Способы очистки ab-связывающего белка, содержащего область fc

(71)(73) Заявитель и патентовладелец: ЭЛАН ФАРМА ИНТЕРНЭШНЛ ЛИМИТЕД (IE); ВАЙЕТ (US) Настоящее изобретение предусматривает способы очистки А-связывающих белков, имеющих область Fc, например антител к А или слитых антител, адсорбцией A-связывающего белка наFc-связывающем агенте, например, таком как белок А или белок G, промыванием буфером соли двухвалентного катиона для удаления примесей с последующей регенерацией адсорбированного А-связывающего белка. Настоящее изобретение также предусматривает способы элюции очищенного А-связывающего белка, а также включение способов в схему (цепь) очистки. Также предусматриваются наборы, содержащие компоненты для осуществления способов и инструкции по применению. 015148 Предпосылки создания изобретения Болезнь Альцгеймера (AD) представляет собой нейродегенеративное нарушение, характеризующееся наличием амилоидных бляшек, нейрофибриллярных узлов и значительной утратой нейронов.-амилоидный белок (также в данном описании называемый А-пептид), основной компонент сенильных бляшек, непосредственно связан с патогенезом болезни Альцгеймера (Selkoe (1989), Cell 58: 611612; Hardy (1997), Trends Neurosci. 20: 154-159). Показано, что -амилоид обладает как прямой токсичностью в отношении культивируемых нейронов (Lorenzo and Yankner (1996), Ann. NY Acad. Sci. 777: 8995), так и косвенной токсичностью через различные медиаторы (Koh et al. (1990), Brain Research 533: 315-320; Mattson et al. (1992), J. Neurosciences 12: 376-389). Кроме того, в исследованиях на in vivo моделях, включая мышиную PDAPP и крысиную модель, связывают -амилоид с изучением недостаточности,измененной когнитивной функции и ингибирования долговременного потенцирования в гиппокампе(Chen et al. (2000), Nature 408: 975-985; Walsh et al. (2002), Nature 416: 535-539). Поэтому большой интерес вызывают терапевтические средства, которые изменяют уровни -амилоида, что, теоретически, снижает тяжесть заболевания или даже "аннулирует" саму болезнь. Один метод лечения AD, разработанный недавно под влиянием успешных исследований на PDAPP мышиной и крысиной экспериментальных моделях, представляет собой метод пассивной иммунизации индивидуума с целью предоставить иммуноглобулины, такие как антитела, специфические к -амилоиду(см., например, Bard et al. (2000), Nat. Med. 6: 916-919 и Bard et al. (2003), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100: 2023-2028). Недавно было также показано, что восстановление Abeta (бета-амилоидного пептида) с помощью пассивной иммунизации защищает от прогрессирующей утраты за счет синаптической дегенерации у трансгенной мышиной модели болезни Альцгеймера (Buttini et al. (2005), J. Neurosci. 25: 9096-101). Последние достижения рекомбинантной технологии позволили получать антитела фактически против любой мишени, например раковых клеток, бактерий и вирусов. Как правило, антитело продуцируют,используя клеточную линию, которая создана для экспрессии высоких уровней антитела. Получаемую генной инженерией (методом рекомбинантной ДНК) линию клеток затем выращивают в культуре, которая содержит сложную смесь сахаров, аминокислот и факторов роста, а также различные белки, включая,например, сывороточные белки. Однако отделение полных антител от побочных клеточных продуктов и компонентов культур с целью достижения чистоты, достаточной для применения в исследовании или в качестве терапевтических средств, является трудной задачей. Очистка антител особенно важна, если антитела предназначены для применения в качестве лекарства, вводимого человеку. Традиционные схемы (или технологические линии) очистки антител часто включают стадию хроматографии, которая основана на способности антитела предпочтительно связываться с, или удерживаться, твердой фазой (или функционализированной твердой фазой) в хроматографической колонке по сравнению со связыванием, или удерживанием, различных примесей. Предложена или осуществлена схема очистки антител, по которой белки, содержащие область СН 2/СН 3, сначала связывают с белком А,иммобилизованным на твердой фазе, а затем удаляют примеси, связанные с твердой фазой, гидрофобным электролитическим растворителем с последующим извлечением белков, содержащих область СН 2/СН 3, из твердой фазы. Однако ограниченность этих схем заключается в том, что условия, применяемые для предпочтительного связывания белков, содержащих область СН 2/СН 3, также способствуют связыванию примесей (например, антител с неполными СН 2/СН 3 областями). При разработке терапевтических средств для человека такие примеси крайне нежелательны. Следовательно, существует необходимость усовершенствовать очистку белков или полипептидов,содержащих константные области, в частности белки, содержащие области Fc (например, антитела), продуцируемые в культуре клеток. Сущность изобретения Настоящее изобретение предусматривает способы очистки А-связывающих белков, в частности А-связывающих антител. Способы по изобретению особенно применимы для очистки белков (например, антител), предназначенных для введения человеку. В частности, изобретение предусматривает очистку белков, имеющих константные области, в особенности белков, имеющих области Fc (например, антител), полученных в культуре клеток. В различных аспектах настоящее изобретение предусматривает способы выделения Асвязывающего белка, содержащего Fc-область, такого как антитела против А, из исходной жидкости,содержащей белок и одну или более примесей. В способе по изобретению А-связывающий белок адсорбируется на F-связывающем агенте, а затем Fc-связывающий агент промывают буферным раствором,содержащим соль двухвалентного катиона, удаляя одну или более примесей. Затем белок выделяют изFc-связывающего агента раствором для элюции. Способы по изобретению особенно применимы для удаления примесей, таких как частицы вариантов, полученных при использовании интронов, содержащих открытую рамку считывания (IRT), частицы с недостающими дисульфидными связями (UDB) и/или варианты низкомолекулярных частиц (LMW). Способы по изобретению также применимы для эффективного удаления таких примесей, как белки клеток-хозяев (НСР) и ДНК. Способы по настоящему изобретению включают одну или более стадий хроматографического раз-1 015148 деления и, кроме того, могут включать одну или более стадий фильтрации. Стадии хроматографического разделения могут быть непрерывными или периодическими (например, партиями) или их комбинацией. В различных вариантах изобретения способы включают одну или более стадий фильтрации, например,для удаления вирусов, концентрации и забуферивания раствора, содержащего целевой белок, и для удаления микробных примесей. В различных вариантах изобретения антитело против А представляет собой мышиное антитело,химерное антитело, гуманизированное антитело или человеческое антитело. В некоторых вариантах изобретения антитело против А представляет собой антитело, которое специфически связывается эпитопом в остатках А 1-7, 1-5, 3-7, 3-6, 13-28, 15-24, 16-24, 16-21, 19-22, 33-40, 33-42. Типичные антитела против А специфически связываются с эпитопом в остатках 1-10 А, например в остатках А 1-7, 1-5, 3-7 или 3-6. Другие типичные антитела к А специфически связываются с эпитопом в остатках А 13-28, например в остатках А 16-21 или 19-22. Другие типичные антитела против А специфически связываются с С-концевым эпитопом А, таким как, например, 33-40 или 33-42 белка А. В некоторых вариантах изобретения антитело против А связывает прерывистый эпитоп, который включает остатки в пределах 1-7 и 13-28 белка А. Другие варианты изобретения предусматривают Fab, F(ab')2 или Fv фрагменты антител против А. В некоторых вариантах изобретения антитело является биспецифическим антителом или антителом, полученным способом, описанным в опубликованной патентной заявке WO 03/070760. В предпочтительном варианте изобретения антитело является "гуманизированным" антителом против А, а в некоторых вариантах изобретения антитело к А выбирают из группы, состоящей из 3D6,10D5, 12 В 4, 12 А 11, 15 С 11 и 266. Изотип антитела может представлять собой IgM, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 или любой другой фармацевтически приемлемый изотип. В предпочтительных вариантах изобретения изотип представляет собой человеческий IgG1 или человеческий IgG4. В различных вариантах изобретения А-связывающий белок получают методом рекомбинантной ДНК. В различных вариантах изобретения А-связывающий белок получают методом рекомбинантной ДНК в клетках яичников китайского хомячка (СНО). В различных вариантах изобретения одна или более примесей представляют собой один или более белок клетки-хозяина, ДНК клетки-хозяина, белок клеточной культуры, нежелательную частицу Асвязывающего белка и их смеси. Например, в различных вариантах изобретения нежелательная частица А-связывающего белка представляет собой одну или более цепей антитела или их фрагментов, содержащих последовательность считывания интрона, одну или более цепей антитела или их фрагментов, содержащих некорректную дисульфидную связь, половина антитела или его фрагмент, димер легкой цепи или его фрагмент и димер тяжелой цепи или его фрагмент. В одном аспекте способы по настоящему изобретению позволяют очищать А-связывающий белок,предпочтительно антитело к А, из исходной жидкости, содержащей белок и одну или более примесей,сначала адсорбируя белок на Fc-связывающем агенте (связывая белок с Fc-связывающим агентом), затем промывая Fc-связывающий агент буферным раствором, содержащим соль двухвалентного катиона, с удалением одной или более примесей, а потом выделяя (извлекая) белок из Fc-связывающего агента. В различных вариантах изобретения стадии адсорбции белка на Fc-связывающем агенте и промывание Fcсвязывающего агента буферным раствором, содержащим соль двухвалентного катиона, осуществляют при температуре в примерном интервале 2-24 С. В различных вариантах изобретения стадия извлечения белка из Fc-связывающего агента включает элюирование белка буфером для элюции, рН которого равен примерно 2.0-6.5. В различных вариантах изобретения агент, связывающий область Fc, представляет собой один или более из белка А и белка G. В предпочтительном варианте Fc-связывающий агент иммобилизован на твердой фазе. Эта твердая фаза может представлять собой, например, один или более следующих компонентов: гранулы, агарозную матрицу, диоксид кремния и их смеси. Соль двухвалентного катиона в буфере, применяемом для промывания Fc-связывающего агента,может представлять собой, например, хаотропную соль. Соли двухвалентного катиона, подходящие для приготовления буферного раствора для промывки, включают, но без ограничения, хлорид магния, хлорид кальция, хлорид никеля и их смеси. В различных вариантах изобретения соли двухвалентных катионов, подходящие для приготовления буферного раствора для промывания, включают, но без ограничения, соли: тиоцианаты (SCN-), перхлораты (ClO4-), нитраты (NO3-), хлориды и бромиды двухвалентных катионов II группы (например, магния, кальция, бария и т.д.), двухвалентных переходных металлов катионов (например, меди, никеля, марганца и т.д.) и комбинации этих катионов. В различных вариантах изобретения рН буферного раствора, содержащего соль двухвалентного катиона, находится в примерном интервале 4-9, а в некоторых вариантах изобретения в примерном интервале 4-8, в примерном интервале 4.5-7.5 или в примерном интервале 6-8. Предполагается также, что значения и интервалы, входящие в набор интервалов и/или промежуточные в интервалах по данному описанию, также входят в объем настоящего изобретения. Например, соль двухвалентного катиона имеет рН примерно 7.1-7.9, примерно 7.2-7.9, примерно 7.3-7.7, примерно 7.4-7.6, примерно 4-5, примерно 5-6,примерно 6-7 или примерно 8-9.-2 015148 Кроме того, предполагается, что интервалы между значениями, представленными в данном описании в качестве верхнего или нижнего предела, входят в объем настоящего изобретения. Например, соль двухвалентного катиона имеет рН по меньшей мере около (или около) 4.5, 5, 5.5, 6, 6.5, 7, 7.5 или 8. В различных вариантах настоящего изобретения концентрация соли двухвалентного катиона в буферном растворе равна примерно 0.1-5 М, а в некоторых вариантах изобретения примерно 0.5-3 М, примерно 1.0-3 М или примерно 0.6-2.5 М. Например, буферный раствор соли двухвалентного катиона может содержать около 0.6 М CaCl2, или по меньшей мере около 2 М MgCl2, или по меньшей мере около 2 М CaCl2. Предполагается также, что величины и интервалы, входящие в интервалы и/или промежуточные в интервалах по данному описанию, входят в объем настоящего изобретения. Например, концентрация буферного раствора соли двухвалентного катиона составляет примерно 0.5-0.75 М, примерно 0.5-0.8 М, примерно 0.5-0.9 М, примерно 0.5-1.0 М, примерно 0.5-2.0 М, примерно 1.5-2.0 М, примерно 1.5-2.5 М, примерно 1.5-3.0 М или примерно 2.5-3.0 М. Кроме того, предполагается, что интервалы между значениями, представленными в данном описании в качестве верхнего или нижнего пределов, входят в объем настоящего изобретения. Например, концентрация соли двухвалентного катиона в буферном растворе равна по меньшей мере примерно (или примерно) 0.6 М, 1 М, 1.5 М, 2 М, 2.5 М или 3 М. В различных вариантах изобретения температура буферного раствора, содержащего соль двухвалентного катиона, равна около 2-24 С. В различных вариантах изобретения стадия регенерации антитела из Fc-связывающего агента включает элюцию антитела с применением элюирующего буфера, имеющего рН в интервале около 2.06.5, предпочтительно в интервале около 2.0-4.0, более предпочтительно в интервале около 2.5-3.5. Предполагается, что величины и интервалы, входящие в интервалы и/или промежуточные в интервалах по данному описанию, входят в объем настоящего изобретения. Например, элюирующий буфер (буфер для элюции) имеет рН около 2-3 или около 3-4. Кроме того, предполагается, что интервалы между значениями, представленными в данном описании в качестве верхнего или нижнего пределов, входят в объем настоящего изобретения. Например,элюирующий буфер имеет рН по меньшей мере около (или около) 2, 2.5, 3, 3.5 или 4. В различных вариантах изобретения можно проводить дополнительную стадию очистки регенерированных белков либо до, либо после стадии хроматографии на Fc-связывающем агенте. Например, типичная дополнительная стадия очистки включает, но без ограничения, анионообменную хроматографию,катионообменную хроматографию, аффинную хроматографию с иммобилизованным ионом металла,хроматографию с гидрофобным взаимодействием (HIC), хроматографию на гидроксиапатите, диализ,аффинную хроматографию, осаждение сульфатом аммония, осаждение этанолом, обращенно-фазовую ВЭЖХ (ОФ-ВЭЖХ), хроматофокусирование, ультрафильтрацию, диафильтрацию, микрофильтрацию и гель-фильтрацию (гель-хроматографию). В различных вариантах изобретения за стадией хроматографии на Fc-связывающем агенте следует стадия анионообменной хроматографии и стадия HIC. В различных вариантах изобретения после стадий хроматографии следует стадия фильтрации вирусов, стадия ультрафильтрации/диафильтрации и/или стадия фильтрации микробных примесей. В одном аспекте настоящее изобретение предусматривает способы очистки А-связывающего белка, предпочтительно антитела против А, от содержащего примеси раствора этого белка. В различных вариантах изобретения способы включают, во-первых, адсорбирование белка на Fc-связывающем агенте с последующим промыванием Fc-связывающего агента буферным раствором, содержащим соль двухвалентного катиона, с целью удаления одной или более примесей и последующую регенерацию белка изFc-связывающего агента для получения первого элюированного пула (собранных элюированных фракций). В различных вариантах изобретения процесс очистки продолжает ионообменная хроматография первого элюированного пула (пула элюента) при контактировании ионообменной смолы с первым полом элюента таким образом, что целевой белок не адсорбируется смолой, а регенерируется проходящий целевой белок, получают второй элюированный пул. В различных вариантах изобретения стадия ионообменной хроматографии дополнительно включает промывание ионообменной смолы буферным раствором для промывания с целью регенерировать по меньшей мере часть какого-либо адсорбированного целевого белка. В различных вариантах изобретения процесс очистки продолжают хроматография с гидрофобным взаимодействием второго пула элюента, адсорбируя целевой белок на смоле с гидрофобным взаимодействием (например, твердая фаза функционализована гидрофобными лигандами), промывание смолы с гидрофобным взаимодействием буферным промывающим раствором с ионной силой, которая позволяет практически не элюировать целевой белок, и регенерация очищенного целевого белка (обычно элюирующим буфером с ионной силой, достаточно низкой, чтобы десорбировать целевой белок со смолы с гидрофобным взаимодействием). В предпочтительных вариантах различных аспектов