Применение человеческого моноклонального антитела к ил-15 в составе композиции и лекарственного препарата (варианты), композиция и лекарственный препарат, его включающие

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ЕВРАЗИЙСКОМУ ПАТЕНТУ Дата публикации и выдачи патента ПРИМЕНЕНИЕ ЧЕЛОВЕЧЕСКОГО МОНОКЛОНАЛЬНОГО АНТИТЕЛА К ИЛ-15 В СОСТАВЕ КОМПОЗИЦИИ И ЛЕКАРСТВЕННОГО ПРЕПАРАТА (ВАРИАНТЫ),КОМПОЗИЦИЯ И ЛЕКАРСТВЕННЫЙ ПРЕПАРАТ, ЕГО ВКЛЮЧАЮЩИЕ Ван Де Винкел Ян, Г., Я., Ван Дейк Маркус Антониус, Схурман Янине,Герритсен Арнаут Ф. (NL), Бодсгор Оле Д., M., Ск. (SE), Петерсен Йерген Описаны выделенные человеческие моноклональные антитела, которые специфически связываются с ИЛ-15 (например, человеческим ИЛ-15), а также соответствующие композиции на основе подобных антител и молекулы. Человеческие антитела могут быть получены в трансфектоме или отличном от человека трансгенном животном, например в трансгенной мыши, способной к образованию множества изотипов человеческих моноклональных антител путем рекомбинации V-D-J и переключения изотипов. Представлены также фармацевтические композиции, содержащие человеческие антитела, трансгенные животные, отличные от человека, и гибридомы, которые продуцируют человеческие антитела, а также способы терапии и диагностики с использованием человеческих антител. 015897 Область техники, к которой относится изобретение Изобретение относится к биотехнологии и медицине, конкретно к выделенным моноклональным человеческим антителам к интерлейкину-15 (ИЛ-15), которые могут быть использованы для диагностики, лечения или предупреждения нарушений, которые ассоциированы со сверхэкспрессией человеческого ИЛ-15 и/или при которых даунрегуляция или ингибирование эффектов, индуцированных человеческим ИЛ-15, являются благоприятными. Сведения о предшествующем уровне техники Интерлейкин-15 представляет собой провоспалительный цитокин, гликопротеин молекулярной массы 14-15 кД. Отмечена его конститутивная экспрессия в различных клетках и тканях, включая моноциты и макрофаги, фибробласты, кератиноциты и дендритные клетки (см. статьи Waldmann иTagaya, 1999; Fehniger и Caligiuri, 2001). Положительная регуляция экспрессии происходит в условиях воспаления, как описано для моноцитов, стимулируемых IFN- (интерфероном-) и LPS (липополисахаридами), или при инфекции вирусов, бактерий или простейших (см. статьи Kirman и соавт., 1998;Waldmann и соавт., 1998; Waldmann и Tagaya, 1999; Fehniger и Caligiuri, 2001). Кроме того, при хронических воспалительных заболеваниях, таких как ревматоидный артрит, местное образование ИЛ-15,вероятно, усиливает воспаление путем рекрутирования и активации синовиальных T-клеток. Данный эффект, индуцируемый ИЛ-15, как предполагалось, играет центральную роль в патогенезе заболеванияFehniger и Caligiuri, 2001). Исследования in vitro показали, что ИЛ-15 имеет ряд общих биологических активностей с ИЛ-2 в связи с наличием общих рецепторных компонентов. Рецептор ИЛ-15, присутствующий на T-клетках,состоит из уникальной -цепи, ИЛ-15R, но имеет такие же -цепь и -цепь, как ИЛ-2R. Вследствие этого, оба рецептора используют одинаковые элементы передачи сигнала Jak/STAT. Однако, основываясь на системной регуляции и дифференцированной экспрессии ИЛ-2 и ИЛ-15 и их рецепторов, были описаны важные различия данных функций in vivo (см. статьи Kirman и соавт., 1998; Waldmann и Tagaya, 1999; Waldmann и соавт., 2001). Важно также отметить основную роль ИЛ-15 в развитии, жизнеспособности, экспансии и функции натуральной киллерной (NK) клетки, NK-T-клетки и интраэпителиального лимфоцита (см. статьиMcInnes с коллегами (см. статью McInnes и соавт., 1997; McInnes и Liew, 1998) описали индукцию продукции TNF- в T-клетках, выделенных у больных ревматоидным артритом, после стимуляции с помощью ИЛ-15. Кроме того, было показано, что T-клетки периферической крови, активированные ИЛ-15, индуцируют продукцию TNF- макрофагами на значительном уровне посредством механизма,зависимого от контакта клеток. Вследствие деструктивной роли TNF- в развитии ревматоидного артрита ингибирование данного цитокина снижает активность заболевания (см. статьи Bathon и соавт.,2000; Klippel, 2000; Lovell и соавт., 2000; Maini и Taylor, 2000). Сущность изобретения Изобретательской задачей является получение новых, полностью человеческих антител к интерлейкину-15, позволяющих расширить круг средств данного назначения. Данное изобретение основано на создании и выделении впервые полностью человеческих моноклональных антител, которые специфически связываются с человеческим ИЛ-15, а также на характеризации данных новых антител и демонстрации их терапевтической ценности при лечении ряда ИЛ-15 опосредованных заболеваний. Например, как описано в данном контексте, было показано, что человеческие антитела ингибируют оба процесса, как продукцию TNF-, так и пролиферацию T-клеток, которые полностью входят в воспалительные нарушения. Согласно этому человеческие антитела, соответствующие данному изобретению, представляют собой усовершенствованное средство для лечения и профилактики данных нарушений (и любого другого ИЛ-15-опосредованного нарушения). Это отчасти обусловлено их уникальной специфичностью (например, специфичностью в отношении эпитопа или вида), аффинностью, структурой, функциональной активностью и тем фактом, что они являются полностью человеческими, что делает их значительно менее иммуногенными и более терапевтически эффективными при введении пациенту-человеку, чем другие антитела против ИЛ-15, полученные ранее(например, мышиные и гуманизированные антитела). В основе данного изобретения лежит также разработка новых способов терапевтического применения антител, ингибирующих ИЛ-15, таких как человеческие антитела, описанные в данном контексте, в том числе для лечения воспалительных заболеваний, таких как ревматоидный артрит, псориаз, отторжение трансплантатов и рак. Выделенные человеческие антитела, соответствующие изобретению, включают множество изотипов антител, таких какIgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA1, IgA2, IgAsec, IgD и IgE. Как правило, они включают изотипы IgG1(например, IgG1k), IgG3 и IgM. Антитела могут иметь полную длину (например, антитело IgG1 илиIgG3) или включать только антигенсвязывающую часть (например, Fab, F(ab')2, Fv, фрагмент одноцепочечного Fv, выделенный гипервариабельный участок (участок, определяющий комплементарность)(CDR) или комбинацию из двух или более выделенных CDR.-1 015897 В одном из вариантов осуществления человеческие антитела представляют собой рекомбинантные антитела. В конкретном варианте осуществления человеческое антитело кодируется нуклеиновыми кислотами человеческой тяжелой цепи IgG и человеческой -легкой цепи, которые содержат в вариабельных областях нуклеотидные последовательности, приведенные в SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 3 соответственно, и консервативные модификации данных последовательностей. В другом варианте осуществления человеческое антитело включает вариабельные области тяжелой цепи IgG и -легкой цепи, которые содержат последовательности аминокислот, представленные вSEQ ID NO: 2 и SEQ ID NO: 4 соответственно, и консервативные модификации данных последовательностей. Человеческие антитела, соответствующие изобретению, могут быть получены рекомбинантным путем в клетке-хозяине, такой как трансфектома (например, трансфектома, состоящая из иммортализованных клеток CHO (яичников китайского хомячка) или лимфоцитарных клеток), содержащей нуклеиновые кислоты, кодирующие тяжелую и легкую цепи антитела, или могут быть получены непосредственно из гибридомы, которая экспрессирует антитело (например, гибридомы, которая включает Bклетку, выделенную из организма трансгенного животного, отличного от человека, например трансгенной мыши, геном которой содержит трансген человеческой тяжелой цепи и трансген человеческой легкой цепи, кодирующие антитело, слитую с иммортализованной клеткой). В конкретном варианте осуществления продукция антител осуществляется гибридомой, обозначаемой в данном контексте 146B7, или трансфектомой на основе клетки-хозяина (например, клеткиCHO), содержащей нуклеиновые кислоты человеческой тяжелой цепи и человеческой легкой цепи, которые содержат в вариабельных областях нуклеотидные последовательности, представленные в SEQ IDNO: 1 и 3 соответственно, и их консервативные модификации. В конкретных вариантах осуществления продукция антител осуществляется гибридомами, обозначаемыми в данном контексте 146B7, 146H5, 404E4 и 404A8. В предпочтительном варианте осуществления антитело специфически связывает эпитоп, находящийся на домене ИЛ-15, который взаимодействует с - и/или -цепью. В другом варианте осуществления человеческие антитела, соответствующие данному изобретению, специфически связываются с человеческим ИЛ-15 и подавляют способность ИЛ-15 индуцировать провоспалительные эффекты, например ингибируют продукцию TNF- и/или подавляют пролиферацию T-клеток, таких как T-клетки, представленные PBMC (мононуклеарными клетками периферической крови) или CTLL-2, при связывании ИЛ-15 с рецептором ИЛ-15. Как правило, человеческие антитела связываются с ИЛ-15 с константой равновесия диссоциации(KD) меньше чем приблизительно 10-7 М, например, меньше чем приблизительно 10-8 М, 10-9 М или 10-10 М или даже меньше, определенной методом поверхностного плазменного резонанса (SPR) на приборе BIACORE 3000, используя рекомбинантный человеческий ИЛ-15 в качестве аналита и антитело в качестве лиганда. В конкретном варианте осуществления антитело связывается с человеческим ИЛ-15 с константой равновесия диссоциации (KD) приблизительно 6,510-8 М. В следующем варианте осуществления изобретение относится к выделенному человеческому моноклональному антителу, которое специфически связывается с человеческим ИЛ-15, содержащему по меньшей мере одну последовательность CDR, выбранную из группы, состоящей из:(ii) последовательностей, которые по меньшей мере на 90% гомологичны, предпочтительно по меньшей мере на 95% гомологичны и более предпочтительно по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99% гомологичны последовательностям, определенным в (i); и(iii) фрагментов последовательностей, определенных в (i) или (ii), которые сохраняют способность специфически связываться с человеческим ИЛ-15. В другом варианте осуществления изобретение относится к выделенному человеческому моноклональному антителу, которое специфически связывается с человеческим ИЛ-15, содержащему:(ii) последовательность, которая по меньшей мере на 90% гомологична, предпочтительно по меньшей мере на 95% гомологична и более предпочтительно по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99% гомологична SEQ ID NO: 7; или(iii) фрагмент последовательности, определенной в (i) или (ii), который сохраняет способность специфически связываться с человеческим ИЛ-15. В следующем варианте осуществления изобретение относится к выделенному человеческому моноклональному антителу, которое специфически связывается с человеческим ИЛ-15, содержащему:(iv) последовательности, которые по меньшей мере на 90% гомологичны, предпочтительно по-2 015897 меньшей мере на 95% гомологичны и более предпочтительно по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99% гомологичны последовательностям, определенным в (i), (ii) или (iii); либо(v) фрагменты последовательностей, определенных в (i)-(iii) или (iv), которые сохраняют способность специфически связываться с человеческим ИЛ-15. В другом варианте осуществления изобретение относится к выделенному человеческому моноклональному антителу, которое специфически связывается с человеческим ИЛ-15, содержащему по меньшей мере четыре CDR, выбранные из:(ii) последовательностей, которые по меньшей мере на 90% гомологичны, предпочтительно по меньшей мере на 95% гомологичны и более предпочтительно по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99% гомологичны последовательностям, определенным в (i); и(iii) фрагментов последовательностей, определенных в (i) или (ii), которые сохраняют способность специфически связываться с человеческим ИЛ-15. В следующем варианте осуществления изобретение относится к выделенному человеческому моноклональному антителу, которое специфически связывается с человеческим ИЛ-15, содержащему:(ii) последовательности, которые по меньшей мере на 90% гомологичны, предпочтительно по меньшей мере на 95% гомологичны и более предпочтительно по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99% гомологичны последовательностям, определенным в (i); и(iii) фрагменты последовательностей, определенных в (i) или (ii), которые сохраняют способность специфически связываться с человеческим ИЛ-15. В следующем варианте осуществления изобретение относится к выделенному человеческому моноклональному антителу, которое специфически связывается с человеческим ИЛ-15, содержащему вариабельную область тяжелой цепи с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 2 или последовательностью, которая по меньшей мере на 90% гомологична, предпочтительно по меньшей мере на 95% гомологична и более предпочтительно по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99% гомологична SEQ ID NO: 2. В следующем варианте осуществления изобретение относится к выделенному человеческому моноклональному антителу, которое специфически связывается с человеческим ИЛ-15, содержащему вариабельную область легкой цепи с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 4 или последовательностью, которая по меньшей мере на 90% гомологична, предпочтительно по меньшей мере на 95% гомологична и более предпочтительно по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99% гомологична SEQ ID NO: 4. В следующем варианте осуществления изобретение относится к выделенному человеческому моноклональному антителу, которое специфически связывается с человеческим ИЛ-15, которое ингибирует цис-передачу сигнала через -цепь ИЛ-15R посредством специфического связывания эпитопа, находящегося на домене человеческого ИЛ-15, взаимодействующим с -цепью, и которое ингибирует транс-передачу сигнала на соседние клетки, экспрессирующие -цепъ или - и -цепи как часть ИЛ-15R или другого цитокинового рецептора. В еще одном варианте осуществления выделенное человеческое моноклональное антитело специфически связывается с человеческим ИЛ-15 и нарушает сборку -, - и -цепей рецептора ИЛ-15 и/или ингибирует сборку на соседних клетках, экспрессирующих - и -цепи как часть рецептора ИЛ-15 или другого цитокинового рецептора. В другом аспекте в изобретении представлены молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие антитела или антигенсвязывающие части, соответствующие изобретению. Согласно этому изобретение охватывает также рекомбинантные экспрессионные векторы, которые включают кодирующие антитело нуклеиновые кислоты, соответствующие изобретению, клетки-хозяева, трансфицированные данными векторами, а также способы получения антител, соответствующих изобретению, путем культивирования данных клеток-хозяев. Изобретение касается также экспрессионного вектора, содержащего нуклеотидную последовательность, кодирующую вариабельные области тяжелой и легкой цепей, которые содержат аминокислотные последовательности, представленные в SEQ ID NO: 2 и SEQ ID NO: 4 соответственно, и их консервативные модификации. Данные экспрессионные векторы хорошо известны в области техники. Примеры векторов включают векторы для транскрипции/трансляции in vitro с использованием, например, лизатов ретикулоцитов. В еще одном аспекте изобретение представляет выделенные B-клетки трансгенного животного,отличного от человека, например трансгенной мыши, которые способны экспрессировать различные изотипы (например, IgG, IgA и/или IgM) человеческих моноклональных антител, которые специфически связываются с ИЛ-15. Предпочтительно, когда выделенные B-клетки получают у трансгенного животного, отличного от человека, например трансгенной мыши, которая была иммунизирована очищенным или обогащенным препаратом антигена ИЛ-15 и/или клеток, экспрессирующих ИЛ-15. Предпоч-3 015897 тительно, когда геном трансгенного животного, отличного от человека, например трансгенной мыши,содержит трансген человеческой тяжелой цепи и трансген человеческой легкой цепи. Затем выделенные B-клетки иммортализуют с целью получения источника (например, гибридомы) человеческих антител против ИЛ-15. Соответственно данное изобретение представляет также гибридому, способную продуцировать человеческие моноклональные антитела, которые специфически связываются с ИЛ-15. В одном из вариантов осуществления гибридома включает B-клетку, полученную от трансгенного животного, отличного от человека, например трансгенной мыши, с геномом, содержащим трансген человеческой тяжелой цепи и трансген человеческой легкой цепи, кодирующие целое антитело, соответствующее изобретению, или его фрагмент, слитую с иммортализованной клеткой. Трансгенное животное, отличное от человека, может быть иммунизировано очищенным или обогащенным препаратом антигена ИЛ-15 и/или клеток, экспрессирующих ИЛ-15, с целью создания гибридом, продуцирующих антитело. Конкретные гибридомы, представленные в изобретении, включают 146B7, 146H5, 404E4 и 404A8. В еще одном аспекте изобретение представляет трансгенное животное, отличное от человека, например трансгенную мышь, которая экспрессирует человеческие моноклональные антитела, специфически связывающиеся с ИЛ-15. В конкретном варианте осуществления трансгенное животное, отличное от человека, представлено трансгенной мышью, геном которой содержит трансген человеческой тяжелой цепи и трансген человеческой легкой цепи. Трансгенное животное, отличное от человека, может быть иммунизировано очищенным или обогащенным препаратом антигена ИЛ-15 и/или клеток,экспрессирующих ИЛ-15. Предпочтительно, когда трансгенное животное, отличное от человека, например трансгенная мышь, способно к образованию множества изотипов человеческих моноклональных антител к ИЛ-15 (например, IgG, IgA и/или IgM) путем рекомбинации V-D-J и переключения изотипов. Переключение изотипов может осуществляться, например, путем классического и неклассического переключения изотипов. В другом аспекте данное изобретение представляет способы получения человеческих моноклональных антител, которые специфически реагируют с ИЛ-15. В одном из вариантов осуществления способ включает иммунизацию трансгенного животного, отличного от человека, например трансгенной мыши, геном которой содержит трансген человеческой тяжелой цепи и трансген человеческой легкой цепи, кодирующие целое антитело, очищенным или обогащенным препаратом антигена ИЛ-15 и/или клеток, экспрессирующих ИЛ-15. Затем получают B-клетки (например, B-клетки селезенки) животного и сливают их с клетками миеломы с образованием иммортализованных гибридомных клеток, которые секретируют человеческие моноклональные антитела против ИЛ-15. В еще одном аспекте данного изобретения охарактеризованы человеческие антитела против ИЛ 15, конъюгированные с терапевтической молекулой, например цитотоксическим лекарственным веществом, токсином с ферментативной активностью или его фрагментом, радиоизотопом или маленькой молекулой противоопухолевого лекарственного вещества. В другом аспекте данное изобретение представляет композиции, например фармацевтические и диагностические композиции, содержащие фармацевтически приемлемый носитель и по меньшей мере одно человеческое моноклональное антитело, соответствующее изобретению, которое специфически связывается с ИЛ-15. Кроме того, композиция может содержать другие терапевтические агенты, такие как другие иммунодепрессанты или химиотерапевтические агенты. В еще одном аспекте в изобретении представлены способы ингибирования провоспалительных эффектов ИЛ-15, такие как ингибирование образования TNF- и/или пролиферации T-клеток, индуцируемых ИЛ-15, предпочтительно без ингибирования активности (например, образования TNF- и/или пролиферации T-клеток) структурно близких белков/цитокинов (например, ИЛ-2) с использованием одного или более человеческих антител, соответствующих изобретению. Человеческие антитела, соответствующие данному изобретению, можно использовать для лечения и/или профилактики ряда ИЛ-15-опосредованных заболеваний посредством введения антител пациентам, страдающим данными заболеваниями. Примеры заболеваний, которые можно лечить (например, облегчить) или предупредить, используя способы и композиции, соответствующие изобретению, включают без ограничения перечисленным воспалительные заболевания, такие как артрит (например, псориатический артрит и ревматоидный артрит, в том числе активный ревматоидный артрит и ювенильный ревматоидный артрит (болезнь Стилла и воспалительное заболевание кишки. Например, было показано, что антитела снижают паракератоз, уменьшают толщину эпидермиса и снижают пролиферацию кератиноцитов при псориазе. Показано также, что антитела уменьшают воспаление и/или препятствуют хемотаксису активированных лейкоцитов, участвующих в развитии ревматоидного артрита. Антитела можно также использовать для лечения инфекционных заболеваний, таких как ВИЧ-инфекция. Более того, антитела могут быть использованы для лечения отторжения трансплантата. Согласно этому человеческие моноклональные антитела,соответствующие изобретению, могут быть использованы у пациентов, подвергающихся или тех, которые были подвергнуты трансплантации органа или ткани, например сердца, легкого, комбинации серд-4 015897 ца-легкого, трахеи, почки, печени, поджелудочной железы, пищевода, кишки, кожи, конечности,трансплантации пуповины, трансплантации стволовых клеток, трансплантации клеток островков и т.