Стабильные белковые препараты
Номер патента: 14232
Опубликовано: 29.10.2010
Авторы: Неруркар Маной, Борсадиа Сунита, Далхейм Чарльз И., Нарингрекар Виджай Х., Дали Маниша М., Ганди Раджеш Б.
Формула / Реферат
1. Препарат для подкожного введения, содержащий по меньшей мере 100 мг/мл CTLA4Ig, сахар, способный стабилизировать препарат, в концентрации, обеспечивающей эффективную стабилизацию, и фармацевтически приемлемый водный носитель.
2. Препарат по п.1, отличающийся тем, что сахар выбирают из группы, состоящей из сахарозы, лактозы, мальтозы, маннита и трегалозы и их смесей.
3. Препарат по п.1, отличающийся тем, что сахар представляет собой дисахарид.
4. Препарат по п.3, отличающийся тем, что дисахарид представляет собой сахарозу.
5. Препарат по п.1, дополнительно содержащий фармацевтически приемлемый буфер.
6. Препарат по п.1, имеющий рН в интервале от 6 до 8.
7. Препарат по п.1, отличающийся тем, что CTLA4Ig имеет аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO:2, начиная с метионина в положении 27 или с аланина в положении 26 и кончая лизином в положении 383 или глицином в положении 382.
8. Препарат по п.1, отличающийся тем, что CTLA4Ig представляет собой L104EA29YIg, имеющий аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO:4, начиная с метионина в положении 27 или с аланина в положении 26 и кончая лизином в положении 383 или глицином в положении 382.
9. Препарат по п.7 или 8, отличающийся тем, что сахар выбирают из группы, состоящей из сахарозы, лактозы, мальтозы, маннита и трегалозы и их смесей.
10. Препарат по п.7 или 8, отличающийся тем, что сахар представляет собой дисахарид.
11. Препарат по п.7 или 8, отличающийся тем, что сахар представляет собой сахарозу.
12. Раствор по пп.1, 7 или 8, отличающийся тем, что соотношение белок:сахар составляет по меньшей мере 1:1,3.
13. Препарат по п.7 или 8, дополнительно содержащий фармацевтически приемлемый буфер.
14. Препарат по п.7 или 8, имеющий рН в интервале от 6 до 8.
15. Препарат для подкожного введения, содержащий CTLA4Ig, имеющий аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO:2, начиная с метионина в положении 27 или с аланина в положении 26 и кончая лизином в положении 383 или глицином в положении 382, в количестве около 125 мг/мл, сахарозу в количестве около 170 мг/мл, по меньшей мере один буферный агент, стерильную воду для инъекций и, необязательно, поверхностно-активное вещество.
16. Препарат по п.15, отличающийся тем, что буферный агент представляет собой по меньшей мере 10 мМ раствора фосфата натрия, который является смесью двухосновной и одноосновной солей натрия.
17. Препарат по п.15, отличающийся тем, что поверхностно-активное вещество представляет собой Полоксамер 188 в количестве около 8 мг/мл.
18. Препарат по п.15, имеющий рН в интервале от 6 до 8.
19. Препарат для подкожного введения, содержащий L104EA29YIg, имеющий аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO:4, начиная с метионина в положении 27 или с аланина в положении 26 и кончая лизином в положении 383 или глицином в положении 382, в количестве около 125 мг/мл, сахарозу в количестве около 170 мг/мл, по меньшей мере один буферный агент, стерильную воду для инъекций и, необязательно, поверхностно-активное вещество.
20. Препарат по п.19, отличающийся тем, что буферный агент представляет собой по меньшей мере 10 мМ раствора фосфата натрия, который является смесью двухосновной и одноосновной солей натрия.
21. Препарат по п.19, отличающийся тем, что поверхностно-активное вещество представляет собой Полоксамер 188 в количестве около 8 мг/мл.
22. Препарат по п.19, имеющий рН в интервале от 6 до 8.
23. Препарат по пп.1, 15 или 19, отличающийся тем, что он стабилен при хранении при температуре 2-8°С по меньшей мере в течение 12 месяцев.
24. Набор, включающий:
а) по меньшей мере один контейнер, содержащий препарат по пп.1, 15 или 19, и
б) инструкции по применению препарата для подкожного введения нуждающемуся в этом субъекту.
25. Набор по п.24, отличающийся тем, что контейнер представляет собой пузырек (флакон) или шприц.
26. Препарат для подкожного введения, содержащий CTLA4Ig, имеющий аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO:2, начиная с метионина в положении 27 или с аланина в положении 26 и кончая лизином в положении 383 или глицином в положении 382, в количестве около 20 мг/мл, сахарозу в количестве около 40 мг/мл, по меньшей мере один буферный агент, стерильную воду для инъекций и, необязательно, поверхностно-активное вещество.
27. Препарат по п.26, отличающийся тем, что буферный агент представляет собой некоторое количество, по меньшей мере 10 мМ, раствора фосфата натрия.
28. Препарат по п.26, отличающийся тем, что поверхностно-активное вещество представляет собой Полоксамер 188 в количестве около 8 мг/мл.
29. Препарат по п.26, имеющий рН в интервале от 6 до 8.
30. Препарат для подкожного введения, содержащий L104EA29YIg, имеющий аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO:4, начиная с метионина в положении 27 или с аланина в положении 26 и кончая лизином в положении 383 или глицином в положении 382, в количестве около 20 мг/мл, сахарозу в количестве около 40 мг/мл, по меньшей мере один буферный агент, стерильную воду для инъекций и, необязательно, поверхностно-активное вещество.
31. Препарат по п.30, отличающийся тем, что буферный агент представляет собой некоторое количество, по меньшей мере 10 мМ, раствора фосфата натрия.
32. Препарат по п.30, отличающийся тем, что поверхностно-активное вещество представляет собой Полоксамер 188 в количестве около 8 мг/мл.
33. Препарат по п.30, имеющий рН в интервале от 6 до 8.
34. Препарат по п.26 или 30, отличающийся тем, что он стабилен при хранении при температуре 2-8°С по меньшей мере в течение 12 месяцев.
35. Набор, включающий:
а) по меньшей мере один контейнер, содержащий препарат по пп.26, 39 или 43, и
б) инструкции по разведению препарата водным носителем до конечной концентрации CTLA4Ig от 1 до 10 мг/мл.
36. Набор по п.35, дополнительно включающий шприц.
37. Набор по п.35, отличающийся тем, что водный носитель представляет собой стерильную воду для инъекций, USP, или 0,9% раствор хлорида натрия для инъекций, USP.
38. Лиофилизированный препарат для разведения перед внутривенным вливанием, содержащий растворимый CTLA4Ig и лиопротектор, выбранный из группы, состоящей из сахарозы, лактозы, мальтозы и трегалозы, причем минимальное количество лиопротектора таково, что отношение белка к лиопротектору составляет 1:2.
39. Лиофилизированный препарат по п.38, отличающийся тем, что лиопротектор представляет собой сахарозу или мальтозу и их смеси.
40. Лиофилизированный препарат по п.38, дополнительно содержащий фармацевтически приемлемый буфер.
41. Лиофилизированный препарат по п.38, имеющий рН в интервале от 7 до 8.
42. Лиофилизированный препарат по п.38, отличающийся тем, что CTLA4Ig имеет аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO:2, начиная с метионина в положении 27 или с аланина в положении 26 и кончая лизином в положении 383 или глицином в положении 382.
43. Лиофилизированный препарат по п.38, отличающийся тем, что CTLA4Ig представляет собой L104EA29YIg, имеющий аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO:4, начиная с метионина в положении 27 или с аланина в положении 26 и кончая лизином в положении 383 или глицином в положении 382.
44. Лиофилизированный препарат по п.42 или 43, отличающийся тем, что лиопротектор выбирают из группы, состоящей из сахарозы, лактозы, мальтозы и трегалозы и их смесей.
45. Лиофилизированный препарат по п.42 или 43, отличающийся тем, что лиопротектор представляет собой сахарозу или мальтозу.
46. Лиофилизированный препарат по п.42 или 43, дополнительно содержащий фармацевтически приемлемый буфер.
47. Препарат по п.42 или 43, имеющий рН в интервале от 7 до 8.
48. Лиофилизированный препарат, содержащий CTLA4Ig, имеющий аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO:2, начиная с метионина в положении 27 или с аланина в положении 26 и кончая лизином в положении 383 или глицином в положении 382, в количестве около 262 мг/пузырек (флакон), мальтозу в количестве около 525 мг/пузырек (флакон), по меньшей мере один буферный агент и, необязательно, поверхностно-активное вещество.
49. Лиофилизированный препарат по п.48, отличающийся тем, что буферный агент представляет собой по меньшей мере 10 мМ раствора фосфата натрия.
50. Лиофилизированный препарат по п.48, отличающийся тем, что поверхностно-активное вещество представляет собой Полоксамер 188 в количестве около 8 мг/мл.
51. Лиофилизированный препарат по п.48, имеющий рН в интервале от 7 до 8.
52. Лиофилизированный препарат, содержащий L104EA29YIg, имеющий аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO:4, начиная с метионина в положении 27 или с аланина в положении 26 и кончая лизином в положении 383 или глицином в положении 382, в количестве около 110 мг/пузырек, сахарозу в количестве около 220 мг/пузырек, по меньшей мере один буферный агент, стерильную воду для инъекций и, необязательно, поверхностно-активное вещество.
53. Лиофилизированный препарат по п.52, отличающийся тем, что буферный агент представляет собой по меньшей мере 10 мМ раствора фосфата натрия.
54. Лиофилизированный препарат по п.52, отличающийся тем, что поверхностно-активное вещество представляет собой Полоксамер 188 в количестве около 8 мг/мл.
55. Лиофилизированный препарат по п.52, имеющий рН в интервале от 7 до 8.
56. Лиофилизированный препарат по пп.38, 48 или 52, отличающийся тем, что он стабилен при хранении при температуре 2-8°С по меньшей мере в течение 12 месяцев.
57. Набор, включающий:
а) по меньшей мере один контейнер, содержащий препарат по пп.38, 48 или 52, и
б) инструкции по разведению лиофилизированного препарата до конечной концентрации CTLA4Ig от 1 до 10 мг/мл.
58. Набор по п.57, дополнительно включающий шприц.
59. Набор по п.57, отличающийся тем, что водный носитель представляет собой стерильную воду для инъекций, USP, или 0,9% раствор хлорида натрия для инъекций, USP.
60. Способ лечения заболеваний иммунной системы, заключающийся во введении нуждающемуся в этом субъекту эффективного количества препарата по любому из пп.1, 15, 19, 26, 30, 38, 48, 52.
61. Способ по п.60, отличающийся тем, что заболевания иммунной системы выбирают из группы, состоящей из аутоиммунных заболеваний, иммунопролиферативных заболеваний и расстройств, связанных с трансплантатом.
62. Способ лечения или предупреждения гомологичной болезни (болезни трансплантат против хозяина), заключающийся во введении нуждающемуся в этом субъекту эффективного количества препарата по любому из пп.1, 15, 19, 26, 30, 38, 48, 52.
63. Способ лечения ревматоидного артрита, заключающийся во введении нуждающемуся в этом субъекту эффективного количества препарата по любому из пп.1, 15, 19, 26, 30, 38, 48, 52.
64. Способ ингибирования отторжения трансплантата солидного органа и/или ткани, заключающийся во введении субъекту, перенесшему трансплантацию, эффективного количества препарата по любому из пп.1, 15, 19, 26, 30, 38, 48, 52.
Текст
Настоящее изобретение в целом относится к стабильным препаратам, содержащим CTLA4Ig,включая лиофилизированные или жидкие препараты для введения различными способами,включая, например, такие способы, как внутривенный (в/в, IV) и подкожный (SC), для лечения заболеваний иммунной системы и индукции толерантности. 014232 Область, к которой относится изобретение Настоящее изобретение относится в целом к стабильным препаратам, содержащим молекулыCTLA4Ig, включая лиофилизированные и жидкие препараты, для введения различными способами,включая, например, такие как внутривенный (IV, в/в) и подкожный (SC). Предпосылки создания изобретения В течение двух последних десятилетий метод рекомбинантной ДНК сделал возможным промышленный выпуск многих белковых лекарственных веществ. Наиболее обычным способом доставки белковых лекарств является внутривенное (IV, в/в) введение вследствие плохой биодоступности при применении большинства других способов, лучшего контроля в процессе клинического применения и более быстрой доставки препарата. Для продуктов, требующих частого и постоянного введения, более привлекательным является альтернативный подкожный способ доставки. При использовании предварительно заполненного шприца в сочетании с автоинжектором SC доставка делает возможным введение на дому и повышает приверженность к лечению. Лечение высокими дозами, выше 1 мг/кг или 100 мг на дозу, часто требует создания препаратов в концентрациях, превышающих 100 мг/мл, вследствие малого объма ( 1,5 мл), который можно вводитьSC способом. В случае белков, которые склонны к агрегации при более высоких концентрациях, получение таких высококонцентрированных препаратов является сложной научно- производственной задачей. Даже при IV (в/в) способе доставки, когда можно вводить большие объмы, в схемах с высокими дозами могут потребоваться концентрации белка десятки миллиграммов на миллилитр, и это может представлять трудность для стабильности некоторых белков. Закономерности, определяющие растворимость белков, более сложны, чем закономерности, определяющие растворимость малых синтетических молекул (низкомолекулярных соединений), и поэтому для того чтобы преодолеть затруднения, связанные с растворимостью белков, требуются другие методы. Растворимость белков можно описать как максимальное количество белка, присутствующее, в сорастворителях, при котором раствор остатся оптически прозрачным (т.е. в нм не видно осадка, кристаллов или геля белка). Зависимость растворимости белка от ионной видно осадка, кристаллов или геля белка. Зависимость растворимости белка от ионной силы, солевой формы, рН, температуры и некоторых эксципиентов с точки зрения механизма объясняли изменениями поверхностного натяжения в объме воды и связыванием белка с водой и ионами по сравнению с самоассоциацией, см. Arakawa et al в Theory of protein solubility, Methods of Enzymology, 114: 49- 77, 1985; Schein в Solubility as a function of protein structureproblem, Protein Science 7(2): 376-382, 1998; и др. Связывание белков со специфическими эксципиентами или солями влияет на растворимость за счт изменения конформации белка или маскировки некоторых аминокислот, участвующих в "самовзаимодействии". Белки также предпочтительно гидратируются (и стабилизируются в виде более компактных конформаций) в присутствии некоторых солей, аминокислот и сахаров, что ведт к изменению их растворимости. Предполагают, что агрегация, для которой требуется бимолекулярное столкновение, является основным направлением деградации в белковых растворах. Соотношение концентрации с образованием агрегатов зависит от размера агрегатов, а также от механизма ассоциации. Агрегация белков может привести к ковалентной (например, за счт связывания дисульфидной связью) или нековалентной (обратимой или необратимой) ассоциации. Необратимая агрегация с помощью нековалентной ассоциации обычно осуществляется за счт гидрофобных областей, подвергающихся температурным, механическим или химическим процессам, которые изменяют нативную конформацию белка. Агрегация белка может оказывать влияние на активность, фармакокинетику и безопасность белка, например, за счт иммуногенности. Типичный способ свести агрегацию к минимуму - это ограничение подвижности белков с целью понизить число столкновений. Лиофилизация с подходящими эксципиентами может повысить устойчивость белка к агрегации за счт снижения подвижности белка и за счт ограничения конформационной гибкости и дат дополнительное преимущество, а именно сводит к минимуму гидролитические реакции вследствие удаления воды. Добавление подходящих эксципиентов, включая лиопротекторы, может предупредить образование агрегатов в процессе лиофилизации, а также при хранении конечного продукта. Важнейшим показателем эффективной защиты является молярное соотношение лиопротектора и белка. Обычно для обеспечения подходящей стабильности, особенно для хранения при комнатной температуре,требуются молярные соотношения 300: 1 или выше. Однако такие соотношения могут также привести к нежелательному повышению вязкости. Лиофилизация позволяет создавать препарат с подходящей стабильностью и тоничностью (осмотическим давлением). Хотя изотоничность необязательна для SC введения, она может быть желательной для того, чтобы минимизировать боль при введении. Изотоничности лиофильного соединения трудно достичь, потому что как белок, так и эксципиенты концентрируются в процессе реконституции. Молярные соотношения эксципиент:белок 500:1 дают в результате гипертонические