипотеза авторовGuirakhoo et al., (J. Virol. 78:9998-10008, 2004) была, что предсказанные новые водородные связи между 204R и 261 Н и солевой мостик между 204R и 257 Е могут влиять на пороговое значение рН слияния. Эта теория, как выясняется, является верной, так как эксперименты, описанные здесь, показали, что порог для слияния ChimeriVax-DEN1 находится около 6,0, что на 0,4 единицы рН ниже, чем он у Р 7 вируса(рН 6,4). По-видимому, новые внутримолекулярные связи, введенные остатком R в положении 204, усиливают связывание Е-димера таким образом, что переход к низкому рН требует большего протонирования соответствующих остатков (например, Н 261). Более низкий порог слияния влияет на висцеротропизм вируса у обезьян и уменьшает нейровирулентность для мышей-сосунков, привитых интрацеребрально (Guirakhoo et al., J. Virol. 78:9998-10008, 2004). Замена K на R в положении Е 202 в Е-белке вакцины ChimeriVax-DEN3 P10 гомологична мутации Е 204 в вакцине ChimeriVax-DEN1 P10. Как и в случае ChimeriVax-DEN1 P10, вакцина ChimeriVaxDEN3 P10 (гетерогенная по остатку 202, содержащему как K, так и R остаток) показывала более низкое пороговое значение рН (0,2 единицы рН) для слияния по сравнению с Р 7. Пороговое значение рН для слияния было далее понижено (0,4 единицы, похоже на ChimeriVax-DEN1 P10), когда мутация была- 23015907 закреплена на пассаже 15 вируса ChimeriVax-DEN3. Эти данные показали, что остаток 202/204 может являться универсальной детерминантой аттенуирования во всех вирусах денге. На данный моментChimeriVax-DEN3 и DEN4 Р 10 вакцинные вирусы не содержат эту мутацию, и оба вируса вызывают более высокие уровни виремии в мартышках (Guirakhoo et al., J. Virol. 78:4761-4775, 2004),привитых составом тетравалентной вакцины. Остается выяснить, понижает ли мутация K на R вChimeriVax-DEN3 или ChimeriVax-DEN4 их висцеротропизм в их хозяевах. Ранее сообщалось, что вирус японского энцефалита дикого типа имеет пороговое значение рН для слияния, равное 6,4 (Guirakhoo et al., J. Gen. Virol. 72:1323-1329, 1991). В этом исследовании все варианты ChimeriVax-JE имели пороговое значение рН, равное 5,9. Низкое пороговое значение рН, наблюдаемое в этих экспериментах, похоже, обусловлено наличием одной или нескольких из 10 аттенуирующих мутаций в белке оболочки ChimeriVax-JE. Эта мутация могла бы усилить связывание димера Е-белка таким образом, что более низкий рН требуется для диссоциации и перехода в тримерную структуру и последующего слияния. Данные, представленные здесь, показали, что ни мутация Е 107 F на L(находящаяся в cd-петле домена II Е-белка), ни мутация Е 279 М на K (находящаяся внутри гидрофобного кармана домена II) не ответственны за понижение порога рН. Возможно, что другие мутации в Е-белке вируса японского энцефалита могут влиять на порог рН слияния. Анализ кристаллической структуры Е-белка вируса клещевого энцефалита, который близко похож на Е-белок вируса японского энцефалита, может помочь предсказать остатки, которые, если их изменить, могут поменять порог рН слияния. Основываясь на этой модели, вероятно, что мутации в остатках Е 244 G и/или Е 264 Н ответственны за более низкое пороговое значение рН слияния вируса ChimeriVax-JE, чем у вируса японского энцефалита дикого типа. Влияние мутаций М-60 и Е-107 на эффектность проникновения вируса. Эффекты мутаций М-60 (клон С вируса) и Е-107 (клон I вируса) на проникновение вируса в SF Vero клетки были исследованы с использованием метода камер (Vlaycheva et al., J. Virol. 