п. Антитела, соответствующие данному изобретению, могут быть, таким образом, использованы для профилактики отторжения аллотрансплантата или ксенотрансплантата или использованы для реверсии,лечения или иного облегчения эпизодов острого отторжения аллотрансплантатов или ксенотрансплантатов. Дальнейшие заболевания, которые можно лечить, включают болезнь трансплантат против хозяина, например болезнь трансплантат против хозяина, связанную с переливанием крови, и болезнь трансплантат против хозяина при трансплантации костного мозга. Кроме того, антитела могут быть использованы для лечения ряда заболеваний, включающих неоваскуляризацию, опосредованную ИЛ-15, таких как рост опухоли и формы рака, например T-клеточный лейкоз. Другие примеры заболевания с повышенным уровнем ангиогенеза включают воспалительные заболевания, такие как ревматоидный артрит. В другом варианте осуществления изобретение относится к способу лечения или предупреждения нарушения, которое ассоциировано со сверхэкспрессией человеческого ИЛ-15 и/или при котором даунрегуляция или ингибирование эффектов, индуцированных человеческим ИЛ-15, является благоприятной, предусматривающему введение антитела, соответствующего изобретению, субъекту в количестве, эффективном для лечения или предупреждения нарушения. В следующем варианте изобретения нарушение выбрано из группы, состоящей из подагрических заболеваний, таких как анкилозирующий спондилит, реактивный артрит, саркоилеит и болезнь Стилла взрослых; нарушений соединительной ткани, таких как системная красная волчанка, дискоидная волчанка,волчанка ЦНС, волчаночный нефрит, саркоидоз, саркоидоз ЦНС и полимиозит/дерматомиозит; глазных нарушений, таких как увеит и хореоритинит; неврологических нарушений, таких как миелопатия/тропический спастический парапарез, злокачественная миастения, рак шейки матки, рабдомиосаркома, саркома Эвинга и рассеянный склероз; желудочно-кишечных нарушений и нарушений печени, таких как острый скоротечный гепатит, колики,послеоперационный энтероколит, язвенный колит и болезнь Крона; аллергических нарушений, таких как бронхиальная астма; гематологических нарушений, таких как острый T-клеточный лимфобластоидный лейкоз, Tклеточный лейкоз взрослых, синдром Сезари, хронический лимфоцитарный лейкоз, грибовидный микоз, острый лимфобластный лейкоз/лимфома предшественников B-клеток, хронический миелогенный лейкоз, острый миелоидный лейкоз, большой гранулярный лимфоцитоз, большой гранулярный лимфоцитарный лейкоз, миелома, плазмацитома, миелома плазматических клеток, заболевания, связанные с тяжелой цепью (включая -, - и -заболевание), лимфома экстранодальных натуральных киллеров/Tклеток и агрессивный лейкоз клеток натуральных киллеров; кожных нарушений, таких как аллергическая контактная экзема, буллезный пемфигоид, послеожоговые гипертрофированные рубцы и красный лишай; легочных нарушений, таких как хроническое обструктивное легочное заболевание, фиброзирующий альвеолит и острый респираторный дистресс-синдром; злокачественных новообразований, таких как колоректальный рак и злокачественная меланома; нарушений, связанных с трансплантацией, таких как отторжение аллотрансплантата и ксенотрансплантата и болезнь трансплантат против хозяина; эндокринологических нарушений, таких как аутоиммунный тиреоидит и болезнь Грейва; сосудистых нарушений, таких как грануломатоз Вегенера, микроскопический полиангиит, узелковый полиартериит, артериит гигантских клеток и атеросклероз; гинекологических нарушений - нарушений при родах, таких как привычный самопроизвольный выкидыш и эндометриоз; и инфекционных заболеваний, таких как сепсис и СПИД. В еще одном варианте осуществления нарушение выбрано из группы, состоящей из анкилозирующего спондилита, системной красной волчанки, язвенного колита, отторжения трансплантата и болезни трансплантат против хозяина. Человеческие антитела, соответствующие данному изобретению, могут быть также скомбинированы с одним или более дополнительными терапевтическими агентами, такими как противовоспалительные агенты, DMARD (модифицирующие заболевание антиревматические лекарственные вещества), иммунодепрессанты, химиотерапевтические препараты и агенты для лечения псориаза. В одном из вариантов осуществления субъекта могут дополнительно лечить одним или более агентами, которые усиливают подавление провоспалительного эффекта антител, например противовоспалительным агентом, таким как стероидное лекарственное вещество или NSAID (нестероидное противовоспалительное лекарственное вещество). Предпочтительные агенты включают, например, аспирин и другие салицилаты, ингибиторы Cox-2, такие как рофекоксиб (Vioxx (Виокс и целекоксиб (Celebrex(Целебрекс, NSAID, такие как ибупрофен (Motrin, (Мотрин) Advil (Адвил, фенопрофен (Nalfon (Налфон, напроксен (Naprosyn (Напросин, сулиндак (Clinoril (Клинорил, диклофенак (Voltaren (Воль-5 015897 тарен, пироксикам (Feldene (Фелден, кетопрофен (Orudis (Орудис, дифлунисал (Dolobid (Долобид, набуметон (Relafen (Релафен, этодолак (Lodine (Лодин, оксапроцин (Daypro (Дайпро и индометацин (Indocin (Индоцин. В другом варианте осуществления человеческие антитела, соответствующие изобретению, могут быть введены в комбинации с одним или более DMARD, такими как метотрексат (Rheumatrex (Реуматркес, гидроксихлороквин (Plaquenil (Плаквенил, сульфасалазин (Asulfidine (Асульфидин, ингибиторы синтеза пиримидина, например лефлуномид (Arava (Арава, блокаторы рецептора ИЛ-1, например анакинра (Kineret (Кинерет и блокатор TNF-, например этанерцепт (Enbrel (Энбрел, инфликсимаб (Remicade (Ремикад и адалимумаб. Дальнейшие примеры представляют собой ИЛ-10, растворимый ИЛ-15R, антитела против ИЛ-6R,CTLA4Ig и антитела против CD20. В другом варианте осуществления человеческие антитела, соответствующие изобретению, могут быть введены в комбинации с одним или более иммунодепрессантами, такими как циклоспорин(Sandimmune (Сандиммун), Neoral (Неорал и азатиоприн (Imural (Имурал. Дальнейшими примерами являются микофеноловая кислота, мофетил микофенолят, кортикостероиды, такие как преднизон, метотрексат, соли золота, сульфасалазин, антималярийные препараты,бреквинар, лефлуномид, мизорибин, 15-дезоксиспергуалин, 6-меркаптопурин, циклофосфамид, рапамицин, такролимус (FK-506) и антитимоцитарный глобулин. В другом варианте осуществления человеческие антитела, соответствующие изобретению, могут быть введены в комбинации с двумя или более иммунодепрессантами, такими как преднизон и циклоспорин; преднизон, циклоспорин и азатиоприн или преднизон, циклоспорин и мофетил микофенолят. В другом варианте осуществления человеческие антитела, соответствующие изобретению, могут быть введены в комбинации с одним или более химиотерапевтическими препаратами, такими как доксорубицин (Adriamycin (Адриамицин, цисплатин (Platinol (Платинол, блеомицин (Blenoxane (Бленоксан, кармустин (Gliadel (Глиадел, циклофосфамид (Cytoxan (Цитоксан), Procytox (Процитокс),Neosar (Heocap и хлорамбуцил (Leukeran (Лейкеран. Человеческие антитела, соответствующие изобретению, могут быть также введены в сочетании с радиотерапией. В следующем варианте осуществления человеческие антитела, соответствующие изобретению,могут быть введены в комбинации с одним или более агентами для лечения псориаза, такими как наружные лекарственные препараты, содержащие каменноугольный деготь, витамин A, кортизон или другие кортикостероиды, пероральные или инъекционные лекарственные препараты, такие как кортикостероиды, метотрексат, ретиноиды, например ацикретин (Neogitason (Неогистасон или циклоспорин (Sandimmune (Сандиммун), Neoral (Неорал. Другие способы лечения могут включать воздействие солнечного света или фототерапию. Дальнейшими примерами являются антралин, кальципотриен, таразотен, энанерцепт, алефацепт,эфалицумаб, 6-тиогуанин, мофетил микофенолят, такролимус (FK-506) и гидроксимочевина. Другие примеры представляют собой CTLA4Ig и инфликсимаб. Другие лекарственные препараты могут включать UBV (широкополосный и узкополосный ультрафиолет B), UVA (ультрафиолет A) и PUVA (псорален метоксален и ультрафиолет A). В следующем варианте осуществления композиции, соответствующие изобретению, вводят в сочетании с двумя или более вышеуказанными терапевтическими препаратами, такими как метотрексат+фототерапия (PUVA или UVA); метотрексат+аситретин; ацитретин+фототерапия (PUVA илиUVA); метотрексат+аситретин+фототерапия (PUVA или UVA); гидроксимочевина+ацитретин; циклоспорин+метотрексат или кальципотреин+фототерапия (UVB). В другом варианте осуществления человеческие антитела, соответствующие изобретению, могут быть введены в комбинации с другими антителами, такими как CD4-специфические антитела и ИЛ-2 специфические антитела. Комбинацию данных человеческих антител с CD4-специфическими антителами или ИЛ-2-специфическими антителами считают особенно эффективной для лечения аутоиммунных заболеваний и отторжения трансплантатов. В еще одном варианте осуществления данные антитела могут быть введены в комбинации с другими антителами, например другими иммуносупрессивными человеческими моноклональными антителами, такими как антитела, связывающиеся, например, с MHC, CD2, CD3, CD7, CD28, B7, CD40, CD45,ИФН-, TNF-, ИЛ-2R, ИЛ-4, ИЛ-5, ИЛ-6R, ИЛ-7, ИЛ-8, ИЛ-10, CD11a, CD20 или CD58, или другие лиганды либо другие иммуномодулирующие соединения, например растворимый ИЛ-15R или ИЛ-10. В еще одном аспекте данное изобретение представляет способ детекции in vitro или in vivo присутствия антигена ИЛ-15 в образце, например, с целью диагностики ИЛ-15-опосредованных заболеваний. В одном из вариантов осуществления этого достигают посредством контактирования тестируемого образца параллельно с контрольным образцом с человеческим моноклональным антителом, соответствующим изобретению, или его антигенсвязывающей частью в условиях, которые дают возможность формирования комплекса антитела и ИЛ-15. Затем формирование комплекса определяют (например, с помощью ELISA (твердофазный иммуноферментный анализ в обоих образцах, и любая значимая раз-6 015897 ница в образовании комплексов между образцами указывает на присутствие антигена ИЛ-15 в тестобразце. Другие признаки и преимущества настоящего изобретения очевидны из следующего детального описания и пунктов формулы изобретения. Перечень чертежей Фиг. 1 включает графики, отражающие связывание специфических в отношении человеческого ИЛ-15 антител 146B7, 147H5, 404A8 и 404E4 с человеческим ИЛ-15 (hИЛ-15) и мутантными белками ИЛ-15 Q108S и D8SQ108S. Различные разведения антитела исследуют на связывание с hИЛ-15 или мутантными белками ИЛ-15 D8SQ108S и Q108S с помощью ELISA. На фиг. 2 и 3 представлены аминокислотные и (SEQ ID NO: 2 и 4) и нуклеотидные (SEQ ID NO: 1 и 3) последовательности VH- и VL-областей соответственно из антитела 146B7. Указаны каркасный сегмент (FR) и гипервариабельные участки (CDR). Фиг. 4A-4D включают графики, отражающие ингибирование ИЛ-15-опосредованного выходаTNF- антителом 146B7. Человеческие PBMC инкубировали с hИЛ-15 (в концентрациях 0, 50, 100 нг/мл) в комбинации с антителом 146B7 или изотипическим контрольным антителом (в концентрации 0,1, 1, 10 мкг/мл) в течение 72 ч. Количество образованного TNF- измеряли с помощью ELISA. Приведены данные по двум здоровым добровольным участникам эксперимента. На фиг. 5 представлен график, демонстрирующий эффект антитела 146B7 на IL-2- или IL-15 опосредованную продукцию TNF-. Человеческие PBMC инкубировали с hИЛ-15 (в концентрациях 0,50, 100 нг/мл) или hИЛ-2 (в концентрации 100 нг/мл) в комбинации с антителом 146B7 (в концентрации 0,1, 1, 10 мкг/мл) в течение 72 ч. Количество образованного TNF- измеряли с помощью ELISA. На фиг. 6 представлен график, демонстрирующий ингибирующую активность антител 146B7,146H5, 404E4 и 404A8 на индуцированную hИЛ-15 пролиферацию CTLL-2. Клетки CTLL-2, испытывающие необходимость в hИЛ-2, инкубировали с hИЛ-15 (в концентрации 60 пг/мл) в сочетании с серийными разведениями 146B7, 146H5, 404E4 и 404A8 в течение 48 ч. С целью отображения пролиферации измеряли включение [3H]-тимидина (число импульсов/мин). Результаты представлены как средние значения. Фиг. 7-9 включают графики, демонстрирующие ингибирующую активность антител 146B7 (см. фиг. 7), 404E4 (см. фиг. 8) и 404A8 (см. фиг. 9) на индуцированную hИЛ-15 пролиферацию PBMC. Человеческие PBMC инкубировали с hИЛ-15 (в концентрации 0,25, 100 нг/мл; см. фиг. 7A, 8A и 9A соответственно) или hИЛ-2 (в концентрации 0, 10, 100 нг/мл; см. фиг. 7B, 8B и 9B соответственно) в сочетании с 146B7 (см. фиг. 7), 404E4 (см. фиг. 8) или 404A8 (см. фиг. 9) в концентрации 0,1, 1, 10 пг/мл в течение 72 ч. С целью отображения пролиферации измеряли включение [3H]-тимидина (число импульсов/мин). На фиг. 10 представлен график, демонстрирующий связывание антитела 146B7 с моноцитами,стимулированными IFN-. Человеческие PBMC культивировали в присутствии IFN- (500 ед./мл) сроком до 2 дней (при 37C). Интенсивность флуоресценции по меньшей мере 5000 клеток/образец определяли после анализа с помощью проточной цитометрии при установке дискриминационного окна на моноциты. Данные показывают коэффициент стимуляции (S.I.) = (средняя флуоресценция положительного окрашивания)/(средняя флуоресценция фонового окрашивания. На фиг. 11 представлено связывание человеческих моноцитов с антителом 146B7 (панель B) или с изотипическим контрольным антителом (панель A). Выделяли человеческие PBMC и получали осадки в цитоцентрифуге после культивирования клеток с IFN- (500 ед./мл). Клетки подвергали контрастному окрашиванию гематоксилином. На фиг. 12 представлено связывание человеческой пораженной псориазом кожи с 146B7 (панельB) или с изотипическим контрольным антителом (hIgGL) (панель A). Человеческие псориазные бляшки получали от пациентов после согласия на основе полученной информации и хранили при -80 С до проведения анализа. Ткани окрашивали биотинилированными антителами и визуализировали после активации пероксидазой хрена. На фиг. 13A представлен график, демонстрирующий процент ядерных клеток в ткани, пораженной ревматоидным артритом, после лечения мышей SCID с помощью 146B7 или носителем. Ткани окрашивали гематоксилином и эозином (HE) и анализировали с использованием программы Photo Shop,версия 6.0. Данные представлены как средние значения и s.e.m. (стандартная ошибка) для ядер (как процент от общей площади) у мышей после лечения 146B7 (n=4) или введения носителем (n=2). На фиг. 13B и 13C показано репрезентативное окрашивание ГЭ (гематоксилинэозином) ксенотрансплантированной ткани RA у мышей SCID после лечения 146B7 (см. фиг. 13C) или PBS (см. фиг. 13B). Фиг. 14 включает графики, демонстрирующие эффекты лечения антителом 146B7 у мышейSCID/псориаз. Биоптаты фиксировали в формалине для заключения в парафин и окрашивали HE и на ядерный антиген Ki-67. На фиг. 14A представлена степень тяжести псориаза, определенная по толщине кожи, которую измеряли от рогового слоя от начала ограничивающей сети. На фиг. 14B представлена толщина эпидермиса, которая измерена от рогового слоя до самой глубокой части ограничивающей-7 015897 сети. На фиг. 14C представлена степень паракератоза. На фиг. 14D представлено число воспалительных мононуклеарных клеток в верхнем слое дермиса. На фиг. 14E представлено число циклирующих (митотически активных) кератиноцитов Ki- 67+. На фиг. 15 представлено окрашивание HE человеческой пораженной псориазом кожи, трансплантированной мышам SCID, после лечения антителом 146B7 (панель C), CsA (панель B) или введения носителя (панель A). Через три недели после трансплантации мыши получали PBS (плацебо), CsA(циклоспорин A) (Sandoz) в дозе 10 мг/кг каждый второй день в течение 15 дней или 146B7 в дозе 20 мг/кг в день 1 и 10 мг/кг в дни 8 и 15. Через одну неделю после последней инъекции мышей умерщвляли и из каждого ксенотрансплантата брали пункционную биопсию размером 4 мм. Биоптаты фиксировали в формалине для заключения в парафин и окрашивали HE. На фиг. 16 представлено окрашивание Ki-67 человеческой пораженной псориазом кожи, трансплантированной мышам SCID, после лечения антителом 146B7 (панель C), CsA (панель B) или носителем (панель A). Через 3 недели после трансплантации мыши получали PBS (плацебо), CsA (циклоспорин A) (Sandoz) в дозе 10 мг/кг каждый второй день в течение 15 дней или 146B7 в дозе 20 мг/кг в день 1 и 10 мг/кг в дни 8 и 15. Через одну неделю после последней инъекции мышей умерщвляли и из каждого ксенотрансплантата брали пункционную биопсию размером 4 мм. Биоптаты фиксировали в формалине для заключения в парафин и окрашивали ядерным антигеном Ki-67. На фиг. 17 представлен график, показывающий связывание антитела 146B7 с ИЛ-15, связанным с рецептором. Платы покрывают ИЛ-15R и инкубируют с ИЛ-15. Через 10 мин в лунки добавляют биотинилированное 146B7. Связывание 146B7 с ИЛ-15, связанным с рецептором, определяют при длине волны 405 нм с помощью ридера для ELISA. На фиг. 18 представлен график, показывающий связывание антитела 146B7 с ИЛ-15 после связывания ИЛ-15 с его рецептором, экспрессированным на клетках Raji. После инкубирования в течение 10 мин клеток Raji, экспрессирующих ИЛ-15R, с ИЛ-15 к клеткам добавляли биотинилированное 146B7. Связывание 146B7 с ИЛ-15, связанным с рецептором, определяют посредством анализа с использованием FACS (клеточный сортер с возбуждением флуоресценции). Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретения В данном изобретении представлены новые лекарственные препараты на основе антител для лечения и диагностики ряда нарушений, опосредованных ИЛ-15 (т.е. нарушений, вызываемых провоспалительными эффектами ИЛ-15). Как используют в данном контексте, термин "провоспалительные эффекты ИЛ-15" включает любой гуморальный или опосредованный клетками иммунный ответ, индуцируемый ИЛ-15, такой как продукция TNF- и других воспалительных медиаторов и рекрутирование/пролиферация T-клеток. В лекарственных препаратах, соответствующих изобретению, используют выделенные человеческие моноклональные антитела, которые специфически связываются с эпитопом,присутствующим на ИЛ-15. В одном из вариантов осуществления человеческие антитела образуются в организме трансгенного животного, отличного от человека, например трансгенной мыши, способной продуцировать множество изотипов человеческих моноклональных антител к ИЛ-15 (например, IgG, IgA и/или IgE) путем рекомбинации V-D-J и переключения изотипа. Соответственно различные аспекты изобретения включают антитела и их фармацевтические композиции, а также трансгенных животных, отличных от человека, B-клетки, трансфектомы клетки-хозяина и гибридомы для получения данных моноклональных антител. Изобретение охватывает также способы применения антител, соответствующих изобретению,для детекции клеток, с которыми связан ИЛ-15, и/или для подавления функций, опосредованных ИЛ-15 либо in vitro, либо in vivo. Включены также способы создания направленности агентов на клетки, с которыми связан ИЛ-15. Для того чтобы было легче понять данное изобретение, сначала дают определение некоторым терминам. Дополнительные определения представлены во всем тексте детального описания. Термины "ИЛ-15", "антиген ИЛ-15" и "интерлейкин 15" взаимозаменяемо используют в данном контексте, и они включают любые варианты и изоформы, которые в естественных условиях экспрессируются клетками. Термин "антитело", рассматриваемый в данном контексте, включает целые антитела и любой антигенсвязывающий фрагмент (т.е. "антигенсвязывающую часть") или одну цепь антитела. Термин "антитело" относится к гликопротеину, содержащему по меньшей мере две тяжелые (H) цепи и две легкие(L) цепи, связанные между собой дисульфидными связями, или их антигенсвязывающую часть. Каждая тяжелая цепь состоит из вариабельной области тяжелой цепи (сокращенно обозначаемой в данном контексте как VH) и константной области тяжелой цепи. Константная область тяжелой цепи состоит из трех доменов, CH1, CH2 и CH3. Каждая легкая цепь состоит из вариабельной области легкой цепи (сокращенно обозначаемой в данном контексте как VL) и константной области легкой цепи. Константная область легкой цепи состоит из одного домена CL. Области VH и VL могут далее подразделяться на участки гипервариабельности, называемые участками определения комплементарности (CDR), которые перемежаются с участками, являющимися более консервативными, называемыми каркасными (скелет-8 015897 ными) сегментами (FR). Каждая из VH и VL состоит из трех CDR и четырех FR, организованных в направлении от аминоконца к карбоксиконцу в следующем порядке: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3,FR4. Вариабельные области тяжелой и легкой цепей содержат связывающий домен, который взаимодействует с антигеном. Константные области антител могут опосредовать связывание иммуноглобулина с тканями или факторами хозяина, включающими различные клетки иммунной системы (например,эффекторные клетки) и первым компонентом (C1q) классической системы комплемента. Термин "антигенсвязывающая часть" антитела (или просто "часть антитела"), как используют в данном контексте, относится к одному или более фрагментам антитела, которые сохраняют способность специфически связывать антиген (например, EGFR). Показано, что антигенсвязывающая функция антитела может быть осуществлена фрагментами антитела полной длины. Примеры связывающих фрагментов, охватываемые термином "антигенсвязывающая часть" антитела, включают:(i) фрагмент Fab - моновалентный фрагмент, состоящий из доменов VL, VH, CL и CH1;(ii) фрагмент F(ab')2 - бивалентный фрагмент, содержащий два фрагмента Fab, связанных дисульфидным мостиком в шарнирной области;(iii) фрагмент Fd, состоящий из доменов VH и CH1;(iv) фрагмент Fv, состоящий из доменов VL и VH одного плеча антитела;(v) фрагмент dAb (см. статью Ward et al., Nature, 341: 544-546 (1989, который состоит из домена(vi) выделенный гипервариабельный участок (CDR) или(vii) комбинацию двух или более выделенных CDR, которые необязательно могут быть связаны с синтетическим линкером. Более того, хотя два домена фрагмента Fv, VL и VH, кодируются разными генами, они могут быть связаны с использованием рекомбинантных способов синтетическим линкером, который делает возможным получить их в виде одной белковой цепи, в которой области VL и VH связывают попарно с образованием моновалентных молекул (известных как одноцепочечные Fv (scFv); см., например, статьи(1988. Предусматривается, что данные одноцепочечные антитела также охватываются термином "антиген-связывающая часть" антитела. Данные фрагменты антитела получают с использованием принятых технологий, известных компетентным специалистам в области техники, и проводят скрининг фрагментов на возможность применения таким же образом, что интактные антитела. Термин "моноклональное антитело", как используют в данном контексте, относится к антителу,которое проявляет одну специфичность связывания и аффинность к конкретному эпитопу. Соответственно термин "человеческое моноклональное антитело" относится к антителам, проявляющим одну связывающую специфичность, которые имеют вариабельную и константную области, выделенные из последовательностей иммуноглобулина человеческих зародышевых линий. В одном из воплощений изобретения человеческие моноклональные антитела продуцируются гибридомой, которая включает Bклетку, полученную от трансгенного животного, отличного от человека, например трансгенной мыши,геном которой содержит трансген человеческой тяжелой цепи и трансген легкой цепи, слитую с иммортализованной клеткой. Термин "рекомбинантное человеческое антитело", как используют в данном контексте, предусматривает включение всех человеческих антител, которые получены, экспрессированы, созданы или выделены рекомбинантными способами, такими как: (a) антитела, выделенные у животного (например,мыши), которая является трансгенной или трансхромосомной по генам человеческого иммуноглобулина, или из гибридомы, полученной из него (описано далее в разделе I, ниже), (b) антитела, выделенные из клетки-хозяина, трансформированной таким образом, чтобы она экспрессировала антитело, например, из трансфектомы, (c) антитела, выделенные из библиотеки рекомбинантных комбинаторных человеческих антител, и (d) антитела, полученные, экспрессированные, созданные или выделенные любыми другими способами, которые включают сплайсинг последовательностей гена человеческого иммуноглобулина с другими последовательностями ДНК. Данные рекомбинантные человеческие антитела имеют вариабельную и константную области, выделенные из последовательностей иммуноглобулина человеческой зародышевой линии. Однако в ряде вариантов осуществления такие рекомбинантные человеческие антитела могут подвергаться мутагенезу in vitro (или при использовании животного,трансгенного по последовательностям человеческого Ig, соматическому мутагенезу in vivo), и таким образом последовательности аминокислот областей VH и VL рекомбинантного антитела представляют собой последовательности, которые, хотя и выделены из последовательностей VH и VL человеческой зародышевой линии и близки им, могут не существовать в природных условиях в репертуаре человеческих антител зародышевой линии in vivo. Как используют в данном контексте, термин "гетерологичное антитело" определяют относительно трансгенного организма, отличного от человека, продуцирующего данное антитело. Термин относится к антителу, имеющему последовательность аминокислот или кодирующую последовательность нуклеиновой кислоты, соответствующую последовательностям, обнаруженным в организме, который не является трансгенным животным, отличным от человека, и, как правило, выделенному у животного-9 015897 другого вида, чем трансгенное животное, отличное от человека. Термин "выделенное антитело", как используют в данном контексте, предназначен для определения антитела, которое практически не содержит другие антитела, имеющие отличные антигенные специфичности (например, выделенное антитело, которое специфически связывается с ИЛ-15, практически не содержит антитела, которые специфически связываются с антигенами, отличными от ИЛ-15). Выделенное антитело, которое специфически связывается с эпитопом ИЛ-15, может, однако, обладать перекрестной реактивностью с другими подобными цитокинами или другими белками ИЛ-15, выделенными у других видов. Однако антитело всегда предпочтительно связывается с человеческим ИЛ-15. Кроме того, выделенное антитело, как правило, практически не содержит другой клеточный материал и/или химические вещества. В одном из вариантов осуществления изобретения комбинацию "выделенных" моноклональных антител с различными специфичностями в отношении ИЛ-15 смешивают в хорошо определенной композиции. Как используют в данном контексте, термин "специфическое связывание" относится к связыванию антитела с заданным антигеном. Как правило, антитело связывается с аффинностью (KD) меньше чем приблизительно 10-7 М, такой как меньше чем приблизительно 10-8 М, 10-9 М или 10-10 М или даже ниже при определении с применением технологии поверхностного плазменного резонанса (SPR) с помощью прибора BIACORE 3000, при использовании рекомбинантного человеческого ИЛ-15 в качестве аналита и антитела в качестве лиганда. При этом антитело связывается с заданным антигеном с аффинностью, которая по меньшей мере в два раза превышает его аффинность связывания с неспецифическим антигеном (например, BSA, бычьим сывороточным альбумином, казеином), отличным от заданного антигена, или близкородственного антигена. Выражения "антитело, распознающее антиген" и "антитело, специфическое в отношении антигена" используют в данном контексте взаимозаменяемо с термином "антитело, которое специфически связывается с антигеном". Термин "KD", как используют в данном контексте, предназначен для определения константы диссоциации взаимодействия конкретного антитела и антигена. Как используется в данном контексте, термин "изотип" относится к классу антител (например,IgM или IgG1), кодируемых генами константной области тяжелой цепи. Как используется в данном контексте, термин "переключение изотипа" относится к феномену,вследствие которого класс, или изотип, антитела переходит из одного класса Ig в другие классы Ig. Как используется в данном контексте, термин "непереключенный изотип" относится к изотипическому классу тяжелой цепи, который образуется, когда не происходит никакого переключения изотипа; ген CH, кодирующий непереключенный изотип, как правило, представляет собой первый ген CH, расположенный по ходу транскрипции сразу после функционального реаранжированного гена VDJ. Переключение изотипа классифицируют как классическое и неклассическое переключение изотипа. Классическое переключение изотипа происходит посредством рекомбинационных событий, которые затрагивают по меньшей мере один участок переключающей последовательности в трансгене. Неклассическое переключение изотипа может происходить, например, путем гомологичной рекомбинации междучеловека ичеловека (-ассоциированная делеция). Возможно существование и осуществление переключения изотипа посредством альтернативных неклассических механизмов, таких как(среди прочих) интертрансгенная и/или интерхромосомная рекомбинация. Как используется в данном контексте, термин "переключающая последовательность" относится к таким последовательностям ДНК, которые отвечают за переключающую рекомбинацию. Последовательность "донора переключения", как правило, -участок переключения, будет расположена 5' (т.е. выше по ходу транскрипции) участка конструкции, который должен подвергнуться делеции при переключающей рекомбинации. Участок "акцептора переключения" будет находиться между константной областью, которая должна быть подвергнута делеции, и замещающей константной областью (например, ,и т.п.). В связи с отсутствием специфического сайта, в котором всегда происходит рекомбинация, конечную последовательность гена, как правило, нельзя будет предсказать, исходя из конструкции. Как используется в данном контексте, термин "тип гликозилирования" определяют как тип углеводных молекул, которые ковалентно связываются с белком, в частности с белком иммуноглобулина. Тип гликозилирования гетерологичного антитела может быть охарактеризован как в значительной степени близкий типам гликозилирования, которые существуют в естественных условиях на антителах,продуцируемых видами трансгенных животных, отличных от человека. При этом обычный компетентный специалист в данной области определил бы тип гликозилирования гетерологичного антитела, как более близкий к указанному типу гликозилирования у видов трансгенного животного, отличного от человека, чем у видов организмов, из которых были выделены гены CH трансгена. Термин "природный", как используется в данном контексте применительно к объекту, относится к тому факту, что объект можно обнаружить в естественных условиях. Например, полипептидная или полинуклеотидная последовательность, которая присутствует в организме (включая вирусы), которая- 10015897 может быть выделена из природного источника и которая не была преднамеренно модифицирована человеком в лабораторных условиях, является природной. Термин "реаранжированный", как используется в данном контексте, относится к конфигурации локуса тяжелой цепи или легкой цепи иммуноглобулина, где положение сегмента V находится в непосредственной близости к сегменту D-J или J в конформации, кодирующей в основном полный доменVH или VL соответственно. Реаранжированный локус гена иммуноглобулина может быть идентифицирован путем сравнения с ДНК зародышевой линии, реаранжированный локус будет содержать по меньшей мере один подвергнувшийся рекомбинации гептамерный/нонамерный гомологичный элемент. Термин "нереаранжированный" или "конфигурация зародышевой линии", как используется в данном контексте в отношении сегмента V, относится к конфигурации, в которой сегмент V не подвергся рекомбинации, при которой он находился бы в непосредственной близости к сегменту D или J. Термин "молекула нуклеиновой кислоты", как используется в данном контексте, предусматривает включение молекул ДНК и молекул РНК. Молекула нуклеиновой кислоты может быть однонитевой или двунитевой, но предпочтительно представлена двунитевой ДНК. Термин "выделенная молекула нуклеиновой кислоты", как используют в данном контексте применительно к нуклеиновым кислотам, кодирующим антитела или части антител (например, VH, VL,CDR3), которые связываются с ИЛ-15, предназначен для определения молекулы нуклеиновой кислоты,в которой нуклеотидные последовательности, кодирующие антитело или часть антитела, не содержат другие нуклеотидные последовательности, кодирующие антитела или части антител, которые связываются с антигенами, отличными от ИЛ-15. При этом данные другие последовательности могут в естественных условиях фланкировать указанную нуклеиновую кислоту в геномной ДНК человека. SEQ IDNO: 1-4 соответствуют нуклеотидным и аминокислотным последовательностям, содержащим вариабельные области тяжелой цепи (VH) и легкой цепи (VL) человеческого антитела 146B7 против ИЛ-15,соответствующего изобретению. В частности, SEQ ID NO: 1 и 2 соответствуют VH антитела 146B7,SEQ ID NO: 3 и 4 соответствуют VL антитела 146B7. Данное изобретение охватывает также "консервативные модификации последовательности", касающиеся последовательностей, представленных в SEQ ID NO: 1-4, т.е. модификации нуклеотидных и аминокислотных последовательностей, которые не оказывают существенного воздействия или не изменяют характеристик связывания антитела, кодируемого нуклеотидной последовательностью или содержащего аминокислотную последовательность. Данные консервативные модификации последовательности включают замены, добавления и делеции нуклеотидов и аминокислот. Модификации могут быть интродуцированы в SEQ ID NO: 1-4 посредством стандартных технологий, известных в области техники, таких как сайт-направленный мутагенез и ПЦР (полимеразная цепная реакция)опосредованный мутагенез. Консервативные замены аминокислот включают замены, при которых остаток аминокислоты заменяют остатком аминокислоты, имеющим аналогичную боковую цепь. В области техники определены семейства остатков аминокислот, имеющих аналогичные боковые цепи. Данные семейства включают аминокислоты с основными боковыми цепями (например, лизин, аргинин,гистидин), кислотными боковыми цепями (например, аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота),незаряженными полярными боковыми цепями (например, глицин, аспарагин, глутамин, серин, треонин,тирозин, цистеин, триптофан), неполярными боковыми цепями (например, аланин, валин, лейцин изолейцин, пролин, фенилаланин, метионин), -разветвленными боковыми цепями (например, треонин,валин, изолейцин) и ароматическими боковыми цепями (например, тирозин, фенилаланин, триптофан,гистидин). Таким образом, предсказанный остаток неосновной аминокислоты в человеческом антителе против ИЛ-15 предпочтительно заменяют другим остатком аминокислоты из того же семейства боковых цепей. Альтернативно, в другом варианте осуществления возможна интродукция мутаций случайным образом на протяжении всей последовательности, кодирующей антитело против ИЛ-15, или ее части, в частности, путем насыщающего мутагенеза, и может быть проведен скрининг полученных в результате модифицированных антител против ИЛ-15 на активность связывания. Соответственно антитела, кодируемые нуклеотидными последовательностями (вариабельной области тяжелой и легкой цепей), описанными в данном контексте, и/или содержащие аминокислотные последовательности (вариабельной области тяжелой и легкой цепи), описанные в данном контексте(т.е. SEQ ID NO: 1-4), включают практически аналогичные антитела, кодируемые близкими последовательностями или содержащие близкие последовательности, которые были консервативно модифицированы. Ниже приведено дальнейшее обсуждение, касающееся того, как можно получить практические аналогичные антитела на основе частичных последовательностей (т.е. вариабельных областей тяжелой и легкой цепей), представленных в данном контексте как SEQ ID NO: 1-4. Для нуклеиновых кислот термин "существенная гомология" показывает, что две нуклеиновые кислоты или их обозначенные последовательности при оптимальном выравнивании и сравнении являются идентичными (при наличии соответствующих инсерций или делеций нуклеотидов) по меньшей мере приблизительно на 80% нуклеотидов, обычно по меньшей мере приблизительно на 90-95% и более предпочтительно по меньшей мере приблизительно на 98-99,5% нуклеотидов. Альтернативно, имеется- 11015897 существенная гомология, когда сегменты гибридизуются в условиях селективной гибридизации с комплементом нити. Для последовательностей аминокислот термин "гомология" показывает степень идентичности между двумя последовательностями аминокислот, когда их оптимальным образом выравнивают и сравнивают с соответствующими инсерциями и делециями. Процент идентичности двух последовательностей представляет собой функцию числа идентичных положений, общих для последовательностей (т.