Способ идентификации растения подсолнечника или зародышевой плазмы подсолнечника, имеющего устойчивость к orobanche

СПОСОБ ИДЕНТИФИКАЦИИ РАСТЕНИЯ ПОДСОЛНЕЧНИКА ИЛИ ЗАРОДЫШЕВОЙ ПЛАЗМЫ ПОДСОЛНЕЧНИКА, ИМЕЮЩЕГО УСТОЙЧИВОСТЬ К OROBANCHE Предоставлены способы идентификации растения подсолнечника или зародышевой плазмы,которые проявляют устойчивость, улучшенную устойчивость или восприимчивость к Orobanchecumana. Получены растения подсолнечника или зародышевая плазма, которые устойчивы или обладают улучшенной устойчивостью к Orobanche cumana. Растения или зародышевая плазма,полученные посредством способов по настоящему изобретению, также являются предметом настоящего изобретения. Область техники Настоящее изобретение относится к композициям и способам применения молекулярногенетических маркеров для характеристики зародышевой плазмы подсолнечника на предмет устойчивости к Orobanche cumana. Уровень техники Культурный подсолнечник (Helianthus annuus L.) выращивается как все более и более важная масличная культура во многих умеренных, полузасушливых районах мира. Культурный подсолнечник является главным источником растительного масла во всем мире. Масляные сорта подсолнечника содержат от 40 до 48% и более масла в семени. Подсолнечное масло ценится в качестве пищевого масла из-за своего высокого уровня ненасыщенных жиров и светлого цвета. Подсолнечное масло используется для салатов, кулинарного жира или маргарина. Белковое содержание жмыха подсолнечника, приготовленного из семян после экстракции масла, может быть использовано в качестве корма для домашнего скота. Семена как масленичных, так и кондитерских сортов культурного подсолнечника могут быть использованы в качестве корма для птицы. Заразиха, растение-паразит (Orobanche Spp.), стала ограничивающим фактором для зерновых культур подсолнечника в инвазированных странах. На зараженном поле спад урожайности может достигать 95%. Частные разновидности Orobanche, поражающие подсолнечник, включают Orobanche aegyptiacaOrobanche cumana Wallr. (также известный как О. cernua Loefl) является серьезным сельскохозяйственным вредителем подсолнечника в Восточной Европе и распространился в южной Европе. За последние несколько лет наблюдается продвижение этого растения-паразита, его распространение в новых странах и развитие новых и более вирулентных штаммов. Orobanche представляет международный риск,и некоторые разновидности, как, например, О. minor, стали экзотами в Соединенных Штатах. Начиная с 1996 г., появление трех новых штаммов заразихи наблюдалось на полях в Турции, Испании и Болгарии. К 2000 г. число пораженных полей в этих областях резко увеличилось. Некоторые производители прекратили выращивание подсолнечника из-за существенного сокращения урожая зерна. Эти сорняки являются облигатными голопаразитами корневой системы. Разновидности Orobanche очень трудно устранить, поскольку за исключением цветка, они живут в почве; их семена имеют маленькие размеры и производятся в изобилии, легко распространяются и очень долгоживущие. Таким образом,гербициды, обычно используемые в настоящее время в случае подсолнечника, предоставляют неполный контроль. Средства контроля над Orobanche включают средства биологической борьбы, определение генов,ответственных за устойчивость к Orobanche у подсолнечника, и выведение стойких линий подсолнечника. Было сообщено, что Fusarium oxysporum f. Sp. orthoceras могут быть потенциальным средством биологического контроля Orobanche cumana (Thomas-Heiko, et al. (September 1998) Biological control. 13 (l):41-48). Однако способы применения и стандартные дозы в полевых условиях до сих пор не были определены. Ген Or3 обеспечивает устойчивость при заражении Orobanche, но, как известно, он эффективен только против расы С. По меньшей мере было сообщено о шести генетических вариантах Orobanche (Perez-Vich, et al., (2004) Theor. Appl. Gen. 109:92-102; Antonova, T.S., et al., (1996) Weed Research 36 (2): 113-121). Идентификация и использование дополнительных источников устойчивости к Orobanche благоприятны при осуществлении генетических изменений и сокращении потерь продуктивности. Краткое описание сущности изобретения Настоящее изобретение относится к композициям и способам применения генетических маркеров для характеристики зародышевой плазмы подсолнечника в отношении системы 2 устойчивости к Orobanche cumana. Растения и линии, идентифицированные как обладающие высоконаследуемыми признаками устойчивости к Orobanche, могут быть полезны для получения коммерческих культурных сортов подсолнечника, имеющих ценные агрономические и/или семенные качества. Краткое описание чертежей: На фиг. 1 представлена частичная карта маркеров группы сцепления 4 подсолнечника, включая положение предполагаемого гена системе 2 устойчивости к заразихе (BRSII или BRII). На фиг. 2 представлены дополнительные данные карты в отношении гена BRSII, включая SNP маркер признака устойчивости. На фиг. 3 представлено BestFit выравнивание устойчивого и восприимчивого аллелей маркеровBRSII (SEQ ID NO: 2 и 1 соответственно). Полиморфизмы отмечены звездочками. На фиг. 4 представлена таблица, отображающая родословную и фенотипические данные потомства популяции, использованной при составлении генетической карты. Краткое описание последовательностейSEQ ID NO: 1 представляет аллель маркерного гена системы 2 восприимчивости к Orobanche.SEQ ID NO: 2 представляет аллель маркерного гена системы 2 устойчивости к Orobanche.SEQ ID NO: 3 и 4 представляют зонды, используемые для идентификации BRSII-восприимчивых иBRSII-устойчивых аллелей маркерного гена в положениях 105-106 из SEQ ID NO: 1 и 2.SEQ ID NO: 5 и 6 представляют прямой и обратный праймер соответственно, для амплификации аллелей маркерного гена в положениях 105-106 из SEQ ID NO: 1 и 2.SEQ ID NO: 7 и 8 представляют зонды, используемые для идентификации BRSII-восприимчивых иBRSII-устойчивых аллелей маркерного гена в положении 142 из SEQ ID NO: 1 и 2.SEQ ID NO: 9 и 10 представляют прямой и обратный праймер соответственно, для амплификации аллелей маркерного гена в положении 142 из SEQ ID NO: 1 и 2. Подробное описание изобретения Хотя определенные последовательности ДНК, которые кодируют белки, обычно высоко консервативны между представителями вида, некодирующие области имеют тенденцию накапливать полиморфизмы, и поэтому могут быть различными у представителей одного и того же вида. Такие области предоставляют основание для многочисленных молекулярно-генетических маркеров. Обычно любой дифференцированно наследуемый полиморфизм нуклеиновой кислоты, который подвергается сегрегации у потомства, является потенциальным молекулярным маркером. Геномная изменчивость может иметь любое происхождение, включая вставки, делеции, дупликации, повторяющиеся элементы, точечные мутации, рекомбинационные события, и присутствие и последовательности мобильных элементов. Многочисленные способы для обнаружения молекулярных маркеров также являются общепринятыми. Маркеры, соответствующие генетическим полиморфизмам между членами одной популяции, могут быть обнаружены путем многочисленных методов, известных в данной области техники, таких как полиморфизм длины фрагментов рестрикции, маркеры-изозимы, аллель-специфичная гибридизация (АСГ),амплифицированные вариабельные последовательности генома растения, самоподдерживающаяся репликация последовательностей, простые повторы (SSR), однонуклеотидный полиморфизм (SNP), или полиморфизм длины амплифицированных фрагментов (ПДАФ). Маркерами по настоящему изобретению являются SNP. Молекулярно-генетические маркеры могут облегчить составление генетической карты и селекцию важных сельскохозяйственных свойств. Молекулярный маркер, который демонстрирует неравновесное сцепление с желательным фенотипическим признаком, может быть полезным инструментом для маркеропосредованной селекции (MAS), предоставляя средство для быстрого выявления желательных особей или линий. Интрогрессия предпочтительных генов в культурный сорт растения также облегчается посредством MAS. Компоненты исполнения MAS могут включать: (i) создание генетической карты молекулярных маркеров с высоким разрешением, (ii) выявление статистических ассоциаций между маркером и фенотипической изменчивостью, (iii) определение ряда желательных маркерных аллелей, и (iv) экстраполяцию этой информации к текущему набору разводимой зародышевой плазмы для осуществления возможности проводить маркер-опосредованную селекцию. Как правило, идентификация маркеров для проведения MAS включает описание фенотипического(их) признака(ов), представляющего(их) интерес, генотипирование сегрегирующей популяции потомства по полиморфным маркерам и составление генетической карты желаемого признака. Подробности составления генетической карты описаны в другом разделе настоящей заявки. Полиморфные локусы вблизи картированного признака выбирают в качестве потенциальных маркеров (как правило, маркерный локус, самый близкий к представляющему интерес локусу, является предпочтительным маркером). Затем для определения последовательности полиморфного маркерного аллеля, демонстрирующего статистическое предпочтение в косегрегации с желательным фенотипом (таким образом, "маркерный аллель"), проводят анализ сцепления. Далее возможно использовать этот маркер для быстрого, точного скрининга линий растения на предмет маркерного аллеля без необходимости выращивать растения через их жизненный цикл и ожидать фенотипических оценок. Кроме того, данный метод помогает проводить генетическую селекцию на основе конкретного аллеля, даже когда молекулярная природа QTL фактической толерантности неизвестна. Образцы ткани могут быть взяты, например, от первого листа растения и могут быть проскринированы на предмет соответствующего молекулярного маркера, и в течение дней определится, какое потомство будет использовано далее. Применение сцепленных маркеров также удаляет вклад факторов внешней среды, которые могут влиять на проявление фенотипа, и, в отличие от полевых оценок, анализ на основе маркеров может быть проведен в любое время года. Для получения улучшенных сортов растений селекционеры занимаются поиском комбинаций локусов с генами, определяющими высокую урожайность и другие желательные свойства. Скринируя большие количества образцов посредством немолекулярных методов (например, оценка признака у растений подсолнечника) могут быть дорогими, требующими много времени и ненадежными. Применение полиморфных маркеров, описанных в настоящей заявке, предоставляет эффективный способ селекции устойчивых сортов в программах селекции. Если популяция расщепляется по многим локусам, затрагивающим один или несколько признаков, например несколько локусов, определяющих устойчивость, или множественные локусы, где каждый задействован в толерантности или устойчивости к различным заболеваниям, эффективность MAS по сравнению с фенотипическим скринингом становится еще значитель-2 023910 нее, поскольку все локусы вместе могут быть определены в лаборатории из одной пробы ДНК. Частным применением MAS в растениеводстве является помощь в эффективном восстановлении рекуррентного родительского генотипа при обратном скрещивании. При маркер-опосредованном обратном скрещивании на основе определенных маркеров (и соответственно, QTL) из донорного источника,например к элитному генетическому фону, происходит селекция потомства от обратного скрещивания на предмет признаков донора и затем