изобретения Fc-связывающий агент иммобилизован на твердой фазе, которую предпочтительно перед контактированием с исходной жидкостью уравновешивают подходящим буфером. Твердая фаза предпочтительно представляет собой колонку, содер-3 015148 жащую агарозу, иммобилизующую Fc-связывающий агент. В различных вариантах изобретения колонку покрывают реагентом, таким как глицерин, для уменьшения или предотвращения неспецифической адгезии к колонке. В различных вариантах изобретения белки, очищенные методами по настоящему изобретению,можно приготовить в виде препарата с фармацевтически приемлемым носителем и использовать для диагностических, терапевтических или других целей, известных для таких соединений. В различных аспектах настоящее изобретение предусматривает способы очистки А-связывающего белка, предпочтительно антитела к А, из раствора, содержащего белок и варианты (IRT), полученные с использованием интрона с открытой рамкой считывания (считывание интрона). В характерных аспектах способы по настоящему изобретению используют для снижения уровней одного или более вариантов,полученных при считывании интронов, в белковом препарате, например в препарате антитела. В различных вариантах изобретения уровень вариантов белка, полученных при считывании интронов, в белке,регенерированном из Fc-связывающего агента, по меньшей мере в 5 раз ниже, чем уровень вариантов считывания интронов в исходной жидкости, а в некоторых вариантах изобретения - по меньшей мере в 10 раз ниже, чем уровень вариантов "считывании интронов" в исходной жидкости. В различных вариантах изобретения варианты, полученные при считывании интронов, составляют менее примерно 1.0, 0.8,0.5, 0.2 или 0.1% от указанного белка в растворе, содержащем указанный белок, регенерированный из Fcсвязывающего агента. В различных аспектах настоящее изобретение предусматривает способы очистки А-связывающего белка, предпочтительно антитела к А, из раствора, содержащего белок и его низкомолекулярные варианты (LMW). В характерных аспектах способы по настоящему изобретению используют для снижения уровней одного или более низкомолекулярных вариантов в белковом препарате, таком как препарат антитела. В различных вариантах изобретения уровень низкомолекулярных вариантов белка в белке, регенерированном из Fc-связывающего агента, по меньшей мере в 5 раз ниже, чем уровень низкомолекулярных вариантов белка в исходной жидкости, а в некоторых вариантах изобретения по меньшей мере в 10 раз ниже, чем уровень низкомолекулярных вариантов в исходной жидкости. В различных вариантах изобретения низкомолекулярные варианты составляют менее примерно 1.0, 0.8, 0.5, 0.2 или 0.1% от указанного белка в растворе, содержащем указанный белок, регенерированный из Fc-связывающего агента. В различных аспектах настоящее изобретение предусматривает способы очистки А-связывающего белка, предпочтительно антитела к А, из раствора, содержащего белок и его варианты с недостающей дисульфидной связью (UDB). В характерных аспектах способы по настоящему изобретению используют для снижения уровней одного или более вариантов с недостающей дисульфидной связью в белковом препарате, таком как препаратантитела. В различных вариантах изобретения уровень вариантов белка с недостающей дисульфидной связью в белке, регенерированном из Fc-связывающего агента, по меньшей мере в 5 раз ниже, чем уровень вариантов белка с недостающей дисульфидной связью в исходной жидкости, а в некоторых вариантах изобретения - по меньшей мере в 10 раз ниже, чем уровень вариантов с недостающей дисульфидной связью в исходной жидкости. В различных вариантах изобретения варианты с недостающей дисульфидной связью составляют менее примерно 20, 15, 5, 2 или 1% от указанного белка в растворе, содержащем указанный белок, регенерированный из Fc-связывающего агента. В другом аспекте настоящее изобретение предусматривает А-связывающий белок, предпочтительно антитело к А, очищенное любым из способов, который включает, по меньшей мере, стадии, вопервых, адсорбции белка с Fc-связывающим агентом с последующим промыванием Fc-связывающего агента буферным раствором, содержащим соль двухвалентного катиона, для удаления одной или более примесей, а затем стадию регенерации белка из Fc-связывающего агента. В различных вариантах изобретения антитело к А является гуманизированным антителом к A, выбранным из группы, состоящей из 3D6, 10D5, 12 В 4, 12 А 11, 15 С 11 и 266. В различных вариантах изобретения антитело к А является гуманизированным антителом к А, выбранным из группы, состоящей из 3D6, 10D5, 12 В 4 и 12 А 11. В другом аспекте настоящее изобретение предусматривает систему, пригодную для осуществления любых способов, которые включают, по меньшей мере, во-первых, стадии адсорбции А-связывающего белка, содержащего Fc-область, такого как антитело к А, с Fc-связывающим агентом с последующим промыванием Fc-связывающего агента буферным раствором, содержащим соль двухвалентного катиона,для удаления одной или более примесей, а затем регенерацию белка из Fc-связывающего агента. В других аспектах настоящее изобретение предусматривает линию (схему) очистки для осуществления любого из способов, которые включают, по меньшей мере, во-первых, стадии адсорбции Асвязывающего белка, такого как антитело к А, с Fc-связывающим агентом с последующим промыванием Fc-связывающего агента буферным раствором, содержащим соль двухвалентного катиона, для удаления одной или более примесей, а затем регенерацию белка из Fc-связывающего агента. Также настоящее изобретение предусматривает в различных аспектах наборы для применения при осуществлении одного или более способов по настоящему изобретению. В различных вариантах изобретения набор содержит по меньшей мере один реагент и инструкции по применению набора. Например,набор может содержать один или более реагентов, таких как Fc-связывающий агент, соль двухвалентно-4 015148 го катиона и реагенты для приготовления буферного промывающего раствора, содержащего соль двухвалентного катиона, наряду с инструкциями по применению набора, например, для очистки Асвязывающего белка, например антитела к А. Краткое описание чертежа На фигуре показаны полные аминокислотные последовательности легкой и тяжелой цепей гуманизированного антитела к А 3D6 версия 2 (hu3D6.v2), SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 2 соответственно. Гипервариабельные области (CDR) легкой цепи, т.е. CDR1, CDR2 и CDR3, расположены соответственно в остатках в положениях 24-39, 55-61 и 94-102 (верхняя панель). Гипервариабельные области (CDR) тяжелой цепи, т.е. CDR1, CDR2 и CDR3, расположены соответственно в остатках в положениях 40-44, 50-65 и 99-108 (нижняя панель). Ожидаемые внутримолекулярные дисульфидные связи показаны в виде связей имеющихся дисульфидных остатков. Цистеиновые остатки, предположительно, образующие внутримолекулярные дисульфидные связи, подчеркнуты и связи показаны. Типичный сайт N-гликозилирования тяжелой цепи антитела показан курсивом в положениях остатков 299-301 (нижняя панель). Предсказанный С-концевой лизин тяжелой цепи показан в скобках. Подробное описание изобретения Для лучшего понимания данного изобретения прежде, чем описывать его подробно, целесообразно дать определения некоторых терминов, используемых в данном описании. Определения, представленные в данном описании, сгруппированы лишь для того, чтобы проще было ссылаться, но не для ограничения. Определения, относящиеся к белкам. Настоящее изобретение предусматривает способы очистки А-связывающих белков, в частности А-связывающих антител. В частности, данное изобретение включает очистку белков, содержащих константные области, в частности белки, имеющие Fc-области (например, антитела), продуцированные в культуре клеток. В различных аспектах настоящее изобретение предусматривает способы очистки Асвязывающего белка, который содержит Fc-область, такого как антитело к А, из раствора, содержащего белок и один или более его вариантов, образующихся при считывании (трансляции), например, вариантов трансляции гена с интронами. В характерных аспектах способы по настоящему изобретению используют для снижения уровней частиц одного или более вариантов, полученных трансляцией генов с интронами (IRT), в белковом препарате, например в препарате антитела. Выражения "вариант, полученный считыванием интрона" ("вариант со считыванием интрона") и "частицы вариантов, полученных считыванием интрона" используются взаимозаменяемо в данном описании и относятся к продукту процесса, в котором при синтезе А-связывающего белка элонгация полипептидной цепи заканчивается ранее транскрипции кодирующей области с помощью стоп-кодона в интроне, предшествующем кодирующей области. В результате получают представляющий интерес вариант белка (т.е. вариант со считыванием интрона), в котором имеется один или более неполных доменов или отсутствующие домены. Такие интроны могут содержать более одного стоп-кодона, что приводит к продуцированию нескольких различных вариантов считывания интрона. Выражение "вариант с недостающими дисульфидными связями" ("вариант с недостающей дисульфидной связью" или UDB) относится к любому белку, в котором отсутствует (пропущена, утрачена) по меньшей мере одна дисульфидная связь. Отсутствующая дисульфидная связь может быть либо межцепной дисульфидной связью, либо внутрицепной дисульфидной связью, либо их комбинацией. Выражение "низкомолекулярные частицы", или "LMW" частицы, относится к вариантам Асвязывающего белка, например антитела к А, включая белок, который состоит из свободной тяжелой цепи, свободной легкой цепи, IRT частиц, полумолекулярных и "три-четвертимолекулярных" частиц или их смесей. Белок А представляет собой белок клеточной стенки протяженностью около 42 кДа, находящийся в большинстве штаммов Staphylococcus aureas, который связывается с высокой аффинностью (около 10-8 М с человеческим IgG) с Fc-областью антител. Применяемый в данном описании термин "белок А" охватывает белок А, регенерированный (извлеченный) из его нативного источника, белок А, полученный синтетическими методами (например, пептидным синтезом, методом рекомбинантной ДНК и т.д.), и его варианты, которые сохраняют способность связывать белки, содержащие область СН 2/СН 3. Белок G представляет собой белок клеточной стенки группы G streptococci. Белок G представляет собой Fc-рецептор типа III, который с высокой аффинностью связывается с Fc-областью антител, в частности IgG антител. Термин "белок G" по данному описанию охватывает белок G, регенерированный (извлеченный) из его нативного источника, белок G, полученный синтетическими методами (например,пептидным синтезом, методом рекомбинантной ДНК и т.д.), и его варианты, которые сохраняют способность связывать белки, содержащие область Fc. Термины "-амилоидный белок", "-амилоидный пептид", "-амилоид", "А" и "А-пептид" применяются в данном описании равнозначно (взаимозаменяемо). Предполагается, что термин "А-связывающий белок" по данному описанию относится к белку,способному специфически связываться с А-пептидом (пептидами) или эпитопом (эпитопами) внутри указанного (указанных) А-пептида (пептидов) или обладающему заметной аффинностью связывания с-5 015148 А. В типичных вариантах изобретения А-связывающий белок содержит область Fc, так что она может связываться с Fc-связывающим агентом в соответствии со способами по изобретению. Термин "антитело", или "иммуноглобулин" (применяемые в данном описании равнозначно, взаимозаменяемо), относится к антигенсвязывающему белку, имеющему основную структуру из четырех полипептидных цепей, состоящую из двух тяжелых и двух легких цепей, причем указанные цепи стабилизированы, например, межцепными дисульфидными связями, которые обладают способностью специфически связывать антиген. Как тяжелая, так и легкая цепи скручиваются в домены. Термин "антитело", или"иммуноглобулин", включает моноклональные антитела (в том числе полноразмерные (полной длины) моноклональные антитела), поликлональные антитела, полиспецифические антитела (например, биспецифические антитела), химерные антитела, CDR-привитые антитела, "гуманизированные" антитела, человеческие антитела и одноцепочечные антитела (scFvs). Термин "моноклональное антитело", или "композиция моноклонального антитела", по данному описанию относится к популяции антител, которые содержат только один тип антигенсвязывающего сайта, способного распознавать конкретный эпитоп целевого антигена и связываться с ним, например эпитоп(ы) А. Таким образом, композиции моноклонального антитела обычно проявляют единственную специфичность и аффинность связывания в отношении конкретного антигена, с которым у него осуществляется иммунная реакция. Антитела нечеловеческого происхождения можно "гуманизировать" методами, описанными, например, в патенте США 5225539. В одном методе CDR нечеловеческого происхожения встраивают в рамку считывания последовательности антитела человека или консенсусной последовательности антитела человека. Затем можно ввести дополнительные изменения в рамку считывания последовательности антитела с целью модулировать аффинность или иммуногенность. Предполагается, что термин "антитело к А" относится к антителу, обладающему специфичностью связывания с А-пептидом человеческого амилоидного белка-предшественника (АРР). В уровне техники А-пептид известен также как бета-амилоидный пептид. А-пептид представляет собой внутренний фрагмент размером 4 кДа из 39-43 аминокислот АРР (А 39, A40, A41, A42 и А 43 соответственно). Предполагается, что "антитело к А" охватывает антитела, обладающие специфичностью связывания к любой из этих форм А-пептида. Представляющие интерес специфические антитела к А включают, но без ограничения, 3D6, 10D5, 12 В 4, 12 А 11, 15 С 11 и 266 и их гуманизированные варианты. Типичные антитела к А описаны в патентной заявке США регистрационный 10/010942, поданной 6 декабря 2001 г. (опубликованная патентная заявка США 20030165496 А 1; см. также опубликованную патентную заявку РСТWO 2002/46237 A2); в патентной заявке США регистрационный 10/388389, поданной 12 марта 2003 г. (опубликованная патентная заявка США 20040087777 A1; см. также опубликованную патентную заявку РСТWO 2004/080419 А 2); в патентной заявке США регистрационный 10/388214, поданной 12 марта 2003 г. (опубликованная патентная заявка США 20040082762 А 1; см. также опубликованную патентную заявку РСТWO 2003/077858 А 2); в патентной заявке США регистрационный 10/858855, поданной 1 июня 2004 г. (опубликованная патентная заявка США 20050118651 А 1; см. также опубликованную патентную заявку РСТWO 2004/108895 А 2); в патентной заявке США регистрационный 11/304986, поданной 15 декабря 2005 г.; см. такжеPCT/US05/45515; полное содержание всех этих заявок вводится в данное описание в качестве ссылки. Другие типичные антитела к А описаны в патентной заявке США регистрационный 10/226435,поданной 26 февраля 2001 г. (опубликованная патентная заявка США 20040043418 А 1; см. также опубликованную патентную заявку РСТWO 01/062801 A2), в патентной заявке США регистрационный 10/487322, поданной 14 августа 2002 г. (опубликованная патентная заявка США 20040192898 А 1; см. также опубликованную патентную заявку РСТWO 03/016466 A2); в патентной заявке США регистрационный 10/476265, поданной 26 апреля 2002 г. (опубликованная патентная заявка США 20050090648 А 1; см. также опубликованную патентную заявку РСТWO 02/088306A2); в патентной заявке США регистрационный 10/497475, поданной 26 апреля 2002 г. (опубликованная патентная заявка США 20050142131 A1; см. также опубликованную патентную заявку РСТWO 02/088307 A2); в патентной заявке США регистрационный 10/505313, поданной 20 февраля 2003 г. (опубликованная патентная заявка США 20050169925; см. также опубликованную патентную заявку РСТWO 03/070760 A2). Термин "фрагмент антитела" относится к части или участку антитела или цепи антитела, содержащего меньше аминокислотных остатков, чем интактное или полное антитело или цепь антитела. Фрагменты можно получать также методами рекомбинантной ДНК. Типичные фрагменты включают фрагменты Fab, Fab', F(ab')2, Fabc и/или Fv. Методы конструирования Fab фрагментов описаны, например, вHuse, et al. (1989), Science 246: 1275-1281). Другие фрагменты антитела можно получать методами, известными в уровне техники, включая, но без ограничения:(ii) фрагмент Fab, образующийся восстановлением дисульфидных мостиков фрагмента F(ab')2;(iii) фрагмент Fab', образующийся при обработке антитела папаином и восстановителем;-6 015148 Термин "антигенсвязывающий фрагмент" относится к полипептидному фрагменту иммуноглобулина или антитела, который(ое) связывает антиген или конкурирует с интактным антителом, из которого они образованы, за специфическое связывание с антигеном. Термин "домен" относится к глобулярной области полипептида тяжелой или легкой цепи, содержащей пептидные петли (например, содержащей 3-4 пептидные петли), стабилизированные, например,-складкой и/или внутрицепной дисульфидной связью. Кроме того, в данном описании домены называют "константными" или "вариабельными" на основании относительного отсутствия изменений последовательности внутри доменов различных представителей класса в случае "константного" домена или значительного изменения внутри доменов членов различных представителей класса в случае "вариабельного" домена. "Константные" домены на легкой цепи равнозначно (взаимозаменяемо) называют "константными областями легкой цепи", "константными доменами легкой цепи", "CL" областями или "CL" доменами. "Константные" домены тяжелой цепи равнозначно (взаимозаменяемо) называют "константными областями тяжелой цепи", "константными доменами тяжелой цепи", "СН" областями или "СН" доменами. "Вариабельные" домены на легкой цепи равнозначно (взаимозаменяемо) называют "вариабельными областями легкой цепи", "вариабельными доменами легкой цепи", "VL" областями или "VL" доменами."