е. % гомологии = числу идентичных положений/общее число положений 100), с учетом числа гэпов (двунитевых разрывов) и длины каждого гэпа, которые необходимо ввести для оптимального элайнмента (способа сравнения с использованием выравнивания последовательностей) двух последовательностей. Сравнение последовательностей и определение процента идентичности двух последовательностей можно осуществить с использованием математического алгоритма, как описано ниже в неограничивающих примерах. Процент идентичности двух нуклеотидных последовательностей можно определить с помощью программы GAP в пакете программного обеспечения GCG (см. http://www.gcg.com) при использовании матрицы NWSgapdna.CMP и веса гэпа 40, 50, 60, 70 или 80 и веса длины 1, 2, 3, 4, 5 или 6. Процент идентичности двух нуклеотидных или аминокислотных последовательностей можно также определить с использованием алгоритма, предложенного E. Meyers и W. Miller (см. CABIOS, 4:11-17 (1988, введенные в программу ALIGN (версия 2.0), с использованием таблицы весов остатков РАМ 120, поправочного коэффициента длины гэпа 12 и поправочного коэффициента гэпа 4. Кроме того, можно определить процент идентичности двух аминокислотных последовательностей, используя алгоритм Needleman и Wunsch (см. J. Mol. Biol., 48:444-453 (1970, введенный в программу GAP в пакете программного обеспечения GCG (см. http://www.gcg.com) при использовании либо матрицы Blossum 62, либо матрицы PAM250 и веса гэпа 40, 50, 60, 70 или 80 и веса длины 1, 2, 3, 4, 5 или 6. Кроме того, последовательности нуклеиновых кислот и белков, соответствующие данному изобретению, могут быть использованы в качестве "запрашивающей последовательности" для проведения поиска в общедоступных базах данных, например, с целью идентификации близких последовательностей. Такой поиск может быть предпринят с использованием программ NBLAST и XBLAST (версия 2.0), представленных в работе Altschul и соавт., J. Mol. Biol., 215:403-10 (1990). Поиск нуклеотидовBLAST может быть осуществлен с помощью программы NBLAST (сумма баллов = 100, длина слова = 12) с целью получения нуклеотидных последовательностей, гомологичных молекулам нуклеиновых кислот, соответствующих изобретению. Поиск белка BLAST можно выполнить с помощью программыXBLAST (сумма баллов = 50, длина слова = 3) с целью получения аминокислотных последовательностей, гомологичных белковым молекулам, соответствующим изобретению. Для получения выровненных последовательностей с гэпами с целью проведения сравнения можно использовать Gapped BLAST,как описано в статье Altschul и соавт., Nucleic Acids Res., 25 (17):3389-3402 (1997). При использовании программ BLAST и Gapped BLAST могут быть использованы параметры умолчания соответствующих программ (например, XBLAST и NBLAST), см. http://www.ncbi.nlm.nih.gov. Нуклеиновые кислоты могут присутствовать в целых клетках, в лизатах клеток или в частично очищенной или практически чистой форме. Нуклеиновая кислота считается "выделенной" или "практически чистой", когда она очищена от других клеточных компонентов или иных примесей, например других клеточных нуклеиновых кислот или белков стандартными методиками, включая обработку щелочью/SDS (додецилсульфатом натрия), разделение при центрифугировании в градиенте CsCl, колоночную хроматографию, электрофорез в агарозном геле и другие методики, хорошо известные в области техники. См. монографию под ред. F. Ausubel и соавт. Современные методы молекулярной биологии(Current Protocols in Molecular Biology), Greene Publishing and Wiley Interscience, New York (1987). Для получения последовательностей генов композиции нуклеиновых кислот, соответствующие данному изобретению, зачастую в нативной последовательности (за исключением модифицированных сайтов рестрикции и т.п.), из кДНК, геномной ДНК или их смесей, могут быть подвергнуты мутированию согласно стандартным методикам. В кодирующих последовательностях данные мутации могут,если это желательно, затрагивать аминокислотную последовательность. В частности, имеются в виду последовательности ДНК с существенной гомологией или выделенные из нативных последовательностей V, D, J, константных, переключающих или других последовательностей, описанных в данном контексте (в данном случае "выделенный" означает, что последовательность является идентичной другой последовательности или ее модифицированной формой). Нуклеиновая кислота считается "функционально связанной", когда она находится в функциональной связи с другой последовательностью нуклеиновой кислоты. Например, промотор или энхансер являются функционально связанными с кодирующей последовательностью, если они воздействуют на транскрипцию данной последовательности. Касательно последовательностей регуляции транскрипции,термин "функционально связанные" означает, что последовательности ДНК, будучи связанными, прилегают друг к другу и, при необходимости соединения двух участков, кодирующих белки, прилегают друг к другу и находятся в рамке считывания. Для переключающих последовательностей быть функционально связанными означает, что последовательности способны к осуществлению переключающей- 12015897 рекомбинации. Термин "вектор", как используют в данном контексте, предназначен для определения молекулы нуклеиновой кислоты, способной транспортировать другую нуклеиновую кислоту, с которой он связан. Одним из типов вектора является "плазмида", что означает кольцевую петлю двунитевой ДНК, с которой можно лигировать дополнительные сегменты ДНК. Другой тип вектора представлен вирусным вектором, где дополнительные сегменты ДНК могут быть лигированы в геном вируса. Некоторые векторы способны к автономной репликации в клетке-хозяине, в которую они интродуцированы (например, бактериальные векторы, имеющие бактериальный ориджин репликации, и эписомные векторы млекопитающих). Другие векторы (например, неэписомные векторы млекопитающих) могут быть интегрированы в геном клетки-хозяина посредством интродукции в клетку-хозяин и, таким образом, реплицироваться вместе с геномом хозяина. Более того, некоторые векторы способны направлять экспрессию генов, с которыми они функционально связаны. Данные векторы определяют в данном контексте как "рекомбинантные экспрессионные векторы" (или просто "экспрессионные векторы"). Как правило,экспрессионные векторы, используемые в технологиях рекомбинантной ДНК, часто представлены плазмидными формами. В данном описании термины "плазмида" и "вектор" могут использоваться взаимозаменяемо, поскольку плазмида представляет собой наиболее часто используемую форму вектора. Однако изобретение предусматривает включение других форм экспрессионных векторов, таких как вирусные векторы (например, репликационно-дефектные ретровирусы, аденовирусы и аденоассоциированные вирусы), которые осуществляют эквивалентные функции. Термин "рекомбинантная клетка-хозяин" (или просто "клетка-хозяин"), как используют в данном контексте, предназначен для определения клетки, в которую интродуцирован рекомбинантный экспрессионный вектор. Следует понимать, что данные термины предназначены не только для определения данной конкретной клетки, но и потомства такой клетки. Поскольку в последующих поколениях могут произойти определенные модификации либо вследствие мутаций, либо под воздействием окружающей среды, данное потомство в действительности может не быть идентичным родительской клетке, но может еще быть включено в объем термина "клетка-хозяин", как используют в данном контексте. Как используют в данном контексте, термин "субъект" включает любого человека или отличное от человека животное. Например, способы и композиции, соответствующие данному изобретению, могут быть использованы для лечения субъекта с воспалительным заболеванием, таким как артрит, например ревматоидный артрит. Термин "животное, отличное от человека" включает всех позвоночных,например млекопитающих и немлекопитающих, таких как отличные от человека приматы, овца, собака, корова, курицы, амфибии, рептилии и т.п. В последующих подразделах различные аспекты изобретения описаны более детально.I. Получение человеческих антител к ИЛ-15. Человеческие моноклональные антитела, соответствующие изобретению, можно получить с использованием множества известных технологий, таких как стандартная технология гибридизации соматических клеток Kohler и Milstein (см. Nature, 256:495 (1975. Хотя процедуры гибридизации соматических клеток являются предпочтительными, в принципе могут быть использованы другие технологии получения моноклональных антител, например трансформация B-лимфоцитов вирусами или онкогенами, технология представления на фагах с использованием библиотек генов человеческих антител. Предпочтительной системой получения гибридом, которые продуцируют человеческие моноклональные антитела, соответствующие изобретению, на основе является система на основе мышей или крыс. Получение гибридомы с использованием мышей хорошо известно в области техники, включая протоколы иммунизации и технологии выделения и слияния иммунизированных спленоцитов. В одном из вариантов осуществления человеческие моноклональные антитела, направленные против ИЛ-15, получают с использованием трансгенных или трансхромосомных мышей, несущих части человеческой иммунной системы, а не мышиной системы. В одном из вариантов осуществления в изобретении используют трансгенных мышей, обозначаемых в данном контексте как "мыши HuMAb", которые содержат минилокусы гена человеческого иммуноглобулина, кодирующие нереаранжированные последовательности тяжелой ( и ) и -легкой цепей иммуноглобулина, а также направленные мутации, которые инактивируют эндогенные локусы - и -цепей (см. статью Lonberg и соавт., Nature, 368(6474):856-859 (1994. Соответственно у мышей проявляется пониженная экспрессия мышиного IgM или , и в ответ на иммунизацию интродуцированные трансгены человеческой тяжелой и легкой цепей подвергаются переключению класса и соматической мутации с образованием высокоаффинных человеческих моноклональных антител IgG (см. статью Lonberg N. и соавт., supra (1994); обзор в монографии Lonberg, N. Справочник по экспериментальной фармакологии (Handbook of Experimental Pharmacology) 113:49-101 (1994); статьи Lonberg N. и Huszar D., Intern. Rev. Immunol., т. 13:65-93 (1995) иChen J. и соавт., International Immunology, 5:647-656 (1993); Tuaillon и соавт., Proc. Natl. Acad. Sci. USA,90:3720-3724 (1993); Choi и соавт., Nature Genetics, 4:117-123 (1993); Chen J. и соавт., EMBO J., 12:821- 13015897 830 (1993); Tuaillon и соавт., J. Immunol., 152:2912-2920 (1994); Lonberg и соавт., Nature, 368 (6474):856859 (1994); Lonberg N., Справочник по экспериментальной фармакологии (Handbook of ExperimentalN. и Huszar D., Intern. Rev. Immunol., т. 13:65-93 (1995); Harding F. и Lonberg N., Ann. N. Y. Acad. Sci.,764:536-546 (1995); Fishwild D. и соавт., Nature Biotechnology, 14:845-851 (1996). Кроме того, см. патенты США 5545806, 5569825, 5625126, 5633425, 5789650, 5877397, 5661016, 5814318, 5874299 и 5770429, все из которых выданы Lonberg и Kay и GenPharm International, патент США 5545807, выданный Surani и соавт.; международная публикацияWO 98/24884, опубликованная 11 июня 1998 г., WO 94/25585, опубликованная 10 ноября 1994 г., WO 93/1227, опубликованная 24 июня 1993 г., WO 92/22645, опубликованная 23 декабря 1992 г., WO 92/03918, опубликованная 19 марта 1992 г. В частности, получение трансгенных мышей HuMab HCO12 описано в примере 2. Иммунизации. Для генерации полностью человеческих моноклональных антител к ИЛ-15 трансгенных или трансхромосомных мышей, несущих гены человеческого иммуноглобулина (например, мышей HCo12,HCo7 или KM) можно иммунизировать очищенным или обогащенным препаратом антигена ИЛ-15 и/или клеток, экспрессирующих ИЛ-15, как описано, например, в статьях Lonberg и соавт., Nature, 368(6474):856-859 (1994); Fishwild и соавт., Nature Biotechnology, 14:845-851 (1996) и в публикации WO 98/24884. Альтернативно, мыши могут быть иммунизированы ДНК, кодирующей человеческий ИЛ-15. Предпочтительно, когда для первого вливания используют мышей в возрасте 6-16 недель. Например,очищенный или обогащенный препарат (5-50 мкг) антигена ИЛ-15 может быть использован для внутрибрюшинной иммунизации мышей HuMAb. В случае, когда иммунизации с использованием очищенного или обогащенного препарата антигена ИЛ-15 не приводят к образованию антител, мышей можно также иммунизировать клетками, экспрессирующими ИЛ-15, например клеточной линией, с целью стимуляции иммунных ответов. Обобщенный опыт работы с различными антигенами показывает, что трансгенные мыши HuMAb дают наилучший ответ при изначальной внутрибрюшинной (IP) или подкожной (SC) иммунизации антигеном в полном адъюванте Фрейнда с последующими еженедельнымиIP/SC иммунизациями (в целом до 10 раз) антигеном в неполном адъюванте Фрейнда. Иммунный ответ можно мониторировать в ходе протокола иммунизации с использованием образцов плазмы, получаемых при отборе крови из ретроорбитальной вены. Проводят скрининг образцов плазмы с помощьюELISA (как описано ниже) и мышей с достаточными титрами человеческого иммуноглобулина против ИЛ-15 используют для слияний. Мышам проводят бустерную иммунизацию путем внутривенного введения антигена за 3 дня до умерщвления и удаления селезенки. Получение гибридом, продуцирующих человеческие моноклональные антитела к ИЛ-15. Для получения гибридом, продуцирующих человеческие моноклональные антитела к ИЛ-15,спленоциты и клетки лимфатических узлов иммунизированной мыши могут быть выделены и слиты с подходящей иммортализованной клеточной линией, такой как клеточная линия мышиной миеломы. Затем проводят скрининг полученных гибридом на продукцию антигенспецифических антител. Например, суспензии отдельных клеток лимфоцитов селезенки, полученных от иммунизированных мышей, сливают с несекретирующими клетками мышиной миеломы SP2/0-AG8.653 (АТСС (Американская коллекция типовых культур), CRL 1580) с использованием 50% PEG (мас./об.). Клетки в концентрации приблизительно 1105 помещают в плоскодонные платы для микротитрования с последующим инкубированием в течение двух недель в селективной среде, содержащей кроме обычных реагентов 10% эмбриональной Clone Serum (сыворотки для клонирования), 5-10% фактора клонирования гибридом origen (IGEN) и 1HAT (среда ГАТ, содержащая гипоксантин-аминоптерин-тимидин) (Sigma). Приблизительно через две недели клетки можно культивировать в среде, где HAT заменена HT (среда ГТ, содержащая гипоксантин-тимидин). Затем проводят скрининг отдельных лунок с помощью ELISA на человеческие моноклональные антитела IgM и IgG против ИЛ-15. Как правило, после начала сильного роста гибридом среду исследуют через 10-14 дней. Гибридомы, секретирующие антитела, переносят на другие платы, снова проводят скрининг и, если они остаются положительными в отношении человеческих моноклональных антител IgG против ИЛ-15, их субклонируют, по меньшей мере, дважды путем ограничивающего разведения. Затем стабильные субклоны культивируют in vitro в среде для культур тканей с целью получения антитела для характеризации. Получение трансфектом, продуцирующих человеческие моноклональные антитела к ИЛ-15. Человеческие антитела, соответствующие изобретению, также можно получить в трансфектоме клетки-хозяина при использовании, например, комбинации технологии рекомбинантной ДНК и способов трансфекции гена, как это хорошо известно в области техники (см. статью Morrison S., Science,229:1202 (1985. Например, в одном из вариантов осуществления ген(ы), представляющий интерес, в частности гены человеческого антитела, могут быть лигированы в экспрессионный вектор, такой как эукариотическая экспрессионная плазмида, такая как используют в системе экспрессии гена GS, описанной в публикациях WO 87/04462, WO 89/01036 и EP 338841, или других экспрессионных системах, хорошо из- 14015897 вестных в области техники. Очищенную плазмиду с клонированными генами антитела интродуцируют в эукариотические клетки-хозяева, например клетки CHO или клетки NSO, или, альтернативно, в другие эукариотические клетки, например клетки, выделенные из растений, грибов или дрожжей. Способ,используемый для интродукции данных генов, может быть представлен способами, описанными в области техники, такими как электропорация, использование липофектина, липофектамина или иными способами. После интродукции данных генов антител в клетки-хозяева можно идентифицировать и селектировать клетки, экспрессирующие антитело. Данные клетки представляют собой трансфектомы,которые затем могут быть размножены на основе уровня экспрессии и масштабированы для получения антител. Из супернатантов и/или клеток данных культур можно выделить и очистить рекомбинантные антитела. Альтернативно, данные клонированные гены антител можно экспрессировать в других экспрессионных системах, таких как E. coli или целые организмы, или они могут быть экспрессированы синтетическим путем. Использование частичной последовательности антитела для экспрессии интактных антител. Антитела взаимодействуют с антигенами-мишенями в основном посредством аминокислотных остатков, которые находятся в шести гипервариабельных участках (CDR) тяжелой и легкой цепей. По этой причине аминокислотные последовательности внутри CDR являются более разнообразными среди отдельных антител, чем последовательности вне CDR. Поскольку последовательности CDR отвечают за большинство взаимодействий антитела и антигена, можно экспрессировать рекомбинантные антитела, которые имитируют свойства специфических природных антител путем конструирования экспрессионных векторов, которые включают последовательности CDR из специфического природного антитела, привитые на каркасные последовательности из другого антитела с другими свойствами (см., например, статьи Riechmann L. и соавт., Nature, 332:323-327 (1998); Jones P. и соавт., Nature, 321:522-525(1986) и Queen C. и соавт., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 86:10029-10033 (1989. Данные каркасные последовательности могут быть получены из общедоступных баз данных ДНК, которые включают последовательности генов антител зародышевой линии. Данные последовательности зародышевой линии будут отличаться от последовательностей генов зрелого антитела, поскольку они не будут включать полностью собранные вариабельные гены, которые формируются путем связывания V(D)J в процессе созревания B-клеток. Последовательности генов зародышевой линии также будут отличаться от последовательностей высокоаффинного антитела из вторичного репертуара характерным равномерным расположением в вариабельной области. Например, соматические мутации относительно редко встречаются в аминоконцевой части каркасного сегмента. В частности, соматические мутации относительно редко встречаются в аминоконцевой части каркасного сегмента 1 и в карбоксиконцевой части каркасного сегмента 4. Более того, многие соматические мутации не изменяют существенным образом связывающие свойства антитела. В связи с этим нет необходимости в получении полной последовательности ДНК конкретного антитела с целью воссоздания интактного рекомбинантного антитела, имеющего свойства связывания, аналогичные данным свойствам исходного антитела (см. публикацию PCT/US 99/05535, зарегистрированную 12 марта 1999 г.). Как правило, для этой цели является