препараты, если намеченная конечная концентрация белка 100 мг/мл. Если желательно получить изотонический препарат, тогда-1 014232 при выборе более низкого молярного соотношения эксципиент:белок можно получить менее стабильный препарат. Наивысшую достижимую концентрацию белка определяют эмпирическим путм из-за лабильной природы конформации белка и из-за склонности взаимодействовать с самим собой, с поверхностями и со специфическими растворами. Примерами субъектов, для которых предпочтительны SC препараты, являются субъекты, которым требуется частое и постоянное введение, такие как больные с заболеванием иммунной системы ревматоидным артритом и иммунными расстройствами, ассоциированными с трансплантацией. Продающиеся белковые лекарственные продукты для лечения ревматоидного артрита включают HUMIRA,ENBREL и REMCADE.HUMIRA (Abbott) выпускается в виде одноразовых шприцев на 1 мл, предварительно заполненных стерильным раствором без консервантов для подкожного введения. Раствор HUMIRA является прозрачным и бесцветным с рН около 5,2. Каждый шприц доставляет 0,8 мл (40 мг) лекарственного продукта. Каждая доза 0,8 мл HUMIRA содержит 40 мг адалимумаба, 4,93 мг хлорида натрия, 0,69 мг дигидрата одноосновного фосфата натрия, 1,22 мг дигидрата двухосновного фосфата натрия, 0,24 мг цитрата натрия, 1,04 мг моногидрата лимонной кислоты, 9,6 мг маннита, 0,8 мг полисорбата 80 и воду для инъекций, USP. При необходимости для корректировки рН добавляют гидроксид натрия.ENBREL (Amgen) выпускается в виде одноразовых шприцев на 1 мл, предварительно заполненных стерильным раствором без консервантов для подкожного введения. Раствор ENBREL является прозрачным и бесцветным и имеет рН 6,30,2. Каждый предварительно заполненный ENBREL одноразовый шприц содержит 0,98 мл раствора этанерцепта с концентрацией 50 мг/мл плюс 10 мг/мл сахарозы, 5,8 мг/мл хлорида натрия, 5,3 мг/мл L-аргинина гидрохлорида, 2,6 мг/мл моногидрата одноосновного фосфата натрия и 0,9 мг/мл безводного двухосновного фосфата натрия. Введение одного шприца, предварительно заполненного ENBREL с концентрацией 50 мг/мл, обеспечивает дозу, эквивалентную двум флаконам (пузырькам) по 25 мг лиофилизированного ENBREL, когда содержимое пузырьков (флаконов) восстанавливается и вводится в соответствии с рекомендациями. Пузырк (флакон) многократного пользования с ENBREL содержит стерильный белый свободный от консервантов лиофилизированный порошок. Реконституция в 1 мл входящей в комплект стерильной бактериостатической воды для инъекций (BWFI), USP (содержащей 0,9% бензилового спирта) дат прозрачный бесцветный раствор для многократного пользования с рН 7,40,3, содержащий 25 мг этанерцепта, 40 мг маннита, 10 мг сахарозы и 1.2 мг трометамина.REMICADE (Centocor) выпускают в виде стерильного белого лиофилизированного порошка для внутривенной инфузии. После реконституции в 10 мл стерильной воды для инъекций, USP, рН 7,2. Каждый пузырк (флакон) для одноразового применения содержит 100 мг инфликсимаба, 500 мг сахарозы,0,5 мг полисорбата 80, 2,2 мг одноосновного фосфата натрия, моногидрата и 6,1 мг двухосновного фосфата натрия, дигидрата. Консерванты отсутствуют. Продажные белковые лекарственные продукты для лечения иммунных расстройств, обусловленных трансплантацией, включают SIMULECT и ZENAPAX. Лекарственный продукт SIMULECT (Novartis) представляет собой стерильный лиофилизат, который выпускают в виде стеклянных пузырьков (флаконов) по 6 мл и с концентрацией 10 мг и 20 мг. Каждый пузырк на 10 мг содержат 10 мг базиликсимаба, 3,61 мг одноосновного фосфата калия, 0,50 мг динатрийфосфата (безводного), 0,80 мг хлорида натрия, 10 мг сахарозы, 40 мг маннита и 20 мг глицина, для восстановления в 2,5 мл стерильной воды для инъекций, USP. Каждый пузырк на 20 мг содержит 20 мг базиликсимаба, 7.21 мг одноосновного фосфата калия, 0.99 динатрийфосфата (безводного), 1,61 хлорида натрия, 20 мг сахарозы, 80 мг маннита и 40 мг глицина, для восстановления в 5 мл стерильной воды для инъекций, USP. Какие-либо консерванты отсутствуют.ZENAPAX (Roche Laboratories), 25 мг/5 мл, выпускают в прозрачного стерильного бесцветного концентрата для дальнейшего разведения и внутривенного введения. Каждый миллилитр ZENAPAX содержит 5 мг даклизумаба и 3,6 мг моногидрата одноосновного фосфата натрия, 11 мг гептагидрата двухосновного фосфата натрия, 4,6 мг хлорида натрия, 0,2 мг полисорбата 80 и может содержать хлористо-водородную кислоту или гидроксид натрия для корректировки рН до 6.9. Какие-либо консерванты отсутствуют. Молекулы CTLA4Ig мешают костимуляции Т клеток, ингибируя взаимодействие CD28- В 7. Следовательно, молекулы CTLA4Ig могут найти терапевтическое применение при заболеваниях иммунной системы, таких как ревматоидный артрит и иммунные расстройства, ассоциированные с трансплантацией. Необходимы стабильные эффективные удобные препараты, содержащие молекулы CTLA4Ig, для лечения расстройств иммунной системы. Сущность изобретения Настоящее изобретение включает препараты для лечения заболеваний иммунной системы путм введения субъекту молекул CTLA4Ig, которые связываются с молекулами В 7 на В 7-позитивных клетках,-2 014232 тем самым ингибируя связывание молекул эндогенного антигена В 7 с CTLA4 и/или CD28 на Т-клетках. Лиофилизированный препарат по изобретению содержит молекулы CTLA4Ig в весовом соотношении белка и лиопротектора, составляющем по меньшей мере 1:2. Лиопротектор предпочтительно представляет собой сахар, более предпочтительно дисахариды, наиболее предпочтительно сахарозу или мальтозу. Лиофилизированный препарат может также содержать один или более компонентов, выбранных из группы, состоящей из буферных агентов, поверхностно-активных веществ, наполнителей и консервантов. В некоторых вариантах изобретения весовое отношение белка к количеству сахарозы или мальтозы,применимому для стабилизации лиофилизированного лекарственного продукта, составляет 1:2, предпочтительно весовое отношение белка к сахарозе или мальтозе составляет от 1:2 до 1:5, более предпочтительно весовое отношение белка к мальтозе или сахарозе составляет около 1:2. Препарат по изобретению для подкожного (SC) введения содержит CTLA4Ig с концентрацией белка по меньшей мере 100 мг/мл в сочетании со стабилизующими уровнями сахара, предпочтительно с концентрацией белка по меньшей мере 125 мг/мл в сочетании со стабилизующими уровнями сахара в водном носителе. Весовое отношение белка к сахару составляет по меньшей мере 1: 1,1. Стабилизатор используют, предпочтительно, в количестве, не превышающем количество, которое может создать вязкость, нежелательную или неподходящую для введения с помощью SC шприца. Сахар, предпочтительно,представляет собой дисахарид, наиболее предпочтительно сахарозу. SC препарат может также содержать один или более компонентов, выбранных из группы, состоящей из буферных агентов, поверхностноактивных веществ и консервантов. В некоторых вариантах изобретения весовое соотношение белка и сахарозы, применимой для стабилизации SC лекарственного продукта CTLA4Ig, составляет по меньшей мере 1:1, предпочтительно весовое соотношение белка и сахарозы составляет от 1: 1,3 до 1:5, более предпочтительно весовое соотношение белка и сахарозы составляет 1:4. В другом варианте изобретение включает набор, который содержит лекарственный продукт и, предпочтительно, включает инструкции по его применению. Помимо этого, настоящее изобретение включает способы лечения заболеваний иммунной системы и индукции толерантности путм введения препаратов CTLA4Ig по изобретению. Краткое описание фигур На фиг. 1 представлена нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO: 1) участка кассеты для экспрессии CTLA4-Ig. Также показана аминокислотная последовательность (SEQ ID NO:2), кодированная нуклеиновой кислотой. Молекулы CTLA4- Ig, которые могут продуцироваться при использовании этой кассеты экспрессии, включает молекулы, имеющие аминокислотные последовательности из остатков: (i) 26- 383 последовательности SEQ ID NO:2, (ii) 26-382 последовательности SEQ ID NO:2, (iii) 27-383 последовательности SEQ ID NO:2 или (iv) 26-382 последовательности SEQ ID NO:2, или, необязательно, (v) 25-382 последовательности SEQ ID NO:2, или (vi) 25-383 последовательности SEQ ID NO:2. Кассета экспрессии содержит следующие области: (а) сигнальную последовательность онкостатина М содержит следующие области: (а) сигнальную последовательность онкостатина М (нуклеотиды 11-88 из SEQ ID NO: 1; аминокислоты 1- 26 из SEQ ID NO: 2); (б) внеклеточный домен человеческого CTLA4 (нуклеотиды 89463 из SEQ ID NO: 1; аминокислоты 27-151 из SEQ ID NO: 2); (в) модифицированный участок константной области человеческого IgG1 (нуклеотиды 464-1159 из SEQ ID NO: 1; аминокислоты 152-383 из SEQID NO:2), включая модифицированную шарнирную область (нуклеотиды 464-508 из SEQ ID NO:1; аминокислоты 152-166 из SEQ ID NO:2), модифицированный СН 2 домен человеческого IgG1 (нуклеотиды 509-838 из SEQ ID NO: 1; аминокислоты 167-276 из SEQ ID NO:2), и домен CH3 человеческого IgG1(нуклеотиды 839-1159 из SEQ ID NO: 1; аминокислоты 277-383 из SEQ ID NO: 2). На фиг. 2 изображена нуклеотидная (SEQ ID NO: 3) и аминокислотная (SEQ ID NO: 4) последовательность CTLA4- L104EA29Y- Ig (также известная как "L104EA29YIg" и "LEA29Y"), содержащая сигнальный пептид; мутантный внеклеточный домен CTLA4, начиная с метионина в положении +1 и кончая аспарагиновой кислотой в положении +124, или начиная с аланина в положении -1 и кончая аспарагиновой кислотой в положении +124; и Ig область. SEQ ID NO: 3 и 4 изображают нуклеотидную и аминокислотную последовательность, соответственно, L104EA29YIg, содержащую сигнальный пептид; мутантный внеклеточный домен CTLA4, начиная с метионина в положении +27 и кончая аспарагиновой кислотой в положении +150, или начиная с аланина в положении +26 и кончая аспарагиновой кислотой в положении +150; и Ig область. L104EA29YIg может иметь аминокислотную последовательность из остатков: (i) 26-383 из SEQ ID NO:4, (ii) 26-382 из SEQ ID NO:4; (iii) 27-383 из SEQ ID NO:4 или (iv) 27-382 изSEQ ID NO: 4, или, необязательно, (v) 25-382 из SEQ ID NO: 4, или (vi) 25-383 из SEQ ID NO:4. Подробное описание изобретения Применяемые в данном описании:"Стабильный" препарат (состав) или лекарственный продукт представляет собой препарат или лекарственный продукт, в котором (молекула) CTLA4Ig при хранении практически сохраняет свою физическую и химическую стабильность и целостность. Стабильность препаратов CTLA4Ig можно определять при выбранных температурах через выбранные временные периоды. Например, увеличение образо-3 014232 вания агрегатов после лиофилизации и хранения является показателем нестабильности лиофилизированного препарата CTLA4Ig. Помимо образования агрегатов сохранение первоначальных прозрачности,цвета и запаха в течение срока годности является показателем, используемым для мониторинга стабильности растворов CTLA4Ig. HMW частицы представляют собой мультимеры (т.е. тетрамеры, гексамеры и т.д.), имеющие более высокую молекулярную массу, чем димеры молекулы CTLA4Ig. Обычно "стабильный" лекарственный продукт может представлять собой лекарственный продукт, в котором при хранении препарата при 2-8 С в течение года увеличение процентного содержания высокомолекулярных частиц (% HMW) составляет менее примерно 5% и предпочтительно менее примерно 3%. Предпочтительно промышленный лекарственный продукт содержит менее примерно 25% HMW частиц, предпочтительно менее примерно 15% HMW частиц, более предпочтительно менее примерно 10% HMW частиц, наиболее предпочтительно менее примерно 5% HMW частиц. Мономерные, димерные и HMW частицы молекулы CTLA4Ig можно разделить эксклюзионной хроматографией (SEC). SEC позволяет разделить молекулы в зависимости от молекулярной массы. Разделение достигается за счт различного исключения или включения молекул по мере их движения по длине колонки. Поэтому разрешение повышается, являясь функцией длины колонки. Образцы молекулCTLA4Ig можно делить на установке для ВЭЖХ 2695 Alliance HPLC (Waters, Milford, MA), снабжнной последовательно расположенными колонками TSK Gel G3000SWXL (300 мм 7,8 мм) и TSK Gel(аликвота 20 мкл) разделяют, используя в качестве подвижной фазы смесь 0,2 М KH2PO4, 0,9% NaCl, pH 6,8, при скорости потока 1,0 мл/мин. Оптическую плотность образцов проверяют при длине волны 280 нм с помощью детектора Water's 2487 Dual Wavelength. В этой системе HMW частицы показывают время удерживания 7,5 мин 1,0 мин. Для каждого пика интегрируют площадь под пиком. % HMW частиц рассчитывают, деля площадь HMW пика на общую площадь пиков."Восстановленный" ("реконституированный") препарат представляет собой препарат, который готовят, растворяя лиофилизированный препарат в водном носителе, так что CTLA4Ig растворяется в восстановленном (реконституированном) препарате. Восстановленный препарат пригоден для внутривенного (в/в, IV) введения нуждающемуся в этом пациенту."Изотонический" препарат представляет собой препарат, осмотическое давление которого практические такое же, что и крови человека. Изотонические препараты обычно имеют осмотическое давление около 250-350 мосмол/кг H2O. Термин "гипертонический" применяют для описания препарата с осмотическим давлением выше осмотического давления человеческой крови. Изотоничность можно измерять,например, осмометром по давлению паров или осмометром-криоскопом. Термин "буферный агент" относится к одному или более компонентов, которые, при добавлении их к водному раствору, способны предупреждать изменения рН раствора при добавлении кислоты или щлочи или при разведении растворителем. Помимо фосфатных буферов существуют глициновый, карбонатный, нитратный буферы и т.п., в этом случае в качестве противоиона могут служить ионы натрия,калия или аммония."Кислота" представляет собой вещество, которое в водном растворе дат ионы водорода. Выражение "фармацевтически приемлемая кислота" включает неорганические и органические кислоты, нетоксические с точки зрения концентрации и способа приготовления препарата."Основание" представляет собой вещество, которое в водном растворе дат гидроксильные ионы. Выражение "фармацевтически приемлемое основание" включает неорганические и органические основания, нетоксические с точки зрения концентрации и способа приготовления препарата."Лиопротектор" представляет собой соединение (молекулу), которое в комбинации с представляющим интерес белком предупреждает и/или снижает физическую нестабильность белка при лиофилизации и последующем хранении."Консервант" представляет собой агент, который снижает действие бактерий и может, необязательно, добавляться в препараты по данному описанию. Добавление консерванта, например, упрощает получение препарата многоразового действия (для многократного прима). Примеры потенциальных консервантов включают октадецилдиметилбензиламмония хлорид, гексаметония хлорид, бензалкония хлорид(смесь алкилбензилдиметиламмонийхлоридов, в которых алкильные группы представляют собой длинноцепные соединения) и бензетония хлорид. Другие типы консервантов включают ароматические спирты, такие как фенол, бутиловый и бензиловый спирты, алкилпарабены, такие как метил или пропилпарабен, катехин, резорцин, циклогексанол, 3-пентанол и м-крезол."Поверхностно-активное вещество (ПАВ)" ("сурфактант") представляет собой вещество, которое содержит как гидрофобную часть (например, алкильную цепь), так и гидрофильную часть (например,карбоксильную и карбоксилатную группы). Поверхностно-активное вещество можно добавлять в препараты по изобретению. Поверхностно-активные вещества, пригодные для применения в препаратах по настоящему изобретению, включают, но без ограничения, полисорбаты (например, полисорбаты 20 или 80); полоксамеры"Лекарственное вещество" относится к исходному материалу, используемому в препарате конечного лекарственного продукта. Обычная композиция CTLA4Ig лекарственного вещества содержит белок в концентрации от 20 до 60 мг/мл, рН от 7 до 8, и %HMW частиц 5%."Приготовленный объм раствора" относится к конечному препарату для заполнения контейнера,например, раствор, приготовленный для заполнения пузырьков для лиофилизации, или раствор, приготовленный для заполнения шприца для SC инъекции."