Вариабельные" домены на тяжелой цепи равнозначно (взаимозаменяемо) называют "вариабельными областями тяжелой цепи", "вариабельными доменами тяжелой цепи", "VH" областями или "VH" доменами. Термин "область" может также относиться к части (сегменту) или участку цепи антитела или домена цепи антитела (например, к части или участку тяжелой или легкой цепи или к части или участку константного или вариабельного домена по данному описанию), а также к более дискретным частям (сегментам) или участкам указанных цепей или доменов. Например, легкие и тяжелые цепи или вариабельные домены легкой или тяжелой цепи включают "гипервариабельные области", или "CDR", рассеянные среди "каркасных областей", или "FR", по данному описанию. Термин "конформация" относится к третичной структуре белка или полипептида, такой, например,как антитело, цепь антитела, его домен или область. Например, выражение "конформация легкой (или тяжелой) цепи" относится к третичной структуре вариабельной области легкой (или тяжелой) цепи, а выражение "конформация антитела" или "конформация фрагмента антитела" относится к третичной структуре антитела или его фрагмента. Выражение "специфическое связывание" антитела означает, что антитело проявляет значительную аффинность к конкретному антигену или эпитопу и, как правило, не проявляет заметной кроссреактивности. В типичных примерах антитело не проявляет кросс-реактивности (например, не реагирует перекрестно с не-А-пептидами или с отдаленными или дальними эпитопами на А). Значительное (заметное, ощутимое) или предпочтительное связывание включает связывание с аффинностью по меньшей мере 10-6, 10-7, 10-8, 10-9 или 10-10 М. Более предпочтительна аффинность выше 10-7 М, предпочтительно выше 10-8 М. Предполагается, что промежуточные значения в представленной группе также входят в объем настоящего изобретения, а предпочтительная аффинность связывания может быть указана в виде интервала аффинностей, например 10-6-10-10 М, предпочтительно 10-7-10-10 М, более предпочтительно 108-10-10 М. Антитело, которое "не проявляет заметной кросс-реактивности", представляет собой антитело,которое не связывается в значительной степени с нежелательной частицей (например, нежелательным белком, полипептидом или пептидом). Например, антитело, которое специфически связывается с А, в заметной степени связывает А, но заметно не реагирует с не-А-белками или пептидами (например, неА-белками или пептидами, входящими в состав бляшек). Антитело, специфическое к конкретному эпитопу, не будет в значительной степени перекрестно реагировать с удаленными или отличными эпитопами на том же белке или пептиде. Специфическое связывание можно определить любым принятым в уровне техники методом определения такого связывания. Предпочтительно специфическое связывание определяют методом Скетчарда и/или анализами конкурентного связывания. Под иммуноглобулином или антителом, отличным от "биспецифических" или "бифункциональных" иммуноглобулинов или антител, понимают иммуноглобулин или антитело, имеющие идентичные сайты связывания. "Биспецифическое" или "бифункциональное" антитело представляет собой искусственное гибридное антитело, имеющее две различные пары тяжелая/легкая цепь и два различных сайта связывания. Биспецифические антитела можно получать различными методами, включая слияние гибридом или связывание Fab' фрагментов, см., например, Songsivilai and Lachmann, Clin. Exp. Immunol. 19: 315-321"Антиген" представляет собой соединение (например, белок, полипептид, пептид, углевод или низкомолекулярное соединение (малая молекула, содержащее антигенную детерминанту, с которой специфически связывается антитело. Термин "эпитоп", или "антигенная детерминанта", относится к сайту на антигене, с которым специфически связывается иммуноглобулин или антитело (или его антигенсвязывающий фрагмент). Эпитопы могут быть образованы из соседних аминокислот и несоседних аминокислот, сближающихся за счет фолдинга белка с образованием третичной структуры. Эпитопы, образованные из соседних аминокислот,-7 015148 обычно сохраняются при экспозиции с денатурирующими растворителями, тогда как эпитопы, получающиеся при фолдинге белка с образованием третичной структуры, обычно утрачиваются при обработке денатурирующим растворителем. Эпитоп обычно включает по меньшей мере 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11,12, 13, 14 или 15 аминокислот в уникальной пространственной конформации. Методы определения пространственной конформации эпитопов включают, например, рентгеноструктурный анализ и двумерный ядерный магнитный резонанс, см., например, Epitope Mapping Protocols в Methods in Molecular Biology,Vol. 66, G.E. Morris, Ed. (1996). Помимо описанных выше антител к А, другие А-связывающие белки включают слитые белки,содержащие антитело. Выражения "слитые белки, включающие антитело" и "слияние антитела" относятся к слитому белку, включающему целое антитело или часть антитела, слитое (слитую) по меньшей мере с частью отличного от антитела белка или с отличным от антитела полипептидом. Слияние обычно осуществляют методами генной инженерии (методами рекомбинантной ДНК). Дополнительные типичные слитые белки, содержащие антитело, включают участок связывания антитела (включая область Fc) с клеточным рецептором, слитый с целым другим растворимым или клеточным биологическим белком или его участком, например с рецептором (клеточным или растворимым) или его участком, цитокином или его частью, ферментом или его участком и т.д. В частности, слитый белок, содержащий антитело, по изобретению может содержать область Fc антитела, слитую с отличным от антитела участком белка или полипептидом, способным связываться с А. Термин "Fc-связывающий агент" относится к соединению, способному связываться с областью Fc антитела (например, IgG антитела), включая, но без ограничения, белок комплемента, Fc-рецептор или бактериальный белок, такой как белок А или белок G, обладающий высокой аффинностью к области Fc антитела. Термин "область Fc" относится к С-концевой области антитела IgG, в частности к С-концевой области тяжелой (тяжелых) цепи (цепей) указанного IgG антитела. Хотя границы области Fc тяжелой цепи могут немного меняться, область Fc обычно определяют как область тяжелой цепи (тяжелых цепей) IgG от аминокислотного остатка Cys226 до карбоксильного конца. Определения, относящиеся к хроматографии. Выражение "исходная жидкость" по данному описанию относится к жидкости, содержащей по меньшей мере одно целевое вещество, которое хотят очистить от других имеющихся веществ. Исходные жидкости могут быть, например, водными растворами, системами органических растворителей или смеси или растворы водных/органических растворителей. Исходные жидкости часто являются сложными смесями или растворами, содержащими многие биологические соединения (такие как белки, антитела,гормоны и вирусы), малые молекулы (такие как соли, сахара, липиды и т.д.) и даже частицы твердого вещества. Хотя типичная исходная жидкость биологического происхождения может вначале быть в виде водного раствора или суспензии, она может также содержать органические растворители, использовавшиеся на предыдущих стадиях разделения, таких как осаждение растворителем, экстракция и т.д Примеры исходных жидкостей, которые могут содержать ценные биологические вещества, подлежащие очистке в различных вариантах настоящего изобретения, но без ограничения, культуральный супернатант,гомогенизированную клеточную суспензию, плазму, фракции плазмы и молоко. Выражение "целевое вещество", или "целевой белок", или "целевое антитело", в данном описании относится к одному или более заданных А-связывающих белков, например антител к А, которые следует очистить из исходной жидкости. Целевое вещество может находиться в исходной жидкости в виде суспензии или раствора. Термин "примеси" относится к материалам в исходной жидкости, отличным от целевого (целевых) вещества (веществ) и, желательно, исключенным из конечного целевого продукта (конечных целевых продуктов). Типичные примеси включают нуклеиновые кислоты, белки (включая продукты считывания интрона, низкомолекулярные частицы и частицы с недостающими дисульфидными связями), пептиды,эндотоксины, вирусы и малые молекулы. Термин "побочный продукт" включает нежелательные продукты, которые снижают или уменьшают долю терапевтического белка по изобретению. Выражение "высокомолекулярные продукты" относится к комплексам белков, молекулярная масса которых выше, чем у заданного белка по изобретению. В случае антитела, например IgG антитела, такие агрегаты по размеру больше примерно 150 кДа. Выражение "низкомолекулярные продукты" относится к белкам, например продуктам разложения,молекулярная масса которых меньше молекулярной массы заданного белка по изобретению. В случае антитела, например IgG антитела, такие агрегаты по размеру меньше примерно 150 кДа. Применяемый в данном описании термин "твердая фаза" относится к неводной матрице, с которой целевое вещество взаимодействует в процессе очистки или к (с) которой может присоединяться (связываться) Fc-связывающий агент. Подходящие твердофазные материалы включают, но без ограничения,стекло, диоксид кремния (например, силикагель), полисахариды (например, полисахаридная матрица),такие как агароза и целлюлоза, органические полимеры, такие как полиакриламид, метилметакрилат и-8 015148 сополимеры полистирол-дивинилбензол, например, такие как смола Amberlite (выпускаемая фирмойRohm and Haas Chemical Co., Philadelphia, Pa.). Твердую фазу можно выбирать из любой группы смол,обычно описываемых как аффинные, ионообменные и захватывающие ионы смолы; твердая фаза, например колонка для очистки, дисперсная фаза из дискретных частиц или их комбинация. Твердая фаза может быть пористой или непористой и может быть прессованной или непрессованной. В различных вариантах изобретения твердая фаза представляет собой полимерную матрицу или агарозные частицы или бусы (гранулы). В различных вариантах изобретения твердая фаза может быть покрыта реагентом(таким как глицерин), например, для предупреждения неспецифической адгезии примесей к твердой фазе. Необходимо, чтобы Fc-связывающая твердая фаза имела химические группы или ассоциированный лиганд, которые позволяли бы Fc-связывающему агенту связываться с поверхностью твердой фазы. Предпочтительные твердофазные материалы должны быть физически и химически устойчивы к условиям процесса очистки, включая вакуумирование и фильтрацию в поперечном потоке, и температурам, рН и другим характеристикам используемых жидкостей."Аффинный лиганд" относится к частице, которая связывается селективно или предпочтительно с компонентом исходной жидкости за счет специфического взаимодействия с сайтом связывания компонента. В данном изобретении аффинный лиганд (например, Fc-связывающий агент) обычно иммобилизован на твердой фазе, такой как смола. Примеры аффинных лигандов, которые могут связываться с полимерной подложкой с образованием хроматографических смол, применимых в способе по настоящему изобретению, включают, но без ограничения, белок А, белок П и их аналоги, которые селективно связываются с областью Fc белка. Методы связывания аффинных лигандов с материалами твердой подложки хорошо известны в области очистки, см., например, Affinity Separations: A Practical Approach (Practical"Смола для аффинной хроматографии", или "аффинная смола", относится к хроматографической смоле, которая представляет собой твердую фазу или субстрат (подложку, носитель), с поверхностью которых связаны аффинные лиганды."Смола для ионообменной хроматографии", или "ионообменная смола", относится к твердому носителю (подложке), с которым ковалентной связью связаны лиганды, несущие положительный или отрицательный заряд, и, следовательно, содержащему свободные противоионы, способные обмениваться с ионами в растворе, с которым контактирует ионообменная смола. Термин "катионообменные смолы" относится к ионообменной смоле с ковалентно связанными отрицательно заряженными лигандами и, следовательно, содержащей свободные катионы в растворе, с которым контактирует смола. В уровне техники известен большой ряд катионообменных смол, например, таких, в которых связанные ковалентной связью группы представляют собой карбоксилат или сульфонат. Выпускаемые промышленно катионообменные смолы включают "CMC-целлюлозу, SPSephadex (Сефадекс) и Fast Flow S-Sepharose (Сефарозу) (последние две выпускаются фирмой Pharmacia). Термин "анионообменные смолы" относится к ионообменной смоле с ковалентно связанными положительно заряженными группами, такими как четвертичные аминогруппы. Продажные анионообменные смолы включают DEAE целлюлозу, ТМАЕ, QAE Sephadex и Fast Flow Q-Sepharose (последние две выпускаются фирмой Pharmacia). Применяемое в данном описании выражение "хаотропная соль" относится к соли, которая содержит один или более ионных компонентов, расположенных внизу лиотропного ряда, которые способны проникать через гидратирующую оболочку белка и связываться непосредственно с их поверхностью. Это разрушает ассоциацию за счет "согидратации", способствуя солюбилизации белка. Примеры хаотропных солей включают, но без ограничения, галоидные соли элементов II группы (например, хлорид кальция,хлорид магния, хлорид бария, бромид кальция, бромид магния, бромид бария, йодид кальция, йодид магния, йодид бария). Примеры подходящих солей двухвалентных катионов включают, но без ограничения, соли Mn2+,2+(Cl-) и бромидом (Br-) в качестве анионов и их комбинации. В некоторых вариантах изобретения соли двухвалентных катионов содержат двухвалентный катион(например, Mn2+, Ca2+, Ni2+ или Ва 2+). Предпочтительными хаотропными солями в указанных процессах являются MgCl2, NiCl2 и CaCl2. После стадии солью двухвалентного катиона целевой белок элюируют с аффинной хроматографической матрицы."Буфер" представляет собой вещество, которое, присутствуя в растворе, повышает количество кислоты или щелочи, которое следует добавить для того, чтобы вызвать изменение единиц рН. Буферный раствор устойчив к изменениям рН, действуя как сопряженная система кислота-основание. Буферные растворы для применения с биологическими реагентами обычно способны поддерживать постоянную концентрацию ионов водорода, так что величина рН раствора находится в биологическом интервале. Термин "физиологический (физиологическое значение) рН" относится к рН крови млекопитающих(т.е. 7.38 или около 7.4). Таким образом, интервал физиологического рН составляет примерно 7.2-7.6. Традиционные компоненты буфера включают, но без ограничения, органические и неорганические соли,кислоты и основания. Типичные буферы, применяемые для очистки биологических молекул (например,белковых молекул), включают цвиттерионные буферы или "буферы Гуда", см., например, Good et al."Уравновешивающий буфер" по данному описанию представляет собой буфер, используемый для подготовки Fc-связывающего реагента, твердой фазы, или того и другого к нанесению (нагрузке) исходной жидкости, содержащей целевой белок. Уравновешивающий буфер предпочтительно является изотоническим и обычно имеет рН в примерном интервале 6-8. "Буфер для загрузки" ("буфер для нанесения образца", "лодинг-буфер") представляет собой буфер, который используют для нанесения исходной жидкости, содержащей А-связывающий белок, например антитело к А, и примеси, на твердую фазу, на которой иммобилизован Fc-связывающий агент. Часто уравновешивающий и лодинг-буфер представляют собой один и тот же буфер. "Буфер для элюции" используют для элюции А-связывающего белка с иммобилизованного Fc-связывающего агента. Предпочтительно буфер для элюции имеет низкий рН и поэтому нарушает взаимодействие между Fc-связывающим агентом и интересующим белком. Предпочтительно буфер для элюции с низким рН имеет рН в примерном интервале 2-5, наиболее предпочтительно в примерном интервале 3-4. Примеры буферов, которые регулируют рН в этом интервале, включают глициновый, фосфатный, ацетатный, нитратный и аммонийный буферы, а также их комбинации. Предпочтительными такими буферами являются цитратный и ацетатный буферы, наиболее предпочтительно натрий-цитратный или натрий-ацетатный буферы. Рассматриваются другие буферы для элюции, включая буферы с высоким рН (например, буферы с рН 9 или выше) и буферы, содержащие соединение или состав, такие как MgCl2 (2 мМ), для элюции представляющего интерес белка."