используется повторное обратное скрещивание с элитным сортом,чтобы восстановить как можно больше генома элитного фона. Таким образом, маркеры и способы по настоящему изобретению могут быть использованы для направления маркер-опосредованной селекции или скрещивания линий подсолнечника с желательным полным набором аллельных форм хромосомных сегментов, связанных с превосходными агрономическими качествами. Некоторые варианты осуществления по настоящему изобретению охватывают нуклеиновые кислоты, соответствующие маркерам, включая, но не ограничивая зондами, праймерами для амплификации и продуктами амплификации, все из которых могут быть использованы при генотипировании растений, так же, как применение указанных нуклеиновых кислот для "прогулки по геному" с целью определения дополнительных последовательностей или контигов, смежных с маркером(ами), для определения дополнительных или альтернативных полиморфизмов последовательности для применения в маркер-опосредованной селекции. Более широко, такие маркеры могут быть использованы для обогащения генетической карты подсолнечника. Настоящее изобретение также распространяется на способ скрещивания родительских растений для получения потомства растений подсолнечника и на данные растения-потомство, по существу. Способы скрещивания и выращивания растений подсолнечника не выходят за пределы знаний средних специалистов в данной области техники. Полученное потомство может быть проанализировано на предмет аллелей, связанных с устойчивостью, и желаемое потомство может быть отобрано. Такие растения-потомство или семена могут быть проданы для выращивания подсолнечника, использованы в пищу, обработаны для получения желаемых компонентов или далее использованы в последующих раундах селекции. По меньшей мере одно из исходных растений является растением по настоящему изобретению, в котором оно содержит по меньшей мере одну аллельную форму маркеров по настоящему изобретению, таким образом, что потомство способно к наследованию аллеля. Генетическое разнообразие важно для отдаленной генетической выгоды в любой программе селекции. С ограниченным разнообразием генетическая выгода достигнет в конечном счете плато, когда все благоприятные аллели будут перенесены в элитную популяцию. Одна из целей состоит в том, чтобы включить разнообразие в элитный фонд, не теряя генетическое приобретение, которое уже было сделано,и с минимальными возможными вложениями.MAS предоставляет указание на то, какие геномные области и какие благоприятные аллели от исходных предков подверглись селекции и были закреплены в течение долгого времени, облегчая усилия,направленные на введение благоприятной разновидности из экзотических источников зародышевой плазмы (родители, которые не связаны с элитным генофондом) в надежде на обнаружение благоприятных аллелей, которые в настоящее время не присутствуют в элитном генофонде. Например, маркеры по настоящему изобретению могут быть использованы для MAS в скрещиваниях, затрагивающих элитные х экзотические линии подсолнечника, посредством введения расщепляющегося потомства в MAS для сохранения аллелей высокой урожайности, наряду с аллелями маркера устойчивости по настоящему изобретению. Кроме того, при "позиционном картировании" используется близость маркера толерантности для физического определения изолированного фрагмента хромосомы, содержащего QTL толерантности. Изолированный фрагмент хромосомы может быть получен путем таких известных методов, как расщепление хромосомной ДНК одним или более ферментами рестрикции, или посредством амплификации участка хромосомы полимеразной цепной реакцией (ПЦР), или любой подходящей альтернативной реакцией амплификации. Расщепленный или амплифицированный фрагмент, как правило, лигируют в вектор, подходящий для репликации, и, например, экспрессии, вставленного фрагмента. Маркеры, которые прилегают к открытой рамке считывания (ORF), связанной с фенотипическим признаком, могут гибридизоваться с клоном ДНК (например, клоном из библиотеки геномной ДНК), распознавая таким образом клон, в котором заключена ORF (или фрагмент ORF). Если маркер более отдален, то фрагмент, содержащий открытую рамку считывания, идентифицируют посредством последовательных раундов скрининга и изоляции клонов, которые вместе содержат неразрывную последовательность ДНК, способ, который называют "прогулка по хромосоме", результатом которой становится "контиг" или "карта перекрывающихся сегментов ДНК". Протоколы, достаточные для того, чтобы направлять среднего специалиста в данной области техники через изоляцию клонов, ассоциированных со сцепленными маркерами, представлены, например, в Berger, Sambrook и Ausubel, см. ниже. Определенные карты сцепления генома подсолнечника доступны; см., например, Tang, et al., "PCRmultiplexes for a genome-wide framework of simple sequence repeat marker loci in cultivated sunflower,"Sunflower using TRAP and SSR Markers," (2006) Theor. Appl. Gen. 113 (1):122-127. Маркер может быть связан с одним или более локусами, представляющими интерес, например, единственным геном, локусом полигенного признака (QTL), или другим маркером. В основе обнаружения большинства генетических маркеров лежит одно или несколько свойств нуклеиновых кислот. Например, в некоторых методиках обнаружения генетических маркеров используется гибридизация нуклеиновой кислоты-зонда с нуклеиновыми кислотами, соответствующими генетическому маркеру. Способы гибридизации включают, но не ограничены, растворимую фазу, твердую фазу, смешанную фазу, или методы гибридизации in situ. Маркеры полиморфизмов длины фрагментов рестрикции (RFLP) определяют посредством гибридизации зонда с расщепленной эндонуклеазой рестрикции геномной ДНК. Зонд, как правило, является субфрагментом (или синтетический олигонуклеотид,соответствующий субфрагменту нуклеиновой кислоты, которую требуется определить). Эндонуклеазу рестрикции выбирают так, чтобы предоставить фрагменты рестрикции по меньшей мере двух альтернативных (или полиморфных) длин у различных особей, и зачастую будет варьировать от линии к линии. Определение, какая(ие) эндонуклеаза(ы) рестрикции производит(ят) информативные фрагменты для каждой комбинации особей, является простой процедурой, широко известной в данной области техники. После разделения по размеру в соответствующей матрице (например, агарозе) и переноса на мембрану(например, нитроцеллюлоза, нейлон), меченный зонд гибридизуют в условиях, которые обеспечивают равновесное связыванию зонда с мишенью, после чего избыток зонда удаляют посредством промывания. Олигонуклеотидные зонды к маркерным локусам могут быть клонированы и/или синтезированы. Детектируемые метки, подходящие для использования с олигонуклеотидными зондами, включают любую композицию, детектируемую посредством спектроскопических, радиоизотопных, фотохимических,биохимических, иммунохимических, электрических, оптических или химических средств. Подходящие метки включают биотин для окрашивания конъюгированным с меткой стрептавидином, магнитные шарики, флуоресцентные метки, радиоактивные метки, ферменты, и колориметрические метки. Другие метки включают лиганды, которые связываются антителами, помеченными флуорофорами, хемилюминесцентными средствами и ферментами. Меченные маркеры быстро получают как, например, посредством помеченных праймеров для ПЦР к маркерным локусам. Гибридизованный зонд затем детектируют в большинстве случаев посредством авторадиографии или другого подобного метода обнаружения (например, флюорографии или жидкостного сцинтилляционного счетчика). Примеры конкретных протоколов гибридизации широко доступны в данной области техники, см., например, Berger and Kimmel (1987) Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology vol. 152, Academic Press, Inc., San Diego ("Berger"); Sambrook, et al., (2001) Molecular Cloning-A"Амплифицированные вариабельные последовательности" относятся к амплифицированным последовательностям генома растения, которые обладают высокой изменчивостью остатков нуклеиновой кислоты между членами одних и тех же видов. Все организмы обладают вариабельными последовательностями генома, и каждый организм (за исключением клона) обладает различным набором вариабельных последовательностей. После определения, присутствие определенной вариабельной последовательности может быть использовано для предсказания фенотипических признаков. Предпочтительно ДНК из растения служит матрицей для амплификации праймерами, которые примыкают к вариабельной последовательности ДНК. Вариабельную последовательность амплифицируют и затем секвенируют. Методы амплификации in vitro широко известны в данной области техники. Примеры методов, достаточных для ознакомления специалиста с данными in vitro методами, включая полимеразную цепную реакцию (ПЦР), лигазную цепную реакцию (LCR), амплификацию Q-репликазой и другие методы, в которых используются РНК-полимеразы (например, NASBA), могут быть найдены в Berger, Sambrook иVan Brunt (1990) Biotechnology 8:291-294; Wu and Wallace, (1989) Gene 4:560; Barringer, et al., (1990) Gene 89:117; и Sooknanan and Malek (1995) Biotechnology 13:563-564. Улучшенные способы клонирования invitro амплифицированных нуклеиновых кислот описаны в Wallace et al., патент США 5426039. Улучшенные способы амплификации больших фрагментов нуклеиновых кислот посредством ПЦР обобщены в Cheng, et al., (1994) Nature 369:684, и в ссылках там же, где получали ПЦР-ампликоны до 40 КБ. Любой специалист в данной области техники в полной мере понимает, что по существу любая РНК может быть преобразована в двухцепочечную ДНК, подходящую для расщепления рестриктазами, ПЦР амплификации и секвенирования, используя обратную транскриптазу и полимеразу. См., Ausubel, Sambrook и Berger, все выше. Олигонуклеотиды для использования в качестве праймеров, например в реакциях амплификации и для использования в качестве зондов из последовательности нуклеиновой кислоты, как правило, синтезируются химически согласно твердофазному фосфорамидитному триэфирному методу, описанному уBeaucage and Caruthers (1981) Tetrahedron Lett. 22:1859, или могут быть просто заказаны коммерчески. В качестве альтернативы для идентификации генетических маркеров может быть использована самоподдерживающаяся репликация последовательности. Самоподдерживающаяся репликация последовательности относится к методу амплификации нуклеиновой кислоты, используя последовательности нуклеиновой кислоты-мишени, которые экспоненциально реплицируются in vitro в по существу изотермических условиях посредством использования трех ферментативных активностей, вовлеченных в репликацию ретровирусов: (1) обратная транскриптаза, (2) Rnase H, и (3) ДНК-зависимая РНК-полимераза(Guatelli, et al., (1990) Proc Natl Acad Sci USA 87:1874). Посредством подражания ретровирусной стратегии репликации РНК посредством промежуточных кДНК, в данной реакции накапливается копии кДНК и РНК исходной мишени. Картирование маркерных локусов. Для идентификации и анализа молекулярных маркеров было разработано несколько экспериментальных парадигм. Как правило, такие парадигмы включают скрещивание одного или нескольких родительских пар, которые могут быть, например, единственной парой, полученной от двух инбредных штаммов, или несколько родственных или неродственных родителей от различных инбредных штаммов или линий, которые проявляют различные фенотипные родственные характеристики интересующего