достаточным охват участков CDR частичных последовательностей тяжелой и легкой цепей. Частичную последовательность используют для определения, какие вариабельные и связывающие сегменты генов зародышевой линии участвуют в образовании вариабельных генов рекомбинированного антитела. Кроме того,последовательность зародышевой линии используют для заполнения утраченных частей вариабельных областей. Лидерные последовательности тяжелой и легкой цепи расщепляются в процессе созревания белка и не вносят вклад в формирование свойств конечного антитела. Для восполнения утраченных последовательностей клонированные последовательности кДНК можно комбинировать с синтетическими олигонуклеотидами путем лигирования или ПЦР-амплификации. Альтернативно, целая вариабельная область может быть синтезирована как набор коротких перекрывающихся олигонуклеотидов и скомбинирована посредством ПЦР-амплификации с целью создания полностью синтетического клона вариабельной области. Данный процесс обладает рядом преимуществ, таких как элиминация или включение определенных сайтов рестрикции или оптимизация определенных кодонов. Нуклеотидные последовательности транскриптов тяжелой и легкой цепей из гибридом используют для конструирования перекрывающегося набора синтетических олигонуклеотидов с целью создания синтетических Vпоследовательностей со способностями кодирования аминокислот, идентичными способностям природных последовательностей. Синтетические последовательности тяжелой и -цепи могут отличаться от природных последовательностей по трем направлениям: цепи повторяющихся нуклеотидных оснований прерывают для облегчения синтеза олигонуклеотидов и ПЦР-амплификации, инкорпорируют оптимальные сайты инициации трансляции согласно правилам Kozak (см. статью Kozak, J. Biol. Chem.,266L19867019870 (1991 и конструируют сайты HindIII, расположенные выше по ходу транскрипции относительно сайтов инициации трансляции. Для оптимизированного кодирования и соответствующего некодирования вариабельных областей как тяжелой, так и легкой цепи последовательности цепей разбивают на фрагменты из 30-50 нуклеотидов примерно в середине соответствующего некодирующего олигонуклеотида. Таким образом, для ка- 15015897 ждой цепи можно собрать олигонуклеотиды в перекрывающиеся двунитевые наборы, которые заполняют сегменты из 150-400 нуклеотидов. Затем пулы используют как матрицы для получения продуктов ПЦР-амплификации из 150-400 нуклеотидов. Как правило, один набор олигонуклеотидов вариабельной области разбивают на два пула, которые раздельно амплифицируют с получением двух перекрывающихся продуктов ПЦР. Затем данные перекрывающиеся продукты комбинируют путем ПЦРамплификации с образованием полной вариабельной области. Для создания фрагментов, легко клонируемых в конструкции экспрессионных векторов, может быть также желательным включение в ПЦРамплификацию перекрывающегося фрагмента константной области тяжелой или легкой цепи (в том числе сайта BbsI -легкой цепи или сайта AgeI -тяжелой цепи). Затем реконструированные вариабельные области тяжелой и легкой цепей смешивают с клонированными промотором, лидерной последовательностью, последовательностью инициации трансляции,лидерной последовательностью, последовательностями константной области, 3'-нетранслируемого участка, участка полиаденилирования и терминации транскрипции с целью формирования конструкций экспрессионного вектора. Конструкции для экспрессии тяжелой и легкой цепей могут быть скомбинированы в одном векторе, котрансфицированы, серийно трансфицированы или раздельно трансфицированы в клетки-хозяева, которые затем сливают с образованием клетки-хозяина, экспрессирующей обе цепи. Плазмиды, используемые в конструкциях экспрессионных векторов для человеческого IgG-,описаны ниже (см. пример 1). Плазмиды сконструированы таким образом, чтобы ПЦРамплифицированные последовательности кДНК V-тяжелой и Vлегкой цепей можно было бы использовать для реконструкции минигенов полной тяжелой и легкой цепей. Данные плазмиды могут быть использованы для экспрессии полностью человеческих антител IgG1- или IgG4-. Полные человеческие и химерные антитела, соответствующие данному изобретению, включают также антителаIgG2, IgG,3 IgE, IgA, IgM и IgD. Могут быть сконструированы подобные плазмиды для экспрессии других изотипов тяжелых цепей или для экспрессии антител, содержащих -легкие цепи. Таким образом, в другом аспекте изобретения структурные свойства человеческих антител против ИЛ-15, соответствующих изобретению (146B7, 147 Н 5, 404A8 и 404E4), используют для создания структурно близких человеческих антител против ИЛ-15, которые сохраняют по меньшей мере одно функциональное свойство антител, соответствующих изобретению, такое как связывание с ИЛ-15. В частности, один или более участков CDR 146B7,147 Н 5, 404A8 и 404E4 могут быть скомбинированы рекомбинантным образом с известными человеческими каркасными сегментами и CDR для создания дополнительных, рекомбинантно-инжнерных человеческих антител против ИЛ-15, соответствующих изобретению. Соответственно в другом варианте осуществления изобретение представляет способ получения антитела против ИЛ-15, предусматривающий получение антитела, содержащего: (1) каркасные сегменты человеческой тяжелой цепи и CDR человеческой тяжелой цепи, где по меньшей мере один из CDR человеческой тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность, выбранную из аминокислотных последовательностей CDR, представленных на фиг. 2 (или соответствующих аминокислотных остатков в SEQ ID NO: 2), и (2) каркасные сегменты человеческой легкой цепи и CDR человеческой легкой цепи, где по меньшей мере один из CDR человеческой легкой цепи содержит аминокислотную последовательность, выбранную из аминокислотных последовательностей CDR, представленных на фиг. 3 (или соответствующих аминокислотных остатков в SEQ ID NO: 4), где антитело сохраняет способность связываться с ИЛ-15. Способность антитела связывать ИЛ-15 можно установить с использованием стандартных анализов связывания, таких как приведенные в примерах (например, ELISA). Поскольку в области техники хорошо известно, что домены CDR3 тяжелой и легкой цепей антитела играют исключительно важную роль в специфичности связывания/аффиности антитела к антигену, рекомбинантные антитела, соответствующие изобретению, полученные как представлено выше,предпочтительно содержат CDR3 тяжелой и легкой цепей 146B7, 147H5, 404A8 и 404E4. Кроме того,антитела могут содержать CDR2 146B7, 147 Н 5, 404A8 и 404E4. Далее антитела могут содержать CDR1 146B7, 147 Н 5, 404A8 и 404E4. Кроме того, антитела могут содержать любые комбинации CDR. Соответственно в другом варианте осуществления изобретение далее представляет антитела против ИЛ-15, содержащие: (1) каркасные сегменты человеческой тяжелой цепи, участок CDR1 человеческой тяжелой цепи, участок CDR2 человеческой тяжелой цепи и участок CDR3 человеческой тяжелой цепи, где участок CDR3 человеческой тяжелой цепи выбран из CDR3 146B7, 147 Н 5, 404A8 и 404E4,например представлен участком CDR человеческой тяжелой цепи 146B7, как показано на фиг. 2 (или соответствующими аминокислотными остатками в SEQ ID NO: 2), и (2) каркасные сегменты человеческой легкой цепи, участок CDR1 человеческой легкой цепи, участок CDR2 человеческой легкой цепи и участок CDR3 человеческой легкой цепи, где участок CDR3 человеческой легкой цепи выбран из CDR3 146B7, 147 Н 5, 404A8 и 404E4, например представлен участком CDR человеческой тяжелой цепи 146B7, как показано на фиг. 3 (или соответствующими аминокислотными остатками в SEQ ID NO: 4).- 16015897 При этом антитело связывает ИЛ-15. Кроме того, антитело может содержать CDR2 тяжелой цепи и/илиCDR2 легкой цепи 146B7, 147 Н 5, 404A8 и 404E4. Далее антитело может содержать CDR1 тяжелой цепи и/или CDR1 легкой цепи 146B7, 147 Н 5, 404A8 и 404E4. Участки CDR1, 2 и/или 3 вышеописанных инженерных антител содержат точно такую же аминокислотную последовательность(и), как у 146B7, 147 Н 5, 404A8 и 404E4, представленные в данном контексте. Однако обычный компетентный специалист примет во внимание возможность некоторого отклонения от точных последовательностей CDR 146B7, 147 Н 5, 404A8 и 404E4 при сохранении способности антитела эффективно связывать ИЛ-15 (например, консервативные модификации последовательностей). Соответственно в другом варианте осуществления инженерное антитело может состоять из одного или более CDR, которые, например, на 90, 95, 98 или 99,5% идентичны одному или более CDR 146B7, 147 Н 5, 404A8 и 404E4. Кроме того, для простого связывания ИЛ-15 инженерные антитела, такие как описано выше, могут быть отобраны на основании их удерживания или других функциональных свойств антител, соответствующих изобретению, таких как:(3) связывание человеческого ИЛ-15 с константой равновесия диссоциации (KD) меньше чем приблизительно 10-7 М при определении с применением технологии поверхностного плазменного резонанса (SPR) с помощью прибора BIACORE 3000 с использованием рекомбинантного человеческого ИЛ-15 в качестве аналита и антитела в качестве лиганда;(4) связывание эпитопа, находящегося на домене ИЛ-15, взаимодействующем с -и/или -цепью;(7) связывание с человеческим ИЛ-15 и ингибирование способности человеческого ИЛ-15 индуцировать паракератоз;(8) связывание с человеческим ИЛ-15 и ингибирование способности человеческого ИЛ-15 индуцировать утолщение эпидермиса;(9) связывание с человеческим ИЛ-15 и ингибирование способности человеческого ИЛ-15 индуцировать пролиферацию кератиноцитов и/или(10) связывание с человеческим ИЛ-15 и ингибирование способности человеческого ИЛ-15 индуцировать хемотаксис активированных лейкоцитов. Характеризация связывания человеческих моноклональных антител с ИЛ-15. Человеческие моноклональные антитела, соответствующие изобретению, могут быть охарактеризованы по связыванию с ИЛ-15 с использованием множества известных методик. Как правило, изначально антитела характеризуют с использованием ELISA. Вкратце, платы для микротитрования покрывают очищенным ИЛ-15 в PBS (фосфатно-буферном растворе), а затем блокируют несоответствующими белками, такими как бычий сывороточный альбумин (BSA), разведенными в PBS. В каждую лунку вносят разведения плазмы мышей, иммунизированных ИЛ-15, и инкубируют в течение 1-2 ч при 37C. Платы промывают PBS/Твином 20, а затем инкубируют с козьим Fc-специфическим поликлональным реагентом против человеческого IgG, конъюгированным с щелочной фосфатазой, в течение 1 ч при 37C. После отмывания платы проявляют с использованием субстрата ABTS и анализируют при OD(оптическая плотность) 405. Предпочтительно использование для слияний мышей, имеющих максимальные титры. Способ ELISA, как описано выше, также может быть использован для скрининга антител, и, следовательно, гибридом, которые продуцируют антитела, проявляющие положительную реактивность с иммуногеном ИЛ-15. Гибридомы, которые (предпочтительно с высокой аффинностью) связываются с ИЛ-15, затем субклонируют и характеризуют дополнительно. Один клон каждой гибридомы, который сохраняет реактивность родительских клеток (по данным ELISA), затем может быть выбран для создания банка клеток и очистки антитела. Для очистки человеческих антител против ИЛ-15 отобранные гибридомы выращивают в роллерных флаконах, двухлитровых роллерных колбах или в других системах для культивирования. Перед проведением аффинной хроматографии с использованием белка A-сефарозы (Pharmacia, Piscataway, NJ) супернатанты могут быть отфильтрованы и сконцентрированы. После замены буферного раствора наPBS концентрацию можно определить при OD280 с использованием коэффициента экстинкции 1,43 или,что предпочтительно, с помощью нефелометрического анализа. IgG может быть проверен с помощью гель-электрофореза и способом с использованием специфичности антител. Чтобы определить, могут ли отобранные человеческие моноклональные антитела против ИЛ-15 связываться с уникальными эпитопами, каждое антитело биотинилируют с использованием имеющихся в продаже реагентов (Pierce, Rockford, IL). Связывание биотинилированных Mab (моноклональные- 17015897 антитела) может быть определено с использованием зонда, меченного стрептавидином. Для определения изотипа очищенных антител можно провести ELISA изотипов с использованием известных в области техники методик. Например, лунки платы для микротитрования покрывают 10 мкг/мл Ig против человека в течение ночи при 4C. После блокирования с помощью 5% BSA в платах проводят реакцию с 10 мг/мл моноклональных антител или контрольных очищенных изотипов при комнатной температуре в течение 2 ч. Затем в лунках проводят реакцию либо с человеческим IgG1, либо с зондами, конъюгированными с агентом, специфическим в отношении другого человеческого изотипа. Платы проявляют и анализируют, как описано выше. Для демонстрации связывания моноклональных антител с живыми клетками, экспрессирующими ИЛ-15, можно использовать проточную цитометрию. Вкратце,клеточные линии и/или человеческие PBMC, экспрессирующие связанный с мембраной ИЛ-15 (выращенные в стандартных условиях роста), смешивают с различными концентрациями моноклональных антител в PBS, содержащим 0,1% BSA и 0,01% NaN3 при 4C в течение 1 ч. После промывания проводят реакцию клеток с меченным флуоресцеином антителом против человеческого IgG в тех же условиях, что окрашивание первичного антитела. Образцы анализируют с помощью устройства FACScan(клеточный сортер с возбуждением флуоресценции) с использованием характеристик света и бокового рассеяния дискриминационного окна для отдельных клеток, при этом определяют связывание меченых антител. В дополнение или вместо проточного цитометрического анализа может быть использован альтернативный способ анализа с использованием флуоресцентной микроскопии. Клетки окрашивают точно так, как описано выше, и исследуют с помощью флуоресцентной микроскопии. Данный способ позволяет визуализировать отдельные клетки, но он может иметь пониженную чувствительность в зависимости от плотности антигена. Кроме того, человеческие IgG против ИЛ-15 могут быть протестированы на реактивность с антигеном ИЛ-15 с помощью вестерн-блоттинга. Вкратце, получают экстракты из клеток, экспрессирующих ИЛ-15, и подвергают их электрофорезу в полиакриламидном геле с использованием додецилсульфата натрия (SDS). После электрофореза разделенные антигены переносят на нитроцеллюлозные мембраны,блокируют 20% мышиной сывороткой и зондируют с помощью тестируемых моноклональных антител. Связывание человеческого IgG можно определить с использованием IgG против человека-щелочной фосфатазы и проявить таблетированным субстратом BCIP/NBT (Sigma Chem. Co., St. Louis, MO).II. Получение трансгенных и трансхромосомных животных, отличных от человека, которые образуют человеческие моноклональные антитела против ИЛ-15. В еще одном аспекте изобретение представляет трансгенных или трансхромсомных животных,отличных от человека, таких как трансгенные или трансхромосомные мыши, которые способны к экспрессии человеческих моноклональных антител, специфически связывающихся с ИЛ-15. В конкретном варианте осуществления изобретение представляет трансгенную или трансхромосомную мышь с геномом, содержащим трансген тяжелой цепи человека, так что данная мышь продуцирует человеческие антитела против ИЛ-15 при иммунизации антигеном ИЛ-15 и/или клетками, экспрессирующимим ИЛ 15. Трансген тяжелой цепи человека может быть интегрирован в хромосомную ДНК мыши, как в случае трансгенной мыши, например мыши HuMAb, что детально описано в данном контексте и подкреплено примерами. Альтернативно, трансген тяжелой цепи человека может поддерживаться экстрахромосомно, как в случае трансхромосомной мыши (например, KM), как описано в патентной заявке WO 02/43478. Данные трансгенные и трансхромосомные мыши способны продуцировать множество изотипов человеческих моноклональных антител к ИЛ-15 (например, IgG, IgA и/или IgE) путем рекомбинации V-D-J и переключения изотипов. Переключение изотипов может происходить, например, посредством классического или неклассического переключения изотипов. Для конструирования трансгенного или трансхромосомного животного, отличного от человека,которое отвечает на стимуляцию чужеродным антигеном репертуаром гетерологичных антител, необходимо, чтобы трансгены гетерологичного иммуноглобулина, которые содержит трансгенное животное, функционировали нормально на всем пути развития B-клеток. Это включает, например, переключение изотипа трансгена гетерологичной тяжелой цепи. Соответственно трансгены конструируют так,чтобы они осуществляли переключение изотипа и одну или более из следующих характеристик антител: (1) высокий уровень и экспрессия, специфическая для клеточного типа, (2) функциональная реаранжировка гена, (3) активация ответа на аллельное исключение, (4) экспрессия достаточного первичного репертуара, (5) сигнальная трансдукция, (6) соматическая гипермутация и (7) доминирование локуса трансгенного антитела в процессе иммунного ответа. Не все из вышеперечисленных критериев должны быть представлены. Например, в тех вариантах осуществления, где локусы эндогенного иммуноглобулина трансгенного животного функционально разрушены, трансген может не активировать аллельное исключение. Кроме того, в тех вариантах осуществления, когда трансген содержит функционально реаранжированный ген тяжелой и/или легкой цепи иммуноглобулина, второй критерий функциональной реаранжировки гена не является необходимым, по меньшей мере, для трансгена, который уже реаранжирован. Основы молекулярной иммунологии см. в монографии Фундаментальная иммунология (Fundamental Immunology) под ред. Paul WilliamE., 2 изд., Raven Press, N.Y. (1989). В некоторых вариантах осуществления трансгенных или трансхромосомных животных, отличных от человека, используют для генерации человеческих моноклональных антител, соответствующих изобретению, которые содержат реаранжированные, неаранжированные или комбинацию реаранжированных и неаранжированных трансгенов гетерологичных тяжелой и легкой цепей иммуноглобулина в зародышевой линии трансгенного животного. Каждый из трансгенов тяжелой цепи содержит по меньшей мере один ген CH. Кроме того, трансген тяжелой цепи может содержать функциональные последовательности переключения изотипа, которые способны поддерживать переключение изотипа гетерологичного трансгена, кодирующего множество генов CH в B-клетках трансгенного животного. Данные переключающие последовательности могут быть последовательностями, присутствующими в естественных условиях в локусе иммуноглобулина зародышевой линии вида, который служит источником трансгенных генов CH, или данные переключающие последовательности могут быть выделены из имеющихся у видов, которые предназначены для получения трансгенной конструкции (трансгенного животного). Например, человеческая трансгенная конструкция, которую используют для получения трансгенной мыши, может давать повышенную частоту событий переключения изотипа, если она содержит переключающие последовательности, близкие существующим в естественных условиях в локусе тяжелой цепи мыши, поскольку переключающие последовательности мыши, в отличие от переключающих последовательностей человека, по-видимому, оптимизированы для функционирования с переключающей ферментной системой рекомбиназы мыши. Переключающие последовательности выделяют и клонируют принятыми способами клонирования, или они могут быть синтезированы de novo из перекрывающихся синтетических олигонуклеотидов, созданных на основе опубликованной информации о последовательностях, касающейся последовательностей области переключения иммуноглобулина (см. статьи Mills и соавт., Nucl. Acids Res., 15:7305-7316 (1991); Sideras и соавт., Intl. Immunol., 1:631642 (1989). У каждого из вышеописанных трансгенных животных функционально реаранжированные трансгены гетерологичных тяжелой и легкой цепей иммуноглобулина обнаруживают в значительной фракции B-клеток трансгенного животного (по меньшей мере 10%). Трансгены, используемые для создания трансгенных животных, соответствующих изобретению,включают трансген тяжелой цепи, содержащий ДНК, которая кодирует по меньшей мере один сегмент вариабельного гена, один сегмент разнообразия, один сегмент связывающего гена и по меньшей мере один сегмент гена константной области. Трансген легкой цепи иммуноглобулина содержит ДНК, кодирующую по меньшей мере один сегмент вариабельного гена, один сегмент связывающего гена и по меньшей мере один сегмент гена константной области. Сегменты генов, кодирующих сегменты генов легкой и тяжелой цепей, являются гетерологичными для трансгенного животного, отличного от человека, поскольку они выделены из ДНК или соответствуют ДНК, кодирующей сегменты генов тяжелой и легкой цепей иммуноглобулина, видов, не включающих трансгенное животное, отличное от человека. В одном из аспектов изобретения трансген конструируют таким образом, чтобы отдельные сегменты гена были переаранжированными, т.