76:6172-6184, 2002). В этом эксперименте инфицировали клетки SF Vero соответствующим образом разбавленными вирусами(до выхода 50 бляшек/лунка в каждой временной точке) в течение 5, 10, 20 или 60 мин. Неинтернализированный вирус инактивировали добавлением кислого раствора глицина, в то время как параллельные лунки обрабатывали PBS (с нейтральным рН). Клетки промывали PBS и наслаивали слой метилцеллюлозы с последующей визуализацией и подсчетом бляшек на 5-й день. Эффективность проникновения представляли как процент среднего количества бляшек в лунках, обработанных глицином, относительно числа бляшек в контрольных лунках, обработанных PBS. Предварительные результаты теста на проникновение показаны на фиг. 9 А. Важно, что процент проникнувших вирусов клона С и клона I был выше, чем для немутантного клона А вируса во временных точках 5 и 10 мин, при которых наиболее вероятно обнаружить эффекты мутаций на проникновение. Результат не является статистически достоверным, как очевидно из значений среднеквадратичных отклонений, и нуждается в подтверждении дополнительными повторными тестами. Тем не менее, эксперимент означает, что мутации как М-60, так и Е-107 могли улучшать эффективность слияния мембран вируса ChimeriVax-JE и клеток, выращенных в бессывороточной среде. Возможный механизм эффекта остатков М-60 и Е-107 на процесс слияния мембран проиллюстрирован на фиг. 9 В. Остаток М-60 расположен в вирусной мембране, в то время как остаток Е-107 встраивается в клеточную мембрану, и две мембраны вынуждены сливаться, следуя за зависящей от низкого рН перестройкой Е-белка (которой, по данным авторов, может способствовать эктодомен М-белка). Более соответствующая аминокислота в любом из этих двух остатков может способствовать слиянию мембран. Поскольку данные авторов впервые показали, что и эктодомен М-белка, и его трасмембранный домен имеют функциональное значение, весь М-белок может теперь считаться привлекательной мишенью мутагенеза для ослабления флавивирусов с целью разработки новых живых аттенуированных вакцин. Например, случайные или определенные (следующие за дальнейшим анализом белковой структуры) аминокислотные замены или делеции увеличивающейся протяженности, например 1, 2, 3, 4, 5 и т.д. аминокислот, могут быть включены на всем протяжении белка с ожиданием, что биологический фенотип вируса будет изменен, приводя к существенному ослаблению. Результаты клинических испытаний. Профили виремии ChimeriVax-JE с остатками M-60 аргинина и цистеина, полученные из клинических испытаний, приведенных выше, сравнены в табл. 11 А и В. У 67-100% субъектов, получающихChimeriVax-JE M-60 аргинин, обнаруживали виремию, длящуюся один или несколько дней, по сравнению с 29-50% субъектов, получающих ChimeriVax-JE M-60 цистеин. Средние максимальные уровни виремии у субъектов, получающих ChimeriVax-JE M-60 аргинин, варьировали с 13 до 40 БОЕ/мл по сравнению со средними максимальными уровнями виремии в 3,5-6,3 БОЕ/мл в случае ChimeriVax-JEM-60 цистеин. Длительность виремии была также заметно длиннее в случае ChimeriVax-JE M-60 аргинин.- 24015907 Эти данные демонстрируют, что уровень виремии заметно ниже в случае вакцины, содержащей мутацию МбО. Виремия является критерием висцеротропизма (вирулентности) вакцинного вируса. Вакцина с уменьшенной виремией считается безопаснее, так как уменьшаются повреждение клеток и дисфункция органов, поддерживающих вирусную репликацию и вносящих вклад в виремию, а также вероятность того, что вирус пересечет гематоэнцефалический барьер и проникнет в центральную нервную систему. В других экспериментах показано, что мутант M-60 был высокоиммуногенным в людях, как и немутант. Таблица 1 Консенсусная последовательность