Жидкость для промывания" ("промывающая жидкость"), или "буфер для промывания", по данному описанию относится к жидкости, используемой для вымывания примесей с хроматографической смолы,с которой связано целевое вещество. Можно последовательно использовать более одной жидкости для промывания, например последовательно промывать жидкостями с изменяющимися свойствами, такими как рН, проводимость, концентрация растворителя и т.д., предназначенными для отделения (диссоциации) и удаления различных типов примесей, которые неспецифически ассоциированы с хроматографической смолой."Жидкость для элюции" ("элюирующая жидкость"), или "буфер для элюции" ("элюирующий буфер"), по данному описанию относится к жидкости, которую используют для отделения целевого вещества от хроматографической смолы после того, как оно было промыто одной или более жидкостью для промывания. Элюирующая жидкость отделяет (выделяет) целевое вещество, но не вызывает необратимой денатурации. Типичные элюирующие жидкости хорошо известны в хроматографии и могут содержать повышенные концентрации солей, свободных аффинных лигандов или аналогов или других веществ, которые стимулируют выделение целевого вещества из хроматографической смолы. Выражение "условия элюции" относится к условиям процесса, соблюдаемым на связанной с целевым веществом хроматографической смоле, которые способствуют выделению целевого вещества из хроматографической смолы, таким как контактирование связанной с целевым веществом хроматографической смолы элюирующей жидкостью или элюирующим буфером, вызывая такое выделение (разделение, отделение). Термин "очищающая (смывающая) жидкость" ("жидкость для очистки"), или "очищающий (смывающий) буфер" ("буфер для очистки"), по данному описанию относится к жидкости, которую используют для промывания хроматографической смолы после завершения процесса очистки. "Смывающая жидкость" может содержать детергент, агент, инактивирующий вирусы и относительно высокие концентрации солей и может иметь рН выше или ниже, чем жидкости, используемые в процессе очистки. Они предназначены для очистки хроматографической резины от примесей, чтобы сделать ее пригодной для повторного применения. Типичные смывающие (очищающие) жидкости хорошо известны в хроматографии."Жидкость для хранения", или "буфер для хранения", по данному описанию относится к жидкости,в которой хроматографическая смола хранится в суспендированном виде между применениями. Жидкости для хранения, помимо ионов буфера, могут содержать бактерицидные вещества или другие консерванты. Такие жидкости для хранения хорошо известны в хроматографии. В различных аспектах настоящее изобретение предусматривает способы очистки А-связывающего белка, предпочтительно антитела к А, из исходной жидкости, содержащей белок и одну или более примесей, с помощью адсорбции белка на Fc-связывающем агенте с последующим промыванием Fcсвязывающего агента буферным раствором, содержащим соль двухвалентного катиона, для удаления одной или более примесей и регенерацией (выделением) белка из Fc-связывающего агента. ПодходящиеFc-связывающие агенты включают, но без ограничения, белок А и белок G. Настоящее изобретение предусматривает способы очистки А-связывающих белков, в частности- 10015148 антител к А. Типичные процессы очистки включают стадию аффинной хроматографии. Процесс на стадии аффинной хроматографии может быть непрерывным, дискретным или их комбинацией. Например,стадию аффинной хроматографии можно осуществлять в виде дискретного процесса, такого, например,как периодический процесс. Аффинная хроматография представляет собой процесс биоселективной адсорбции и последующей регенерации целевого соединения с иммобилизованного лиганда. Этот процесс способствует высокоспецифической и высокоэффективной очистке целевого соединения. Процесс требует применения подходящего селективного лиганда (например, Fc-связывающего агента), который связывается с целевым соединением (например, антителом к А) с константой диссоциации, как правило, в интервале 10-4-10-8 и в то же время позволяет проводить регенерацию в мягких условиях. Лиганд обычно иммобилизуется на гранулированной и пористой матрице, которая может быть в виде упаковки (насадки) колонки или среды для периодической адсорбции. Предпочтительным связывающим агентом является белок А. Белок А связывается с Fc-областью иммуноглобулинов. Белок А состоит из шести областей, пять из которых связывают IgG. Он связывается с высокой аффинностью с человеческим IgG1, IgG2 и IgG4, а также мышиным IgG2a, IgG2b и IgG3. Белок А связывается с умеренной аффинностью с человеческим IgD, IgM, IgA и IgE, а также с мышиным IgG1. В качестве аффинного лиганда белок А иммобилизуется на матрице таким образом, что эти области остаются свободными для связывания. Одна молекула иммобилизованного белка А может связывать по меньшей мере две молекулы IgG. Нативный и рекомбинантный варианты белка А проявляют сходную специфичность к Fc-области IgG. Можно создать рекомбинантный белок A (r-протеин A, r-белок А), который включает, например, С-концевой цистеиновый остаток и может иммобилизоваться за счет тиоэфирного связывания с твердофазной матрицей. Такое соединение дает в результате повышенную способность к связыванию белка А. Альтернативным связывающим агентом является белок G. Белок G является специфическим к IgG,связываясь с высокой аффинностью с человеческим IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4, а также мышиным IgG1 иIgG3. Белок G PLUS проявляет умеренную аффинность к человеческому IgG4 и к мышиному IgG2a, IgG2b и IgG3. Можно создать рекомбинантный белок G (r-протеин G, r-белок G), в котором удалена альбуминсвязывающая область нативного белка. Рекомбинантный белок G содержит две Fc-связывающие области. Альтернативным связывающим агентом является белок A/G. Белок A/G представляет собой полученный методами генной инженерии (методами рекомбинантной ДНК) белок, который объединяет профили связывания с IgG как белка А, так и белка G. Он представляет собой продукт слияния генов, секретируемый при использовании непатогенной формы Bacillus. Белок A/G содержит четыре Fcсвязывающих домена из белка А и два из белка G. Белок A/G не столь зависим от рН, как протеин А, но в остальном обладает аддитивными свойствами белка А и G. Белок A/G связывается со всеми подклассами IgG человека, в особенности пригоден для очистки поликлональных или моноклональных IgG антител, подклассы которых не определены. Кроме того, он связывается с IgA, IgE, IgM и (в меньшей степени) с IgD. Белок A/G также хорошо связывается со всеми подклассами мышиного IgG, в особенности пригоден для очистки мышиных моноклональных антителIgG подклассов, без вмешательства IgA, IgM и мышиного сывороточного альбумина (см., например, Sikkema. (1989), Amer. Biotech. Lab 7, 42). Отдельные подклассы мышиных моноклональных антител могут проявлять более высокую аффинность к химерному белку A/G, чем к белку А или к белку G (см., например, Eliasson et al. (1988), J. Biol. Chem. 263, 4323-4327.) В настоящем изобретении иммобилизованный Fc-связывающий агент (например, белок А) промывают раствором соли двухвалентного катиона для удаления примесей. В частности, было найдено, что нежелательные примеси, получающиеся в методах экспрессии рекомбинантного антитела, можно удалять, используя стадию промывания солью двухвалентного катиона. Способы по настоящему изобретению могут, необязательно, включать стадии очистки после аффинной хроматографии и стадии промывания солями двухвалентных катионов. Последующие стадии очистки могут включать стадию ионообменной хроматографии и/или стадию хроматографии с гидрофобным взаимодействием (HIC). Последующие стадии хроматографии могут быть непрерывными, прерывными (например, в виде периодического процесса) или сочетанием этих стадий. В процессе ионообменной хроматографии разделение соединений (молекул) основано на разнице общего заряда белков. Целевой белок может иметь заряд, противоположный заряду функциональной группы, соединенной со смолой для связывания. Например, антитела, которые обычно имеют общий положительный заряд, хорошо связываются с катионообменными смолами, которые содержат отрицательно заряженные функциональные группы. Так как это взаимодействие является ионным, связывание должно происходить в условиях низкой ионной силы. Элюция происходит при повышении ионной силы за счет нарушения ионного взаимодействия или при изменении рН белка. В то время как извлечение белков ионообменной хроматографией происходит за счет их зарядов, в хроматографии с гидрофобным взаимодействием используются гидрофобные свойства некоторых белков. Гидрофобные группы на белке связываются с гидрофильными группами на колонке. Чем более гидрофобным является белок, тем сильнее он связывается- 11015148 с колонкой. На стадии HIC удаляются, например, примеси из клеток-хозяев (например, ДНК и другие высоко- и низкомолекулярные компоненты, имеющие отношение к продукту). Дополнительные стадии очистки могут включать стадии удаления вирусов, а также стадии ультрафильтрации и/или диафильтрации по данному описанию. В различных вариантах изобретения белок, содержащий область Fc, представляет собой антитело или содержащий антитело слитый белок, имеющий область Fc, которая связывается с Fc-рецептором Fcсвязывающего агента. Применение буферного раствора, содержащего соль двухвалентного катиона, для промывания Fc-связывающего агента позволяет лучше удалять примеси, такие, например, как варианты считывания интронов и фрагменты, содержащие константную область (включая LMW и UDB частицы),представляющего интерес белка (например, целевого вещества в исходной жидкости). Способы по настоящему изобретению включают одну или более стадий хроматографического разделения и, кроме того, могут содержать одну или более стадий фильтрации для отделения Асвязывающего белка ("целевого белка") от примесей в исходной жидкости. Например, исходную жидкость можно фильтровать, центрифугировать или обрабатывать другим способом для удаления дисперсного осадка (дебриса) и т.п. до контактирования исходной жидкости с Fcсвязывающим агентом. Например, используя методы рекомбинантной ДНК, белки можно продуцировать внутриклеточно, в периплазматическом пространстве, или секретировать непосредственно в культуральную среду. Если белок продуцируют внутриклеточно, осадок макрочастиц (дисперсный осадок), либо клеток-хозяев, либо лизированных фрагментов можно удалять, например, центрифугированием либо ультрафильтрацией. Если белок секретируется в среду, рекомбинантные клетки-хозяева можно отделять от клеточной культуральной среды, например, тангенциальной фильтрацией. В различных вариантах изобретения исходная жидкость, содержащая целевой белок, контактирует с Fc-связывающим агентом (предпочтительно иммобилизованным на твердой фазе и уравновешенным подходящим буфером) таким образом, что целевой белок адсорбируется на Fc-связывающем агенте (например, иммобилизованном Fc-связывающем агенте). Исходная жидкость контактирует с Fcсвязывающим агентом (например, с иммобилизованным Fc-связывающим агентом) в лодинг-буфере(буфере для нанесения вещества), который может быть тем же самым, что и уравновешивающий буфер. Содержащая примеси исходная жидкость течет через твердую фазу, целевой белок адсорбируется на Fcсвязывающем агенте, а различные примеси (такие как белки клеток-хозяев, если целевой белок продуцируют в рекомбинантной клетке-хозяине, или другие образующиеся в процессе примеси) проходят через твердую фазу или неспецифически связываются с ней. В различных вариантах изобретения Fcсвязывающим агентом является белок А, а уравновешивающий буфер содержит 20 мМ Трис, 0.15 М NaCl,pH 7.5. Другие подходящие уравновешивающие буферы включают, например, BIS, HEPES и т.д. в физиологических концентрациях, концентрациях в примерном интервале 0.5-100 мМ (например, 10, 20, 50 мМ и т.д.) и физиологических концентрациях солей (например, около 0.15 мМ NaCl) при рН 5.0-9.0. Твердой фазой, на которой иммобилизуется Fc-связывающий агент, предпочтительно являются гранулы или макрочастицы агарозы (например, сефарозы). В различных вариантах изобретения колонку покрывают реагентом, таким как глицерин, для уменьшения или предупреждения неспецифической адгезии к колонке. В различных вариантах изобретения Fc-связывающим агентом является белок А. Колонкаrmp Protein A Sepharose Fast Flow (FF), выпускаемая Amersham Biosciences, представляет собой пример подходящей колонки с белком А для применения в указанных методах. Затем Fc-связывающий агент промывают буферным промывающим раствором, содержащим соль двухвалентного катиона, для удаления вариантов белка, связанных с твердой фазой или с Fcсвязывающим агентом. В частности, было найдено, что промывание солью двухвалентного катиона может удалить значительное количество нежелательных примесей. Конкретно, было найдено, что варианты считывания интрона, низкомолекулярные варианты и варианты с недостающими дисульфидными связями антитела к А можно удалить, промывая солью двухвалентного катиона. Кроме того, белки клеткихозяина (НСР) и ДНК также можно удалить, промывая солью двухвалентного катиона. Примеры подходящих хаотропных солей включают, но без ограничения, хлорид кальция (CaCl2), хлорид никеля (NiCl) и хлорид магния (MgCl2). Хотя в растворе для промывания может присутствовать одна соль двухвалентного катиона, в различных вариантах изобретения можно использовать две или более соли двухвалентных катионов. В различных вариантах изобретения для удаления примесей, помимо промывающего раствора, содержащего соль двухвалентного катиона, применяют другой промывающий раствор. Например, в различных вариантах изобретения для промывания Fc-связывающего агента до, после или и до и после промывания Fc-связывающего агента промывающим раствором, содержащим соль двухвалентного катиона,применяют раствор, содержащий 20-50 мМ Трис, 0.75-2.0 М NaCl, pH 5.0-9.0, и/или раствор, содержащий 10 мМ Трис, рН 7.5. В различных вариантах изобретения соль двухвалентного катиона предпочтительно добавляют в концентрации около 0.5-2.5 М к буферному раствору с рН в примерном интервале 5-9 и предпочтительно с рН в примерном интервале 7-8. Предпочтительные концентрации соли двухвалентного катиона вклю- 12015148 чают, но без ограничения, 0.6, 2.0 и 2.5 М. Подходящие для этой цели буферные растворы включают, но без ограничения, Трис или ацетатные буферы в концентрации 20-50 мМ. После стадии (стадий) промывания целевой белок регенерируют из Fc-связывающего агента. Обычно это осуществляют с помощью буфера для элюции. Целевой белок можно, например, элюировать с колонки буфером для элюции, имеющим низкий рН, например в интервале около 2-6.5 или предпочтительно в интервале около 2.5-3.5. В различных вариантах изобретения выделенный при этом целевой белок можно приготовить в виде препарата с фармацевтически приемлемым носителем и использовать для различных диагностических, терапевтических или других целей, известных для таких соединений. В различных вариантах изобретения препарат элюированного целевого белка можно пустить на стадии дополнительной очистки после стадии хроматографии на Fc-связывающем агенте. Например,типичные стадии дополнительной очистки включают, но без ограничения, анионообменную хроматографию, катионообменную хроматографию, хроматографию с гидрофобным взаимодействием (HIC),хроматографию на гидроксиапатите, диализ, аффинную хроматографию (включая аффинную хроматографию с иммобилизованным металлом), эксклюзионную хроматографию по размеру (SEC), осаждение сульфатом аммония, осаждение этанолом, обращенно-фазовую ВЭЖХ (ОФ-ВЭЖХ), хроматофокусирование, ультрафильтрацию, диафильтрацию и гель-фильтрацию (гель-хроматографию). В различных вариантах изобретения за стадией хроматографии на Fc-связывающем агенте следует стадия анионообменной хроматографии и стадия HIC. В различных вариантах изобретения после стадий хроматографии далее следует стадия фильтрации вирусов, стадия ультрафильтрации/диафильтрации и/или стадия фильтрации микробных примесей. В различных вариантах изобретения эти стадии дополнительной очистки можно проводить до стадии хроматографии на Fc-связывающем агенте. В различных вариантах изобретения способы очистки А-связывающего белка, предпочтительно антитела к A, начинаются с адсорбирования целевого белка на Fc-связывающем агенте, содержащем белок А, иммобилизованный на твердой фазе, с последующим промыванием Fc-связывающего агента буферным раствором, содержащим соль двухвалентного катиона, для удаления одной или более примесей и дальнейшей регенерацией (выделением) белка