Лекарственный продукт" относится к конечному препарату, помещнному в контейнер, который можно реконституировать перед употреблением, как в случае лиофилизированного лекарственного продукта; развести далее перед употреблением, как в случае жидкого лекарственного продукта; или использовать как есть, как в случае SC раствора лекарственного продукта. Термины "CTLA4-Ig", или "молекула CTLA4-Ig" или "молекула CTLA4Ig" используются взаимозаменяемо и относятся к белковой молекуле (белку), который содержит, по меньшей мере, полипептид,имеющий CTLA4 внеклеточный домен или его часть и константную область иммуноглобулина или е часть. Внеклеточный домен и константная область иммуноглобулина могут быть дикого типа, или мутантные, или модифицированные, и могут являться областями млекопитающих, включая человека и мышь. Кроме того, полипептид может содержать дополнительные домены белка. Молекула CTLA4- Ig может также относиться к мультимерным формам полипептида, таким как димеры, тетрамеры и гексамеры. Молекула CTLA4- Ig способна также связываться с CD80 и/или CD86. Термин "В 7- 1" относится к CD80; термин "В 7- 2" относится к CD86; а термин "В 7" относится как к В 7- 1, так и к В 7- 2 (CD80 и CD86). Термин "B7-1-Ig" или "В 7-Hg" относится к CD80-Ig; термин "B7-2Ig" или "B7-2Ig" относится к CD86- Ig. В одном варианте изобретения "CTLA4Ig" относится к белковой молекуле, имеющей аминокислотную последовательность из остатков: (i) 26-383 из SEQ ID NO:2, (ii) 26-382 из SEQ ID NO:2; (iii) 27-383 из SEQ ID NO:2, или (iv) 27-382 из SEQ ID NO:2, или, необязательно, (v) 25-382 из SEQ ID NO:2, или (vi) 25-383 из SEQ ID NO:2. В мономерной форме эти белки в данном описании могут обозначаться как "мономеры SEQ ID NO:2" или "мономеры, имеющие последовательность SEQ ID NO:2". Эти мономеры SEQID NO:2 могут димеризоваться, так что димерные комбинации могут включать, например: (i) и (i); (i) и(iv); (iii) и (v); (iii) и (vi); (iv) и (iv); (iv) и (v); (iv) и (vi); (v) и (v); (v) и (vi); и (vi) и (vi). Эти различные димерные комбинации могут также ассоциироваться друг с другом с образованием тетрамерных молекулCTLA4Ig. Эти мономеры, димеры, тетрамеры и другие мультимеры могут в данном описании обозначаться как "SEQ ID NO: 2 белки" или белки, имеющие SEQ ID NO: 2 последовательность". (ДНК, кодирующая CTLA4Ig, показанный в SEQ ID NO: 2, депонирована 31 мая 1991 г. в Американской коллекции типовых культур (АТСС), 10801 University Blvd., Manassas, VA 20110- 2209 по условиям Будапештского Договора под входящим номером АТСС 68629; клеточная линия яичника китайского хомячка (СНО),экспрессирующая CTLA4Ig, показанный в SEQ ID NO:2, депонирована 31 мая 1991 г. в АТСС под входящим номером CRL-10762). Термин "Абатацепт" по данному описанию относится к белкам SEQ IDNO:2. В одном варианте изобретения CTLA4-L104EA29Y-Ig (иногда называемый "LEA29Y" или"L104EA29Y") слитый методами генетической инженерии (рекомбинантной ДНК) белок, сходный по структуре с молекулой CTAL4- Ig, как показано в SEQ ID NO: 1. L104EA29Y- Ig имеет функциональный внеклеточный связывающий домен модифицированного CTLA4 и Fc домен иммуноглобулина IgG1 класса. Модификации двух аминокислот, лейцина в глутаминовую кислоту в положении 104 (L104E),что соответствует положению 130 в SEQ ID NO: 2, и аланина в тирозин в положении 29 (A29Y), т.е. положении 55 в SEQ ID NO: 2, осуществлены в В 7-связывающей области CTLA4 домена с образованиемL104EA29Y. SEQ ID NO: 3 и 4 изображают нуклеотидную и аминокислотную последовательность, соответственно, L104EA29YIg, содержащую сигнальный пептид; мутантный внеклеточный домен CTLA4,начиная с метионина в положении +27 и кончая аспарагиновой кислотой в положении +150, или начиная с аланина в положении +26 и кончая аспарагиновой кислотой в положении +150; и Ig область. ДНК, кодирующая L104EA29Y-Ig, депонирована 20 июня 2000 г. в Американской коллекции типовых культур(АТСС), по условиям Будапештского Договора под входящим номером РТА-2104. Кроме того,L104EA29Y-Ig описан в патенте США 7094874, выданном 22 августа 2006 г., и в Международной заявкеWO 01/923337 А 2, которые вводятся ссылкой в данное описание во всей полноте. Экспрессия L104EA29YIg в клетках млекопитающих может привести к продуцированию N- и С-5 014232 концевых вариантов, так что продуцированные белки могут иметь аминокислотные последовательности из остатков: (i) 26-383 из SEQ ID NO: 4, (ii) 26-382 из SEQ ID NO: 4; (iii) 27-383 из SEQ ID NO: 4, или (iv) 27-382 из SEQ ID NO: 4, или, необязательно, (v) 25-382 из SEQ ID NO: 4, или (vi) 25-383 из SEQ ID NO: 4. В мономерной форме эти белки в данном описании могут обозначаться как "мономеры SEQ ID NO: 4" или "мономеры, имеющие последовательность SEQ ID NO: 4". Эти мономеры могут димеризоваться, так что димерные комбинации могут включать, например: (i) и (i); (i) и (ii); (i) и (iii); (i) и (iv); (i) и (v); (i) и(iv) и (v); (iv) и (vi); (v) и (v); (v) и (vi); и (vi) и (vi). Эти различные димерные комбинации могут также ассоциироваться друг с другом с образованием тетрамерных молекул L104EA29YIg. Эти мономеры, димеры, тетрамеры и другие мультимеры могут в данном описании обозначаться как "SEQ ID NO: 4 белки" или белки, имеющие SEQ ID NO: 4 последовательность". Термин "Белатацепт" по данному описанию относится к белкам SEQ ID NO:4. Мономеры и мультимеры CTLA4-Ig Молекулы CTLA4-Ig могут включать, например, CTLA4-Ig белки в мономерной, димерной, тримерной, тетрамерной, пентамерной, гексамерной или других мультимерных формах. CTLA4-Ig молекулы могут представлять собой слитый белок, по меньшей мере, с внеклеточным доменом CTLA4 и константной областью иммуноглобулина. CTLA4-Ig молекулы могут иметь последовательности дикого типа или мутантные последовательности, например, относительно последовательностей внеклеточного доменаCTLA4 и константной области иммуноглобулина. CTLA4-Ig мономеры, одни, или в димерной, тетрамерной или другой мультимерной форме, могут быть гликозилированными. В некоторых вариантах изобретение включает популяции CTLA4-Ig молекул, по меньшей мере, с определнным процентным содержанием димерных или других мультимерных молекул. Например, изобретение включает популяции CTLA4- Ig молекул, которые более чем на 90, 95, 96, 97, 98, 99% или 99,5% состоят из CTLA4-Ig димеров. В одном варианте изобретение включает популяцию CTLA4-Ig молекул, которая содержит примерно от 95%, примерно до 99,5% CTLA4-Ig димера и примерно от 0,5 примерно до 5% CTLA4- Ig тетрамера. В другом варианте популяция молекул CTLA4-Ig содержит около 98% CTLA4- Ig димера, около 1,5% CTLA4-Ig тетрамера и около 0,5% CTLA4-Ig мономера. В одном варианте изобретение включает популяцию CTLA4-Ig молекул, отличающуюся тем, что эта популяция практически не содержит молекул CTLA4-Ig мономера. Понятие "популяция, практически не содержащая CTLA4-Ig мономера", может относиться к популяции CTLA4-Ig молекул, которая содержит менее 1, 0,5 или 0,1% мономеров. В одном варианте изобретение включает популяцию CTLA4-Ig молекул, отличающуюся тем, что эта популяция практически не содержит молекул CTLA4-Ig мультимеров более высокомолекулярных,чем димеры, таких как тетрамеры, гексамеры и т.д. Понятие "популяция, практически не содержащаяCTLA4-Ig мультимеров", может относиться к популяции CTLA4-Ig молекул, которая содержит менее 6,5, 4, 3, 2, 1, 0,5 или 0,1% CTLA4-Ig мультимеров более высокомолекулярных, чем димер. В одном варианте изобретения молекула мономера CTLA4-Ig может иметь аминокислотную последовательность, например, из остатков: (i) 26-383 из SEQ ID NO:2, (ii) 26-382 из SEQ ID NO:2; (iii) 27-383 из SEQ ID NO:2, или (iv) 27-382 из SEQ ID NO:2, или, необязательно, (v) 25-382 из SEQ ID NO:2, или (vi) 25-383 из SEQ ID NO:2. Если кассета экспрессии, содержащая нуклеотидную последовательность SEQID NO:1, экспрессируется в СНО клетках, преобладающая экспрессируемая мономерная форма содержитN-концевой аминокислотный остаток метионина (остаток 27 в SEQ ID NO: 2), который соответствует Nконцевому аминокислотному остатку дикого типа человеческого CTLA4. Однако, так как SEQ ID NO:1 включает также кодирующую последовательность для сигнальной последовательности Онкостатина М(нуклеотиды 11-88 из SEQ ID NO:1), белок, экспрессированный при использовании SEQ ID NO:1, содержит сигнальную последовательность Онкостатина М. Сигнальная последовательность отщепляется от экспрессированного белка в процессе экспорта белка из цитоплазмы или в процессе секретирования клеткой. Но отщепление может привести к N-концевым вариантам, например, расщепление между остатками 25 и 26 (давая N- конец остатка 26, а именно, "Ala вариант"), или между аминокислотными остатками 24 и 25 (что дат в результате N- конец остатка 2, а именно, "Met- Ala вариант"), в противоположность расщеплению между аминокислотными остатками 26 и 27 (дающему N- конец остатка 27). Например, Met-Ala вариант может присутствовать в смеси CTLA4-Ig молекул в количестве, примерно, 1%,a Ala вариант может присутствовать в смеси CTLA4-Ig молекул в количестве, примерно, 8-10%. Кроме того, белок, экспрессированный при использовании SEQ ID NO:1, может иметь С-концевые варианты вследствие неполного процессирования. Преобладающий С-конец представляет собой глициновый остаток в положении 382 в SEQ ID NO:2. В смеси CTLA4-Ig молекул мономеры, имеющие лизин на С-конце(остаток 383 из SEQ ID NO:2) могут присутствовать, например, в количестве около 4-5%. Молекула мономера CTLA4-Ig может содержат внеклеточный домен человеческого CTLA4. В одном варианте изобретения внеклеточный домен может содержать нуклеотидную последовательность нуклеотидов 89-463 из SEQ ID NO:1, которая кодирует аминокислоты 27-151 из SEQ ID NO:2. В другом варианте изобретения внеклеточный домен может содержать мутантные последовательности человеческого CTLA4. В другом варианте изобретения внеклеточный домен может содержать нуклеотидные за-6 014232 мены нуклеотидов 89- 463 из SEQ ID NO:1, так что получают консервативные аминокислотные замены. В другом варианте изобретения домен может содержать нуклеотидную последовательность, которая по меньшей мере на 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 или 99% идентична нуклеотидам 89-463 из SEQ ID NO: 1. Молекула мономера CTLA4-Ig может содержат константную область человеческого иммуноглобулина. Эта константная область может представлять собой участок константной области; эта константная область может иметь последовательность дикого типа или мутантную последовательность. Константная область может быть областью человеческого IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA1, IgA2, IgD или IgE. Константная область может быть из лгкой цепи или тяжлой цепи иммуноглобулина. Если константная область взята из IgG, IgD или IgA молекулы, константная область может содержать один или более следующих доменов константной области: CL, CH1, шарнирную область, СН 2 или CH3. Если константная область взята из IgM или IgE, константная область может содержать один или более следующих доменов константной области: CL, CH1, CH2, CH3 или Са 4. В одном варианте изобретения константная область может содержать один или более доменов константной области из IgG, IgD, IgA, IgM или IgE. В одном варианте изобретения молекула мономера CTLA4-Ig содержит модифицированную шарнирную область человеческого IgG1 (нуклеотиды 464-508 из SEQ ID NO:1; аминокислоты 152-166 изSEQ ID NO:2), где сериновые остатки в положениях 156, 162 и 165 в SEQ ID NO: 2 методом генетической инженерии получены вместо цистеиновых остатков, присутствующих в последовательности дикого типа. В одном варианте изобретения молекула мономера CTLA4-Ig содержит модифицированную СН 2 область человеческого IgG1 и область CH3 дикого типа (модифицированный СН 2 домен человеческогоIgG1 содержит нуклеотиды 509-838 из SEQ ID NO:1 и аминокислоты 167-276 из SEQ ID NO:2; человеческий IgG1 CH3 домен содержит нуклеотиды 839-1159 из SEQ ID NO:1 и аминокислоты 277-383 из SEQID NO:2). В одном варианте изобретения популяция молекул CTLA4-Ig содержит мономеры, имеющие последовательность, показанную на одной или более фиг. 7, 8 или 9 патента США 7094874, выданного 22 августа 2006 г., и в опубликованных патентных заявкахUS 20030083246 и US 20040022787, которые тем самым вводятся в данное описание ссылкой во всей полноте. В одном варианте изобретения молекула тетрамера CTLA4-Ig содержит две пары или два димераCTLA4-Ig полипептидов, причм каждый полипептид имеет одну из следующих аминокислотных последовательностей: (i) 26-383 из SEQ ID NO:2, (ii) 26-382 из SEQ ID NO:2; (iii) 27-383 из SEQ ID NO: 2, илиNO:2. Каждый член пары полипептидов или димер ковалентно связан с другим членом, а две пары полипептидов нековалентной связью ассоциированы друг с другом, тем самым образуя тетрамер. Такие тетрамерные молекулы способны связываться с CD80 или CD86. В другом варианте изобретения такие тетрамерные молекулы способны связываться с CD80 илиCD86 с авидностью, по меньшей мере, вдвое превышающей авидность связывания CTLA4-Ig димера(мономеры в котором имеют одну из вышеприведнных аминокислотных последовательностей) с CD80 или CD86. В другом варианте изобретения такие тетрамерные молекулы могут связываться с CD80 илиCD86 с авидностью, по меньшей мере, вдвое превышающей аффинность или авидность связыванияCTLA4 дикого типа с CD80 или CD86. Такая более высокая авидность может вносить вклад в повышенную эффективность лечения иммунных расстройств и других заболеваний, описанных ниже. Кроме того,повышенная или улучшенная авидность способствует получению лекарства с повышенной активностью. Например, терапевтическая композиция, содержащая CTLA4-Ig тетрамер, обладает более высокой авидностью и, следовательно, более высокой активностью, чем такое же количество терапевтической композиции, содержащей CTLA4-Ig мономер. В другом варианте изобретения такие тетрамерные молекулы могут ингибировать Т-клеточную пролиферацию, по меньшей мере, вдвое сильнее, чем CTLA4-Ig димер(мономеры в котором имеют одну из вышеприведнных аминокислотных последовательностей). В другом варианте изобретения такие тетрамерные молекулы могут ингибировать Т-клеточную пролиферацию, по меньшей мере, вдвое сильнее, чем CTLA4 дикого типа. Пролиферацию Т клеток можно измерять обычными анализами, известными в уровне техники. Например, одним из наиболее обычных способов оценки Т-клеточной пролиферации является стимуляция Т клеток с помощью антигена или агонистических антител к TCR и определение, например, включения титруемого тимидина (3 Н-TdR, тритий-тимидина) в пролиферирующих Т клетках или количество цитокинов, высвобождаемых пролиферирующими Т клетками в культуру. Тем самым можно измерять ингибирующее действие CTLA4-Ig на активацию или пролиферацию Т клеток. Аффинность CTLA4-Ig молекулы обозначает прочность связывания молекулы с единичным лигандом, включая CD80, CD86, или CD80Ig или CD86Ig слитые белки. Аффинность CTLA4-Ig к лиганду можно определять, например, анализом связывающего взаимодействия (BIA) методом поверхностного плазмонного резонанса. Помимо измерения прочности связывания, он позволяет определять кинетику связывания в реальном времени, например, константы скорости ассоциации и диссоциации. Сенсорный чип, состоящий из предметного стекла, покрытого тонкой металлической плнкой, с которой ковалентно связана поверхностная матрица, покрывают одним из взаимодействующих реагентов, т.