признака. Родителей и популяцию потомства генотипируют по маркерным локусам и фенотипически оценивают по интересующему признаку. В контексте настоящего изобретения родительские растения и растения потомства генотипируют по маркеру BRSII или гомологам, или альтернативным маркерам, связанным с маркером BRSII, и оценивают на предмет устойчивости к Orobanche. Маркеры, связанные с устойчивостью, идентифицируют на основе значимых статистических корреляций между генотипом(ами) маркера и фенотипами оцененных растений потомства. Многочисленные методы определения,связаны ли генетически маркеры с геном, связанным с устойчивостью к Orobanche, известны специалистам в данной области техники и включают, например, картирование (Lander and Botstein (1989) Genetics 121:185), регрессионное картирование (Haley and Knott (1992) Heredity 69:315) и MQM картирование(Jansen (1994) Genetics 138:871). См. также патенты США 6399855 и 6368806. Двумя типами маркеров, часто используемых в маркер-опосредованной селекции, являются простые повторяющиеся последовательности (SSR, также известные как микросателлиты) и однонуклеотидные полиморфизмы (SNP). Термин SSR относится вообще к любому типу молекулярной гетерогенности,которая приводит к изменчивости длины, и наиболее часто, является коротким (до нескольких сотен пар азотистых оснований) сегментом ДНК, который состоит из последовательности многократных тандемных повторов двух или трех пар азотистых оснований. Эти повторяющиеся последовательности составляют высоко полиморфные участки ДНК переменной длины из-за низкой точности репликации, например, вызванной "проскальзыванием" полимеразы. Считается, что SSR расположены в геноме случайным образом и, как правило, окружены консервативными областями. Динуклеотидные повторы были найдены у высших растений (Condit and Hubbell (1991) Genome 34:66).SSR геномная изменчивость является наследуемой, мультиаллельной, кодоминантной и воспроизводимо обнаруживаемой, делая SSR хорошо подходящими для использования в качестве молекулярногенетических маркеров. Быстрое увеличение все более и более сложных методов обнаружения, основанных на амплификации (например, ПЦР), предоставляет множество чувствительных методов детекции гетерогенности. Праймеры создаются таким образом, чтобы гибридизоваться с консервативными областями, которые примыкают к SSR домену, приводя к амплификации вариабельной SSR области. Различные ампликоны, полученные с одной SSR области, обладают характерными и воспроизводимыми размерами. Ампликоны SSR различного размера, получаемые с двух гомологичных хромосом особи, или от различных особей в популяции растений, как правило, называют "маркерными аллелями". При условии,что существуют по меньшей мере два аллеля SSR, которые производят продукты ПЦР по меньшей мере двух различных размеров, SSR можно использовать в качестве маркера. Маркеры SSR могут быть получены на основе геномной ДНК или EST (маркерные экспрессируемые последовательности). Маркеры, которые основаны на однонуклеотидных полиморфизмах (SNP), также известны в данной области техники. SNP образуется, когда единственный нуклеотид (А, Т, С или G) в геномной последовательности изменен или происходит вставка/делеция. SNP может приводить, а может и нет, к функциональному изменению гена. Для обнаружения SNP были разработаны различные методы, включая метод аллельспецифичной гибридизации (АСГ; см., например, Coryell, et al., (1999) "Allele specific hybridizationmarkers for soybean," Theor. Appl. Genet. 98:690-696). Усовершенствования SNP анализа и приспособления для использования в системах с высокой пропускной способностью известны специалистам в данной области техники; см., например, Shirasawa, et al., (2006) Theor. Appl. Genet. 113(1):147-155; Giancola, etal., (2006) Theor. Appl. Genet. 112(6): 1115-1124. SSR маркер может служить первым шагом в развитии маркера SNP; см., Brooks, et al., (2006) Crop Sci. 46(4):1467-1470. SSR и SNP маркеры могут быть использованы в комбинации; см., Gilson, et al., (2006) Transgenic Res. 15(6):785-786. Об SNP анализе промоторных последовательностей сообщали (Schwarz, et al., (2003) J. Agr. Food Chem. 51(15):4263-4267). Дополнительные типы молекулярных маркеров также широко используются, включая полиморфизм длины фрагментов рестрикции (RFLP), полиморфизм длины амплифицированных фрагментов(AFLP), произвольно амплифицированная полиморфная ДНК (RAPD), и изоферментные маркеры. Широкий диапазон протоколов для детекции такой изменчивости известен специалистам в данной области техники, и эти протоколы часто являются специфичными для типа полиморфизма, который они предназначены детектировать, включая, например, ПЦР амплификацию, одноцепочечные конформационные полиморфизмы (SSCP) и самоподдерживающуюся репликацию последовательности (3SR; см., Chan andFox (1999) "NASBA and other transcription-based amplification methods for research and diagnostic microbiology," Reviews in Medical Microbiology 10:185-196). Независимо от молекулярной природы, например, является ли маркер SSR, SNP, RFLP, или другим типом, маркеры являются, как правило, штамм-специфичными; т.е. конкретный маркер является определенным для интересующих родительских линий. Для каждого маркерного локуса аллели устойчивости и восприимчивости идентифицированы для каждой пары родительских линий. Следуя корреляции определенных аллелей с устойчивостью или восприимчивостью в родительских линиях, маркер может быть использован для определения генотипов потомства, которые соответствуют желаемому фенотипу. Сцепленность молекулярного маркера с представляющим интерес локусом измеряется как частота рекомбинации, что определяет расстояние (в сантиморганах, сМ) между ориентирами на генетической карте. Физическое расстояние между локусами измеряют в парах оснований, например числе тысяч пар оснований (т.п.о.) или миллионов пар оснований (м.п.о.), на которые два локуса отстоят друг от друга на хромосоме. Как правило, чем ближе два локуса (например, маркер SNP и QTL) находятся на генетической карте, тем ближе они лежат друг к другу на физической карте. В то время как относительное генетическое расстояние, как правило, пропорционально физическому расстоянию между локусами, неточность корреляция между сМ и физическим расстоянием может быть результатом изменчивости в частотах рекомбинации для различных хромосомных участков. Некоторые хромосомные участки являются"горячими точками" рекомбинации, в то время как другие области не показывают рекомбинации, или демонстрируют только редкие рекомбинационные события. Как правило, чем ближе маркер к представляющему интерес локусу, измерено ли это в терминах рекомбинации или физического расстояния, тем лучше он подходит для указания на желаемый признак селекции. Целью селекционера растений является обогащение популяции растений особями с желательными свойствами, приводя в конечном счете к улучшенной сельскохозяйственной производительности. Известно, что определенные хромосомные локусы (или интервалы), которые могут быть картированы в геноме организма, могут коррелировать с определенными количественными фенотипами. Такие локусы называют локусами полигенных признаков, или QTL. Селекционер растений может успешно использовать молекулярные маркеры для определения желательной особи посредством идентификации маркерного аллеля, который проявляет статистически значимую вероятность косегрегации с желательным фенотипом, проявляясь в виде неравновесного сцепления. Посредством идентификации молекулярного маркера или группы молекулярных маркеров, которые косегрегируют с полигенным признаком, селекционер идентифицирует QTL. Для идентификации и анализа QTL было разработано несколько экспериментальных парадигм (см., например, Jansen (1996) Trends Plant Sci 1:89). Большинство опубликованных сообщений по картированию QTL у сельскохозяйственных культур было основано на дискретном скрещивании (Lynch and Walsh (1997) Genetics and Analysis of Quantitative Traits, Sinauer Associates, Sunderland). Посредством идентификации и селекции маркерного аллеля (или желательных аллелей нескольких маркеров), сцепленного с желательным фенотипом, селекционер растений в состоянии быстро провести селекцию в пользу желательного фенотипа. Такой способ называют маркер-опосредованной селекцией,или MAS. Чем больше молекулярных маркеров нанесено на генетическую карту, тем потенциально более полезной становится карта для проведения MAS. Многочисленные статистические методы для определения генетической сцепленности маркеров с представляющим интерес локусом известны специалистам в данной области техники и включают, например, стандартные линейные модели, такие как ANOVA или регрессионное картирование (Haley andKnott (1992) Heredity 69:315), методы максимального правдоподобия, такие как алгоритмы максимизации ожидания (например, Lander and Botstein (1989) "Mapping Mendelian factors underlying quantitative traitsvia interval mapping," Genetics 136:1447-1455). Иллюстративные статистические методы включают метод анализа маркера по одной точке, картирование интервала (Lander and Botstein (1989) Genetics 121:185),комплексное картирование интервала, анализ штрафной регрессии, сложный племенной анализ, анализ МСМС, анализ MQM (Jansen (1994) Genetics 138:871), анализ HAPLO-IM+, анализ HAPLO-MQM, анализHAPLO-MQM+, байесовский МСМС, гребневая регрессия, анализ методом определения по родословной и регрессия Haseman-Elston, любой из которых является подходящим в контексте настоящего изобретения. Дополнительные подробности относительно альтернативных статистических методов, применимых к сложным скрещивающимся популяциям, которые могут быть использованы для идентификации и локализации QTL, описаны в: патенте США 6399855 Beavis, et al., "QTL Mapping in Plant Breeding Populations" и WO2001049104, Jansen, et al., "MQM Mapping Using Haplotyped Putative QTL-Alleles: A SimpleApproach for Mapping QTLs in Plant Breeding Populations." Эти подходы требуют большого объема вычислений и обычно выполняются с помощью системы с управлением от ЭВМ и специализированного программного обеспечения. Подходящие статистические пакеты доступны во множестве общественных и коммерческих источников, и известны специалистам в данной области техники. В данной области техники назрела потребность в улучшении зародышевой плазмы подсолнечника,которая была бы стойкой к Orobanche cumana. В данной области техники существует потребность в идентификации молекулярных маркеров, которые сцеплены с локусами устойчивости к Orobanche cumana для облегчения MAS. Такие маркеры могут быть использованы для селекции индивидуальных особей растений и популяции растений, которые обладают благоприятными маркерными аллелями, которые могут быть далее применены в селекции устойчивого фенотипа. В качестве альтернативы, маркеры могут быть использованы для негативной селекции растения или популяции растений, которые восприимчивы к Orobanche cumana. Настоящее изобретение представляет композиции и способы, которые удовлетворяют данным потребностям и представляют другие преимущества. Представлены способы идентификации растения подсолнечника или зародышевой плазмы, которые обладают устойчивостью, улучшенной устойчивостью или восприимчивостью к Orobanche cumana. Также представлены способы создания растений подсолнечника или зародышевой плазмы, которые являются стойкими или обладают улучшенной устойчивостью к Orobanche