е. не были реаранжированы так, чтобы кодировать функциональные легкую и тяжелую цепи иммуноглобулина. Такие нереаранжированные трансгены поддерживают рекомбинацию сегментов генов V, D и J (функциональную реаранжировку) и предпочтительно поддерживают инкорпорацию полного сегмента гена участка D или его части в полученную в результате реаранжированную тяжелую цепь иммуноглобулина у трансгенного животного, отличного от человека,при воздействии антигена ИЛ-15. В альтернативном варианте осуществления трансгены содержат нереаранжированный "минилокус". Данные трансгены, как правило, содержат значительную часть сегментов C, D и J, а также подгруппу сегментов гена V. В данных трансгенных конструкциях различные регуляторные последовательности, например промоторы, энхансеры, участки переключения класса, сплайс-донорные и сплайсакцепторные последовательности процессинга РНК, сигналы рекомбинации и т.п., содержат соответствующие последовательности, выделенные из гетерологичной ДНК. Такие регуляторные последовательности могут быть инкорпорированы в трансген от того же самого или близкого вида животного,отличного от человека, используемого в изобретении. Например, сегменты гена человеческого иммуноглобулина могут быть скомбинированы в трансгене с последовательностью энхансера иммуноглобулина грызунов для использования в трансгенной мыши. Альтернативно, в трансген могут быть инкорпорированы синтетические регуляторные последовательности, где данные синтетические регуляторные последовательности негомологичны функциональной последовательности ДНК, которая, как известно,присутствует в естественных условиях в геномах млекопитающих. Синтетические регуляторные последовательности конструируют согласно правилам консенсуса, таким как, например, правила, определяющие допустимые последовательности сплайс-акцепторного сайта или мотива промотора/энхансера. Например, минилокус содержит часть геномного локуса иммуноглобулина по меньшей мере с одной внутренней (т.е. неконцевой части) делецией неосновной части ДНК (например, промежуточной последовательности, интрона или его фрагмента) по сравнению с природным локусом Ig зародышевой линии. В предпочтительном варианте осуществления изобретения трансгенное или трансхромосомное- 19015897 животное, используемое для генерации человеческих антител к ИЛ-15, которое содержит по меньшей мере один, как правило, 2-10 и иногда 25-50 или более копий трансгена, описанного в примере 12 патентной заявки WO 98/24884 (например, pHC1 или pHC2), скрещивают с животным, содержащим одну копию трансгена легкой цепи, описанным в примерах 5, 6, 8 или 14 патентной заявки WO 98/24884, и их потомство скрещивают с животным, несущим делецию JH, описанным в примере 10 патентной заявки WO 98/24884. Животных скрещивают до получения гомозиготности по каждому из данных трех признаков. Такие животные имеют следующий генотип: одна копия (на гаплоидный набор хромосом) нереаранжированного минилокуса человеческой тяжелой цепи (описано в примере 12 патентной заявкиWO 98/24884), одна копия (на гаплоидный набор хромосом) реаранжированной конструкции человеческой K-легкой цепи (описано в примере 14 патентной заявки WO 98/24884) и делеция в каждом эндогенном локусе мышиной тяжелой цепи, которая элиминирует все функциональные сегменты JH (описано в примере 10 патентной заявки WO 98/24884). Данных животных скрещивают с мышами, гомозиготными по делеции сегментов JH (примеры 10 патентной заявки WO 98/24884) для получения потомства, гомозиготного по делеции JH и гемизиготного по конструкциям человеческих тяжелой и легкой цепей. Полученным в результате животным инъекционно вводят антигены и используют для продукции человеческих моноклональных антител против данных антигенов.B-клетки, изолированные у данного животного, являются моноспецифическими относительно человеческих тяжелой и легкой цепей, поскольку они содержат только одну копию каждого гена. Более того, они будут моноспецифическими относительно человеческой и мышиной тяжелых цепей, потому что обе копии эндогенного гена мышиной тяжелой цепи нефункциональны вследствие делеции объема участка JH, интродуцированной, как описано в примерах 9 и 12 патентной заявки WO 98/24884. Более того, существенная фракция B-клеток будет моноспецифической относительно человеческой или мышиной легких цепей, поскольку экспрессия единственной копии реаранжированного гена человеческой-легкой цепи будет аллельно и изотипически исключать реаранжировку эндогенных генов мышиных- и -цепей в существенной фракции B-клеток. Трансгенные и трансхромосомные мыши, используемые в данном изобретении, демонстрируют значительный репертуар продукции иммуноглобулина, в идеале практически аналогичном репертуару нативной мыши. Так, например, в вариантах осуществления с инактивацией эндогенных генов Ig уровни общего иммуноглобулина будут лежать в интервале от приблизительно 0,1 до 10 мг/мл сыворотки,предпочтительно от 0,5 до 5 мг/мл, в идеальном случае по меньшей мере приблизительно 1,0 мг/мл. Когда трансген, способный воздействовать на переключение с IgM на IgG, интродуцирован трансгенной мыши, у взрослой мыши соотношение сывороточного IgG к IgM составляет предпочтительно приблизительно 10:1. У неполовозрелой мыши соотношение IgG к IgM будет значительно ниже. Как правило, больше приблизительно 10%, предпочтительно от 40 до 80% B-клеток селезенки и лимфатических узлов экспрессируют исключительно человеческий белок IgG. Репертуар будет идеально приближаться к показанному для нативной мыши, обыкновенно иметь величину по меньшей мере приблизительно 10%, предпочтительно 25-50% или больше. Как правило,будет продуцироваться по меньшей мере приблизительно тысяча различных иммуноглобулинов (в идеале IgG), предпочтительно 104-106 или больше в зависимости прежде всего от числа различных участков V, J и D, интродуцированных в геном мыши. Данные иммуноглобулины, как правило, будут распознавать приблизительно половину или больше высокоантигенных белков, например белок A. Staphylococcus. В типичном случае аффинность (KD), которую проявляют иммуноглобулины в отношении заранее заданных антигенов, будет ниже 10-7 М, например, ниже 10-8 М, 10-9 М или 10-10 М или даже ниже. В ряде вариантов осуществления может быть предпочтительным получение мышей с заранее заданными репертуарами с целью ограничения отбора V-генов, представленных в ответе антитела на заданный тип антигена. Трансген тяжелой цепи, имеющий заранее заданный репертуар, может содержать, например, гены VH человека, которые преимущественно используются в ответах антител на заданный тип антигена у людей. Альтернативно, некоторые гены VH могут быть исключены из определенного репертуара по разным соображениям (например, при низкой вероятности кодирования высокоаффинных V-областей для заданного антигена, при высокой частоте соматических мутаций и сужения аффинности или при иммуногенности для некоторых людей). Таким образом, перед реаранжировкой трансгена, содержащего различные сегменты генов тяжелой и легкой цепей, данные сегменты генов можно легко идентифицировать, например, путем гибридизации или секвенирования ДНК, как происходящие из видов организма, отличного от трансгенного животного. Как описано выше, трансгенные и трансхромосомные мыши могут быть иммунизированы, например, очищенным или обогащенным препаратом антигена ИЛ-15 и/или клетками, экспрессирующими ИЛ-15. Альтернативно, трансгенные мыши могут быть иммунизированы ДНК, кодирующей человеческий ИЛ-15. Тогда мыши будут продуцировать B-клетки, в которых переключение класса происходит путем внутритрансгенной переключающей рекомбинации (цис-переключения), и экспрессировать иммуноглобулины, реактивные с ИЛ-15. Иммуноглобулины могут быть представлены человеческими- 20015897 антителами (называемыми также "антителами с человеческими последовательностями"), где полипептиды тяжелой и легкой цепей кодируются человеческими трансгенными последовательностями, которые могут включать последовательности, полученные путем соматической мутации и рекомбинаторных связей V-области, а также последовательностями, кодируемыми зародышевой линией. Данные человеческие антитела можно рассматривать, как имеющие существенную идентичность с полипептидной последовательностью, кодируемой сегментом гена человеческих VL или VH и сегментом человеческих JL или DH и JH, хотя другие последовательности незародышевой линии могут присутствовать в качестве результата соматической мутации и дифференциальных рекомбинационных связей V-J и V-DJ. Вариабельные области каждой цепи антитела, как правило, по меньшей мере на 80% кодируется сегментами генов человеческой зародышевой линии V, J и, в случае тяжелых цепей D, зачастую по меньшей мере 85% вариабельных областей кодируется последовательностями человеческой зародышевой линии, присутствующими в трансгене; часто 90 или 95% или больше последовательностей вариабельной области кодируется последовательностями человеческой зародышевой линии, присутствующими в трансгене. Однако, хотя последовательности незародышевой линии интродуцируют путем соматической мутации и связывания VJ и VDJ, антитела с человеческими последовательностями зачастую будут иметь некоторые последовательности вариабельной области (и реже последовательности константной области), которые не кодируются сегментами генов человеческих V, D или J, как обнаружено в человеческом трансгене(ах) в зародышевой линии мышей. Обычно такие последовательности незародышевой линии (или отдельные положения нуклеотидов) будут образовывать кластеры в CDR или около них или в областях, где, как известно, соматические мутации образуют кластер. Человеческие антитела, которые связываются с заданным антигеном, можно получить в результате переключения изотипа, при этом происходит продукция человеческих антител, содержащих человеческую последовательность -цепи(такой как 1, 2a, 2B или 3) и человеческую последовательность легкой цепи (такой как ). Такие человеческие антитела с переключенным изотипом часто содержат одну или более соматических мутаций, как правило, в вариабельной области, и часто в приблизительно 10 остатках CDR или около них,что является результатом созревания аффинности и отбора B-клеток с помощью антигена, в особенности после вторичного (или последующего) введения антигена. Данные высокоаффинные человеческие антитела могут иметь аффинности связывания (KD) ниже 10-7 М, такие как ниже 10-8 М, 10-9 М или 10-10 М или даже ниже. Другой аспект изобретения касается B-клеток, выделенных у трансгенных или трансхромосомных мышей, как описано в данном контексте. B-клетки могут быть использованы для генерации гибридом,экспрессирующих человеческие моноклональные антитела, которые связываются с человеческим ИЛ 15 с высокой аффинностью (например, ниже чем 10-7 М). Так, в другом варианте осуществления изобретение представляет гибридому, которая продуцирует человеческое антитело, которое имеет аффинность (KD) ниже 10-7 М, такие как ниже 10-8 М, 10-9 М или 10-10 М или даже ниже по определению с применением технологии поверхностного плазменного резонанса (SPR) с помощью прибора BIACORE 3000, используя рекомбинантный человеческий ИЛ-15 в качестве аналита и антитело в качестве лиганда для связывания человеческого ИЛ-15, где антитело содержит: последовательность человеческой легкой цепи, состоящую из: (1) вариабельной области легкой цепи, имеющей полипептидную последовательность, практически идентичную полипептидной последовательности, кодируемой сегментом человеческого гена VL и сегментом человеческого JL, и (2) константной области легкой цепи, имеющей полипептидную последовательность, практически идентичную полипептидной последовательности, кодируемой сегментом человеческого гена CL и последовательность человеческой тяжелой цепи, состоящую из (1) вариабельной области тяжелой цепи, имеющей полипептидную последовательность, практически идентичную полипептидной последовательности, кодируемой сегментом человеческого гена VH, необязательно D-участком и сегментом человеческого JH, и (2) константной области, имеющей полипептидную последовательность, практически идентичную полипептидной последовательности, кодируемой сегментом человеческого гена CH. Созданию высокоаффинных человеческих моноклональных антител против ИЛ-15 способствует способ расширения репертуара сегментов человеческого гена вариабельной области у трансгенной мыши, которая имеет геном, содержащий интегрированный трансген человеческого иммуноглобулина. Данный способ предусматривает интродукцию в геном трансгена V-гена, содержащего сегменты генаV-области, которые не присутствуют в указанном интегрированном трансгене человеческого иммуноглобулина. Часто трансген V-области представляет собой искусственную хромосому дрожжей, содержащую часть последовательности сегмента человеческого гена VH или VL (VK), так как она может находиться в естественных условиях в геноме человека или поскольку она может быть раздельно сплайсирована вместе рекомбинантными способами, которые могут включать нарушенные или пропущенные сегменты гена V. Часто YAC (искусственная хромосома дрожжей) содержит по меньшей мере пять или более функциональных сегментов гена V. В данном варианте возможно создание трансгенной мыши, полученной способом расширения V-репертуара, где мышь экспрессирует цепь иммуноглобулина,содержащую последовательность вариабельной области, кодируемую сегментом гена V-области, при- 21015897 сутствующим в трансгене V-области, и C-область, кодируемую трансгеном Ig человека. С помощью способа расширения V-репертуара могут быть получены трансгенные мыши по меньшей мере с 5 различными V-генами, а также мыши, несущие по меньшей мере приблизительно 24 V-гена или более. Некоторые сегменты V-гена могут быть нефункциональными (например, псевдогены и т.п.); если желательно, данные сегменты можно сохранять или избирательно элиминировать рекомбинантными способами, которые доступны компетентным исследователям. После конструирования мышиной зародышевой линии, содержащей функциональную YAC,имеющую расширенный репертуар V-сегментов, практически не присутствующий в трансгене человеческого Ig, содержащем сегменты генов J и C, признак может быть размножен и введен путем скрещивания в другие генетические системы, включая системы, в которых функциональную YAC с расширенным репертуаром V-сегментов вводят путем скрещивания в зародышевую линию мышей, несущую другой трансген человеческого Ig. Для функционирования с трансгеном человеческого Ig (или множеством трансгенов человеческого Ig) множество функциональных YAC с расширенным репертуаром Vсегментов может быть путем скрещивания введено в зародышевую линию. Хотя и обозначаемые в данном контексте как трансгены YAC, данные трансгены при интеграции в геном могут практически утрачивать дрожжевые последовательности, такие как последовательности, необходимые для автономной репликации в дрожжах, данные последовательности необязательно могут быть удалены способами геннной инженерии (например, рестрикционным расщеплением и гель-электрофорезом в пульсовом поле или другим подходящим способом) после репликации в дрожжах при отсутствии дальнейшей необходимости (т.е. перед интродукцией в мышиные клетки ES или прозиготу мыши). Способы размножения признака экспрессии последовательности человеческого иммуноглобулина включают скрещивание трансгенной мыши, имеющей трансген(ы) человеческого Ig и необязательно имеющей также функциональную YAC с расширенным репертуаром V-сегмента. На YAC могут присутствовать сегменты обоих генов VH и VL. Трансгенная мышь может быть скрещена с любой системой, желательной для исследователя, включая системы, несущие другие трансгены человека, в том числе трансгены Ig человека и/или трансгены, кодирующие другие белки лимфоцитов человека. Изобретение представляет также последовательность высокоаффинного человеческого иммуноглобулина, продуцируемую трансгенной мышью, несущей трансген YAC расширенного репертуара V-области. Хотя вышеприведенное описывает предпочтительный вариант осуществления трансгенного животного, соответствующего изобретению, представлены другие варианты осуществления, которые разделены на четыре категории:I. Трансгенные животные, содержащие трансген иммуноглобулина с нереаранжированной тяжелой и реаранжированной легкой цепью.II. Трансгенные животные, содержащие трансген иммуноглобулина с нереаранжированной тяжелой и нереаранжированной легкой цепью.III. Трансгенное животное, содержащие трансген иммуноглобулина с реаранжированной тяжелой и нереаранжированной легкой цепью.IV. Трансгенные животные, содержащие трансгены иммуноглобулина с реаранжированной тяжелой и реаранжированной легкой цепью. Из данных категорий трансгенных животных предпочтительным порядком выбора является следующий: IIIIIIIV, где эндогенные гены легкой цепи (или по меньшей мере гена K) выбиты путем гомологичной рекомбинации (или другим способом), и IIIIIIIV, где эндогенные гены легкой цепи не выбиты и должны доминировать посредством аллельного исключения.III. Конъюгаты антител/иммунотоксины. В другом аспекте данное изобретение характеризует человеческое моноклональное антитело против ИЛ-15, конъюгированное с такой терапевтической молекулой, как цитотоксин, лекарственное вещество (например, иммунодепрессант) или радиоизотоп. При конъюгировании с цитотоксином данные конъюгаты антител обозначают термином "иммунотоксины". Цитотоксин или цитотоксический агент включает любой агент, который причиняет вред клетке (например, уничтожает ее). Примеры включают таксол, цитохалазин B, грамицидин D, бромид этидия, эметин, митомицин, этопозид, тенопозид, винкристин, винбластин, колхицин, доксорубицин, даунорубицин, дигидроксиантрациндион, митоксантрон, митрамицин, актиномицин D, 1-дегидротестостерон, глюкокортикоиды, прокаин, тетракаин, лидокаин, пропранолол и пуромицин, а также их аналоги или гомологи. Терапевтические агенты включают без ограничения перечисленным антиметаболиты (например, метотрексат, 6-меркптопурин, 6 тиогуанин, цитарабин, 5-фторурацил, декарбазин), алкилирующие агенты (например, мехлорэтамин,тиоэпа, хлорамбуцил, мелфалан, кармустин (BSNU) и ломустин (CCNU), циклофосфамид, бисульфан,дибромоманнит, стрептозотоцин, митомицин C и цис-дихлордиаминплатину (II) OPP)-цисплатин),антрациклины (например, даунорубицин (прежнее название дауномицин) и доксорубицин), антибиотики (например, дактиномицин (прежнее название актиномицин), блеомицин, митрамицин и антрамицин(AMC, а также антимитотические агенты (например, винкристин и винбластин). Антитело, соответствующее данному изобретению, может быть конъюгировано с радиоизотопом, например радиоактивным йодом, с целью получения цитотоксических радиофармацевтических препаратов для лечения нарушения, связанного с ИЛ-15, такого как рак.