е. CTLA4-Ig или-7 014232 одним из лигандов. Раствор, содержащий другой взаимодействующий реагент, оставляют стекать по его поверхности. Постоянный световой поток направляют с противоположной стороны поверхности и измеряют его угол отражения. При связывании CTLA4-Ig с лигандом резонансный угол светового потока изменяется (так как он зависит от показателя преломления среды близ реактивной стороны сенсора, который, в свою очередь, коррелирует с концентрацией растворнного в среде материала). Затем показания анализируют с помощью компьютера. В одном варианте изобретения эксперименты по связыванию CTLA4-Ig можно проводить методом поверхностного плазмонного резонанса (ППР, SPR) на приборе BIAcore (BIAcore AG, Uppsala, Sweden).CTLA4-Ig может связываться ковалентной связью за счт первичных аминогрупп с матрицей из карбоксиметилированного декстрана на сенсорном чипе BIAcore, тем самым CTLA4-Ig иммобилизуется на поверхности сенсорного чипа. Или же, антитело против константной области можно использовать для не непосредственной иммобилизации CTLA4-Ig на поверхности сенсора через Ig фрагмент. Затем к чипу добавляют лиганды для определения связывания CTLA4-Ig с лигандами. Измерения аффинности можно проводить, например, как описано в van der Merwe, P. et al., J. Exp. Med. (1997) 185 (3): 393-404. Можно также измерять авидность CTLA4-Ig молекул. Авидность можно определить как суммарную общую прочность (силу) связывания двух молекул или клеток друг с другом во множестве сайтов. Авидность отличается от аффинности, которая представляет собой прочность (силу) связывания одного сайта на молекуле с е лигандом. Не связывая себя теорией, можно сказать, что более высокая авидность молекул CTLA4-Ig может вызывать повышенную эффективность ингибирования молекулами CTLA4-Ig пролиферации и активации Т-клеток. Авидность можно измерять, например, с помощью твердофазных анализов двух типов: а) конкурентным ингибированием и б) элюционным анализом. В обоих случаях лиганд присоединяют к тврдой подложке. При конкурентном ингибировании молекулы CTLA4-Ig затем помещают в раствор с фиксированной концентрацией, вместе со свободным лигандом в различных концентрациях, и определяют количество лиганда, которое ингибирует связывание с тврдой фазой на 50%. Чем меньше требуется лиганда, тем сильнее авидность. В элюционных анализах лиганд добавляют в раствор. По достижении равновесного состояния для нарушения взаимодействий CTLA4-Ig/лиганд добавляют хаотропный или денатурирующий агент (например, изотиоцианат, мочевину или диэтиламин) в различных концентрациях. Затем методом ELISA определяют количество CTLA4-Ig, устойчивого к элюции. Чем выше авидность, тем более хаотропный агент необходим для элюции определнного количестваCTLA4-Ig. Относительную авидность гетерогенной смеси молекул CTLA4-Ig можно выражать в виде индекса авидности (ИА, AI), равного концентрации элюирующего агента, необходимого для элюции 50% связанных молекул CTLA4-Ig. Уточннные данные можно получить, определяя процентное содержание элюированного CTLA4-Ig при различных концентрациях элюирующего агента. Способы получения CTLA4Ig по изобретению Экспрессия молекул CTLA4Ig может происходить в прокариотических клетках. Прокариоты наиболее часто могут быть представлены различными штаммами бактерий. Бактерии могут быть грамположительными и грамотрицательными. Обычно предпочтительными являются грамотрицательные бактерии, такие как Е. coli. Также могут использоваться другие штаммы микроорганизмов. Описанные выше последовательности, кодирующие CTLA4Ig, можно включать в вектор, созданный для экспрессии чужеродных последовательностей в прокариотических клетках, таких как Е. coli. Эти векторы могут включать широко используемые прокариотические регуляторные последовательности, которые по данному описанию включают промоторы для инициации транскрипции, необязательно с оператором, наряду с последовательностями сайтов связывания рибосом, включают такие широко используемые промоторы, как промоторные системы бета-лактамазы (пенициллиназы) и лактозы (lac)(Chang, et al., (1977) Nature 198: 1056), промоторная система триптофана (trp) (Goeddel, et al., (1980) Nucleic Acids Res. 8: 4057) и PL промотор фага лямбда, и сайт связывания рибосом N-гена (Shimatake, et al.,(1981) Nature 292: 128). Такие векторы экспрессии также включают ориджин репликации, селективные маркеры, такие как ген бета-лактамазы или неомицинфосфотрансферазы, придающий устойчивость к антибиотикам, так что векторы могут реплицироваться в бактериях, и клетки, несущие такие плазмиды, можно выбирать при выращивании в присутствии антибиотиков, таких как ампициллин или канамицин. Плазмиды экспрессии можно вводить в прокариотические клетки различными стандартными методами, включая, но без ограничения, CaCl2-шок (Cohen, (1972) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69: 2110, и Sambrook et al. (eds.), "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 2nd Edition, Cold Spring Harbor Press, (1989 и электропорацию. В соответствии с практикой применения изобретения эукариотические клетки также являются подходящими клетками-хозяевами. Примеры эукариотических клеток включают любую животную клетку,либо первичную, либо иммортализованную, клетки дрожжей (например, Saccharomyces cerevisiae,Schizosaccharomyces pombe и Pichia pastoris) и растительные клетки. Клетки миеломы, COS и СНО являются примерами животных клеток, которые можно использовать в качестве хозяев. Конкретные СНО клетки включают, но без ограничения, DG44 (Chasin, et la., 1986 Som. Cell. Molec. Genet. 12: 555- 556;On (Clontech), СНО, обозначенные как ЕСАСС 85050302 (CAMR, Salisbury, Wiltshire, UK), CHO клон 13(GEIMG, Genova, IT), CHO клон В (GEIMG, Genova, IT), клетки CHO-K1/SF, обозначенные как ЕСАСС 93061607 (CAMR, Salisbury, Wiltshire, UK), и клетки RR- CHOK1, обозначенные как ЕСАСС 92052129(CAMR, Salisbury, Wiltshire, UK). Примеры растительных клеток включают клетки табака (целое растение, культура клеток или каллюс), клетки пшеницы, сои и риса. Также применимы семена пшеницы, сои и риса. Нуклеотидные последовательности, кодирующие описанные выше молекулы CTLA4Ig, также можно включать в вектор, созданный для экспрессии чужеродных последовательностей в эукариотическом хозяине. Регуляторные элементы вектора могут варьироваться в зависимости от конкретного эукариотического хозяина. Широко используемые эукариотические регуляторные последовательности для применения в векторах экспрессии включают промоторы и регуляторные последовательности, совместимые с клетками млекопитающих, например, такие как CMV промотор (CDM8 вектор) и вирус саркомы птиц (ASV) (LN вектор). Другие широко используемые промоторы включают ранний и поздний промоторы вируса зелной мартышки - симиан- вируса 40 (SV40) (Fiers, et al., (1973) Nature 273: 113), или другие вирусные промоторы, такие как промоторы полиомы, Аденовируса 2 и вируса бычьей полиомы. Также можно использовать индуцибельный промотор, такой как hMTII (Karin, et al, (1982) Nature 299: 797-802). Векторы для экспрессии молекул CTLA4Ig в клетках эукариот могут также нести последовательности, называемые энхансерными областями. Эти последовательности играют важную роль в оптимизации экспрессии генов и находятся либо выше (5'), либо ниже (3') промоторной области. Примеры векторов экспрессии для эукариотических клеток- хозяев включают, но без ограничения,векторы для клеток-хозяев млекопитающих (например, BPV-1, pHyg, pRSV, pSV2, pTK2 (Maniatis);(Invitrogen) или их модифицированные формы, аденовирусные векторы; адено-ассоциированные вирусные векторы, бакуловирусные векторы, дрожжевые векторы (например, векторы pESC (Stratagene. Нуклеотидные последовательности, кодирующие молекулы CTLA4Ig, можно интегрировать в геном эукариотической клетки- хозяина и реплицировать в виде репликатов генома хозяина. Или же, вектор, несущий молекулы CTLA4Ig, может содержать ориджины репликации, способствующие внехромосомной репликации. Для экспрессии нуклеотидных последовательностей в Saccharomyces cerevisiae можно использовать ориджин репликации из эндогенной дрожжевой плазмиды, цикл 2 мкм (Broach, (1983) Meth. Enz. 101: 307). Или же можно использовать последовательности генома дрожжей, способные промотировать автономную репликацию (см., например, Stinchcomb et al., (1979) Nature 282: 39); Tschemper et al., (1980)Gene 10: 157; и Clarke et al., (1983) Meth. Enz. 101: 300). Последовательности транскрипционного контроля для дрожжевых векторов включают промоторы для синтеза гликолитических ферментов (Hess et al, (1968) J. Adv. Enzyme Reg. 7: 149; Holland et al.,(1978) Biochemistry 17:4900). Другие промоторы, известные в уровне техники, включают CMV промотор,предусматриваемый в CDM8 векторе (Toyama and Okayama, (1990) FEBS 268: 217- 221); промотор для 3 фосфоглицераткиназы (Hitzeman et al, (1980) J. Biol. Chem. 255:2073), и промоторы для других гликолитических ферментов. Другие промоторы являются индуцибельными, так как они могут регулироваться внешними раздражителями или питательной средой для роста клеток. Эти индуцибельные промоторы включают промоторы генов белков теплового шока, алкогольдегидрогеназы 2, изоцитохрома С, кислой фосфатазы,ферментов, ассоциированных с катаболизмом азота, и ферментов, отвечающих за утилизацию мальтозы и галактозы. Регуляторные последовательности можно также поместить на 3' конце кодирующих последовательностей. Эти последовательности могут стабилизировать матричную РНК. Такие терминаторы находятся в 3' нетранслируемой области после кодирующих последовательностей в некоторых генах дрожжей и млекопитающих. Примеры векторов растений и растительных клеток включают, но без ограничения, Ti плазмиды агробактерий, вирус мозаики цветной капусты (CaMV) и вирус золотой мозаики томатов (TGMV). Клетки млекопитающих можно трансформировать методами, включающими, но без ограничения,трансфекцию в присутствии фосфата кальция, микроинъекцию, электропорацию или трансдукцию с помощью вирусных векторов. Методы введения чужеродных последовательностей ДНК в геном растения или дрожжей включает(1) механические методы, такие как микроинъекция ДНК в единичную клетку или протопласты, при встряхивании клеток со стеклянными бусинами в присутствии ДНК, или при бомбардировке клеток или протопластов покрытыми вольфрамом или золотом сферами; (2) введение ДНК за счт того, что клеточные мембраны делают проницаемыми для макромолекул обработкой полиэтиленгликолем или выдерживанием в пульсовом режиме при высоком напряжении (электропорация); или (3) использование липосом-9 014232 В опубликованной патентной заявке США за номером 20050019859 и в опубликованной патентной заявке США за номером 20050084933 раскрываются способы получения белков по изобретению, конкретно, рекомбинантных гликопротеиновых продуктов, при использовании животных или культур клеток млекопитающих, и эти патентные заявки вводятся в данное описание в качестве ссылки. После фазы продуцирования белка в процессе культивирования клеток молекулы CTLA4Ig выделяют из клеточной культуральной среды методами, понятными специалистам в данной области техники. В частности, CTLA4Ig выделяют из культуральной среды в виде секретированного полипептида. Культуральную среду сначала центрифугируют для удаления клеточного осадка (дебриса) и макрочастиц. Затем нужный белок очищают от примеси ДНК, растворимых белков и полипептидов с последующими, без ограничения, методами очистки, общеизвестными в уровне техники: SDS-PAGE; осаждение сульфатом аммония; осаждение этанолом; фракционирование на иммуноаффинной или ионообменной колонке; обращнно-фазовая ВЭЖХ; хроматография на силикагеле или на анионообменной смоле,такой как QAE или DEAE; хроматофокусирование; гель-фильтрация с применением, например колонки Сефадекс G-75; и колонки с белок А-Сефарозой для удаления примесей, таких как IgG. Добавление ингибиторов протеаз, такого как фенилметилсульфонил фторид (PMSF) или коктейля из смеси ингибиторов протеаз также можно использовать для ингибирования протеолитического расщепления в процессе очистки. Специалист в данной области техники знает, что в методах очистки, пригодных для очистки представляющего интерес белка, например гликопротеина, могут потребоваться изменения в связи с изменением свойств белка, экспрессирующегося в культуре рекомбинантных клеток. Методы очистки и методы отбора по углеводным (карбогидратньм) группам гликопротеина также применяются в контексте настоящего изобретения. Например, такие методы включают ВЭЖХ или ионообменную хроматографию с применением катионо- или анионообменных смол, при этом собирают более основную или более кислую фракцию, в зависимости от того, какой углевод выбран. Применение таких методов также дат возможность одновременно удалять примеси. Метод очистки может далее включать дополнительные стадии, в ходе которых инактивируются и/или удаляются примеси и/или ретровирусы, которые теоретически могут присутствовать в клеточной культуральной среде линий клеток млекопитающих. Возможно значительное число стадий очистки от вируса, включая, но без ограничения, обработку хаотропами, такими как мочевина или гуанидин, дополнительные стадии ультрафильтрации/диафильтрации, обычное разделение, такое как ионообменная или эксклюзионная хроматография, крайние значения рН, нагревание, протеазы, органические растворители и любые их сочетания. Перед тем, как оставить CTLA4Ig на хранение или продолжить обработку, требуется концентрация и замена буфера. Для концентрации и замены буфера для элюции после предшествующей колонки для очистки на конечный буфер, желательный для лекарственного вещества, можно использовать системуPall Filtron TFF. В одном аспекте очищенный CTLA4Ig, после концентрации и стадии диафильтрации, можно наливать в бутыли Biotainer на 2 л, в биопроцессорный мешок на 50 л или любой другой подходящий сосуд. В таких сосудах CTLA4Ig может храниться около 60 дней при 2-8 С перед замораживанием. Более продолжительное хранение очищенного CTLA4Ig при 2-8 С может привести к увеличению содержанияHMW частиц. Следовательно, для длительного хранения CTLA4Ig можно перед хранением замораживать при температуре около -70 С и хранить при температуре около -40 С. Температура замерзания может варьироваться примерно от -50 С, примерно, до -90 С. Время замерзания может меняться и в большой степени зависит от объма сосуда, в котором содержится CTLA4Ig, и числа сосудов, помещнных в морозильную камеру. Например, в одном варианте изобретения CTLA4Ig находятся в 2-литровых бутылях Biotainer. При загрузке в морозильную камеру менее четырх 2-литровых бутылей Biotainer для замораживания требуется примерно от 14 по меньшей мере до 18 ч. При загрузке в морозильную камеру по меньшей мере четырх бутылей для замораживания требуется примерно от 18 по меньшей мере до 24 ч. Сосуды с замороженным CTLA4Ig хранят при температуре от примерно -35 С до примерно -55 С. Время хранения при температуре от примерно -35 до примерно -55 С может меняться и может храниться минимум 18 ч. Замороженное лекарственное вещество можно размораживать, контролируя состав лекарственного продукта. В рассматриваемой одновременно патентной заявке США регистрационный 60/752267, поданной 20 декабря 2005 г., в патентной заявке США 06/849543, поданной 5 октября 2006 г., и в патентной заявке РСТ No. в реестре патентного поверенного 10734 РСТ, озаглавленной "Cell Lines, Compositions and Methods for Producing a Composition", заявитель Kirk Leister, поданной 19 декабря 2006 г., раскрываются способы продуцирования белков по изобретению, специфически рекомбинантных гликопротеиновых продуктов, в животных или в культурах клеток млекопитающих, все они вводятся ссылкой в данное описание. Лиофилизированный препарат по изобретению Лиофилизированный препарат по изобретению содержит CTLA4Ig в весовом отношении белка к лиопротектору, по меньшей мере, 1: 2. Лиопротектором, предпочтительно, является сахар, более пред- 10014232 почтительно, дисахариды, наиболее предпочтительно, сахароза или мальтоза. Лиофилизированный препарат может также содержать один или более компонентов, выбранных из группы, состоящей из буферных агентов, поверхностно- активных веществ, наполнителей и консервантов. В ходе исследований по созданию препарата изучалось влияние различных эксципиентов на стабильность CTLA4Ig в растворе и в виде тврдого лиофилизата. Нестабильность лиофилизированного CTLA4Ig в отсутствие стабилизатора ясно показывает необходимость включения в препарат лиопротектора. Предварительные исследования показали, что лекарственный продукт стабилен в присутствии сахаров, таких как мальтоза и сахароза, и аминокислот, таких как аргинин и лизин. Полиолы, такие как маннит, и полисахариды, такие как декстран 40, плохо влияют на стабильность. Предпочтительными лиопротекторами являются мальтоза и сахароза. В Примере VI описывается исследование стабильности лиофилизированного лекарственного продукта Абатацепта, хранящегося в присутствии мальтозы при 50 С. Увеличение содержания высокомолекулярных (HMW) частиц проверяют, применяя эксклюзионную хроматографию (SE- ВЭЖХ), являющуюся показателем стабильности. Результаты демонстрируют, что стабильность тврдого лиофилизированного CTLA4Ig повышается в присутствии мальтозы. Весовое отношение белка к количеству сахарозы или мальтозы, применимому для стабилизации лиофилизированного лекарственного продукта, составляет, по меньшей мере, 1: 2, предпочтительно, весовое отношение белка к сахарозе или мальтозе составляет от 1: 2 до 1: 5, более предпочтительно, весовое отношение белка к сахарозе или мальтозе составляет около 1:2. При необходимости значение рН препарата перед лиофилизацией устанавливают, добавляя фармацевтически приемлемую кислоту и/или фармацевтически приемлемое основание. Предпочтительной фармацевтически приемлемой кислотой является соляная кислота. Предпочтительным основанием является гидроксид натрия. В процессе разработки препарата изучали стабильность лиофилизированного лекарственного продукта как функцию рН. В примере VI описано изучение стабильности лиофилизированного лекарственного продукта Абатацепта в зависимости от рН. Перед лиофилизацией значение рН раствора доводят до 6-8. Готовят образцы для определения стабильности и проводят мониторинг пузырьков (флаконов) с составленным продуктом, проверяя увеличение содержания высокомолекулярных частиц в различных временных точках с помощью характеризующей стабильность эксклюзионной хроматографии (SEВЭЖХ). При хранении в рекомендуемых условиях 2-8 С не происходит никаких значительных изменений скорости образования HMW частиц. Помимо этого данные по стабильности в растворе, полученные на предварительной стадии, показывают, что для максимальной стабильности требуется рН 7-8. Приемлемый интервал рН для лиофилизированного лекарственного продукта составляет 7-8, причм предпочтительным значением рН является 7,5. В другом аспекте можно добавлять соли или буферные компоненты в количестве, по меньшей мере,около 10 мМ, предпочтительно 10- 200 мМ. Соли и/или буферы являются фармацевтически приемлемыми и образуются из различных известных кислот (неорганических и органических) с "образующими основания" металлами или аминами. Помимо фосфатных буферов, можно использовать глициновый, карбонатный, цитратный буферы и т.