cumana, например, где стойкие растения получены благодаря интрогрессии желательных маркерных аллелей устойчивости (например, маркер-опосредованная селекция), и/или посредством методов трансгеноза. Растения или зародышевая плазма, полученные посредством способов по настоящему изобретению, также являются объектом по настоящему изобретению. Системы идентификации растения и зародышевой плазмы с предсказанной устойчивостью, улучшенной устойчивостью или восприимчивостью к Orobanche cumana, также являются отличительным признаком настоящего изобретения, так же как и наборы, которые облегчают способы по настоящему изобретению. В определенных вариантах осуществления настоящее изобретение предоставляет способы для идентификации первого растения подсолнечника, которое обладает устойчивостью, улучшенной устойчивостью, или восприимчивостью к Orobanche cumana. В этих способах аллель по меньшей мере одного маркерного локуса, который связан с устойчивостью, улучшенной устойчивостью, или восприимчивым фенотипом, детектируют у первого растения подсолнечника. Маркерным локусом может быть BRSII. Как правило, близко сцепленный локус проявляет частоту генетической рекомбинации в отношении маркерного локуса менее чем приблизительно 10%. В желательных вариантах осуществления сцепленный локус проявляет частоту генетической рекомбинации 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1, 0,75, 0,5 или 0,25%,или менее. При желании, определяют растения, которые обладают по меньшей мере одним благоприятным аллелем, который положительно коррелирует с устойчивостью или улучшенной устойчивостью. Необязательно, у растения определяют, или проводят итрогрессию, два, три или более благоприятных аллеля(ей). Для анализа устойчивости или восприимчивости подсолнечника к Orobanche cumana может быть использован любой подходящий метод. Например, устойчивость может быть рассчитана на части поля,про которое известно, что на нем распространены семена Orobanche, или уровень устойчивости может быть рассчитан, используя контролируемые тепличные или оранжерейные условия. Способы скрининга подробно описаны в WO 2003/073837. Любой из множества молекулярных методов может быть использован для обнаружения маркерного аллеля. Например, аллельная форма полиморфного простого повтора (SSR) может быть обнаружена посредством методики, основанной на амплификации, как например, ПЦР. В качестве альтернативы, маркерный аллель, несущий однонуклеотидный полиморфизм (SNP), может быть обнаружен посредством шага амплификации, за которым следует метод аллель-специфичной гибридизации (ASH). В этих и других методах детекции, основанных на амплификации, маркерный локус или его часть амплифицируют(например, посредством ПЦР, LCR или транскрипции, используя в качестве матрицы нуклеиновую кислоту, выделенную от представляющего интерес растения), и полученный ампликон маркера детектируют. В одном из примеров, затравку для амплификации или пару праймеров для амплификации (например, пара праймеров представлена в SEQ ID NO: 5 и 6) смешивают с геномной нуклеиновой кислотой,изолированной от первого растения подсолнечника, при этом праймер или пара праймеров являются комплементарными или частично комплементарными по меньшей мере части маркерного локуса, и способны к инициации полимеризации ДНК посредством ДНК-полимеразы, используя в качестве матрицы геномную нуклеиновую кислоту подсолнечника. Праймер или пара праймеров (например, пара праймеров, которой амплифицируют маркерный локус BRSII) достраивается в реакции полимеризации ДНК в присутствие ДНК-полимеразы и матричной геномной нуклеиновой кислоты с получением по меньшей мере одного ампликона. В любом случае, данные, представляющие детектированный(ые) аллель(и), могут быть перенесены (например, с помощью электроники или через инфракрасную, беспроводную или оптическую передачу) на компьютер или на читаемый компьютером носитель для анализа или хранения. Специалистам ясно, что способность детектировать благоприятный маркерный локус, который коррелирует с устойчивостью к Orobanche, представляет способ для селекции растения с благоприятным признаком устойчивости. Таким образом, любое растение, которое идентифицировано как носитель желательного маркерного локуса, может быть положительно селектировано, в то время как растения, не имеющие этот локус, или имеющие локус, который отрицательно коррелирует с устойчивостью, могут быть селектированы негативно. Таким образом, в одном из способов, после идентификации благоприятного маркерного локуса,способы включают селекцию первого растения подсолнечника или селекцию потомства первого растения. Кроме того, выбранное первое растение подсолнечника может быть скрещено со вторым растением подсолнечника (например, элитный или экзотический подсолнечник, в зависимости от признаков, которые желательны в потомстве). Точно так же, если аллель коррелирует с устойчивостью к Orobanche, способ может содержать интрогрессию аллеля во второе растение подсолнечника. По желанию, второе растение подсолнечника обладает меньшей устойчивостью к Orobanche, чем первое растение подсолнечника, в то время как растение подсолнечника после интрогрессии обладает повышенной толерантностью кOrobanche по сравнению со вторым растением. В некоторых вариантах осуществления элитное растение подсолнечника используется как второе растение для интрогрессии. Растение подсолнечника после интрогрессии или зародышевая плазма, полученные посредством любого из приведенных в настоящем описании способов, также являются отличительными признаками по настоящему изобретению. Трансгенные подходы также могут быть использованы для получения растений подсолнечника или зародышевой плазмы, устойчивых к Orobanche. Например, способы получения растения подсолнечника с повышенной устойчивостью к Orobanche, могут включать введение экзогенной нуклеиновой кислоты в целевое растение подсолнечника, при этом экзогенная нуклеиновая кислота получена из геномной нуклеотидной последовательности, которая близко сцеплена с благоприятным маркерным локусом, который ассоциирован с повышенной устойчивостью к Orobanche. Маркерным локусом может быть BRSII, и/или генетический локус, сцепленный с ним. Для получения экзогенной нуклеиновой кислоты может быть использован любой из множества способов. В одном способе нуклеотидная последовательность выделена путем позиционного клонирования, и идентифицирована как сцепленная с благоприятным аллелем. Точный состав экзогенной нуклеиновой кислоты может варьировать; в одном варианте осуществления экзогенная нуклеиновая кислота соответствует открытой рамке считывания (ORF), кодирующей полипептид, который при экспрессии в растении подсолнечника, приводит к появлению растения подсолнечника с улучшенной устойчивостью к Orobanche. Системы для идентификации растения подсолнечника, которое ожидаемо обладает устойчивостью,улучшенной устойчивость или восприимчивостью к Orobanche, также являются отличительным признаком настоящего изобретения. Как правило, система может включать (а) набор маркерных зондов или праймеров, подходящих для детекции по меньшей мере одного благоприятного аллеля маркерного локуса, связанного с устойчивостью к Orobanche, при этом маркерным локусом может быть BRSII или генетический локус, сцепленный с ним; (b) детектор, который подходит для обнаружения одного или более выходного(ых) сигнала(ов) от набора маркерных зондов, или праймеров, или ампликона таковых, идентифицируя таким образом присутствие или отсутствие аллеля; и (с) системные инструкции, которые определяют корреляцию присутствия или отсутствия благоприятного аллеля с ожидаемой устойчивостью или восприимчивостью. В некоторых вариантах осуществления набор маркерных зондов или праймеров содержит нуклеотидные последовательности, представленные в SEQ ID NO: 3-6. Точная конфигурация детектора будет зависеть от типа метки, используемой для обнаружения маркерного аллеля. Типичные варианты осуществления включают детекторы света, детекторы радиоактивности, и т.п. Обнаружение эмиссии света (или комплексной эмиссии света) или другого меченного зонда указывает на присутствие или отсутствие маркерного аллеля. Подобным образом, точная форма инструкций может измениться в зависимости от компонентов системы, например, они могут присутствовать или в системном программном обеспечении в одной или нескольких интегрированных группах систем,или могут присутствовать в одном или более компьютерах или носителях, читаемых на компьютере,функционально соединенных с датчиком. В одном типичном варианте осуществления системные инст-8 023910 рукции включают по меньшей мере одну справочную таблицу, которая включает корреляцию между присутствием или отсутствием благоприятного аллеля и ожидаемой устойчивостью или улучшенной устойчивостью. Система может состоять из отдельных элементов или может быть объединена в одно целое для удобства детекции маркерных аллелей и для определения корреляции между маркером и признаком. Данная система может также включать пробу, как, например, геномную ДНК, амплифицированную геномную ДНК, кДНК, амплифицированную кДНК, РНК, или амплифицированную РНК от подсолнечника или от выбранной ткани растения подсолнечника. Если не указано иначе, все технические и научные термины, использованные в настоящем описании, имеют такие же значения,которые общеизвестны специалистам в данной области техники, к которой принадлежит настоящее изобретение. Если не указано иначе, методы, используемые или рассмотренные здесь, являются стандартными методиками, известными квалифицированному специалисту в данной области техники. Материалы, способы и примеры являются лишь иллюстративными и не ограничивают объем настоящего изобретения. В контексте настоящего описания будут использованы многие термины. Чтобы предоставить ясное и согласованное понимание описания и формулы изобретения, включая область, в которой представлены эти термины, даны нижеследующие определения."Аллель" относится к одному из двух или нескольких нуклеотидных последовательностей, которые могут встречаться в определенном хромосомном локусе. У гетерозиготной диплоидной особи есть две различные формы последовательности, или аллеля, в соответствующих локусах на паре хромосом. У гомозиготной диплоидной особи есть две копии одного и того же аллеля в соответствующих локусах гомологичных хромосом."Благоприятный аллель" может быть аллелем в определенном локусе, который наделяет, или способствует, агрономически желательным фенотипом. При других случаях, "благоприятный аллель" может таким, который позволяет идентифицировать растения с невыгодными агрономическими признаками,как, например, предрасположенность к заболеванию. Аллель "положительно" коррелирует с признаком, если присутствие аллеля является индикатором того, что растение, содержащее данный аллель, обладает желательным признаком или формой признака. Аллель "отрицательно" коррелирует с признаком, если присутствие аллеля является индикатором того,что растение, содержащее данный аллель, не обладает желательным признаком или формой признака."Аллельная частота" относится к частоте, с которой аллель находится в локусе у особи, у линии или у популяции линий. Например, для аллели "А", диплоидные особи с генотипами "АА", "Аа" или "аа" обладают аллельные частотой 1,0, 0,5, или 0,0 соответственно. Термин "сцепленный с" или "сцепленный" в контексте настоящего изобретения относится, например, к нуклеиновой кислоте и фенотипическому признаку, которые находятся в неравновесном сцеплении, т.