- 22015897 Конъюгаты антител, соответствующие изобретению, могут быть использованы для модификации заданного биологического ответа. Термин "терапевтическая молекула" не следует ограничивать рамками классических химических терапевтических агентов. Например, молекула лекарственного вещества может быть представлена белком или полипептидом, обладающими желательной биологической активностью. Данные белки могут включать, например, токсин с активностью фермента или его активный фрагмент, такой как абрин, рицин A, эндотоксин Pseudomonas или дифтерийный токсин; белок,такой как фактор некроза опухолей или интерферон-, или модификаторы биологического ответа, такие как, например, лимфокины, интерлейкин-1 ("ИЛ-1"), интерлейкин-2 ("ИЛ-2"), интерлейкин-6 ("ИЛ-6"),гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор ("GM-CSF"), гранулоцитарный колониестимулирующий фактор ("G-CSF") и другие факторы роста. Технологии конъюгирования такой терапевтической молекулы с антителами хорошо известны,см., например раздел, написанный Arnon и соавт., "Моноклональные антитела для создания иммунонаправленности лекарственных веществ в терапии рака" (Monoclonal antibodies For Immunotargeting OfDrugs In Cancer Therapy"), в монографии "Моноклональные антитела и терапия рака" ("Monoclonal antibodies And Cancer Therapy") под ред. Reisfeld и соавт., с. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985); раздел, написанный Hellstrom и соавт., "Антитела для доставки лекарственных веществ" ("Antibodies For Drug Delivery") в монографии "Контролируемая доставка лекарственных веществ" ("Controlled Drug Delivery"),2 изд., под ред. Robinson и соавт., с. 623-53 (Marcel Dekker, Inc. 1987); обзор Thorpe "Антитела-носители цитотоксических агентов в терапии рака" (Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: AReview", в сборнике "Моноклональные антитела'84: биологическое и клиническое применение" (Monoclonal antibodies'84: Biological And Clinical Applications) под ред. Pinchera и соавт., с. 475-506 (1985); раздел "Анализ, результаты и будущие перспективы терапевтического применения антител с радиоактивной меткой в терапии рака" "Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy", в монографии "Моноклональные антитела для определения и терапии рака" "Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy", под ред. Baldwin и соавт., с. 303-16 (Academic Press 1985) и статью Thorpe и соавт. "Получение и цитотоксические свойства конъюгатов антител и токсинов", "The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates", Immunol. Rev., 62:119-58 (1982).IV. Фармацевтические композиции. В другом аспекте данное изобретение представляет композицию, например фармацевтическую композицию, содержащую одно или комбинацию человеческих моноклональных антител или их антигенсвязывающую часть(и), соответствующие данному изобретению, изготовленные вместе с фармацевтически приемлемым носителем. В предпочтительном варианте осуществления композиции включают комбинацию множества (двух или более) выделенных человеческих антител или их антигенсвязывающих фрагментов, соответствующих изобретению. Предпочтительно, когда каждое из антител, составляющих композицию, связывается с различными заранее выбранными эпитопами ИЛ-15. Фармацевтические композиции, соответствующие изобретению, можно также применять в комбинированной терапии, т.е. в сочетании с другими агентами. Например, комбинированная терапия может включать композицию, соответствующую данному изобретению, по меньшей мере с одним или более дополнительных терапевтических агентов, таких как противовоспалительные агенты, DMARD(противоревматические лекарственные вещества, модифицирующие заболевание), иммунодепрессанты,химиотерапевтические агенты и агенты против псориаза). Фармацевтические композиции, соответствующие изобретению, могут также вводиться в сочетании с радиотерапией. Изобретение охватывает также совместное введение с другими антителами, такими как CD4-специфические антитела и ИЛ-2 специфические антитела. Полагают, что данные комбинации с CD4-специфическими антителами и ИЛ 2-специфическими антителами являются особенно эффективными для лечения аутоиммунных заболеваний и отторжения трансплантатов. Как используют в данном контексте, термин "фармацевтически приемлемый носитель" включает любой и все растворители, дисперсионные среды, покрытия, антибактериальные и противогрибковые агенты, изотонические и задерживающие всасывание агенты и т.п., которые являются физиологически совместимыми. Предпочтительно, когда носитель пригоден для внутривенного, внутримышечного,подкожного, парентерального, спинального или эпидермального введения (например, путем инъекции или инфузии). В зависимости от способа введения активное соединение, т.е. антитело, биспецифическая и мультиспецифическая молекула, могут быть покрыты материалом для защиты соединения от действия кислот и других условий естественной среды, которые могут инактивировать соединение. Термин "фармацевтически приемлемая соль" относится к соли, которая сохраняет желательную биологическую активность исходного соединения и не вносит никакие нежелательные токсикологические эффекты (см., например, Berge S.M. и соавт. J. Pharm. Sci., 66:1-19 (1977. Примеры данных солей включают соли, полученные при добавлении кислот, и соли, полученные при добавлении оснований. Соли, полученные при добавлении кислот, включают соли, полученные из нетоксичных неорганических кислот, таких как гидрохлорная, азотная, фосфорная, серная, бромисто-водородная, йодистоводородная, фосфористая и т.п., а также из нетоксичных органических кислот, таких как алифатиче- 23015897 ские моно- и дикарбоновые кислоты, фенилзамещенные алкановые кислоты, гидроксиалкановые кислоты, ароматические кислоты, алифатические и ароматические сульфоновые кислоты и т.п. Соли, полученные при добавлении оснований, включают соли, полученные из щелочно-земельных металлов,таких как натрий, калий, магний, кальций и т.п., а также из нетоксичных органических аминов, таких как N-N'-дибензилэтилендиамин, N-метилглюкамин, хлорпрокаин, холин, диэтаноламин, этилендиамин, прокаин и т.п. Композиция, соответствующая данному изобретению, может быть введена множеством способов,известных в области техники. Компетентный специалист примет во внимание, что путь и/или способ введения будет изменяться в зависимости от желательных результатов. Активные соединения могут быть приготовлены с носителями, которые будут предохранять соединение от быстрого выхода, как в препарате с контролируемым выходом, включая имплантаты, чрескожные пластыри и микроинкапсулированные системы доставки. Возможно использование биодеградируемых биосовместимых полимеров, таких как этиленвинилацетат, полиангидриды, полигликолевая кислота, коллаген, полиортоэфиры и полимолочная кислота. Многие способы приготовления данных препаратов запатентованы или в целом известны компетентным специалистам в данной области. См., например, монографию под ред. J. R.Robinson "Системы доставки лекарственных веществ с задержанным или контролируемым выходом"("Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems"), Marcel Dekker, Inc., New York (1978). Для введения соединения, соответствующего изобретению, определенными путями может быть необходимым покрыть соединения оболочкой или вводить соединения вместе с материалом, который предупреждает его инактивацию. Например, соединение может быть введено субъекту в подходящем носителе, например в липосомах или разбавителе. Фармацевтически приемлемые разбавители включают физиологический раствор и водные буферные растворы. Липосомы включают эмульсии CGF типа вода-в-масле-в-воде, а также обычные липосомы (см. статью Strejan и соавт., J. Neuroimmunol., 7:27(1984. Фармацевтически приемлемые носители включают стерильные водные растворы или дисперсии и стерильные порошки для приготовления стерильных инъекционных растворов или дисперсий для немедленного применения. В области техники известно применение таких сред и агентов для фармацевтически активных субстанций. Таким образом, за исключением любых обычных сред и агентов, несовместимых с данным активным соединением, их применение предусматривается в фармацевтических композициях, соответствующих изобретению. В композиции могут быть также введены дополнительные активные соединения. Терапевтические композиции, как правило, должны быть стерильными и стабильными в условиях изготовления и хранения. Композиция может быть приготовлена в виде раствора, микроэмульсии, липосомы или другой упорядоченной структуры, подходящей для высокой концентрации лекарственного вещества. Носитель может быть представлен растворителем или дисперсионной средой, содержащей,например, воду, этанол, полиол (например, глицерин, пропиленгликоль и жидкий пропиленгликоль и т.п.), а также их подходящие смеси. Необходимую текучесть можно поддерживать, например, с помощью такого покрытия, как лецитин, поддержанием требующегося размера частиц в случае дисперсии и применения поверхностно-активных веществ. Во многих случаях будет предпочтительным включение в композицию изотонических агентов, например сахаров, многоатомных спиртов, таких как маннит и сорбит, или хлорида натрия. Пролонгированное всасывание инъекционных композиций можно осуществить включением в композицию агента, который задерживает всасывание, например солей моностеарата и желатина. Стерильные инъекционные растворы могут быть приготовлены путем введения активного соединения в необходимом количестве в соответствующий растворитель с одним или комбинацией вышеперечисленных ингредиентов, как требуется, с последующей стерилизацией путем микрофильтрации. Как правило, дисперсии готовят введением активного соединения в стерильный носитель, который содержит базовую дисперсионную среду и другие необходимые ингредиенты из вышеперечисленных. В случае стерильных порошков для приготовления стерильных инъекционных растворов предпочтительными способами получения являются вакуумная сушка и высушивание вымораживанием (лиофилизация), которые приводят к получению порошка активного ингредиента, содержащего любой дополнительный желательный ингредиент из его раствора, предварительно простерилизованного фильтрованием. Схемы дозирования подбирают так, чтобы получить оптимальный желательный ответ (например,терапевтический ответ). Например, может быть введен один болюс, за определенный период может быть введено несколько разделенных доз или доза может быть пропорционально уменьшена или увеличена, как продиктовано терапевтической ситуацией. Например, человеческие антитела, соответствующие изобретению, можно вводить путем подкожной инъекции один или два раза в неделю или путем подкожной инъекции один или два раза в месяц. Особенно эффективным является приготовление парентеральных композиций в унифицированной лекарственной форме для простоты применения и унификации дозы. Термин "унифицированная лекарственная форма", как используют в данном контексте, относится к физически дискретным единицам, соответствующим однократным дозам, предназна- 24015897 ченным для субъектов, проходящих лечение. Каждая единица содержит заданное количество активного соединения, рассчитанное для получения желательного терапевтического эффекта, в сочетании с необходимым фармацевтическим носителем. Подробное определение унифицированных лекарственных форм, соответствующих изобретению, продиктовано и непосредственно зависит от: (a) уникальных характеристик активного соединения и определенного терапевтического эффекта, который предусматривается достигнуть, и (b) ограничений, присущих области техники, связанной с составлением рецептур данного активного соединения для лечения чувствительности у субъектов. Примеры фармацевтически приемлемых антиоксидантов включают: (1) водорастворимые антиоксиданты, такие как аскорбиновая кислота, цистеина гидрохлорид, бисульфат натрия, метабисульфат натрия, сульфит натрия и т.п.; (2) антиоксиданты, растворимые в масле, такие как аскорбилпальмитат,бутилированный гидроксианизол (BHA), бутилированный гиброкситолуол (ВНТ), лецитин, пропилгаллат, -токоферол и т.п.; и (3) металл-хелатирующие агенты, такие как лимонная кислота, этилендиаминтетрауксусная кислота (EDTA), сорбит, винная кислота, фосфорная кислота и т.п. Касательно терапевтических композиций, препараты, соответствующие данному изобретению,включают пригодные для перорального, назального, наружного (в том числе защечного и подъязычного), ректального, вагинального и/или парентерального введения. Препараты могут быть удобно представлены в унифицированной лекарственной форме и могут быть приготовлены способами, известными в фармации. Количество активного ингредиента, которое может сочетаться с материалом носителя при получении лекарственной формы для однократного приема, будет варьировать в зависимости от субъекта, проходящего лечение и конкретного способа введения. Количество активного ингредиента,которое может сочетаться с материалом носителя для получения лекарственной формы для однократного приема, будет, как правило, составлять то количество композиции, которое обеспечивает терапевтический эффект. В общем, из 100% данное количество будет находиться в интервале от приблизительно 0,001 до приблизительно 90% активного ингредиента, предпочтительно от приблизительно 0,005 до приблизительно 70%, наиболее предпочтительно от приблизительно 0,01 до приблизительно 30%. Препараты, соответствующие данному изобретению, которые пригодны для вагинального введения, включают также препараты в виде пессариев (маточных колец), тампонов, кремов, гелей, паст,пенок или спреев, содержащих такие носители, которые в области техники известны как приемлемые. Лекарственные формы для наружного или чрескожного применения композиций, соответствующих данному изобретению, включают порошки, спреи, мази, пасты, кремы, лосьоны, гели, растворы, пластыри и ингаляционные препараты. Активное соединение может быть смешано в стерильных условиях с фармацевтически приемлемым носителем и любыми консервантами, буферами или пропеллентами,которые могут оказаться необходимыми. Выражения "парентеральное введение" и "вводимый парентерально", как используют в данном контексте, означают способы введения, отличные от энтерального и наружного введения, обычно путем инъекции, и включают без ограничения внутривенную, внутримышечную, внутриартериальную,интратекальную (подоболочечную), внутрикапсульную, внутриглазничную, внутрисердечную, внутрикожную, внутрибрюшинную, транстрахеальную, подкожную, субкутикулярную, внутрисуставную,субкапсулярную, субарахноидальную, интраспинальную, эпидуралыную и внутригрудинную инъекции или вливания. Примеры подходящих водных и неводных носителей, которые могут быть использованы в фармацевтических композициях, соответствующих изобретению, включают воду, этанол, полиолы (такие как глицерин, пропиленгликоль, полиэтиленгликоль и т.п.) и их подходящие смеси, растительные масла,такие как оливковое масло, и пригодные для инъекционного введения органические сложные эфиры,такие как этилолеат. Надлежащую текучесть можно поддерживать, например, с помощью таких покрывающих материалов, как лецитин, поддержанием требующегося размера частиц в случае дисперсии и применения поверхностно-активных веществ. Данные композиции могут также содержать вспомогательные компоненты, такие как консерванты, увлажняющие агенты, эмульгаторы и диспергирующие агенты. Предупреждение появления микроорганизмов обеспечивают процедурами стерилизации, supra, и введением различных антибактериальных и противогрибковых агентов, например парабена, хлорбутанола, фенола, сорбиновой кислоты и т.п. Желательным может также оказаться введение в композиции изотонических агентов, таких как сахара, хлорид натрия и т.п. Кроме того, пролонгированное всасывание инъекционной фармацевтической формы можно осуществить включением агентов, которые задерживают всасывание, таких как моностеарат алюминия и желатин. При введении человеку и животным соединений, соответствующих данному изобретению, в виде фармацевтических препаратов их можно применять в виде монокомпонентов или как фармацевтическую композицию, содержащую, например, 0,001-90% (более предпочтительно 0,005-70%, например 0,01-30%) активного ингредиента в комбинации с фармацевтически приемлемым носителем. Независимо от выбранного способа введения, соединения, соответствующие данному изобретению, которые могут быть использованы в подходящей гидратированной форме, и/или фармацевтиче- 25015897 ские композиции, соответствующие данному изобретению, готовят в виде фармацевтически приемлемых лекарственных форм обычными способами, известными компетентным специалистам в данной области техники. Фактические уровни дозировок активных ингредиентов в фармацевтических композициях, соответствующих данному изобретению, могут варьировать, чтобы обеспечить количество активного ингредиента, эффективное для достижения желательного терапевтического ответа у конкретного пациента, состав и способ введения без токсического воздействия на пациента. Выбранный уровень дозы будет зависеть от ряда фармакокинетических факторов, включая активность используемых определенных композиций, соответствующих данному изобретению, или их сложных эфиров, солей или амидов, способа введения, времени введения, скорости выведения конкретного используемого соединения, продолжительности лечения, других лекарств, соединений и/или материалов, применяемых в комбинации с определенными композициями, которые используют, возраста, пола, массы тела, условий, общего состояния здоровья и истории болезни пациента, проходящего лечение, а также подобных факторов,хорошо известных в области медицины. Врач или ветеринар со средним уровнем компетентности в данной области легко может определить и прописать эффективное количество требующейся фармацевтической композиции. Например, врачу или ветеринару следовало бы начать с доз соединений, соответствующих изобретению, которые используют в фармацевтической композиции, на более низких уровнях, чем требуются для достижения желательного терапевтического эффекта, и постепенно повышать дозу, пока терапевтический эффект не будет достигнут. Как правило, подходящей суточной дозой композиций, соответствующих изобретению, будет такое количество соединения, которое в самой низкой дозе эффективно обеспечивает терапевтический эффект. В основном данная эффективная доза будет зависеть от вышеописанных факторов. Предпочтительным является внутривенное, внутримышечное, внутрибрюшинное или подкожное введение, предпочтительно проведенное вблизи области мишени. Если желательно, эффективную суточную дозу терапевтической композиции можно вводить в виде двух, трех, четырех, пяти, шести или