п., в этом случае в качестве противоиона могут служить ионы натрия,калия или аммония."Наполнитель" обозначает соединение, которое увеличивает массу лиофилизированной смеси и вносит вклад в физическую структуру лиофилизированной лепшки (например, содействует получению практически однородной лиофилизированной лепшки, которая имеет структуру с открытыми порами). Примеры наполнителей включают маннит, глицин, полиэтиленгликоль и сорбит. Лиофилизированные препараты по настоящему изобретению могут содержать такие наполнители. Для снижения бактериального воздействия в препараты по данному описанию можно, необязательно, добавлять консерванты. Добавление консервантов может, например, способствовать получению препарата для многократного прима (многодозового препарата). Специалист в данной области техники выбирает количество лекарственного продукта, помещаемого в пузырк (флакон), в зависимости от нужной дозы и схемы применения для конкретного лечения. Например, содержание CTLA4Ig в пузырьке (флаконе) может составлять 50-300 мг/пузырк, предпочтительно 100- 250 мг/пузырк. Типичная композиция лиофилизированного лекарственного продукта Абатацепта представлена ниже в табл. 1. включает избыток 5% с учтом потерь в пузырьке, игле и шприце Эти компоненты присутствуют в растворе лекарственного продукта Абатацепта Типичная композиция лиофилизированного лекарственного продукта Белатацепта представлена ниже в табл. 2. Таблица 2. Композиция лиофилизированного лекарственного продукта Белатацепта (100 мг/пузырк) каждый пузырк (флакон) включает избыток 10% с учтом потерь реконституированного раствора в пузырьке, игле и шприце Лиофилизированный лекарственный продукт готовят с водным носителем. Водный носитель, представляющий интерес по данному описанию, является носителем, который фармацевтически приемлем(безопасен и нетоксичен при введении человеку) и применим для приготовления жидкого препарата после лиофилизации. Типичные разбавители включают стерильную воду для инъекций (SWFI), бактериостатическую воду для инъекций (BWFI), забуференный до определнного рН раствор (например, забуференный фосфатом физиологический раствор), стерильный физиологический раствор, раствор Рингера или раствор декстрозы. Предпочтительно, лиофилизированный лекарственный продукт по настоящему изобретению восстанавливают либо стерильной водой для инъекций, USP (SWFI), либо 0,9% раствором хлорида натрия для инъекций, USP. В процессе восстановления лиофилизированный порошок медленно растворяют,получая прозрачный бесцветный раствор. Обычно лиофилизированный сухой продукт по настоящему изобретению готовят (восстанавливают, реконституируют) до примерной концентрации 25 мг/мл, добавляя 10 мл либо стерильной воды для инъекций, USP (SWFI), либо 0,9% раствор хлорида натрия для инъекций, USP. Приготовленный раствор разводят далее до концентраций лекарственного продукта 1- 10 мг/мл 0,9% раствором хлорида натрия для инъекций, USP. Разведнный лекарственный продукт для инъекций является изотоническим и пригоден для введения в виде внутривенной инфузии. В ходе предварительных клинических разработок было найдено, что восстановленные (приготовленные) растворы лиофилизированного лекарственного продукта несовместимы с одноразовыми силиконизированными шприцами, которые обычно используются для приготовления и парентерального введения продуктов. А именно, в таких шприцах более чем через 10-15 мин после приготовления раствора лекарственного продукта появляются нитевидные желатинообразные частицы. Дальнейшие исследования показали, что эта несовместимость обусловлена взаимодействием лекарственного продукта с силиконовым маслом (диметилсилоксан), который используют в качестве смазки в этих шприцах. Образование этих частиц не влияет на эффективность раствора лекарственного продукта во время применения. Предпочтительно, для восстановления лекарственного продукта и переноса приготовленных растворов из пузырька (флакона) в пакеты для внутривенного вливания используют шприцы без силиконовой смазки. Или же, в препарат можно добавлять поверхностно- активное вещество для уменьшения или предупреждения взаимодействия приготовленного лекарственного продукта с силиконизированным шприцем,например, в достаточном для этого количестве. Рекомендуется хранить лиофилизированный препарат при 2-8 С в течение рекомендуемого срока хранения по меньшей мере 12 месяцев.- 12014232 Приготовление лиофилизированного препарата Процесс производства лиофилизированного лекарственного продукта включает дозирование приготовленного основного объма раствора для лиофилизации, асептическую фильтрацию, заполнение пузырьков (флаконов), замораживание пузырьков (флаконов) в камере для лиофилизации с последующей лиофилизацией, закупоривание и герметизацию. В примерах III и IV описывается производство лиофилизированных лекарственных продуктов Абатацепта и Белатацепта, соответственно. Приготовленный основной объм раствора обычно имеет постоянную концентрацию белка, так что нужный объм для заполнения пузырька (флакона) может оставаться постоянным. При добавлении лиопротектора проверяют, чтобы скорость перемешивания была 25050 об./мин, чтобы свести до минимума образование пены в приготовленном для дозирования растворе и для того, чтобы гарантировать полное растворение лиопротектора за 10-20 мин. Приготовленный объм раствора может храниться при 28 С или при комнатной температуре и комнатном освещении по меньшей мере в течение 32 ч до лиофилизации. Приготовленный основной объм раствора не стерилизуют при нагревании вследствие чувствительности CTLA4Ig к нагреванию. Перед заполнением пузырьков для лиофилизации приготовленный основной объм раствора можно стерилизовать, используя расположенные последовательно два фильтра для стерилизации 0,22 мкм Millipore Millipack. Цикл лиофилизации, выбранный для этого продукта, оптимизируют так, чтобы сублимация и испарение в процессе первичной и вторичной фаз сушки, соответственно, были эффективными, чтобы при этом не ухудшалось качество продукта. Чтобы способствовать быстрому растворению лиофилизированного порошка и предотвратить избыточное пенообразование в процессе составления лекарственного продукта, в конце цикла лиофилизации пузырьки с лиофилизированным раствором закупоривают под давлением в камере 500 100 мкм. Специалист в данной области техники знает о необходимости помещать в контейнер избыточное количество с тем, чтобы компенсировать остатки препарата ("задержку") в пузырьке, игле, шприце в процессе подготовки к инъекции. Например, каждый пузырк с лекарственным продуктом абатацептом,250 мг/мл, содержит 5% избыток лекарственного продукта с учтом реконституции и потерь при заборе препарата. Жидкий препарат для подкожного введения Специалист в данной области техники понимает, что в/в препарат не годится для пациента, которому нужно частое, постоянное лечение. Пациент должен часто посещать больницу, чтобы получать сво лекарство в виде в/в вливания, которое можно продолжаться не менее часа. Поэтому SC препарат, который такой пациент может вводить себе дома самостоятельно, является для него предпочтительным. Для подкожного введения желательна лекарственная форма с высоким содержанием белка. Терапия высокими дозами, более 1 мг/кг (100 мг на дозу), требует разработки препаратов с концентрацией, превышающей 100 мг/мл, вследствие малого объма (1,5 мл), который можно ввести SC способом. Для того, чтобы обеспечить оптимальную продолжительную устойчивость против образования высокомолекулярных частиц при высокой концентрации, при разработке препарата изучали влияние различных эксципиентов на стабильность растворов жидких SC препаратов по изобретению.SC препарат по изобретению содержит CTLA4Ig с концентрацией белка по меньшей мере 100 мг/мл в комбинации с сахаром с концентрацией, обеспечивающей стабилизирующий уровень предпочтительно с концентрацией белка по меньшей мере 125 мг/мл в комбинации с сахаром с концентрацией, обеспечивающей стабилизирующий уровень, в водном носителе. Предпочтительно, весовое соотношение белка к сахару составляет по меньшей мере 1: 1.1. Стабилизатор предпочтительно применяют в количестве, не превышающем количество, которое может повысить вязкость настолько, что она станет нежелательной или неподходящей для введения SC шприцем. Сахар, предпочтительно, представляет собой дисахариды,наиболее предпочтительно, сахарозу. SC препарат может также содержать один или более компонентов,выбранных из списка, состоящего из буферных агентов, поверхностно-активных веществ и консервантов. Профиль стабильности SC препарата оценивают в присутствии различных стабилизаторов, включая сахара, полисахариды, аминокислоты, поверхностно- активные вещества, полимеры, циклодекстраны,белки и т.д. Из всех проверенных эксципиентов сахара, такие как сахароза, манит и трегалоза, вызывают наивысший стабилизирующий эффект противодействия образованию высокомолекулярных частиц. В примерах V и VIII описываются исследования стабильности SC лекарственных продуктов Белацепта и Абатацепта, соответственно, хранящихся в присутствии сахарозы различное время. Увеличение высокомолекулярных частиц контролируют характеризующей стабильность эксклюзионной хроматографией (SE-ВЭЖХ). Результаты показывают, что стабильность CTLA4Ig в SC препарате повышается в присутствии сахарозы. Стабилизация с помощью сахарозы выше при более высоком весовом соотношении сахароза: белок. На основании этих исследований в качестве стабилизатора выбирают сахарозу в соотношении, которое обеспечивает оптимальную стабильность, не вызывая избыточной гипертонично- 13014232 сти SC раствора. Количество сахарозы, применимое для стабилизации SC лекарственного продукта, соответствует соотношению белка к сахарозе 1:1, предпочтительно весовое соотношение белка к сахарозе составляет от 1:1,3 до 1:5, более предпочтительно весовое соотношение белка к сахарозе составляет 1: 1,4. При необходимости, рН препарата корректируют, добавляя фармацевтически приемлемую кислоту и/или основание. Предпочтительной фармацевтически приемлемой кислотой является соляная кислота. Предпочтительным основанием является гидроксид натрия. При разработке препарата изучали стабильность SC лекарственного продукта в зависимости от рН. В примере V описывается исследование стабильности SC лекарственного продукта Белатацепта в зависимости от рН. рН SC препарата доводят до 7-8,2, ставят эксперимент по определению стабильности образцов, контролируя увеличение высокомолекулярных частиц в лекарственном продукте в различных временных точках характеризующей стабильность эксклюзионной хроматографией (SE-ВЭЖХ). В рекомендуемых условиях хранения при 2-8 С никаких заметных изменений скорости образования HMW частиц не наблюдалось в течение 3 месяцев. Помимо агрегации, обычным продуктом, который может образовываться в процессе ферментации,сбора/осветления и очистки клеток, хранения лекарственного вещества/лекарственного продукта и в процессе анализа образцов, является продукт деамидирования пептидов и белков. Деамидирование обозначает потерю белком NH3 с образованием промежуточного сукцинимида, который может подвергаться гидролизу. Масса промежуточного сукцинимида на 17 ед ниже массы исходного пептида. Последующий гидролиз вызывает увеличение массы на 18 ед. Выделение промежуточного сукцинимида затруднено вследствие нестабильности в присутствии воды. По этой причине деамидирование обычно обнаруживают в виде увеличения массы на 1 ед. Деамидирование аспарагина дат либо аспарагиновую, либо изоаспарагиновую кислоту. Параметры, влияющие на скорость деамидирования, включают рН, температуру,диэлектрическую постоянную растворителя, ионную силу, локальную конформацию полипептида и третичную структуру. Аминокислотные остатки, прилегающие к Asn в пептидной цепи, влияют на скорость деамидирования. Остатки Gly и Ser после Asn в белковых последовательностях способствуют более высокой чувствительности к деамидированию. Предварительные лабораторные исследования стабильности методом пептидного картирования наводят на мысль, что деамидирование превышает эталонные уровни через 24 месяца при использованииSC препарата абатацепта при рН 7,8. Данные, полученные через шесть месяцев как при 2-8 С, так и при 25 С, при влажности 60%, показывают, что скорость деамидирования ниже при рН 7,2 и выше при рН 8 по сравнению с SC образцом абатацепта при рН 7,8. В примерах IX и XII описаны лабораторные исследования влияния рН с целью изучения деамидирования в SC препаратах лекарственного продукта в интервале рН 6,3-7,2. Приемлемый интервал рН для SC лекарственного продукта составляет 6-8, предпочтительно 6-7,8,более предпочтительно 6-7,2. В другом аспекте можно добавлять соли или буферные компоненты в количестве по меньшей мере 10 мМ, предпочтительно 10-200 мМ. Соли и/или буферы являются фармацевтически приемлемыми и образованы из различных известных кислот (неорганических и органических) с "образующими основания" металлами или аминами. Помимо фосфатных буферов могут использоваться глициновый, карбонатный, цитратный буферы и т.п., в этом случае в качестве противоиона могут служить ионы натрия,калия или аммония. В примере VIII описано влияние концентрации буфера на SC лекарственный продукт Абатацепт. Стабильность лекарственного продукта абатацепта с концентрацией 100 мг/мл при рН 7,4 выше при концентрации фосфатного буфера с 10 мМ, чем при концентрации фосфатного буфера 5 мМ. Кроме того,более высокая буферная мкость 10 мМ фосфатного буфера обеспечивает лучший рН контроль препарата по сравнению с 5 мМ буфером. Водный носитель, представляющий интерес по данному описанию, является водным носителем,фармацевтически приемлемым (безопасным и нетоксическим для введения человеку) и применимым для приготовления жидкого препарата. Примеры носителей включают стерильную воду для инъекций(SWFI), бактериостатическую воду для инъекций (BWFI), забуференный до определнного рН раствор(например, забуференный фосфатом физиологический раствор), стерильный физиологический раствор,раствор Рингера или раствор декстрозы. Необязательно, в препараты по данному описанию можно добавлять консервант для того, чтобы снизить бактериальное действие. Добавление консерванта может, например, упростить приготовление препарата многократного действия (многодозового). Как указывается при обсуждении лиофилизированного лекарственного продукта, CTLA4Ig несовместим с силиконом, находящимся в стандартных шприцах, так как он реагирует с силиконом с образованием видимых макрочастиц, поэтому пациенты должны применять только безсиликоновые шприцы.SC препарат, необязательно, может содержать поверхностно- активное вещество для предупреждения образования видимых макрочастиц в присутствии силикона. В примерах V и VIII описывается действие поверхностно-активных веществ, таких как полисорбат- 14014232 80 и полоксамер 188, на стабильность лекарственного продукта белатацепта и абатацепта, соответственно, в растворе, и было найдено, что поверхностно-активные вещества не оказывают влияния на стабильность CTLA4Ig в SC препарате. Изучали поведение препарата при различных уровнях полоксамера 188 и нашли, что при концентрации от 4 до 8 мг/мл, предпочтительно 8 мг/мл, он адекватно предупреждает обусловленное силиконом образование макрочастиц в препарате. Типичный состав SC лекарственного продукта белатацепта 125 мг/мл (100 мг/пузырк) лекарственного продукта, приведн ниже в табл. 3. Таблица 3. Состав Белатацепта SC лекарственного продукта, 125 мг/мл (100 мг/пузырк) Рекомендуемые условия хранения SC препарата 2-8 С в течение рекомендуемого срока хранения по меньшей мере 12 месяцев. Плотность SC лекарственного продукта абатацепта и соответствующего плацебо определяют при комнатной температуре денситометром Mettler-Toledo. Измерения проводят в тройном повторе на образцах объмом 5 мл. Найдено, что плотность SC лекарственного продукта Абатацепта равна 1,1 г/см 3, а продукта плацебо 1,065 г/см 3. Обычно плотность SC CTLA4Ig препарата составляет около 1,0-1,2 г/см 3,предпочтительно около 1,0-1,15 г/см 3, более предпочтительно около 1,095-1,105 г/см 3. Вязкость SC препарата абатацепта определяют на реометре Брукфилда при комнатной температуре. Для измерений используют контрольный эталон 9,3 сП (cps). Найденное значение вязкости SC лекарственного продукта при концентрации абатацепта 125 мг/мл составляет 132 сП. Обычно вязкость SCCTLA4Ig препарата при концентрации абатацепта 125 мг/мл составляет около 9-20 сП, предпочтительно около 9-15 сП, более предпочтительно 12-15 сП.