е. нуклеиновая кислота и признак определяются вместе у растений потомства чаще, чем если нуклеиновая кислота и фенотип наследуются отдельно.cumana" взаимозаменяемо используются в рамках настоящего описания для ссылки на описанный паразитирующий сорняк и его расы. Термин "сантиморган" означает единицу измерения частоты рекомбинации. Один сантиморган представляет 1%-ый шанс, что маркер в одном генетическом локусе, в рамках одного поколения, будет отделен от маркера во втором локусе в результате кроссинговера."Цитоплазматически стерильный" или "ЦМС": линия подсолнечника, которая не производит жизнеспособной пыльцы, называется цитоплазматически стерильной. Цитоплазматическая мужская стерильность передается по материнской линии, т.е., мужское стерильное растение используют в качестве женского родителя при оплодотворении пыльцой от другого подсолнечника. ЦМС линии получают посредством скрещивания воспроизводящейся линии с растением подсолнечника с цитоплазматической мужской стерильностью, и затем проводят возвратное скрещивание с воспроизводящейся линией до получения линии с мужской стерильностью, которая является гомологичной воспроизводящейся линии по всем остальным признакам. ЦМС линии также упоминаются как женские линии."Генетическая карта" является описанием генетического сцепления между локусами на одной или нескольких хромосомах (или групп сцепления) в пределах данного вида, как правило, изображенной в схематической или табличной форме. "Генетическое картирование" является способом определения сцепления локусов с помощью генетических маркеров, популяций, разнородных по маркерам, и стандартных генетических принципов частоты рекомбинации."Местоположение на генетической карте" является контрольной точкой на генетической карте, относительно окружающих генетических маркеров в пределах одной группы сцепления, где может быть найден указанный маркер. Напротив, физическая карта генома относится к абсолютным расстояниям(например, измеренным в парах азотистых оснований или изолированных и перекрывающихся смежных генетических фрагментах, или контигах). Физическая карта генома не принимает во внимание генетиче-9 023910 ское поведение (например, частоты рекомбинации) различных сегментов хромосомы. Термин "генетически сцепленный" относится к генетическим локусам, которые находятся в неравновесном сцеплении и согласно статистике наследуются не независимо. Генетически сцепленные локусы наследуются сцеплено в от 51 до 99% случаев или любом целочисленном значении в данном интервале,предпочтительно по меньшей мере 60%, 70%, 80%, 90%, 95% или 99%. Термин "однородность" указывает на то, что члены группы обладают одинаковым генотипом по одному или нескольким конкретным локусам. Термин "гетерогенность" указывает на то, что особи в пределах группы отличается по генотипам по одному или более конкретным локусам. Термин "гомологичный" относится к последовательностям нуклеиновых кислот, которые происходят от общего предкового гена посредством природных или искусственных механизмов (например, члены одного семейства генов), и таким образом, как правило, разделяют сходство последовательностей. Гомологичные нуклеиновые кислоты зачастую обладают достаточной степенью подобия последовательностей так, что одна из последовательностей или комплементарная ей способна избирательно гибридизоваться с другой в жестких условиях гибридизации. Термин "избирательно гибридизуется" включает ссылку на гибридизацию в строгих условиях, последовательности нуклеиновой кислоты с определенной последовательностью нуклеиновой кислоты-мишени к детектируемо большей степени (например, по меньшей мере 2-кратно превышая фон), чем ее гибридизация с посторонними последовательностям нуклеиновых кислоты и к существенному исключению нуклеиновых кислота, не относящихся к нуклеиновой кислоте-мишени. Избирательно гибридизующиеся последовательности обладают по меньшей мере приблизительно 80% идентичностью последовательности, часто по меньшей мере 90% идентичностью последовательности, и могут обладать 95%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичностью между последовательностями. Нуклеиновая кислота, которая обладает по меньшей мере некоторой степенью гомологии с исходной нуклеиновой кислотой, может быть отличной или идентичной исходной нуклеиновой кислоте или комплементарной ей последовательности. Термин "клетка-хозяин" означает клетку, которая содержит чужеродную нуклеиновую кислоту, такую как вектор, и поддерживает репликацию и/или экспрессию данной нуклеиновой кислоты. Клеткихозяева могут быть прокариотическими клетками, как, например, Е. coli, или эукариотическими клетками, как, например, клетки дрожжей, насекомых, амфибий, или клетки млекопитающих. Предпочтительно клеткой-хозяином является клетки растения. В рамках настоящего изобретения, одной особенно предпочтительной клеткой-хозяином является клетка подсолнечника. Термин "интервал" относится к непрерывному линейному участку хромосомной ДНК, концы которого ограничены и включают молекулярные маркеры. Термин "введенный", относящийся к чужеродной или выделенной нуклеиновой кислоте, относится к введению нуклеиновой кислоты в эукариотическую или прокариотическую клетку, причем нуклеиновая кислота может быть инкорпорирована в геном клетки (например, хромосома, плазмида, пластида или митохондриальная ДНК), преобразована в автономный репликон, или временно экспрессироваться (например, трансфицированная мРНК). Данный термин включает такие средства введения нуклеиновой кислоты как "трансфекция", "трансформация" и "трансдукция". Термин "интрогрессия" относится к переносу желательного аллеля генетического локуса из одного генетического фонда в другой. Например, интрогрессия желательного аллеля в определенном локусе может произойти при половом размножении двух растений, причем по меньшей мере одно растение обладает желательным аллелем в составе своего генома. Аллель интрогрессирует в потомство. В другом примере передача аллеля может произойти посредством рекомбинация между геномами двух доноров in vitro, например в слившемся протопласте, где по меньшей мере один протопласт-донор обладает желательным аллелем в составе своего генома. Желательный аллель может быть, например, трансгеном или выбранным маркерным аллелем или локусом полигенного признака. Термин "изолированный" или "выделенный" относится к материалу, такому как нуклеиновая кислота или белок, который по существу свободен от компонентов, которые обычно сопровождают или взаимодействуют с ним, во встречающемся в природных условиях окружении. Изолированный материал необязательно содержит материал, не находящийся с данным материалом в его природной среде, например клетку. Кроме того, если данный материал находится в своей природной среде, как, например, в клетке, то данный материал был помещен в область в клетке (например, геном или субклеточная органелла), которая является неприродной для данного материала, находящегося в этой окружающей среде. Например, встречающаяся в природе нуклеиновая кислота (например, промотор), как считается, является изолированной, если она введена посредством не встречающегося в природе средства в геномный локус,который не является природным для этой нуклеиновой кислоты. Нуклеиновые кислоты, которые являются "изолированными" как указано в настоящем описании, также обозначены как "гетерологичные" нуклеиновые кислоты."Линия" означает группу растений, которые являются генетически гомогенными и обладают низкой вариабельностью между особями, как правило, в результате нескольких генераций самоопыления. Кроме того, линия может включать группу растений, размноженных вегетативным способом из одного исход- 10023910 ного растения, используя методику клеточных и тканевых культур. Термин "неравновесное сцепление" относится к неслучайной сегрегации генетических локусов. Это подразумевает, что такие локусы находятся в достаточной физической близости на хромосоме, и они имеют тенденцию сегрегировать вместе, т.е. с больше частотой, чем при случайном распределении. Термины "маркер", "молекулярный маркер" и "маркерный локус" относятся к нуклеотидной последовательности или кодируемому ими продукту (например, белку), который используют в качестве точки отсчета, идентифицируя сцепленный локус, как, например, локус полигенного признака (QTL). Маркер может происходить из геномной нуклеотидной последовательности или из экспрессируемых нуклеотидных последовательностей или из кодируемого полипептда. Термин может также относиться к последовательностям нуклеиновой кислоты, комплементарным, или примыкающим к последовательности маркера,как, например, нуклеиновые кислоты, используемые в качестве зондов или пары праймеров, с помощью которых может быть амплифицирована последовательность маркера. Такая последовательность нуклеиновой кислоты или молекула, которая может быть использована для идентификации наличия маркерного локуса, например зонд нуклеиновой кислоты, который является комплементарным последовательности маркерного локуса, могут также упоминаться как "маркерный зонд". В качестве альтернативы, в некоторых аспектах маркерный зонд относится к любому зонду, который способен отличить (т.е. определить генотип) определенный аллель, который присутствует в маркерном локусе. Термины "нуклеиновая кислота", "полинуклеотид", "полинуклеотидная последовательность" и "последовательность нуклеиновой кислоты" относятся к одноцепочечному или двухцепочечному дезоксирибонуклеотиду или рибонуклеотидным полимерам или их химерам. Как используется в настоящем описании, эти термины могут дополнительно или в качестве альтернативы включать аналоги встречающихся в природе нуклеотидов, обладающие важным свойством природных нуклеотидов, а именно, что они гибридизуются с одноцепочечными нуклеиновыми кислотами подобно тому, как встречающиеся в природе нуклеотиды (например, пептидно-нуклеиновые кислоты). Если не указано иначе, конкретная последовательность нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению в дополнение к последовательности, указанной явно, необязательно охватывает комплементарные последовательности. Термин "ген" использован как для обозначения, например, кДНК и мРНК, кодируемой геномной последовательностью, так и этой геномной последовательности."Растения или части растения" относится к растительным клеткам, растительным протопластам,культурам клеточных тканей растений из которых могут быть регенерированы растения, каллюсы растений, побеги астений и клетки растений, которые не повреждены на растениях, или части растений, как,например, эмбрионы, пыльца, яйцеклетки, цветы, листья, кожицы, стебли, корни, корневые кончики,пыльники, семя и мука из семян, и т.