вируса с фенотипом маленьких бляшек (Р 10 PMS) (P/N IT-0116; L/N I020504A) (бляшка, очищенная из лота вакцины 5-го пассажа 1 выделение) Таблица 2 Консенсусная последовательность вируса с фенотипом больших бляшек PMS (P10, PMS) (P/N IT-0117; L/N I030804A) (полученная из лота вакцины 5-го пассажа 1 выделение) Таблица 3 Последовательность вирусов из больших бляшек, выделенных после 2 дополнительных пассажей маленькой (S) бляшки PMS (p10) в клетках Vero в бессывороточных условиях- 25015907 Таблица 4 Наблюдаемые цитопатические эффекты у клеток HepG2 Виремия выражена в БОЕ/мл. День 1: День 1 исследования, обезьян прививали в день 1. Нулевое значение БОЕ/мл означает - ниже границ обнаружения, теоретический порог обнаружения равен 10 БОЕ/мл. Таблица 6 Последовательность М-области химеры YF-WN, полученная прямо из изолята бляшки от обезьян с виремией, привитых вакцинным вирусом WN02- 26015907 Таблица 7 Нуклеотидные и аминокислотные последовательности неклонированных и клонированных образцов SF ChimeriVax-JE (см. фиг. 6) Таблица 9 Нейровирулентность у яванских макаков эталонного и производственного посевных материалов М-60 (клона С) в сравнении с контролем YF-VAX БОЕ = бляшкообразующие единицы. 4 из 11, 2 из 11 и 1 из 11 животных в группах 1, 2 и 3 соответственно были исключены из подсчета оценок, потому что они были найдены являющимися сероположительными на вирус японского энцефалита (JE) в 1-й день (до прививки) в более позднем тесте PRNT50, который является более чувствительным, чем тест HAI, использованный в предварительном скрининге. 2- 28015907 Таблица 10 Сравнение величин виремии и иммуногенности в яванских макаках, привитых подкожно начальной Р 5 ChimeriVax-JE вакциной, полученной на среде, содержащейFBS (не содержащей мутаций, кроме Е 491), и очищенной основной массой клона С Р 13 вакцины (мутанта М-60) 2 из 6, 1 из 6 и 2 из 6 животных в группах 1, 2 и 3 соответственно были исключены из подсчета значений, потому что они были найдены являющимися сероположительными на вирус японского энцефалита (JE) в 1-й день (до прививки) в более позднем тесте PRINT50, который является более чувствительным, чем тест HAI, использованный в предварительном скрининге. Таблица 11 А Профили виремии в субъектах, участвующих в исследовании Н-040-003, в котором вводилась вакцина ChimeriVax-JE с аргинином в положении M-60. Ряд дозировок,выделенный жирным шрифтом, является аналогичным тому, что применялся в другом исследовании (Н-040-007), в котором вводилась вакцина с мутантным цистеином в положении М-60
МПК / Метки
МПК: A61K 39/12, C12Q 1/70
Метки: flavivirus, рекомбинантный, применение
Код ссылки
<a href="https://eas.patents.su/30-15907-rekombinantnyjj-flavivirus-i-ego-primenenie.html" rel="bookmark" title="База патентов Евразийского Союза">Рекомбинантный флавивирус и его применение</a>
Рекомбинантный онколитический парамиксовирус и его применение
Номер патента: 13615
Опубликовано: 30.06.2010
Авторы: Виллуда Ханс Йёрг, Пюлер Флориан, Байер Рудольф, Босслет Клаус
МПК: A61K 35/76, A61P 35/00, C07K 14/115...
Метки: парамиксовирус, онколитический, рекомбинантный, применение
Формула / Реферат:
1. Рекомбинантный онколитический парамиксовирус, содержащий нуклеиновую кислоту по крайней мере с одним трансгеном, кодирующим обладающий терапевтической активностью при экспрессии инфицированной вирусом опухолевой клеткой слитый белок, который содержит по крайней мере один домен, связывающийся с внутриклеточными компонентами клетки-мишени, и второй домен, полученный из белков, которые выбраны из группы, включающей токсин, такой как человеческая...