- 15014232 Осмоляльность (осмолярность) SC лекарственного продукта Абатацепта и препарата плацебо определяют по давлению паров. Данные показывают, что при концентрации 125 мг/мл осмоляльность (осмолярность) SC препарата Абатацепта составляет 77025 мОсм/кг H2O. Обычно осмоляльность (осмолярность) SC CTLA4Ig препарата при концентрации Абатацепта 125 мг/мл составляет около 250-800 мОсм/кг H2O, предпочтительно около 700-800 мОсм/кг H2O, более предпочтительно около 750-800 мОсм/кг H2O. Приготовление SC препарата Процесс производства SC препаратов обычно включает приготовление смеси с сахаром и поверхностно-активньм веществом с последующей асептической стерильной фильтрацией и дальнейшим заполнением пузырьков или шприцев, необязательно с предшествующей диафильтрацией (буферный обмен) и концентрацией лекарственного вещества на установке для ультрафильтрации. В примерах I и II описано производство SC лекарственных продуктов Белатацепта и Абатацепта,соответственно. Специалист в данной области техники знает, что необходимо в контейнер помещать избыток препарата, чтобы компенсировать потери в пузырьке, игле, шприце при подготовке и инъекции. Например, в каждый пузырк SC жидкого препарата помещают 40% избыток лекарственного продукта с учтом потерь при заборе и для гарантии, что 0,8 мл раствора, содержащего 100 мг лекарственного продукта белатацепта можно забрать из пузырька. Жидкий препаратIV (в/в) препараты могут быть предпочтительными в некоторых случаях, например, для введения пациенту, который в больнице после трансплантации все лекарства получает в/в. Специалист в данной области техники знает недостатки и возможные риски лиофилизированного препарата как для производителя, так и медицинского работника, соответственно. Опасности (риски) и недостатки для медицинского работника, обусловленные реконституцией, могут включать попадание примесей, пенообразование и потерю продукта, а также затрату медицинским работником времени на приготовление в/в препарата. Кроме того, затраты производителя на оборудование и время, затраченное работниками, можно уменьшить, исключив стадию лиофилизации из процесса производства. Все эти причины являются достаточным стимулом для создания жидкого препарата для в/в применения. Предпочтительным жидким препаратом для разработки является препарат, который имитировал бы лиофилизированный лекарственный продукт первого разведения до концентрации около 25 мг/мл. Затем непосредственно перед применением медицинский работник разводит далее продажный жидкий препарат до заданных концентраций лекарственного продукта между 1 и 10 мг/мл 0,9% раствором хлорида натрия для инъекций, USP. Разбавленный лекарственный продукт для инъекции является изотоническим и пригоден для введения внутривенной инфузией. Как обсуждается выше, продолжительная стабильность жидких препаратов - это выход, решение для белковых лекарственных продуктов. Для того, чтобы подтвердить продолжительную стабильность раствора с точки зрения образования высокомолекулярных частиц, проводили изучение жидкого препарата по изобретению, оценивая стабильность в растворе. Жидкий препарат по изобретению содержит CTLA4Ig с концентрацией белка по меньшей мере 20 мг/мл в комбинации с сахаром в стабилизирующей концентрации, предпочтительно по меньшей мере 25 мг/мл в комбинации с сахаром в стабилизирующей концентрации. Предпочтительно весовое соотношение белка и сахара составляет по меньшей мере 1:1. Сахар предпочтительно представляет собой дисахариды, наиболее предпочтительно сахарозу. Жидкий препарат может также содержать один или более компонентов, выбранных из списка, состоящего из буферных агентов, поверхностно-активных веществ и консервантов. Количество сахарозы, применимое для стабилизации жидкого лекарственного продукта, таково, что весовое отношение белка к сахарозе составляет по меньшей мере 1:1, предпочтительно весовое отношение белка к сахарозе составляет от 1:2 до 1:10, более предпочтительно весовое отношение белка к сахарозе составляет около 1:2. При необходимости, рН препарата корректируют, добавляя фармацевтически приемлемую кислоту и/или основание. Предпочтительной фармацевтически приемлемой кислотой является соляная кислота. Предпочтительным основанием является гидроксид натрия. При разработке препарата изучали стабильность жидкого лекарственного продукта при целевом значении рН 7,5. В примере VII описывается исследование стабильности жидкого лекарственного продукта Белатацепта при рН 7,5. Значение рН жидкого препарата доводят до 7-8,2, ставят эксперимент по определению стабильности образцов, контролируя увеличение высокомолекулярных частиц в лекарственном продукте в различных временных точках характеризующей стабильность эксклюзионной хроматографией (SE-ВЭЖХ). В рекомендуемых условиях хранения при 2-8 С никаких заметных изменений скорости образования HMW частиц не наблюдалось. Помимо продуктов агрегации, вариантами пептидных и белковых продуктов, которые могут образовываться в процессе ферментации, сбора/осветления и очистки клеток, хранения лекарственного вещества/лекарственного продукта и в процессе анализа образцов, являются продукты деамидирования пеп- 16014232 тидов и белков. Предварительные исследования стабильности в лабораторных масштабах методом пептидного картирования наводят на мысль, что деамидирование превышает эталонные уровни (превышают 5% Т 26 а или Т 26b (%Т 30) максимум) и что, по определению методом SDS-PAGE, фрагментация превышает эталонные уровни (падает ниже 96% минимальной основной полосы) через 24 месяца при использовании белатацепта (20 мг/мл при рН 7,5), хранящегося при 2-8 С. Данные, полученные для жидкого препарата (см. данные для SC препарата), показывают, что скорость деамидирования в препаратах по изобретению понижается при снижении рН препаратов. Приемлемый интервал рН для жидкого лекарственного продукта составляет 6-8, предпочтительно 6-7,8, более предпочтительно 6-7,2. В другом аспекте можно добавлять соли или буферные компоненты в количестве по меньшей мере 10 мМ, предпочтительно 10-200 мМ. Соли и/или буферы являются фармацевтически приемлемыми и образованы из различных известных кислот (неорганических и органических) с "образующими основания" металлами или аминами. Помимо фосфатных буферов могут использоваться глициновый, карбонатный, цитратный буферы и т.п., в этом случае в качестве противоиона могут служить ионы натрия,калия или аммония. Водный носитель, представляющий интерес по данному описанию, является водным носителем,фармацевтически приемлемым (безопасным и нетоксическим для введения человеку) и применимым для приготовления жидкого препарата. Примеры носителей включают стерильную воду для инъекций(SWFI), бактериостатическую воду для инъекций (BWFI), забуференный до определнного рН раствор(например, забуференный фосфатом физиологический раствор), стерильный физиологический раствор,раствор Рингера или раствор декстрозы. Необязательно, в препараты по данному описанию можно добавлять консервант для того, чтобы снизить бактериальное действие. Добавление консерванта может, например, упростить приготовление препарата многократного действия (многодозового). Как указывается при обсуждении лиофилизированного лекарственного продукта, CTLA4Ig несовместим с силиконом, находящимся в стандартных шприцах, так как он реагирует с силиконом с образованием видимых макрочастиц, поэтому медицинские работники должны применять только безсиликоновые шприцы. Жидкий препарат необязательно может содержать поверхностно-активное вещество для предупреждения образования видимых макрочастиц в присутствии силикона. Типичный состав SC лекарственного продукта белатацепта, 20 мг/мл (250 мг/пузырк) лекарственного продукта, приведн ниже в табл. 6. Таблица 6. Состав Белатацепта жидкого лекарственного продукта, 20 мг/мл (250 мг/пузырк) Рекомендуемые условия хранения жидкого препарата 2-8 С при рекомендуемом сроке хранения по меньшей мере 12 месяцев. Приготовление жидкого препарата Процесс производства жидкого лекарственного продукта обычно включает смешение с сахаром и,необязательно, с поверхностно-активным веществом с последующей асептической фильтрацией, заполнение пузырьков (флаконов), закупоривание и герметизацию. Приготовленный основной объм раствора обычно имеет постоянную (фиксированную) концентрацию белка, так что нужный объм для заполнения пузырька (флакона) может оставаться постоянным. При добавлении сахара к лекарственному веществу проверяют, чтобы скорость перемешивания была 25050 об./мин, чтобы свести до минимума вспенивание в приготовленном для дозирования растворе и для того, чтобы гарантировать полное растворение сахара за 10-20 мин. Приготовленный основной (исходный) объм раствора может храниться при 2-8 С или при комнатной температуре и комнатном освещении по меньшей мере в течение 24 ч до загрузки (заполнения) в мкость. Приготовленный основной объм раствора не стерилизуют при нагревании вследствие чувствительности CTLA4Ig к нагреванию. Перед заполнением пузырьков приготовленный основной объм раствора можно стерилизовать, используя расположенные последовательно два фильтра для стерилизации- 17014232 0,22 мкм Millipore Millipack. Специалист в данной области техники знает о необходимости помещать в контейнер избыточное количество с тем, чтобы компенсировать остатки препарата ("задержку") в пузырьке, игле, шприце в процессе подготовки и инъекции. Например, каждый пузырк с лекарственным продуктом Белатацептом,20 мг/мл (250 мг/флакон (пузырк, содержит 4% избыток лекарственного продукта с учтом реконституции и потерь при заборе препарата. Промышленные изделия В другом варианте изобретение включает промышленное изделие, которое содержит лекарственный продукт и, предпочтительно, включает инструкции по его применению. Промышленное изделие включает контейнер. Подходящие контейнеры включают, например, бутыли, пузырьки (флаконы),шприцы и пробирки. Контейнер может быть из различных материалов, таких как стекло, пластик или металлы. Контейнер содержит лиофилизированный или жидкий препарат. Этикетка на контейнере, или прилагающаяся к контейнеру, может содержать указания по реконституции и/или применению. Например,на этикетке может быть указано, что лекарственный продукт Белатацепт с концентрацией 25 мг/мл следует развести до указанных выше концентраций белка. Кроме того, на этикетке может указываться, чтоSC препарат применим или предполагается для подкожного введения. Контейнер, содержащий препарат,может представлять многодозовый (многоразовый, многократного действия) флакон (пузырк), который делает возможным многократное (повторное) введение (например, 2-6 раз), например, подкожного препарата. Или же, контейнер может представлять собой предварительно заполненный шприц, содержащий,например, подкожный препарат. Изделие может, кроме того, включать второй контейнер, содержащий, например, подходящий носитель для лиофилизированного препарата. Кроме того, изделие может включать другие материалы, желательные с промышленной точки зрения или для пользователя, включая другие буферы, разбавители, фильтры, иглы, шприцы и листовкувкладыш с инструкциями по применению. Безсиликоновые шприцы, предпочтительно, используются для лекарственных продуктов, не содержащих поверхностно-активные вещества, например для реконституции лиофилизированного лекарственного продукта и/или переноса растворов из флакона (пузырька) в мешок для внутривенного вливания,и могут быть упакованы вместе с флаконом (пузырьком) с лекарственным продуктом. Методы применения Помимо этого, данное изобретение включает методы лечения заболевания иммунной системы или индукции толерантности, заключающиеся во введении эффективного количества препаратов CTLA4Ig по изобретению. В конкретных вариантах изобретения заболевания иммунной системы опосредуются взаимодействиями CD28- и/или CTLA4Ig-позитивных клеток с CD80/CD86-позитивными клетками. В другом варианте изобретения Т клеточные взаимодействия ингибируются. Заболевания иммунной системы включают, но без ограничения, аутоиммунные заболевания, иммунопролиферативные заболевания и расстройства, обусловленные трансплатацией. Эти методы включают введение субъекту препаратовCTLA4Ig по изобретению для регуляции Т-клеточных взаимодействий с CD80/CD86-позитивными клетками. Примеры заболеваний, связанных с трансплантатом, включают гомологическую болезнь (трансплантат против хозяина, GVHD) (например, такую, как болезнь, которая может возникнуть в результате пересадки костного мозга, или при индукции толерантности), иммунные расстройства, связанные с отторжением трансплантата, хроническим отторжением, и тканевыми или клеточными алло- или ксенотрансплантатами, включая солидные органы, кожу, островки, мышцы, гепатоциты, нейроны. Примеры иммунопролиферативных заболеваний включают, но без ограничения, псориаз; Т-клеточную лимфому; Т-клеточный острый лимфобластный лейкоз; тестикулярную ангиоцентрическую Т-клеточную лимфому; доброкачественный лимфоцитарный ангиит; и аутоиммунные заболевания, такие как волчанка (например, красная волчанка, волчаночный нефрит), тиреоидит Хашимото, первичную микседему, болезнь Грейвза, злокачественную анемию, аутоиммунный атрофический гастрит, болезнь Аддисона, диабет (например, инсулинзависимый сахарный диабет, диабет типа I), синдром Гудпасчера, тяжлую псевдопаралитическую миастению, пузырчатку, болезнь Крона, симпатическую офтальмию, аутоиммунный увеит,рассеянный склероз, аутоиммунную гемолитическую анемию, идиопатическую тромбоцитопению, первичный билиарный цирроз, хронический активный гепатит, язвенный колит, синдром Шгрена, ревматические заболевания (например, ревматоидный артрит), полимиозит, склеродермию и смешанную соединительнотканную болезнь. Помимо этого, настоящее изобретение включает способ ингибирования отторжения субъектом трансплантата солидного органа и/или ткани, причм субъект является реципиентом пересаженной ткани. Обычно в случае тканевых трансплантатов отторжение трансплантата инициируется тем, что Тклетки распознают его как чужеродного, с последующей реакцией, которая разрушает трансплантат. Препараты CTLA4Ig по данному изобретению, ингибируя пролиферацию Т лимфоцитов и/или секрецию цитокинов, могут вызвать пониженную деструкцию ткани, и индукция атигенспецифической иммунологической толерантности Т-клеток может привести к продолжительной приживляемости трансплантата- 18014232 при отсутствии необходимости в общей иммуносупрессии. Кроме того, препараты CTLA4Ig по изобретению можно применять с другими фармацевтическими веществами, включая, но без ограничения, кортикостероиды, циклоспорин, рапамицин, микофенолята мофетил, азатиоприн, такролимус, базиликсимаб и/или другие биологические вещества. Настоящее изобретение включает также способы ингибирования болезни "трансплантат- противхозяина" у субъекта. Этот способ заключается во введении субъекту препаратов по изобретению, одного или совместно с другими дополнительными лигандами, реактивными в отношении IL-2, EL-4 или интерферона. Например SC препарат CTLA4Ig по изобретению можно вводить реципиенту трансплантата костного мозга для ингибирования аллореактивности донорных Т-клеток. Или же донорные Т-клетки в трансплантате костного мозга можно перед трансплантацией сделать толерантными к аллоантигенам реципиента ex vivo. Ингибирование Т-клеточного ответа препаратами CTLA4Ig по изобретению может также применяться для лечения аутоиммунных расстройств. Многие аутоиммунные расстройства возникают в результате неподходящей активации Т клеток, реактивных в отношении аутоантигенов, и это промотирует продуцирование цитокинов и