из белка А с образованием первого элюированного пула. В различных вариантах изобретения процесс очистки продолжается анионообменной хроматографией первого элюированного пула при контактировании анионообменной смолы с первым элюированным пулом, так что примеси адсорбируются смолой, тогда как целевой белок не адсорбируется смолой. Таким образом, целевой белок можно регенерировать из потока, получая второй элюированный пул. В различных вариантах изобретения стадия анионообменной хроматографии включает далее промывание анионообменной смолы буферным промывающим раствором для регенерации по меньшей мере части адсорбированного целевого белка, который затем объединяют со вторым элюированным пулом. Или же первый элюированный пул может контактировать с анионообменной смолой таким образом, что адсорбируется антитело, а любые примеси проходят через смолу, а затем, необязательно, смолу промывают и элюируют адсорбированное антитело. В различных вариантах изобретения процесс очистки продолжает HIC второго элюированного пула(собранных фракций): адсорбция целевого белка на смоле с гидрофобным взаимодействием (например,твердой фазе, функционализованной гидрофобными лигандами), промывание смолы с гидрофобным взаимодействием буферным раствором для промывания с ионной силой, которая не позволяет элюировать целевой белок в значительной степени, и регенерация целевого белка (обычно с применением буфера для элюции с достаточно низкой ионной силой для того, чтобы десорбировать целевой белок со смолы с гидрофобным взаимодействием) в третьем элюированном пуле. Или же второй элюированный пул может контактировать с HIC колонкой таким образом, что целевой белок не адсорбируется, выделяя проходящий целевой белок в виде третьего элюированного пула. В различных вариантах изобретения процесс очистки включает одну или более стадий фильтрации,например, для удаления вирусов, концентрирования и забуферивания раствора, содержащего целевой белок, и для удаления микробных загрязнений. В различных вариантах настоящее изобретение предусматривает способы очистки Асвязывающего белка, предпочтительно антитела к А, из исходной жидкости, содержащей белок и одну или более примесей, где примеси содержат один или более IRT вариантов. В одном варианте изобретения способы обеспечивают примерно 2-20-кратное снижение уровней IRT вариантов по сравнению с уровнями в исходной жидкости. Предпочтительно уровни IRT вариантов уменьшаются по меньшей мере в 5 раз, более предпочтительно уровни IRT вариантов уменьшаются по меньшей мере в 10 раз. Например, в исходной жидкости (исходном (начальном) образце), содержащей около 3-5% IRT вариантов антитела (в виде процентного содержания всех компонентов в исходной жидкости), содержание частиц IRT вариантов антитела можно понизить примерно до 0.3-0.5%. В различных вариантах изобретения содержание IRT вариантов снижается до менее 1, менее 0.8,менее 0.5, менее 0.3, менее 0.2 и/или менее 0.1%. Предпочтительно при очистке исходной жидкости для приготовления белка содержание IRT вариантов снижается до менее 1, менее 0.8, менее 0.5, менее 0.3,- 13015148 менее 0.2 и/или менее 0.1% от общего количества компонентов в исходной жидкости. В различных вариантах настоящее изобретение предусматривает способы очистки Асвязывающего белка, предпочтительно антитела к А, из исходной жидкости, содержащей белок и одну или более примесей, при этом примеси содержат один или более LMW вариантов. В одном варианте изобретения способы обеспечивают примерно 2-20-кратное снижение уровней LMW вариантов по сравнению с уровнями в исходной жидкости. Предпочтительно уровни LMW вариантов уменьшаются по меньшей мере в 5 раз, более предпочтительно уровни LMW вариантов уменьшаются по меньшей мере в 10 раз. Например, в исходной жидкости (исходном (начальном) образце), содержащей около 3-5% LMW вариантов антитела (в виде процентного содержания всех компонентов в исходной жидкости), содержание частиц LMW вариантов антитела можно понизить примерно до 0.3-0.5%. В различных вариантах изобретения содержание LMW вариантов снижается до менее 1, менее 0.8, менее 0.5, менее 0.3, менее 0.2 и/или менее 0.1%. Предпочтительно при очистке исходной жидкости для приготовления белка содержание LMW вариантов снижается до менее 1, менее 0.8, менее 0.5, менее 0.3, менее 0.2 и/или менее 0.1% от общего количества компонентов в исходной жидкости. В различных вариантах настоящее изобретение предусматривает способы очистки Асвязывающего белка, предпочтительно антитела к А, из исходной жидкости, содержащей белок и одну или более примесей, где примеси содержат один или более UDB вариантов. В одном варианте изобретения способы обеспечивают примерно 2-20-кратное снижение уровней UDB вариантов по сравнению с уровнями в исходной жидкости. Предпочтительно уровни UDB вариантов уменьшаются по меньшей мере в 5 раз, более предпочтительно уровни UDB вариантов уменьшаются по меньшей мере в 10 раз. Например, в исходной жидкости (исходном (начальном) образце), содержащей около 20% UDB вариантов антитела (в виде процентного содержания всех компонентов в исходной жидкости), содержание частиц UDB вариантов антитела можно понизить примерно до 10-2%. В различных вариантах изобретения содержание UDB вариантов снижается до менее 20, менее 15, менее 10, менее 5, менее 2 и/или менее 1%. Предпочтительно при очистке исходной жидкости для приготовления белка содержание UDB вариантов снижается до менее 20, менее 15, менее 10, менее 5, менее 2 и/или менее 1% от общего количества компонентов в исходной жидкости. Также, например, в исходной жидкости (начальном образце), содержащей около 3-5% UDB вариантов антитела (в виде процентного содержания всех компонентов в исходной жидкости), содержание частиц UDB вариантов антитела можно понизить примерно до 0.3-0.5%. В различных вариантах изобретения содержание UDB вариантов снижается до менее 1, менее 0.8, менее 0.5, менее 0.3, менее 0.2 и/или менее 0.1%. Предпочтительно при очистке исходной жидкости для приготовления белка содержаниеUDB вариантов снижается до менее 1, менее 0.8, менее 0.5, менее 0.3, менее 0.2 и/или менее 0.1% от общего количества компонентов в исходной жидкости.A-связывающие белки для применения в способах очистки по изобретению. А-связывающие белки, например антитела к А, подлежащие очистке по описываемому изобретению, можно приготовить общепринятыми в уровне техники методами, которые включают, например,синтетические методы (такие как методы рекомбинантной ДНК и пептидный синтез или сочетание этих методов) или их можно выделять из эндогенного источника белка. В различных вариантах изобретения антитело может представлять собой, например, поликлональное антитело, моноклональное антитело,рекомбинантное антитело, химерное антитело, гуманизированное антитело или человеческое антитело. Методы получения антител подробнее описаны ниже. В других вариантах изобретения А-связывающий белок может представлять собой антителосодержащий слитый белок, который включает область Fc антитела, слитую с участком белка или полипептида, способного связываться с А. Подробнее получение антителосодержащих слитых белков также описано ниже. Поликлональные антитела. Поликлональные антитела можно получать иммунизацией подходящего субъекта иммуногеном. Мониторинг титра антитела у иммунизированного субъекта во времени можно проводить традиционными методами, такими как твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA), используя иммобилизованный целевой антиген. При желании, антитела к целевому антигену можно выделять из млекопитающего (например, из крови) и очищать далее общеизвестными методами, такими как хроматография на белок А-сефарозе, для получения фракции антитела, например IgG. В соответствующее время после иммунизации, например,когда титры антитела к антигену наиболее высоки, у субъекта можно взять антителопродуцирующие клетки и использовать их для приготовления моноклональных антител традиционными методами, такими как метод гибридом (впервые описанный Kohler and Milstein (1975), Nature 256: 495-497; см. также(1976), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76: 2927-31; Yeh et al. (1982), Int. J. Cancer 29: 269-75). О получении химерных поликлональных антител см. Buechler et al., патент США 6420113. Моноклональные антитела. Для получения моноклонального антитела можно применять любые общеизвестные протоколы- 14015148 слияния лимфоцитов и иммортализованных линий клеток (см., например, G. Galfre et al. (1977), Nature 266: 55052; Gefter et al., Somatic Cell Genet., см. выше; Lerner, Yale J. Biol. Med., см. выше; Kenneth,Monoclonal Antibodies, см. выше). Помимо этого, рядовой специалист в данной области техники понимает, что существует множество вариантов таких методов, которые также применимы. Обычно "бессмертные" линии клеток (например, линия клеток миеломы) взяты из того же вида млекопитающих, что и лимфоциты. Например, мышиные гибридомы можно получать слиянием лимфоцитов мышей, иммунизированных иммуногенным препаратом по настоящему изобретению, линией иммортализованных клеток мышей. Предпочтительными "бессмертными" линиями клеток являются линии клеток мышиной миеломы, которые чувствительны к культуральной среде, содержащей гипоксантин, аминоптерин и тимидин("среда HAT"). Любую из множества миеломных клеточных линий можно использовать в качестве партнера для слияния традиционными методами, например линии клеток миеломы P3-NS1/1-Ag4-1, P3-x63Ag8.653 или Sp2/O-Ag14. Миеломные линии клеток получают от АТСС. Обычно HAT-чувствительные клетки мышиной миеломы сливают с мышиными спленоцитами с помощью полиэтиленгликоля ("ПЭГ,PEG"). Затем клетки гибридомы, образующиеся в результате слияния, отбирают, используя среду HAT,которая убивает неслитые и "непродуктивно" слитые клетки миеломы (неслитые спленоциты погибают через несколько дней, так как они не трансформируются). Клетки гибридомы, продуцирующие моноклональное антитело по изобретению, детектируют скринингом супернатантов гибридомных культур на антитела, которые связывают целевой антиген, с применением метода ELISA. Рекомбинантные антитела. В качестве альтернативы получению гибридом, секретирующих моноклональное антитело, моноклональное антитело можно идентифицировать и выделять скринингом комбинаторной библиотеки рекомбинантных иммуноглобулинов (например, библиотеки антител в формате фагового дисплея) с помощью целевого антигена, выделяя при этом представителей библиотеки иммуноглобулинов, которые связывают целевой антиген. Наборы для генерации и скрининга библиотек антител в формате фагового дисплея выпускаются промышленностью (например, система Pharmacia Recombinant Phage Antibody System, Catalog No. 27-9400-01; и набор Stratagene SurfZAP Phage Display Kit, Catalog No. 240612). Кроме того, примеры методов и реагентов, особенно пригодных для генерации и скрининга библиотеки антител в формате фагового дисплея, можно найти, например, в Ladner et al., патент США 5223409; Kang et al.,Международная опубликованная заявка РСТWO 92/18619; Dower et al., Международная опубликованная заявка РСТWO 91/17271; Winter et al., Международная опубликованная заявка РСТWO 92/20791; Markland et al., Международная опубликованная заявка РСТWO 92/15679; Breitling etal., Международная опубликованная заявка РСТWO 93/01288; McCafferty et al., Международная опубликованная заявка РСТWO 92/01047; Garrard et al., Международная опубликованная заявка РСТWO 92/09690; Ladner et al., Международная опубликованная заявка РСТWO 90/02809; Fuchs et al.(1990) 348: 552-554. Химерные и гуманизированные антитела. Помимо этого, в объем изобретения входят рекомбинантные антитела, такие как химерные и гуманизированные моноклональные антитела, содержащие участки как человеческого, так и нечеловеческого происхождения, которые можно получать стандартными методами рекомбинантной ДНК. Термин "гуманизированный иммуноглобулин" или "гуманизированное антитело" относится к иммуноглобулину или к антителу, которое включает по меньшей мере одну гуманизированную цепь иммуноглобулина или антитела (т.е. по меньшей мере одну гуманизированную легкую или тяжелую цепь). Термин "гуманизированная цепь иммуноглобулина" или "гуманизированная цепь антитела" (т.е. "гуманизированная легкая цепь иммуноглобулина" или "гуманизированная тяжелая цепь антитела") относится к цепи иммуноглобулина или антитела (т.е. к легкой или тяжелой цепи соответственно), содержащей вариабельную область, которая включает вариабельную каркасную область главным образом человеческого иммуноглобулина или антитела и гипервариабельные области (CDR) (например, по меньшей мере одну CDR, предпочтительно две CDR, более предпочтительно три CDR) иммуноглобулина или антитела в основном "нечеловеческого" происхождения и, кроме того, включает константные области (например,по меньшей мере одну константную область или ее участок в случае легкой цепи и три константные области в случае тяжелой цепи). Термин "гуманизированная вариабельная область" (например, "в основном гуманизированная вариабельная область легкой цепи" или "гуманизированная вариабельная область тяжелой цепи") относится к вариабельной области, которая включает вариабельную каркасную область в основном человеческого иммуноглобулина или антитела и гипервариабельные области (CDR) иммуноглобулина или антитела в основном "нечеловеческого" происхождения. Выражение "в основном (главным образом, практически) человеческого иммуноглобулина или антитела" или "в основном (главным образом, практически) человеческий" означает, что при выравнивании- 15015148 с аминокислотной последовательностью человеческого иммуноглобулина или антитела с целью сравнения наблюдается идентичность (т.е. локальная идентичность последовательностей) последовательности области с последовательностью человеческой каркасной или константной области по меньшей мере 8090, 90-95 или 95-99%, допуская, например, консервативные замены, замены в консенсусной последовательности, замены в зародышевой линии, обратные мутации и т.п. Введение консервативных замен, обратных мутаций и т.п. часто называют "оптимизацией" гуманизированного антитела или цепи. Выражение "иммуноглобулина или антитела в основном (главным образом, практически) "нечеловеческого" происхождения" или "практически "нечеловеческий" означает наличие последовательности иммуноглобулина или антитела по меньшей мере на 80-95%, предпочтительно по меньшей мере на 90-95%, более предпочтительно на 96, 97, 98 или 99% идентичной последовательности "нечеловеческого" организма,например млекопитающего, отличного от человека. Соответственно, все области или остатки гуманизированного иммуноглобулина или антитела, или цепи гуманизированного иммуноглобулина или антитела, за исключением CDR, практически идентичны(имеют значительную степень идентичности) соответствующим областям или остаткам одной или более нативных человеческих иммуноглобулиновых последовательностей. Термин "соответствующая область" или "соответствующий остаток" относится к области или остатку на второй аминокислотной или нуклеотидной последовательности, которая занимает то же (или эквивалентное) положение, что и область или остаток на первой аминокислотной или нуклеотидной последовательности, когда в целях сравнения оптимально выравнивают первую и вторую последовательности. Термин "значительная степень идентичности" ("значительная идентичность") означает, что две полипептидные последовательности при оптимальном выравнивании, таком как с помощью программ GAP или BESTFIT с применением по умолчанию средневзвешенных гэпов, идентичны по меньшей мере на 50-60% (степень идентичности 50-60%), предпочтительно по меньшей мере на 60-70%, более предпочтительно по меньшей мере на 70-80%, более предпочтительно по меньшей мере на 80-90% и еще более предпочтительно по меньшей мере на 95% или выше (например, идентичность последовательностей,например, 99% или более). Термин "существенная (практическая) идентичность" означает, что две полипептидные последовательности при оптимальном выравнивании, таком как с помощью программ GAP или BESTFIT с применением по умолчанию средневзвешенных гэпов, идентичны по меньшей мере на 80-90% (степень идентичности 80-90%), предпочтительно по меньшей мере на 90-95% и более предпочтительно по меньшей мере на 95% или выше (например, идентичность последовательностей, например,99% или более). При сравнении последовательностей обычно одна последовательность является эталонной (контрольной) последовательностью, с которой сравнивается тестируемая последовательность. При использовании алгоритма сравнения последовательностей тестируемую и эталонную (контрольная) последовательности вводят в компьютер, при необходимости задают координаты последовательностей. Затем, используя алгоритм сравнения последовательностей, рассчитывают процентное содержание идентичности последовательностей для тестируемой(ых) последовательности(ей) относительно эталонной последовательности исходя из