Рекомбинантный поксвирус, содержащий по меньшей мере два промотора ati вируса коровьей оспы, и его применение
Номер патента: 12723
Опубликовано: 30.12.2009
Авторы: Лейрер Соня, Хаули Пол
МПК: A61K 39/275, A61K 39/285, C12N 15/863...
Метки: два, коровьей, вируса, рекомбинантный, мере, применение, оспы, содержащий, поксвирус, промотора, меньшей
Формула / Реферат:
1. Рекомбинантный поксвирус, содержащий в вирусном геноме по меньшей мере две экспрессионные кассеты, каждая из которых содержит промотор ATI вируса коровьей оспы или его производное или субпоследовательность промотора ATI или ее производное и кодирующую последовательность, где экспрессия кодирующей последовательности регулируется указанным промотором, производным или субпоследовательностью и где производное промотора ATI коровьей оспы является...
Рекомбинантный поксвирус, экспрессирующий гомологичные гены, встроенные в поксвирусный геном, и его применение
Номер патента: 12160
Опубликовано: 28.08.2009
Авторы: Лейрер Соня, Хаули Пол
МПК: A61K 39/12, C07K 14/18, A61P 37/04...
Метки: геном, применение, гомологичные, экспрессирующий, поксвирусный, рекомбинантный, поксвирус, встроенные, гены
Формула / Реферат:
1. Рекомбинантный поксвирус, используемый для воздействия на иммунный ответ, предпочтительно на его индуцирование у животного, включая человека, содержащий по меньшей мере два гомологичных чужеродных гена с гомологией, составляющей по меньшей мере 50%, в котором каждый из указанных генов встроен в отдельный сайт инсерции вирусного генома. 2. Рекомбинантный поксвирус по п.1, в котором указанные гены имеют гомологию, составляющую по меньшей мере...
Способ получения линии клеток, продуцирующей рекомбинантный поликлональный белок, способ получения поликлонального белка, линия клеток, продуцирующая рекомбинантный поликлональный белок, библиотека векторов, популяция клеток
Номер патента: 13225
Опубликовано: 30.04.2010
Авторы: Ян Чиоу-Ин, Хаурум Джон С., Виберг Финн К., Шарон Жаклин, Колье Винсент В.
МПК: A61K 38/17, A61K 39/395, C07K 14/705...
Метки: линия, продуцирующая, рекомбинантный, векторов, библиотека, популяция, поликлональный, продуцирующей, получения, линии, клеток, белок, способ, поликлонального, белка
Формула / Реферат:
1. Способ получения линии клеток, продуцирующей рекомбинантный поликлональный белок, предусматривающий:a) получение библиотеки векторов, содержащей совокупность вариантных последовательностей нуклеиновых кислот, где каждый из указанных векторов включает 1) одну-единственную копию определенной последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей определенный элемент поликлонального белка, содержащего элементы, которые связывают специфический...
Рекомбинантный вирус, содержащий ген теломелизина-gfp
Номер патента: 11880
Опубликовано: 30.06.2009
Авторы: Мизугучи Хиройуку, Кио Сатору, Хаякава Такао, Фудживара Тошийоши, Танака Нориака
МПК: A61K 48/00, C12N 15/09, A61P 35/00...
Метки: рекомбинантный, ген, теломелизина-gfp, вирус, содержащий
Формула / Реферат:
1. Реагент для выявления раковых клеток, отличающийся тем, что он включает рекомбинантный вирус, в котором репликационная кассета, включающая промотор из теломеразы человека, ген Е1А, последовательность IRES и ген Е1В в таком порядке, интегрирована в область Е1 генома вируса и маркировочная кассета, включающая ген, кодирующий маркировочный белок, и промотор, способный регулировать экспрессию гена, кодирующего маркировочный белок, интегрирована в...