аутоантител, участвующих в патологии заболевания. Введение препаратаCTLA4Ig субъекту, страдающему аутоиммунным расстройством или восприимчивому к аутоиммунному расстройству, может предупредить активацию аутореактивных Т клеток и может ослабить или прекратить симптомы заболевания. Этот способ может также включать введение субъекту препарата по изобретению, одного или совместно с другими дополнительными лигандами, реактивными в отношении IL-2,IL-4 или -интерферона. Наиболее эффективные способ введения и схема прима препаратов по данному изобретению зависят от тяжести и течения заболевания, состояния здоровья и реакции пациента на лечение и мнения лечащего врача. В соответствии с практикой применения изобретения эффективное количество для лечения субъекта может составлять около 0,1-10 мг/кг массы тела субъекта. Также эффективное количество может составлять около 1-10 мг/кг массы тела субъекта. Препараты CTLA4Ig по изобретению можно вводить субъекту в количестве и во времени (например, продолжительность и/или кратность введения), достаточном для того, чтобы блокировать связывание эндогенных В 7 (например, CD80 и/или CD86) с соответствующими лигандами в организме субъекта. Тем самым блокада связывания эндогенный В 7/лиганд ингибирует взаимодействие между В 7- позитивными клетками (например, CD80 и/или CD86-позитивными клетками) и CD28- и/или CTLA4Igпозитивными клетками. Доза CTLA4Ig зависит от многих факторов, включая, но без ограничения, тип подвергаемой воздействию ткани, тип пролечиваемого заболевания, тяжесть заболевания, состояние здоровья субъекта и реакцию субъекта на лечение данными агентами. Соответственно, дозы агентов могут варьироваться в зависимости от субъекта и способа введения. В опубликованной патентной заявке СШАUS 2003/0083246 и в опубликованной патентной заявке США US 2004/0022787 указываются дозы и схемы введения CTLA4Ig, имеющего аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO:2, для лечения ревматических заболеваний, таких как ревматоидный артрит. Обе патентные заявки вводятся в данное описание в качестве ссылки. Эффективное количество CTLA4Ig можно вводить субъекту ежедневно, еженедельно, ежемесячно и/или ежегодно, один или несколько раз в час/день/неделю/месяц/год, в зависимости от необходимости. Например, в одном варианте изобретения эффективное количество CTLA4Ig можно сначала вводить один раз в две недели в течение месяца, а затем один раз в месяц. Эффективное количество CTLA4Ig составляет примерно 0,1-100 мг/кг массы тела субъекта. В другом варианте изобретения эффективное количество составляет примерно 0,1-20 мг/кг массы тела субъекта. В конкретном варианте изобретения эффективное количество CTLA4Ig составляет примерно 2 мг/кг массы тела субъекта. В другом конкретном варианте изобретения эффективное количество CTLA4Ig составляет примерно 10 мг/кг массы тела субъекта. В другом конкретном варианте эффективное количество CTLA4Ig составляет 500 мг для субъекта, весящего менее 60 кг, 750 мг для субъекта, весящего между 60-100 кг и 1000 мг для субъектов, весящего более 100 кг. В патентной заявке США регистрационный номер 60/668774, поданной 6 апреля 2005 г., и в патентной заявке США регистрационный номер 11/399666, поданной 6 апреля 2006 г., раскрывается доза и схема введения LEA29YIg, имеющего аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 4 для лечения иммунных нарушений, ассоциированных с трансплантацией. Обычно дозы препарата CTLA4Ig по изобретению применяют с учтом веса тела, а схемы введения могут диктоваться целевым минимумом на кривых концентрации в сыворотке. Обычно целевой минимальной концентрации LEA29YIg по изобретению в сыворотке около 3-30 мкг/мл в первые 3-6 месяцев после трансплантации достаточно для поддержания функционирования аллотрансплантата, предпочтительно, около 5-20 мкг/мл. Обычно целевая минимальная концентрация LEA29YIg по изобретению в сыворотке во время поддерживающей фазы составляет около 0,2-3 мкг/мл, предпочтительно около 0,252,5 мкг/мл.LEA29YIg по изобретению можно вводить в количестве около 0,1-20,0 мг/кг веса пациента, обычно- 19014232 около 1,0-15,0 мг/кг. Например, L104EA29YIg можно вводить в количестве 10 мг/кг веса пациента на первой фазе в период высокого риска после трансплантации и снижать до 5 мг/кг веса пациента в качестве поддерживающей дозы. Введение CTLA4Ig по изобретению можно осуществлять в виде внутривенной инфузии в течение от 30 мин до одного часа или более. Или же, требуемую дозу можно доставлять в виде от одной до нескольких подкожных инъекций. Обычно 30-минутная внутривенная инфузия является способом введения, который применяется на ранней фазе лечения, когда пациент находится в больнице и/или во время плановых посещений медицинского работника для контроля. Подкожная инъекция является типичным способом введения во время поддерживающей фазы, она позволяет пациенту вернуться к его обычной схеме, уменьшая число визитов к медицинскому работники для внутривенных инфузий. В примере 10 описывается фармакокинетика лиофилизированного в/в препарата CTLA4Ig у здоровых пациентов и больных ревматоидным артритом (RA). Очевидно, что фармакокинетика Абатацепта уRA пациентов и здоровых людей сравнима. У RA пациентов после многократных внутривенных инфузий в фармакокинетике Абатацепта наблюдается пропорциональное увеличение Cmax и AUC в интервале доз от 2 до 10 мг/кг. Очевидно, что при дозе 10 мг/кг сывороточная концентрация достигает равновесного состояния на 60 день при средней (диапазон) минимальной концентрации 24 мкг/мл (примерно от 1 до 66 мкг/мл). Никакого системного накопления Абатацепта при многократном введении дозы 10 мг/кг один раз в месяц у RA пациентов не наблюдается. Изобретение можно глубже понять с помощью нижеприведнных примеров. Однако они приводятся не для того, чтобы ограничить объм изобретения. Все цитируемые материалы, упоминаемые в описании, явно тем самым вводятся в данное описание в качестве ссылки. Пример I. Лекарственный продукт Белатацепт SC, 125 мг/мл (100 мг/пузырк) приготовлен в виде стерильного непирогенного готового раствора для подкожного введения. Лекарственный продукт Белатацепт SC, 125 мг/мл (100 мг/пузырк) получают в масштабе 2,2 кг Общий объм партии 2.2 кг (2 л). Плотность раствора 1,10 г/мл (при 20-25 С) Белатацепт лекарственное вещество: концентрация белка 25 мг/мл,25 мМ фосфата натрия, 10 мМ хлорида натрия, рН 7,5, 5% HMW частиц Процесс получения SC лекарственного продукта Белатацепта, 125 мг/мл (100 мг/пузырк), включает буферный обмен в основном объме лекарственного вещества - замену буфера 25 мМ фосфата натрия,10 мМ хлорида натрия с рН 7,5 на буфер 10 мМ фосфата натрия рН 7,5, с последующей концентрацией белка с 25 до 150 мг/мл путм удаления буфера. Буферный обмен осуществляют пятикратной диафильтрацией основного объма лекарственного вещества против нового буфера 10 мМ фосфата натрия рН 7,5, с последующей концентрацией белка до 150 мг/мл путм удаления буфера. Держатель из нержавеющей стали (Millipore) система ультрафильтрации Pellicon снабжн манометрами из нержавеющей стали и мембранными клапанами на отверстии для подачи, для концентрата и для фильтрата. Фильтрационные кассеты, применяемые с системой ультрафильтрации Pellicon, оборудованы мембраной Biomax на основе полиэфирсульфона площадью 0,1 м с предельным срезом (предельной номинальной молекулярной массой) 30 кДа. Фильтрационные кассеты устанавливают в соответствии с рекомендациями производителя. Контейнер для подачи лекарственного вещества представляет собой стеклянный контейнер на 4 л с магнитной мешалкой. Контейнер для подачи с держателем фильтра (фильтрационной установкой) и линией концентрата соединяют с помощью высокоэффективных силиконовых шлангов MasterFlex. Подачу материала осуществляют с помощью перистальтического насоса, установленного на питательной линии. Затем в концентрированном белковом растворе растворяют сахарозу и полоксамер 188 и конечный вес партии корректируют, добавляя 10 мМ фосфатный буфер, рН 7,5. Основной объм раствора фильтруют через стерилизующий фильтр 0.22 микрона и заполняют стерилизованные и депирогенизированные пузырьки из кварцевого стекла типа I на 5 мл, закрывают резиновыми пробками 20 мм и герметизируют отламывающимися алюминиевыми крышками 20 мм. Композиция SC лекарственного Пример II. Лекарственный продукт Абатацепт SC, 125 мг/мл (125 мг/пузырк) готовят в виде стерильного непирогенного готового раствора для подкожного введения. Партию лекарственного продукта Абатацепта Как описано выше в примере I, процесс получения SC лекарственного продукта Абатацепта, 125 мг/мл (125 мг/пузырк), включает буферный обмен в основном объме лекарственного вещества - замену буфера 25 мМ фосфата натрия, 50 мМ хлорида натрия с рН 7,5 на буфер 10 мМ фосфата натрия рН 7,8, с последующей концентрацией белка с 50 до 150 мг/мл путм удаления буфера. Буферный обмен осуществляют пятикратной диафильтрацией основного объма лекарственного вещества против нового буфера 10 мМ фосфата натрия рН 7,5, с последующей концентрацией белка до 150 мг/мл путм удаления буфера. Затем в концентрированном белковом растворе растворяют сахарозу и полоксамер 188 и конечный вес партии корректируют, добавляя 10 мМ фосфатный буфер, рН 7,8. Основной объм раствора фильтруют через стерилизующий фильтр 0,22 мкм и заполняют стерилизованные и депирогенизированные пузырьки из кварцевого стекла типа I на 5 мл, закрывают резиновыми пробками 20 мм и герметизируют отламывающимися алюминиевыми крышками 20 мм. Композиция SC лекарственного продукта Абатацепт, 125 мг/мл (125 мг/пузырк) представлена ниже, в табл. 10. Таблица 10. Композиция SC лекарственного продукта Абатацепт, 125 мг/мл (125 мг/пузырк) Пример III. Лекарственный продукт Абатацепт, лиофилизированный, (250 мг/пузырк), является стерильным непирогенным лиофильным, пригодным для внутривенного (в/в) введения. Каждый одноразовый пузырк (флакон) содержит 250 мг Абатацепта, который смешивают со стерильной водой для инъекций, USP,и далее разводят 0,9% раствором хлорида натрия для инъекций, USP, в момент применения.b Плотность приготовленного общего раствора = около 1,04 г/мл Требуемое количество лекарственного вещества абатацепта помещают в очищенный и стерилизованный смеситель из нержавеющей стали, снабжнный мешалкой. Раствор лекарственного вещества перемешивают при 250 об./мин при температуре 5-25 С. В смеситель добавляют требуемое количество порошка моногидрата мальтозы. Раствор перемешивают минимум 10 мин при 15-25 С. рН раствора доводят до 7,3-7,7, при необходимости добавляя приготовленный заранее IN раствор гидроксида натрия или 1N раствор соляной кислоты. Конечный вес партии (конечный q.s.) получают,добавляя воду для инъекций, USP, и перемешивают минимум 8 мин. Проверяют рН полученного общего объма раствора. Полученный общий объм раствора предварительно фильтруют через фильтр 0,45 мкм. После фильтрации через фильтр 0,45 мкм отбирают пробы для проверки на микрофлору и бактериальный эндотоксин (BET). Перед заполнением флаконов (пузырьков) предварительно отфильтрованный общий объм раствора подвергают стерильной фильтрации через два последовательных фильтра 0,22 мкм. После стерильной фильтрации основной объм раствора разливают в пузырьки и неплотно закрывают пробками 20 нм- Daikio из серого бутилкаучука на полностью автоматизированной установке для наполнения/закрывания. Флаконы (пузырьки) на 15 мл Типа I из кварцевого стекла промывают и стерилизуют/депирогенизируют. Заполненные и неплотно закрытые пробками пузырьки (флаконы) с лекарственным продуктом лиофилизируют. Краткие сведения о цикле лиофилизации в процессе лиофилизации лекарственного продукта Абатацепта приводятся ниже, в табл. 12. Таблица 12. Цикл лиофилизации при получении лиофилизированного лекарственного продукта Абатацепта В конце цикла лиофилизации давление в камере повышают до 500 мкм с помощью стерильно отфильтрованного азота, а закрывание пробкой пузырьков осуществляют в вакууме. Закрытые пробкой пузырьки остаются внутри лиофилизатора по меньшей мере в течение 4 ч. Лиофилизированные и закрытые пробкой пузырьки герметизируют с помощью 20-мм алюминиевого белого отламывающегося уп- 22014232 лотнения (колпачка) в атмосфере воздуха, проходящего через фильтр HEPA, на машине для укупоривания колпачками. Герметизированные пузырьки промывают деионизированной водой с помощью внешнего моечного аппарата для пузырьков. Промытые пузырьки с лекарственным продуктом хранят при 28 С. Состав лиофилизированного лекарственного продукта Абатацепта (250 мг/пузырк) представлена ниже в табл. 13. Таблица 13. Состав лиофилизированного лекарственного продукта Абатацепта (250 мг/пузырк) Включает 5% избыток с учтом потерь в пузырьке, игле, шприце Эти компоненты присутствуют в растворе лекарственного вещества Абатацепта Пример IV. Белатацепт, лиофилизированный (100 мг/пузырк) лекарственный продукт является стерильным непирогенным лиофильным, пригодным для внутривенного (в/в) введения. Каждый пузырк (флакон) однократного пользования содержит 100 мг Белатацепта, который смешивают (составляют) с 4,2 мл стерильной воды для инъекций, USP, получая раствор с концентрацией 25 мг/мл. В момент применения его можно далее развести до концентрации не ниже 1 мг/мл 5% раствором декстрозы для инъекций, USP,или 0,9% раствором хлорида натрия для инъекций, USP. Размер получаемой партии лекарственного продукта может варьироваться от 20 до 120 л. Типичная производственная рецептура (состав) партии объмом 66 л (12000 пузырьков) представлена ниже, в табл. 14. Таблица 14. Производственная рецептура партии объмом 66 л (12000 пузырьков) Белатацепта лиофилизированный лекарственный продукт получают, как описано выше в примере III. Композиция (состав) лиофилизированного лекарственного продукта белатацепта, 100 мг/пузырк,представлена ниже в табл. 15. Таблица 15. Состав лиофилизированного лекарственного продукта Белатацепта (100 мг/пузырк) Каждый пузырк (флакон) содержат 10% избыток с учтом потерь восстановленного раствора в пузырьке (флаконе), игле, шприце. Пример V. Стабильность SC жидкого препарата лекарственного продукта Белатацепта изучают, испытывая стабильность при различных температурах и в различные временные периоды. Влияние сахарозы При разработке препарата проводят исследования по оценке влияния различных уровней сахарозы на стабильность в растворе лекарственного продукта Белатацепта. Стабильность образцов определяют в следующих условиях: -70 С, 8 С и 25 С/60% влажность и проверяют в различных временных точках. Оцениваемое отношение белка к сахарозе 1: 1, 1: 1.7 и 1:1.75. Образование высокомолекулярных (HMW) частиц используют для определения стабильности в растворе. Результаты показаны ниже в табл. 16. Таблица 16. Действие различных уровней сахарозы на лекарственный продукт Белатацепт с концентрацией 100 мг/мл Лекарственный продукт Белатацепт в 10 мМ натрий-фосфатного буфера, 100 мг/мл, рН 7,5 Результаты исследований показывают, что повышение отношения сахарозы к белку повышает стабильность белка. Отношение белка к сахарозе 1: 1,36 (вес:вес.) выбирают для создания SC раствора, так как оно обеспечивает оптимальную стабильность, при этом лекарственный продукт не обладает избыточной гипертоничностью. Влияние поверхностно-активных веществ Проверяют действие различных поверхностно- активных веществ в продажных (товарных) продуктах, таких как Полисорбат 80 и Полоксамер 188, на стабильность раствора лекарственного продукта. Действие Полоксамера 188 проверяют при уровнях 4, 6 и 8 мг/мл, а действие Полисорбата 80 оценивают при конечной концентрации препарата 1 и 2 мг/мл. Стабильность образцов проверяют и определяют в следующих условиях: -70 С, 8 С и 25 С/60% влажность и проверяют в различных временных точках. Результаты показаны ниже, в табл. 17. Таблица 17. Действие различных уровней и типов поверхностно-активных веществ на лекарственный продукт Белатацепт (100 мг/мл)- 24014232 Результаты действия поверхностно-активных веществ наводят на мысль, что поверхностно- активные вещества не оказывают значительного влияния на стабильность раствора лекарственного продукта белатацепта. Найдено, что из проверенных уровней Полоксамера 188 концентрация 8 мг/мл адекватно предупреждает образование в препарате связанных с силиконом макрочастиц. Влияние рН Проверяют стабильность лекарственного продукта Белатацепта SC (125 мг/мл, белок: сахароза 1: 1,36, Плуроник F68 8 мг/мл) в зависимости от рН. рН раствора доводят до 7-8,2, добавляя либо 1N раствор гидроксида натрия, либо 1N раствор соляной кислоты. Стабильность образцов проверяют при 28 С и при 25 С/60% RH и контролируют в различных временных точках. Аналитическая проверка включает определение рН и SE-ВЭЖХ с целью контроля за увеличением высокомолекулярных (HMW) частиц. Эти результаты суммированы ниже, в табл. 18. Таблица 18. Влияние рН на SC лекарственный продукт Белатацепт Никаких заметных изменений в скорости образования HMW частиц не наблюдается при рекомендуемой температуре хранения 2-8 С. Кроме того, из данных стабильности в растворе видно, что значение рН, при котором стабильность максимальна, составляет 7-8. На этом основании для этого препарата выбирают интервал рН 7- 8, причм целевым является значение рН 7,5. Осмоляльность Осмоляльность растворов лекарственного продукта белатацепта в различных буферах, при различных концентрациях белка и из различных стадий процесса приготовления определяют, измеряя давление паров. Эти результаты суммированы ниже, в табл. 19. Таблица 19. Влияние рН на SC лекарственный продукт Белатацепт Влияние перемешивания/встряхивания Определяют влияние перемешивания на стабильность раствора SC лекарственного продукта белатацепта с концентрацией 100 и 125 мг/мл. Аликвоты раствора, содержащие примерно 1 мл в закрытых пробирках на 5 мл, встряхивают при скорости 3 в ручном шейкере (на ручной качалке) при 2-8 С. Температуру шейкера поддерживают 2-8 С, поместив его в холодную комнату. Образцы отбирают через определнные временные интервалы и анализируют рН и внешний вид, также проверяют биоактивность тех же образцов после 30 дней перемешивания.