заданных параметров программы. Оптимальное выравнивание последовательностей с целью их сравнения можно проводить, например, применяя алгоритм локальной гомологии Смита-Ватермана, Adv. Appl. Math. 2: 482 (1981), алгоритм выравнивания гомологичных последовательностей Нидлмана-Вунша, J. Mol. Biol. 48: 443 (1970),поиском подобия по методу Пирсона и Липмана, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 2444 (1988), используя компьютерные программы с применением этих алгоритмов (GAP, BESTFIT, FASTA и TFASTA в Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI) или визуальным исследованием (см. в целом Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology). Одним примером алгоритма подобия, применимого для определения в процентах идентичности последовательностей и подобия последовательностей, является алгоритм BLAST, описанный Altschul et al., J. Mol. Biol. 215: 403(1990). Программное обеспечение для BLAST анализов доступно через National Center for BiotechnologyInformation (по Интернету на сервере National Institutes of Health NCBI). Обычно для сравнения последовательностей можно применять параметры программы по умолчанию, хотя также можно использовать специальные параметры. Для аминокислотных последовательностей в качестве параметров по умолчанию программа BLASTP использует длину слова (W) 3, математическое ожидание (Е) 10 и матрицуBLOSUM62 (см. HenikoffHenikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915 (1989. Предпочтительно положения остатков, не являющихся идентичными, различаются консервативными аминокислотными заменами. Для классификации аминокислотных замен в качестве консервативных или неконсервативных аминокислоты объединяют в группы следующим образом: группа I (гидрофобные боковые цепи): leu, met, ala, val, leu, ile; группа II (нейтральные гидрофильные боковые цепи): cys, ser, thr; группа III (кислые боковые цепи): asp, glu; группа IV (основные боковые цепи): asn, gln, his, lys, arg; группа V (остатки, влияющие на ориентацию цепи): gly, pro; группа VI (ароматические боковые цепи): trp, tyr, phe. Консервативные замены включают замены между аминокислотами того же класса. Неконсерватив- 16015148 ные замены представляют собой замену представителя одного из этих классов на представителя другого класса. Предпочтительно гуманизированные иммуноглобулины или антитела связывают антиген с аффинностью, в три, четыре или пять раз более высокой, чем аффинность негуманизированного антитела. Например, если аффинность связывания негуманизированного антитела равна 10-9 М, аффинность связывания гуманизированных антител будет по меньшей мере 310-8, 410-8, 510-8 или 10-9 М. Говорят, что цепь иммуноглобулина "управляет связыванием с антигеном", когда она придает интактному иммуноглобулину или антителу (или его антигенсвязывающему фрагменту) свойство специфического связывания или аффинность связывания. Говорят, что мутация (например, обратная мутация) в значительной степени влияет на способность тяжелой или легкой цепи управлять связыванием антигена, если она влияет на аффинность связывания интактного иммуноглобулина или антитела (или его антигенсвязывающего фрагмента), содержащего указанную боковую цепь, например, снижая ее по меньшей мере на порядок по сравнению с величиной аффинности связывания антитела (или его антигенсвязывающего фрагмента),содержащего эквивалентную цепь, в которой отсутствует указанная мутация. Мутация "незначительно влияет (практически не влияет), например понижает, на способность цепи управлять связыванием антигена", если она влияет на аффинность связывания интактного иммуноглобулина или антитела (или его антигенсвязывающего фрагмента), содержащего указанную боковую цепь, например, понижая ее только в два, три или четыре раза по сравнению с величиной аффинности связывания антитела (или его антигенсвязывающего фрагмента), содержащего эквивалентную цепь, в которой отсутствует указанная мутация. Термин "химерный иммуноглобулин" или антитело относится к иммуноглобулину или антителу,вариабельные области которого происходят из первого вида, а константные области происходят из второго вида. Химерные иммуноглобулины или антитела можно конструировать, например, методами генетической инженерии (методами рекомбинантной ДНК) при использовании сегментов гена иммуноглобулина, принадлежащего к разным видам. Не предполагается, что термины "гуманизированный иммуноглобулин" или "гуманизированное антитело" охватывают химерные иммуноглобулины или антитела по определению ниже. Хотя гуманизированные иммуноглобулины или антитела являются химерными по своей конструкции (т.е. содержат области более чем одного вида белка), они включают дополнительные признаки (т.е. вариабельные области, содержащие донорные остатки CDR, и акцепторные остатки каркасной области), которые отсутствуют в химерных иммуноглобулинах или антителах по определению в данном описании. Такие химерные и гуманизированные моноклональные антитела можно получать известными в уровне техники методами рекомбинантной ДНК, например методами, описанными в Robinson et al., Международная патентная заявкаPCT/US86/02269; Akira, et al., Европейская патентная заявка 184187;Taniguchi, M., Европейская патентная заявка 171496; Morrison et al., Европейская патентная заявка 173494; Neuberger et al., опубликованная Международная патентная заявка РСТWO 86/01533; Cabillyet al., патент США 4816567; Cabilly et al., Европейская патентная заявка 125023; Better et al. (1988),Science 240: 1041-1043; Liu et al. (1987), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 3439-3443; Liu et al. (1987), J. Immunol. 139: 3521-3526; Sun et al. (1987), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 214-218; Nishimura et al. (1987),Canc. Res. 47: 999-1005; Wood et al. (1985), Nature 314: 446-449; Shaw et al. (1988), J. Natl. Cancer Inst. 80: 1553-1559; Morrison, S.L. (1985), Science 229: 1202-1207; Oi et al. (1986), BioTechniques 4: 214; Winter,патент США 5225539; Jones et al. (1986), Nature 321: 522-525; Verhoeyan et al. (1988), Science 239: 1534;Beidler et al. (1988), J. Immunol 141: 4053-4060. Человеческие антитела от трансгенных животных и фаговый дисплей. В качестве альтернативы в настоящее время можно получать трансгенных животных (например,мышей), способных, после иммунизации, вырабатывать полный спектр человеческих антител, не вырабатывая эндогенный иммуноглобулин. Например, было описано, что гомозиготная делеция гена шарнирной области тяжелой цепи (JH) антитела в химерных и зародышевой линии мутантных мышах приводит к полному ингибированию продуцирования эндогенного антитела. Перенос набора генов человеческого зародышевого иммуноглобулина в таких зародышевой линии мутантных мышах приводит в результате к выработке человеческих антител при контрольном заражении антигеном, см., например, патенты США 6150584; 6114598 и 5770429. Полностью человеческие антитела можно также получать при использовании фаг-дисплейных библиотек (Hoogenboom et al., J. Mol. Biol., 227-381 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol., 222: 581-597 (1991. Химерные поликлональные антитела можно также получать при использовании фаг-дисплейных библиотек (Buechler et al., патент США 6420113). Биспецифические антитела и конъюгаты антител. Биспецифические антитела (BsAbs) представляют собой антитела, обладающие специфичностью связывания по меньшей мере к двум различным эпитопам. Такие антитела можно получать при использовании полноразмерных антител или фрагментов антител (например, F(ab)'2 биспецифических антител). Способы получения биспецифических антител известны в уровне техники. Традиционные способы получения полноразмерных (полной длины) биспецифических антител основаны на коэкспрессии двух пар- 17015148 тяжелая цепь-легкая цепь иммуноглобулина, причем две цепи обладают различными специфичностями(Millstein et al., Nature, 305: 537-539 (1983. Ввиду случайного набора тяжелой и легкой цепей иммуноглобулина эти гибридомы (квадромы) дают возможную смесь различных антител (см. Международную патентную заявку WO 93/08829 и в Traunecker et al., EMBO J., 10: 3655-3659 (1991. Биспецифические антитела включают также перекрестно сшитые или "гетероконъюгатные" антитела. Например, одно из антител в гетероконъюгате может быть соединено с авидином, другое с биотином или другой полезной нагрузкой. Гетероконъюгатные антитела можно получать, используя любые обычные методы сшивания. Подходящие сшивающие агенты хорошо известны в уровне техники и раскрываются в патенте США 4676980 наряду с рядом методов сшивания. Еще в одном варианте изобретения антитело может быть конъюгировано химическими или генетическими методами с полезной нагрузкой, такой как реактивная, детектируемая или функциональная частица, например иммунотоксин, для получения конъюгата антитела. Такие полезные нагрузки включают,например, иммунотоксины, химиотерапевтические вещества и радиоизотопы, которые все хорошо известны в уровне техники. А-связывающий белок, имеющий Fc-область, применяемый в данном изобретении, может представлять собой слитый белок, который содержит, по меньшей мере, Fc-участок антитела, слитый с отличным от антитела белком или полипептидом, способным связывать А. Так, создают растворимый слитый белок, который способен связывать А и который имеет Fc-родственные функции (такие как сывороточная стабильность, Fc-рецепторное связывание и т.п.). Антитело(содержащие)-слитые белки (также в уровне техники называемые Fc-слитые белки или Ig-слитые белки) можно получать традиционными методами рекомбинантной ДНК, они описаны в уровне техники, см., например, патенты США 5116964, 5225538, 5336603 и 5428130, все принадлежат Capon et al. Антитела к А. В целом антитела по настоящему изобретению включают различные антитела для лечения амилоидных заболеваний, в частности болезни Альцгеймера, за счет нацеливания на А-пептид. Термины "А-антитело", "антитело к А" и "анти-А" в данном описании применяются взаимозаменяемо и относятся к антителу, которое связывается с одним или более эпитопов или антигенных детерминант человеческого амилоидного белка-предшественника (АРР), А-белка или и того, и другого. Типичные эпитопы или антигенные детерминанты могут находиться внутри АРР, но предпочтительно находятся внутри А-пептида АРР. Существует множество изоформ АРР, например АРР 695, APP752 и АРР 770. Аминокислотам в АРР номера даются в соответствии с последовательностью изоформы АРР 770(см., например, GenBank Accession No. P05067). В настоящее время примеры конкретных изотипов АРР, известные у человека, представляют собой полипептид из 695 аминокислот, описанный Kang et al. (1987) Nature 325: 733-736, который принимается за "нормальный" АРР; полипептид из 751 аминокислот, описанный Ponte et al. (1988), Nature 331: 525-527et al. (1988), Nature 331: 530-532. Образованный в результате протеолитического расщепления (процессирования) АРР различными секретазами in vivo или in situ, А существует как в "короткой форме", длиной в 40 аминокислот, так и в "длинной форме", протяженностью 42-43 аминокислоты. Короткая форма,А 40, состоит из остатков 672-711 АРР. Длинная форма, например А 42 или А 43, состоит из остатков 672-713 или 672-714 соответственно. Часть гидрофобного домена АРР находится на карбоксиконце А и может отвечать за способность А к агрегации, в особенности в длинной форме. А-пептид может находиться в жидкостях организма человека и других млекопитающих, например цереброспинальной жидкости, включая как здоровых индивидуумов, так и индивидуумов, страдающих амилоидными нарушениями. Термины "-амилоидный белок", "-амилоидный пептид", "-амилоид", "А" и "А-пептид" в данном описании применяются на равных правах. А-пептид (например, А 39, А 40, А 41, А 42 и А 43) представляет собой внутренний фрагмент АРР протяженностью 4 кДа, содержащий 39-43 аминокислоты. Например, А 40 состоит из остатков 672-711 АРР, а А 42 состоит из остатков 672-713 АРР. А-пептиды включают пептиды, получающиеся при расщеплении АРР секретазами, и синтетические пептиды,имеющие такую же или практически такую же последовательность, что и продукты расщепления. Апептиды можно получать из различных источников, например тканей, линий клеток или жидкостей организма (например, сыворотки и цереброспинальной жидкости (ликвора, спинно-мозговой жидкости. Например, А можно получать при использовании АРР-экспрессирующих клеток, таких как клетки яичников китайского хомячка, стабильно трансфецируемые АРР 717VF, описанным, например, в Walsh etal., Nature, 416, с. 535-539. Препарат А можно получать из тканевых источников описанными ранее методами (см., например, Johnson-Wood et al. (1997), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 1550). Или же Апептиды можно синтезировать методами, хорошо известными специалистам в данной области техники,см., например, Fields et al., Synthetic Peptides: A User's Guide, ed. Grant, W.H. FreemanCo., New York,NY, 1992, p. 77). Так, пептиды можно получать твердофазным синтезом (методом Меррифилда) либо с- 18015148 трет-Вос, либо с F-moc группами для защиты аминокислот в боковой цепи на автоматическом синтезаторе пептидов, например на синтезаторе Applied Biosystems Peptide Synthesizer Модель 430 А или 431. Более протяженные пептидные антигены можно синтезировать общеизвестными методами рекомбинантной ДНК. Например, полинуклеотид, кодирующий пептид или слитый пептид, можно синтезировать или получать молекулярным клонированием и вводить в подходящий экспрессирующий вектор для трансфекции и гетерологичной экспрессии при использовании подходящей клетки-хозяина. А-пептид относится также к родственным А последовательностям, которые образуются в результате мутаций в Аобласти нормального гена. Типичные эпитопы, или антигенные детерминанты, с которыми связывается А-антитело, могут находиться внутри человеческого амилоидного белка-предшественника (АРР), но предпочтительно находятся внутри А-пептида АРР. Типичные эпитопы, или антигенные детерминанты, внутри А расположены в пределах N-конца, центральной области или С-конца А. "N-концевой эпитоп" представляет собой эпитоп, или антигенную детерминанту, локализованную внутри N-конца А-пептида или включаяN-конец А-пептида. Типичные N-концевые эпитопы включают остатки внутри аминокислот 1-10 или 112 А, предпочтительно из остатков 1-3, 1-4, 1-5, 1-6, 1-7, 2-6, 2-7, 3-6 или 3-7 А 42. Другие типичные Nконцевые эпитопы начинаются в остатках 1-3 и заканчиваются в остатках 7-11 А. Другие типичные Nконцевые эпитопы включают остатки 2-4, 5, 6, 7 или 8 А, остатки 3-5, 6, 7, 8 или 9 А или остатки 4-7,8, 9 или 10 А 42. "Центральные эпитопы" представляют собой эпитопы, или антигенные детерминанты,содержащие остатки, локализованные внутри центрального или среднего участка А-пептида. Типичные центральные эпитопы включают остатки внутри аминокислот 13-28 А, предпочтительно из остатков 1427, 15-26, 16-25, 17-24, 18-23 или 19-22 А. Другие типичные центральные эпитопы включают остатки внутри аминокислот 16-24, 16-23, 16-22, 16-21, 18-21, 19-21, 19-22, 19-23 или 19-24 А. "С-концевые" эпитопы, или антигенные детерминанты, расположены внутри С-конца или включая С-конец А-пептида и включают остатки внутри аминокислот 33-40, 33-41 или 33-42 А. "С-концевые эпитопы" представляют собой эпитопы, или антигенные детерминанты, локализованные внутри С-конца А-пептида (например, примерно внутри аминокислот 30-40 или 30-42 А). Дополнительные типичные С-концевые эпитопы, или антигенные детерминанты, включают остатки 33-40 или 33-42 А. Если говорят, что антитело связывается с эпитопом внутри указанных остатков, таких как А 3-7,это означает, что антитело специфически связывается с полипептидом, содержащим указанные остатки(т.е. А 3-7 в данном примере). Такое антитело необязательно контактирует с каждым остатком в А 3-7. Не каждая единичная аминокислотная замена или делеция внутри А 3-7 обязательно сильно влияет на аффинность связывания. В различных вариантах изобретения антитело к А является специфическим к концу. Термин "специфический к концу" по данному описанию относится к антителу, которое специфически связывается с N-концевыми или С-концевыми остатками А-пептида, но которое не распознает такие же остатки в более протяженных А, содержащих эти остатки, или в АРР. В различных вариантах изобретения А антитело является "специфическим к С-концу". Термин "специфический к С-концу" по данному описанию означает, что антитело специфически распознает свободный С-конец А-пептида. Примеры антител к А, специфических к С-концу, включают такие антитела, которые узнают конец(окончание) А-пептида в остатке 40, но не узнают конец А-пептида в остатке 41, 42 и/или 43; узнают конец (окончание) А-пептида в остатке 42, но не узнают конец А-пептида в остатке 40, 41 и/или 43 и т.