п. Термин "локус полигенного признака" или "QTL" относится к полиморфному генетическому локусу по меньшей мере с двумя аллелями, которые дифференцированно отражают экспрессию непрерывно распределенного фенотипического признака. В рамках настоящего изобретения, "устойчивость", "устойчивость к заразихе" или "устойчивость кOrobanche" определяются как генетически-определяемое свойство растений подсолнечника, которое препятствует прикреплению паразитирующего растения заразихи к растению подсолнечника и позволяет закончить свой жизненный цикл, пройдя через репродуктивную (семяносную) стадию. Устойчивость может быть результатом одного или нескольких взаимоотношений растения и паразита, включая, но без ограничения: (1) отсутствие необходимого стимула для прорастания семени заразихи от растения подсолнечника (предполагается, что это химический компонент пасоки); (2) предотвращение проникновения гаусторий заразихи в через поверхность корня подсолнечника; или (3) предотвращение доступа гаусторий заразихи к сосудистой системе растения подсолнечника. Термин "рекомбинантный" относится к материалу (например, нуклеиновой кислоте или белку), который был искусственно (неприродным образом) изменен посредством вмешательства человека. Такое изменение для получения синтетического материала может быть выполнено на материале вне или в пределах его природной среды или состояния. Например, встречающаяся в природе нуклеиновая кислота считается рекомбинантной нуклеиновой кислотой, если она изменена, или если она была транскрибирована с ДНК, которая была изменена посредством человеческого вмешательства, проведенного в пределах клетки, из которой она происходит. См., например, Compounds and Methods for Site Directed Mutagenesis in Eukaryotic Cells, Kmiec, U.S. Patent5565350; In Vivo Homologous Sequence Targeting in Eukaryotic Cells; Zarling, et al., PCT/US 93/03868."Восстанавливающая линия" относится к линии, обладающей геном или генами, восстанавливающими фертильность мужских особей или жизнеспособность пыльцы у гибридного подсолнечника или инбредной линии, имеющих материнскую цитоплазму, которая служит причиной мужской стерильности. Данный термин также обсуждается в литературе. См., например, Fick, "Breeding and Genetics," in Sunflower Science and Technology 279-338 (J. F. Carter, ed., 1978), содержание которого включено в настоящее описание ссылкой."Селекция" означает отбор желательного фенотипа из широкой, генетически гетерогенной популяции, участвующей в скрещивании, обычно называемой популяцией. Индивидуальные растения в преде- 11023910 лах популяции проходят селекцию в пользу предпочтительных проявлений таких признаков как морфология растения, морфология цветка, устойчивость к насекомым или болезням, зрелость и урожайность. Термин "простой повтор" или "SSR" относится к типу молекулярных маркеров (также известный как микросателлит), образованных короткими последовательностями нуклеотидов (2-6 оснований в длину), которые повторяются в тандеме. Например, динуклеотидный повтор может быть GAGAGAGA, а тринуклеотидный повтор может быть ATGATGATGATG. Считается, что при репликации ДНК происходят ошибки, и дополнительные наборы этих повторяющихся последовательностей встраиваются в цепь. С течением времени эти повторяющиеся последовательности изменяются по длине между одним культурным сортом растения и другим. Пример аллельной изменчивости в SSR был бы: Аллель A: GAGAGAGA (4 повтора последовательности GA) и Аллель В: GAGAGAGAGAGA (6 повторов последовательности GA). Такие вариации длины могут быть легко определены в лабораторных условиях и позволяют отслеживать генотипическую вариабельность в программах скрещивания. Термин "однонуклеотидный полиморфизм" или "SNP" относится к однонуклеотидному изменению в геномной последовательности. Это может произойти, когда единственный аденин, тимин, цитозин, или гуанин (представленные посредством А, Т, С или G) изменены на любой из других четырех нуклеотидов,или когда единственный нуклеотид вставлен или удален. SNP может как приводить, так и не приводить к функциональному изменению гена. Термин "трансгенное растение" относится к растению, которое содержит в составе своего генома гетерологичный полинуклеотид. Как правило, гетерологичный полинуклеотид стабильно интегрируется в геном таким образом, что полинуклеотид передается последующим поколениям. Гетерологичный полинуклеотид может быть внедрен в геном лишь один или в составе рекомбинантной экспрессионной кассеты. "Трансгенный" используется в настоящем описании для обозначения любой клетки, клеточной линии, каллюса, ткани, части растения или растения, генотип которого был изменен посредством наличия гетерологичной нуклеиновой кислоты, включая те трансгенные организмы или клетки, первоначально измененные таким методом, так же как и те, которые получены посредством полового или бесполого размножения исходно трансгенного организма или клетки, сохраняя гетерологичную нуклеиновую кислоту. Термин "трансгенный" в рамках настоящего описания не охватывает изменения генома (хромосомного или внехромосомного) посредством традиционных способов растениеводства (т.е. скрещиваний) или посредством встречающихся в природе событий, как, например, случайное перекрестное опыление, заражение нерекомбинантными вирусами, трансформация нерекомбинантными бактериями, нерекомбинантная транспозиция или спонтанная мутация."Сорт" или "культурный сорт растения" относятся к группе растений в пределах одного вида (например, Helianthus annuus), которые разделяют определенные неизменные особенности, которые выделяют их из типичной формы и от других возможных сортов в пределах одного вида. Полевые зерновые культуры выращивают посредством методов, которые используют преимущество способов опыления растений. Растение является самоопыляемым, если пыльца от одного цветка переносится тому же самому или другому цветку того же самого растения или генетически идентичного растения. Растение является перекрестноопыляемым, если пыльца попадает от одного цветка на генетически отличное растение. Таким образом, термин "самоопыляемый" в программе скрещивания относится к самоопылению, и термин "перекрестносамоопыляемый" относится к перекрестному опылению. Подсолнечники имеют соцветие типа метелки со стерильными язычковыми цветками и полноценными (имеющий и тычинку, и пестик) трубчатыми цветками. В диком состоянии подсолнечник был аутостерильным или самонесовместимым, таким образом, он является преимущественно перекрестноопыляемой культурой, которая в значительной степени зависит от медоносных пчел или других насекомых для опыления. Большинство областей разведения не обладает достаточной популяции пчел для требуемого уровня опыления сельскохозяйственной культуры. Это привело к отбору селекционерами по признаку аутосовместимости или аутофертильности, что увеличивает урожайность при небольшом количестве пчел. Разводимая популяция подсолнечника должна быть по существу однородной и воспроизводящейся,чтобы быть полезной либо в дальнейшем разведении или в выведении коммерческого культурного сорта. Существует несколько аналитических методов, пригодных для определения фенотипической стабильности популяции подсолнечника. Самым старым и самым традиционным способом анализа является наблюдение за фенотипическими признаками. Данные обычно собираются в полевых экспериментах в течение жизни растений подсолнечника, которые предстоит исследовать. Чаще всего отмечают фенотипические характеристики, связанные с урожайностью, содержанием масла в семени, содержанием белка в семени, составом жирных кислот масла, содержанием глюкозинолата в муке, формой роста, устойчивостью к полеганию, высотой растений, устойчивостью к осыпанию, и т.д. Другие фенотипические характеристики, обычно наблюдаемые, включают устойчивость к болезням или насекомым, и толерантность к гербицидам. Было отмечено, что композиции и способы по настоящему изобретению могут быть полезны при идентификации новых линий подсолнечников, устойчивых к Orobanche cumana. Около корневой зоны предрасположенного сорта семя Orobanche прорастает, образует гаусторию на корне предрасположенного растения и заканчивает свой жизненный цикл получая питательные вещества из от растения-хозяина, принося таким образом серьезный вред для роста растения-хозяина и созревания урожая. См., например, Dominguez, (1996) Plant Breed. 115:203-204; Ish-Shalom-Gordon, et al.,(1993) Phytopathology 83: 1250-1252; Kirichenco, et al., (1987) Plant Breed. Abstr. 57:1392; Melero-Vara, etal. (2000), Helia 23:45-56; и Sukno, et al., (1999) Crop Sci. 39:674-678). Система 1 устойчивости к Orobanche cumana приводит к неспособности семени Orobanche заразить растение-хозяина в корневой зоне устойчивого сорта. Эта форма устойчивости представлена в линии подсолнечника U00S9LM и АТСС,номер доступа РТА-3793. В отличие от случая системы 1 устойчивости, семя Orobanche cumana в корневой зоне растений подсолнечника, которые имеют ген систему 2 устойчивости, прорастет, проникая в ткани корня хозяина и образовывая гаусторию. Корни заразихи приступают к развитию под землей. Однако, для растений подсолнечника с геном системы 2 устойчивости, вторжение растение Orobanche увянет и умрет прежде, чем появится из почвы, неспособное закончить свой жизненный цикл на корневой системе устойчивого растения. Такая форма устойчивости представлена в линии подсолнечника 8556UG и депозите АТСС, номер доступа РТА-3792; см. WO 2003073837. В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение представляет молекулярные маркеры для гена, который наделяет системой 2 устойчивости к Orobanche cumana. Третий механизм совмещает механизмы устойчивости обеих систем с получением более высокой устойчивости. Такая форма устойчивости представлена в гибриде подсолнечника 01 UL2365 и АТСС номер доступа РТА-3791. Устойчивость к заразихе усилена посредством объединения особенность систему 2 устойчивости с другими генами устойчивости. В прошлом селекционеры полагались на биологический метод при селекции устойчивых растений,проводя поиск живой заразихи в радиусе 50 см вокруг каждого растения и проверяя подпочву на предмет корней заразихи, прикрепленных к корневой системе. Этот способ чрезвычайно утомителен и может быть неточен из-за факторов окружающей среды. Молекулярный маркер, сцепленный с устойчивым аллелем гена устойчивости системы 2, позволил бы селекционерам гораздо быстрее и надежнее проводить селекцию устойчивых растений в процессе скрещивания. В определенных вариантах осуществления настоящее изобретение предоставляет молекулярные маркеры для системы 2 устойчивости к Orobanche cumana. Ранее не было доступно ни одного молекулярного маркера для идентификации или дифференциации система 2 устойчивости к Orobanche у подсолнечника. Селекционерам подсолнечника приходилось полагаться на полевые наблюдения при введении гена систему 2 устойчивости к Orobanche в свои разводимые популяции. Новые молекулярные маркеры облегчают усилия селекционеров подсолнечника. Например, применение маркеров позволяет селекционерам: 1) дифференцировать растения в пределах сегрегирующей разводимой популяции с целью определения тех, которые обладают геном системы 2 устойчивости; 2) скрестить систему 2 устойчивости с элитными инбредными линиями, которые ранее обладали низкой или не обладали устойчивостью к Orobanche, повышая таким образом разнообразие сортов подсолнечника, доступных для производителей в областях, зараженных Orobanche; 3) объединить ген системы 2 с другими генами устойчивости, получая растения, которые обладают как системой 1, так и системой 2 устойчивости, и, таким образом, предоставляют комбинацию устойчивости, которая превосходит как систему 1, так и систему 2 устойчивости по отдельности; 4) объединить ген системы 2 с генами, которые предоставляют другие полезные признаки, как, например, устойчивость к другим паразитам или болезням, которые поражают подсолнечник, или толерантность к гербицидам; 5) создавать новые коммерческие продукты, которые могут быть использованы для истощения