- 25014232 В образцах с концентрацией 100 и 125 мг/мл, перемешиваемых при 2-8 С вплоть до 30 дней, не наблюдается никаких изменений уровня HMW частиц, SDS- PAGE профиля, в пептидном картировании,анализе связывания В 7, рН, внешнего вида или концентрации белка. Воздействие многократного замораживания/оттаивания Влияние многократного замораживания и оттаивания на стабильность SC препарата лекарственного продукта Белатацепта изучают на образцах с рН в интервале 7,0-8,2. Аликвоты SC препарата лекарственного продукта Белатацепта (125 мг/мл) объмом около 10 мкл с рН 7,0, 7,4, 7,8 и 8,2 помещают в контейнеры Nalgene PETG. Процедуру многократного замораживания и оттаивания осуществляют, выдерживая пробирки (пузырьки) при -70 С с последующим оттаиванием при комнатной температуре (25 С) в течение 10 мин. Этот цикл повторяют в течение 5 дней. Содержимое пробирок (пузырьков) анализируют: проверяют рН,% HMW частиц и внешний вид после каждого цикла замораживания/оттаивания. Никаких изменений рН, внешнего вида или % содержания высокомолекулярных частиц не наблюдается в течение пяти циклов замораживания/оттаивания. Рекомендуемые условия хранения Рекомендуемые условия хранения Белатацепта SC лекарственного продукта, 100 мг/пузырк (125 мг/мл): 2-8 С при рекомендуемом времени хранения 12 месяцев. Исследование "впрыскиваемости" (syringeability) шприца Исследование "впрыскиваемости" (syringeability) шприца проводят с SC лекарственным продуктом Белатацептом, (125 мг/мл) при 2-8 С. Проверяют иглы различного размера. Время наполнения шприца и эффективность доставки показана ниже, в табл. 20. Таблица 20. Изучение syringeability ("впрыскиваемости") SC лекарственного продукта Белатацепта, 125 мг/мл, при 2-8 На основании результатов исследования syringeability, приведнных в табл. 20, рекомендуется игла номер 211/1/2 дюйма для забора этого продукта из пузырька и игла номер 271/2 дюйма для последующего введения дозы. Пример VI. Стабильность лиофилизированного препарата лекарственного продукта Абатацепта изучают, определяя стабильность при различных температурах и в различные временные периоды. Влияние мальтозы При разработке препарата проводят исследования по оценке влияния различных уровней мальтозы на стабильность лекарственного продукта абатацепта. Стабильность образцов определяют при 50 С и проверяют в различных временных точках. Оцениваемое отношение белка к мальтозе 1:1,1:2 и 1:5. Образование высокомолекулярных (HMW) частиц используют для определения стабильности в тврдом состоянии. Результаты показаны ниже, в табл. 21. Таблица 21. Действие мальтозы на стабильность лиофилизированного лекарственного продукта Абатацепта в тврдом состоянии при 50 С Стабильность лекарственного продукта при весовом соотношении лекарства и мальтозы 1:5 оценивают на раннем этапе разработки при содержании 50 мг/пузырк. Партия лекарственного вещества, используемая в этом исследовании, отличается от партии, используемой для получения других результатов в этой таблице. Это является причиной различия начальных уровней высокомолекулярных частиц в этих образцах. Результаты показывают, что стабильность лекарственного продукта абатацепта в лиофилизированном тврдом виде повышается в присутствии мальтозы. Кроме того, определено, что минимальное количество мальтозы, применимое для стабилизации абатацепта выражается соотношением белка и мальтозы 1:2. Влияние рН Проверяют стабильность лиофилизированного лекарственного продукта Абатацепта SC (250 мг/пузырк, белок: мальтоза 1:2) в зависимости от рН. рН раствора доводят до 6-8, добавляя либо 1N раствор гидроксида натрия, либо 1N раствор соляной кислоты. Стабильность образцов проверяют при 28 С и контролируют в различных временных точках. Аналитическая проверка включает определение рН и SE-ВЭЖХ с целью контроля за увеличением высокомолекулярных (HMW) частиц. Эти результаты суммированы ниже в табл. 22. Таблица 18. Влияние рН на скорость образования высокомолекулярных (HMW) частиц Партия лекарственного вещества, используемая для образцов с рН 6,0 и 6,5, отличается от партии, используемой для образцов с рН 7,0, 7,5 и 8,0. Это является причиной различия начальных уровней высокомолекулярных частиц в этих образцах. Никаких заметных изменений в скорости образования HMW частиц не наблюдается при рекомендуемой температуре хранения 2-8 С. Кроме того, из данных стабильности в растворе, полученных на ранней стадии разработки, видно, что значение рН, при котором стабильность максимальна, составляет 7-8. Пример VII. Стабильность SC жидкого препарата лекарственного продукта Белатацепта (20 мг/мл) изучают, испытывая стабильность при различных температурах и в различные временные периоды. Влияние сахарозы При разработке препарата проводят исследования по оценке влияния различных уровней сахарозы на стабильность в растворе жидкого лекарственного продукта Белатацепта с концентрацией 20 мг/мл. Стабильность образцов определяют в следующих условиях: 8 С, 25 С/60% влажность и 30 С/60% влажность и проверяют в различных временных точках. Оцениваемое отношение белка к сахарозе 1:1, 1:2, 1:5 и 1:10. Образование высокомолекулярных (HMW) частиц используют для определения стабильности в растворе. Результаты этих исследований суммированы и показаны ниже, в табл. 23. Таблица 23. Действие различных уровней сахарозы на жидкий лекарственный продукт Белатацепт с концентрацией 20 мг/мл Образцы непригодны для анализа вследствие испарения- 27014232 Результаты исследований показывают, что повышение отношения сахарозы к белку повышает стабильность белка. Отношение белка к сахарозе 1:2 (вес:вес.) выбирают для создания жидкого раствора,так как оно обеспечивает оптимальную стабильность, при этом лекарственный продукт не обладает избыточной гипертоничностью. Исследование стабильности Готовят три партии жидкого Белатацепта и определяют стабильность в следующих условиях: 2-8 С и 25 С/60% RH и проверяют в различных временных точках. Весовое отношение белка к сахарозе составляет 1:2. Образование высокомолекулярных (HMW) частиц Белатацепта используют для определения стабильности в жидком препарате. Результаты этих исследований суммированы ниже в табл. 24. Таблица 24. Стабильность жидкого лекарственного продукта Белатацепта Данные показывают увеличение высокомолекулярных частиц в жидком препарате только на 0,1% по сравнению с увеличением на 0,2% в лекарственном веществе Белатацепте без сахарозы за 12 месяцев при 2-8 С. Эти результаты также показывают, что добавление сахарозы способствует снижению содержания высокомолекулярных частиц. Пример VIII. Стабильность SC жидкого препарата лекарственного продукта Абатацепта изучают, испытывая стабильность при различных температурах и в различные временные периоды. Влияние концентрации буфера Оценивают стабильность SC лекарственного продукта Абатацепта (100 мг/мл) в зависимости от концентрации буфера. Буферная система представляет собой фосфатный буфер 5 или 10 мМ. Стабильность образцов определяют при 2-8 С и 30 С/60% влажности и проверяют в различных временных точках. Аналитическая проверка включает определение рН и SE-ВЭЖХ с целью контроля за увеличением высокомолекулярных (HMW) частиц. Эти результаты суммированы ниже в табл. 25. Таблица 25. Влияние концентрации буфера на лекарственный продукт Абатацепт (100 мг/мл, рН 7,5) Стабильность абатацепта SC лекарственного продукта выше в 10 мМ фосфатном буфере по сравнению с 5 мМ фосфатным буфером при рН 7,5 при концентрации абатацепта 100 мг/мл. Кроме того, более высокая буферная мкость 10 мМ фосфатного буфера обеспечивает лучший рН контроль препарата по сравнению с 5 мМ буфером. На основании этих данных для разработки выбирают 10 мМ фосфатный буфер.- 28014232 Влияние сахаров При разработке препарата проводят исследования по оценке влияния различных сахаров на стабильность в растворе SC лекарственного продукта Абатацепта. Стабильность образцов определяют при 2- 8 С и 30 С/60% влажности и проверяют в различных временных точках. Проверяют сахара - сахарозу,трегалозу и маннит. Образование высокомолекулярных (HMW) частиц Абатацепта используют для определения стабильности в растворе. Результаты этих исследований показаны ниже, в табл. 26. Таблица 26. Действие различных сахаров на SC лекарственный продукт Абатацепт с концентрацией 100 мг/мл, рН 7,5 Лекарственный продукт Абатацепт в 10 мМ натрий-фосфатном буфере, 100 мг/мл, рН 7,5. Препарат с маннитом при рН 7,8 Результаты исследования показывают, что все три сахара, сахароза, трегалоза и маннит, обеспечивают более высокую стабилизацию Абатацепта по сравнению с контрольными образцами без сахара. Результаты исследований при повышенной температуре 30 С показывают, что маннит обеспечивает лучшую стабилизацию Абатацепта по сравнению с сахарозой и трегалозой. Сахароза немного лучше трегалозы. При охлаждении стабилизация в присутствии всех трх сахаров отличается незначительно. Сахарозу выбирают в качестве предпочтительного сахара, так как тоничность препарата с маннитом вдвое выше тоничности препарата с сахарозой. Выбор сахарозы для стабилизации позволяет прибавлять двойное количество сахарозы для достижения такой же тоничности, что и с маннитом, в том же соотношении, но со значительно более высокой стабилизацией против агрегации. Отношение белок: сахароза 1:1,36(вес:вес) выбирают для создания SC лекарственного продукта, так как оно обеспечивает оптимальную стабильность, но не дат лекарственный продукт с избыточной гипертоничностью. Влияние сахарозы При разработке препарата проводят исследования по оценке влияния различных уровней сахарозы на стабильность в растворе SC лекарственного продукта Абатацепта с концентрацией 20 мг/мл. Стабильность образцов определяют при 2-8 С и при 30 С/60% влажности и проверяют в различных временных точках. Оцениваемые отношения белка к сахарозе 1:1 и 1:2. Образование высокомолекулярных (HMW) частиц абатацепта используют для определения стабильности в растворе. Результаты этих исследований показаны ниже, в табл. 27. Таблица 27. Действие различных уровней сахарозы на SC лекарственный продукт Абатацепт с концентрацией 100 мг/мл, рН 7,5 Лекарственный продукт Абатацепт в 10 мМ натрий-фосфатном буфере, 100 мг/мл, рН 7,5 Результаты исследований показывают, что повышение отношения сахарозы к белку повышает стабильность белка. Отношение белка к сахарозе 1:2 (вес.:вес.) выбирают для создания RTU раствора, так как оно обеспечивает оптимальную стабильность, при этом лекарственный продукт не обладает избы- 29
МПК / Метки
МПК: A61K 38/17, C07K 14/705
Метки: препараты, белковые, стабильные
Код ссылки
<a href="https://eas.patents.su/30-14232-stabilnye-belkovye-preparaty.html" rel="bookmark" title="База патентов Евразийского Союза">Стабильные белковые препараты</a>
Стабильные при хранении препараты сульфонамидов
Номер патента: 13129
Опубликовано: 26.02.2010
Авторы: Краузе Ханс-Петер, Шнабель Герхард, Грос Ральф
МПК: A01N 47/36, A01N 47/28, A01N 25/30...
Метки: препараты, стабильные, сульфонамидов, хранении
Формула / Реферат:
1. Твердый, диспергируемый в воде препарат, который содержит:(а) одно или несколько биологически активных веществ из группы сульфонамидов и их солей, как минимум, с одним биологически активным веществом из группы фенилсульфониламинокарбонилтриазолинонов,(b) одно или несколько веществ-носителей, и(c) одно или несколько смачивающих средств из группы нафталинсульфоновых кислот и группы производных сульфоянтарной кислоты, а также солей соединений,...
Стабильные фармацевтические препараты в виде растворов для дозированных ингаляторов под давлением
Номер патента: 5179
Опубликовано: 30.12.2004
Авторы: Брамбилла Гаэтано, Микин Брайан, Феррарис Алессандра, Гандертон Дейвид, Льюис Дейвид
МПК: A61K 9/12, B65D 83/14
Метки: ингаляторов, стабильные, давлением, виде, препараты, дозированных, растворов, фармацевтические
Формула / Реферат:
1. Аэрозольная композиция, которая включает в себя в качестве активного ингредиента b2-агонист класса фенилалкиламинов, несущий функциональную группу, чувствительную к окислительной и/или гидролитической реакции, в растворе сжиженного HFA (гидрофторалканового) пропеллента, сорастворитель, выбранный из фармацевтически приемлемых спиртов, причем pH раствора отрегулирован между 2,5 и 5,0 посредством добавления небольших количеств неорганической...
Стабильные порошковые препараты, находящиеся в стекловидном состоянии
Номер патента: 2055
Опубликовано: 24.12.2001
Авторы: Биллингслей Шейла Р., Фостер Линда С., Куо Мей-Чанг
МПК: A61K 9/14, A61P 11/00
Метки: находящиеся, стекловидном, препараты, состоянии, стабильные, порошковые
Формула / Реферат:
1. Распыляемая в виде аэрозоли порошковая композиция, предназначенная для введения через легкие пациента, хранящаяся в течение минимального периода 3 недели при температуре хранения (Ts), которая, по меньшей мере, на 10шС ниже температуры стеклования (Tg) указанной композиции, и включающая в себя смесь фармацевтически приемлемой стекловидной матрицы и, по меньшей мере, одного фармакологически активного вещества внутри стекловидной матрицы,...
Жидкие стабилизированные белковые составы в фармацевтических контейнерах с покрытием
Номер патента: 8308
Опубликовано: 27.04.2007
Авторы: Самаритани Фабрицио, Дель Рио Алессандра
МПК: A61K 38/21, A61J 1/00
Метки: стабилизированные, покрытием, жидкие, фармацевтических, контейнерах, составы, белковые
Формула / Реферат:
1. Применение укупорочного средства, покрытого инертным фторированным материалом, для контейнера с жидкой фармацевтической композицией, готовой для инъекции и содержащей белок в качестве активного ингредиента. 2. Применение по п.1, в котором инертный фторированный материал является тефлоном. 3. Применение по одному из предшествующих пунктов, в котором белок является интерфероном. 4. Применение по одному из предшествующих пунктов, в котором...
Рекомбинантные мультимерные белковые комплексы, связанные с масляными тельцами, способы получения указанных комплексов и масляных телец и содержащие их продукты и композиции
Номер патента: 9181
Опубликовано: 28.12.2007
Авторы: Дель Вал Грегг, Далмиа Бипин Кумар, Хайфетц Петер Бернард, Заплачински Стив, Молони Морис, Бриггз Стивен П., Ван Роэйен Гейс, Декерз Харм
МПК: C12N 15/12, C12N 15/82, C12N 15/79...
Метки: композиции, способы, комплексы, указанных, содержащие, мультимерные, связанные, масляных, масляными, тельцами, получения, комплексов, рекомбинантные, продукты, белковые, телец
Формула / Реферат:
1. Способ получения масляного тельца, связанного с биологически активным рекомбинантным мультимерным белковым комплексом, включающий: (a) получение в клетке, содержащей масляные тельца, первого рекомбинантного полипептида и второго рекомбинантного полипептида, где указанный первый рекомбинантный полипептид способен связываться с указанным вторым рекомбинантным полипептидом с образованием указанного биологически активного рекомбинантного...
Предыдущий патент: Комбинации, включающие ингибитор cdk и антитело фактора роста, или антимитотик
Следующий патент: Замещенные карбоксамиды
Случайный патент: Аппарат для регулирования температуры жидкости, а именно вина