д. В одном варианте изобретения антитело к А может представлять собой 3D6 антитело или его вариант или 10D5 антитело или его вариант, оба эти антитела описаны в опубликованной патентной заявке США 20030165496 A1, опубликованной патентной заявке США 20040087777 A1, опубликованной Международной патентной заявкеWO 02/46237 A3 и в Международной опубликованной патентной заявкеWO 04/080419 A2. Описание антител 3D6 и 10D5 можно найти также в Международной опубликованной патентной заявкеWO 02/088306 A2 и в Международной опубликованной патентной заявкеWO 02/088307 A2. Дополнительные 3D6 антитела описаны в патентной заявке США 11/303478 и Международной патентной заявкеPCT/US05/45614. 3D6 является моноклональным антителом (mAb),которое специфически связывается с N-концевым эпитопом, локализованным в человеческом амилоидном пептиде, конкретно с остатками 1-5. Для сравнения, 10D5 представляет собой mAb, которое специфически связывается с N-концевым эпитопом, локализованным в человеческом -амилоидном пептиде, конкретно в остатках 3-6. Линия клеток, продуцирующая моноклональное антитело 3D6 (RB96 3D6.32.2.4), депонирована в Американской коллекции типовых культур (American Type Culture Collection(ATCC, Manassas, VA 20108, USA, 8 апреля 2003 г. согласно Будапештскому договору под номером РТА-5130. Линия клеток, продуцирующая моноклональное антитело 10D5 (RB44 10D5.19.21), депонирована в АТСС 8 апреля 2003 г. согласно Будапештскому договору под номером РТА-5129. Типичными вариантами антител 3D6 являются антитела, имеющие, например, гуманизированную легкую цепь, содержащую аминокислотные последовательности вариабельной области, представленные- 19015148 как SEQ ID NO: 3 или SEQ ID NO: 5, и гуманизированную тяжелую цепь, содержащую аминокислотные последовательности вариабельной области, представленные как SEQ ID NO: 4 или SEQ ID NO: 6. Другие типичные варианты 3D6 антител представляют собой антитела, имеющие, например, аминокислотную последовательность гуманизированной легкой цепи, представленную как SEQ ID NO: 7, и аминокислотную последовательность гуманизированной тяжелой цепи, представленную как SEQ ID NO: 8. Типичными вариантами антител 10D5 являются антитела, имеющие, например, гуманизированную легкую цепь, содержащую аминокислотные последовательности вариабельной области, представленные как SEQ ID NO: 9 или SEQ ID NO: 11, и гуманизированную тяжелую цепь, содержащую аминокислотные последовательности вариабельной области, представленные как SEQ ID NO: 10 или SEQ ID NO: 12. Другие типичные варианты 10D5 антител представляют собой антитела, имеющие, например, аминокислотную последовательность гуманизированной легкой цепи, представленную как SEQ ID NO: 13, и аминокислотную последовательность гуманизированной тяжелой цепи, представленную как SEQ ID NO: 14. Такие варианты антител подробно описаны в Международной патентной заявке WO 02/088307 A2. В другом варианте изобретения антитело может представлять собой антитело 12 В 4 или его вариант,описанные в опубликованной патентной заявке США 20040082762 А 1 и в Международной опубликованной патентной заявкеWO 03/077858 A2. 12 В 4 представляет собой mAb, которое специфически связывается с N-концевым эпитопом, локализованным в человеческом -амилоидном пептиде, конкретно в остатках 3-7. Типичными вариантами антител 12 В 4 являются антитела, имеющие, например, гуманизированную легкую цепь (или легкую цепь), содержащую аминокислотные последовательности вариабельной области, представленные как SEQ ID NO: 15 или SEQ ID NO: 17, и гуманизированную тяжелую цепь, содержащую аминокислотные последовательности вариабельной области, представленные как SEQ ID NO: 16,SEQ ID NO: 18 или SEQ ID NO: 19. Еще в одном варианте изобретения антитело может представлять собой антитело 12 А 11 или его вариант, описанные в опубликованной патентной заявке США 20050118651 А 1, патентной заявке США регистрационный 11/303478, Международной опубликованной патентной заявкеWO 04/108895 A2 и в Международной патентной заявке регистрационныйPCT/US05/45614. 12 А 11 представляет собойmAb, которое специфически связывается с N-концевым эпитопом, локализованным в человеческом амилоидном пептиде, конкретно в остатках 3-7. Линия клеток, продуцирующая моноклональное антитело 12 А 11, депонирована в АТСС 13 декабря 2005 г. согласно Будапештскому договору под номером РТА-7271. Типичными вариантами антител 12 А 11 являются антитела, имеющие, например, гуманизированную легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность вариабельной области, представленную как SEQ ID NO: 20, и гуманизированную тяжелую цепь, содержащую аминокислотные последовательности вариабельной области, представленные как SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23,SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ IDNO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36,SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40 или SEQ ID NO: 41. Еще в одном варианте изобретения антитело может представлять собой антитело 6 С 6 или его вариант, описанные в патентной заявке США 11/305899 и Международной патентной заявкеPCT/US05/45860. 6 С 6 представляет собой mAb, которое специфически связывается с N-концевым эпитопом, локализованным в человеческом -амилоидном пептиде, конкретно в остатках 3-7. Линия клеток, продуцирующая моноклональное антитело 6 С 6, депонирована в АТСС 1 ноября 2005 г. согласно Будапештскому договору под номером РТА-7200. Еще в одном варианте изобретения антитело может представлять собой антитело 2 Н 3 или его вариант, описанные в патентной заявке США 11/305899 и Международной патентной заявкеPCT/US05/45860. 2 Н 3 представляет собой mAb, которое специфически связывается с N-концевым эпитопом, локализованным в человеческом -амилоидном пептиде, конкретно в остатках 2-7. Еще в одном варианте изобретения антитело может представлять собой антитело 3 А 3 или его вариант, описанные в патентной заявке США 11/305899 и Международной патентной заявкеPCT/US05/45860. 3 А 3 представляет собой mAb, которое специфически связывается с N-концевым эпитопом, локализованным в человеческом -амилоидном пептиде, конкретно в остатках 3-7. Линии клеток, продуцирующие антитела 2 Н 3 и 3 А 3, имеющие регистрационные номера в АТСС РТА-7267 и РТА-7269 соответственно, депонированы 13 декабря 2005 г. согласно Будапештскому договору. Еще в одном варианте изобретения антитело может представлять собой антитело 15 С 11 или его вариант, описанные в патентной заявке США 11/304896 и Международной патентной заявкеPCT/US05/45515, озаглавленной "Гуманизированные антитела, распознающие бета-амилоидный пептид". 15 С 11 представляет собой mAb, которое специфически связывается с центральным эпитопом, локализованным в человеческом -амилоидном пептиде, конкретно в остатках 19-22. Линия клеток, продуцирующая моноклональное антитело 15 С 11, депонирована в АТСС 13 декабря 2005 г. согласно Буда- 20015148 пештскому договору под номером РТА-7270. Еще в одном варианте изобретения антитело может представлять собой антитело 266 или его вариант, описанные в опубликованной патентной заявке США 20050249725 А 1 и Международной патентной заявкеWO 01/62801 A2. 266 представляет собой mAb, которое специфически связывается с центральным эпитопом, локализованным в человеческом -амилоидном пептиде, конкретно в остатках 1624. Линия клеток, продуцирующая моноклональное антитело 266, депонирована в АТСС 20 июля 2004 г. согласно Будапештскому договору под номером РТА-6123. Типичными вариантами антител 266 являются антитела, имеющие, например, гуманизированную легкую цепь, содержащую аминокислотные последовательности вариабельной области, представленные как SEQ ID NO: 42 или SEQ ID NO: 44, и гуманизированную тяжелую цепь, содержащую аминокислотные последовательности вариабельной области, представленные как SEQ ID NO: 43 или SEQ ID NO: 45. Другие типичные варианты антител 266 представляют собой антитела, имеющие, например, аминокислотную последовательность гуманизированной легкой цепи, представленную как SEQ ID NO: 46, и аминокислотную последовательность гуманизированной тяжелой цепи, представленную как SEQ ID NO: 47. Такие варианты антител подробно описаны в опубликованной патентной заявке США 20050249725A1 и опубликованной Международной патентной заявке WO 01/62801 А 2. Еще в одном варианте изобретения антитело может представлять собой антитело 2 В 1 или его вариант, описанные в патентной заявке США 11/305899 и Международной патентной заявкеPCT/US05/45860, озаглавленной "Антитела к A для применения с целью улучшения познавательной способности". 2 В 1 представляет собой mAb, которое специфически связывается с центральным эпитопом, локализованным в человеческом -амилоидном пептиде, конкретно в остатках 19-23. Еще в одном варианте изобретения антитело может представлять собой антитело 1 С 2 или его вариант, описанные в патентной заявке США 11/305899 и Международной патентной заявкеPCT/US05/45860, озаглавленной "Антитела к A для применения с целью улучшения познавательной способности". 1 С 2 представляет собой mAb, которое специфически связывается с центральным эпитопом, локализованным в человеческом -амилоидном пептиде, конкретно в остатках 16-23. Еще в одном варианте изобретения антитело может представлять собой антитело 9G8 или его вариант, описанные в патентной заявке США 11/304986 и Международной патентной заявкеPCT/US05/45515. 9G8 представляет собой mAb, которое специфически связывается с центральным эпитопом, локализованным в человеческом В-амилоидном пептиде, конкретно в остатках 16-21. Линии клеток, продуцирующие антитела 2 В 1, 1 С 2 и 9G8, депонированы 1 ноября 2005 г. в АТСС согласно Будапештскому договору и им присвоены регистрационные номера РТА-7202, РТА-7199 и РТА-7201 соответственно. Антитела, которые специфически связываются с С-концевыми эпитопами, локализованными в человеческом -амилоидном пептиде, для применения в настоящем изобретении включают, но без ограничения, 369.2 В, описанное в патенте США 5786180, озаглавленном "Моноклональное антитело 369.2 В,специфическое кА 4 пептиду". Более подробное описание антител для применения в настоящем изобретении можно найти, например, в Bussiere et al. (Am. J. Pathol. 165(3): 987-95 (2004, Bard et al. (PNAS 100(4): 2023-8 (2003, Kajkowski et al. (J. Biol. Chem. 276(22): 18748-56 (2001, Games et al. (Ann. NYAcad. Sci. 920: 274-84 (2000, Bard et al. (Nat. Med. 6(8): 916-9 (2000 и в Международной патентной заявкеWO 03015691 A2, озаглавленной "Осуществление быстрого улучшения познавательной способности у субъекта, страдающего болезнью Альцгеймера, синдромом Дауна, церебральной амилоидной ангиопатией или слабой когнитивной недостаточностью, заключается во введении антитела к А бета". Более подробное описание фрагментов антител для применения в настоящем изобретении можно найти,например, в Bales et al. (реферат Р 4-396, с. S587, представленный на постерной сессии Р 4: Therapeuticsand Therapeutic Strategies-Therapeutic Strategies, Amyloid-Based) и Zameer et al. (реферат Р 4-420, с. S593,представленный на постерной сессии Р 4: Therapeutics and Therapeutic Strategies-Therapeutic Strategies,Amyloid-Based). Антитела для применения в настоящем изобретении можно получать методами рекомбинантной ДНК или синтетическими методами. Например, антитело можно получать, используя культуру рекомбинантных клеток, например СНО клеток, NIH 3 Т 3 клеток, PER.C6 клеток, NS0 клеток, VERO клеток,фибробластов эмбрионов цыплят и ВНК клеток. Кроме того, в настоящем изобретении рассматриваются антитела с минорными модификациями, которые сохраняют основное функциональное свойство связывать А-пептид. В конкретном варианте изобретения антитело представляет собой гуманизированное антитело 3D6 к А-пептиду, которое селективно связывает А-пептид. Более конкретно, гуманизированное 3D6 антитело к А-пептиду создано для специфического связывания с NH2-концевым эпитопом, например аминокислотными остатками 1-5, локализованными в человеческом -амилоидном 1-40 или 1-42 пептиде, обнаруженном в отложениях в виде бляшек в мозге (например, у пациентов, страдающих болезнью Альцгеймера). Примером гуманизированного антитела к А-пептиду является вариант 2 гуманизированного антитела 3D6 (h3D6v2). Полные аминокислотные последовательности легкой и тяжелой цепей h3D6v2, пред- 21015148 сказанные исходя из последовательностей ДНК соответствующих экспрессирующих векторов, показаны на фигуре (где нумерация остатков начинается с NH2-конца легкой и тяжелой цепей в виде остатка номер 1) и в SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 2 соответственно. Последний аминокислотный остаток, кодированный последовательностью ДНК тяжелой цепи, Lys449, наблюдался в зрелой секретированной форме h3D6v2, и без связи с какой-либо конкретной теорией можно сказать, что он, по-видимому, удаляется в ходе внутриклеточного процессирования с помощью СНО клеточных протеаз. Следовательно, СООН-конец тяжелой цепи h3D6v2, необязательно, представляет собой Gly448. В рекомбинантных антителах и антителах плазмы наблюдается процессирование и СООН-концевого лизина, и, по-видимому, это не влияет на их функцию (Harris (1995), J. Chromatogr. A. 705: 129-134). Очищенное h3D6v2 модифицируют после трансляции, присоединяя N-связанные гликаны к Fc-участку тяжелой цепи, которая, как известно, содержит консенсусный сайт N-гликозилирования. Сайт N-гликозилирования выявляет три главные биантенные структуры нейтральных олигосахаридов, обычно наблюдаемых в аналогичном сайте Nгликозилирования IgG белков млекопитающих. Другим примером гуманизированного антитела к А-пептиду является вариант 1 гуманизированного антитела 3D6 (h3D6v1), имеющий последовательность, представленную на фигуре, за исключением замены DY в положении 1 легкой цепи, замены SА в положении 75 тяжелой цепи (положение 74 по нумерации Kabat), замены ТS в положении 78 тяжелой цепи (положение 77 по нумерации Kabat) и замены VL (положение 89 по нумерации Kabat). Различные аспекты и варианты настоящего изобретения описываются подробнее с помощью нижеприведенных примеров. Примеры предлагаются только в качестве иллюстрации, но ни в коем случае не как ограничение. Примеры Нижеприведенные примеры предлагаются только с целью иллюстрации. Приводятся примеры, в которых используются два различных моноклональных антитела к А. Описаны шесть экспериментов, каждый из которых включает комбинацию удаления антитела и примесей. Материалы и методы. В целом при применении настоящего изобретения на практике, если не указано иначе, используются традиционные методы химии, молекулярной биологии, рекомбинантной ДНК, иммунологии (особенно, например, методы с применением иммуноглобулинов) и стандартные методы электрофореза, см.,например, Sambrook, Fritsch and Maniatis, Molecular Cloning: Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989);disulfide bonds in a monoclonal antibody via mass spectrometry, Rapid Commun. Mass Spectrom, 13 (24): 2503-2510 (1999). Получение целевого антитела. Целевое антитело можно получать, например, используя рекомбинантную линию клеток млекопитающих, выращенную в суспензионной культуре. Кондиционированную среду, содержащую представляющее интерес антитело, получают в продукционном биореакторе. Получающийся в результате продукт можно собирать и осветлять любым подходящим методом осветления, например либо микрофильтрацией и фильтрацией с тонкостью фильтра 0.22 мкм или центрифугированием, либо фильтрацией через слой (зернистого материала) и фильтрацией с тонкостью фильтра 0.22 мкм. Очистка целевого антитела. Очистка целевых моноклональных антител, приводимых в качестве примеров в данном описании(ААВ или 12A11), состоит из улавливания (захвата) целевого соединения при аффинной хроматографии на твердой фазе с белком А. Она может содержать rmp Protein A Sepharose Fast Flow, Protein A Sepharose Fast Flow или MabSelect Protein А. Затем смолу промывают, как описано в каждом эксперименте, и продукт элюируют и проверяют на содержание примесей. Анализ целевого антитела. Для количественного определения IRT в образцах моноклонального антитела ААВ применяют обращенно-фазовую ВЭЖХ (ОФ-ВЭЖХ, RP-HPLC). Эксклюзионную хроматографию (SEC-ВЭЖХ) используют для определения процентного содержания мономерного белка (мономерного IgG), высокомолекулярного (HMW) и низкомолекулярного (LMW) белков. Для определения относительного количества видов с недостающими дисульфидными связями (UDB) в образцах проводят денатурирующую SECВЭЖХ. Уровни НСР в испытуемых образцах определяют твердофазным иммуноферментным анализом- 22015148 Обращенно-фазовая ВЭЖХ (анализ ААВ IRT). ОФ-ВЭЖХ проводят следующим образом. Восстановление дисульфидной группы в каждом образце проводят инкубацией при 40 С в течение 60 мин в присутствии 2.5 мМ DTT. Алкилирование проводят, инкубируя при комнатной температуре в присутствии 5.5 мМ йодуксусной кислоты. После восстановления и алкилирования во все образцы добавляют ("гасят") 5 мкл 1 М DTT. Точность количественных определений в данном анализе составляет 0.5%. Около 40 мкг каждого восстановленного алкилированного образца вводят в колонку для ОФ-ВЭЖХ POROS R1/H RP-HPLC и хроматографируют в течение 70 мин в следующих условиях. Колонка: Poros R1/H RP-HPLC Column; Температура: 50 С; Подвижная фаза А: 0.1% ТФК (вес./об.) в воде; Подвижная фаза В: 0.1% ТФК (вес./об.) в 95% в ацетонитриле; Скорость потока: 1.0 мл/мин; Детекция: 217 нм; Время цикла: 70 мин; Ввод: трехкратное введение по 40 мкг каждый ввод; Время градиента указано в табл. 1. Таблица 1 Время градиента в методе ОФ-ВЭЖХdSEC-ВЭЖХ (анализ ААВ UDB). Денатурирующую SEC-ВЭЖХ проводят следующим образом. Предварительная обработка образцов для анализа методом денатурирующей SEC-ВЭЖХ включает смесь реагент/образец с конечной концентрацией белка 200 мкг/мл, 3 М гуанидин HCl и 100 мМ Трис, рН 7.4. Образцы нагревают при 80 С в течение 20 мин при перемешивании в процессе превращения. В данном анализе используют два контроля для установления пределов (вилки, ограничения) уровней UDB. В качестве контрольных используют внутренние эталоны с низким и высоким уровнями UDB. Хроматографию/анализ проводят в следующих условиях. Колонка: Tosoh BioSep G3000 SWx1; Температура в колонке: комнатная; Подвижная фаза: 3 М гуанидин HCl, 25 мМ NaPO4, рН 6.8; Градиент: изократический (постоянный состав элюента); Скорость потока: 0.5 мл/мин; Детекция: 280 нм; Время цикла: 50 мин; Ввод: трехкратное введение по 50 мкл (10 мкг). Пример 1.