существующих банков семян Orobanche в почвенном профиле и ограничения образования новых отложений семян Orobanche в системе земледелия; 6) идентифицировать области и/или кластеры генов в геноме подсолнечника, которые наделяют подсолнечник устойчивостью к Orobanche и клонировать полезные гены из этих локусов для дальнейшего развития маркеров или создания новых конструкций для трансгеноза, которые могут быть использованы для получения трансгенного подсолнечника с устойчивостью к Orobanche. Композиции и способы по настоящему изобретению могут помочь в воспроизводимом создании линий подсолнечника, которые обладают свойством устойчивости к Orobanche в контексте соответствующего фенотипического фона, обладающего одним или несколькими желательными свойствами, как,например, высокая урожайность семян, ранняя зрелость, устойчивость к засухе, холодоустойчивость,соответствующее содержание белка в семени и профиля аминокислот, карликовость, устойчивость к полеганию, устойчивость к насекомым или болезням, вызываемым бактериями, грибами или вирусами, и толерантность к обработке гербицидами. Получение гибридов подсолнечника. Семя гибридного подсолнечника, как правило, получают посредством системы мужской стерильности, прибегая к инбредным растениям с генетической или цитоплазматической мужской стерильностью(ЦМС). Инбредные ЦМС-растения характеризуются мужской стерильностью в результате факторов,происходящих из цитоплазмы, в противоположность ядру, геному. Таким образом, эта особенность наследуется исключительно от родительской женской особи, поскольку только родитель женского пола предоставляет цитоплазму оплодотворенному семени. ЦМС можно получить из широко распространенных линий подсолнечника, известных в данной области техники, и публично доступной, как, например,CMS HA89 (USDA). Источником CMS HA89 является материал Leclercq, "Cytoplasmic Sterility in the Sunflower," (1969) Ann. Amelior Plant 19:99-106. Растения с ЦМС оплодотворяют пыльцой от другого растения, которое не является цитоплазматически стерильным. Пыльца от второго растения может или, возможно, не вносит гены, которые делают мужские растения потомства фертильными. Линии с цитоплазматической мужской стерильностью традиционно получают методом обратного скрещивания, в котором желательные линии, которые прошли инбридинг и селекцию в нескольких поколениях, сначала скрещивают с растением с цитоплазматической мужской стерильностью. После того желательная инбредная линия используется в качестве возвратного родителя в процедуре обратного скрещивания. Итоговое потомство будет генетически подобно возвратному родителю за исключением того, что оно будет обладать мужской стерильностью. Линии, восстанавливающие фертильность, могут быть получены при обратном скрещивании для переноса доминантного восстанавливающего гена к установленной инбредной линии с нормальной цитоплазмой. При использовании данного метода прошедшие селекцию растения должны быть скрещены с линией с цитоплазматической мужской стерильностью после каждой генерации для определения присутствия генов, восстанавливающих фертильность. Более распространенной процедурой является самоопыление и селекция мужских фертильных растений от коммерческих гибридов или запланированных скрещиваний родителей, имеющих гены, восстанавливающие мужскую цитоплазматическую стерильность. Этот метод не требует аналитического скрещивания с мужской стерильной линией при проведении селекции, поскольку растения будут полностью фертильны, если присутствуют необходимые восстанавливающие гены. Подходящая ЦМС восстанавливающая линия может быть получена посредством скрещивания с любой из широко доступных восстанавливающих линий, как, например, RHA274, RHA271 и RHA273(USDA), или другими линиями, обладающими генами для восстановления мужской фертильности. Линии и сорта, полученные таким образом, которые производят семена, обладающие устойчивостью к заразихе и которые являются чистосортными по меньшей мере в отношении генов восстанавливающих фертильность, могут быть затем изолированы посредством непрерывного самоопыления и скрещены с ранее описанными ЦМС линиями, устойчивыми к заразихе. Получение инбредной линии подсолнечника. Использование инбредных линий с мужской стерильностью является всего лишь одним фактором при получении гибридов подсолнечника. Для получения гибридов подсолнечника, как правило, требуется получение гомозиготных инбредных линий, скрещивание этих линий, и оценка потомства. Методы племенного размножение и размножения с рекуррентной селекцией используются для получения инбредных линий из размножающихся популяций. Программы разведения объединяют генетические фонды от двух или нескольких инбредных линий или других различных универсальных источников скрещиваемых популяций, от которых новые инбредные линии получают посредством самоопыления и селекции желательных фенотипов. Новые инбредные линии скрещивают с другими инбредными линиями, и гибриды от этих скрещиваний оценивают на предмет коммерческого потенциала. Чистосортное разведение обычно используется для усовершенствования зерновых культур. Чистосортное разведение начинается со скрещивания двух генотипов, каждый из которых может обладать одним или несколькими желательными признаками, которого недостает в другом, или который служит дополнением другому. Если два исходных родителя не предоставляют все желательные признаки, в схему скрещивания могут быть включены дополнительные родители. Этих родителей скрещивают по простой или сложной схеме для получения F1. Популяцию F2 получают в результате самоопыления одного или нескольких F1 или путем скрещивания двух F1 (т.е. близкородственное скрещивание). Селекция самой лучшей особи может начаться в популяции F2. Начинаясь с F3, проводят селекцию самых лучших семей, и самой лучшей особи в пределах самых лучших семей. Повторное тестирование семей (линий) может быть начато в поколении F4 для повышения эффективности селекции в пользу признаков с низкой наследуемостью. На поздней стадии инбридинга (т.е. F6 и F7),самые лучшие линии или смеси фенотипически подобных линий обычно проверяют на потенциальный переход к новому сорту. Улучшенные сорта могут также быть получены в результате рекуррентной селекции. Генетически вариабельную популяцию гетерозиготных особей или определяют или получают, скрещивая несколько различных родителей. Самые лучшие растения отбирают, основываясь на индивидуальных преимуществах, исключительности потомства и/или превосходной скрещиваемости. Отобранные растения скрещивают между собой для получения новой популяции, с которой продолжают проводить следующие циклы селекции. Цель коммерческих программ выведения гибрида подсолнечника состоит в том, чтобы получить новые инбредные линии, которые объединяют свойства производить гибриды с высокой урожайностью и превосходными агрономическими свойствами. В первую очередь селекционеры обращают внимание на урожайность. Однако многие другие основные агрономические свойства имеют высокое значение в комбинациях гибридов и оказывают влияние на урожай или иначе обеспечивают превосходные свойства у комбинаций гибридов. Основные цели при селекции подсолнечника включают улучшенную урожайность семян, улучшенную масличность семени или качество масла, раннюю зрелость, более низкую высоту, однородность типа растения и устойчивость к насекомым или болезням. Кроме того, линии по существу предпочтительно обладают приемлемыми показателями в качестве родительских свойств, как, например, урожайность семенами и производство пыльцы, каждый из которых влияет на способность предоставлять родительские линии в достаточном количестве и качестве для скрещивания. Было показано, что эти признаки находятся под генетическим контролем и многие, если не все свойства, определяются несколькими генами. Посредством методов скрещивания улучшенная устойчивость к Orobanche cumana может быть совмещена или "укомплектована" с любым другим желательным свойством семени, агрономическим, или устойчивостью к насекомым или болезни. Примеры других желательных признаков включают, но не ограничены, измененный профиль масел семени или содержание, высокий урожай семенами, более ранняя зрелость, засухоустойчивость, холодоустойчивость, повышенное содержание белка в семени, измененный профиль содержания аминокислот в семенах, карликовость, устойчивость к полеганию, устойчивость к насекомым или болезням, вызываемым бактериями, грибами или вирусами, или толерантность к обработке гербицидами. Способы по настоящему изобретению находят частное применение в программах селекции линий подсолнечника, устойчивых к гербициду на основе сульфонилмочевины. Было установлено, что гербициды на основе сульфонилмочевины являются эффективными против паразитных сорняков подсолнечника, как, например, повилика и разновидностей Orobanche (L. Garcia-Torres, et al., (1994) Weed Research 34:395-402). Регенерация растений. Настоящее изобретение также относится к частям растений, раскрытым в настоящем описании,включая растительные клетки, протопласты растений, клеточные тканевые культуры растений, из которых могут быть регенерированы растения подсолнечника, каллюсы растений, побеги растений, и клетки растений, которые сохранены в растениях или частях растений, как, например, эмбрионы, пыльца, яйцеклетки, цветы, листья, кожицы, стебли, корни, кончики корней, пыльники, семя и жмых, и т.п. Растения, полученные в соответствии с настоящим изобретением, могут быть регенерированы из частей растения, используя известные методики. Например, семена из растений по настоящему изобретению могут быть привиты в соответствии с обычной процедурой выращивания подсолнечника. Такие растения произведут дополнительные семена. Растения подсолнечника могут также быть регенерированы, используя культуру ткани и регенерацию. Культура различных клеток и тканей подсолнечника и регенерация растений из них известны квалифицированным специалистам в данной области техники. Например, выращивание подсолнечника посредством культуры ткани описано в следующих ссылках: Henderson, et al, (1952) "The culture of normaldifferent auxins on growth and differentiation in callus tissue from sunflower stem pith", Indian J. Exp. Biol. 12:110-111. Растительное масло и пища. Семя растений по настоящему изобретению может использоваться для получения растительного масла и пищи. Семена этих сортов, растение, полученное из такого семени, гибридное растение подсолнечника, полученное после скрещивания этих сортов с другими сортами, получаемое семя от такого гибрида, и различные части гибридного растения подсолнечника, могут быть использованы для получения съедобного растительного масла или других продовольственных продуктов в соответствии с известными методами. Единицы, префиксы и символы использованы по правилам, принятым в Международной Системе Единиц (СИ). Если не указано иначе, нуклеиновые кислоты написаны к ориентации слева направо от 5' к 3'; аминокислотные последовательности написаны слева направо в ориентации от аминокислотного конца к карбоксильному. Числовые диапазоны, приведенные в настоящем описании, включают числа, ограничивающие диапазон, и включают каждое целое число в пределах определенного диапазона. Нуклеотиды могут быть упомянуты здесь посредством их однобуквенных символов, рекомендуемых комиссией по номенклатуре IUPAC-IUBMB. Термины, определенные в настоящем описании, более полно раскрыты в