более субдоз, которые вводят раздельно с определенными интервалами в течение дня, (необязательно) в унифицированных лекарственных формах. Хотя для соединения, соответствующего данному изобретению, допустимо введение в виде монокомпонента, предпочтительным является вводить соединение как фармацевтический препарат (композицию). Терапевтические композиции можно вводить с помощью медицинских устройств, известных в данной области. Например, в предпочтительном варианте осуществления терапевтическая композиция,соответствующая изобретению, может быть введена с помощью безыгольного гиподермического инъекционного устройства, такого как устройства, описанные в патентах США 5399163, 5383851,5312335, 5064413, 4941880, 4790824 или 4596556. Примеры хорошо известных имплантатов и модулей,используемых в данном изобретении, включают патент США 4487603, который раскрывает имплантируемый микроинфузионный насос для введения лекарственного препарата с контролируемой скоростью; патент США 4486194, который раскрывает терапевтическое устройство для введения лекарственных препаратов через кожу; патент США 4447233, в котором описан насос для инфузии лекарственного препарата, доставляющий лекарственный препарат с точной скоростью инфузии; патент США 4447224, раскрывающий имплантируемое устройство для инфузии с изменением потока, служащее для непрерывной доставки лекарственного вещества; патент США 4439196, в котором описана осмотическая система доставки лекарственного вещества, имеющая многокамерные отделения, и патент США 4475196, раскрывающий осмотическую систему доставки лекарственного вещества. Компетентным специалистам в данной области известно много других подобных имплантатов, систем доставки и модулей. В ряде вариантов осуществления может быть получен препарат человеческих моноклональных антител, соответствующих изобретению, обеспечивающий надлежащее распределение in vivo. Например, гематоэнцефалический барьер (BBB) не пропускает многие соединения с высокой гидрофильностью. Чтобы обеспечить прохождение терапевтических соединений, соответствующих изобретению,через BBB (если это желательно), их можно приготовить, например, в липосомах. Относительно способов изготовления липосом см., например, патенты США 4522811, 5374548 и 5399331. Липосомы могут содержать одну или более молекул, которые селективно транспортируются в специфические клетки или органы, повышая таким образом направленную доставку лекарственного вещества (см., например,статью V.V. Ranade, J. Clin. Pharmacol., 29:685 (1989. Примеры направленных молекул включают фолат или биотин (см., например, патент США 5416016, выданный Low и соавт.); маннозиды (см. статью(1995, различные виды которого могут представлять препараты, соответствующие изобретениям, а также являться компонентами изобретенных молекул; p120 (см. Schreier и соавт., J. Biol. Chem.,269:9090 (1994; см. также статьи K. Keinanen, M.L. Laukkanen, FEBS Lett., 346:123 (1994); J.J. Killion,I.J. Fidler, Immunomethods, 4:273 (1994). В одном из вариантов осуществления изобретения терапевтические соединения, соответствующие изобретению, приготовлены в липосомах; в более предпочти- 26015897 тельном варианте осуществления липосомы содержат направленную структуру. В наиболее предпочтительном варианте осуществления терапевтические соединения в липосомах доставляют путем болюсной инъекции в область, расположенную вблизи опухоли или места инфекции. Композиция должна быть текучей до такой степени, чтобы ее можно было легко набрать в шприц. Она должна быть стабильной в условиях изготовления и хранения, и необходимо принять меры для ее предохранения от загрязняющего действия таких микроорганизмов, как бактерии и грибы. В следующем варианте осуществления человеческие моноклональные антитела, соответствующие изобретению, могут быть получены для предупреждения или уменьшения транспорта через плаценту. Это можно осуществить способами, известными в области техники, например путем ПЭГилирования антитела или использования фрагментов F(ab)2'. Дальнейшие ссылки можно сделать на статьи "Cunningham-Rundles C., Zhuo Z., Griffith B., Keenan J. (1992) Биологические активности конъюгатов полиэтиленгликоль-иммуноглобулин. Устойчивость к ферментативному разложению (Biological activities ofpolyethylene-glycol immunoglobulin conjugates. Resistance to enzymatic degradation), J. Immunol. Methods,152:177-190 и Landor M. (1995) Перенос иммуноглобулинов от матери к плоду (Maternal-fetal transfer ofimmunoglobulins), Ann. Allergy Asthma Immunol., 74:279-283. Это особенно важно, когда антитела используют для лечения или предупреждения привычного самопроизвольного выкидыша."Терапевтически эффективная доза" для ревматоидного артрита предпочтительно выражается в Предварительном определении улучшения ACR20 у пациентов, более предпочтительно в Предварительном определении улучшения ACR50 и даже более предпочтительно в Предварительном определении улучшения ACR70. Предварительное определение улучшения ACR20 определяют как 20% улучшение Показателя болезненности сустава (TCJ) и Показателя опухания сустава (SWJ) и 20% улучшение по 3 из 5 следующих критериев: оценка болезненных ощущений у пациента (VAS), оценка общего состояния пациента (VAS), самооценка нетрудоспособности пациента (HAQ), реагент острой фазы (CRP или ESR).ACR50 и ACR70 определяют аналогичным образом при улучшениях 50 и 70% соответственно. Более подробное описание см. в работе Felson и соавт. Американская корпорация по Ревматологическому предварительному определению улучшения при ревматоидном артрите (American College ofRheumatology Preliminary Definition of Improvement in Rheumatoid Arthritis); Arthritis Rheumatism, 38: 727-735 (1995). Способность соединения подавлять развитие рака можно оценить в системе модели на животных,предсказывающей эффективность в отношении опухолей человека. Альтернативно, данное свойство композиции можно оценить путем исследования подавляющей способности соединения, данное подавление in vitro определяют с помощью анализов, известных компетентным практическим исследователям. Терапевтически эффективное количество терапевтического соединения может уменьшать размер опухоли или иным образом ослаблять симптомы у субъекта. Обычный специалист в данной области смог бы определить данные количества на основе таких факторов, как размер субъекта, тяжесть симптомов заболевания у субъекта, а также выбор конкретной композиции и способа введения. Согласно способам, хорошо известным в области техники, может быть также определена способность антител лечить или предупреждать развитие псориаза. Композиция должна быть стерильной и текучей до такой степени, чтобы композицию можно было доставлять с помощью шприца. Кроме воды, носитель может быть представлен изотоническим забуференным солевым раствором, этанолом, полиолом (например, глицерином, пропиленгликолем и жидким полиэтиленгликолем и т.п.), а также их подходящими смесями. Надлежащую текучесть можно поддерживать, например, с помощью таких покрывающих материалов, как лецитин, поддержанием требующегося размера частиц в случае дисперсии и применением поверхностно-активных веществ. Во многих случаях предпочтительно введение в композицию изотонических агентов, например сахаров,многоатомных спиртов, таких как маннит и сорбит, или хлорида натрия. Длительное всасывание инъекционных композиций можно осуществить включением в композицию агента, который задерживает всасывание, например моностеарата алюминия или желатина. При соответствующей защите активного соединения, как описано выше, соединение можно принимать перорально, например, с инертным разбавителем или ассимилируемым пищевым носителем.V. Применения и способы, соответствующие изобретению. Человеческие антитела против ИЛ-15, соответствующие данному изобретению, (включая производные и конъюгаты антител) и композиции, содержащие антитела, могут быть использованы в ряде диагностических и терапевтических способов применения in vitro и in vivo. В одном из вариантов осуществления человеческие антитела, соответствующие изобретению, используют для ингибирования индуцируемой ИЛ-15 продукции TNF- T-клетками и/или моноцитами/макрофагами предпочтительно без ингибирования продукции TNF-, индуцируемой другими цитокинами, такими как ИЛ-2. При контактировании антитела с ИЛ-15 (например, при введении антитела субъекту) происходит подавление способности ИЛ-15 к образованию сигнала посредством рецептора ИЛ-15 и таким образом осуществляется ингибирование продукции TNF- T-клетками и/или моноцита- 27015897 ми/макрофагами. Предпочтительные антитела связываются с эпитопами (например, определенными субъединицами, такими как -субъединица), которые обладают специфичностью в отношении ИЛ-15,и, таким образом эффективно ингибируют продукцию TNF-, индуцируемую ИЛ-15, но не нарушают продукцию TNF-, связанную с близкими цитокинами, такими как ИЛ-2. Альтернативно, человеческие антитела используют для нарушения сборки -, - и -цепи рецептора ИЛ-15 и/или ингибирования сборки на соседних клетках, экспрессирующих - и -цепи как часть рецептора ИЛ-15 или другого цитокинового рецептора. В другом варианте осуществления человеческие антитела, соответствующие изобретению, используют для подавления индуцируемых ИЛ-15 рекрутирования и/или пролиферации T-клеток предпочтительно без ингибирования пролиферации T-клеток, индуцируемой другими структурно близкими цитокинами, такими как ИЛ-2. Что касается продукции TNF-, то при контактировании антитела с ИЛ 15 (например, при введении антитела субъекту) происходит подавление способности ИЛ-15 к образованию сигнала посредством рецептора ИЛ-15 и таким образом осуществляется ингибирование стимуляции T-клеток под воздействием ИЛ-15. Соответственно в еще одном варианте осуществления данное изобретение представляет способ лечения или профилактики нарушения, опосредованного ИЛ-15 (например, аутоиммунного заболевания, такого как псориаз, ревматоидный артрит или воспалительное заболевание кишечника, или инфекционного заболевания, такого как ВИЧ), путем введения субъекту человеческого антитела, соответствующего изобретению, в количестве, эффективном для лечения или профилактики нарушения. Антитело может быть введено в виде монотерапии или вместе с другим терапевтическим агентом, таким как противовоспалительный агент, например стероидный или нестероидный противовоспалительный агент, или цитотоксин, который дает сочетанный или синергический эффект с антителом при лечении или профилактике заболевания, опосредованного ИЛ-15. В конкретном варианте осуществления человеческие антитела, соответствующие данному изобретению, используют для лечения или профилактики ревматоидного артрита (RA). Антитела ограничивают роль, которую ИЛ-15 играет в развитии воспаления, ассоциированного с заболеваниями, такими как RA (ревматоидный артрит). T-клетки, в особенности Т-хелперные клетки CD4+, участвуют в инициации и поддержании воспалительных процессов при RA. TNF-, другой цитокин, также участвует в воспалительных путях, которые в конечном счета ведут к разрушению сустава и инвалидности пациента с RA. Местный синтез ИЛ-15 играет ключевую роль как в активации, так и в рекрутировании Tклеток и индукции TNF- и других воспалительных цитокинов. Роль ИЛ-15 в развитии RA включает процесс, при котором ИЛ-15, синтезирующийся в макрофагах, индуцирует рекрутирование T-клеток. Затем активированные T-клетки: (1) поддерживают активацию макрофагов и (2) индуцируют продукцию TNF-. Стимулированные макрофаги способствуют дальнейшему синтезу ИЛ-15 и активации Tклеток, продолжая таким образом данный цикл. Кроме указанных эффектов в отношении TNF- и макрофагов ИЛ-15 активирует также нейтрофилы и воздействует на локальную секрецию иммуноглобулина B-клетками, в частности на синтез ревматоидного фактора. Согласно этому антитела против ИЛ-15, соответствующие изобретению, могут быть использованы для предупреждения или блокирования вышеперечисленных эффектов ИЛ-15, которые вызываютRA, и, таким образом, могут быть использованы для лечения данного заболевания. Например, антитела против ИЛ-15, соответствующие изобретению, могут быть использованы для подавления воспаления и/или предупреждения хемотаксиса активированных лимфоцитов, участвующих в развитии RA. Человеческие антитела, соответствующие данному изобретению, могут быть использованы для подавления развития структурных повреждений у пациентов с ревматоидным артритом, которые давали неадекватную реакцию на метотрексат, или для уменьшения признаков и симптомов, а также задержки появления структурных нарушений у пациентов со средним до тяжелого активным ревматоидным артритом, включая больных, которых ранее безуспешно лечили DMARD. Человеческие антитела, соответствующие данному изобретению, могут быть также использованы для блокирования или подавления других эффектов ИЛ-15. ИЛ-15 экспрессируется в различных клетках и тканях, включая моноциты и макрофаги, фибробласты, дендритные клетки и кератиноциты. Кератиноциты являются основным компонентом эпидермиса и эпителиальной выстилки слизистой ткани. Контроль роста кератиноцитов опосредуется сложным комплексом цитокинов и факторов роста, ряд которых продуцируют сами кератиноциты. ИЛ-15 из кератиноцитов участвует в процессах кумуляции,пролиферации и выживаемости T-клеток в псориазных бляшках. Известно множество заболеваний, при которых повышается число кератиноцитов, что приводит к гиперплазии эпидермиса, обусловливающей, по меньшей мере, некоторые из симптомов, связанных с заболеванием. Данные заболевания включают такие хронические заболевания, как псориаз и атопический дерматит, а также состояния,как, например, хроническая экзема кистей рук, контактный дерматит, вирусные бородавки (ассоциированные с HPV (вирусом папилломы человека, кожная T-клеточная лимфома, нарушения заживления ран, такие как плохо заживающие раны при диабете. Соответственно в изобретении представлены способы лечения или профилактики данных нарушений посредством введения пациентам человеческого- 28015897 антитела против ИЛ-15, соответствующего изобретению, в количестве, эффективном для лечения или профилактики нарушения. Например, антитела против ИЛ-15, соответствующие изобретению, могут быть использованы для блокирования или подавления паракератоза при псориазе, снижения толщины эпидермиса при псориазе и уменьшения пролиферации кератиноцитов при псориазе. ИЛ-15 модулирует также функцию кишечных эпителиальных клеток (см. статью Reinecker и соавт., Gastroenterology, 111:1706-13 (1996. В частности, ИЛ-15 может вызывать модификации эпителиальных клеток слизистой оболочки и клеточных линий кишечного эпителия и, вследствие этого, участвует в патогенезе воспалительного заболевания кишечника, например заболевания брюшной полости. Роль ИЛ-15 в данных заболеваниях показана на основании избирательной сверхпрезентации клеток ИЛ-15+ в тонкой кишке нелеченых пациентов с заболеванием брюшной полости (см. патентную заявкуWO 00/02582). Так, показано, что ИЛ-15 непосредственно участвует в инициации и течении заболевания брюшной полости. Соответственно в другом варианте осуществления человеческие антитела против ИЛ-15, соответствующие данному изобретению (т.е. ингибирующие провоспалительные эффекты ИЛ-15), могут быть использованы для лечения и/или профилактики заболевания брюшной полости посредством введения антитела пациенту в количестве, эффективном для лечения или профилактики нарушения. Кроме того, авторами данного изобретения обнаружено, что ИЛ-15 способствует также образованию новых кровеносных сосудов, т.е. процессу, называемому неоваскуляризацией или ангиогенезом. Соответственно еще одно применение антител, соответствующих изобретению, включает профилактику или лечение заболеваний с участием неоваскуляризации. Кроме воспалительных заболеваний данные заболевания включают многие формы рака, которые зависят от неоваскуляризации или характеризуются неоваскуляризацией. Человеческие антитела, соответствующие данному изобретению, могут быть также использованы для блокирования или ингибирования эффектов ИЛ-15, ассоциированных с инфекционными заболеваниями, таким как ВИЧ. Соответственно другое применение антител, соответствующих изобретению,включает профилактику или лечение инфекционных заболеваний, например ВИЧ-1. Например, антитела могут быть использованы in vitro или in vivo для диагностики ряда заболеваний, опосредованных ИЛ-15. В частности, антитела могут быть использованы для детекции уровней ИЛ-15 или уровней клеток, которые на поверхности мембраны содержат ИЛ-15, или он связан с их рецепторами (связанный с рецептором человеческий ИЛ-15). Затем может быть установлена корреляция определения данных уровней ИЛ-15 с определенными симптомами заболевания. Альтернативно, антитела могут быть использованы для ингибирования или блокирования функции ИЛ-15, которая, в свою очередь, может препятствовать появлению или ослаблять симптомы заболевания, вызываемые функцией ИЛ-15. Как описано ранее, человеческие антитела против ИЛ-15, соответствующие изобретению, могут быть введены с одним или более других терапевтических агентов, например иммунодепрессантом или противовоспалительным агентом, для усиления общего противовоспалительного эффекта. Антитело может быть связано с агентом (таким, как иммунокомплекс) или может быть введено отдельно от агента. В последнем случае (раздельное введение), антитело может вводиться до, после или одновременно с агентом. Подходящие терапевтические агенты включают среди прочих противовоспалительные агенты,DMARD (противоревматические лекарственные препараты, модифицирующие заболевание), иммунодепрессанты, химиотерапевтические агенты и агенты для лечения псориаза. Человеческие антитела,соответствующие изобретению, могут быть также введены в сочетании с радиотерапией. В другом варианте осуществления человеческие антитела, соответствующие изобретению, могут быть введены в комбинации с другими антителами, такими как CD4-специфические антитела и ИЛ-2 специфические антитела. Считают, что комбинация данных человеческих антител с CD4 специфическими антителами или ИЛ-2-специфическими антителами особенно эффективна для лечения аутоиммунных заболеваний и отторжения трансплантатов. В объем данного изобретения входят также наборы, содержащие человеческие антитела против ИЛ-15, соответствующие изобретению, и (необязательно) инструкции по применению. Кроме того,набор может содержать один или более дополнительных реагентов, таких как иммунодепрессанты, или одно или более дополнительных человеческих антител, соответствующих изобретению (например, человеческое антитело, обладающее комплементарной активностью, которое связывается с эпитопом на антигене ИЛ-15, отличном от эпитопа связывания первого человеческого антитела). Соответственно пациентам, леченным антителами, соответствующими изобретению, можно дополнительно ввести (до, одновременно или после введения человеческого антитела, соответствующего изобретению) другой терапевтический агент, такой как противовоспалительный агент, который усиливает или повышает терапевтический эффект человеческих антител. В еще одном варианте осуществления человеческие антитела, соответствующие изобретению, могут быть использованы для того, чтобы направить соединения (например, терапевтические агенты, метки, цитотоксины, иммунодепрессанты и т.п.) на клетки, с поверхностью которых связан ИЛ-15 (например, связанный с мембраной или связанный с рецептором ИЛ-15) путем присоединения данных соеди- 29