Сравнение промывающих буферов для выделения IRT. В данном примере содержащий примеси раствор, содержащий моноклональное антитело к А ААВ очищают адсорбцией на колонке с белком А с последующим первым промыванием буфером, содержащим либо CaCl2, MgCl2, NaCl, либо пропиленгликоль. Культуру, содержащую моноклональное антитело, очищают в малом масштабе на колонке rmp Protein A Sepharose FF (8.9 мл), связанной с хроматографической системой GE Healthcare KTA FPLC. Во всех стадиях хроматографии на rmp Protein A Sepharose FF используют нижеприведенные условия (исключения отмечены в отдельных описаниях эксперимента). Размеры колонки - 1.0 см 11.4 см; Рабочая скорость потока - 150 см/ч; Уравновешивание 1 - 20 мМ Трис, 150 мМ NaCl, pH 7.5 (5 объемов колонки); Быстрое промывание - 20 мМ Трис, 150 мМ NaCl, pH 7.5 (1 объем колонки); Промывание 1 - переменный состав (см. табл. 2) за исключением опыта 1, в котором отсутствует промывание 1; Промывание 2 - 20 мМ Трис, 1.0 М NaCl, pH 7.5 (5 объемов колонки); Промывание 3 - 10 мМ Трис, 75 мМ NaCl, pH 7.5 (7 объемов колонки); Элюция - 50 мМ глицина, 75 мМ NaCl, pH 3.1 (6 объемов колонки); Десорбция 1 - 20 мМ цитрата натрия, рН 2.7 (5 объемов колонки); Десорбция 2 - 6 М гуанидин HCl (2 объема колонки); Промывание после десорбции - 20 мМ Трис, 150 мМ NaCl, pH 7.5 (5 объемов колонки); Хранение - 16% этанол (5 объемов колонки);- 23015148 Рабочая температура - 2-8 С. Колонку с rmp Protein A Sepahrose FF уравновешивают буфером 20 мМ Трис, 150 мМ NaCl,pH 7.5 (5 объемов колонки). В колонку загружают продукт в количестве примерно 10 мг продукта/мл смолы. После загрузки смывают (промывают) уравновешивающим буфером (1 объем колонки) и промывающим раствором 1 (5 объемов колонки). Все растворы 1 для промывания (промывающие растворы 1) приведены в табл. 2. Промывание 1 проводят во всех опытах, кроме опыта 1. После промывания 1 промывают 20 мМ Трис, 1.0 М NaCl, pH 7.5 (5 объемов колонки) и 10 мМ Трис, 75 мМ NaCl, pH 7.5 (7 объемов колонки). Моноклональное антитело элюируют с колонки раствором 50 мМ глицина, 75 мМNaCl, pH 3.1. Затем собранные фракции (пул) продукта нейтрализуют до рН 7.9-8.1 раствором 2 М Трис,рН 8.5. Затем проводят десорбцию с колонки, промывают и хранят. В табл. 2 приводятся уровни IRT вариантов и LMW в объединенных фракциях (пулах) из различных опытов. Промывание хлоридом магния и хлоридом кальция снижает уровни IRT и LMW частиц. Таблица 2 Величины IRT и LMW для различных промывающих буферов 1 Как видно из результатов, промывание хлоридом магния и хлоридом кальция снижает уровни IRT иLMW белков, тогда как промывание хлоридом натрия и пропиленгликолем не уменьшает содержаниеIRT и LMW белков. Пример 2. Хроматография на белке А с промыванием CaCl2 для удаления IRT. В этом примере в большем масштабе проводят очистку антитела хроматографией на белке А с промыванием CaCl2 для удаления IRT вариантов. Культуру, содержащую моноклональное антитело, очищают в масштабе пилотной установки на колонке MabSelect Protein A (2.4 л), связанной с хроматографической системой Millipore K-Prime 400. Два опыта на MabSelect проводят, как описано ниже. Размеры колонки - 13 см 18 см; Рабочая скорость потока - 150 см/ч, 300 см/ч; Уравновешивание 1-20 мМ Трис, 150 мМ NaCl, pH 7.5 (5 объемов колонки); Быстрое промывание - 20 мМ Трис, 150 мМ NaCl, pH 7.5 (2 объема колонки); Промывание 1 - 50 мМ Трис, 2.0 М CaCl2, рН 7.5 в опыте 1, в опыте 2 промывание 1 отсутствует; Промывание 2 - 20 мМ Трис, 1.0 М NaCl, pH 7.5 (5 объемов колонки); Промывание 3 - 10 мМ Трис, 75 мМ NaCl, pH 7.5 (5 объемов колонки); Элюция - 50 мМ глицина, 25 мМ NaCl, pH 3.1 (6 объемов колонки); Десорбция 1 - 50 мМ глицина, 0.5 М NaCl, pH 2.7 (5 объемов колонки); Десорбция 2 - 6 М гуанидин HCl (2 объема колонки); Промывание после десорбции - 20 мМ Трис, 150 мМ NaCl, pH 7.5 (5 объемов колонки); Хранение - 16% этанол (5 объемов колонки); Рабочая температура - 2-8 С. Колонку с MabSelect Protein А уравновешивают буфером 20 мМ Трис, 150 мМ NaCl, pH 7.5 (5 объемов колонки). На носитель в колонке наносят продукт в количестве примерно 10 мг продукта/мл смолы. После загрузки смывают (промывают) уравновешивающим буфером (2 объема колонки) и промывающим раствором 1 (5 объемов колонки). Раствор 1 для промывания (промывающий раствор 1) содержит 50 мМ Трис, 2.0 М CaCl2, рН 7.5 в опыте 1, тогда как в опыте 2 его полностью исключают. После промывания 1 промывают раствором 50 мМ Трис, 1.0 М NaCl, pH 7.5 (5 объемов колонки) и раствором 10 мМ Трис, 75 мМ NaCl, pH 7.5 (5 объемов колонки). Моноклональное антитело элюируют с колонки MabSelect Protein А раствором 50 мМ глицина, 25 мМ NaCl, pH 3.1. Затем собранные фракции (пул) продукта нейтрализуют до рН 7.8-8.2 раствором 2 М Трис рН 8.5. Затем проводят десорбцию с колонки, промывают и хранят. Результаты показаны в табл. 3. Таблица 3 Содержание IRT (%) в опытах в масштабе пилотной установки с промыванием хлористым кальцием и в отсутствие промывания хлористым кальцием- 24015148 Результаты показывают, что в масштабах пилотной установки промывание хлористым кальцием удаляет IRT из объединенных фракций (пула) продукта. Пример 3. Удаление ДНК. В данном примере изучается способность промывающего раствора CaCl2 удалять ДНК клетокхозяев из препарата, содержащего моноклональное антитело ААВ. Небольшое количество культуры, содержащей моноклональное антитело, очищают на колонкеMabSelect Protein A (19 мл), связанной с хроматографической системой GE Healthcare KTA FPLC. Проводят три описанных ниже опыта с MabSelect. Размеры колонки - 1.1 см 20 см; Рабочая скорость потока - 300 см/ч; Уравновешивание 1 - 20 мМ Трис, 150 мМ NaCl, pH 7.5 (5 объемов колонки); Быстрое промывание - 20 мМ Трис, 150 мМ NaCl, pH 7.5 (2 объема колонки); Промывание 1 - 50 мМ Трис, 2.0 М CaCl2, рН 7.5 (5 объемов колонки) (только опыты 2 и 3); Промывание 2 - 20 мМ Трис, 1.0 М NaCl, pH 7.5 (5 объемов колонки) (только опыты 1 и 3); Промывание 3 - 10 мМ Трис, 75 мМ NaCl, pH 7.5 (7 объемов колонки); Элюция - 50 мМ глицина, 75 мМ NaCl, pH 3.0 (6 объемов колонки); Десорбция 1 - 50 мМ глицина, 0.5 М NaCl, pH 2.7 (5 объемов колонки); Промывание после десорбции - 20 мМ Трис, 150 мМ NaCl, pH 7.5 (5 объемов колонки); Хранение - 16% этанол (5 объемов колонки); Рабочая температура - 18-24 С. В опытах колонку с MabSelect Protein А уравновешивают буфером 20 мМ Трис, 150 мМ NaCl,pH 7.5 (5 объемов колонки). Затем на носитель в колонке наносят продукт в количестве примерно 40 мг продукта/мл смолы. После этого смывают (промывают) уравновешивающим буфером (2 объема колонки). В опытах 2 и 3 за этой стадией следует промывание промывающим раствором 1 (5 объемов колонки). В опытах 1 и 3 колонку промывают промывающим раствором 2 (5 объемов колонки). Во всех трех опытах используют 7 объемов раствора 3 для промывания (промывающего раствора 3). Моноклональное антитело элюируют с колонки MabSelect Protein А раствором 50 мМ глицина, 75 мМ NaCl, pH 3.0. Затем собранные фракции (пул) продукта нейтрализуют до рН 7.5-8.0 раствором 2 М Трис, рН 8.5. Затем проводят десорбцию с колонки, промывают и хранят. Результаты показаны в табл. 4. Таблица 4 Удаление ДНК промыванием раствором с хлористым кальцием Результаты показывают, что добавление 50 мМ Трис, 2.0 М хлористого кальция, рН 7.5 в 10 раз уменьшает количество ДНК по сравнению с применением NaCl в растворе для промывания. Пример 4. Удаление белка клеток-хозяев. В данном примере в опытах по очистке, в которых проверяют влияние различных условий на способность удалять белки клеток-хозяев (НСР), используют второе моноклональное антитело к А, 12 А 11. Для стадии MabSelect проводят высокопроизводительный скрининг (HTS) в формате 96-луночного фильтрационного планшета для удаления примесей, таких как НСР. В этом скрининге варьируют наполнители (эксципиенты), концентрацию наполнителей и рН промывающего раствора наполнителей (эксципиентов) для того, чтобы определить их влияние на обусловленные процессом примеси, такие как НСР. Смолу MabSelect уравновешивают буфером 5 мМ Трис, 10 мМ NaCl, рН 7.3, и продукт наносят на колонку. Затем смолу выгружают, перемешивают и вносят 50 мкл смолы в каждую лунку 96-луночного фильтрационного планшета. Смолу в каждой лунке уравновешивают в растворе 5 мМ Трис, 10 мМ NaCl,рН 7.3, а затем промывают промывающими растворами, содержащими каждый из различных наполнителей (эксципиентов), в 3 стадии, на каждой стадии используют 300 мкл буфера для промывания. После промывания наполнителем проводят второе промывание буфером, содержащим 5 мМ Трис, 10 мМ NaCl,рН 7.3, в 4 стадии, по 300 мкл буфера в каждой. Затем продукт элюируют со смолы в 3 стадии по 300 мкл. Продукты стадий элюции 1 и 2 объединяют и проверяют уровни НСР. Объем смолы - 50 мкл; Наполнители для промывающего раствора - хлорид натрия, хлорид кальция, хлорид магния; Концентрации наполнителей - 100, 250, 500, 1000,1500 и 2000 мМ; рН наполнителя - 6.0 и 7.5; Буферы для элюции - 25 мМ Hepes, 10 мМ NaCl, рН 3.0, 25 мМ Hepes, 100 мМ NaCl, рН 3.0, 50 мМ глицина, 10 мМ NaCl, рН 3.0, 50 мМ глицина, 100 мМ NaCl, рН 3.0 и 100 мМ аргинина, 10 мМ NaCl,рН 3.0, 100 мМ аргинина, 100 мМ NaCl, рН 3.0; Рабочая температура - 18-24 С. Результаты показаны в табл. 5 и 6.- 25015148 Таблица 5 Величины НСР, полученные при промывании смолы MabSelect растворами хлорида натрия, хлорида кальция или хлорида магния с рН 6.0 Таблица 6 Величины НСР, полученные при промывании смолы MabSelect растворами хлорида натрия, хлорида кальция или хлорида магния с рН 7.5 Результаты показывают, что как хлорид кальция, так и хлорид магния снижают уровни НСР в пуле пика на MabSelect по сравнению с хлоридом кальция при рН 6.0 (табл. 5) и рН 7.5 (табл. 6). Пример 5. Удаление антител с недостающими дисульфидными связями (UDB). В данном примере изучается способность промывающего раствора с CaCl2 удалять антитела с недостающими дисульфидными связями (UDB). Проводят два опыта на колонке rmp Protein A Sepharose FF практически, как описано в примере 1. Размеры колонки - 1.0 см 11.4 см; Рабочая скорость потока - 150 см/ч; Уравновешивание 1 - 20 мМ Трис, 150 мМ NaCl, pH 7.5 (5 объемов колонки); Быстрое промывание - 20 мМ Трис, 150 мМ NaCl, pH 7.5 (1 объем колонки); Промывание 1 - 50 мМ ацетата, 2.0 М CaCl2, рН 5.0 в опыте 1; отсутствует в опыте 2; Промывание 2 - 20 мМ Трис, 1.0 М NaCl, pH 7.5 (5 объемов колонки); Промывание 3 - 10 мМ Трис, 75 мМ NaCl, pH 7.5 (7 объемов колонки); Элюция - 50 мМ глицина, 75 мМ NaCl, pH 3.1 (6 объемов колонки); Десорбция 1 - 20 мМ цитрата натрия, рН 2.7 (5 объемов колонки); Десорбция 2 - 6 М гуанидин HCl (2 объема колонки); Промывание после десорбции - 20 мМ Трис, 150 мМ NaCl, pH 7.5 (5 объемов колонки); Хранение - 16% этанол (5 объемов колонки); Рабочая температура - 2-8 С. Колонки с rmp Protein A Sepahrose FF уравновешивают буфером 20 мМ Трис, 150 мМ NaCl,pH 7.5 (5 объемов колонки). В колонки загружают продукт в количестве примерно 10 мг продукта/мл смолы. После загрузки смывают (промывают) уравновешивающим буфером (1 объем колонки), а затем промывающим раствором 1 (5 объемов колонки). Этот раствор для промывания 1 (промывающий раствор 1) содержит 50 мМ ацетата, 2.0 М CaCl2, рН 5.0 в опыте 1; совершенно отсутствует в опыте 2. После промывания 1 промывают 20 мМ Трис, 1.0 М NaCl, pH 7.5 (5 объемов колонки) и 10 мМ Трис, 75 мМNaCl, pH 7.5 (7 объемов колонки). Моноклональное антитело элюируют с колонки rmp Protein ASepahrose FF раствором 50 мМ глицина, 75 мМ NaCl, pH 3.1. Затем собранные фракции (пул) продукта нейтрализуют до рН 7.9-8.2 раствором 2 М Трис рН 8.5. Затем проводят десорбцию с колонки, промывают и хранят. Результаты показаны в табл. 7.- 26015148 Таблица 7 Содержание UBD (%) в опытах с промыванием хлористым кальцием и в отсутствие промывания хлористым кальцием В опыте с дополнительным промыванием раствором, содержащим 50 мМ ацетата, 2.0 М CaCl2, рН 5.0, наблюдается двукратное уменьшение уровней UDB. Пример 6. Удаление НСР и IRT промыванием другими солями двухвалентных катионов. В данном примере изучается способность раствора для промывания, содержащего MnCl2 или NiCl2,удалять примеси из препарата, содержащего моноклональное антитело к А ААВ. Для проверки действия промывающих растворов, содержащих другие соли двухвалентных катионов, таких как MnCl2 или NiCl2, проводят два опыта. Также проводят два контрольных опыта один с буфером для промывания, содержащим 20 мМ Трис, 1.0 М NaCl, pH 7.5 (не ожидается удаления IRT или НСР), а другой с буфером для промывания, содержащим 50 мМ Трис, 2.0 М CaCl2, рН 7.5. Небольшое количество культуры, содержащей моноклональное антитело, очищают на колонкеMabSelect Protein A (9 мл), связанной с хроматографической системой GE Healthcare KTA FPLC. Опыты с MabSelect проводят, как описано ниже. Как указано ниже, все рабочие параметры идентичны в четырех опытах, за исключением буфера для промывания 1, который все время меняется (табл. 8). Размеры колонки - 1.0 см 11.5 см (9 мл); Рабочая скорость потока - 300 см/ч (уравновешивание, промывание 2, элюция, регенерация, хранение); Рабочая скорость потока - 230 см/ч (нанесение нагрузки (образца), быстрое промывание, промывание 1); Уравновешивание 1 - 50 мМ Трис, 150 мМ NaCl, pH 7.5 (5 объемов колонки); Промывание 1 - меняется (см. состав в табл. 8); Промывание 2 - 50 мМ Трис, 1.0 М NaCl, pH 7.5 (5 объемов колонки); Элюция - 50 мМ глицина, 10 мМ NaCl, pH 3.0 (3 объема колонки); Регенерация - 50 мМ NaOH, 0.5 М Na2SO4 (5 объемов колонки); Хранение - 16% этанол, 50 мМ Трис, 150 мМ NaCl, pH 7.5 (5 объемов колонки); Рабочая температура - 18-24 С. Колонку с MabSelect Protein А уравновешивают буфером 20 мМ Трис, 150 мМ NaCl, pH 7.5 (5 объемов колонки). На носитель в колонке наносят продукт в количестве примерно 40 мг продукта/мл смолы. Оставшуюся часть загрузки смывают (струей) буфером 50 мМ Трис, 150 мМ NaCl, pH 7.5 (5 объемов колонки). После этого колонку промывают одним из растворов, описанных в табл. 8. Перед элюцией колонку промывают раствором 50 мМ Трис, 10 мМ NaCl, pH 7.5 (5 объемов колонки). Продукт элюируют с колонки MabSelect Protein А раствором 50 мМ глицина, 10 мМ NaCl, pH 3.0. Затем собранные фракции (пул) продукта нейтрализуют до рН 8.0 раствором 2 М Трис, рН 9.0. Проводят десорбцию с колонки раствором 50 мМ NaOH, 0.5 М Na2SO4 (5 объемов колонки). Затем хранят с 16% этанола, 50 мМ Трис, 150 мМ NaCl, рН 7.5 (5 объемов колонки). Результаты показаны в табл. 8(очистка от НСР) и в табл. 9 (очистка от IRT). Таблица 8 Удаление НСР различными растворами для промывания Таблица 9 Удаление IRT различными растворами для промывания рН 5.0 выбирают из-за растворимости MnCl2 и NiCl2. В табл. 8 показано, что уровни НСР в образцах из опытов с промыванием растворами, содержащими соли двухвалентных катионов, в 1.5-3.5 раз ниже, чем уровни НСР в контрольных образцах (промывание раствором 1.0 М NaCl). В табл. 9 показано, что промывание растворами, содержащими соли двухвалентных катионов, обеспечивает 3.5-кратное удаление IRT по сравнению с образцами из опытов с- 27015148 промыванием растворами 1.0 М NaCl. Таким образом, эти результаты показывают, что промывание солями других двухвалентных катионов (например, MnCl2 или NiCl2), отличных от CaCl2, также эффективно удаляет примеси. Эквиваленты. Специалисты в данной области техники знают или могут выяснить с помощью лишь обычных экспериментов многие эквиваленты конкретных экспериментов по изобретению в данном описании. Предполагается, что такие эквиваленты охватываются нижеприведенной формулой изобретения. Перечень последовательностей