ссылках к настоящему описанию в его полноте. Заголовки разделов, данные на всем протяжении описания, предоставлены для удобства и не ограничены различными предметами и вариантами осуществления по настоящему изобретению. Следующие далее примеры представлены как определенные иллюстрации к заявленному изобретению. Следует подразумевать, однако, что настоящее изобретение не ограничено определенными подробностями, сформулированными в примерах. Примеры. Пример 1. Скрининг в поле. Скрининг нового источника для селекции зародышевой плазмы и инбредных линий с устойчивостью к заразихе проводился в течение нескольких лет в летнем питомнике в Ahmetbey, LuleburgazKirklarli, Турция. Питомник был искусственно заражен с семенами новых рас O.cumana. Заражение почвы питомника повторяли каждый год. Скрининг проводили путем высаживания 15 растений в 4-метровый по длине ряд для каждой селекции скрещивающихся зародышевой плазмы и инбредных линий. Устойчивость к заразихе оценивали непосредственно перед сбором урожая посредством удаления растения из земли и подсчета числа растений подсолнечника с мертвыми побегами заразихи, прикрепленными к корневой системе подсолнечника под поверхностью почвы. Растения с системой 2 устойчивости, как находили, имели мертвые первичные побеги заразихи, прикрепленные к их корневым системам под землей. Восприимчивые к заразихе линии были заражены побегами заразихи, которые появились над землей. Восприимчивые растения характеризовались различной степенью интенсивности атаки заразихи. Пример 2. Молекулярное картирование QTL, наделяющего системой 2 устойчивости к заразихе. Одним подходом к определению, какие аллели играют роль в фенотипическом признаке, является сравнение штаммов растений с высоко дивергентными фенотипами по интересующему признаку. Распределения аллелей для всей базы данных маркеров были проанализированы для двух фенотипических групп. Например, тест "Intergroup Allele Distribution" можно провести, используя GeneFlow программное обеспечение версии 7.0 (GENEFLOW, Inc, Александрия, Вирджиния). Межгрупповой анализ аллельной частоты предоставляет способ для нахождения неслучайных распределений аллелей между двумя фенотипическими группами. Во время анализа была составлена таблица статистической структуры изучаемой популяции с аллельными частотами, и на основании нее были вычислены статистическая величина G и вероятность (статистическую величину G скорректировали посредством использования поправок William). Значение вероятности было скорректировано таким образом, чтобы учитывать тот факт,что были проведены многократные тесты (таким образом, есть некоторая ожидаемая вероятность ложноположительных значений). Скорректированная вероятность пропорциональна вероятности того, что наблюдаемые различия в распределении аллелей между двумя данными классами произошли случайно. Чем ниже значение вероятности, тем более значима ассоциация между генотипом маркера в том локусе и интересующим фенотипом, в данном случае фенотип устойчивости к Orobanche. Более полное обсуждение получения значений вероятностей можно найти в документации к программному обеспечениюin Biological Research, 2nd ed., San Francisco, W. H. Freeman and Co. В данном анализе скорректированные вероятности менее чем 0,05 считают значимыми (маркер и фенотип показывают неравновесное сцепление), и скорректированные вероятности менее, чем приблизительно 0.01 считают высоко значимыми. Классы аллелей, представленные менее, чем минимальным значением наблюдений в обеих группах, не включены в статистический анализ. Основная логика заключена в том, что маркеры с достоверно различными распределениями аллелей между устойчивыми и восприимчивыми группами могли бы быть связаны с признаком, и могут быть использованы для их различения. Посредством настоящего метода проводили анализ одного маркерного локуса за один раз и определяли, было ли распределение аллеля в пределах устойчивой группы достоверно отличным от распределения аллеля в пределах восприимчивой группы. Статистически различное распределение аллелей является указанием на то, что маркер сцеплен с локусом, который связан с устойчивостью к Orobanche. Чтобы идентифицировать генетические маркерные локусы подсолнечника, связанные с устойчивостью к Orobanche, картируемая популяция 182 F2:3 линий подсолнечника была получена при скрещивании U0151LG (устойчивый родитель) X E0005LG (восприимчивый родитель). Устойчивость или восприимчивость родительских линий были определены ранее. Геномная ДНК была изолирована от родителя и растений потомства и проанализирована в реакциях ПЦР, используя публично доступные праймеры для амплификации, специфичные для большого количества SSR маркеров, которые все вместе покрывали все хромосомы в геноме подсолнечника. Потомство и родительские растения также оценивали по устойчивости к Orobanche в полевых условиях. В результате данного анализа предполагаемый локус системы 2 устойчивости к заразихе расы Н был картирован с группой сцепления 4 (LG-04) на общедоступной консенсусной карте подсолнечника, приблизительно в 3 сМ от SSR HT0664-CA (Wills, D. M. and Burke, J. Для заполнения области большим количеством маркеров из стандартной карты сцепления для подсолнечника (Yu, J. , et al., (2003) Crop Science 43:367-387; Gentzbittel, L., et al., (1999) Theor. Appl Gen 99:218-234), два SNP маркера были идентифицированы как потенциальные представляющие интерес маркеры, НТ 0183 и НТ 090 (Theor. Appl.Gen. 11:1532-1544; Perez-Vich, В. (2004) Theor. Appl Gen. 109:92102). См. фиг. 2. Праймеры (SEQ ID NO: 5 и 6), были разработаны таким образом, чтобы амплифицировать фрагмент приблизительно 278 пар оснований, и ПЦР проводили как с двумя родительскими линиями, U0151 LG и E0005LG, так же как и с U01P6LM и четвертой линией. Продукт ПЦР амплифицировали для каждой из четырех линий, используя пару праймеров HT183-F1/HT183-R1. Полученные последовательности данных четырех полос свидетельствуют о том, что имеются три потенциально истинных SNP маркерных локуса. Эти три SNP отмечены звездочками в выравнивании, представленном на фиг. 3. Анализ TAQMAN (Roche Molecular Systems, Inc) был затем разработан и применен для обнаружения SNP HT183, используя праймеры SEQ ID NO: 3 и 4. Ассоциация SNP HT183 с устойчивостью кBRSII была утверждена, используя образцы выводимых линий с известными фенотипами устойчивости к болезни. Результат генотипирования согласовывался с полевыми наблюдениями у 98,2% образцов(N=167). НТ 183 SNP локус был нанесен на карту на расстоянии 1 сМ от ранее идентифицированного локуса QTL устойчивости к Orobanche в группе сцепления 4. 167 особей потомства были отобраны из пяти популяций, представленных на фиг. 4. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Способ идентификации растения подсолнечника (Helianthus) или зародышевой плазмы подсолнечника, имеющего фенотип системы II устойчивости к Orobanche, включающий обнаружение у растения подсолнечника или зародышевой плазмы подсолнечника по меньшей мере одного однонуклеотидного полиморфизма (SNP) маркерного локуса, который ассоциирован с указанным фенотипом, где маркерный локус представлен последовательностью SEQ ID NO: 2, или обладает частотой рекомбинации менее чем 5% относительно маркерного локуса SEQ ID NO: 2 и картирован в группе сцепления 4 Helianthusannuus. 2. Способ по п.1, в котором обнаружение включает амплификацию маркерного локуса или части маркерного локуса и детекцию полученного амплифицированного ампликона маркера. 3. Способ по п.2, в котором амплификация включает:a) смешивание праймера для амплификации или пары праймеров для амплификации с нуклеиновой кислотой, изолированной от растения подсолнечника или зародышевой плазмы, причем праймер или пара праймеров являются комплементарными или частично комплементарными по меньшей мере к части маркерного локуса и способны к инициации полимеризации ДНК посредством ДНК-полимеразы, используя нуклеиновую кислоту подсолнечника в качестве матрицы; иb) удлинение праймера или пары праймеров в реакции полимеризации ДНК, содержащей ДНК-полимеразу и матричную нуклеиновую кислоту, для получения по меньшей мере одного ампликона. 4. Способ по п.3, в котором праймер или пара праймеров выбраны из группы, состоящей из SEQ IDNO: 5, 6, 9 и 10. 5. Способ селекции растений подсолнечника на устойчивость к Orobanche, включающий скрещивание растения подсолнечника, идентифицированного способом по п.1, со вторым растением подсолнечника, которое проявляет меньшую устойчивость к Orobanche, чем растение, идентифицированное способом по п.1, и отбор потомства с устойчивостью к Orobanche, полученного в результате данного скрещивания, путем анализа образцов ДНК, выделенных из одного или более растений потомства с идентификацией растения, содержащего по меньшей мере один полиморфизм маркерного локуса SEQ ID NO: 2,ассоциированный с устойчивостью к Orobanche. 6. Способ по п.5, дополнительно включающий одну или несколько стадий обратного скрещивания,самоопыления и случайного скрещивания и селекции растений, полученных способом по п.5. 7. Способ по п.5, где указанное идентифицированное растение дополнительно содержит систему I устойчивости к Orobanche. 8. Способ идентификации фрагмента нуклеиновой кислоты растения подсолнечника в качестве маркера чувствительности или маркера системы II устойчивости к Orobanche, который включает обеспечение взаимодействия указанного фрагмента нуклеиновой кислоты с последовательностями маркерного локуса, выбранными из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1 или 2, и определение на основе взаимодействия указанного фрагмента и указанных маркерных последовательностей наличия у фрагмента одного или нескольких полиморфизмов SEQ ID NO: 2 относительно SEQ ID NO: 1, где наличие одного или нескольких указанных полиморфизмов является показателем устойчивости к Orobanche, и отсутствие указанных полиморфизмов показателем чувствительности к Orobanche. 9. Применение генетического маркера, связанного с системой II устойчивости к Orobanche и картированного в группе сцепления 4 Helianthus annuus, содержащего нуклеотидную последовательность SEQID NO: 2 или ее вариант, который сохраняет по меньшей мере один из полиморфизмов SEQ ID NO: 2 относительно SEQ ID NO: 1, для получения дополнительных маркеров устойчивости к Orobanche. 10. Способ снижения существующего семенного фонда Orobanche в почве, включающий выращивание растения подсолнечника, содержащего маркер системы II устойчивости к Orobanche, который содержит нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 2, или ее вариант, который сохраняет по меньшей мере один полиморфизм последовательности SEQ ID NO: 2 относительно SEQ ID NO: 1. 11. Способ идентификации генов или кластеров генов в геноме растения подсолнечника, обеспечивающих устойчивость к Orobanche, включающий амплификацию хромосомного участка, идентифицированного посредством гибридизации с праймером, выбранным из группы, состоящей из SEQ ID NO: 5, 6,9 или 10. 12. Способ по п.11, дополнительно включающий последовательные раунды скрининга и изоляции клонов для составления контига, содержащего открытую рамку считывания. 13. Применение гена или кластеров генов, идентифицируемых способом по п.11, для получения трансгенных растений подсолнечника, устойчивых к Orobanche. 14. Растение, полученное способом по любому из пп.5, 6. 15. Растение, идентифицированное способом по любому из пп.1-3.